7/27/2019 Acid Biliar

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M O L E C U L A R A N D C E L L U L A R B I O L O G Y , A p r . 1 9 9 4 , p . 2 8 0 9 - 2 8 2 1 V o l . 1 4 , N o . 40 2 7 0 - 7 3 0 6 / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t 1 9 9 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

C h o l e s t e r o l a n d B i l e A c i d s R e g u l a t e C h o l e s t e r o l 7 a o - H y d r o x y l a s eE x p r e s s i o n a t t h e T r a n s c r i p t i o n a l L e v e l i n C u l t u r ea n d i n T r a n s g e n i c M i c eMARIA I . RAMIREZ, DENISE KARAOGLU, DIEGO HARO,t CARMEN B A R I L L A S ,ROYA BASHIRZADEH, AND GREGORIO G I L *

D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t sM e d i c a l S c h o o l , W o r c e s t e r , M a s s a c h u s e t t s 0 1 6 5 5R e c e i v e d 1 0 N o v e m b e r 1 9 9 3 / R e t u r n e d f o r m o d i f i c a t i o n 1 4 J a n u a r y 1 9 9 4 / A c c e p t e d 2 4 J a n u a r y 1 9 9 4

C h o l e s t e r o l 7 a - h y d r o x y l a s e ( 7 a - h y d r o x y l a s e ) i s t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e i n b i l e a c i d b i o s y n t h e s i s . I t i ss u b j e c t t o a f e e d b a c k c o n t r o l , w h e r e b y h i g h l e v e l s o f b i l e a c i d s s u p p r e s s i t s a c t i v i t y , a n d c h o l e s t e r o l e x e r t s ap o s i t i v e c o n t r o l . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l p l a y s a m a j o r p a r t i n t h a t r e g u l a t i o n .We h a v e s t u d i e d t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h c h o l e s t e r o l a n d b i l e a c i d s r e g u l a t e e x p r e s s i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s eg e n e a n d f o u n d i t t o b e s o l e l y a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l b y u s i n g t w o d i f f e r e n t a p p r o a c h e s . F i r s t , u s i n g a t i s s u ec u l t u r e s y s t e m , we l o c a l i z e d a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r l o c a t e d 7 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o ns i t e . We a l s o s h o w e d t h a t l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n m e d i a t e s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f c h i m e r i c g e n e s ,c o n t a i n i n g e i t h e r t h e 7 a - h y d r o x y l a s e o r t h e a l b u m i n e n h a n c e r i n f r o n t o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e p r o x i m a lp r o m o t e r , t o t h e same e x t e n t a s t h e i n v i v o c h o l e s t e r o l - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f 7 a - h y d r o x y l a s e mRNA. I n as e c o n d a p p r o a c h , u s i n g t r a n s g e n i c m i c e , we h a v e f o u n d t h a t e x p r e s s i o n o f an a l b u m i n e n h a n c e r - 7 a -h y d r o x y l a s e - I a c Z f u s i o n g e n e i s r e s t r i c t e d t o t h e l i v e r a n d i s r e g u l a t e d b y c h o l e s t e r o l a n d b i l e a c i d s i n a mannerq u a n t i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h a t o f t h e e n d o g e n o u s g e n e . We a l s o f o u n d , t h a t a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r i s n e c e s s a r yf o r e x p r e s s i o n o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e , i n a g r e e m e n t w i t h t h e t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s . T o g e t h e r , t h e s er e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e s t e r o l a n d b i l e a c i d s r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e s o l e l ya t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l .

C h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i s i s m a i n t a i n e d t h r o u g h t h e r e g u l a -t i o n o f t h r e e m e t a b o l i c p a t h w a y s . Two p a t h w a y s f u n c t i o n i nt h e s u p p l y o f c h o l e s t e r o l t o c e l l s . T h e s e i n c l u d e a n e n d o g e n o u sb i o s y n t h e t i c p a t h w a y i n w h i c h c h o l e s t e r o l i s s y n t h e s i z e d f r o ma c e t a t e p r e c u r s o r s a n d a n e x o g e n o u s p a t h w a y i n w h i c h t h el o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( L D L ) r e c e p t o r i n t e r n a l i z e s c h o l e s t e r -o l - c a r r y i n g l i p o p r o t e i n p a r t i c l e s f r o m t h e b l o o d ( 2 0 ) . A t h i r dp a t h w a y f u n c t i o n s i n t h e c a t a b o l i s m o f c h o l e s t e r o l a n d i n v o l v e si t s c o n v e r s i o n t o b i l e a c i d s . I m p r o p e r r e g u l a t i o n o f t h i s p a t h -way h a s p a t h o l o g i c a l i m p l i c a t i o n s b e c a u s e t h e m a j o r p a t h w a yf o r t h e c a t a b o l i s m a n d e x c r e t i o n o f c h o l e s t e r o l i n mammals i st h e f o r m a t i o n o f b i l e a c i d s . T h e r a t e o f e l i m i n a t i o n o f c h o l e s -t e r o l i s a c r i t i c a l f a c t o r i n d i s e a s e s s u c h a s a t h e r o s c l e r o s i s ,g a l l s t o n e d i s e a s e , a n d some l i p i d s t o r a g e d i s e a s e s ( 5 , 1 1 , 1 3 ) .T h e i n i t i a l a n d r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h i s p a t h w a y i s t h e h y d r o x y -l a t i o n o f c h o l e s t e r o l a t p o s i t i o n 7 a n d i s c a t a l y z e d b y t h ee n z y m e c h o l e s t e r o l 7 a - h y d r o x y l a s e ( 7 o a - h y d r o x y l a s e ) ( c h o l e s -t e r o l 7 a - m o n o o x y g e n a s e ; EC 1 . 1 4 . 1 3 . 1 7 ) , a m i c r o s o m a l c y t o -c h r o m e P 4 5 0 ( 3 5 ) . T h i s e n z y m e i s s u b j e c t t o a f e e d b a c kc o n t r o l , w h e r e b y h i g h l e v e l s o f b i l e a c i d s r e t u r n i n g t o t h e l i v e rv i a t h e e n t e r o h e p a t i c c i r c u l a t i o n s u p p r e s s i t s a c t i v i t y . C h o l e s -t e r o l , t h e s u b s t r a t e o f t h e e n z y m e , e x e r t s a p o s i t i v e c o n t r o l .T h e r a t a n d human 7 o t - h y d r o x y l a s e cDNAs h a v e b e e ni s o l a t e d b y s e v e r a l g r o u p s ( 7 , 2 6 , 3 0 , 3 7 , 3 8 ) . T h e a v a i l a b i l i t y o ft h e s e m o l e c u l a r p r o b e s h a s f a c i l i t a t e d s t u d i e s d i r e c t e d t o w a r d s

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . M a i l i n g a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m -i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t s M e d i c a lS c h o o l , 5 5 L a k e A v e n u e N o r t h , W o r c e s t e r , MA 0 1 6 5 5 . P h o n e : ( 5 0 8 )8 5 6 - 6 1 3 8 . F a x : ( 5 0 8 ) 8 5 6 - 2 3 9 1 .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a rB i o l o g y , S c h o o l o f P h a r m a c y , U n i v e r s i t y o f B a r ce l o na , 0 8 0 2 8 B a r c e -l o n a , S p a i n .

u n d e r s t a n d i n g t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s t h a t r e g u l a t e b i l ea c i d s y n t h e s i s . F o r e x a m p l e , J e l i n e k e t a l . h a v e s h o w n t h a t t h e7 a - h y d r o x y l a s e g e n e i s e x p r e s s e d o n l y i n l i v e r ( 2 6 ) , a s e x -p e c t e d , s i n c e b i l e a c i d s a r e s y n t h e s i z e d o n l y i n t h a t o r g a n ( 3 5 ) .A l s o , t h e a c t i v i t y o f 7 a - h y d r o x y l a s e e x h i b i t s a c i r c a d i a n r h y t h mi n r a t s , w i t h a m a xim u m a t m i d n i g h t a n d a minimum d u r i n g t h ed a y t i m e ( 3 5 ) . T h i s d i u r n a l v a r i a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y i s d u e t oc h a n g e s i n t h e p r o t e i n a n d mRNA l e v e l s ( 3 9 ) a n d a p p e a r s t ob e d u e , a t l e a s t i n p a r t , t o v a r i a b l e l e v e l s o f g l u c o c o r t i c o i d s( 3 2 ) .S p e c i f i c d i e t a r y m a n i p u l a t i o n s h a v e b e e n s h o w n t o a l t e r7 o t - h y d r o x y l a s e p r o t e i n l e v e l s , e n z y m e a c t i v i t y , a n d mRNAl e v e l s . C h o l e s t y r a m i n e , a r e s i n t h a t b i n d s b i l e a c i d s , t h u sr e d u c i n g t h e i r l e v e l s i n t h e l i v e r , a n d c h o l e s t e r o l f e e d i n g o f r a t se f f e c t i v e l y u p - r e g u l a t e s 7 a - h y d r o x y l a s e p r o t e i n l e v e l s a n d e n -zyme a c t i v i t y b y i n c r e a s i n g t h e amount o f 7 a - h y d r o x y l a s emRNA a b o u t t w o f o l d ( 2 6 , 3 0 , 3 9 , 5 3 ) . I n a d d i t i o n , 7 a -h y d r o x y l a s e mRNA a n d p r o t e i n l e v e l s d e c r e a s e ( 5 - t o 1 0 - f o l d )w h e n r a t s a r e f e d b i l e a c i d s ( 2 6 ) .D i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e b e e n u s e d t o s t u d y t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s m ( s ) i n v o l v e d i n t h e b i l e a c i d - a n d c h o l e s t e r o l - m e d i -a t e d r e g u l a t i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e . I t h a s b e e n p r o -p o s e d t h a t t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n p l a y s a r o l e b y a n a l o g yw i t h o t h e r s y s t e m s i n v o l v e d i n c h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i s ( 2 6 , 3 3 ,4 6 , 5 2 ) . S t u d i e s i n t i s s u e c u l t u r e s y s t e m s h a v e b e e n d i f f i c u l tb e c a u s e o f t h e l a c k o f a p p r o p r i a t e c e l l l i n e s w i t h w h i c ht r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n c o u l d b e s t u d i e d . R e c e n t l y , c h i m e r i cg e n e s c o n t a i n i n g f r a g m e n t s o f t h e 5 ' - f l a n k i n g r eg i o n o f t h ehuman 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e h a v e b e e n e x p r e s s e d i n HepG2c e l l s , b u t i t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e y a r e r e g u l a t e d b yc h o l e s t e r o l a n d / o r b i l e a c i d s ( 3 3 ) . B i l e a c i d - m e d i a t e d r e g u l a -t i o n o f 7 a - h y d r o x y l a s e mRNA a n d t r a n s c r i p t i o n h a s b e e ns h o w n i n i s o l a t e d p r i m a r y r a t h e p a t o c y t e s ( 2 4 , 5 2 ) , a l t h o u g h

2 8 0 9

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2 8 1 0 RAMIREZ ET A L .t h e e x t e n t o f r e g u l a t i o n ( 2 - f o l d ) d i f f e r s f r o m t h e r e g u l a t i o n o fmRNA l e v e l s i n t h e e n t i r e a n i m a l ( 5 - t o 1 0 - f o l d ) ( 2 6 , 5 3 ) . I t h a sb e e n s u g g e s t e d t h a t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l p l a y s a m a j o rp a r t i n t h a t r e g u l a t i o n a s s h o w n b y n u c l e a r r u n - o n a s s a y s ( 5 2 )a n d b y t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e b i l e a c i d - m e d i a t e d r e g u -l a t i o n o f 7 a - h y d r o x y l a s e mRNA i n h e p a t o c y t e s i n c u l t u r e( n i n e f o l d ) c o m p a r e d w i t h t h e t w o f o l d d e cr e a s e i n t r a n s c r i p t i o na s q u a n t i f i e d b y r u n - o n o r b y t h e s u p p r e s s i on o f a c h l o r a m -p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C A T ) a c t i v i t y d i r e c t e d b y p r o m o t e rc o n s t r u c t s c o n t a i n i n g u p t o 3 . 6 k b o f 7 a - h y d r o x y l a s e u p s t r e a ms e q u e n c e s .Two m e t h o d s a r e c u r r e n t l y a v a i l a b l e t o t e s t f o r r e g u l a t e de x p r e s s i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n o f c l o n e d g e n e s . One a p p r o a c hi s t o i n t r o d u c e a p u r i f i e d g e n e i n t o c e l l s i n c u l t u r e b y t r a n s f e c -t i o n . R e g u l a t i o n i s m e a s u r e d b y t h e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f ag e n e i n a n a p p r o p r i a t e c e l l l i n e u p o n a d d i t i o n o f t h e e f f e c t o r .M a j o r a d v a n t a g e s o f t h i s m e t h o d a r e t h e r e l a t i v e e a s e i nt e s t i n g m u l t i p l e g e n e s o r a l t e r e d g e n e c o n s t r u c t s a n d t h e s p e e do f t h e a s s a y . I t i s i m p r a c t i c a l , h o w e v e r , w h e n c e l l - s p e c i f i cf u n c t i o n s o u g h t t o b e s t u d i e d , s i n c e c e l l s i n c u l t u r e t e n d t oe x p r e s s a l l t r a n s f e c t e d e u k a r y o t i c g e n e s a t a l o w b a s a l l e v e lr e g a r d l e s s o f c e l l s p e c i f i c i t y . S i m i l a r l y , c o n d i t i o n s s u c h a sc h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i s r e q u i r e w h o l e a n i m a l m o d e l s t o s t u d yt h e c o m p l e x i n t e r a c t i o n o f w h o l e o r g a n s y s t e m s . T h e o t h e ra p p r o a c h o f c h o i c e i s t o i n t r o d u c e c l o n e d g e n e s i n t o a l l c e l l s o fa n a n i m a l b y m i c r o i n j e c t i o n i n t o f e r t i l i z e d e g g s t o c r e a t et r a n s g e n i c a n i m a l s ( 4 1 ) . A m a j o r a d v a n t a g e o f t h i s m e t h o d i st h e a b i l i t y t o a s s a y f o r e x p r e s s i o n i n many t i s s u e s o f a n a n i m a l .I t a l s o p r o v i d e s a m o r e p h y s i o l o g i c a l s y s t e m f o r s t u d y i n gt i s s u e - s p e c i f i c a n d d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d g e n e t i c e l e m e n t s( 4 2 ) . T h e l i m i t a t i o n o f t r a n s g e n i c t e c h n o l o g i e s i s t h e l e n g t h o ft i m e r e q u i r e d f o r t h e p r o d u c t i o n a n d g e n e r a t i o n o f s e v e r a ll i n e s o f t r a n s g e n i c a n i m a l s c o n t a i n i n g a s i n g l e g e n e c o n s t r u c t .

