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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nanostrukturen aus biologischer Sicht II Molekulare Maschinen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie This presentation is subject to constant change and not for use by the general public. Last years presentation of the course is available online only for participants of this course. Login, password and authorization should only be obtained from the author. Any access to this file that has not been explicitly authorized by the author will be prosecuted. The author is aware that, due to rapid changes in the field, some material may be outdated or incorrect. Mistakes can never be ruled out. The author is aware that some figures may not be correctly referenced, this will be completed with time and/or corrected during the lecture. With access to this material, users confirm that they are aware of these shortcomings and that they will not make the author liable for any mistakes. Kassel, April 2008 Wolfgang Nellen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Inhalte: Isolierung von Proteinen Reinigung komplexer molekularer Maschinen Knstliche Konstruktion von Dimeren Antikrper zur Detektion von Modifikationen an Einzelmoleklen Targeting von Proteinen an Nukleinsuren Detektion und Funktion von RNP Maschinen Die Notwendigkeit molekularbiologischer Grundlagen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Molekularbiologische Nanomaschinen werden (meist) nicht de novo konstruiert oder synthetisiert. Um sie zu verstehen und letztlich manipulieren zu knnen, ist zuerst ihr Aufbau und ihre Funktion zu analysieren. Anders als in der Synthesechemie erfolgt dies reduktionistisch und Top-Down. Die Charakterisierung molekularer Nanomaschinen erfordert die Kenntnis molekularbiologischer Methoden und ein Verstndnis dafr, was diese Methoden aussagen knnen und was nicht.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 1: An eine eukaryotische mRNA wird ein Linker ligiert, um die mRNA ber PCR zu amplifizieren. TGGAGTTGCGGAATTCACTAGTTG.....CGAAAAA Warum geht das nicht? Wie kann man das Problem lsen?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 2: Eine molekulare Maschine produziert aus dem Substrat X in vivo das Produkt Y. Ein Kandidaten-Gen A wird im Organismus ausgeschaltet und die Reaktion von X nach Y fllt aus. Das Produkt des Gens A wird rekombinant hergestellt und die Reaktion wird in vitro durchgefhrt. Die Produktion von Y findet nicht statt. Genprodukt A ist notwendig, aber nicht hinreichend fr die Reaktion. Was knnen die Grnde dafr sein und wie kann man das herausfinden?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie - hammerhead ribozyme cis cleavage Das Hammerhead-Ribozym ist eine katalytische RNA Sequenz, die ein subvirales (z.B. Viroid) Rolling-Circle-Transkript in Fragmente von Einheitslnge zerschneidet. Beispiel 3:

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Natural cis cleavage Die Struktur des Ribozyms wurde aufgeklrt und der Mechanismus (weitgehend) verstanden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann diese einfache molekulare Maschine so umgebaut werden, dass sie fr andere Zwecke eingesetzt werden kann? A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Engineered trans cleavage 3' 5' C. Hammann et al. (1997) Nucleic Acids Res. C. Hammann et al. (1999) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Ein Teil des Ribozyms wird in vivo produziert. Der zweite Teil wird von einer zellulren Ziel- RNA gestellt. Hybridisierung des (partiellen) Ribozyms mit dem Ziel rekonstruiert die enzy- matisch aktive Struktur. Die Ziel-RNA wird zerschnitten. A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Die minimale katalytisch aktive Sequenz wurde bestimmt. Sie kann in vitro aus drei einzelnen Moleklen zusammengesetzt werden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Natural cis cleavage A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Engineered trans cleavage 3' 5' Die Reaktion ist allerdings nicht sehr effektiv. Was ist der Unterschied zwischen den beiden Strukturen? Welche Vermutungen kann man anstellen? Wie knnte die Reaktion verbessert werden?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Przybilski et al. (2005) Plant Cell Ara2 AU C 3'5' III I II L1L2 AAGAAG UGAUGA C U G A U G A A A C U C AA A GG C Scheinbar einfache Molekle wie RNA erlauben eine Vielzahl unterschiedlicher dreidimensionaler Strukturen. Die Aufklrung dieser Strukturen und ihre Vorhersage steckt noch in den Kinderschuhen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Klassische Reinigungsmethoden der Biochemie zur Reinigung von Proteinen und Proteinkomplexen: Zellfraktionierung Gelfiltration Ultrazentrifugation Ionenaustauscher HPLC

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Reinigung ber 6x His-Tag (6 CAU Codons an 5- oder 3-Ende) nitrilotriaceticacid (NTA)HistidinNi-NTA Coordinierung von 2 His an ein Ni 2+ www.uni-giessen.de/biochem/BC_GS

