Microscope Parts & Function Electron Microscope Light Microscope.
กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี ·...
Transcript of กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี ·...
![Page 1: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/1.jpg)
ผศ.ดร.ปิยะนุช เนียมทรพัย์
คณะวิทยาศาสตร ์มหาวิทยาลยัแม่โจ้
กล้องจลุทรรศน์และการย้อมสี
![Page 2: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/2.jpg)
การวดัขนาดจลิุนทรีย์
เน่ืองจากจุลนิทรยีเ์ป็นสิง่มชีวีติขนาดเลก็ทีไ่มส่ามารถมองเหน็
ไดด้ว้ยตาเปลา่ ดงันัน้จงึตอ้งอาศยักลอ้งจุลทรรศน์ (microscope) ซึง่จะ
ชว่ยขยายใหม้องเหน็รายละเอยีดทัง้รปูรา่งและลกัษณะของเซลล์
หน่วยใชว้ดัขนาดของจุลนิทรยี ์เชน่ ไมครอนหรอืไมโครเมตร
(micron, micrometer หรอื µm), นาโนเมตร (nanometer, nm) และ
แองสตรอม (angstrom, oA)
1 micrometer (µm) = 10-3 millimeter
= 10-6 meter
1 nanometer = 10-9 meter
1 angstrom (oA) = 10-10 meter
![Page 3: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/3.jpg)
กล้องจลุทรรศน์ (Microscope) กลอ้งจุลทรรศน์ แบ่งออกเป็น 2 ประเภท คอื แบบใชแ้สง
ธรรมดาและแบบใชแ้สงอเิลก็ตรอน
1. กล้องท่ีใช้แสงธรรมดา (compound microscope)
มเีลนส ์2 ชุด คอื เลนสว์ตัถุ (objective lens)
และเลนสต์า (ocular lens หรอื eyepieces)
ใชแ้สงธรรมดาเป็นแหล่งกาํเนิดแสง ขยายภาพ
โดยแสงเดนิทางจากแหล่งกําเนิดแสงผา่นเลนส์
รวมแสง (condenser lens) ซึง่จะบงัคบัใหแ้สง
ตรงเขา้สูว่ตัถุทีต่อ้งการด ูภาพของวตัถุจะถูก
ขยายอกีครัง้หน่ึงดว้ยเลนสต์า
![Page 4: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/4.jpg)
1. กล้องท่ีใช้แสงธรรมดา (compound microscope)
แบ่งออกเป็น
1.1 กลอ้งจุลทรรศน์แบบไบรทฟิ์ลด ์(bright field microscope)
1.2 กลอ้งจุลทรรศน์แบบดารค์ฟิลด ์(dark field microscope)
1.3 กลอ้งจุลทรรศน์แบบใชแ้สงอลัตราไวโอเลต (ultraviolet microscope)
1.4 กลอ้งจุลทรรศน์ฟลอูอเรสเซนซ ์(fluorescence microscope)
1.5 กลอ้งจุลทรรศน์เฟสคอนทรสัต ์(phase-contrast microscope)
![Page 5: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/5.jpg)
1.1 กล้องจลุทรรศน์แบบไบรทฟิ์ลด ์(bright field microscope)
เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีใ่ชก้นัอยา่งแพรห่ลายในหอ้งปฏบิตักิารทัว่ไป มี
กาํลงัขยายประมาณ 1,000 เทา่ ขอ้จาํกดัของกาํลงัขยาย (magnification)
น้ีไมไ่ดข้ึน้อยูก่บัผลคณูของกาํลงัขยายของเลนสต์าและเลนสว์ตัถุเทา่นัน้
แต่ยงัขึน้กบัความสามารถของเลนสว์ตัถุในการแยกแยะรายละเอยีดของ
ภาพ ใหเ้หน็ความแตกต่างกนัได ้ทีเ่รยีกวา่รซีอลวงิเพาเวอร ์(resolving
power)
![Page 6: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/6.jpg)
คา่ resolving power หรอืคา่รโีซลชูนั (resolution) หมายถงึ ค่าความสามารถของเลนสใ์นการแยกแยะรายละเอยีดของภาพ ทาํใหเ้หน็ความแตกต่างระหวา่งจุดสองจุดทีอ่ยูภ่ายในโครงสรา้งได้ คา่ resolving power ขึน้อยูก่บัความยาวคลื่นแสง และคา่ numerical aperture, N.A.) ของเลนสน์ัน้
ค่า resolving power = ความยาวคล่ืนแสง2 N.A.
