7/27/2019 aac00280-0019

1/5

Vo l .1 6 ,N o .4N T I M I C R O B I A LAGENTSAND CH EMO TH E RA P Y,OC t . 1 9 7 9 ,p . 4 3 9 - 4 4 30 0 6 6 - 4 8 0 4 / 7 9 / 1 0 - 0 4 3 9 / 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0

M e c h a n i s mo f S y n e r g i s t i cA c t i o no f a C o m b i n a t i o no fAmp i c i l l i na n d D i c l o x a c i l l i nAg a i n s t a , B -L a c t ama s e - P r o d u c i n g

S t r a i n o f C i t r o b a c t e rf r e u n d i iJUNZO MIZOGUCHI , t HIDEKAZU SUGINAKA,*AND SHOZO KOTAN I

D e p a r t m e n to fMi c r o b i o l o g yan d O r a l B a c t e r i o l o g y ,Osaka U n i v e r s i t yD e n t a lS c h o o l ,3 - 4 8 ,N a k a n o s h i m a - 4 -c h o m e ,K i t a - k u ,O s a k a5 3 0 ,J a p a nR e c e i v e df o rp u b l i c a t i o n1 8 J u l y 1 9 7 9

The m e c h a n i s mo f s y n e r g i s t i ca c t i v i t yo f a c o m b i n a t i o no f a m p i c i l l i na n dd i c l o x a c i l l i nwas s t u d i e d on f l - l a c t a m a s e - p r o d u c i n gC i t r o b a c t e rf r e u n d i iGN346a n d i t s d e r i v e d f , - l a c t a m a s e l e s smutan t G N 3 4 6 / 1 6 .Th e s y n e r g i s t i ca c t i v i t ywase x h i b i t e d aga i n s t t h e p a r e n t s t r a i nb u t n o t ag a i n s t t h e mutan t s t r a i n .P r e c u l t i -v a t i o n o f t h e p a r e n t s t r a i nw i t h t h e c o m b i n a t i o nr e d u c e d t h e amoun t o f t h es u b s e q u e n tb i n d i n go f [ 1 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e membrane f r a c t i o n f r o mt h e t r e a t e dc e l l s ,b u t no r e d u c t i o nwas o b s e r v e di n t h e ca se o f c e l l s t r e a t e d w i t h a m p i c i l l i no rd i c l o x a c i l l i na l o n e .On t h e o t h e r h a n d , t h e amoun t o f b i n d i n g o f [ 1 4 C ] p e n i c i l l i nGt o t h e membrane f r a c t i o n f r o m .t h e mutan t s t r a i nwas r e d u c e d b y a m p i c i l l i nt r e a t m e n t a l o n e .T h e s e r e s u l t sc l e a r l yi n d i c a t e d t h a t d i c l o x a c i l l i ni n h i b i t e d t h eB - l a c t am a s ea c t i v i t yp r o d u c e db y t h e p a r e n t s t r a i n ,and , c o n s e q u e n t l y ,a m p i c i l l i ncan p e n e t r a t e t h r o u g ht h e o u t e rmembrane a n d p e r i p l a sm i c, B - l a c t a m a s eb a r r i e ri n t oi t s t a r g e t s i t e son t h e c y t o p l a s m i cm em b r a n e .

S y n e r g i s t i ca c t i v i t yo f t h e c om b i n a t i o no fp e n -i c i l l i n so r c e p h a l o s p o r i n sa n d i s o x a z o l y l p e n i c i l -l i n sh a s b e e n w e l lk n o w na g a i n s tf 8 - l a c t a m a s e -p r o d u c i n gg r am - n e g a t i v eo r g a n i sm s( 1 ,7 , - 8 ,1 2 -1 4 ,1 8 ,2 5 ) .No r e p o r t i s a v a i l a b l eo n t h e me c h -a n i sm o f t h e s y n e r g i s t i ce f f e c to f t h e c om b i n a -t i o ni n a w h o l e - c e l ls y s t em , a l t h o u g hi s o x a z o l y l -p e n i c i l l i nh a s b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i ts o l u b l ef 8 - l a c t a m a s ea c t i v i t yi na c e l l - f r e es y s t e m( 1 ,3 ,4 ,9 , 1 2 ,1 3 ) .

Th i s r e p o r t d e a l sw i t h t h e me c h a n i s mo f t h es y n e r g i s t i ca c t i v i t yo fa c om b i n a t i o no fa m p i c i l -l i n a n d d i c l o x a c i l l i na g a i n s ta , B - l a c t a m a s e - p r o -du c i n g s t r a i no f C i t r o b a c t e rf r e u n d i ia n d i t sd e r i v e d / 8 - l a c t a m a s e l e s sm u t a n ts t r a i n ,c o m p a r -i n gt h e p e n e t r a t i o no fs i n g l eo r c om b i n e da n t i -b i o t i c si n t op e n i c i l l i nt a r g e ts i t e so n t he c y t o -p l a sm i cm e m b r a n e .