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Protein Beta-Galaktosidase hat ein Molekulargewicht von 116kD. Die funktionelle Maschine ist ein Tetramer von 464kD. Die gesamte Maschine kann einfach und funktionsfhig als rekombinantes Protein gereinigt werden (Praktikumsversuch). LysatWaschschritte 1 2 - 3 Eluat (dieses Gel zeigt die Aufreinigung von EriA, nicht von Beta-Gal!)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Science Bridge 2007 Daniela Moll & Sara Mller PDB IX4 Fehlfunktion oder Mutation fhrt zu Laktoseintoleranz (besonders verbreitet im asiatischen Raum, in Sdamerika und Sdafrika).

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nachteile von His-Tags: Endogene, Histidin-reiche Proteine binden auch an die Sule. Unspezifische Bindung von Lektinen an die Agarose-Matrix. andere ionische Wechselwirkungen knnen Proteinkomplexe stren Vorteile von His-Tags: kurzer Tag, meist geringe Auswirkungen auf Proteinfunktion Reinigung einfach und schnell Imidazol im Eluat

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ntzliche Beispiele fr Proteinreinigung: Taq Polymerase Pfu Polymerase TEV Protease SP6 RNA Polymerase Vor ca. 25 Jahren reinigten Diplomanden, Doktoranden oder TAs als Gemeinschaftsaufgabe Restriktionsenzyme, weil es sie kommerziell nicht gab oder weil sie zu teuer waren. In den 90er Jahren konnte man alles kaufen. Was es nicht bei Boehringer gab, das gab es einfach nicht. Und das Geld war da, um Enzyme zu kaufen und nicht die Zeit von Wissenschaftlern zu verschwenden. Heute reinigen Diplomanden, Doktoranden oder TAs Taq, Pfu, TEV, SP6 und andere, weil es sich bei dem knappen Etat lohnt, etwas Geld zu sparen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie TAP-Tag (tandem affinity purification) The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification Oscar Puig, Friederike Caspary, Guillaume Rigaut, Berthold Rutz, Emmanuelle Bouveret, Elisabeth Bragado-Nilsson, Matthias Wilm, and Bertrand Seraphin, METHODS 24, 218229 (2001) geeignet fr gute und schnelle Reinigung komplexer Maschinen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie IgG Protein A TEV CBP Protease Calmod. PAGEMS

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Zwei IgG Bindedomnen von Protein A (aus Staph. aureus) Calmodulin binding protein (CBP) bindet nur in Gegenwart von Ca 2+ an Calmodulin (Elution mit Chelator EGTA). Schnittstelle fr (virale) TEV Protease: 7 AA Consensus Sequenz Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser. Komplex wird von der Matrix abgeschnitten

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Gen Rse1 wurde mit TAP getagged und ist als CBP-Rse1 Fusion am strksten auf dem Gel vertreten. (aus Puig et al., 2001) Proteine der isolierten Komplexe werden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Einzelne Banden werden dann massenspektrometrisch identifiziert. (TEV Protease geht im zweiten Reinigungsschritt in den Abfall! oft wird nur ein Reinigungsschritt durchgefhrt!)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Variationen: Strep-Tag Basiert auf der Interaktion von Streptavidin mit Biotin (K d ~ 10 15 M -1 ) Mit kombinatorischen Methoden wurde ein Streptavidinderivat Strep-tactin entwickelt, das hochaffin an ein kurzes Peptid (Strep Tag - ersetzt Biotin) bindet: NH 2 WSHPQFEK COOH Das Zielprotein wird mit dem Strep-Tag fusioniert und an eine Matrix mit gekoppeltem Strep-tactin gebunden. Die Elution erfolgt mit einem Biotinderivat (Desthiobiotin). http://smid.blueprint.org/mod2pcsimilar.php?id=698 Biotin

