activación de una infeccion persitrente en dos poblaciones de spodoptera exigua
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Universidad Pública de Navarra Nafarroako Unibertsitate Publikoa ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR NEKAZARITZAKO INGENIARIEN DE INGENIEROS AGRONOMOS GOI MAILAKO ESKOLA TEKNIKOA Activación de infecciones virales persistentes en dos poblaciones de S. exigua inoculadas con baculovirus presentado por EDUARDO VILLAR ZABAL-k aurkeztua
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Universidad Pública de Navarra Nafarroako Unibertsitate Publikoa
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR NEKAZARITZAKO INGENIARIEN
DE INGENIEROS AGRONOMOS GOI MAILAKO ESKOLA TEKNIKOA
Activación de infecciones virales persistentes
en dos poblaciones de
S. exigua inoculadas con baculovirus
presentado por
EDUARDO VILLAR ZABAL-k
aurkeztua
INGENIERO TÉCNICO AGRÍCOLA EN EXPLOTACIONES AGROPECUARIAS
NEKAZARITZAKO INGENIARI TEKNIKOA NEKAZARITZA ETA ABELTZAINTZA
USTIAPENAK BEREZITASUNA
Marzo 2009 / 2009eko martxoak
UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
TRABAJO FIN DE CARRERA DE INGENIERO TÉCNICO
AGRÍCOLA
Trabajo fin de carrera presentado por Eduardo Villar Zabal al objeto de
optar al título de Ingeniero Técnico Agrícola en la especialidad de
Explotaciones Agropecuarias, siendo su tutora y directora Delia Muñoz
Labiano.
VºBº Directora del trabajo: VºBº Tutora del trabajo:
Delia Muñoz Labiano Delia Muñoz Labiano
Autor del trabajo:
Eduardo Villar Zabal
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a Primitivo Caballero por haberme dado la
oportunidad de realizar este trabajo. Pero sobre todo muchas gracias a Delia
Muñoz por su dedicación y disponibilidad constantes.
No puedo olvidarme de todos mis compañeros del laboratorio 10: Sarhay, Iñigo,
Carlos, Elena, Oihane, Leire, Ohiana, Maite.A, Alex, Laura. N, Noelia, Itxaso,
Mª Ángeles, Claudia, Esther, Pili, Laura. P, Guti, Gabriel, Sonia, Alejandro,
Amaia, Isabel, Amaya, Leo y en especial a Maite.E, Ines y Carlos. C por
haberme enseñado y ayudado. Gracias también a todos los compañeros de
ITA que tantos momentos hemos compartido durante estos años, y a mi familia
y amigos por haber estado ahí. A tod@s vosotr@s, muchas gracias.
Índice
ÍNDICE
RESUMEN.......................................................................................................................1
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................2
OBJETIVO:.....................................................................................................................4
MATERIAL Y MÉTODOS...............................................................................................5
Insectos...........................................................................................................................5
Virus.................................................................................................................................5
Titulación de las muestras virales...................................................................................6
Purificación de OBs.........................................................................................................6
Extracción de ADN viral y digestión con endonucleasas................................................7
Bioensayos......................................................................................................................7
RESULTADOS................................................................................................................9
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Almería inoculadas con NPVs a dosis altas..........................................................................................................9
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Almería inoculadas con NPVs a dosis bajas.......................................................................................................10
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Oxford inoculadas con NPVs a dosis altas...................................................................................................................11
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Oxford inoculadas con NPVs a dosis bajas..................................................................................................................12
Comparación entre poblaciones....................................................................................13
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Almería....14
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Almería....15
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Oxford......16
DISCUSIÓN...................................................................................................................17
CONCLUSIONES:........................................................................................................20
BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................................21
Resumen
RESUMEN
Spodoptera exigua es el lepidóptero que causa mayores pérdidas económicas en los
cultivos bajo plástico de Almería. Este fitófago ha desarrollado resistencias a la
mayoría de insecticidas utilizados actualmente para su control, por lo que se estudian
otros métodos que resulten más efectivos y compatibles con los ya desarrollados para
otras plagas que se dan simultaneamente sobre los cultivos. El nucleopoliedrovirus de
Spodoptera exigua (SeMNPV) es un patógeno natural de la plaga que produce
epizootias de forma natural en la zona gracias a su facilidad para transmitirse
horizontalmente. Pero este virus tambien se transmite de forma vertical de unas
generaciones a otras y se encuentra causando infecciones persistentes en distintas
poblaciones de campo y laboratorio por lo que conocer los mecanismos de activación
de los virus persistentes puede llegar a ser una herramienta muy eficaz en la lucha
biológica frente a esta plaga. Este trabajo fin de carrera muestra la posibilidad de
activación de una infección persistente mediante la infección con virus exógenos
homólogos y heterólogos de dos poblaciones de S. exigua a diferentes dosis. Los
resultados indican que dosis tan bajas como 1 OB/larva pueden provocar altas
mortalidades en poblaciones portadoras de virus persistentes y que tanto en dosis
altas como bajas, el virus persistente se activa de forma mucho más rápida, de hasta
tres días, que en las larvas no inoculadas. Los resultados parecen indicar que el
genotipo inoculado influye en el grado de activación del virus, siendo los virus
homólogos genéticamente más próximos los que mayor capacidad de activación
tienen. Estos resultados pueden llegar a tener un interés práctico en el control de
plagas ya que los virus persistentes de una población podrían activarse con
aplicaciones exógenas de virus a dosis mucho menores de las que se aplican hoy día,
resultando en una disminución de los costes de tratamiento.
