รายงานฉบบสมบรณ

โครงการวจย

การผลตสารพอลแซคคาไรดจากเหดสมนไพรพนเมองภาคใตในอาหารเหลวจากนาทงโรงงานสกดนามนปาลม

(Polysaccharides Production of Local Medicinal Mushroom of Southern Thailand in

Submerged Culture from Palm Oil Mill Effluent)

คณะนกวจย

ผชวยศาสตราจารย ดร.สวทย สวรรณโณ

ดร.ณฐธดา สวรรณโณ

โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากเงนงบประมาณแผนดนมหาวทยาลยสงขลานครนทร

ประจาปงบประมาณ 2555-2556 รหส ENV 5500075

(1)

บทคดยอ

งานวจยนมว ตถประสงคเพอส ารวจชนดของเหดสมนไพรในพนทภาคใต และประยกตใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนสารอาหารเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร จากผลการทดลองศกษาอตราการเจรญของเสนใย และวเคราะหปรมาณสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคนของเหดสมนไพรทคดแยกได 15 สายพนธจากแหลงธรรมชาตในสามจงหวดของภาคใต คอ สงขลา พทลง และสตล พบวาเหดดนหมมวงด า (Daldania concentrica) มอตราการเจรญของโคโลนสงสด 9.0 เซนตเมตร ทเวลาเพาะเลยง 7 วนในขณะทสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคนพบปรมาณสงสดในเหดหลนเจอขอบเหลอง (Ganoderma calidophilum) คอ 1,230 มก./ลตร และ 920 มก./ลตร ตามล าดบ จากการวเคราะหองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไดแก คาพเอช 7.93 ซโอด 7,286 มก./ลตร ของแขงละลายน าไดทงหมด 11,720 มก./ลตร ของแขงแขวนลอยทงหมด 1,900มก./ลตร คารโบไฮเดรต 4.30 มก./ลตร ปรมาณแรธาต ไนโตรเจนทงหมด 437 มก./ลตร ฟอสฟอรสทงหมด 15 มก./ลตรโพแทสเซยม 280 มก./ลตร และเหลก 0.93 มก./ลตร เมอน าไปใชทดลองในการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองโดยการใชเทคนค Seed inoculum ในการเตรยมเชอเรมตน ดวยการเพาะเลยงเสนใย เหด ในอาหาร Sweet Potato Dextrse Broth (SPDB) บนเคร อ ง เขย า (120 rpm) ทอณหภมหองเปนเวลา 7 วน แลวใช Seed inoculum รอยละ 7 โดยปรมาตรเพาะเลยงในอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทปรบสภาวะตางๆ พบวาสภาวะทเหมาะสมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอของเหลอง คอคาพเอชเรมตนของน าทงเทากบ 6 อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 และอตราสวนแรธาต CaCl2 :MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 6:0.5:1:0.06 เพาะเลยงทอณหภมหองเปนเวลา 8 วน โดยทการใชอตราการเตมอากาศ 0.5 vvm เหดหลนจอขอบเหลองสามารถใหผลตเสนใยแหง มปรมาณสารเอนโดโพลแซคคาไรด และเอนโดเบตากลแคนสงสดเทากบ 2.308 กรม/ลตร 3,072 และ 37,570 ไมโครกรม/กรม นน.เซลลแหง ตามล าดบ ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.5 vvm เชอเหดหลนจอขอบเหลองใหปรมาณสารเอกโซเบตากลแคนสงสด 69,512 ไมโครกรม/กรม นน.เซลลแหง นอกจากนยงพบวาสารสกดในรป endocellular product ซงสกดไดจาก Ganoderma calidophilum ทเพาะเลยงในอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมความสามารถสงในการจบกบอนมลของ DPPH และ ABTS ไดถงรอยละ 87.4 และรอยละ 80.7 ตามล าดบ ใหปรมาณฟนอลทงหมด 307 ไมโครกรม/มล. และคา FRAP 513 ไมโครกรม/มล. สารสกดในรป endocellular product ยงสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรยทกอใหเกดโรค ไดแก Escherichia coli และ Staphylococcus aureus ไดดกวาสารสกดในรป exocellular product

(2)

Abstract

The objective of this research was survey on local medicinal mushroom occurence in Sounthern Thialand. The palm oil mill effluent was applicated for medium broth culture of medicinal mushroom mycelium. The results were found that mycelium growth rat, polysaccharide and ß -glucan analysis of local medicinal mushroom 15 isolates from natural sources in the 3 sourthern provinces of Songkhla, Phatthalung and Satun. Daldania concentrica has the highest growth rate with a colony diamerter of 9.0 cm at 7 day of cultivation time. While, the maximum of polysaccharide content (1,230 mg/l) and ß-glucan content (920 mg/l) were obtanted from Ganoderma calidophilum. The chemical characteristics of palm oil mill effluent were analysed includining pH 7.93, Chemical Oxygen Demand 7,286 mg/l, Total Dissolve Solid 11,720 mg/l, Total Suspended Solid 1,900 mg/l, Carbohydrate 4.30 mg/l, Total Kjeldahl Nitrogen 437 mg/l, Total Phosphorus 15 mg/l, Total Potassium 280 mg/l and Iron 0.93 mg/l. The initial inoculum of Ganoderma calidophilum mycelium was prepared by seed inculum technique. The technique was done by cultivation the mycelium in Sweet Potato Dextrse Broth (SPDB) and placed on a rotay shker (120 rpm) at room temperature for 7 days. The seed inoculum (7 % v/v) was cultivated in palm oil mill effuent by varous conditions. The obtimized condition for Ganoderma calidophilum mycelium cultivated in palm oil mill effuent was including initial pH 6, C:N ratio at 40, micronutrients ratio of CaCl2: MgSO4: ZnCl2: FeSO4 at 6.0:0.5:1.0:0.06 and incubated at room temperature for 8 days. It was found that when the areatio rat adjusted at 0.5 vvm, this condition gave maximum value of mycelium dry weight, endopolysacchid and endo ß-glucan contents was 2.3 g/l, 3,072 and 37,570 mg/ dry cell weight, respectively. While, the aeration rat was adjusted at 1.5 vvm, the maximum value of exo ß-glucan content was obtained at 69,512 mg/l. Moreover, the endocellular product was extracted from Ganoderma calidophilum mycelium which cultivated in palm oil mill effluent gave exhibited the higest values of DPPH and ABTS at 87.4 % and 80.4%, respectively. The total phenolic value was 307 µg/ml , and FRAP value was 513 µg/ml, respectively. Besides, the endocellular extract showed antimicrobial activity against pathogenic bacteria of Escherichia coli and Staphylococcus aureus than those of exocellular extract.