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Vorsicht bei Isolierung von getaggten Proteinen mit ihren putativen Bindungspartnern! berexpression: Die Fusionsproteine werden meist berexprimiert, die anderen Teile der molekularen Maschine aber nicht! a) viel hilft nicht viel! substoichiometrische Mengen an Bindungspartnern! b) groe Mengen knnen zu Bindung mit unspezifischen Partnern fhren. Zellulre Reaktionen: a) Tags knnen in der Zelle Stressreaktionen auslsen (Stressproteine, stressbedingte, andere Interaktionspartner). b) Getaggte Proteine knnen andere (geringere) Affinitten als das endogene Protein haben und konkurrieren manchmal schlechter um Interaktionspartner.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lsungsmglichkeiten: Single Copy Insertionen in das Genom Knock out des Endogens Einfgung des Tags in das Endogen (homologe Rekombination) Alle Lsungen sind suboptimal, besonders bei molekularen Maschinen, die in geringer Anzahl in der Zelle vorhanden sind. 10 9 bis 10 10 Zellen sind meist erforderlich, d.h. ca. 10 bis 20 l Zellkultur!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Eine weitere (suboptimale) Alternative, Interaktionspartner zu identifizieren: Bindung des rekombinanten Bait-Proteins an eine Matrix (z.B. Ni-NTA). Inkubation mit einem Zellextrakt Waschen Elution des Bait-Proteins mit assoziierten Partnern Problem: in der Zelle liegt das endogene Bait-Protein im Komplex mit den Partnern vor. Das Experiment funktioniert nur, wenn der Komplex einen ausreichenden turn-over hat.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Artifizielle Zusammensetzung von verschiedenen Komponenten (artifizielle Dimere). Yeast-Two-Hybrid-System Yeast-One-Hybrid-System FK506 System Lokalisation durch RNA bindende Proteine

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast two hybrid system Deutsches Ressourcenzentrum fr Genomforschung GmbH Gal4 DNA binding domain: Bait-Vector (TRP1) Gal4 Activation domain: Prey-Vector (Leu2) mit cDNA Bibliothek. basiert auf dem modularen Aufbau von Transkriptionsfaktoren

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Xiaoxioa Zhang, 2006

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A -Gal Gen mit Gal4 aktiviertem Promotor (Gal1) liegt im Genom der Hefe. Ein Gal4 aktiviertes His3 ist ebenfalls im Hefegenom integriert. TRP1 liegt auf Bait Vector Leu2 liegt auf Prey Vector c-myc Epitop zum Nachweis der Bait-Expression. T7 prom. u.a. als priming site um Gal4 DBD Bait ORF zu besttigen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Selektion, Screening auf Interaktion zwischen Bait und Prey: Selektion auf Leu -, Trp - Medium (Test auf Anwesenheit von beiden Vektoren) Screening auf X-gal Medium fr Interaktion zwischen Bait und Prey Selektion auf His - mit 3-Amino-1,2,4-trizol (3-AT) unterscheidet starke und schwache Interaktionen. Restriktionsverdau positiver Prey Vektoren (eventuelle Duplikate ausschlieen). Sequenzierung der Prey Inserts, Vermutungen zu wahrscheinlichen Partnern. Rckfhrung der Prey Vektoren in E. coli (andere Resistenz als Bait Vektor!) Umkehrung von Prey und Bait Vektoren Screening auf Interaktion berprfung, ob Prey Vektor die Induktion alleine vermitteln kann (Y1H!)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Y2H System wird auch eingesetzt, um vermutete Interaktionen direkt zu prfen. Das heit, in Bait- und Prey-Vektor werden bekannte Gene eingesetzt und es wird berprft, ob die Kombination zur Induktion von -Gal fhrt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Verschiedene Mglichkeiten, Interaktion zu besttigen: FRET (fluorescence resonance energy transfer), Biacore, funktionelle Assays in vitro, Co-Lokalisation mit GFP / RFP getaggten Versionen in vivo (FM). Co-Immunprzipitation Beachte: Die beschriebene Methode gilt fr Proteine, die im Zellkern interagieren knnen. Membranproteine, extrazellulre Proteine, Proteine in Zellorganellen sind nicht mit dieser Methode zu erfassen!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM AD DBD baitprey Ub-NUb-C

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM AD DBD bait Ub-N prey Ub-C

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM AD DBD bait Ub-N prey Ub-C AD DBD zum Kern

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel fr extrazellulre Proteine GHR (Growth hormone receptor) mit Gal4 DBD exprimiert. (GHR ist ein intrazellulrer Rezeptor, kein Membranrezeptor! GH (growth hormone) mit Gal4 AD exprimiert. GH wird sekretiert, kann in andere Zellen eindringen und an den cytoplasmatischen Rezeptor GHR binden. Der Rezeptor-Ligandenkomplex wird in den Kern transportiert. Die durch GH GHR Komplex verbundenen Gal4 Domnen aktivieren -gal.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast one hybrid Nutzt allein die Aktivierungsdomne fr verschiedene Analysen. Wenn unbekanntes Protein an DNA-Motiv bindet, wird Reporter aktiviert. Identifizierung von DNA-Bindedomnen. AD ? Reporterbinding site