1
Introducción
INTRODUCCIÓN
El lepidóptero Spodoptera exigua es una especie fitófaga actualmente distribuida por
las zonas tropicales y subtropicales del mundo. Normalmente no puede sobrevivir a las
condiciones invernales de los climas templados, pero sobre cultivo protegido se puede
encontrar durante todo el año. Las larvas de S. exigua se encuentran entre los
fitófagos que mayores perdidas económicas causan en la producción de cultivo bajo
plástico de la provincia de Almería (Belda, 1994). Se trata de un fitófago que ha
desarrollado resistencias contra la mayor parte de los insecticidas químicos utilizados
hasta ahora para su control. Se han descrito resistencias de esta plaga a
organoclorados y piretroides (Belda, 1994), reguladores de crecimiento de los insectos
como el teflubenzuron y hexaflumuron y análogos de la hormona de la muda como el
tebufenocida (Smagghe et al., 1997). Incluso los productos más recientes (Spinosad,
abemectina, cipermetrina, azadiractina, etc) ven disminuída su eficiencia tras su
utilización reiterada durante una sola campaña. El control biológico de esta plaga es
también muy deseable porque permitiría el uso de enemigos naturales para el control
de otras plagas presentes de forma simultánea en la región.
Por todo esto ha surgido la necesidad de disminuir las aplicaciones de productos
químicos, lo que ha potenciado el uso de plaguicidas biológicos, entre los que se
encuentran los baculovirus. Estos patogenos exclusivos de artropodos poseen, entre
otras características insecticidas, una elevada patogenicidad y virulencia, son
compatibles con otros agentes de lucha, y su aplicación resulta sencilla y familiar para
los agricultores (Moscardi, 1999).
La familia Baculoviridae es la más numerosa y ampliamente estudiada de todas las
que afectan a insectos y morfológicamente comprende dos grupos:
nucleopolyhedrovirus (NPVs) y granulovirus (GVs) (Blissard et al., 2000).
Estructuralmente, los baculovirus están formados por un genoma constituido por una
doble cadena de ADN de un tamaño de entre 80-180 Kb rodeado de una cápsida de
naturaleza proteica con la que forma las nucleocápsidas, que a su vez se encuentran
rodeadas por una membrana lipoprotéica formando los viriones (ODVs: virus derivados
del cuerpo de inclusión) (Federeci, 1986). Los viriones de los baculovirus se
encuentran característicamente incluidos en una matriz proteica denominada cuerpo
de inclusión (oclussion body, OB) (Wood et al., 1993), que los hace estables durante
largos periodos de tiempo en el medio ambiente (Jacques, 1985).
2
Introducción
Los baculovirus se transmiten entre sus huéspedes horizontalmente por via oral, por lo
que necesitan ser ingeridos para iniciar el ciclo de infección y, por lo tanto, estar
presentes (OBs) en el alimento de la larva (Granados y Williams 1986). Sin embargo,
existe otro mecanismo de transmisión, que se da entre las distintas generaciones de
huéspedes (de adultos infectados a su progenie) y se conoce como transmisión
vertical. Aunque menos conocido, se sabe que se establece por varias vías:
contaminación externa de los huevos (Murray y Elkinton,1989), contaminación intra
ovo (Evans, 1986) o por una infección persistente (Cory y Myers, 2003). En las
infecciones persistentes el virus puede estar latente, integrado dentro del genoma
celular en insectos como Bombyx mori, o replicándose a niveles bajos, subletales, sin
causar mortalidad (Khurad et al., 2004). En ambas situaciones es capaz de
transmitirse a la descendencia (Kok et al.1983, Ilyinykh and Ulýanova, 2005) y
activarse ante situaciones de estrés tales como cambios de temperatura o humedad
relativa, cambios en la dieta, estrés químico, altas densidades poblacionales del
huésped o también por una infección con otro virus (Podwaite y Mazzone, 1986;
Guimares et al., 1998; Fuxa et al., 1999). La importancia de la transmisión vertical de
los NPVs reside en asegurar la persistencia de éstos en el medio. Situaciones de baja
densidad poblacional, o la degradación de los OBs por la luz ultravioleta son factores
limitantes de los bioinsecticidas que pueden superarse gracias a las infecciones
persistentes. Se ha descrito la existencia de transmisión vertical en especies tales
como Helicoverpa armigera (Zhou et al., 2005), Spodoptera frugiperda, (Fuxa y
Richter, 1991; Fuxa et al., 2002) o Spodoptera littoralis (Abul-Nasr et al., 1979), y más
recientemente en Spodoptera exigua (Ibáñez 2008). La activación controlada de
infecciones persistentes podría llegar a suponer una importante herramienta para el
control de plagas, pero antes deben conocerse muy bien los mecanismos que
gobiernan su activación.