ดงันัน้ ถา้ความยาวคลื่นแสงยิง่สัน้ จะใหร้ายละเอยีดของภาพมากขึน้ Numerical aperture (N.A.) เป็นสมบตัขิองเลนสท์ีเ่กีย่วขอ้งกบัดชันีหกัเหของตวักลางทีแ่สงผา่นไปก่อนจะเขา้สูเ่ลนสว์ตัถุ
![Page 7: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/7.jpg)
คา่ numerical aperture, N.A. มสีตูรดงัน้ี
N.A. = n sin θ
θ = มมุครึง่หน่ึง (half-aperture angle) ของกรวยแสงทีผ่า่นเขา้สูเ่ลนส์ n = ดชันีหกัเหแสงของตวักลางระหวา่งวตัถุกบัเลนส์
จะเหน็วา่การใชน้ํ้ามนัจะทาํใหค้า่ N.A. สงูขึน้ ดงันัน้ถา้ตอ้งการใหค้า่
resolving power สงูทีส่ดุ จะตอ้งใช้
แสงทีม่คีวามยาวคลื่นสัน้ทีส่ดุ และ
เลนสว์ตัถุมคีา่ N.A. มากทีส่ดุดว้ย
![Page 8: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/8.jpg)
เลนสว์ตัถท่ีุใช้น้ํามนั (oil immersion objective)
เป็นเลนสว์ตัถุทีม่กีาํลงัขยายมากทีส่ดุ คอื 100 เทา่ ซึง่การใชเ้ลนสน้ี์
ตอ้งเพิม่ความระมดัระวงัมาก เน่ืองจากระยะหา่งระหวา่งวตัถุกบัเลนสช์ดิ
กนัมาก เวลาใชจ้งึตอ้งหยดน้ํามนั (immersion oil) บนสไลดแ์ละใหเ้ลนส์
วตัถุสมัผสักบัน้ํามนั เพือ่ใหแ้สงเดนิทางผา่นเป็นเสน้ตรงเขา้สูเ่ลนสว์ตัถุได ้
ถา้ไมใ่ชน้ํ้ามนั แสงทีผ่า่นจากแกว้สไลดเ์ขา้สูอ่ากาศ จะหกัเหออกไปมาก
ทาํใหแ้สงเขา้สูเ่ลนสน้์อย ภาพจงึไมช่ดั
![Page 9: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/9.jpg)
กาํลงัขยายของกล้องจลุทรรศน์ (magnification)
กลอ้งสว่นใหญ่ทีใ่ชใ้นหอ้งปฏบิตักิารจุลชวีวทิยา ประกอบดว้ยเลนส์
วตัถุ 4 ขนาด ซึง่มกีาํลงัขยายทีต่่างกนั คอื
- เลนสว์ตัถุกาํลงัขยายตํ่า (low-power objective lens) = 4x, 10x
- เลนสว์ตัถุกาํลงัขยายสงู (high-power objective lens) = 40x
- เลนสว์ตัถุหวัน้ํามนั (oil immersion objective lens) = 100x
ขณะทีเ่ลนสต์ามกีาํลงัขยาย 10 เทา่
ดงันัน้ กาํลงัขยายของภาพจากกลอ้งจุลทรรศน์จงึสามารถคาํนวณไดจ้าก
กาํลงัขยายของภาพ = กาํลงัขยายของเลนสต์า x กําลงัขยายของเลนสว์ตัถุ
![Page 10: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/10.jpg)
1.2 กล้องจลุทรรศน์แบบดารค์ฟิลด ์(dark field microscope)
เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีท่าํใหพ้ืน้ภาพเป็นสดีาํ ในขณะทีว่ตัถุทีต่อ้งการดู
เกดิภาพสว่าง โดยอาศยั condenser พเิศษ (dark field stop) ทีจ่ะตดัแสง
ออกไปไมใ่หเ้ขา้กลอ้ง ดงันัน้ถา้พืน้ของตวัอยา่งทีจ่ะศกึษาเป็นสารเน้ือ
เดยีวกนัและโปรง่ใส แสงทีผ่า่น condenser พเิศษน้ีจะเลยออกไปและพืน้