I n t h e p r e s e n t s t u d y , we u s e d b o t h a p p r o a c h e s t o i n v e s t i g a t et h e r e g u l a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e .F i r s t , we u s e d a c o n d i t i o n a l l y t r a n s f o r m e d h e p a t o c y t e c e l l l i n e ,H 2 . 3 5 ( 5 6 ) , t o t r a n s f e c t c h i m e r i c g e n e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n tp o r t i o n s o f t h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e r a t 7 o t - h y d r o x y l a s eg e n e . T h i s s y s t e m a l l o w e d u s t o l o c a l i z e a l i v e r - s p e c i f i c e n -h a n c e r l o c a t e d 7 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o ns i t e . We h a v e a l s o s h o w n t h a t LDL m e d i a t e s t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o n o f c h i m e r i c g e n e s c o n t a i n i n g e i t h e r t h e 7 o t - h y d r o x -y l a s e o r t h e a l b u m i n e n h a n c e r i n f r o n t o f t h e 7 o t - h y d r o x y l a s ep r o m o t e r i n d i f f e r e n t i a t e d l i v e r c e l l s , t o t h e s a m e e x t e n t a s t h ei n v i v o c h o l e s t e r o l - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f 7 a . - h y d r o x y l a s emRNA. H o w e v e r , b i l e a c i d s o n l y p a r t i a l l y ( t w o f o l d ) r e g u l a t e dr a t 7 a - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r a c t i v i t y i n t h a t t i s s u e c u l t u r es y s t e m . T h u s , we u s e d t r a n s g e n i c m i c e t o s t u d y t h a t r e g u l a t i o n ,a n d we s h o w e d t h a t m i c e h a r b o r i n g a c h i m e r i c g e n e c a r r y i n gt h e 7 a o - h y d r o x y l a s e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n w i t h t h e a l b u m i n e n -h a n c e r e x p r e s s e d t h e r e p o r t e r g e n e w h e r e a s a f u s i o n g e n ec o n t a i n i n g t h e same 7 a - h y d r o x y l a s e p r o x i m a l p r o m o t e r b u tw i t h o u t e n h a n c e r d i d n o t s h o w e x p r e s s i o n . T h i s a n a l y s i s s u p -p o r t e d o u r t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s w h i c h i n d i c a t e t h a te i t h e r t h e 7 a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r o r t h e a l b u m i n e n h a n c e r i sn e c e s s a r y f o r t r a n s c r i p t i o n o f t h e 7 o - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r( s e e F i g . 1 , 2 , a n d 6 ) . More i m p o r t a n t l y , e x p r e s s i o n o f t h et r a n s g e n e i s r e g u l a t e d b y c h o l e s t e r o l a n d b i l e a c i d s i n a manners i m i l a r t o t h e e x p r e s s i o n o f t h e e n d o g e n o u s g e n e . T h e s e r e s u l t sd e m o n s t r a t e t h a t c h o l e s t e r o l a n d b i l e a c i d s r e g u l a t e t h e e x -p r e s s i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e s o l e l y a t t h e t r a n s c r i p -t i o n a l l e v e l . T h e s y s t e m s p r e s e n t e d i n t h i s a r t i c l e p r o v i d ee x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s t o s t u d y c h o l e s t e r o l - a n d b i l e a c i d -m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f 7 o t - h y d r o x y l a s e t r a n s c r i p t i o n .

MATERIALS AND METHODSM a t e r i a l s . 3 2 P - l a b e l e d n u c l e o t i d e s , 3 5 S - d A T P a n d [ 1 4 C ]c h l o r a m p h e n i c o l w e r e p u r c h a s e d f r o m Du P o n t New E n g l a n dN u c l e a r , B o s t o n , M a s s . R e s t r i c t i o n e n z y m e s a n d o t h e r e n -z y m e s u s e d i n DNA c l o n i n g a n d DNA s e q u e n c i n g w e r eo b t a i n e d f r o m c o m m e r c i a l s o u r c e s a n d u s e d a c c o r d i n g t or e c o m m e n d a t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r . XGEM-11 a n d pCAT( a p r o m o t e r l e s s p l a s m i d c o n t a i n i n g t h e c o d i n g r e g i o n o f t h eb a c t e r i a l CAT g e n e a n d t h e s i m i a n v i r u s 4 0 [ S V 4 0 ] t i n t r o n a n dp o l y a d e n y l a t i o n s i g n a l s ) ( 4 5 ) w e r e o b t a i n e d f r o m P r o m e g a ,M a d i s o n , W i s . O l i g o n u c l e o t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d b y t h e p h o s -p h o r a m i d i t e m e t h o d o n a n A p p l i e d B i o s y s t e m s m o d e l 3 8 0 ADNA s y n t h e s i z e r . G 4 1 8 s u l f a t e ( G e n e t i c i n ) w a s p u r c h a s e df r o m GIBCO L a b o r a t o r i e s . p S V 3 - n e o , a p l a s m i d t h a t c o n f e r sr e s i s t a n c e t o t h e n e o m y c i n ( N e o ) a n a l o g G 4 1 8 , w a s o b t a i n e df r o m B e t h e s d a R es e a r c h L a b o r a t o r i e s . Mouse c h o w w a s o b -t a i n e d f r o m A g w a y I n c . ( S y r a c u s e , N . Y . ) . C h o l e s t e r o l w a sp u r c h a s e d f r o m ICN B i o c h e m i c a l s ( C l e v e l a n d , O h i o ) . C o l e s t i -p o l ( C o l e s t i d ) w a s p u r c h a s e d f r o m T h e U p j o h n C o . ( K a l a m a -z o o , M i c h . ) ; c h o l i c a c i d a n d c h e n o d e o x y c h o l i c a c i d w e r eo b t a i n e d f r o m S i g m a .G e n e r a l m e t h o d s . R e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n s , a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s , a n d DNA a n d RNA b l o t t i n g a n d h y b r i d -i z a t i o n w e r e c a r r i e d o u t b y s t a n d a r d p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e db y S a m b r o o k e t a l . ( 4 8 ) . DNA p r o b e s w e r e 3 2 p l a b e l e d b y t h em e t h o d o f C h u r c h a n d G i l b e r t ( 9 ) . DNA s e q u en c i n g w a s d o n eb y t h e d i d e o x y c h a i n t e r m i n a t i o n m e t h o d o f S a n g e r e t a l . ( 4 9 )w i t h e i t h e r t h e M13 u n i v e r s a l s e q u e n c i n g p r i m e r o r s p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e s , a f t e r s u b c l o n i n g i n t o b a c t e r i o p h a g e M13

v e c t o r s ( 4 8 ) . I n c e r t a i n G C - r i c h r e g i o n s , 20 % f o r m a m i d e w a su s e d i n t h e s e q u e n c i n g g e l s ( 1 2 ) . B o t h s t r a n d s w e r e s e q u e n c e da t l e a s t o n c e . H u m a n LDL a n d l i p o p r o t e i n - d e f i c i e n t f e t a l c a l fs e r u m w e r e p r e p a r e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n ( 1 8 ) . P r o t e i nc o n t e n t w a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f B r a d f o r d ( 2 ) .C l o n i n g o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e . R a t l i v e r DNA w a sp r e p a r e d a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 4 8 ) . A f t e r p a r t i a l S a u 3 A Id i g e s t i o n , f r a g m e n t s r a n g i n g i n s i z e b e t w e e n 1 5 a n d 2 5 k b w e r ep u r i f i e d a n d l i g a t e d t o t h e BamHI a r m s o f t h e c l o n i n g v e c t o rX G E M - 1 1 . A f t e r i n v i t r o p a c k a g i n g o f t h e r e c o m b i n a n t m o l e -c u l e s i n t o i n f e c t i o u s p h a g e p a r t i c l e s , c l o n e s w e r e s c r e e n e d f o ri n s e r t s c o n t a i n i n g 7 o t - h y d r o x y l a s e s e q u e n c e s b y i n s i t u h y b r i d -i z a t i o n ( 4 8 ) u s i n g a s a p r o b e a n o l i g o n u c l e o t i d e c o m p l e m e n -t a r y t o n u c l e o t i d e s + 8 6 t o + 1 2 5 , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h eb e g i n n i n g o f t h e c o d i n g r e g i o n o f t h e p u b l i s h e d r a t 7 a -h y d r o x y l a s e cDNA s e q u e n c e ( 3 7 ) . Two c l o n e s , X R 7 a - 1 a n dX R 7 o a - 2 , w e r e i d e n t i f i e d o u t o f 3 x 1 0 5 r e c o m b i n a n t s . F o rmore d e t a i l e d a n a l y s i s o f X c l o n e s , s u b g e n o m i c f r a g m e n t s wereg e n e r a t e d b y d i g e s t i o n w i t h E c o R I , B a m H I , a n d P s t I a n ds u b c l o n e d i n t o p l a s m i d v e c t o r s . T h e t r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o ns i t e w a s d e t e r m i n e d b y p r i m e r e x t e n s i o n a n d S 1 n u c l e a s ea n a l y s i s a n d c o i n c i d e d , e s s e n t i a l l y , w i t h t h e p o s i t i o n d e s c r i b e db y J e l i n e k e t a l . ( 2 7 ) .P l a s m i d c o n s t r u c t i o n s . P l a s m i d p R 7 o a C A T - 1 wa s c o n -s t r u c t e d b y i n s e r t i o n o f a 4 - k b P s t I f r a g m e n t , e x c i s e d f r o mX R 7 o t - 1 , w h i c h s p a n s f r o m 1 . 6 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p -t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e t o t h e s e c o n d i n t r o n i n t h e 7 a x - h y d r o x y l a s eg e n e . To d e l e t e t h e f i r s t tw o e x o n s f r o m t h i s c o n s t r u c t , w ei n t r o d u c e d a S a l l s i t e a t p o s i t i o n +5 9 ( F i g . 1 ) b y PCRt e c h n i q u e s ( 4 7 ) a n d l i g a t e d i t t o t h e S a l I s i t e i n t h e p o l y l i n k e ro f p C A T , u p s t r e a m o f t h e CAT g e n e , t o g e n e r a t e p R 7 a C A T - 3 .p R 7 a C A T - 9 a n d p R 7 a C A T - 8 were made b y i n s e r t i n g t h eX b a I - P s t I f r a g m e n t s ( - 7 4 5 5 t o - 1 6 7 1 a n d - 6 2 6 5 t o - 1 6 7 1 ,r e s p e c t i v e l y ) i n t o t h e P s t I s i t e o f p R 7 a C A T - 3 . p R 7 o t C AT - 1 0w a s c r e a t e d b y d e l e t i o n o f t h e X b a I - S p h I f r a g m e n t i np R 7 o L C A T - 8 a n d r e c i r c u l a r i z a t i o n . p R 7 a C A T - 5 wa s made

M O L . C E L L . B I O L .