MATERLALSAN DMETHODSO r g a n i s m s .The o r g a n i sm su s e d w e r eC .f r e u n d i i

GN346 a n d i t s d e r i v e d f B - l a c t am a s e l e s sm u t a n tG N 3 4 6 / 1 6( 1 9 ) ,k i n d l y p r o v i d e db y S .Yamag i s h i( F a c -u l t yo f P h a rm a c e u t i c a lS c i e n c e s ,Ch i b a U n i v e r s i t y ,C h i b a , J a p a n ) .An t i b i o t i c s . [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG ( l a b e l e dw i t h [ 1 _ - 4 C ] -

pheny l a c e t i c a c i d )was p u r c h a s e d f r o m The Rad i -

t P r e s e n t a d d r e s s :Re s e a r c hL a b o r a t o r i e s ,T o y oJ o z o Co .L t d . ,6 3 2 - 1 ,M i f u k u ,Oh i t o - c h o ,Ta g a t a - g u n ,S h i z u o k a4 1 0 - 2 3 ,J a p a n .

o c h em i c a lC e n t r e ( Am e r s h a m ,En g l a n d ) .I t h a d a s p e -c i f i ca c t i v i t yo f5 2 mC i / m m o l .Un l a b e l e dp e n i c i l l i nG ,

a m p i c i l l i n ,a n d d i c l o x a c i l l i nw e r e s u p p l i e db y T o y oJ o z oCo . L t d .( S h i z u o k a ,J a p a n ) .C u l t i v a t i o nand p r e p a r a t i o n so f t h ememb r a n e

an d s o l u b l e f r a c t i o n s .E a c h s t r a i nw a s r o u t i n e l yg r o w na t 3 7 Ci n Tr y p t i c a s es o y b r o t h (BBL M i c r o -b i o l o g yS y s t em s ,C o c k e y s v i l l e ,Md . )w i t h shak ing . Thec e l l sw e r eh a r v e s t e db y c e n t r i f u g a t i o na t 6 , 0 0 0x g f o r1 0m i n a t a b o u th a l f -max ima lg r o w t h ,wh i c hr e q u i r e da p p r o x im a t e l y3 . 5h f r o ma 5% i n o c u l u mo f t he o v e r -n i g h tc u l t u r e .T h e yw e r e t h o r o u g h l yw a s h e dw i t h 5 0mM t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e - h yr i d eb u f f e r ,pH 7 . 5 ,c o n t a i n i n g1mM Mg C l 2a n d r e s u s -p e n d e di n 1 / 1 0 0o f t he o r i g i n a lc u l t u r ev o l u m ew i t ht he s a m e b u f f e r .A p o r t i o no f t h e s es u s p e n s i o n sw a su s e d f o rt he f , - l a c t a m a s ea s s a y o ft he i n t a c tc e l l s .Thes u s p e n d e dc e l l sw e r e d i s r u p t e dw i t h a S u p e rS o n i cv i b r a t o r( U R - 1 5 0 ,Tom i n a g aWo r k sL t d . ,To k y o ,J a -p a n ) ,a n d c e l ld e b r i sw a sr e m o v e db y c e n t r i f u g a t i o na t8 , 0 0 0x g f o r1 0min . T h em e m b r a n ef r a c t i o nw a s t h e ns e d im e n t e db y c e n t r i f u g a t i o na t 1 0 0 , 0 0 0x g f o r4 0min , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s u s e d as t h e s o l u b l ef r a c t i o na s de s c r i b ed p r e v i o u s l y( 2 3 ) .A s s a y f o r 8 - l a c t a m a s ea c t i v i t i e s ./ i - L a c t a m a s e

a c t i v i t i e sw e r e e s t i m a t e d i o d o m e t r i c a l l yb y a mod i f i -c a t i o no f P e r r e t ' sm e t h o d( 1 5 ) .The e n z y m er e a c t i o nw a s c a r r i e do u t a t 3 0 Ci n0 . 1M p h o s p h a t eb u f f e r ,pH6 . 8 ,c o n t a i n i n g8 mM c e p h a l o r i d i n ea s a s u b s t r a t e .

D i c l o x a c i l l i n( f i n a lc o n c e n t r a t i o n ,1 n m o l / m l )w a sa d d e ds i m u l t a n e o u s l yt o t h e r e a c t i o nm i x t u r ef o rd e m -o n s t r a t i o n o f t h e i n h i b i t o r ye f f e c t .One u n i t w a s d e -f i n e da s t h e a m o u n to f a c t i v i t yc a p a b l eo f h y d r o l y z i n g1 , u m o lo f t h e s u b s t r a t ep e r m i n u n d e r t h i sc o n d i t i o n .

4 3 9

7/27/2019 aac00280-0019

2/5

440 MIZOGUCHI , SUG INAKA ,AND KOTAN I

S u s c e p t i b i l i t y t e s t .M i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a -t i o n swere e s t i m a t e db y t h e agar p l a t ed i l u t i o nmethodi nh e a r t i n f u s i o nagar ( D i f c o )w i t h an i n o c u l u mo f o n el o o p f u lo f 1 0 6b a c t e r i ap e r ml .

Assay f o r b i n d i n g o f [ 1 4 C j p e n i c i l l i nG t o t h ememb r a n e f r a c t i o n . Th e method u s e d t o assay [ ' I C ]p e n i c i l l i nG b i n d i n g was as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( 2 4 ) .The assay m ix t u r e , c o n t a in in g2 5 1 Io f t h e memb ran ef r a c t i o n( a p p r o x i m a t e l y2 0 mg o f p r o t e i npe r m l ) ,1 0, [ l o f 1 M t r i s ( h y d r o x ym e t h y l ) a m i n om e t h a n e - h y d r o -c h l o r i d eb u f f e r ,pH 7 . 5 ,2 . t L o f 1 M MgC l 2 ,3 i d o fw a t e r , a n d 10 u l o f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG s o l u t i o n v a r y i n gi n c o n c e n t r a t i o n s f r o m6 . 2 5t o 1 0 0 n m o l / m l ,was i n -c u b a t e df o r3 0 m i n a t 3 0 C .[ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG b o u n dt ot h e membrane was s e p a r a t e d b y pape r c h r o m a t o g r a -p h y f r o m u n b o u n d ' 4 C - l a b e l e dc o m p o u n d sa n dc o u n t e d i n a l i q u i ds c i n t i l l a t i o ns p e c t r o m e t e r( t y p e

L S C - 6 5 3 ,A l o k aL t d . ,To k y o ,J a p a n ) . A sac o n t r o l ,t h eb i n d i n g o f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e b o i l e d memb r an e

f r a c t i o n( 1 0 0 C ,1 0 min ) was a l s o m e a s u r e df o re x c l u -s i o no f n o n s p e c i f i cb i n d i n g .