ภาพจะเป็นสดีาํ แต่ถา้มวีตัถุอยูจ่ะเกดิการสะทอ้นและหกัเหแสงใหเ้ขา้สู่
เลนส ์จงึเกดิภาพสว่างขึน้ในทีม่ดื กลอ้งน้ีมี
ประโยชน์ใชศ้กึษาจุลนิทรยีท์ีไ่มย่อ้มสแีละ
ศกึษาสไลดส์ดและเทคนิคหยดแขวน
และใชใ้นการวนิิจฉยั
เชือ้โรคบางชนิด เชน่
เชือ้ซฟิิลสิ
![Page 11: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/11.jpg)
1.3 กล้องจลุทรรศน์อลัตราไวโอเลต (ultraviolet microscope)
เป็นกลอ้งจุลทรรศน์ทีใ่ชแ้สงอลัตราไวโอเลต ซึง่จะทาํให ้resolving
power มากกวา่กลอ้งธรรมดา เพราะแสงอลัตราไวโอเลตมคีลื่นสัน้กวา่
(ประมาณ 180-400 nm) เลนสข์องกลอ้งชนิดน้ีทาํจากควอตซ ์ทาํใหแ้สง
เขา้สูก่ลอ้งไดม้าก จงึทาํใหภ้าพชดัเจน แต่เน่ืองจากแสงอลัตราไวโอเลตน้ี
ตาเรามองไมเ่หน็ จงึตอ้งบนัทกึภาพไวบ้นฟิลม์
![Page 12: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/12.jpg)
1.4 กล้องจลุทรรศน์ฟลอูอเรสเซนซ ์(fluorescence microscope)
เป็นกลอ้งทีใ่ชห้ลกัการทีใ่หจุ้ลนิทรยีย์อ้มสฟีลอูอเรสเซนซ ์ซึง่จะเกดิ
การเรอืงแสงและสวา่งขึน้เมือ่ผา่นรงัสอีลัตราไวโอเลต จงึทาํใหจุ้ลนิทรยี์
ชดัเจนในฉากทีม่ดื สทีีนิ่ยมใชย้อ้ม เชน่ ส ีauramine O ส ีacridine yellow
สฟีลอูอเรสเซนซใ์ชม้ากในการหาปฏกิริยิาทางน้ําเหลอืงวทิยา
เรยีกเทคนิคน้ีวา่ fluorescent-antibody technique
![Page 13: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/13.jpg)
1.5 กล้องจลุทรรศน์เฟสคอนทรสัต ์(phase contrast microscope)
เป็นกลอ้งทีใ่ชศ้กึษาเซลลท์ีม่ชีวีติ โดยมหีลกัการทีใ่ช ้phase contrast
objective และ condenser พเิศษ (annular stop) ตดิเขา้ไปในกลอ้ง
จุลทรรศน์ทีใ่ชแ้สงธรรมดา โดยการทีแ่สงผา่นวตัถุทีม่คีวามหนาแน่น
ต่างกนั แสงจะหกัเหออกไปมากน้อยต่างกนั ทาํใหแ้ต่ละสว่นของวตัถุมี
ความสวา่งต่างกนัดว้ย จงึทาํใหก้ลอ้งชนิดน้ีแยกรายละเอยีดของลกัษณะ
ภายในจุลนิทรยีไ์ด้
![Page 14: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/14.jpg)
2. กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอน (electron microscope, EM)
เป็นกลอ้งทีม่คีวามแตกต่างจากกลอ้งจุลทรรศน์ธรรมดาหลายขอ้
- มกีําลงัขยายสงูมาก
- มคีวามยาวคลื่นอเิลก็ตรอนสัน้มาก คอื 0.05 Ao ดงันัน้จงึสามารถ
แยกแยะรายละเอยีดของวตัถุทีข่นาด 10 Ao ได ้และขยายภาพไดถ้งึ
400,000 เทา่
- การทาํใหเ้กดิภาพจะใชส้นามแมเ่หลก็ไฟฟ้า และการเตรยีมตวัอยา่งเพือ่
ใชศ้กึษาตอ้งเป็นตวัอยา่งทีแ่หง้และเบามาก