7/27/2019 Acid Biliar

3/13

CHOLESTEROL 7ox-HYDROXYLASE 2 8 1 17 1 i-- 1 0 K i l o b a s e s-1I1 - 1 I I ~~~~~~~~~~~I

- 6 2 6 5

- 3 5 7 6

P s t I H i n d 3 S a l II \ I CA T

- 1 6 7 1 - 3 4 2

pR7aCAT-9p R 7 a C A T - 8p R 7 a C A T - 1 0p R 7 a C A T - 3

- p R 7 a C A T - 5- 3 4 2-1671

F I G . 1 . P r o m o t e r a c t i v i t y o f 5 ' d el e t i o n m u t a n t s o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r i n H2.35 c e l l s . Th e DNA f r a g m e n t ( t h i n s o l i d b a r ) f r o mt h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e r a t 7 o a - h y d r o x y l a s e gene i s shown w i t h t h e r e s t r i c t i o n s i t e s u s e d f o r p l a s m i d c o n s t r u c t o i n ( s e e M a t e r i a l s a nd M e t h o d s ) .T h e CAT c o d i n g sequence i s d e n o t e d b y t h e h a t c h e d b a r . Th e p u t a t i v e TATA b o x a nd a p o t e n t i a l TGT3-HNF-3 s i t e a re i n d i c a t e d . A scheme o ft h e d i f f e r e n t c h i m e r i c genes u s e d i s s h o w n . H 2 . 3 5 c e l l s w e re s t a b l y t r a n s f e c t e d w i t h t h e i n di c a t e d p l a s m i d a s e x p l a i n e d i n M a t e r i a l s a nd M e t h o d s .A f t e r s e l e c t i o n o f G418 r e s i s t a n t c o l o n i e s , c e l l s were c u l t u r e d u n d e r d i f f e r e n t i a t i n g or n o n d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . R e l a t i v e t r a n s c r i p t i o n was d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g CAT a c t i v i t y w i t h amounts o f e x t r a c t s t h a t c o n t a i n e d t h e same a m o u n t o fi - g a l a c t o s i d a s e ( e - g a l ) a c t i v i t y . T h e d a t a a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e s o f t h e a c t i v i t y p r o d u c e d b y t h e c o n s t r u c t c o n t a i n i n g t h e l o n g e s t p r o m o t e rf r a g m e n t , p R 7 o t - C A T - 9 , u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s a n d r e p r e s e n t t h e a v e r a g e s o f seven e x p e r i m e n t s w i t h tw o d i f f e r e n t t r a n s f e c t i o n s s t a n d a r d errors o f t h e m e a n .

f r o m pR7aCAT-3 b y H i n d l l l d i g e s t i o n a n d r e c i r c u l a r i z a t i o n .p 7 c E - R 7 a c C A T - 5 w a s made b y b l u n t - e n d l i g a t i o n o f t h e X b a I -XbaI f r a g m e n t ( - 7 4 5 4 t o -6265 f r o m t h e 7 a - h y d r o x y l a s et r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e ) i n t o t h e H i n d l I l s i t e o fp R 7 a C A T - 5 . pAE-R7aCAT-5 w a s p r e p a r e d b y b l u n t - e n dl i g a t i o n o f t h e NheI-BamHI f r a g m e n t ( - 1 0 4 0 0 t o -8500 f r o mt h e mouse a l b u m i n gene [ 4 3 ] ) e x c i s e d f r o m p A N / T 2 - N B ' ( ap l a s m i d t h a t c o n t a i n s t h e mouse a l b u m i n e n h a n c e r a n d pro-m o t e r , k i n d l y p r o v i d e d b y K . S . Z a r e t , Brown U n i v e r s i t y ) i n t ot h e H i n d l l l s i t e o f pR7aCAT-5. p G a l , a p r o m o t e r l e s s p l a s m i dc o n t a i n i n g t h e b a c t e r i a l l a c Z gene, w a s c o n s t r u c t e d b y r e p l a c -i n g t h e b a c t e r i a l CAT c o d i n g r e g i o n f r o m pCAT b y t h e l a c Zgene o b t a i n e d b y D r a l d i g e s t i o n o f pNK 1 9 1 5 ( a g i f t f r o m P .D o b n e r , U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t s M e d i c a l S c h o o l ) .p R 7 a G a l - 3 was made b y l i g a t i o n o f a 4 . 1 - k b B a m H I - S a l If r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e l a c Z gene a n d t h e SV40 t i n t r o n a n dp o l y ( A ) a d d i t i o n s i t e f r o m p G a l t o t h e 4 . 4 - k b B a m H I - S a l Ib a c k b o n e f r o m pR7aCAT-3. p A E - 7 a G a l - 3 was p r e p a r e d b yb l u n t - e n d l i g a t i o n o f t h e NheI-BamHI f r a g m e n t i n t o t h e P s t Is i t e o f t h e p l a s m i d p R 7 a c G a l - 3 . P l a s m i d DNA was p u r i f i e d b ytw o C s C l g r a d i e n t s , a n d t h e i n t e g r i t y o f t h e DNA was v e r i f i e db y s e q u e n c i n g when necessary.

C e l l c u l t u r e a n d t r a n s f e c t i o n e x p e r i m e n t s . H 2 . 3 5 c e l l s ( 5 6 )( a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e , S V 4 0 - t r a n s f o r m e d mouse h e p a t o c y t ec e l l l i n e k i n d l y p r o v i d e d b y K . S . Z a r e t ) were c u l t u r e d a sd e s c r i b e d b y Z a r e t e t a l . ( 5 6 ) . B r i e f l y , c e l l s were m a i n t a i n e d i nb a s a l medium ( D u l b e l c c o ' s m o d i f i e d e a g l e medium s u p p l e -m e n t e d w i t h 4 % f e t a l c a l f seru m , 0 . 2 , u M d e x a m e t h a s o n e , a n da n t i b i o t i c s ) a t 3 3 C i n a h u m i d i f i e d a t m o s p h e r e o f 5 % C O 2 .C e l l s were c o t r a n s f e c t e d b y t h e c a l c i u m p h o s p h a t e m e t h o d a sm o d i f i e d b y Chen a n d Okayama ( 6 ) , u s i n g 1 5 p u g o f t h e t e s tp l a s m i d a n d 1 , u g o f p S V 3 - n e o . To n o r m a l i z e f o r e f f i c i e n c y o ft r a n s f e c t i o n , a r e f e r e n c e p l a s m i d ( p SV - g a l ; 4 , u g ) c o n t a i n i n gt h e b a c t e r i a l l a c Z ge ne u n d e r t h e c o nt r o l o f t h e SV40 e a r l ypromoter was c o t r a n s f e c t e d w i t h t h e t e s t p l a s m i d . S e l e c t i o n

w i t h G418 ( 1 m g / m l ) was m a i n t a i n e d f o r 2 w e e k s . R e s i s t a n tc o l o n i e s were p o o l e d ( 1 5 0 t o 3 0 0 c o l o n i e s per t r a n s f e c t i o n )a n d e x p a n d e d i n m a s s c u l t u r e i n t h e presence o f 1 mg o f G418per m l .F o r e a c h e x p e r i m e n t , 1 0 0 - m m - d i a m e t e r p l a s t i c d i s h e s weres e e d e d on d a y 0 a t 1 0 6 c e l l s pe r d i s h i n 8 m l o f b a s a l mediuma n d i n c u b a t e d a t t h e p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e f o r S V 4 0 , 3 3 C( d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s ) . F o r d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s ,1 0 0 - m m - d i a m e t e r d i s h e s c o n t a i n i n g 4 m l o f a 1 . 3 5 - m g / m l g e l o fr a t t y p e I c o l l a g e n p r e p a r e d e x a c t l y a s d e s c r i b e d b y Z a r e t e t a l .( 5 6 ) were s e e d e d w i t h 2 x 1 0 6 c e l l s per d i s h i n 8 m l o f b a s a lmedium s u p p l e m e n t e d w i t h 10% f e t a l c a l f seru m . A f t e r t h ec e l l s on c o l l a g e n were c u l t u r e d a t t h e n o n p e r m i s s i v e t e m p e r -a t u r e ( 3 9 C ) f o r 3 t o 5 h , t h e medium was r e p l a c e d b ys e r u m - f r e e medium ( 5 6 ) a n d m a i n t a i n e d a t 3 9 C . On d a y 2 ,c e l l s were r e f e d w i t h e i t h e r b a s a l medium or s e r u m - f r e emedium a n d h a r v e s t e d b y s c r a p i n g ( p l a s t i c d i s h e s ) or b y a b r i e fc o l l a g e n a s e d i g e s t i o n ( c o l l a g e n p l a t e s ) on d a y 3 . C e l l s werel y s e d b y t h r e e c y c l e s o f f r e e z e - t h a w i n g , a n d , - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d as d e s c r i b e d b y S a m b r o o k e t a l . ( 4 8 )w i t h o - n i t r o p h e n y l - f i - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e as a s u b s t r a t e . On eu n i t o f , - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i s d e f i n e d a s t h e a mount o fe n z y m e t h a t t r a n s f o r m s 1 , u m o l o f s u b s t r a t e per m i n a t 3 7 C .CAT a c t i v i t i e s were m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f Gorman e t a l .( 2 1 ) , a f t e r t h e c e l l e x t r a c t s were i n c u b a t e d a t 6 5 C f o r 5 m i n .On e u n i t o f CAT a c t i v i t y i s d e f i n e d a s t h e a m o u n t o f enzymew h i c h t r a n s f o r m s 1 n m o l o f c h l o r a m p h e n i c o l i n t o i t s a c e t y l a t e dp r o d u c t s pe r m i n a t 3 7 C . A l l assays were l i n e a r r e g ar d i ng t i m eo f i n c u b a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n .DNA p r e p a r a t i o n f o r m i c r o i n j e c t i o n a n d g e n e r a t i o n o ft r a n s g e n i c m i c e . F o r m i c r o i n j e c t i o n , t h e pR7aCAT-3 f u s i o ngene ( s e e F i g . 5 ) w a s p r e p a r e d b y P s t I - B a m H I d i g e s t i o n o fpR7aCAT-3 ( 3 . 4 k b ) . Th e A E - 7 a G a l - 3 f u s i o n ge ne ( 7 . 8 k b )( s e e F i g . 5 ) was p r e p a r e d b y B a m HI c o m p l e t e d i g e s t i o n a n dS p h I p a r t i a l d i g e s t i o n o f p A E - 7 a G a l - 3 . DNA f r a g m e n t s were

Xba l X b a ll l

I G C , , A A A C A IH N F - 3

S p h I

- 3 5 7 6

- 7 4 5 4

P l a s t i c - 3 3 C C o l l a g e n - 3 9 CD e - d i f f e r e n t i a t e d D i f f e r e n t i a t e d( C A T 4 I - g a l ) ( C A T 4 3 - g a l )