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD DNA library Die Bindestelle auf der DNA wird durch eine Bibliothek verschiedener Varianten ersetzt. Bestimmung der Consensus-Sequenz, die eine Interaktion erlaubt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD binding site Mutagenese der DBD Bestimmung der AA Sequenz und Proteinstruktur, die Interaktion erlaubt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vivo Targeting von Proteinen Proteine knnen mit verschiedenen Tricks innerhalb der Zelle an verschiedene Orte dirigiert werden. Dort kann so die lokale Konzentration erhht werden Proteine knnen bevorzugt in bestimmte Komplexe eingebaut werden. Proteine knnen durch Interaktionsdomne in einen Komplex gezwungen werden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch ein externes Signal knnen in der lebenden Zelle zwei Proteine mit einander verbunden werden. Damit knnen Komplexe geschaffen werden, die auf natrliche Weise nicht vorkommen. Die lokale Konzentration eines Proteins kann an einem Ort der Zelle erhht werden, wenn einer der Partner in der Zelle spezifisch lokalisiert ist.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Zugabe eines Liganden fhrt zur Interaktion der beiden Proteine. Wenn eines an einem Ort der Zelle konzentriert ist, wird es die Konzentration des Partners an diesem Ort erhhen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Tacrolimus (Prograf) Macrolide Lakton aus Streptomyceten. Verwendung als Immunsuppressor wie Cyclosporin. GD Van Duyne, et al., Science 252, 839 (1991) 2 FKBPs binden cooperativ an ein FK506 Molekl. FK506 kann wieder aus der Zelle ausge- waschen werden und die Protein- assoziation wird rckgngig gemacht.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch rational design und Mutagenese wurde eine FKBP konstruiert, die ohne FK506 dimerisiert. Die Zugabe von FK506 fhrt bei diesem Derivat zu einer Dissoziation des Dimers.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Targeting von Proteinen an spezifische RNA oder DNA Sequenzen (kleiner Exkurs in Nukleinsure Protein Interaktionen). Manche Proteine erkennen spezifisch DNA Sequenzen oder Strukturen. (z.B. Restriktionsenzyme, Modifizierungsenzyme). M EcoRV Anspach, Nellen, Jeltsch Die Bindung verursacht in manchen Fllen Strukturnderungen in der Nukleinsure-Komponente des Komplexes. Hier jedoch nur, wenn das Protein an der richtigen Bindungsstelle (Mitte) sitzt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie J. R. Horton, K. Liebert, M. Bekes, A. Jeltsch, X. Cheng Journal of Molecular Biology, 358, 559-570 Structure and substrate recognition of the Escherichia coli DNA adenine methyltransferase.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Moleklmitte! Bestimmung der Bindungsstelle mit SFM. Messung des Knickwinkels der DNA an korrekt gebundenem Protein. Knickwinkel an unspezifischen Binde- stellen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Manche Proteine erkennen spezifische RNA Strukturen und Sequenzen. ADAR (adenosine deaminase that acts on RNA) erkennt eine spezifische Hairpinstruktur. (Bei dieser Moleklkonstruktion ist die Orientierung durch die Gabelung erkennbar)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Auswertung der SFM Daten zeigt wo und mit welcher Genauigkeit (im Vergleich zu unspezifischer Bindung) das Protein seine Erkennungssequenz im Molekl findet. Als Kontrolle werden Molekle ohne die Erkennungssequenz/Struktur oder mit mutierten Sequenzen verwendet.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Biochemisch wird der Interaktionsnachweis auch durch Gelshif Assays (EMSA = electrophoretic mobility shift assay) gefhrt. Biacore Experimente wurden in der Biochemie erklrt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Einschub: was versteht wer unter Nanostrukturwissenschaften? (zugegeben: mit gewisser Voreingenommenheit!) Synthesechemie physikalische Charakterisierung chemische Charakterisierung Anwendung physikalische Methodenentwicklung proof of principle experiment (Fragestellung spielt nicht unbedingt eine Rolle ) Theorie- entwicklung