3
Objetivo
OBJETIVO:
El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto activador de los virus persistentes
en dos poblaciones de S. exigua originarias de Oxford y Almería con virus exógenos
homólogos y heterólogos a diferentes dosis.
4
Material y métodos
MATERIAL Y MÉTODOS
Insectos
Las poblaciónes de S. exigua fueron criadas en condiciones de 25-26 ºC, 50-55% de
humedad relativa y fotoperiodo de 16 horas de luz y ocho de oscuridad en el
Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra. El estado
larvario fue alimentado con una dieta artificial semisintética (cuadro 1) y el adulto con
miel diluida al 30% (p/v)
Cuadro 1: Composición de la dieta semisintética empleada para la cría de larvas de S. exigua.
Ingrediente gr/litro Ingrediente gr/litro
Germen de trigo 72 Carragenina 18,75
Proteína de soja 25 Ácido sórbico 1,5
Azúcar comercial 29,25 Ácido benzoico 0,375
Levadura de cerveza 14,25 Vitaminas y Antibióticos 4,37
Mezcla de sales Wesson 9,4 Cloruro de colina 0,94
Colesterol 0,94 Agua destilada 0,7 l
Nipagina 0,94
Virus
Los virus homólogos del NPV múltiple de S. exigua (SeMNPV) utilizados en los
bioensayos fueron: 1) la materia activa del producto comercial Virex (Biocolor, Almería,
España), 2) la materia activa del producto comercial Spexit (Andermatt Biocontrol AG,
Stahlermatten, Suiza), 3) la cepa viral SeMNPV-NIC (SeNIC), aislada a partir de
cadáveres larvarios de S. exigua encontrados en campo en Nicaragua (Echeverz,
2008) y 4) la cepa viral SeMNPV-SP2 (SeSP2), aislada durante una epizootia en
invernaderos de El Ejido (Almería, España) en 1990 (Caballero et al., 1992).
Los virus heterólogos utilizados fueron dos: 1) la cepa del NPV simple (SNPV) de
Chrysodeixis chalcites aislada en Canarias (ChchMNPV-SP2 o ChchSP2) (Bernal et
al., 2008) y 2) la cepa del NPV de S. frugiperda aislada en Nicaragua (SfMNPV-NIC o
SfNIC) a partir de cadáveres larvarios recogidos en campo. S exigua es una especie
semi-permisiva y no permisiva para SfMNPV y ChchNPV, respectivamente.
5
Material y métodos
Los aislados de los diferentes virus fueron multiplicados in vivo en el laboratorio en
larvas de cuarto estadio de las especies permisivas (S. exigua, S. frugiperda y C.
chalcites) a las que se les administró una dosis de 108 OBs/ml.
Titulación de las muestras virales
El conteo de OBs en suspensión acuosa se realizó sobre una cámara Neubauer
Improved de 0,1 mm de profundidad con un microscopio óptico de contraste de fases
de 400x. La concentración de la muestra se determinó aplicando la expresión:
N = 5 x n x D x 10-4
Donde:
N = OBs por ml de suspensión viral
n = número medio de poliedros contados
D = factor de dilución
Figura 1: Esquema de las características de la cámara de conteo Neubauer con detalle del
campo de visión de una célula donde se señalan en sombreado los cuadros
seleccionados para realizar los conteos.