1 0 0 4 1 0 + 1 1 42 6 t 5 3 2 t 52 9 t 4 4 2 t 72 1 t 4 2 3 t 43 1 t 6 2 1 t 4

V O L . 1 4 , 1 9 9 4

7/27/2019 Acid Biliar

4/13

2 8 1 2 RAMIREZ ET A L .i s o l a t e d b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d e l e c t r o e l u t i o n a n df u r t h e r p u r i f i e d w i t h E l u t i p m i n i c o l u m n s ( S c h l e i c h e r &S c h u e l l ) . L i n e a r i z e d DNA w a s d i s s o l v e d i n 5 mM T r i s ( p H7 . 4 ) - O . 1 mM EDTA a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 p L g / m l . Two t of i v e p i c o l i t e r s w a s m i c r o i n j e c t e d i n t o t h e m a l e p r o n u c l e u s o ff e r t i l i z e d B 6 SJ L F 1 / J e m b r y o s ( J a c k s o n L a b o r a t o r i e s , B a r H a r -b o r , M a i n e ) b y s t a n d a r d t e c h n i q u e s a n d t r a n s f e r r e d i n t o t h eo v i d u c t s o f p s e u d o p r e g n a n t CD1 f o s t e r m o t h e r s ( 2 3 ) . F o u n d e rm a l e s w e r e m a t e d t o f e m a l e w i l d - t y p e C 5 7 B L / 6 m i c e .DNA a n a l y s i s a n d e s t i m a t i o n o f g e n e c o p y n u m b e r . Toi d e n t i f y t r a n s g e n i c f o u n d e r m i c e , g e n o m i c DNA w a s i s o l a t e df r o m t h e t a i l s o f 4 - t o 5 - w e e k - o l d p u p s , d i g e s t e d w i t h E c o R I( f o r R 7 o t C A T - 3 ) o r w i t h A v a l l ( f o r A E - R 7 o x G a l - 3 ) , a n d s u b -j e c t e d t o S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s . H y b r i d i z a t i o n w a s d o n e w i t h a3 2 P - l a b e l e d s i n g l e - s t r a n d e d M13 p r o b e ( 9 ) p r e p a r e d f r o m t h ec o d i n g r e g i o n o f t h e CAT g e n e o r f r o m a 4 1 9 - b p f r a g m e n t o ft h e 7 x - h y d r o x y l a s e - l a c Z f u s i o n g e n e ( - 2 6 7 t o + 1 5 2 ) . T h en u m b e r o f c o p i e s o f i n s e r t e d DNA p e r g e n o m e w a s e s t i m a t e db y u s i n g a c a l i b r a t i o n c u r v e o f p R 7 o t C A T - 3 o r p A E - 7 o t G a l - 3DNA, p r o c e s s e d u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . F u r t h e r g e n e r a -t i o n s o f t r a n s g e n i c m i c e w e r e d e t e c t e d b y PCR t e c h n i q u e su s i n g b l o o d s a m p l e s ( 2 9 ) t o s c r e e n a l a r g e n u m b e r o f o f f s p r i n g .A 4 6 5 - b p f r a g m e n t o f t h e 5 ' r e g i o n o f t h e l a c Z g e n e w a sa m p l i f i e d ( 4 7 ) .F e e d i n g o f m i c e . T r a n s g e n i c m i c e w e r e k e p t u n d e r a 1 2 - hl i g h t / 1 2 - h d a r k c y c l e . M a l e a n d f e m a l e m i c e , 6 t o 8 w e e k s o l d ,w e r e f e d a s f o l l o w s : ( i ) r e g u l a r c h o w d i e t ( n o r m a l d i e t ) , ( i i )n o r m a l d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h 2% ( w t / w t ) c h o l e s t e r o l f o r 1 4d a y s , ( i i i ) n o r m a l d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h 5 % ( w t / w t ) c o l e s t i p o lf o r 5 d a y s , ( i v ) n o r m a l d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 % ( w t / w t )c h o l i c a c i d f o r 5 d a y s , o r ( v ) n o r m a l d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h0 . 5 % ( w t / w t ) c h e n o d e o x y c h o l i c a c i d f o r 5 d a y s . A n i m a l s w e r ek i l l e d b e t w e e n t h e 6 t h a n d 8 t h o f t h e d a r k p e r i o d .P r e p a r a t i o n o f t i s s u e e x t r a c t s a n d a s s a y o f , I - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y . M o u s e t i s s u e s ( 0 . 5 g ) w e r e h o m o g e n i z e d i n a D o u n c eh o m o g e n i z e r o n i c e , w i t h 5 m l o f 4 0 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 4 ) - imM EDTA-500 mM s u c r o s e - 1 5 0 mM N a C l - 1 0 mM d i t h i o -t h r e i t o l . T h e l y s a t e s w e r e c l e a r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 xg f o r 3 0 m i n a t 4 C . T h e s o l u b l e f r a c t i o n was p u r i f i e d b yu l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 9 0 m i n a t 4 C a n d u s e dt o q u a n t i f y P - g a l a c t o s i d a s e o r CAT a c t i v i t y .RNA p u r i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s . T o t a l c e l l u l a r RNA wasi s o l a t e d f r o m t i s s u e - c u l t u r e d c e l l s b y g u a n i d i n i u m t h i o c y a n a t ee x t r a c t i o n f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n t h r o u g h a c e s i u m c h l o -r i d e c u s h i o n ( 8 ) . P r i m e r e x t e n s i o n a n a l y s i s o f Neo mRNA wasp e r f o r m e d w i t h 1 5 f m o l o f a 4 0 - n u c l e o t i d e s y n t h e t i c DNAp r i m e r c o m p l e m e n t a r y t o n u c l e o t i d e s + 2 6 1 t o + 3 0 0 o f NeoRNA ( 1 ) . To i n i t i a t e p r i m e r e x t e n s i o n , 1 0 0 U o f M o l o n e ym u r i n e l e u k e mi a v i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e wa s a d d e d t o t h em i x t u r e a n d i n c u b a t e d f o r 1 h a t 3 7 C i n t h e p r e s e n c e o fd e o x y n u c l e o t i d e s a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 5 ) . S i n u c l e a s ea n a l y s i s o f t h e 5 ' e n d o f t h e 7 o - h y d r o x y l a s e - C A T mRNA w a sp e r f o r m e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 5 ) , e x c e p t t h a tt h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e was 4 4 C , b y u s i n g a s i n g l e - s t r a n d e dp r o b e t h a t s p a n s f r o m p o s i t i o n -39 i n t h e 7 a - h y d r o x y l a s e5 ' - f l a n k i n g r e g i o n t o t h e E c o R I s i t e w i t h i n t h e CAT c o d i n gr e g i o n .T o t a l RNA w a s p u r i f i e d f r o m m o u se l i v e r b y g u a n i d i n i u mt h i o c y a n a t e h o m o g e n i z a t i o n f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o nt h r o u g h a c e s i u m c h l o r i d e c u s h i o n ( 8 ) . E q u a l amounts o f t h ei n d i v i d u a l RNA s a m p l e s ( f i v e t o s e v e n p e r g r o u p ) were p o o l e d .P o l y ( A ) + RNA was i s o l a t e d f r o m t h o s e p o o l s b y u s i n g a M i n iR i b o S e p U l t r a mRNA i s o l a t i o n k i t ( C o l l a b o r a t i v e B i o m e d i c a lP r o d u c t s , B e d f o r d , M a s s . ) . RNA s l o t b l o t t i n g a n d h y b r i d i z a -t i o n w e r e c a r r i e d o u t b y s t a n d a r d p r o c e d u r e s ( 4 8 ) . T h r e ed i f f e r e n t M13 s i n g l e - s t r a n d e d p r o b e s , p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y

C h u r c h a n d G i l b e r t ( 9 ) , were u s e d . T h e , - g a l a c t o s i d a s e p r o b ew a s a 4 1 9 - bp f r a g me n t ( - 2 6 7 t o + 1 5 2 ) f r o m t h e 7 a - h y d r o x y -l a s e - l a c Z f u s i o n g e n e ; t h e 7 o - h y d r o x y l a s e p r o b e c o n t a i n e d a1 . 1 - k b B a mH I f r a g m e n t f r o m t h e 5 ' e n d o f t h e r a t 7 o t -h y d r o x y l a s e cDNA. As a c o n t r o l , we u s e d a h a m s t e r a l b u m i ncDNA p r o b e ( 1 6 ) . 7 o x - H y d r o x y l a s e a n d a l b u m i n h y b r i d i z a t i o n sw e r e d o n e i n 35% ( v o l / v o l ) f o r m a m i d e s o l u t i o n ( 4 8 ) c o n t a i n i n g3 2 P - l a b e l e d p r o b e s a t 2 x 1 0 6 c p m / m l . A f t e r o v e r n i g h t h y b r i d -i z a t i o n a t 4 2 C , m e m b r a n e s w e r e w a s h e d i n 4 x SSC ( 1 x SSCi s 1 5 0 mM N a C l p l u s 1 5 mM s o d i u m c i t r a t e ) - 0 . 2 % s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) a t 5 5 C . H y b r i d i z a t i o n w i t h t h e f - g a l a c -t o s i d a s e p r o b e wa s c a r r i e d o u t i n 50% ( v o l / v o l ) f o r m a m i d es o l u t i o n , a n d t h e m e m b r a n e s were w a s h e d i n 0 . 5 x S S C - 0 . 2 %SDS a t 6 5 C .

RESULTSL o c a l i z a t i o n o f a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r i n t h e r a t c h o l e s -t e r o l 7 e i - h y d r o x y l a s e g e n e . F i g u r e 1 s h o w s t h e 5 ' - f l a n k i n gr e g i o n o f t h e r a t 7 o - - h y d r o x y l a s e g e n e a n d t h e s t r u c t u r e s o f f i v e7 o x - h y d r o x y l a s e - C A T c h i m e r i c g e n e s w h i c h were u s e d t o l o c a l -

i z e DNA s e q u e n c e s n e c e s s a r y f o r t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e7 c x - h y d r o x y l a s e g e n e i n a l i v e r - s p e c i f i c m a n n e r . N u c l e o t i d e + 1c o r r e s p o n d s t o t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e a s d e f i n e d b yp r i m e r e x t e n s i o n a n d S 1 n u c l e a s e a n a l y s i s o f t h e r a t mRNA( d a t a n o t s h o w n ) a n d d i f f e r s b y 1 n u c l e o t i d e f r o m t h e s i t ed e s c r i b e d b y J e l i n e k a n d R u s s e l l ( 2 7 ) . F i v e c h i m e r i c g e n e swere c r e a t e d b y p l a c i n g d i f f e r e n t p a r t s o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y -l a s e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n i n f r o n t o f t h e c o d i n g r e g i o n o f t h e CATg e n e . A s a r e c i p i e n t c e l l l i n e , we u s e d a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e ,S V 4 0 - t r a n s f o r m e d m o u s e h e p a t o c y t e c e l l l i n e , H 2 . 3 5 ( 5 6 ) , t h a th a s b e e n s h o w n t o b e e x t r e m e l y u s e f u l i n t h e s t u d y o fl i v e r - s p e c i f i c f u n c t i o n s . When H 2 . 3 5 c e l l s a r e c u l t u r e d u n d e rt h e d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) ,t h e c e l l s assume a f l a t s t r u c t u r e a n d t r a n s c r i b e l i v e r - s p e c i f i cg e n e s s u c h a s a l b u m i n a t v e r y l o w r a t e s . When c u l t u r e d a t t h ed i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s , t h e c e l l s e x h i b i t a c u b o i d a l s t r u c t u r e ,a n d t h e t r a n s c r i p t i o n o f a s u b s e t o f l i v e r - s p e c i f i c g e n e s i si n c r e a s e d s e l e c t i v e l y ( 3 1 , 5 6 ) .As s h o w n i n F i g . 1 , w h e n s t a b l y t r a n s f e c t e d H 2 . 3 5 c e l l s werec u l t u r e d u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s , p l a s m i d p R 7 o tCAT-9 c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d t h e h i g h e s t r a t i o o f C A T / 1 -g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y . M o s t i m p o r t a n t l y , when c e l l s were c u l -t u r e d u n d e r d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s CAT a c t i v i t y w a s i n -c r e a s e d ( a n a v e r a g e o f f o u r f o l d ) o n l y i n c e l l s t r a n s f e c t e d w i t hp R 7 a C A T - 9 . CAT a c t i v i t y f o r a l l o t h e r c e l l l i n e s d i d n o t s h o wa n y n o t i c e a b l e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e tw o c u l t u r e c o n d i t i o n s .T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e f r a g m e n t - 7 4 5 4 t o - 6 2 6 5l o c a t e d a t t h e v e r y 5 ' e n d o f p R 7 o L C A T - 9 , w h i c h i s d e l e t e d i np R 7 o t C A T - 8 , a c t s a s a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r o f 7 o x - h y d r o x y -l a s e t r a n s c r i p t i o n .To s t u d y w h e t h e r t h e DNA s e q u e n c e s l o c a t e d b e t w e e n- 6 2 6 5 a n d -342 were i n f a c t d i s p e n s a b l e f o r 7 c x - h y d r o x y l a s et r a n s c r i p t i o n a s s u g g e s t e d b y t h e e x p e r i m e n t s i n F i g . 1 , wed e l e t e d t h e s e s e q u e n c e s , p l a c i n g t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e e n h a n c e ri n f r o n t o f t h e p r o m o t e r f r a g m e n t i n p R 7 o t C A T - 5 , t o g e n e r a t ep 7 o a E - R 7 o L C A T - 5 ( F i g . 2 A ) . When H 2 . 3 5 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t ht h i s c h i m e r i c g e n e were c u l t u r e d u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g a n dd i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s , a l e v e l o f i n d u c t i o n o f CAT a c t i v i t y( F i g . 2 C ) , u p o n h e p a t o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n , c o m p a r a b l e t o t h a tw i t h c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p R 7 o L C A T - 9 w a s o b s e r v e d . T h er a t i o s o f C A T / , - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t i e s i n c e l l s t r a n s f e c t e dw i t h p R 7 o a C A T - 9 o r p 7 o t E - R 7 o t C A T - 5 were e q u i v a l e n t . p 7 o x E -R 7 o a C A T - 5 h a s t h e 7 o x - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r i n t h e reverseo r i e n t a t i o n , a n d s i m i l a r i n d u c t i o n u n d e r d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i -

M O L . C E L L . B I O L .

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5/13

CHOLESTEROL 7oa-HYDROXYLASE 2 8 1 3

- 7 1 - 6 - 5 - 3 - 2 - 1 0 K i l o b a s e s-1 ~~ ~ ~ ~ I1 I j I

X b a 1 F l i n d 3 S a l I

\ I- 3 4 2I G C A A A C A IH N F - 3

p 7 a E - R 7 a x C A T - 5- 6 2 6 5 - 7 4 5 4 - 3 4 2

l a |3|4

5 2 7 -_-7aCAT mRNA

( S I p r o t e c t i o n )4 0 43 0 92 4 2 - 0

a h

w g W o neomRNA( P r i m e r e x t e n s i o n )

CP l a s t i c - 3 3 C C o l l a g e n - 3 9 0 C

I ) e - d i f f e r e n t i a t e d D i f f e r e n t i a t e d1 0 0 3 8 51 0 0 3 3 1

CAT S p ec i f i c A ct i v i t y( r e l a t i v e v a l u e s )CAT mRNA/neo mRNA

( r e l a t i v e v a l u e s )F I G . 2 . P r o m o t e r a c t i v i t y a n d S 1 n u c l e a s e m a p p i n g o f t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e o f t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r - C A T c h i m e r i c gene i nH 2 . 3 5 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p 7 o a E - R 7 o t C AT - 5 . ( A ) Scheme o f t h e i n t e r n a l l y d e l e t e d p 7 a E - R 7 c t C A T - 5 c o n s t r u c t c o n t a i n i n g t h e r a t 7 o t - h y d r o x y l a s ee n h a n c e r ( i n t h e reverse o r i e n t a t i o n ) i n f r o n t o f 3 4 2 b p o f t h e p r o x i m a l p r o m o t e r . H 2 . 3 5 c e l l s w e re t r a n s f e c t e d a n d c u l t u r e d as e x p l a i n e d i nM a t e r i a l s a n d M e t h o d s , i n d u p l i c a t e d i s h e s u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g a n d d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s . On e s e t o f d i s h e s w a s p r o c e s s e d f o r CAT a c t i v i t y ,a n d a n o t h e r w a s u s e d t o prepare RNA. ( B ) RNAs f r o m d e d i f f e r e n t i a t e d ( l a n e 4 ) a n d d i f f e r e n t i a t e d ( l a n e 5 ) c e l l s a n d tRNA a s a c o n t r o l we re u s e d

t o q u a n t i f y 7aCAT mRNA b y S 1 n u c l e a s e a n a l y s i s , w i t h Neo mRNA a s a c o n t r o l , a s e x p l a i n e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . S t a n d a r d s shown ont h e l e f t i n n u c l e o t i d e s ( n t ) w e re d e r i v e d f r o m a n M s p I d i g e s t o f p B R 3 2 2 . ( C ) R el a t i v e v a l u e s o f CAT s p e c i f i c a c t i v i t y a n d CATmRNA n o r m a l i z e dt o Neo mR NA. A B e t a g e n a n a l y z e r was u s e d t o d i r e c t l y m e a s u r e c o u n t s pe r m i n u t e pe r b a n d .