P r e t r e a t m e n t o f c u l t u r e ce l i s by an t i b i o t i c s .Am p i c i l l i n ,d i c l o x a c i l l i n ,o r a m p i c i l l i np l u sd i c l o x a c i l l i n( 2 : 1 ,b y we i g h t ) was a d d e d t o a f i n a lc o n c e n t r a t i o no f2 0 0t c g /m le a c h i n t o t h e c u l t u r e b r o t h ,w h i c hh ad b e e nc u l t i v a t e d f o r3 . 5h a t 3 7 0 C .A f t e r a f u r t h e r c u l t i v a t i o nf o r2 0 min , t h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d . Th e membranef r a c t i o nf r o me a c h t r e a t e d c e l l c u l t u r e was i n c u b a t e dw i t h 7 . 5n m o lo f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG pe r ml i n t h e samei n c u b a t i o nm i x t u r eas a b o v e .

RESULTS

Synerg i sm o f a c o m b i n a t i o no f am p i c i l l i nan d d i c l o x a c i l l i n . Ta b l e 1 s h o w st h e a n t i b a c -t e r i a la c t i v i t i e so f a m p i c i l l i na n d d i c l o x a c i l l i na l o n e o r i n c o m b i n a t i o na g a i n s ta f l - l a c t a m a s e -p r o d u c i n gs t r a i n ,C . f r e u n d i i G N 3 4 6 ,a n d i t sd e r i v ed 8 - l a c t am as el e ssmutant G N 3 4 6 / 1 6 .The

f o r m e rs t r a i nwas r e s i s t a n tt o a m p i c i l l i na n d t od i c l o x a c i l l i n ,b u t t h e l a t t e rs t r a i nwas s u s c e p t i b l et o a m p i c i l l i na l o n e .On t h e o t h e r h a n d , t h e f o r -mer s t r a i nwas s u s c e p t i b l et o a m p i c i l l i na n dd i c l o x a c i l l i ni n c omb i n a t i o n . I n c o n t r a s t ,t h ec om b i n a t i o nd id n o t exh ib i t s y n e r g i s t i c a c t i v i ta g a i n s tt h e f l - l a c t a m a s e l e s smutan t s t r a i n .

E f f e c t s o f d i c l o x a c i l l i n on , - l a c t a m a s e ac -t i v i t i e s .The r e s u l t si n Ta b l e 2 show f , - l a c t a -mase a c t i v i t i e sa n d t h e i ri n h i b i t i o nb y d i c l o x a -c i l l i n .f 3 - L a c t am a s ea c t i v i t i e so f i n t a c t c e l l san dt h e s o l u b l ef r a c t i o n f r o mt h e b r o k e n - c e l l prepa -r a t i o no f C . f r e u n d i iG N 3 4 6 / 1 6was r e d u c e d> 5 0 0t i m e s i nc o m p a r i s o nw i t h t h e p a r e n t s t r a i n .The m e m b r a n ef r a c t i o nf r o mC .f r e u n d i iGN346a l s os h o w e d8 - l a c t am a s ea c t i v i t y ,w h e r e a s t h ea c t i v i t yc o u l d n o t b e d e t e c t e d in t h e memb ran ef r a c t i o nf r o m t h e mutant s t r a i n .Th e / i - l a c t a -mase a c t i v i t i e so f t h e s o l u b l ef r a c t i o n s f r o mb o t hs t r a i n swere i n h i b i t e db y t h e a d d i t i o n o fd i c l o x -a c i l l i n ,as h a d b e e n p r ev io u sl y r e p o r t e d( 1 ) ,b u td id n o t d e s t r o y d i c l o x c i l l i nt o any me a s u r a b l ee x t e n t ( d a t an o t s h o w n ) .The a c t i v i t i e so f i n t a c tc e l l s f r o mb o t h s t r a i n sa n d t h e membrane f r a c -t i o nf r o m t h e p a r e n t s t r a i ns h o w e dt h e samer e s u l t s .B i n d i n g o f [ ' 4 C j p e n i c i l l i n G t o t h e mem-

brane f r a c t i o n . When e a c h s u s p e n s i o no f t h emembrane f r a c t i o nf r o mC .f r e u n d i i GN346 a n di t smutan t s t r a i nG N 3 4 6 / 1 6was i n c u b a t e dw i t hv a r io u s c o nc en t r a t i o ns o f[ 1 4 C ] p e n i c i l l i nG f o r3 0min , t h e a n t i b i o t i cwas i r r e v e r s i b l yb o u n d t ob o t h membrane f r a c t i o n s( F i g .1 ) .The b i n d i n go f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e membrane f r a c t i o nf r o mt h e mutant s t r a i nf o l l o w e ds a t u r a t i o n - t y p ek i n e t i c s ,as h a d b e e n s h o w ne a r l i e rw i t h mem-b r a n e f r a c t i o n sf r o m v a r i o u s o r g a n i s m s ( 6 , 2 1 ,

TABLE 1 .M i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n so f a m p i c i l l i na n d d i c l o x a c i l l i na g a i n s t C .f r e u n d i iGN346 andGN 3 4 6 / 1 6

Mi n im a li n h i b i t o r yc o n c n( # g / m l )S t r a i n Amp i c i l l i np l u s

Amp i c i l l i n D i c l o x a c i l l i n d i c l o x a c i l l i n C e p h a l o r i d i n e( 2 : 1 ,b y w t )