Purificación de OBs
Los cadáveres de las larvas infectadas se recogieron individualmente, se
homogeneizaron con aproximadamente 1 vol. de 0,1% SDS y se trituraron con la
ayuda de una lanza para la liberación de los OBs. Las suspensiones obtenidas fueron
filtradas a través de una tela de muselina para eliminar los restos de tegumento y
centrifugadas a 2500 g durante 5 min. Tras desechar el sobrenadante, el sedimento se
resuspendió en 1 ml de 0,1% SDS y se volvió a centrifugar en igualdad de
condiciones. Los restos de SDS se lavaron con agua bidestilada. Finalmente el
sedimento se resuspendió en agua bidestilada estéril de tal manera que este
supusiese 1/3 del volumen total y se almacenó a 4ºC hasta su utilización.
6
Material y métodos
Extracción de ADN viral y digestión con endonucleasas
La extracción del ADN se llevo a cabo a partir de OBs purificados, a los que se les
añadió 1 vol. de una solución alcalina (0,5 M Na2CO3, 0,5 vo.l de 10% SDS) y 2,5 vol.
de agua destilada estéril, y se incubó durante 10 min a 60ºC. Esta solución permite la
ruptura de la matriz proteica de los OBs y la liberación de los viriones al medio. A
continuación se sedimentaron los restos de poliedrina mediante centrifugación durante
5 min. a 5900 g y el sobrenadante, conteniendo los viriones, se incubo con 500 g/ml
de proteinasa K durante 45 min. a 50ºC para romper las envolturas de los viriones.
Posteriormente el ADN se extrajo por fenolización mediante dos pases: el primero con
fenol y el segundo con cloroformo. En cada uno de los pases se agitó la mezcla
suavemente para homogeneizarla y se centrífugo a 15,700 g durante 5 min,
recuperando la fase acuosa. El ADN se precipitó añadiendo 1/10 vol de NaAc 3M (pH
5.2) y 2 vol. de etanol 96% frío, y se centrífugo a 5900 g durante 10 min, se lavó con
etanol 70% y se centrífugo 5 min. a 5900 g. Tras eliminar el sobrenadante el ADN se
resupendió en 50 l de TE al 0,1%.
El ADN se digirió con las endonucleasas de restricción BglII y PstI durante 4-24 h a
37ºC utilizando los tampones de digestión recomendados por el proveedor. (Takara
Bio INC. Otsu Shiga, Japón). Los fragmentos resultantes se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% en tampón de TAE (40M Tris-acetato;
1mM EDTA, pH 8.0) a 16 V durante aproximadamente 16 h.
Posteriormente el gel se tiño en bromuro de etidio para la observación de los
fragmentos de ADN y se fotografió utilizando el programa informático Chemi-doc
(BioRad, Madrid, España).
Bioensayos
Activación del virus latente
Para determinar la influencia de la dosis viral en la activación del virus latente se
inocularon grupos de 30 larvas con cada uno de los siguientes aislados de NPVs:
SeSP2, SeNIC, Virex, Spexit, ChchNPV y SfNIC. S. exigua es permisiva al SeMNPV,
semipermisiva a SfMNPV y no permisiva a ChchNPV.
Se inocularon dos grupos de larvas de cada virus, uno con una dosis alta y otro con
una dosis baja de acuerdo a experiencias previas con cada una de las especies y sus
virus homólogos (Cuadro 2). El método de inoculación fue una adaptación del método
7
Material y métodos
de la gota de Hughes & Wood (1981) basado en la infección per os de larvas de cuarto
estadio (entre 0 y 12 horas después de la muda) mantenidas en hambre a 25ºC
durante unas 12 horas previas a la infección, permitiéndoles posteriormente ingerir ad
libitum una suspensión acuosa compuesta por 10% de sacarosa, 0,001% de fluorella
blue y OBs a la concentración deseada. La solución acuosa de las distintas
concentraciones virales se deposito en forma de pequeñas gotitas en el fondo de
placas Petri de 90 mm de diámetro donde previamente se habían colocado 15 larvas.
Transcurrido un periodo de 10 min, las larvas cuyo tubo digestivo estaba totalmente
coloreado de azul, se dispusieron individualmente en vasos de unos 30 cm3 con dieta
artificial y se mantuvieron a 26ºC, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad. Los datos de mortalidad se registraron cada 24 h y se realizó un análisis
REN de 5 larvas de cada dosis para identificar el virus causante de la muerte.
Se llevaron a cabo varias repeticiones independientes del bioensayo empleando un
total de 30 larvas por repetición para cada dosis de inóculo. Igualmente un grupo de 30
larvas por repetición se alimento de una suspensión libre de OBs y se utilizó como
testigo negativo. Los registros de mortalidad se realizaron cada 24 horas comprobando
la causa de la muerte de las larvas por la sintomatología típica de la enfermedad o, en
caso de duda, en el microscopio óptico de contraste de fases a 400x.
Cuadro 2: Dosis virales empleadas de cada uno de los aislados para la infección de larvas L4
de S. exigua.