t i o n s w a s o b s e r v e d when t h e e n h a n c e r was p l a c e d i n t h e sameo r i e n t a t i o n a s t h e e n d o g e n o u s ge ne ( d a t a n o t s h o w n ) .To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i n c r e a s e i n CAT a c t i v i t y , uponh e p a t o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n , i s a r e f l e c t i o n o f t h e a m o u n t o fCAT mRNA a n d w h e t h e r t h e i n i t i a t i o n s i t e u s e d i n t h ep 7 a c E - R 7 a C A T - 5 - t r a n s f e c t e d c e l l s c o r r e s p o n d e d t o t h e i n i t i a -t i o n s i t e u s e d b y t h e e n d o g e n o u s r a t 7 o a - h y d r o x y l a s e m R N A ,we p e r f o r m e d S i n u c l e a s e a n a l y s i s w i t h RNAs i s o l a t e d f r o mt h o s e c e l l s g r o w n u n d e r b o t h c o n d i t i o n s . As a p r o b e , we u s e da s i n g l e - s t r a n d e d DNA f r a g m e n t t h a t e nc o m p a s s e s t h e t r a n -

s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e , a n d as a c o n t r o l , we q u a n t i f i e d NeomRNA b y t h e p r i m e r e x t e n s i o n t e c h n i q u e . F i g u r e 2B s h o w st h a t t h e a mount o f CAT mRNA i n c r e a s e d a p p r o x i m a t e l yt h r e e f o l d u p o n d i f f e r e n t i a t i o n ( l a n e s 4 a n d 5 ) , a n d t h e l e n g t ho f t h e p r o t e c t e d f r a g m e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e h y b r i d mRNAwas i n i t i a t e d a t t h e a p p r o p r i a t e p o s i t i o n .N u c l e o t i d e sequence o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e gene e n h a n c e r .F i g u r e 3A s h o w s t h e n u c l eo t i d e sequence o f t h e 7 o a - h y d r o x y -l a s e e n h a n c e r r e g i o n ( - 7 4 5 4 t o -6264 f r o m t h e t r a n s c r i p -t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e ) . E x a m i n a t i o n o f t h e e n h a n c e r r e g i o n b y

AX b a I CA T

B

V O L . 1 4 , 1 9 9 4

7/27/2019 Acid Biliar

6/13

2 8 1 4 RAMIREZ ET A L . M O L . C E L L . B I O L .

A X b a I-7454 iCAATTTGGAAGAAACTTCAAAATCAT CATACTGAGGCAGTGATACCTTTGAATAAG TTTGGCCCCCATATAATCCCATGTTTCAAT

-7364 GCTTCCTTACTGAAGGAGTTGTGGCTTTGC TGGAGAAAGTGTGTCACTGTGTGGGTGGGC TTTGAGGTCTCAATATGATGAGGCTTTGCC

-7274 CAGTGTGGAAGAATCTCCTTCTGCTGCCTT TAGATCAAGATGTAGAACTCTACTCTATCT CCGGGGCCATGTAGACCTGTATATGCTGTC

-7184 ATGCTTCCTGCCATGATGTTAATGGACATG CTTCTGAGGCTGTAAGCAGCCAAATTTCTT ATAAGACTTGCCTTGGTTATGATGTCTCTT

-7094 CACGGCAATGAAACCCAAACTAAGACATGC CTACTACTAAAGTCAAAGATCTTCTATATG AGACCCATTCCAAACCAGTGTCCCTAGTGC

-7004 CCATGGATTGAGAAATCTCCCATAAACAAA GTTAGCAATAATAACCATAATAGCCTTATA CCCCTGACAAGCAGGACTTATCCCACCAAT

-6914 AGAAATAGCCTAGCAAGCAAAGGAAACAAT GAAATACTTCCCAGCAGCATAGAGAAACAC AAAGAATCTCACTGACAAAGAAAAACAACAFP I

- 6 8 2 4 GATCAAAAATCTCTCCCCCTTCCATGAGAA ACACTCTACAAGTAAGAAATCAATATCTAC AAAGAAGACTTCAAGATACCACAGCTGATAF P I I FP I I I

-6734 CACTTAATGAAATAAGTGACTGAAATATTT TCTCCTAGACAAGGATCTCTGTCTTCACTA CTTGTTCCACATTTTACTAATGGCTGTATC

-6644 TGGTGCAGCTAGACCAGAGAAATAAAAGGA GAAAATAGTCTCAAAGAATAAATGAGCCTG TTTATTAAAAGACCTGAAGAATCTACACAG

-6554 TAGTATTGAGAGCTACCTTCTTCAGAGTTA GGGGATGCAAGGCGAAATTTCAAAAATCCA GTCTAGCTTTATAATTTCTGAACAGTAGCGF P I V FP Vr ** I

-6464 ATGAACACTGTAACTGGAGTTATGAAACAA CTCCGTGTGTGAAAACATAAAGTCCTTAGA AATAAGTGCAACAAACTATACAATAAAAGCF P V I

-6374 GACAAAACATTATTGAAAAAAAAACTACAG AAGACCTCAGCAAACAGAAACTCATGTTCC CCAATCAAAAGGAACCTAATTCTGATGGAC* IFP V I I-6284 TGTCCTCTCCTCAAATTGA A AAGA AATTAGATGTAATCAAAGATGATCCTAAAG TTATGTGGAAATATAAGAGATGCAGAGTAC

X b a I

BXba I ( 7 4 5 4 ) Xba I ( - 6 2 6 5 )L m i i n i i n I I ,I I # t

I 1 I I I I V V V I V I I

I /// / !TGTTTGCTATTGATTTCT A G T T T l TF I G . 3 . S e q u e n c e a n d s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r r e g i o n . ( A ) T h e X b a I s i t e s ( a t p o s i t i o n s - 7 4 5 4 a n d - 6 2 6 5 )a r e b o x e d . R e g i o n s ( F P I t o FP V I I ) p r o t e c t e d f o r DNase I d i g e s t i o n b y n u c l e a r e x t r a ct s a r e u n d e r l i n e d ( f o r t h e b o t t o m s t r a n d ) a n d o v e r l i n e d ( f o rt h e t o p s t r a n d ) . A s t e r i s k s , p o s i t i o n s o f DNase I - h y p e r s e n s i t i v e c l e a v a g e s i t e s . ( B ) F o o t p r i n t s i t e s ( F P I , FP I I I , FP V , a n d ' F P V I ) w h i c h wereo b s e r v e d o n l y w i t h l i v e r n u c l e a r e x t r a c t s ( s t i p p l e d o v a l s ) a n d s i t e s ( F P I I , FP I V , a n d FP V I I ) t h a t were d e t e c t e d w i t h e x t r a c t s f r o m b o t h l i v e r sa n d k i d n e y s ( o p e n o v a l s ) a r e d e p i c t e d d i a g r a m a t i c a l l y on t h e X b a I ( - 7 4 5 4 ) - t o - X b a I ' ( - ' 6 2 6 5 ) e n h a n c e r r e g i o n . An 1 1 - b p s e q u e n c e c l o s e l y r e l a t e dt o TTR-HNF-3 c o n s e n s u s [ T A T T G A ( T / C ) T T A f G ] w i t h i n t h e FP I p r o t e c t i o n s i t e i s s h o w n . H o m o l o g i e s w i t h TGT3-HNF-3 c o n s e n s u s[ T ( G / A ) T T T G ( C t T ) ] l o c a t e d w i t h i n FP V a n d FP V I a r e s h o w n , a n d t h e n u c l e o t i d e s r e p r e s e n t i n g i d e n t i c a l m a t c h e s a r e b o l d f a c e d .

7/27/2019 Acid Biliar

7/13

CHOLESTEROL 7oa-HYDROXYLASE 2 8 1 5

> e-tDifferentiated D i f f e r e n t i a t e dQ ~ 4

~ - e - d i f f e r e n t i a t e d D e - d i f f e r e n t i a t e dI ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~~~~I0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0LDL ( u g / m l )

F I G . 4 . L D L - m e d i a t e d i n d u c t i o n o f CAT a c t i v i t y i n H 2 . 3 5 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p 7 ( x E - R 7 o t C A T - 5 a n d p A E - R 7 c x C A T - 5 . H 2 . 3 5 c e l l s w e r et r a n s f e c t e d w i t h p 7 a E - R 7 a C A T - 5 ( A ) o r p A E - R 7 a C A T - 5 ( B ) a n d s e l e c t e d f o r G 4 1 8 r e s i s t a n c e a s e x p l a i n e d i n M a t e r i a l s a n d M et h o ds . F o r t h ee x p e r i m e n t s , c e l l s w e r e s e e d e d a s e x p l a i n e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , e x c e p t t h a t 6 0 - m m - d i a m e t e r d i s h e s were u s e d , a n d 4 x 1 0 5 o r 1 0 6 c e l l s w e r es e e d e d p e r p l a s t i c o r c o l l a g e n d i s h , r e s p e c t i v e l y . T h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f LDL were a d d e d a t t h e t i m e o f m e d i u m c h a n g e . F o r t h ed e d i f f e r e n t i a t e d c e l l s l i p o p r o t e i n - d e f i c i e n t s e r u m w a s u s e d i n s t e a d o f f e t a l c a l f s e r u m w h e n LD L wa s a d d e d . A v e r a g e v a l u e s f o r t h r e e e x p e r i m e n t sd o n e w i t h t w o d i f f e r e n t t r a n s f e c t i o n s a r e s h o w n , r e l a t i v e t o t h e v a l u e s o f c e l l s g r o w n u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s , i n t h e a b s e n c e o f L D L .B a r s , s t a n d a r d e r r o r s o f t h e m e a n s .

DNase I f o o t p r i n t i n g a n a l y s i s u s i n g l i v e r n u c l e a r e x t r a c t sr e v e a l e d s e v e n p r o t e c t i o n s i t e s ( d a t a n o t s h o w n ) . E x a c t l o c a -t i o n s o f t h o s e f o o t p r i n t s i t e s a r e s h o w n on t h e e n h a n c e rs e q u e n c e ( F i g . 3 A ) . F o o t p r i n t s FP I I , FP I V , a n d FP V I I w e r ea l s o d e t e c t a b l e w i t h k i d n e y n u c l e a r e x t r a c t a t l e a s t o n o n es t r a n d , a l t h o u g h t h e l e v e l s o f p r o t e c t i o n w e r e l o w e r . On t h eo t h e r h a n d , f o u r r e g i o n s c o r r e s p o n d i n g t o FP I , FP I I I , FP V ,a n d FP V I w e r e p r o t e c t e d o n l y w i t h l i v e r e x t r a c t o n b o t hs t r a n d s . A d d i t i o n a l l y , s e v e r a l h y p e r s e n s i t i v e s i t e s ( i n d i c a t e d b ya s t e r i s k s o n t h e DNA s e q u e n c e i n F i g . 3 A ) w e r e a l s o o b s e r v e dn e a r o r w i t h i n t h e p r o t e c t e d s i t e s .F i g u r e 3 B s h o w s a s c h e m a t i c s u m m a r y o f t h e n u c l e a r p r o t e i nb i n d i n g s i t e s i n t h e 7 a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r . T h e s e q u e n c eh o m o l o g i e s b e t w e e n t h e s i t e s p r o t e c t e d b y l i v e r n u c l e a r e x t r a c tb u t n o t b y k i d n e y e x t r a c t ( F P I , FP V , a n d FP V I ) a n d k n o w nl i v e r - s p e c i f i c f a c t o r - b i n d i n g s i t e s a r e a l s o i l l u s t r a t e d . T h e FPI I I s i t e s h o w e d n o h o m o l o g y w i t h k n o w n b i n d i n g s i t e s . An1 1 - b p s e q u e n c e c l o s e l y r e l a t e d t o t h e t r a n s t h y r e t i n - h e p a t o c y t en u c l e a r f a c t o r 3 ( T T R - H N F - 3 ) c o n s e n s u s [ T A T T G A ( T /C ) T T A / T G ] ( 1 0 ) f o u n d w i t h i n t h e FP I p r o t e c t i o n s i t e i ss h o w n . S i m i l a r l y , h o m o l o g i e s w i t h TGT3-HNF-3 c o n s e n s u s[ T ( G / A ) T ' T G ( C / T ) ] ( 2 2 ) l o c a t e d w i t h i n FP V a n d FP V I a r es h o w n . T h e e x a c t n a t u r e o f t h e f a c t o r ( s ) t h a t b i n d s t o t h o s es i t e s i s u n d e r i n v e s t i g a t i o n .LDL u p - r e g u l a t e s t r a n s c r i p t i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e p r o x -i m a l p r o m o t e r w i t h e i t h e r t h e m o u s e a l b u m i n e n h a n c e r o r t h e7 a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r . T h e p r o t e i n b i n d i n g s i t e s l o c a t e dw i t h i n t h e 7 a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r s u g g e s t e d t o u s t h a t p e r -h a p s b o t h e n h a n c e r s a r e f u n c t i o n a l l y s i m i l a r . To s t u d y w h e t h e rt h e 7 o a - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r c o u l d b e s u b s t i t u t e d f u n c t i o n a l l yb y t h e a l b u m i n e n h a n c e r , we c o n s t r u c t e d a h y b r i d p l a s m i d ,p A E - R 7 a C A T - 5 . T h i s p l a s m i d c o n t a i n s t h e l i v e r - s p e c i f i c e n -h a n c e r f r o m t h e m o u s e a l b u m i n g e n e d e s c r i b e d b y P i n k e r t e ta l . ( 4 3 ) , e n c o m p a s s i n g t h e N h e I - B a m H I f r a g m e n t e x t e n d i n gf r o m - 1 0 . 4 t o - 8 . 5 k b , w h i c h a l s o f u n c t i o n s o n t h e a l b u m i n