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beobachtung eines biologischen Mechanismus Isolierung der Komponenten (Methoden dazu!) Identifizierung/Annahme eines molekularen Mechanismus, einer molekularen Maschine reduktionistische Rekonstruktion der Maschine in vitro strukturelle Analyse (chemische/physikalische Methoden) funktionelle Analyse der Komponenten in vivo (zurck zu den Genen im Organismus) molekulare Analyse der Funktion in vivo (was kann die Maschine?) funktionelle Analyse in vitro (Assay- Entwicklung, Synthese von Komponenten, Synthese von Substraten) funktionelle Besttigung, (Detailanalyse mit modifizierter Maschine und (chem.) modifizierten Substraten in vitro) rationales Design modifizierter Maschinen (fr technische, biomedizinische Anwendung) systembiol. Komponenten- analyse, (verwandte Mechanismen Struktur-Funktion-Verhltnis, Bioinformatik) Dynamik der Maschine in vitro (Assembly/Disassembly, transiente Komponenten) Dynamik der Maschine im Systemnetzwerk (erfordert Analyse aller interagierenden Maschinen wie oben)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Analyse biologischer Nanomaschinen erfordert die Entwicklung bzw. Adaptation chemischer, physikalischer, mathematischer und bioinformatischer Werkzeuge, die genau auf die jeweilige Problem- stellung ausgerichtet sind. Das Verstndnis der biologischen Fragestellung sowie das Verstndnis biologischer Systeme ist erforderlich, um zu wissen, welche chemischen/ physikalischen Methoden man sinnvoll einsetzen kann/soll. (Beispiel: Lngenmessung von DNA Fragmenten nicht mit AFM sondern mit Gelelektrophorese) Ein einfaches proof-of-principle Experiment kann eine neue Methode interessant machen, lst aber nicht das Problem der spezifischen An- passung an die Fragestellung. Beispiel: die Mglichkeit, chemisch methylierte DNA mit SFM zu detektieren, lst nicht das Problem, in vivo methylierte DNA zu detektieren.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Weitere Beispiele fr Proteine, die spezifische RNA Strukturen oder Sequenzen erkennen: CBP PABP TBP prokaryotische RNA Polymerase virale Proteine: Tat bindet an HIV TAR RNA (Hairpin) N-Protein (Page Lambda) bindet an B-Box auf RNA (Antiterminator)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukt Nr. 1: Reportergen Luziferase (fr quantitative Bestimmung der Genexpression/ Translation), 5 B-Box Sequenzen im 3-UTR. Gezeigt ist die transkribierte mRNA. Luciferase AAAAA N-ProteinAgo A Konstrukt Nr. 2 Fusion von N-Protein und Testprotein (hier AgoA) mit flexiblem Linker. Expression des Fusionsproteins in Zelle. Assoziierung eines Proteins mit einer spezifischen mRNA

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Luciferase AAAAA AgoA wird normalerweise durch kleine RNAs (miRNAs) spezifisch an den 3 UTR einer mRNA rekrutiert und inhibiert die Translation. Das Experiment zeigt, dass die miRNA keine weitere Funktion als die eines Guides hat. AgoA kann Translation auch inhibieren, wenn es durch Protein RNA Interaktion an den 3 UTR gebracht wird. R. S. PILLAI, C. G. ARTUS, and W. FILIPOWICZ, (2004): RNA, 10:15181525. Neuere Ergebnisse zeigen jedoch, dass der knstliche Komplex in einer Ein- bahnstrae landet und und ohne die miRNA nicht reaktiviert werden kann.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Proteinen-Protein oder Proteinen-Nukleinsure-Interaktionen werden von (lokalen) Konzentrationen und Affinitten bestimmt. Interaktionen ndern sich mit lokalen und temporren Konzentrationen Liganden knnen miteinander in Konkurrenz treten konkurrierende Substrate und Liganden knnen ihre Affinitt durch Modifikationen ndern Der in vitro gemessene K D Wert sagt nicht viel ber die Situation in einer Zelle aus!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie g Protein % Komplex Vergleich der Komplexbildung zwischen zwei verschiedenen dsRBDs mit einem dsRNA Substrat (EMSA, Endpunktbestimmung nach festgelegter Inkubationszeit)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF Dicer Dicer-dsRBD hat niedrigeren K ass als HelF aber gleichen K diss K ass 2,72 e 5 1/Ms K diss 4,4 e -3 1/s K D 19,5 nM K ass 4,7 e 4 1/Ms K diss 7,7 e -3 1/s K D 171 nM Biacore, Kinetik in Echtzeit Popova & Biaffin, 2005

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass (1,3 0,5)e 4 l/Ms(4,7 1,0)e 4 1/Ms(2,0 0,6)e 5 1/Ms(2,7 1,2)e 5 1/Ms k diss (8,0 2,2)e -3 1/s(7,7 2,6)e -3 1/s(2,2 0,8)e -3 1/s(4,4 2,2)e -3 1/s KDKD (70,6 27,1) nM(171 39) nM(12,1 3,9) nM(19,5 9,3) nM HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass 2,7 e 4 1/Ms 8,2 e 4 1/Ms6,6 e 4 1/Ms k diss 3,4 e -4 1/s5,8 e -4 1/s8,9 e -4 1/s1,0n e -3 1/s KDKD 12,7 nM21,1 nM10,9 nM15,3 nM Pre-let7 dsRNA