VIRUSDOSIS (OBs/larva)
Alta Baja
Se-SP2
10000 1VIREXSPEXITSe-NIC
ChchSP2 10000 1
SfNIC 100000 100
8
Discusión
RESULTADOS
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Almería inoculadas
con NPVs a dosis altas
Todos los tratamientos virales causaron una mortalidad significativamente mayor que
la del testigo, observándose cuatro niveles de significación (p=0.0038; g=6) (Fig. 1a).
La mayor mortalidad fue producida por los virus homólogos, SeSP2, Virex y Spexit,
(96-100%), a continuación por el virus homólogo SeNIC (70%), y los menores niveles
de mortalidad se obtuvieron de las larvas inoculadas con los virus heterólogos SfNIC
(56%) y ChchSP2 (31%), para los que S. exigua es semipermisiva y no permisiva,
respectivamente.
La distribución en el tiempo (días posteriores a la infección o dpis) de la mortalidad
acumulada de las larvas se calculó respecto al total de larvas muertas en cada
tratamiento (Fig. 1b). Estos datos indicaron que todos los tratamientos virales, excepto
el de ChchSP2, indujeron la muerte de las larvas varios días antes que el testigo. Por
ejemplo, el 50% de mortalidad se supera a los cinco dpis en los tratamientos con
SeSP2, Virex, Spexit y SfNIC, a los seis dpis en el tratamiento con SeNIC y SfNIC, y
dos o un día más tarde, respectivamente (a los siete dpis) en los testigos y ChchSP2.
Figura 1: Porcentajes de mortalidad total y sus correspondientes errores estándar de larvas L4
de S.exigua de Almería inoculadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, ChchSP2 y SfNIC a dosis altas (a) y distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada respecto al total de larvas muertas con los mismos tratamientos (b).
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Discusión
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Almería inoculadas
con NPVs a dosis bajas
Todos los tratamientos excepto el del virus heterólogo ChchSP2, produjeron
mortalidades significativamente mayores que la del testigo, observándose tres niveles
de significación (p=0.0007; g=6) (Fig. 2a). La mayor mortalidad se registró en los
tratamientos con SeSP2, Virex y Spexit (39-44%), después con SeNIC (28%), y por
último con SfNIC (23%).
La distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada (Fig. 2b) mostró que en los
tratamientos con los virus homólogos Virex y SeSP2 la mortalidad de más del 50% de
las larvas se alcanzó a los seis dpis. En el resto de tratamientos virales y en el testigo,
se superó el 50% de mortalidad un día más tarde (a los siete dpis).
Figura 2: Porcentajes de mortalidad total y sus correspondientes errores estándar de larvas L4
de S.exigua de Almería inoculadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, ChchSP2 y SfNIC a dosis bajas (a) y distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada respecto al total de larvas muertas con los mismos tratamientos (b).
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Testigo
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b
dpis
50
10
Discusión
Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Oxford inoculadas con
NPVs a dosis altas
Todos los tratamientos virales causaron una mortalidad significativamente mayor que
la del testigo, observándose cuatro niveles de significación (p=0.0061; g=6) (Fig.3a).
La mayor mortalidad fue producida por los virus homólogos, SeSP2, Virex y Spexit
(98-100%), después por SeNIC (79%), y por último por SfNIC (66%) y ChchSP2
(45%).
La distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada indicó que todos los
tratamientos virales, excepto el del virus heterólogo ChchSP2, indujeron la muerte
varios días antes que el testigo (Fig. 3b). Por ejemplo, el 50% de mortalidad se supera
a los cuatro dpis en los tratamientos con SeSP2, Virex y Spexit y a los seis dpis con
SeNIC y SfNIC. En las larvas tratadas con ChchSP2 y en el testigo, el 50% de
mortalidad se superó un día más tarde, a los siete dpis.
Figura 3: Porcentajes de mortalidad total y sus correspondientes errores estándar de larvas L4
de S.exigua de Oxford inoculadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, ChchSP2 y SfNIC a dosis
b
17e
31d
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TestigoSeSP2VirexSpexitSeNICSfNICChchSP2
11
Discusión
altas (a) y distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada respecto al total de larvas muertas con los mismos tratamientos (b).Activación de virus persistentes en larvas de S. exigua de Oxford inoculadas con
NPVs a dosis bajas
Todos los tratamientos excepto el del virus heterólogo ChchSP2, produjeron
mortalidades significativamente mayores que la del testigo, observándose tres niveles
de significación (p=0.002: g=6) (Fig. 4a). La mayor mortalidad se registró en los
tratamientos con SeSP2, Virex y Spexit (45-51%), después con SeNIC (36%) y SfNIC
(36%) y por ultimo con ChchSP2 (29%) y el control (28%).
La distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada mostró que en los
tratamientos con los virus homólogos SeSP2, Spexit y Virex la mortalidad de más del
50% de las larvas se alcanzó a los seis dpis. En el resto de tratamientos virales y en el
testigo, se superó el 50% de mortalidad un día más tarde a los siete dpis (Fig. 4b).
Figura 4: Porcentajes de mortalidad total y sus correspondientes errores estándar de larvas L4
de S.exigua de Oxford inoculadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, ChchSP2 y SfNIC a dosis
0
20
40
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Testigo
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Testigo
SeSP2
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Testigo
SeSP2
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Test
igo
Mor
talid
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%)
12
Discusión
bajas (a) y distribución en el tiempo de la mortalidad acumulada respescto al total de larvas muertas con los mismos tratamientos (b)
13
Discusión
Comparación entre poblaciones
El porcentaje de mortalidad producido por cada inóculo en las dos poblaciones es
estadísticamente igual tanto en las dosis altas de SeSP2, Virex y Spexit como en las
dosis bajas de Virex y Spexit (Fig. 5). En el resto de tratamientos la mortalidad es
significativamente mayor en la población de Oxford que en la de Almería, incluyendo
las larvas testigo (Fig. 5)
Figura 5: Porcentajes de mortalidad total y sus correspondientes errores estándar de larvas L4
de S. exigua de Almería y Oxford inoculadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, SfNIC, y ChchSP2 a dosis altas (a) y bajas (b).
a
b
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Tratamiento
Mo
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d(%
)
Oxford
Almería
14
Discusión
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Almería
Los ADNs virales extraídos de las larvas infectadas con SeSP2, Virex, Spexit, SfNIC y
ChchSP2 con dosis altas mostraron los perfiles REN de la Fig. 6. Las cepas virales
que se replicaron mayoritariamente son las mismas que las cepas inoculadas en el
caso de los virus homólogos, con excepción de SeNIC. En las larvas inoculadas con
SeNIC se obtuvieron perfiles idénticos al SeSP2. Por otra parte las larvas inoculadas
con virus heterólogos y los testigos negativos muestran perfiles similares idénticos a la
cepa SeSP2, que es la que se encuentra de forma persistente en la población.
Figura 6: Perfiles REN con BglII del ADN viral extraído de larvas infectadas con SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, SfNIC y ChchSP2 a dosis de 10.000 OBs/L4. El carril de la derecha de la fotografía corresponden al marcador de peso molecular 1Kb ladder (M).Cada carril viene encabezado por el virus que le fue inoculado a cada una de las larvas, entre paréntesis se indica la cepa de SeMNPV formando la materia activa de los formulados Virex y Spexit y el número indica el día post infección en el que murió la larva. En la parte inferior de cada carril se señala la cepa viral que se ha replicado de forma dominante. Las flechas rojas señalan los fragmentos marcadores y los asteriscos verdes la ausencia de banda respecto a éstos.
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SeSP2
SeSP2
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SeUS1
SeSP2
SeSP2
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15
Discusión
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Almería
Los perfiles REN obtenidos de larvas infectadas con SeSP2, Virex, ChchSP2 y SfNIC
a dosis bajas se muestran en la Fig. 7. Las cepas que se replican mayoritariamente en
larvas inoculadas con Spexit, SeNIC, SfNIC y ChchSP2 son diferentes a los de las
variantes inoculadas: SeUS2 en larvas inoculadas con Spexit y SeSP2 en el resto.
Esta última es la misma cepa que está provocando una infección persistente en la
población del huésped, como lo indican los perfiles obtenidos de las larvas testigo.
SeUS2 también se ha descrito como causante de una infección persistente en un
pequeño porcentaje de adultos capturados en campo en Almería (Cabodevilla, 2008).
Figura 7: Perfiles REN con BglII del ADN viral extraído de larvas infectadas con, SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, SfNIC y ChchSP2 a dosis 1 OBs/L4 y control negativo. El carril de la derecha de la fotografía corresponden al marcador de peso molecular 1Kb ladder (M). Cada carril viene encabezado por el virus que le fue inoculado a cada una de las larvas, entre paréntesis se indica la cepa de SeMNPV formando la materia activa de los formulados Virex y Spexit y el número indica el día post infección en el que murió la larva. En la parte inferior, se señala la cepa viral que se ha replicado de forma dominante. Las flechas rojas señalan los fragmentos marcadores y los asteriscos verdes la ausencia de banda respecto a éstos.