GN346 8 0 0 4 0 0 5 0 4 0 0G N 3 4 6 / 1 6 1 . 6 4 0 0 1 . 6 3 . 1

TABLE 2 . C o m p a r i s o no f / 8 - l a c t a m a s ea c t i v i t i e sa n d t h e i ri n h i b i t i o nb yd i c l o x a c i l l i ni n C .f r e u n d i iGN346a n d G N 3 4 6 / 1 6

, 6 - L a c t a m a s ea c t i v i t y

Strd d i t i o n I n t a c tc e l l s Af t e r c e l ld i s r u p t i o n( U / m go fp r o t e i n )

Strm(U/mg f c e l l s ) S o l u b l ef r a c t i o n Mem b r a n ef r a c t i o nGN346 None 2 7 . 3 3 9 . 0 2 . 9

D i c l o x a c i l l i n( 1n m o l / m l ) 8 . 9 7 . 8 0 . 3 1G N 3 4 6 / 1 6 None 0 . 0 4 0 . 0 6 -a

D i c l o x a c i l h i n( 1n m o l / m i ) 0 . 0 1 0 . 0 1a N o td e t e c t a b l e .

ANT IM I C ROB .AGENTSC H EMO T H E R .

7/27/2019 aac00280-0019

3/5

SYNERG I ST I CACT IONOF AMPICILLIN-DICLOXACILLIN

-3

, 2 ,CD

E

0E 4

0 ~

0 5 1 0 1 5 2 0D cJ P e n i c i l l i nG ( noles/m4)

F I G .1 . B i n d i n g o f [ 1 4 C ] p e n i c i l l i n0 t o t h e mem-b r a n e f r a c t i o n sf r o mC .f r e u n d i i GN346 a n d G N 3 4 6 /1 6 . T h e membrane f r a c t i o n sf r o m ( A ) C .f r e u n d i iGN346 an d ( B )i t sd e r i v e d m u t a n ts t r a i nG N 3 4 6 / 1 6w e r e i n c u b a t e df o r1 0m i n a t 3 0 Cw i t h ( ) o r w i t h o u t

( 0 ) 5 n m o l o f d i c l o x a c i l l i np e r m l a n d t h e n w e r ei n c u b a t e d w i t h v ar i ou s c on ce nt r a t io n s o f[ ' 4 C ] p e n i -c i l l i nG a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t .D a t a a r e e x p r es se da s n a n o m o l e so f b o u n dr a d i o a c t i v i t yp e r m i l l i g r a m no f membrane p r o t e i n s .

2 2 ,2 4 ) ,a n d t h e s a t u r a t i o n o fp e n i c i l l i n - s p e c i f i ct a r g e ts i t e sw a s a c h i e v e d a t a p p r o x i m a t e l y7 . 5n m o l / m l( F i g .1 B ) .On t h e o t h e r h a n d , t h e b i n d -i n gt o t h e m e m b r a n ef r a c t i o nf r o mt h e , B - l a c t a -ma s e - p r o d u c i n gs t r a i nf o l l o w e d n o ns at u r a t io n -t y p ek i n e t i c s( F i g .1 A ) ,s u g g e s t i n gt h a t [ ' 4 C ] p e n -i c i l l i nG i n t h e r e a c t i o nm i x t u r ew a sh y d r o l y z e db y , B - l a c t a m a s ei n t h e m e m b r a n ef r a c t i o na n dc o u l dn o t b i n d t o i t s s p e c i f i ct a r g e ts i t e s .

A s f l - l a c t a m a s ea c t i v i t yo ft h e m e m b r a n ef r a c -t i o nf r o mC . f r e u n d i i GN346 w a s i n h i b i t e db yd i c l o x a c i l l i n ,a s s h o w ni n Ta b l e 2 , t h e e f f e c to fd i c l o x a c i l l i no n t h e b i n d i n g o f [ ' 4 0 ] p e n i c i l l i nGw a s s t u d i e d ( F i g .2 ) .The a m o u n tb o u n dt o t h em e m b r a n ef r a c t i o nf r o m t h e p a r e n t s t r a i ni n -c r e a s e d w i t h t h e a d d i t i o no fl o wc o n c e n t r a t i o n so fd i c l o x a c i l l i n ,a n d t h e o p t i m u mc o n c e n t r a t i o no f d i c l o x a c i l l i nr e q u i r e d f o rmax imum b i n d i n gu n d e r t h e c o n d i t i o n s

o ft h e e x p e r i m e n tw a s 5

n m o l / m l( F i g .2 A ) .Th i s r e s u l ts h o w e dt h a tt h ea b o v e c o n c e n t r a t i o n o f d i c l o x a c i l l i ni n h i b i t e dm e m b r a n e - b o u n df i - l a c t a m a s ea c t i v i t ya n d t h a t[ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG c o u l d b i n d t o i t s s p e c i f i ct a r -g e t s .On t h e o t h e r h a n d , t h e b i n d i n g a b i l i t yi n

c^

I n

4 ,

0

c

L-

Cm

E1-. 0

. 00~E .U

0 5 1 0D i rl o x a c i l l i n( n mo l e s /m l)

F I G .2 . E f f e c t so f d i c l o x a c i l l i n on b i n d i n g o f[ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e membr ane f r ac t io ns o f C .f r e u n d i i GN346 an d G N 3 4 6 / 1 6 .Th e memb r a n e f r a c -t i o n sf r o m( A )C .f r e u n d i i GN346 an d ( B ) i t s d e r i v e dmutan t s t r a i nG N 3 4 6 / 1 6were p r e i n c u b a t e df o r 10m i n a t 3 0 Cw i t h v a r i o u s c o nc en t r a t io n s o fd i c l o x a -c i l l i n ,f o l l o w e db y t h e a d d i t i o n o f a f i n a l c o n c e n t r a -t i o no f 7 . 5n m o l o f [ ' 4 C J p e n i c i l l i nG per m l f o r af u r t h e r i n c u b a t i o n a t 3 0 C . Data are e x p r e s s e d as

n a n o m o l e so f b o u n dr a d i o a c t i v i t y per m i l l i g r a mo fmembrane p r o t e i n s .