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF dsRBD interagiert mit pre-miRNA (Bulges) bei hherem K D als mit perfekter dsRNA. Die dsRBD von Dicer unterscheidet nicht zwischen den beiden Substraten. Der Unterschied beruht hauptschlich auf einem Unterschied in K diss. Die Daten werden durch quantitative EMSAs und Scanning Force Microscopie (SFM) untersttzt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP: Chromatin Immune Precipitation Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Formen von Chromatin assoziiert sind. Epigenetische Regulation erfolgt ber die Remodellierung von Chromatin. Dabei werden z.B. Histonvarianten ausgetauscht, andere spezifische Proteine mit dem Chromatin assoziiert und wieder andere Proteine (z. B. Histone) posttranslational modifiziert. Die klassische Aufteilung in Euchromatin (aktiv) und Heterochromatin (inaktiv) ist nicht mehr ausreichend, es gibt weitere Formen, die durch spezifische Komplexe gekennzeichnet sind.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie H3: blau H2A: gelb H2B: rot H4: grn 147 bp DNA 1,65 Windungen Core-Nucleosom Zur Erinnerung aus der Grundvorlesung

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Obwohl Histonmodifikationen evolutionr konserviert sind, ist fr genauere Chromatinuntersuchungen eine Kartierung der Modifikationen sinnvoll. Kartierung von H3A Modifikationen in vegetativen Dictyosteliumzellen Diese Karte sagt noch nichts ber eventuelle Modifikationen (und entsprechende nderungen der molekularen Maschinen) in der Entwicklung aus!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es stehen Antikrper zur Verfgung, die einzelne Histonmodifizierungen erkennen, z.B. H3K9me2, H3K9me3. Weiterhin gibt es Antikrper gegen andere Chromatinproteine und gegen histonmodifizierende Proteine. 1. Zellen mit Paraformaldehyd behandeln, um DNA und Protein zu crosslinken. 2. Zellen mit Ultraschall behandeln, um Chromatin in Fragmente von ca. 400bp zu schreddern. 3. Immunprzipitation mit Antikrper gegen Chromatinprotein oder Histonmodifikation. 4. Crosslink wieder aufheben und DNA aus der Chromatinprparation isolieren. 5. PCR auf verschiedene Gene, die man in der entsprechenden Chromatin- fraktion vermutet.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromatin wurde mit einem Antikrper gegen H3K9me2 przipitiert (meist Heterochromatin). Es wurden drei verschiedene Stmme verwendet, zwei enthielten getaggtes Hcp Protein. Fr jedem Stamm wurde die PCR Reaktion drei mal durchgefhrt. Die Genloci DIRS-1 und skipper sind in der przipitierten Heterochromatinfraktion enthalten. Das (aktive) Actin-Gen ist in der Fraktion nicht nachweisbar. Kaller et al., 2006

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie 0510 0 1.0 0.5 tri di mono ACA 5 036912 ACA Northern rasG Northern 036912h 051015h 0 1.0 1.5 0.5 rasG 5 036912h V18 Northern 051015h 0 1.0 2.0 V18 5 Die Trimethylierung von H3K4 korreliert mit aktiven Genen whrend Mono- und Di- methylierung inaktives Chromatin reprsentiert. ChIP Experimente wurden zu verschiedenen Zeiten der Dictyostelium-Entwicklung mit verschiedenen Antikrpern durchgefhrt und mit PCR auf ACA, rasG und V18 Gene geprobt. Northern-Blots reprsentieren das Expressionsmuster der Gene.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Wie findet man unbekannte genetische Loci, die mit einer bestimmten Chromatinkonstellation verbunden sind? Zur Erinnerung:

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie a) Microarrays Krankes GewebeGesundes Gewebe RNA isolieren rot markierengrn markieren mehr in krankem Gewebe gleich in beiden mehr in gesundem Gewebe

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP on Chip http://www.chem.agilent.com

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Durch ChIP on Chip werden Gene identifiziert, die in einem bestimmten Stadium mit bestimmten Chromatinproteinen besetzt sind. Ebenso knnen Gene identifiziert werden, die von bestimmten Transkriptionsfaktoren reguliert werden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Isolierung von genspezifischem Chromatin Griesenbeck et. al., 2004, Meth. Enzym. 375, 170-178 Konstrukt Nr. 1 Zielgen wird flankiert von RS-Rekombinationsstellen und Bindestellen fr das bakterielle LexA Protein. Das Konstrukt wird in das Genom der Zelle integriert. GenLexA RS Chrom. je nach Aktivittszustand des Gens ist der Bereich mit verschiedenen Formen von Chromatin belegt. Wie findet man die Chromatinzusammensetzung eines spezifischen Gens unter verschiedenen Bedingungen?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukte Nr. 2 und 3 Plasmid mit Gen fr R-Rekombinase und LexA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Induktion mit Galaktose fhrt zur Expression von R-Rekombinase und LexA mit Tap-Tag. R-RekombinaseGal1-P und LexA TAP-Tag Gal1-P