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16
Discusión
Identificación de las cepas virales resultantes de la infección de larvas de Oxford
Como ocurre con la población de Almería, las cepas virales que se replican
mayoritariamente en las larvas inoculadas con virus homólogos a dosis altas son
idénticas a los de las cepas que se inocularon. De las larvas inoculadas con SeNIC se
obtienen perfiles REN diferentes al inoculado e idénticos al de la cepa persistente y lo
mismo ocurre con los virus heterólogos (Fig. 8). La cepa de SeMNPV que se replica en
larvas inoculadas con todos los virus a dosis bajas, así como en los controles
negativos es SeSP2.
Figura 8: Perfiles REN con BglII del ADN viral extraído de larvas infectadas con, SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC, SfNIC y ChchSP2 a dosis 1 OBs/L4. El carril de la derecha de la fotografía corresponden al marcador de peso molecular 1Kb ladder (M). Cada carril viene encabezado por el virus que le fue inoculado a cada una de las larvas y entre paréntesis se indica la cepa de SeMNPV formando la materia activa de los formulados Virex y Spexit. El número indica el día post infección en el que murió la larva. En la parte inferior, se señala la cepa viral que se ha replicado de forma dominante. Las flechas rojas señalan los fragmentos marcadores.
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17
Discusión
Discusión
La activación de un virus persistente se puede deber, entre otros factores, a
infecciones exógenas producidas por otros baculovirus (Burden et al., 2003; Echeverz,
2008; Hughes et al., 1993; Kouassi et al., 2009). Este trabajo se planteo sobre la
hipótesis de que distintos genotipos virales, inoculados exógenamente en larvas con
infecciones persistentes de SeMNPV, tienen diferente capacidad para activar el virus
persistente y que la dosis empleada también influye en el nivel de activación del virus.
Para comprobar la hipótesis planteada, en este trabajo se trataron dos poblaciones
diferentes de larvas de S. exigua, con dos dosis diferentes, alta y baja, de los virus
homólogos SeSP2, Virex, Spexit, SeNIC y de dos virus heterólogos, ChchSP2 y
SfNIC, para los que S. exigua es no permisiva y semi permisiva, respectivamente. No
se observaron diferencias significativas en los porcentajes de mortalidad que se dan
en las dos poblaciones de S. exigua ni en cuanto al tiempo de mortalidad. Además las
cepas que se replicaron mayoritariamente en ambos casos con dosis altas de virus
heterólogos y con dosis bajas de todos los virus fueron similares al SeSP2 o alguna de
sus variantes genotípicas, que son las que causan las infecciones persistentes en
estas poblaciones.
Con las dosis altas, se replicó el virus inoculado en el tratamiento con Spexit, como
ocurrió en el estudio de Echeverz (2008), realizado con idéntico diseño experimental
en la población de Oxford. En el caso del SeNIC no ocurre lo mismo, ya que la cepa
viral que se replica tiene un perfil REN distinto al del virus inoculado. Este virus
ocasionó porcentajes de mortalidad intermedios entre los producidos por los virus
homólogos y heterólogos. Este resultado es algo distinto al obtenido en el trabajo de
Echeverz (2008), en el que la mortalidad de las larvas de Oxford inoculadas con
SeNIC fue significativamente mayor y el virus resultante fue una mezcla de genotipos
de SeSP2 y SeNIC. Estas diferencias pueden deberse a: i) a una mala replicación in
vivo en larvas de S. exigua con infección persistente, ii) a la mala conservación de la
muestra con la que se realizaron los bioensayos.
En los tratamientos con Virex y SeSP2, se replican principalmente dos variantes
genotípicas de SeMNPV, SeSP2-A y SeSP2-B, presentes de manera mayoritaria en la
cepa de SeSP2 (Muñoz et al., 1999; Murillo et al., 2006). Por último en las larvas
inoculadas con los virus heterólogos, únicamente se detecta replicación de la cepa
18
Discusión
SeSP2 que es la cepa que origina la infección persistente y que muestra una alta
incidencia como virus persistente en adultos tanto de la población de S. exigua criada
en la UPNA proveniente de Oxford (Ibáñez, 2008) como en poblaciones de campo (O.
Cabodevilla, 2008) o en muestras de suelo de Almería (Murillo, 2007). En el trabajo de
Echeverz (2008) se obtuvieron los mismos datos, aunque la carga viral utilizada en
este estudio fue mayor.
A dosis bajas se manifestó una infección franca en todos los tratamientos,
obteniéndose en todos ellos la cepa SeSP2, lo que indica que dosis tan bajas como 1
OB/larva son capaces de activar la infección persistente en estas dos poblaciones de
S. exigua. Echeverz (2008) también obtuvo replicación de la cepa viral SeSP2 en
todos los tratamientos con virus homólogos y heterólogos.