t h e 8 i - l a c t a m a s e l e s smutan t memb ran e was r e -d u c e db y t h e a d d i t i o n o f d i c l o x a c i l l i n( F i g .2 B ) .The b i n d i n g o f [ 1 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e mem-b r a n e f r a c t i o nf r o mt h e p a r e n t s t r a i n examineda f t e rp r e i n c u b a t i o nw i t h 5 nmo l o f d i c l o x a c i l l i np e r ml f o l l o w e dt h e same s a t u r a t i o n c u r v e ast h a t f r o mt h e mutan t s t r a i n ( F i g .1 A ) .T h u s , t h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n ton t h e b i n d i n g o f [ 1 4 C ] _

p e n i c i l l i nG t o t h e membr ane f r a c t i o n f r o mt h ep a r e n t s t r a i nwas d o n ea f t e rp r e i n c u b a t i o nw i t h5 n m o l o f d i c l o x a c i - l i np e r ml t o o b t a i n t h em a x i m a lamoun t o f b i n d i n g .B i n d i n g o f [ 1 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e mem-

brane f r a c t i o n f r om p e n i c i l l i n - t r e a t e d c e l s .B i n d i n g o f a m p i c i l l i nt o i t s t a r g e t s i t e swas d e -t e r m i n e d b y me a s u r i n gt h e r e d u ct i o n in [ 1 4 C ] -p e n i c i l l i nG- b i n d i n g t o t h e membr ane f r a c t i o np r e p a r e df r o mc e l l sp r e c u l t i v a t e dw i t h u n l a b e l e da m p i c i l l i na n d d i c l o x a c i l l i na l o n e an d i n c o m b i -n a t i o n ( Ta b l e 3 ) .N e i t h e r a m p i c i l l i nn o r d i c l o x -a c i l l i nt r e a t m e n t o f t h e c e l l so f t h e

f l - l a c t a m a s e -p r o d u c i n gs t r a i n ,C . f r e u n d i i G N 3 4 6 ,r e d u c e dt h e amoun t o f s u b s e q u e n tb i n d i n g o f [ ' 4 C ] p e n i -c i l l i nG t o t h e memb r a n e f r a c t i o n f rom t h et r e a t e d c e l l s . H o w e v e r ,p r e t r e a t m e n tw i t h t h ec o m b i n a t i o no f a m p i c i l l i nan d d i c l o x a c i l l i nr e -

( A )

2 -

5 '

4 -

4 4 1OL . 1 6 ,1 9 7 9

I

7/27/2019 aac00280-0019

4/5

4 4 2 MIZOGUCHI, SUGINAKA,AND KOTANI

TABLE 3 . B i n d i n go f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h em e m b r a n ef r a c t i o n sf r o mc e l l so fC .f r e u n d i iGN346an d G N 3 4 6 /1 6 t r ea t edw i t h a m p i c i l l i nan d d i c l o x a c i l l i na l o n e o r i n c omb i n a t i o n .

S t r a i n T r e a t m e n t( 2 0 0Ag / r l ) [ ' 4 C ] p e n i c i l h i nG b o u n d P e n e t r a t i o n '( % )( d pm /mgo fp r o t e i n )GN346 None 8 8 9 0

Am p i c i l l i n 8 3 7 5 . 8D i c l o x a c i l l i n 8 3 8 5 . 7Am p i c i l l i np l u sd i c l o x a c i l l i n 4 7 7 4 6 . 3( 2 : 1 ,b y w t )

G N 3 4 6 / 1 6 None 8 6 8 0Amp i c i l i n 3 3 1 6 1 . 9D i c l o x a c i l l i n 6 6 4 2 3 . 5Am p i c i l l i np l u sd i c l o x a c i l l i n 3 5 0 5 9 . 7( 2 : 1 ,b y w t )

a Pe n e t r a t i o no fa n t i b i o t i ct o i t s t a r g e ts i t e sw a s c a l c u l a t e da c c o r d i n gt o t h ef o l l o w i n gf o r m u l a :( 1 - [ b o u n dr a d i o a c t i v i t yt o t he m e m b r a n ef r a c t i o nf r o mt he t r e a t e dc e l l s / b o u n dr a d i o a c t i v i t yt o t he m e m b r a n ef r a c t i o nf r o mt h e n o n t r e a t e dc e l l s ] )x 1 0 0 .

d u c e d t he b i nd i ng a b i l i t y.On t he o t h e r h an d ,t h e a m o u n to fb i nd i ngo f[ 1 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h emembrane f r a c t i o nf r o m t h e f ? - l a c t a m a s e l e s sm u t a n t s t r a i n ,C . f r e u n d i iGN 3 4 6 / 1 6 ,w a s r e -d u c e d b y t r e a t m e n tw i t h a m p i c i l l i n .D i c l o x a c i l -l i n t r e a t m e n t a l s or e s u l t e di n a sma l l e x t e n t o fr e d u c t i o ni n t he b i n d i n g .