- ภาพทีไ่ดจ้ะปรากฏบนฉากเรอืงแสงหรอืถ่ายภาพไว้
กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนม ี2 ชนิด คอื
2.1 กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนแบบสอ่งผา่น (Transmission EM, TEM)
2.2 กลอ้งจุลทรรศน์อเิลก็ตรอนแบบสอ่งกราด (Scanning EM, SEM)
![Page 15: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/15.jpg)
2.1 กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอนแบบส่องผา่น (TEM)
ใชใ้นการศกึษาโครงสรา้งภายในและรายละเอยีดขององคป์ระกอบ
ภายในตวัอยา่ง และยงัสามารถใชศ้กึษารปูรา่ง ขนาด และลกัษณะ
ภายนอกของตวัอยา่งแบบสองมติไิด้
Bacillus subtilis
![Page 16: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/16.jpg)
2.2 กล้องจลุทรรศน์อิเลก็ตรอนแบบส่องกราด (SEM)
ใชใ้นการศกึษาลกัษณะทางสณัฐานและลกัษณะพืน้ผวิของตวัอยา่ง
แต่กาํลงัขยายทีไ่ดไ้มส่งูเทา่กบั TEM
![Page 17: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/17.jpg)
เปรยีบเทยีบระบบการเกดิภาพของกลอ้งจุลทรรศน์ 3 ชนิด
![Page 18: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/18.jpg)
TEM SEM
ขอ้ดี - มคีา่ resolution สงู ขยายภาพได้
ถงึแสนเทา่
- ไมต่อ้งตดัชิน้สว่นใหบ้าง
- สามารถมองเหน็ภาพ 3 มติไิด้
ขอ้เสยี - มคีวามสามารถในการทะลุทะลวง
จาํกดั ตอ้งใชช้ิน้ตวัอยา่งทีบ่างมาก
- ไมส่ามารถเหน็ภาพ 3 มติไิด้
- ตอ้งผา่นกระบวนการเตรยีม
ตวัอยา่งหลายขัน้ตอน ทาํให ้
ตวัอยา่งเหีย่วยน่และเสยีรปูทรงได้
- กาํลงัขยายไมส่งูเทา่ TEM
![Page 19: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/19.jpg)
การเตรียมวตัถเุพ่ือศึกษาด้วยกล้องจลุทรรศน์ธรรมดา
การเตรยีมตวัอยา่งเชือ้จุลนิทรยีเ์พือ่นํามาศกึษาดว้ยกลอ้งจุลทรรศน์ที่
ใชแ้สงธรรมดาอาจทาํได ้2 วธิ ีคอื
- การเตรยีมสไลดส์ดและการทาํเทคนิคหยดแขวน
- การทาํใหเ้ซลลแ์หง้ตรงึอยูก่บัที ่และยอ้มสเีพือ่ใหเ้หน็ความแตกต่าง
การเตรียมสไลดส์ด
วธิน้ีีจะชว่ยใหม้องเหน็จุลนิทรยีใ์นสภาพธรรมชาตจิรงิๆ โดยทีจุ่ลนิทรยีจ์ะ
ลอยอยูใ่นของเหลว โดยหยดของเหลวทีม่จุีลนิทรยีบ์นแผน่แกว้สไลด ์ปิดทบั
ดว้ยกระจกปิดสไลด ์(cover slip)
![Page 20: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/20.jpg)
การทาํเทคนิคหยดแขวน (Hanging drop technique)
มลีกัษณะคลา้ยการทาํสไลดส์ด แต่ใหห้ยดของเหลวทีม่จุีลนิทรยีบ์น
กระจกปิดสไลดก่์อน แลว้จงึควํ่าสไลดห์ลุมทีม่หีลุมตรงกลางลงบนกระจกปิด