Las infecciones persistentes se han descrito en diferentes especies de lepidópteros.
En Bombyx mori se ha comprobado que el virus puede estar latente, integrado en el
genoma celular y es capaz de transmitirse a la descendencia (Kok et al.1983, Ilyinykh
and Ulýanova, 2005), siendo los últimos estadios larvarios los que mayoritariamente
presentaron la infección persistente (Ilyinykh et al., 2004; Karpov., 1979). En una
población de laboratorio de Mamestra brassicae (Hughes et al.1993), se activó una
infección persistente mediante inoculación con una dosis baja de dos baculovirus, el
NPV de Pannolis flamea, infectiva para M. brassicae y un virus heterólogo AcMNPV.
Lo mismo ocurrió en poblaciones de campo de M. brassicae, recolectadas en
diferentes zonas de Gran Bretaña, y que fueron criadas después en laboratorio e
infectadas con dos baculovirus heterólogos, PfNPV-4 y AcNPV-C6 (Burden et al.,
2003). En estos dos ensayos el virus que se activo fue el NPV de M. brassicae
(MbMNPV) y aunque en el testigo negativo también hubo una mortalidad causada por
el MbNPV, ésta fue significativamente menor que en las larvas tratadas. Más
recientemente se ha comprobado la prevalencia de una infección persistente en una
población de laboratorio de Spodoptera litura y en ejemplares silvestres recolectados
en diferentes lugares de Kagoshima (Kovassi et al., 2009)
En este estudio se demuestra también que tanto en dosis altas como bajas, el virus
persistente se activa de forma mucho más rápida en larvas inoculadas con virus,
aunque éste sea heterólogo, que en las larvas no inoculadas con virus, en las que la
19
Discusión
mortalidad se retrasa hasta en tres días, al igual que en las experiencias de Echeverz
(2008).
La activación del virus persistente por medio de virus heterólogos o por dosis
subletales de virus homólogos que no causarían mortalidad en poblaciones sanas, es
muy interesante desde el punto de vista agronómico en general y en el control de
plagas en particular. Los virus persistentes de una población podrían activarse con
aplicaciones de virus a dosis menores a las que se están aplicando hoy en campo, de
alrededor de 5 x 108 OBs/Ha (Lasa et al., 2007) lo cual podría reducir
considerablemente los costes del tratamiento.
En conclusión, los resultados parecen indicar que el genotipo inoculado influye en el
grado de activación del virus, siendo los virus homólogos los que mayor capacidad de
activación tienen y dentro de estos, los virus cuyos genotipos son más parecidos al
virus persistente. Determinar con mayor precisión la influencia del genotipo viral
inoculado en el poder de activación del virus persistente tanto en laboratorio como en
campo sería muy interesante para su aplicación en control biológico. Asimismo sería
conveniente estudiar más profundamente la influencia de distintos inóculos sobre el
genotipo que más se replica. En aislados silvestres se produce la coexistencia de
diferentes genotipos virales (Caballero et al., 1992, Hara et al., 1995, Muñoz et al.,
1998) que juegan un papel fundamental en la transmisibilidad del virus (López-Ferber
et al., Simon et al., 2005) y que también podrían coexistir como persistentes en una
población del huésped.
Los resultados de este trabajo se verían reforzados con estudios adicionales en una
población de S. exigua que llevara una cepa distinta de SeMNPV. Por último trabajar
con controles adecuados consistentes en una población libre de virus a la que se le
podría inducir una infección persistente, permitiría realizar conclusiones más sólidas.
20
Conclusiones
CONCLUSIONES:
Los virus homólogos genéticamente más próximos activan la infección
persistente en un grado significativamente mayor que los virus homólogos de
genotipos menos cercanos o que los virus heterólogos, lo que sugire la
importancia de conocer los genotipos persistentes presentes en las
poblaciones de campo de cara a utilizar virus homólogos de genotipo idéntico o
similar como agentes de control.
La activación del virus persistente en larvas L4 es posible con dosis tan
pequeñas como 1 OB/larva con virus homólogos y de 1-100 OB/larva con virus
heterólogos. Dosis tan pequeñas aplicadas en campo permitirían disminuir
considerablemente los costes de los tratamientos con bioinsecticidas basados
en SeMNPV.
La activación del virus persistente mediante inoculación por virus exógenos se
adelanta varios días respecto a la activación del virus en larvas no inoculadas,
por lo que activar los virus persistentes presentes en poblaciones de campo
mediante virus exógenos podría reducir la cantidad de daños.
Las dos poblaciones de S. exigua de Oxford y Almería han sido igual de
susceptibles a la activación de la infección persistente, probablemente porque
albergan la misma cepa de virus persistente.
21
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