DISCUSSION

A / 8 - l a c t a m a s e - p r o d u c i n gs t r a i n ,C . f r e u n d i iG N 3 4 6 ,w a s r e s i s t a n tt o am p i c i l l i n ,wh e r e a si t sd e r i v e d f - l a c t a m a s e l e s sm u t a n ts t r a i n ,G N 3 4 6 /1 6 ,w a s s u s c e p t i b l et o t h i sa n t i b i o t i c .Th i s i n d i -c a t e d t h a t , 8 - l a c t am a s eo ft h e p a r e n t s t r a i nc a nb e c o n s i d e r e dt o b e a n am p i c i l l i nr e s i s t a n c ef a c -t o ra s s u g g e s t e dp r e v i o u s l y( 1 6 ,1 7 ,2 6 ) .A c o m -b i n a t i o no fa m p i c i l l i na n d d i c l o x a c i l l i ne x h i b i t e da m a r k e ds y n e r g i s t i ce f f e c ta g a i n s tt h e p a r e n ts t r a i n .T h eme c h a n i s mo ft he s y n e r g i s t i ca c t i v i t yh a s b e e n a t t r i b u t e dt o t h e f a c tt h a t d i c l o x a c i l l i ni n h i b i t e df i - l a c t a m a s ea c t i v i t yo f t h e p a r e n t

s t r a i n ,a s w i t h v a r i o u s f 8 - l a c t a m a s e - p r o d u c i n gg r am - n e g a t i v eo r g a n i sm s( 1 ) .I n g e n e r a l ,f l - l a c t a ma n t i b i o t i c sa r e k n o w nt o

b e i r r e v e r s i b l ya n d s p e c i f i c a l l yb o u n d t o t h ei s o l a t e dm e m b r a n ea n d i n h i b i tt r a n s p e p t i d a s ea n dD- a l a n i n ec a r b o x y p e p t i d a s ea c t i v i t i e s( 2 , 2 0 ) .The p r e s e n t i n v e s t i g a t i o nr ev ea l ed t ha t t h eb i nd i ng o f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e m e m b r a n ef r a c t i o nf r o mC .f r e u n d i iG N 3 4 6 / 1 6f o l l o w e dt h esame s a t u r a t i o n - t y p ek i n e t i c sa s t h o s e f r o mv a r -i o u so r g a n i sm s( 6 ,2 1 , 2 2 , 2 4 ) ,a n d t h e b i nd i ng t ot h e m e m b r a n ef r a c t i o nf r o m t h e p a r e n t s t r a i nw a s n o n s p e c i f i c .Th i s r e s u l ts u g g e s t e dt h a t[ I 4 C ] - p e n i c i l l i nG i n t h e r e a c t i o nm i x t u r ewash y d r o l y z e db y t h e f B - l a c t a m a s ep r e s e n t i n t h emembrane f r a c t i o na n d c o u l d n o t b i n d t o i t ss p e c i f i c t a r g e ts i t e s ,w h e r e a si t c o u l db i n d t o i t ss p e c i f i cs i t e swhen m em b r a n e - b o u n de n z y m eac -t i v i t ywas i n h i b i t e db y t h e a d d i t i o no f d i c l o x a -

c i l l i n .I n f a c t ,t h e membrane f r a c t i o nf r o m t h ep a r e n t s t r a i ns h o w e df l - l a c t a m a s ea c t i v i t y ,a sr e p o r t e d p r e v i o u s l yi n t h e c a s e o f a s t r a i no fB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s( 2 7 ) ,wh e r e a s t h e mem -b r a n e f r a c t i o nf r o mt h e m u t a n t s t r a i nd i d n o ts h o wf i - l a c t a m a s ea c t i v i t y .I t w o u l db e o f i n t e r -e s t t o k n o ww h e t h e r t he m e m b r a n e - b o u n df i -l a c t am a s e i s t h e s a m e a s t he s o l u b l ee n z y m ep r e s e n t i n t h e p e r i p l a s m i cs p a c e ,a n d t h i s i s

c u r r e n t l yu n d e rs t u d y .To d em o n s t r a t et h e s y n e r g i s t i ce f f e c t so f t hea b o v ec o mb in at i o n o ng r o w i n gc e l l s ,we s h o w e dt h a t p r e c u l t i v a t i o no f t h e c e l l so f C . f r e u n d i iGN346 w i t h t h e c om b i n a t i o no fa m p i c i l l i na n dd i c l o x a c i l l i nr e d u c e dt h e a m o u n to fs u b s e q u e n tb i n d i ng o f [ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h e membranef r a c t i o nf r o mt h e t r e a t e dc e l l s ,w he r e as n or e -d u c t i o nw a s o b s e r v ed w it hp r e c u l t i v a t i o nw i t ha m p i c i l l i no r d i c l o x a c i l l i ns e p a r a t e l y .I n c o n t r a s t ,t h e a m o u n to fb i nd i ngo f[ ' 4 C ] p e n i c i l l i nG t o t h emembrane f r o mt h e m u t a n ts t r a i nw a s r e d u c e db y a m p i c i l l i nt r e a t m e n ta l o n e .Thu s , t h e p r e s e n t s t u d yc l e a r l yd em o n s t r a t e s

t h e me c h a n i s mo fs y n e r g i s t i ca c t i o no ft h e c o m -b i n a t i o no fa m p i c i l l i na n d d i c l o x a c i l l i n ;d i c l o x a -c i l l i n ,a 8 - l a c t am a s e i n h i b i t o r ,p e n e t r a t e dt h r o u g ht h e o u t e r membrane ( 5 )a n d i n h i b i t e d, 8 - l a c t a m a s ea c t i v i t yl o c a l i z e dma i n l yi n t h e p e r -i p l a s m i cs p a c e ( 1 0 , 1 1 ) ;c o n s e q u e n t l y ,a m p i c i l l i nc o u l d p e n e t r a t e t h r o u g h t w o b a r r i e r s ,o u t e rmembrane a n d p e r i p l a s m i c/ 3 - l a c t a m a s e ,ena -b l i n gt h e l a t t e ra n t i b i o t i ct o r e a c h a n d b i n d t oi t ss p e c i f i ct a r g e ts i t e so n t h e c y t o p l a s m i cmem -b r a n e .

