Activation de la protéine p53 par l’irradiation laser dans ... · utilisé en ophtalmologie pour...
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1DSV/DRR/SFRP Bordeaux 14/04/04
Activation de la protéine p53 par l’irradiation laser
dans l’ultraviolet lointain
Catherine Chapel1, Evelyne May2, Monique Vacher3
et D. Courant1
1 DSV/DRR/SRBF, CEA, Fontenay aux Roses2CNRS UPR 9045, Institut André Lwoff, Villejuif
3Laboratoire de Radiobiologie de l’ADN, DSV/DRR, CEA, Fontenay aux Roses,
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posterior
anterior
Coupe histologique de cornée humaine
Epithelium
Endothelium
Stromakeratocytes
• Le rayonnement à 193 nm émis par le laser à excimères ArF estutilisé en ophtalmologie pour la chirurgie de la réfraction (PKR, et LASIK).
• La photoablation élimine ou endommage :L’épithélium cornéen et la membrane basaleLe stroma cornéen et les kératocytesLes cellules endothéliales
• Données partielles voire contradictoires
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Objectif
• La photoablation par laser UV 193 nm expose les cellules viables, autour de la zone traitée, à des doses sub-ablatives d’un rayonnement constituéde photons de haute énergie (6.4 ev)
0 400 J.m-2150 1800 2500
Zone de photoablationEn chirurgie réfractive
Fluence seuilcette étude
Fréquence 10-20 Hz
Fréquence 5 Hz
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L’absence de p53 augmente la sensibilité à l’irradiation Laser
Cellular Type D37 Laser 193nm
D37 254 nm
H1299 62,1 J. m-2 12,6 J. m-2
RKO 174,5 J. m-2 28,1 J. m-2
p53 statut
absence
Wild type
H1299 : Human non-small lung carcinoma cellsRKO: Human colorectal carcinoma cells
D37 : Dose at which 37% of surviving cells
60 J.m-2
L’absence de p53 induit une réductionde la capacité à former des colonies après irradiation.Observé après UVC 254 nm, corrélé àune diminution des mécanismes de réparation. Smith et al., 2000
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La protéine P53
Stratégies possibles
ou
Réparations
Arrêt du cycle cellulaireG1 ou G2/M
P53
UV, rayonnements ionisants, agents chimiques,LASER ?
•Antisens•inhibiteur (PFT)
Activation non possibleP53
cycle Apoptoseréponse
P53
P53
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Approche expérimentale
t -1
•Mise
en
cultu
re
t 24 h t 48 h t 72h•I
mmun
omar
quag
es•P
rolif
érat
ion c
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•Mar
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se
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•Cyc
le •Pro
lifér
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n ce
llulai
re
•Cyc
le
•Cyc
le/
P53
24 ht 0
•Irr
adiat
ion L
aser
193
nm
(ou
UVC
254
nm)
± Pifithrinecyclique
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La pifithrine : un inhibiteur réversible de p53• La pifithrine est un inhibiteur réversible de la p53. Komarov et al., 1999
• Pifithrin-α permet de démontrer l ’implication de p53 suite à un stress
• Gammes utilisées : 10-50 µM
• Forme cyclique utilisée plus stable
• Dans notre étude : Non toxique pour les cellules(WST-1 et BrdU)
•Pifithrin cyclique2-(4-methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-
tetrahydrobenzothiazole,HBrCalbiochem
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Activation de la P53 après irradiation Laser 1/2
0
10
20
30
40
0 60
Irradiation Laser (J/m²)
% P
53
KHKH+PFT
Marquage P53 24 heures après irradiation Laser (n=500)
Non irradiées
Laser 60 J. m-2
Ac: Anti p53 DO7Gift from E. May
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Non irradiées avec ou sans
PFT
Activation de la P53 après irradiation Laser 2/2
60J/m²
Marquage P5372 heures après irradiation Laser
Protocole selon Bassi et al., 2002
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
6h 24h 48h 72h
% n
oyau
x m
arqu
és P
53 non irradiées60 J.m-2
Cinétique d’expression de p53 après irradiation LaserImmunofluorescence
300<Nb noyaux analysés<1000Mesure de l’activation par cytométrie de flux
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L’irradiation Laser entraîne une augmentation des phases S et G2
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 0+PFT 60 60+PFT
Irradiation Laser (J/m²)
G2/MSG0/G1
Pourcentage des différentes phases du cycle cellulaire des kératocytes humains 72h
après irradiation Laser
Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150
Num
ber
020
040
060
0
Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150
Num
ber
090
180
270
360
DebrisAggregatApoptosisDip G1Dip G2Dip S
60 J/m²Non irradié
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L’irradiation Laser à 193 nm déclenche la mort cellulaireMarquage TUNEL
24 heures après irradiation Laser (n=500)
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Cytotoxicité du rayonnement Laser : Apoptose
Mockirradiated
C. Chapel
CEA/DSV/DRR
05
1015202530354045
0 0+PFT 60 60+PFT
Irradiation Laser (J/m²)
% s
ubG1
Pourcentage de sub-G1 72h après irradiation LaserCytométrie de flux
Channels (FL3-A)0 30 60 90 120 150
Num
ber
090
180
270
360subG1
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La protéine p21• La protéine p53 se lie avec le promoteur du gène WAF1 / Cip1 (pour Wild Type p53-activated fragment et cdk2 inhibiting protein) codant pour la protéine p21
• La liaison de la protéine p21 aux kinases cdk2, inhibe leur activité et bloque le cycle cellulaire
• Rôles clé dans la croissance et la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN
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Cinétique d’expression de p21 après irradiation Laser
0
5
10
15
20
25
30
35
40
6h 24h 48h 72h
% n
oyau
x m
arqu
és P
21
non irradiées60 J.m-2
Immunofluorescence
Nb noyaux analysés>1000Ac: Anti WAF1 (Ab6)
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ConclusionLASER UV-C 193 nm
Accumulation de P53.Arrêt en phases S et G2/M.Augmentation de l ’apoptose.
Accumulation de P21.
LASER 193 nm + Inhibition de p53
Augmentation plus importante de l’arrêt en phase G2/M.Apoptose plus élevée.Accumulation de P21 autres voies d’activation ?
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193 nmMembrane cellulaire
193 nm193 nm
apoptose
Survie cellulaire
MMP
P21
193 nm
ROS
Photovieillissement
P73, P63*
FASCaspases
TNF-α
193 nm
Dommages de l ’ADN