p r o x i m a l p r o m o t e r i n H 2 . 3 5 c e l l s ( 5 6 ) . We i n s e r t e d t h i sf r a g m e n t i n t o pR7aCAT-5 j u s t u p s t r e a m o f t h e 7 a c - h y d r o x y -l a s e p r o m o t e r . T h i s c h i m er i c g e n e w a s t r a n s f e c t e d i n t o H 2 . 3 5c e l l s a n d c u l t u r e d u n d e r e i t h e r d e d i f f e r e n t i a t i n g o r d i f f e r e n t i -a t i n g c o n d i t i o n s a s d e s c r i b e d a b o v e .T h e d a t a i n F i g . 4B d e m o n s t r a t e t h a t t h e a l b u m i n e n h a n c e rs t i m u l a t e d t r a n s c r i p t i o n o f t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r ( f o u r -t o f i v e f o l d ) i n d i f f e r e n t i a t e d H 2 . 3 5 c e l l s c o m p a r e d w i t h d e d i f -f e r e n t i a t e d c e l l s . T h i s a c t i v a t i o n w a s s i m i l a r t o t h e o n e b y t h e7 c t - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r i n t h e c h i m e r i c g e n e p 7 a E - R 7 a C A T - 5( F i g . 2 a n d 4 A ) . M o r e i m p o r t a n t l y , w h e n c e l l s t r a n s f e c t e d w i t he i t h e r o n e o f t h e s e c h i m e r i c g e n e s w e r e c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c eo f i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f human L D L , CAT a c t i v i t y r o s eb e t w e e n 2 - a n d 2 . 5 - f o l d i n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s . I n d e d i f f e r e n t i -a t e d c e l l s l o w e r a c t i v a t i o n , i f a n y , w a s s h o w n , s u g g e s t i n g t h a t t h ef a c t o r ( s ) i n v o l v e d i n t h a t p r o c e s s i s p r o b a b l y e x p r e s s e d a t h i g h e rl e v e l s i n d i f f e r e n t i a t e d H 2 . 3 5 c e l l s .I n c u b a t i o n o f t h o s e c e l l l i n e s , H 2 . 3 5 t r a n s f e c t e d w i t h p 7 a E -R 7 o a C A T - 5 o r pAE-R7aCAT-5 o r H 2 . 3 5 t r a n s f e c t e d w i t h pAE-R 7 a G a l - 3 ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d b e l o w ) w i t h b i l ea c i d s s h o w e d o n l y 2 - f o l d r e g u l a t i o n , a t b e s t , o f t h e t r a n s c r i p t i o no f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e u n d e r a l l t h e c o n d i t i o n s t e s t e d( 2 8 ) , w h i c h i s f a r f r o m t h e 5 - t o 1 0 - f o l d r e g u l a t i o n i n v i v o .E x p r e s s i o n o f a l b u m i n e n h a n c e r - 7 o L - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r -l a c Z f u s i o n g e n e i n t r a n s g e n i c m i c e m i m i c s t h e c h o l e s t e r o l a n db i l e a c i d - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f t h e 7 o x - h y d r o x y l a s e g e n e . T h el a c k o f q u a n t i t a t i v e b i l e a c i d - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f t h e e x -p r e s s i o n o f 7 a - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r - C A T f u s i o n g e n e s i n t h et i s s u e c u l t u r e s y s t e m e x p l a i n e d a b o v e c o u l d b e d u e t o t h e f a c tt h a t l i v e r c e l l s i n c u l t u r e o f t e n d o n o t r e p r o d u c e f u n c t i o n so b s e r v e d i n v i v o ( 5 6 ) , o r , a s i t h a s b e e n s u g g e s t e d , p o s t t r a n -s c r i p t i o n a l c o n t r o l p l a y s a m a j o r p a r t i n t h a t r e g u l a t i o n ( 5 2 ,5 5 ) . To a d d r e s s t h e s e q u e s t i o n s , we d e c i d e d t o u s e t r a n s g e n i cm i c e . Two f u s i o n g e n e s ( F i g . 5 ) c o n t a i n i n g 1 . 6 k b o f t h e5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e w e r e m i c r o -

V O L . 1 4 , 1 9 9 4

7/27/2019 Acid Biliar

8/13

2 8 1 6 RAMIREZ ET A L .

+ 6 0 CA T S V 4 0_7aproe *

I * - T A T A A 1 1 \ S a l I B a m H I

- 1 0 4 0 0

A E - R 7 a x G A L - 3 r E A l b .S p h I N h e I

- 8 5 0 0 - 1 6 3 3e n h a n c e r L j . e n 7 o D r o m o t e rAB a m H I P s t I I T A T A A I \ S a l I

F I G . 5 . S t r u c t u r e s o f t h e 7 o - h y d r o x y l a s e promoter c o n s t r u c t s u s e d t o g e n e r a t e t r a n s g e n i c m i c e . A 1 . 6 - k b f r a g m e n t f r o m t h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o no f t h e r a t 7 o t - h y d r o x y l a s e gene i s d e n o t e d b y a s o l i d b a r . N u c l e o t i d e p o s i t i o n s - 6 3 3 t o +6 0 a re n u m b e r e d r e l a t i v e t o t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o ns i t e o f t h e r a t 7 c o - h y d r o x y l a s e gene. T h e p u t a t i v e TATA b o x i s s h o w n . T h e - 0 . 4 t o - . 5 k b mouse a l b u m i n e n h a n c e r r e g i o n i s r e p r e s e n t e d b ya s t i p p l e d b a r . T h e b a c t e r i a l l a c Z a n d CAT c o d i n g r e g i o n s t h a t we re u s e d as r e p o r t e r genes a n d t h e S V 4 0 t i n t r o n a n d p o l y a d e n y l a t i o n s i t e a r ei n d i c a t e d . R e s t r i c t i o n s i t e s u s e d f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g p l a s m i d s a n d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t he DNAs f o r m i c r o i n j e c t i o n a res h o w n .

i n j e c t e d i n m o u s e e m b r y o s a n d i m p l a n t e d i n f o s t e r m o t h e r s .R 7 o t C A T - 3 c o n t a i n s t h e 7 a - h y d r o x y l a s e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n i nf r o n t o f t h e CAT g e n e . A E - R 7 u t G a l - 3 c o n t a i n s t h e m o u s ea l bu m i n e n h a n c e r i n f r o n t o f t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e 5 ' - f l a n k i n gr e g i o n a n d t h e l a c Z g e n e . T a b l e 1 i s a s u m m a r y o f t h e m i c eb o r n a s a r e s u l t o f t h os e e x p e r i m e n t s . O f 4 7 m i c e s c r e e n e d f o rt h e p r e s e n c e o f R 7 o a C A T - 3 , 8 w e r e p o s i t i v e , a n d t h e y c o n -t a i n e d o n e t o f i v e c o p i e s o f t h e t r a n s g e n e i n t e g r a t e d i n t o t h e i rg e n o m e . E x p r e s s i on e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h F 1 m i c eg e n e r a t e d f r o m e a c h f o u n d e r a f t e r t h e m i c e w e r e f e d a d i e tc o n t a i n i n g 5 % c o l e s t i p o l ( a d i e t t h a t i n c r e a s e s 7 o t - h y d r o x y l a s emRNA [ 2 6 ] ) . We u s e d n o n t r a n s g e n i c m i c e f r o m t h e s a m el i t t e r s a s c o n t r o l s . No CAT a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n a n y o f t h o s em i c e .O f 5 2 m i c e b o r n a s a r e s u l t o f t h e i n j e c t i o n o f A E - 7 o t G a l - 3DNA, 1 6 c o n t a i n e d t h e t r a n s g e n e , a n d t h e n u m b e r o f i n t e -g r a t e d c o p i e s r a n g e d f r o m 0 . 6 ( p r e s u m a b l y a m o s a i c mouse f o rt h e t r a n s g e n e ) t o 7 . S i x o f t h e s e t r a n s g e n i c f o u n d e r s w e r e f e da d i e t c o n t a i n i n g 5 % c o l e s t i p o l , k i l l e d , a n d t e s t e d f o r e x p r e s -s i o n o f 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n l i v e r e x t r a c t s . Two o f t h e s ef o u n d e r s ( F O - 2 a n d F O - 3 ) s h o w e d e x p r e s s i o n o f t h e r e p o r t e rg e n e . T h e r e m a i n i n g f o u n d e r s w e r e m a t e d , a n d F 1 m i c e w e r et e s t e d f o r e x p r e s s i o n a s a b o v e . On e mouse l i n e ( l i n e 1 ) s h o w e de x p r e s s i o n a n d w a s u s e d f o r s u b s e q u e n t r e g u l a t o r y e x p e r i -m e n t s . T h e p r o p o r t i o n o f f o u n d e r m i c e e x p r e s s i n g t h e t r a n s -g e n e ( 1 i n 5 ) c a n b e c o n s i d e r e d a v e r a g e ( 4 2 ) .

TABLE 1 . S u m m a r y o f e x p e r i m e n t s w i t h t r a n s g e n i c m i c e aN o . o f N o : E x p r e s s i n g N o . o f R e p o r t e rp u p s t e s t e d p o s i t i v e ( F o ) l i n e g e n e s / c e l l b a c t i v i t y '

R7oCAT-3 4 7 8 1 - 5 NDA E - 7 o L G a l - 3 5 2 1 6 1 1 1 6 . 42 0 . 6 1 . 63 1 2 . 2

a Mouse e m b r y o s w e r e m i c r o i n j e c t e d w i t h f u s i o n g e n e s R 7 a C A T - 3 o r A E -7 a x G a l - 3 . P u p s b o r n w e r e t e s t e d f o r t r a n s g e n i c i t y b y S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s .I - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y w a s m e a s u r e d i n l i v e r e x t r a c t s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l sa n d M e t h o d s .b Number o f c o p i e s o f t h e i n s e r t e d DNA p e r g e n o m e , e s t i m a t e d f r o mS o u t h e r n b l o t s .c I n m i l l i u n i t s p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n . A l l a n i m a l s were c o l e s t i p o l f e d . F o rf o u n d e r 1 , t w o m i ce f r o m t h e F 1 g e n e r a t i o n were t e s t e d . F o u n d e r s 2 a n d 3 werek i l l e d a n d t e s t e d . N D , n o t d e t e c t a b l e .