L f T E R AT U R ECMD1 . B a c h ,J . A . ,N . B u o n o ,D . C h i s h o l m ,K . E . P r i c e , T . A .

P u r s i a n o , an d A . G o u r e v i t c h .1 9 6 7 .I n v i t r oa n d i nv i v o s y n e rg i smo fm ix t u r e s o fp e n i c i l l i n s ,p . 3 2 8 - 3 3 6 .An t im i c r o b .Ag e n t sC h em o t h e r .1 9 6 6 .

2 . B l u m b e r g ,P . M. , an d J . L .S t r o m i n g e r .1 9 7 4 .I n t e r a c -

AN T I M I C RO B .AGENTSCH EMO TH E R .

7/27/2019 aac00280-0019

5/5

SYNERG IST ICACTIONOF AMPICILLIN-DICLOXACILLIN 443

t i o no fp e n i c i l l i nw i t h t h e b a c t e r i a lc e l l :p e n i c i l l i n - b i n d -i n gp r o t e i n sa n d p e n i c i l l i n - s e n s i t i v een zyme s . B a c t e r i o l .Re v. 3 8 : 2 9 1 - 3 3 5 .

3 . Boman, H . G . ,K . N o r d s t r o m ,an d S . Normark . 1 9 7 4 .P e n i c i l l i nr e s i s t a n c ei nEsch e r i ch i a c o l iK 1 2 :s y n e r g i smb e t w e e np e n i c i l l i n a s e sa n d a b a r r i e ri n t h e o u t e r p a r t o ft he e n v e l o p e .An n .N . Y.Ac a d .S c i .2 3 5 : 5 6 9 - 5 8 6 .

4 . Co l e ,M. ,S .E l s o n ,an d P . D . F u l l b r o o k .1 9 7 2 .I n h i b i t i o no f, f - l a c t a m a s e so f E s c h e r i c h i a c o l ia n d K l e b s i e l l a aer-o g e n e s b y s e m i - s y n t h e t i cp e n i c i l l i n s .B i o c h em .J . 1 2 7 :2 9 5 - 3 0 8 .

5 . C o s t e r t o n , J . W . , J . M. I n g r a m , an d K . J . C h e n g .1 9 7 4 .S t r u c t u r e a n d f u n c t io n o f t hec e l l e n v e l o p eo fg r am - n e g a t i v eb a c t e r i a .B a c t e r i o l .R e v. 3 8 : 8 7 - 1 1 0 .

6 . E d w a r d s ,J . R . ,an d J . T . P a r k . 1 9 6 9 .C o r r e l a t i o n b e-t w e e n g r o w t h i n h i b i t i o na n d t h e b i n d i n go f v a r i o u sp e n i c i l l i n sa n d c e p h a l o s p o r i n st o S t a p h y l o c o c c u sau -r e u s . J . B a c t e r i o l .9 9 : 4 5 9 - 4 6 2 .

7 . G r e e n w o o d ,D . ,an d F . 0. G r a d y . 1 9 7 5 .P o t e n t c om b i -n a t i o n s o fb e t a - l a c t a ma n t i b i o t i c su s i n gt h e b e t a - l a c t a -mase i n h i b i t i o np r i n c i p l e .C h e m o t h e r a p y2 1 : 3 3 0 - 3 4 1 .

8 . H am i l t o n -M i l l e r ,J . M. T . 1 9 7 1 .The d e m o n s t r a t i o na n ds i g n i f i c a n c eo f s y n e r g i smb e t w e e nb e t a - l a c t a m a n t i b i -o t i c s . J .Me d .Mi c r o b i o l .4 : 2 2 7 - 2 3 7 .

9 . H am i l t o n -M i l l e r ,J . M. T . , an d J . T . S m i t h . 1 9 6 4 .I n h i b i t i o no f p e n i c i l l i n a s e sf r o m g r am - p o s i t i v ea n dg r am - n e g a t i v eb a c t e r i a b y s u b s t r a t e a n a l o g u e s .N a t u r e( L o n d o n )2 0 1 : 9 9 9 - 1 0 0 1 .

1 0 .N e u , H . C . ,an d J . Chou . 1 9 6 7 .Re l e a s e o f s u r f a c e en -zymes i nEn t e r o b a c t e r i a c e a eb y o s m o t i cs h o c k . J . B a c -t e r i o l .9 4 : 1 9 3 4 - 1 9 4 5 .

1 1 .N e u ,H . C . ,an d E . B . W in sh el l . 1 9 7 0 .Pu r i f i c a t i o n an dc h a r a c t e r i z a t i o no f p e n i c i l l i n a s e sf r o mS a l m o n e l l at y -p h i m u r i u ma n d E s c h e r i c h i a c o l i .A r c h . B i o c h e m .B i o -p h y s .1 3 9 : 2 7 8 - 2 9 0 .

1 2 .N i s h i d a , M. , an d Y . M i n e . 1 9 6 9 .S y n e r g i s t i ca c t i v i t yo fa m p i c i l l i na n d c l o x a c i l l i n .J . A n t i b i o t .2 2 : 1 4 4 - 1 5 0 .

1 3 .O ' C a l l a g h a n ,C . H . ,an d A . M o r r i s . 1 9 7 2 .I nh ib i t i o n o ff ? - l a c t a m a s e sb y , B - l a c t a ma n t i b i o t i c s .An t i m i c r o b .Ag e n t sC h e m o t h e r .2 : 4 4 2 - 4 4 8 .

1 4 .O k u b o ,T . ,M. I n o u e , an d S . M i t a u h a s h i . 1 9 7 5 .An t i -b a c t e r i a la c t i v i t yo f c om b i n a t i o n so f c e f a z o l i nan d s em i -s y n t h e t i cp e n i c i l l i n s .J . An t i b i o t . 2 8 : 8 0 4 - 8 0 8 .