สไลดใ์หบ้รเิวณหลุมอยูต่รงกลางเหนือหยดของเหลว แลว้พลกิสไลดใ์หห้งาย
ขึน้ หยดเชือ้จะแขวนอยูก่บักระจกปิดสไลดแ์ละอยูเ่หนือหลุมของสไลดห์ลุม
พอดี ขอ้ดี
- สามารถศกึษาเซลลท์ีม่ชีวีติได้
- สงัเกตรปูรา่งและการเรยีงตวัของเซลล์
ไดช้ดัเจน
- สามารถศกึษาพฤตกิรรมต่างๆ ของเซลล์
ได ้เชน่ การเคลื่อนที่
- สามารถศกึษาถงึองคป์ระกอบต่างๆ ภาย
ในเซลล์
![Page 21: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/21.jpg)
การย้อมสีจลิุนทรีย ์(Staining)
เน่ืองจากจุลนิทรยีม์ขีนาดเลก็มากและมกัโปรง่แสง จงึแยกความ
แตกต่างกบัของเหลวทีจุ่ลนิทรยีแ์ขวนลอยอยูไ่ดน้้อย ทาํใหม้องเหน็ไดย้าก
ดงันัน้การยอ้มสจีะชว่ยใหเ้หน็รายละเอยีดและความแตกต่างของจุลนิทรยีแ์ต่
ละชนิดไดม้ากขึน้
สทีีใ่ชย้อ้มจุลนิทรยีพ์วกแบคทเีรยี แบ่งออกเป็น 2 ชนิด คอื
1. สทีีม่คีุณสมบตัเิป็นกรดหรอืมปีระจุลบ (acid dye หรอื ionic dye)
ตวัทาํใหเ้กดิสมีปีระจุเป็นลบ จงึยอ้มตดิกบัสารทีม่ปีระจุไฟฟ้าเป็นบวก
ไดแ้ก่สอีโีอซนิ (eosin)
2. สทีีม่สีมบตัเิป็นเบสหรอืมปีระจุบวก (basic dye หรอื cationic dye)
ตวัทีท่าํใหเ้กดิสมีปีระจุไฟฟ้าเป็นบวก จงึยอ้มตดิกบัสารทีม่ปีระจุ
ไฟฟ้าเป็นลบไดด้ ีไดแ้ก่สเีมทลินีบล ู(methylene blue)
![Page 22: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/22.jpg)
วิธีการเตรียมสเมียรเ์ช้ือ (smear preparation)
1. Smear preparation
2. Air dry 3. Heat fix 4. Staining
![Page 23: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/23.jpg)
วิธีการย้อมสีแบคทีเรีย มวีธิกีารทีส่าํคญั 2 แบบ คอื
1. การย้อมสีแบบธรรมดา (simple staining)
โดยใชส้ชีนิดเดยีวยอ้มเซลลท์ิง้ไวร้ะยะหน่ึง หลงัจากนัน้ลา้งออกดว้ยน้ํา
และซบัใหแ้หง้ เซลลจ์ะยอ้มตดิสสีมํ่าเสมอกนั การยอ้มแบบน้ีเพือ่ศกึษา
รปูรา่งและขนาดของเซลล ์ตวัอยา่งสทีีใ่ช ้เชน่ crystal violet (A), methylene
blue (B) และ carbol fuchsin (C) เป็นตน้
![Page 24: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/24.jpg)
2. การย้อมมากกว่าหน่ึงสี (differential staining)
โดยการใชส้ยีอ้มมากกวา่หน่ึงชนิด ทาํใหส้ยีอ้มตดิสว่นต่างๆ ของเซลล์
ไมเ่ทา่กนั จงึเหน็ความแตกต่างระหวา่งเซลลห์รอืองคป์ระกอบของเซลล ์
2.1 การย้อมสีแบบแกรม (Gram staining)
การยอ้มสแีบบน้ีมคีวามสาํคญัทีส่ดุ
และใชก้นัแพรห่ลาย สามารถใชศ้กึษา
รปูรา่งลกัษณะและการจดัเรยีงตวัของ
เซลล ์และทาํใหจ้าํแนกแบคทเีรยีออก
เป็นสองชนิดคอื แบคทเีรยีแกรมบวก