To s t u d y w h e t h e r t h e e x p r e s s i o n o f t h e r e p o r t e r gene i n l i n e1 m i c e w a s r e s t r i c t e d t o t h e l i v e r , as i s t h e case f o r t h ee n d o g e n o u s r a t 7 a - h y d r o x y l a s e gene ( 2 6 ) , p r o t e i n e x t r a c t swere p r e p a r e d f r o m t h e l i v e r s , b r a i n s , h e a r t , k i d n e y s , a n d l u n g so f a n i m a l s f e d a r e g u l a r d i e t . As s h o w n i n F i g . 6 , , 3 - g a l a c t o s i -d a s e a c t i v i t y was c l e a r l y d e t e c t a b l e i n t h e l i v e r , very l o w i n t h eh e a r t , a n d u n d e t e c t a b l e i n b r a i n , k i d n e y , a n d l u n g e x t r a c t s .C u r i o u s l y , l i v e r e x p r e s s i o n i n m a l e s w a s f o u r f o l d h i g h e r t h a n i nf e m a l e s ( s e e D i s c u s s i o n ) .T h e r e g u l a t i o n o f t h e e x p r es s i on o f t h e a l b u m i n e n h a n c e r -7 a o - h y d r o x y l a s e - 4 a c Z t r a n s g e n e was e x a m i n e d b y m o n i t o r i n gc h a n g e s i n , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n response t o d i f f e r e n td i e t a r y m a n i p u l a t i o n s t h a t are known t o c o n t r o l r a t h e p a t i c7 o a - h y d r o x y l a s e . M i c e were f e d r e g u l a r chow ( n o r m a l d i e t ) orchow s u p p l e m e n t e d w i t h c o l e s t i p o l , c h o l e s t e r o l , or b i l e a c i d sf o r 5 t o 1 4 d a y s , a n d b o t h s o l u b l e p r o t e i n e x t r a c t s a n d t o t a lRNA were p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s .Th e r e s u l t s are s h o w n i n F i g . 7 . Q u a n t i t a t i v e l y e q u i v a l e n t l e v e l so f r e g u l a t i o n were o b s e r v e d f o r m i c e o f b o t h s e x e s , a l t h o u g h3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y was h i g h e r ( t h r e e - t o f o u r f o l d ona v e r a g e ) i n m a l e s t h a n i n f e m a l e s u n d e r a l l t e s t e d d i e t a r y

4 -1 ;

IP o.0

I T *a l e sO F e m a l e s2

0-L i v e r B r a i n H e a r t K i d n e y Lung

F I G . 6 . E x p r e s s i o n o f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e - 4 a c Z t r a n s g e n e i n d i f f e r -e n t t i s s u e s . 1 - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y was measured i n l i v e r , b r a i n , h e a r t ,k i d n e y , a n d l u n g e x t r a c t s as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d Meth od s.T r a n s g e n i c m a l e or f e m a l e m i c e f r o m l i n e 1 we re k e p t on a r e g u l a rchow d i e t a n d k i l l e d b e t w e e n t h e 6 t h a nd 8 t h h o f t h e d a r k p e r i o d . Th ed a t a are means w i t h s t a n d a r d errors o f t h e means f o r f i v e a n i m a l s e a c h .

- 1 6 3 3R7aCAT-3

P s t

+ 6 0 L a c Z S V 4 0

B a m H I

M O L . C E L L . B I O L .

, , I

7/27/2019 Acid Biliar

9/13

CHOLESTEROL 7a-HYDROXYLASE 2 8 1 7

C h e n od e o x y c h ol i c A c i d

C h o l i c A c i d

C o l e s t i p o l

Females*ales

C h o l e s t e r o l /

N o r m a l0 100 200

P - G a l a c t o s i d a s e A c t i v i t y( R e l a t i v e V a l u e s )F I G . 7 . D i e t a r y r e g u l a t i o n o f a l b u m i n e n h a n c e r - 7 o a - h y d r o x y l a s e -l a c Z f u s i o n gene e x p r e s s i o n . A n i m a l s were f ed t h e i n d i c a t e d d i e t s asd e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 3 - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y w a sm e a s u r e d i n l i v e r e x t r a c t s o f 6 - t o 8 - w e e k s - o l d m a l e or f e m a l e mice a s

d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . The d a t a are means w i t h s t a n d a r derrors o f t h e means f o r f i v e t o seven m i c e , e x p r e s s e d a s r e l a t i v en u m b e r s n o r m a l i z e d t o t h e v a l u e s f o r n o r m a l l y f e d males ( 4 mU/mg o fp r o t e i n ) .

c o n d i t i o n s ( s e e D i s c u s s i o n ) . C h o l e s t e r o l f e e d i n g e l e v a t e dP - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y 2 . 5 - f o l d i n males ( P s 0 . 0 0 5 ) a n d2 - f o l d i n f e m a l e s ( P c 0 . 0 2 5 ) , c o m p a r e d w i t h mice f e d an o r m a l d i e t . T h i s c o r r e l a t e s w e l l w i t h r e s u l t s i n o u r t i s s u ec u l t u r e s y s t e m ( F i g . 4 ) . S i m i l a r i n d u c t i o n w a s o b s e r v e d b yc o l e s t i p o l f e e d i n g o f m a l e ( 2 . 2 - f o l d ; P s 0 . 0 5 ) or female( 2 . 7 - f o l d ; P c 0 . 0 2 5 ) m i c e , c o m p a r e d w i t h m i c e f e d a normald i e t . C h o l i c a c i d f e e d i n g , on t h e o t h e r h a n d , r e d u c e d , B - g a l a c -t o s i d a s e a c t i v i t y i n b o t h m a l e s ( 2 . 9 - f o l d ; P c 0 . 0 5 ) and f e m a l e s( 2 . 4 - f o l d ; P c 0 . 0 0 5 ) . C h e n o d e o x y c h o l i c a c i d f e e d i n g a l s or e d u c e d f - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n b o t h m a l e s ( 4 . 3 - f o l d ; P c0 . 0 2 5 ) a n d f e m a l e s . Most s i g n i f i c a n t l y , i n m a l e s t h e l e v e l o f1 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n c o l e s t i p o l - f e d m i c e ( w h i c h corre-s p o n d s t o t h e l o w e s t l e v e l o f b i l e a c i d s i n t h e l i v e r ) was 6 . 5 - f o l d( P c 0 . 0 0 5 ) h i g h e r t h a n i n c h o l i c a c i d - f e d m i c e a n d 9 . 5 - f o l d ( Ps 0 . 0 0 5 ) h i g h e r t h a n i n c h e n o d e o x y c h o l i c a c i d - f e d m i c e .L i k e w i s e , f e m a l e c o l e s t i p o l - f e d m i c e showed 6 . 5 - f o l d ( P c0 . 0 0 5 ) h i g h e r 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y t h a n c h o l i c a c i d - f e d m i c ea n d 4 . 6 - f o l d ( P c 0 . 0 5 ) h i g h e r t h a n c h e n o d e o x y c h o l i c a c i d - f e dm i c e .To c o n f i r m t h a t t h o s e c h a n g e s i n 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t ywere a r e f l e c t i o n o f v a r i a t i o n s i n t h e l e v e l o f 3 - g a l a c t o s i d a s emRNA a n d t o d e t e r m i n e w h e t h e r e x p r e s s i o n o f t h e e n d o g e -n o u s 7 o t - h y d r o x y l a s e mRNA was s i m i l a r l y r e g u l a t e d , we quan-t i f i e d , B - g a l a c t o s i d a s e mRNA a n d 7 a - h y d r o x y l a s e mRNA i np o l y ( A ) + RNA p o o l s p r e p a r e d f r o m e q u a l amounts o f t o t a lRNA f r o m e a c h mouse b y s l o t b l o t a n a l y s i s ( F i g . 8 ) . Ton o r m a l i z e t h e a mount o f l o a d e d RNA, we a l s o q u a n t i f i e da l b u m i n m R N A. We u s e d RNA f r o m n o n t r a n s g e n i c m i c e f r o mt h e same l i t t e r s as a n e g a t i v e c o n t r o l . T h r e e s i n g l e - s t r a n d e dp r o b e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e t h r e e mRNAs were u s e d a sd e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s .As i n d i c a t e d i n F i g . 8 , , B - g a l a c t o s i d a s e mRNA l e v e l s s h o w e da p a t t e r n o f i n d u c t i o n b y c h o l e s t e r o l a n d c o l e s t i p o l , a n d o fs u p p r e s s i o n b y c h o l i c a c i d , s i m i l a r t o t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y .The l e v e l o f 3 - g a l a c t o s i d a s e mRNA i n m a l e s was a l s o h i g h e rt h a n t h a t i n f e m a l e s u n d e r a l l t h e d i e t a r y c o n d i t i o n s . R e g u l a -t i o n o f 7 a - h y d r o x y l a s e mRNA was very s i m i l a r , w i t h t h ee x c e p t i o n t h a t no d i f f e r e n c e i n t h e l e v e l o f 7 o t - h y d r o x y l a s e

mRNA w a s o b s e r v e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s u n d e r a n yd i e t a r y c o n d i t i o n . W i t h t h e s e a s s a y c o n d i t i o n s , t h e 7 o t - h y d r o x -y l a s e mRNA i n f e m a l e s f e d c o l e s t i p o l s h o w e d a s i x f o l d i n -c r e a s e w i t h r e s p e c t t o n o r m a l f e m a l e s ( F i g . 8 A ) , i n d i s a g r e e -ment w i t h t h e r e g u l a t i o n o b s e r v e d f o r t h e P - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y a n d m RNA. H o w e v e r , w h e n t h e 7 o a - h y d r o x y l a s emRNA wa s q u a n t i f i e d i n t h e i n d i v i d u a l t o t a l RNA s a m p l e sr a t h e r t h a n i n t h e p o o l e d p o l y ( A ) + R N A s , a t w o f o l d i n d u c t i o nwa s o b s e r v e d ( F i g . 8 B ) , i n a g r e e m e n t w i t h t h e 3 - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y a n d e n d o g e n o u s 7 o t - h y d r o x y l a s e mRNA.

DISCUSSIONI t i s c o m m o n f o r l i v e r - s p e c i f i c g e n e s n o t t o b e e x p r e s s e da n d / o r r e g u l a t e d i n t i s s u e c u l t u r e s y s t e m s i n a manner s i m i l a r

t o t h a t o f t h e e n t i r e a n i m a l ( 5 6 ) . A l s o , c o n d i t i o n s s u c h a st i s s u e - s p e c i f i c e x p r e s s i o n a n d c h o l e s t e r o l h o m e o s t a s i s r e q u i r ew h o l e a n i m a l m o d e l s t o s t u d y t h e c o m p l e x i n t e r a c t i o n s o fw h o l e o r g a n s y s t e m s . I n t h i s s t u d y we h a v e u s e d two e x p e r i -m e n t a l a p p r o a c h e s t o s t u d y t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h c h o l e s -t e r o l a n d b i l e a c i d s r e g u l a t e e x p r e s s i o n o f t h e 7 o a - h y d r o x y l a s eg e n e . F i r s t , w e u s e d a m o u s e h e p a t o c y t e - d e r i v e d c e l l l i n e ,H 2 . 3 5 , t h a t ca n b e p r o p a g a t e d i n a d e d i f f e r e n t i a t e d s t a t e a n dt h e n i n d u c e d t o t h e d i f f e r e n t i a t e d s t a t e a t w i l l ( 5 6 ) . T h eb i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s i n d u c t i o n i s e m p h a s i z e d b y t h ee n h a n c e d t r a n s c r i p t i o n o f a n u m b e r o f l i v e r - s p e c i f i c g e n e s ,s u c h a s a l b u m i n a n d s e v e r a l l i v e r - s p e c i f i c t r a n s - a c t i n g f a c t o r s( 2 5 , 3 1 , 5 6 , 5 7 ) , b u t n o t o f g e n e s e n c o d i n g a c t i n or rRNA ( 5 6 ) .U s i n g t h i s s y s t e m , we h a v e l o c a l i z e d a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e rl o c a t e d 7 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e o ft h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e . We a l s o s h o w e d t h a t LDLm e d i a t e s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f c h i m e r i c g e n e s , c o n t a i n -i n g e i t h e r t h e 7 a - h y d r o x y l a s e or t h e a l b u m i n e n h a n c e r i n f r o n to f t h e 7 a - h y d r o x y l a s e p r o x i m a l p r o m o t e r , t o t h e s a m e e x t e n t a st h e i n v i v o c h o l e s t e r o l - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f 7 o a - h y d r o x y l a s emRNA. H o w e v e r , i n t h a t t i s s u e c u l t u r e s y s t e m b i l e a c i d s o n l yp a r t i a l l y ( t w o f o l d , a t b e s t ) r e g u l a t e d r a t 7 o t - h y d r o x y l a s e p r o -moter a c t i v i t y . T h e s e l i m i t a t i o n s p e r s u a d e d u s t o u se t r a n s -g e n i c m i c e t o s t u d y t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h er e g u l a t i o n o f 7 o t - h y d r o x y l a s e e x p r e s s i o n . U s i n g t h a t a p p r o a c h ,i n t h i s a r t i c l e w e d e m o n s t r a t e t h a t t h e p r o m o t e r r e g i o n o f t h er a t 7 c e - h y d r o x y l a s e g e n e m e d i a t e s t h e r e g u l a t i o n o f i t s t r a n -s c r i p t i o n b y b i l e a c i d s a n d c h o l e s t e r o l . T h i s r e g u l a t i o n i sq u a n t i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h a t o f t h e e n d o g e n o u s m o u s e 7 a -h y d r o x y l a s e g e n e a n d o f t h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e g e n e ( 7 , 2 6 ,5 3 ) , i n d i c a t i n g t h a t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l m o d i f i c a t i o n d o e s n o tp l a y a m a j o r r o l e , i f a n y .S e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e h a v e l e d u s t o c o n c l u d e t h ee x i s t e n c e o f a l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r , 7 k b u p s t r e a m f r o m t h et r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e , i n t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e g e n e . F i r s t ,c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p R 7 a C A T - 9 , t h e c o n s t r u c t c o n t a i n i n gt h e l o n g e s t 7 a t - h y d r o x y l a s e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n , h a s f o u r f o l dh i g h e r CAT a c t i v i t y u n d e r d e d i f f e r e n t i a t i n g c o n d i t i o n s t h a nc e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p R 7 o t C A T - 8 , w h i c h l a c k s t h e 1 . 2 - k b Xba If r a g m e n t f r o m t h e f a r 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n . A l l o t h e r 5 ' d e l e t i o nm u t a n t s s t u d i e d s h o w e d l e v e l s o f e x p r e s s i o n s i m i l a r t o t h a t o fp R 7 a C A T - 8 ( F i g . 1 ) . More i m p o r t a n t l y , w h e n t r a n s f e c t e dH 2 . 3 5 c e l l s were i n d u c e d t o d i f f e r e n t i a t e t o h e p a t o c y t e - l i k ec e l l s , o n l y p R 7 o t C A T - 9 s h o w e d h i g h e r e x p r e s s i o n ( f o u r f o l d ) ,p r e s u m a b l y d u e t o a n i n c r e a s e i n t h e r a t e o f t r a n s c r i p t i o n . T h i sw a s q u a n t i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h e i n d u c t i o n o f a l b u m i n t r a n -s c r i p t i o n i n t h e s a m e c e l l s ( 5 6 ) . T h i r d , c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h a ni n t e r n a l l y d e l e t e d m u t a n t , p 7 c a E - R 7 a C A T - 5 , t h a t p l a c e s t h ep u t a t i v e e n h a n c e r i n f r o n t o f t h e 3 4 2 b p o f p r o x i m a l p r o m o t e rs h o w e d l e v e l s o f i n c r e a s e d e x p r e s s i o n u p o n d i f f e r e n t i a t i o n t h a twere s i m i l a r t o t h a t f o r p R 7 o a C A T - 9 ( F i g . 2 ) . Q u a n t i f i c a t i o n o f

I

V O L . 1 4 , 1 9 9 4

7/27/2019 Acid Biliar

10/13

2 8 1 8 RAMIREZ ET A L .