1 5 .P e r r e t , C . J . 1 9 5 4 .I o d om e t r i c a s s a y o f p e n i c i l l i n a s e .N a t u r e( L o n d o n )1 7 4 : 1 0 1 2 - 1 0 1 3 .

1 6 .R i c h m o n d ,M. H . , an d N . A . C . C u r t is . 1 9 7 4 .Th e

i n t e r p l a yo f / ? - l a c t a m a s e sa n d i n t r i n s i cf a c t o r si n t her e s i s t a n c eo fg r am - n e g a t i v eb a c t e r i at o p e n i c i l l i n sa n dc e p h a l o s p o r i n s .Ann . N . Y.Acad . S c i .2 3 5 : 5 5 3 - 5 6 8 .

1 7 .R i c h m o n d ,M . H . ,an d R . B . S y k e s . 1 9 7 3 .T h e , - l a c t a -ma s e s o f g r am - n e g a t i v eb a c t e r i aa n d t h e i rp o s s i b l ep h y s i o l o g i c a lr o l e .Ad v.Mic r o b .P h y s i o l .9 : 3 1 - 8 8 .

1 8 .S a b a t h , L . D . ,an d E . P . Abraham. 1 9 6 4 .S y n e r g i s t i ca c t i o no fp e n i c i l l i n sa n d c e p h a l o s p o r i n sa g a i n s tP s e u -d o m o n a s p y o c y a n e a .N a t u r e( L o n d o n )2 0 4 : 1 0 6 6 - 1 0 6 9 .

1 9 .S a w a i ,T . ,S .N a k a j i m a ,T . Mo r o h o s h i ,an d S .Yama-g i s h i .1 9 7 7 .T h e rm o l a b i l er e p r e s s i o no fc e p h a l o s p o r i n -a s es y n t h e s i si n C i t r o b a c t e r f r e u n d i i .M i c r o b i o l .I m -m u n o l .2 1 : 6 3 1 - 6 3 8 .

2 0 .S t r o m i n g e r ,J . L . ,P . M . B l u m b e r g ,H . S u g i n a k a ,J .Um b r e i t ,and G . G .Wi c k u s .1 9 7 2 .Howp e n i c i l l i nk i l l sb a c t e r i a :p r o g r e s sa n d p r o b l em s .P r o c .R . S o c .L o n d o nS e r .B 1 7 9 : 3 6 9 - 3 8 3 .

2 1 .S u g i n a k a ,H . 1 9 7 6 .C om p a r i s o no ft h eb i nd i ng o fp e n i c i l -l i n G t o s t a p h y l o c o c c a lL - f o rm an di t s p a r e n t ' r a i nmemb r a n e s .An t im i c r o b .Ag e n t s C h em o t h e r .9 : 5 4 4 -5 4 5 .

2 2 .S u g i n a k a ,H . ,P . M .B l u m b e r g ,an d J . L .S t r o m i n g e r .1 9 7 2 .Mu l t i p l ep e n i c i l l i n - b i n d i n gc o m p o n e n t si nB a c i l -l u ss u b t i l i s ,Ba c i l l u s c e r e u s ,S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ,a n d Esch e r i ch i a c o l i .J . B i o l .C h em .2 4 7 : 5 2 7 9 - 5 2 8 8 .

2 3 .S u g i n a k a ,H . ,A . I c h i k a w a ,an d S .K o t a n i . 1 9 7 4 .P en -i c i l l i n - r e s i s t a n tme c h a n i sm si n P s e u d o m o n a sa e r u g i -no s a : e f f e c t so fp e n i c i l l i nG a n d c a r b e n i c i l l i no n t r a n s -p e p t i d a s ea n d D- a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s ea c t i v i t i e s .An t im i c r o b .Ag e n t sC h e m o t h e r .6 : 6 7 2 - 6 7 5 .

2 4 .S u g i n a k a ,H . ,A . I c h i k aw a , an d S .K o t a n i . 1 9 7 5 .Pe n -i c i l l i n - r e s i s t a n tme c h a n i sm si n P s e u d o m o n a sa e r u g i -n o s a : b i n d i n go fp e n i c i l l i nt oP s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aKM 3 3 8 .An t im i c r o b .Ag e n t sCh em o t h e r .7 : 6 2 9 - 6 3 5 .

2 5 .S u t h e r l a n d ,R . ,an d F . R . B a t c h e l o r . 1 9 6 4 .E f f e c t o fp e n i c i l l i n a s eo n t he a c t i v i t yo f p e n i c i l l i n s :s y n e r g i s t i ca c t i v i t yo f p en i c i l l i n s a g a i n s tp e n i c i l l i n a s e - p r o d u c i n gg r am - n e g a t i v eb a c i l l i .N a t u r e ( L o n d o n )2 0 1 : 8 6 8 - 8 6 9 .

2 6 .S y k e s , R . B . ,a n d M . M a t t h ew .1 9 7 6 .T h e f , - l a c t a m a s e so f g r am - n e g a t i v eb a c t e r i aa n d t h e i rr o l ei nr e s i s t a n c et of - l a c t ama n t i b i o t i c s .J . An t im i c r o b .C h em o t h e r .2 : 1 1 5 -1 5 7 .

2 7 .Yamamoto, S . ,a n d J . 0 . L a m p e n .1 9 7 6 .P u r i f i c a t i o no fp l a s m am e m b r a n ep e n i c i l W i n a s ef r o mB a c i l l u s l i c h e n i -f o rm i s7 4 9 / Ca n d c om p a r i s o nw i t h e x o e n z ym e .J . B i o l .C h e m .2 5 1 : 4 0 9 5 - 4 1 0 1 .

VOL. 1 6 ,1 9 7 9