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromosom Zielgen Recombinase ber die RS-Sites rekombinieren die Flanken des Zielgens. Die Rekombinase schneidet an der Rekombinationsstelle.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es entsteht ein Ring des Zielgens mit einer RS-Site. Auf dem Chromosom verbleibt die zweite RS-site. Zielgen Chromosom

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie An die LexA Sites bindet das LexA Protein mit TAP-Tag. Der ganze Chromatinkomplex kann aus dem Kernlysat ber Affinittschromatografie an IgG und Calmodulin aufgereinigt werden. Als positive Kontrolle wird eine PCR mit Primern zum Zielgen, als negative Kontrolle eine PCR mit Primern zu einem anderen, Nicht-Zielgen durchgefhrt. Das in-vivo assemblierte Chromatin kann ber MS auf seine Zusammensetzung und z.B. auf Modifikationen der Histone untersucht werden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Problem an der Sache: Ein Gen (Dictyostelium) hat ca. 1500 bp und damit etwa 10 Nukleosomen Aus 2 x 10 9 Zellen (1 Liter Kultur) knnen demnach theoretisch 2 x10 10 genspezifische Nukleosomen isoliert werden. Das entspricht 2 x 10 -13 Mol eines Proteins, das an ein Nukleosom assoziiert ist. Das entspricht 200 fM Dictyosteliumzellen wachsen auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen /ml Bei einer Ausbeute von 10% muss man mit mindestens 10l Kultur anfangen, um ausreichend Material fr MS zu bekommen. Bei Sugerzellen wird das richtig teuer!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Neue Funktion fr eine alte Maschine oder doppelte Funktion? (wie kommt man zu Funktionsvorhersagen? Wie werden sie untersucht? Wie entstehen wissenschaftliche Fragestellungen?) Sequenzhnlichkeit, besonders im katalytischen Zentrum, legt Funktion als DNA Methyltransferase nahe.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lokalisation im Zellkern (Dictyostelium) steht mit einer Funktion an der DNA im Einklang.... aber in Drosophila und in Sugern wird hauptschlich cytoplasmatische Lokalisation gefunden.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arbeitet das Enzym als Methyltransferase? Findet man DNA Methylierung? Ist diese von der Gegenwart des Enzyms abhngig? Es gibt DNA Methylierung an wenigen Stellen (diese im Genom zu finden ist ein Problem fr sich!) Methylierung ist in einer KO-Mutante reduziert (oder nicht vorhanden) und damit abhngig von der Gegenwart des Enzyms.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vitro findet man mit dem rekombinanten Protein weder DNA Bindung (EMSA) noch DNA Methylierung.... das kann an fehlenden Co-Faktoren oder sub- optimalen Inkubationsbedingungen liegen, schliet eine Aktivitt aber nicht aus. In Drosophila findet man zwei Proteine, Nup50 (Porin, cytoplasmatisch) und p68 (Helikase, nukler) als In- teraktionspartner dass diese fr enzymatische Aktivitt erforderlich sind, ist eher unwahrscheinlich aber nicht unmglich!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es zeigte sich dann berraschend, dass Dnmt2 aus Maus tRNA Asp methyliert. (Goll, 2006).

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Dnmt2 ? DNA MethRNA Meth Bunicki et al. Nucleic acids res. Vol. 32, 2453, adapted by T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Welchen Mechanismus benutzt Dnmt2? C292 SAM C287 E119 R160R162 C140 C24 T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen Austausch aller Cys um zu sehen, ob es ein zweites gibt, das den RNA Mechanismus erlaubt.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R X R C F T ? DNA Mechanismus oder Hybrid DNA-RNA Mechanismus T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann das Enzym beide Substrate methylieren? Hat es unterschiedliche Interaktionspartner fr die verschiedenen Reaktionen? Gibt es weitere RNAs, die methyliert werden? Was ist die Funktion der DNA und/oder der RNA Methylierung? 1.Dnmt2 in Fisch fr Leber, Hirn und Retina-Entwicklung notwendig. 2.Dnmt2 in Drosophila fr lngeres Leben und gutes Kletterverhalten. 3.Dnmt2 in Dictyostelium fr Immobilitt eines Retrotransposons. Was haben diese Phnotypen gemeinsam? weitere biochemische, biophysikalische, genetische und zellbiologische Experimente.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar SFM Anwendungen... Kraftmessungen der einfachsten Art: Nukleinsure bindet unspezifisch an Mica (Glimmer = Schichtsilikat) Nukleinsure bindet ebenfalls un- spezifisch an Siliziumcantilever. Bei Entfernung vom Substrat wird die Nukleinsure gespannt und es treten messbare Krfte auf.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie -2000200400600800100012001400 1600 -400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 melting-phase F P Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002) L 0 : kraftfreies Anheben der Nukleinsure F P : Streckung bei B-S Transition L P : kraftfrei Extension der S-Form Kraft-Abstandskurve