M a l e sg a l 7 |XA l b u m i n

:2Omm_~ IF e m a l e s

g a l 7 ( y A l b u m i

0

F I G . 8 . D i e t a r y r e g u l a t i o n o f 7 o - h y d r o x y l a s e a n d P - g a l a c t o s i d a s emRNA l e v e l s i n m o u s e l i v e r . P o l y ( A ) + RNA w a s i s o l a t e d f r o m p o o l e dt o t a l RNA f r o m l i v e r s o f m a l e a n d f e m a l e m i c e f e d t h e i n d i c a t e d d i e t sas d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . S l o t b l o t s were h y b r i d i z e d w i t hj 3 2 P - l a b e l e d p r o b e s f o r 1 - g a l a c t o s i d a s e [ w i t h 2 . 5 , u g o f p o l y ( A ) + R N A ] ,n 7 o z - h y d r o x y l a s e [ w i t h 2 . 5 , u g o f p o l y ( A ) + RNA o r 1 0 , u g o f t o t a l R N A ] ,a n d a l b u m i n [ w i t h 0 . 5 p . g o f p o l y ( A ) + RNA] a s a c o n t r o l . N y l o nm e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o X - r a y f i l m ( A ) f o r e i t h e r 9 d a y s ( P -g a l a c t o s i d a s e [ g a l ] ) o r 2 4 h a t - 7 0 C ( 7 a - h y d r o x y l a s e [ 7 o x ] ) w i t hi n t e n s i f y i n g s c r e e n s o r 2 4 h a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h n o s c r e e n( a l b u m i n ) . R a d i o a c t i v e b a n d s w e r e q u a n t i f i e d ( B ) b y u s i n g a P h o s p h o r -I m a g e r ( Mo l e c u l a r D y n a m i c s ) a f t e r a 2 4 - h e x p o s u r e a n d n o r m a l i z e d

_ w i t h r e s p e c t t o a l b u m i n mRNA. T h e v a l u e f o r c o l e s t i p o l - f e d f e m a l e sw a s o b t a i n e d b y a v e r a g i n g t h e i n d i v i d u a l t o t a l RNA s a m p l e s r a t h e rt h a n t h e p o o l e d p o l y ( A ) + RNAs. T h e v a l u e s a r e r e l a t i v e t o t h o s e f o rn o r m a l l y f e d m a l e s . 1 - G a l a c t o s i d a s e mRNA f r o m c h o l i c a c i d - f e df e m al e m i c e w a s u n d e t e c t a b l e . RNA f r o m n o n t r a n s g e n i c m i c e w a su s e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l .B

E l I v l n l a l l SN1a__~~~~~

0

C h o l i c A c i d

U t n o l e s t e r o lNormal

1 0 0 2 0 0 3 0 0O - g a l a c t o s i d a s e mR N A / A l b u n m i n mRNA

( R e l a t i v e V a l u e s )

mRNA b y S I n u c l e a s e t e c h n i q u e s c o n f i r m e d t h a t t h e i n d u c t i o nu p o n d i f f e r e n t i a t i o n w a s d u e t o a n i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f7 o x - h y d r o x y l a s e - C A T mRNA, a n d t h i s mRNA w a s i n i t i a t e d a tt h e s a m e p l a c e a s t h e e n d o g e n o u s r a t 7 o x - h y d r o x y l a s e t r a n -s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e ( F i g . 2 ) .A n o t h e r l i n e o f e v i d e n c e t h a t s u p p o r t s o u r f i n d i n g o f al i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r i n t h e r a t 7 o x - h y d r o x y l a s e g e n e d e r i v e df r o m t h e DNA s e q u e n c e a n d f o o t p r i n t a n a l y s i s ( F i g . 3 a n d d a t an o t s h o w n ) o f t h e e n h a n c e r r e g i o n a n d f r o m t h e DNAs e q u e n c e h o m o l o g i e s f o u n d w i t h t h e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s o fa l i v e r - s p e c i f i c t r a n s - a c t i n g f a c t o r HNF-3 ( F i g . 3 B ) . F o u rr e g i o n s w i t h i n t h e 7 o x - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r ( F P I , I I I , V , a n dV I ) w e r e p r o t e c t e d o n l y b y l i v e r n u c l e a r e x t r a c t s ( F i g . 3 ) . T h ec l u s t e r o f b i n d i n g s i t e s i n t h e 7 o t - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r r e s e m -b l e s a s i m i l a r c l u s t e r i n t h e mouse a l b u m i n e n h a n c e r ( 3 1 ) a n di s a common c h a r a c t e r i s t i c o f g e n e e n h a n c e r s . C o m p u t e ra n a l y s i s o f a d a t a b a s e c o n t a i n i n g t h e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e sf o r l i v e r - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s r e v e a l e d a 1 0 0 % h o m o l -o g y w i t h a n o c t a n u c l e o t i d e f o u n d i n FP V I ( - 6 4 0 5 t o - 6 4 4 0 )a n d t h e c o n s e n s u s b i n d i n g s i t e [ T ( G / A ) T I T G ( C / T ) T ] f o r t h eTGT3-HNF3 f a c t o r ( F i g . 4 B ) , w h i c h o c c u r s a t t h e eH s i t e o fmouse a l b u m i n e n h a n c e r ( 2 5 , 3 1 ) a n d o t h e r l i v e r - s p e c i f i c g e n e s( 1 7 , 2 2 , 3 4 , 3 6 , 5 0 ) . C o m p e t i t i o n g e l s h i f t e x p e r i m e n t s a l s os u g g e s t e d t h a t t h e same o r h o m o l o g o u s f a c t o r b i n d s t o t h e eHs i t e o f t h e a l b u m i n e n h a n c e r a n d t o t h e FP V I s i t e o f t h e7 o t - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r ( d a t a n o t s h o w n ) .

0 1 00 0 2 0 0 3 0 07 t - h y d r o x y l a s e m R N A / A l b u m i n mRNA

( R e l a t i v e V a l u e s )

T h e f i n a l e v i d e n c e s u p p o r t i n g t h e e x i s t e n c e o f a l i v e r - s p e c i f i ce n h a n c e r i n t h e r a t 7 o x - h y d r o x y l a s e g e n e c o m e s f r o m t h es t u d i e s w i t h t h e a l b u m i n e n h a n c e r . We h a v e d e m o n s t r a t e d t h a tt h e 7 o - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r r e g i o n c a n b e f u n c t i o n a l l y s u b s t i -t u t e d b y a n o t h e r l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r , t h e m o u s e a l b u m i ne n h a n c e r ( F i g . 4 ) . T h i s e n h a n c e r i s e s s e n t i a l f o r m a x i m a le x p r e s s i o n o f t h e a l b u m i n p r o m o t e r i n d i f f e r e n t i a t e d H 2 . 3 5c e l l s ( 5 6 , 5 7 ) a n d i n t r a n s g e n i c m i c e ( 4 3 ) . B o t h b a s a l a c t i v i t ya n d i n d u c t i o n o f t h e e x p r e s s i o n u p o n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n f r o mc h i m e r i c g e n e s t h a t c o n t a i n t h e 7 o a - h y d r o x y l a s e w e r e e q u i v a -l e n t t o t h o s e f r o m t h e g e n e s c o n t a i n i n g t h e m o u s e a l b u m i ne n h a n c e r ( F i g . 4 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e a l b u m i ne n h a n c e r ma y r e q u i r e i t s own p r o m o t e r , b e c a u s e i t d i d n o tf u n c t i o n w i t h t h e g r o w t h h o r m o n e p r o m o t e r i n t r a n s g e n i c m i c e( 4 3 ) . H e r e , h o w e v e r , we d e m o n s t r a t e t h a t t h e a l b u m i n e n -h a n c e r c a n , i n f a c t , a c t i v a t e a h e t e r o l o g o u s p r o m o t e r b o t h i nt i s s u e c u l t u r e c e l l s ( F i g . 4 ) a n d i n t r a n s g e n i c m i c e ( F i g . 5 t o 8a n d T a b l e 1 ) . T h i s f i n d i n g u n d e r l i e s t h e s i m i l a r i t i e s b e t w e e nb o t h e n h a n c e r s . F i r s t , t h e t r a n s - a c t i n g f a c t o r ( s ) t h a t b i n d s t ob o t h e n h a n c e r s s e e m s t o b e s i m i l a r a c c o r d i n g t o t h e s e q u e n c eh o m o l o g y a n d t h e g e l s h i f t c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t s d i s c u s s e da b o v e . S e c o n d , t h e f a c t t h a t t h e a l b u m i n e n h a n c e r c a n f u n c -t i o n a l l y s u b s t i t u t e t h e 7 o - h y d r o x y l a s e e n h a n c e r i m p l i e s t h a tb o t h e n h a n c e r s a r e c a p a b l e o f i n t e r a c t i n g w i t h t h e 7 a o - h y d r o x -y l a s e p r o x i m a l p r o m o t e r i n v i v o .T h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e h u m a n 7 o t - h y d r o x y l a s e g e n e

AP r o b e sl ) i e t s

N o r m a lC h l o l e s t e r o l( C o l e s t i p o lC h o l i c A c i d

C o n t r o l .B g ~ ~ ~ ~ ~ ~ F e m n a l o . s| * ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ M a l o s. `o l e s t i - p o lM O L . C E L L . B I O L .

I " I 4. I

, r - ' I L - -l -4. I

7/27/2019 Acid Biliar

11/13

CHOLESTEROL 7a-HYDROXYLASE 2 8 1 9h a s b e e n i s o l a t e d a n d f u n c t i o n a l l y c h a r a c t e r i z e d w i t h HepG2c e l l s a s r e c i p i e n t s ( 3 3 ) . A l i v e r - s p e c i f i c e n h a n c e r h a s b e e nl o c a l i z e d a t p o s i t i o n -432 t o -2 2 0 , a l t h o u g h no c h o l e s t e r o l orb i l e a c i d r e g u l a t i o n h a s y e t b e e n s h o w n t o b e m e d i a t e d b y t h i s5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e human 7 a - h y d r o x y l a s e gene. I t i si n t e r e s t i n g t h a t t h e DNA sequence b e t w e e n -4 3 2 a n d - 2 2 0 ,w h i c h appears t o c o n f e r c e l l s p e c i f i c i t y on t h e t r a n s c r i p t i o n o ft h e human 7 a - h y d r o x y l a s e gene, h a s o n l y 51% h o m o l o g y w i t ht h e r a t 7 a - h y d r o x y l a s e promoter a n d s e v e r a l o f t h e r e l e v a n tr e g u l a t o r y e l e m e n t s f o u n d i n t h e human promoter a re m i s s i n gi n t h e r a t ( 3 3 ) . H o m o l o g o u s e l e m e n t s ( H N F - 3 m o t i f s ) a ref o u n d i n t h e r a t e n h a n c e r l o c a t e d 7 k b upstream o f t h et r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o n s i t e as d e s c r i b e d i n t h i s a r t i c l e ( F i g .3 ) . I t s eem s t h a t p e r h a p s e v o l u t i o n h a s p l a ce d t h a t e n h a n c e rc l o s e r t o t h e p r o x i m a l promoter i n t h e human gene, a l t h o u g hi t c a n n o t b e r u l e d o u t t h a t t h e human gene c o n t a i n s a n o t h e re n h a n c e r a t a p o s i t i o n s i m i l a r t o t h a t o f t h e r a t gene.E x p r e s s i o n o f c h i m e r i c genes, c o n t a i n i n g t h e 7 o t - h y d r o x y l a s ep r o x i m a l promoter w i t h e i t h e r i t s own e n h a n c e r or t h e a l b u m i ne n h a n c e r , i s i n d u c e d up t o 2 . 5 - f o l d i n d i f f e r e n t i a t e d c e l l si n c u b a t e d i n t h e presence o f LD L ( F i g . 4 ) . Th e c o n c e n t r a