และแบคทเีรยีแกรมลบ
![Page 25: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/26.jpg)
Gram positive bacteria
Gram negative bacteria
ขอ้จาํกดัของการยอ้มสแีบบแกรม
- อายขุองเชือ้ ถา้แก่ แบคทเีรยีแกรมบวกจะ
สญูเสยีความสามารถในการตดิส ีcrystal
volet ทาํใหต้ดิสแีกรมลบแทน
- ขึน้กบัสภาพแวดลอ้มของแบคทเีรยี
หรอืขึน้กบัวธิกีารเกลีย่เชือ้ วธีกีารยอ้มส ี
และคุณภาพของสทีีใ่ช้
![Page 27: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/27.jpg)
2.2 การย้อมสีแบบทนกรด (Acid-fast staining)
แบคทเีรยีบางชนิดมคีวามสามารถทีจ่ะทนต่อการลา้งดว้ย acid alcohol
เราเรยีกแบคทเีรยีพวกน้ีว่าแบคทเีรยีทนกรด (acid-fast bacteria)
เน่ืองจากมปีรมิาณไขมนัในเซลลส์งู เชน่ mycolic acid ไดแ้ก่แบคทเีรยี
กลุ่ม Mycobacterium เชน่ M. tuberculosis สาเหตุของวณัโรค และ
M. leprae สาเหตุของ
โรคเรือ้น
![Page 28: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/28.jpg)
2.3 การย้อมสีสปอร(์Spore staining)แบคทเีรยีบางชนิด เชน่ ในจนีสั Bacillus และ Clostridium จะมกีาร
สรา้งสปอรภ์ายในเซลลเ์รยีกวา่ endospore ซึง่สปอรจ์ะตดิสยีอ้มยาก แต่ เมือ่ตดิแลว้กล็า้งออกยากดว้ย จงึตอ้งใชค้วาม รอ้นชว่ยเพือ่ใหต้ดิสมีากขึน้และเรว็ขึน้ การ ยอ้มสปอรช์ว่ยใหศ้กึษาขนาดรปูรา่งและ ตําแหน่งของสปอรไ์ด้ วธิยีอ้มนิยมใชว้ธิขีอง Schaeffer และ
Fulton โดยใชส้ ีmalachite green ยอ้มสปอร์ และยอ้มเซลลด์ว้ยสแีดงของ safranin
![Page 29: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/29.jpg)
2.4 การย้อมสีโครงสร้างต่างๆ ของเซลลแ์บคทีเรีย
โครงสรา้งต่างๆ ของเซลลแ์บคทเีรยี เชน่ แฟลกเจลลา แคปซลู ผนงัเซลล ์เมด็แกรนูลต่างๆ ตอ้งใชว้ธิกีารยอ้มดว้ยเทคนิคพเิศษ จงึจะเหน็ความแตกต่างของโครงสรา้งเหล่านัน้
![Page 30: กล้องจุลทรรศน์และการย้อมสี · กล้องจุลทรรศน์ (Microscope) กล้องจุลทรรศน์](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041621/5e3f4d28e567ea6c8b6d6d82/html5/thumbnails/30.jpg)
2.5 การย้อมสีแบบลบ (negative staining)
การยอ้มแบบลบตวัเซลลแ์บคทเีรยีจะไมต่ดิสยีอ้ม แต่สจีะไปตดิแน่นกบัแผน่สไลดแ์ทน จงึมองเหน็ฉากมดื สว่นตวัเซลลแ์บคทเีรยีจะโปรง่แสง สทีีนิ่ยมคอื หมกึอนิเดยี หรอืสนิีโกรซนิ วธิน้ีีมขีอ้ดคีอื ทาํใหข้นาดและ
รปูรา่งของแบคทเีรยีไมเ่ปลีย่นแปลง เน่ืองจากไมม่กีารใชค้วามรอ้นซึง่จะทาํให้ ขนาดเลก็ลงและรปูรา่งบดิเบีย้วจากความ เป็นจรงิ