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Plateau-Force F P ist abhngig vom GC Gehalt der Nukleinsure F P ist bei RNA grer als bei DNA Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie S-Value: L P / L 0 Dehnbarkeit der S-Form (relativ zur ursprnglichen Lnge des Molekls in B- bzw. A Konformation. Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002)

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene Kraftspektroskopie Fragestellung: der Transkriptionsfaktor expG bindet an Sequenzen in verschiedenen Promotoren. Unterscheiden sich diese Bindungen in ihrer Strke?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene Kraftspektroskopie Funktionalisierung der Spitze (hier DNA an PEG), Protein auf der Mica-Oberflche. Bartels et al, 2003 Unbinding force (rupture) wird gemessen. Die verschiedenen Promotoren zeigen dabei keine signifikanten Unterschiede.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Bindungsstrke kann ber die Loading rate genauer bestimmt werden. Die Loading rate ist definiert als: Federkonstante (nN/nm) x retraction velocity (nm/s) = nN/s Bei hoher Loading rate spielt die thermodynamische off-rate der Protein DNA Interaktion eine grere Rolle und die Bindung an die ver- schiedenen Promotoren unter- scheidet sich signifikant. Kraftspektroskopie liefert zu- stzliche Informationen, die EMSA Experimente ergnzen. Bartels et al, 2003

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar Ideen... Knnen Krfte der enzymatischen Aktivitt gemessen werden? Hybridisierung von RNAs an Oberflche und Cantilever Spannen der RNA Zugabe einer Helikase und Aktivierung mit ATP Entwindung und Relaxation des Cantilevers

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Bindung der dsRNA an Oberflche und Cantilever Spannen der RNA Zugabe von Dicer und Aktivierung mit Mg 2+ Schnitt und Relaxation des Cantilevers Knnen Krfte der enzymatischen Aktivitt gemessen werden?

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Detektion von DNA Modifikationen an Einzelmoleklen: Der Traum von der Einzelmolekl-Sequenzierung. U. Bockelmann, et al. Phy. Rev. Lett. 79, 4489 (1997). G-C: 20pN A-T: 9pN Resolution limit: 10 basepairs

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Antikrper gegen 5-Methylcytosin als Modell 1 2 Cantilever Crosslinker Antibody ssDNA Methyl- cytidine Aldehyde glass Force (pN) Distance (nm) 12 Der Abstand zwischen zwei Bindungsereignissen an einem Antikrper kann durch Kraft- spektroskopie gemessen werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil. 5 methylcytosines separated by 4 nucleotides DNA - methylcytosine

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie In einem gegebenen einzelstrngigen DNA Fragment kann der Abstand zwischen Methylcytosinen mit einer Auflsung von einem Nucleotid ge- messen werden. Spezifische Antikrper gegen normale Nucleotide knnen hergestellt werden. branched crosslinker Antibody fragment against specific nucleoside ssDNA Nucleoside Cantilever 1 Force (pN) Distance (nm) 12 2 Die Auflsung und Detektions- weite kann durch monovalente Antikrperfragmente und durch verzweigte Crosslinker ver- bessert werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arrays von 1.000 x 200 Cantilevers knnten auf einem 2 x 2cm Chip 200.000 Proben gleichzeitig messen.

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ob diese Methode eine Alternative zu anderen Sequenzierverfahren bieten wird, ist eher fraglich. Fr die SNP Analyse (single nucleotide polymorphism) oder die Detektion modifizierter Nucleotide knnte sie jedoch einsetzbar werden. Aber: DNA Modifizierung geht bei Clonierung oder bei PCR Amplifikation verloren. Die gezeigten Ergebnisse entstanden an synthetischen Moleklen mit synthetisch plazierte Methylcytosinen!

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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das waren Nanostrukturen aus (molekular)biologischer Sicht.