(3)

กตตกรรมประกาศ

งานวจยเรองการผลตสารโพลแซคคาไรดจากเหดสมนไพรพนเมองภาคใตในอาหารเหลวจากน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ซงไดท าการวจยโดยคณาจารยและนกศกษาปรญญาโท ส า ข า ก า ร จ ด ก า ร ส ง แ ว ด ล ล อ ม แ ล ะ อ า จ า ร ย จ า ก ค ณ ะ ว ท ย า ก า ร จ ด ก า ร มหาวทยาลยสงขลานครนทร โครงการวจยนไดรบเงนทนสนบสนนการวจยจากงบประมาณแผนดน ประจ าปงบประมาณ 2554-2556 โดยมวตถประสงคเพอส ารวจและวเคราะหปรมาณสารโพลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan ทพบในเหดพนเมองของภาคใตตอนลาง และเพอศกษาวธการเพาะเลยงทเหมาะสมในการผลตชวมวล และ ß-1,3-glucan อาหารเหลวทใชวตถดบจากน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม รวมทงการศกษาคณสมบตของสารสกดทไดจากการเพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม คณะผวจยโครงการใครขอขอบพระคณส านกวจยและพฒนาทสนบสนนเงนทนในการวจย และคณะการจดกาสงแวดลอมทอนญาตใหใชสถานทในการวจย รวมทงนกศกษาปรญญาโทสาขาการจดการสงแวดลอมและอาจารยจากคณะวทยาการจดการทรวมกนท างานวจยนใหส าเรจลลวงไปดวยด และหวงเปนอยางยงวาสวนทเปนประโยชนและมคณคาของงานวจยชนนจะเปนสวนหนงในการพฒนาเศรษฐกจของชมชนในพนทภาคใตไดตอไป คณะผวจย กนยายน 2558

(4)

สารบญ

หนา

บทคดยอ Abstract กตตกรรมประกาศ สารบญ รายการตาราง รายการรป บทท 1 บทน า

1.1 บทน าตนเรอง 1.2 การตรวจเอกสาร

1.2.1 กระบวนการสกดน ามนปาลม 1.2.2 ปรมาณ และลกษณะของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม 1.2.3 การใชประโยชนจากน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม 1.2.4 ขอมลทวไปเกยวกบเหดสมนไพร

1.2.4.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหด 1.2.4.2 องคประกอบและสารออกฤทธทพบในเหดสมนไพร 1.2.4.3 การเพาะเลยงเหดสมนไพร

1.2.5 สารพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan 1.2.5.1 สารพอลแซคคาไรด 1.2.5.2 ß-1,3-glucan

1.2.6 สารตานอนมลอสระ (Antioxidant) 1.3 วตถประสงค 1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 1.5 ขอบเขตการวจย

บทท 2 วธการวจย 2.1 วธด าเนนการ

2.1.1 การคดเลอกสายพนธเหดสมนไพร 2.1.2 การวเคราะหการเจรญของเสนใยเหดสมนไพร ปรมาณสาร

เอนโดพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan 2.1.2.1การทดสอบลกษณะการเจรญของเสนใยเหดสมนไพร

(1) (2) (3) (4) (8) (10) 1 2 2 3 5 8 8 9 13 19 19 21 23 24 24 24

25 25 25 25

(5)

สารบญ (ตอ)

หนา

2.1.2.2 การทดสอบความสามารถของสายพนธเหดพนเมอง ภาคใตทเจรญในอาหารเหลวเอสพดบ 25

2.1.2 ศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรดของเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

2.1.2.1 ศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม

2.1.2.2 การเตรยมเชอเรมตน 2.1.2.3 การศกษาระยะเวลาทเหมาะสมของการเตรยม Seed

inoculum 2.1.2.4 การศกษาคาพเอชเรมตนทเหมาะสมของน าทงโรงงาน

สกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร 2.1.2.5 การศกษาอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทเหมาะสม

ของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

2.1.2.6 การศกษาอตราสวนแรธาตทเหมาะสมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

2.1.2.7 การศกษาอตราการเตมอากาศทเหมาะสมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

2.1.3 ศกษาคณสมบตของสารพอลแซคคาไรดทไดจากการเพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

2.1.3.1 ศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทใชเปนอาหารส าหรบการเพาะเลยงหลงเกบเกยวผลผลตเสรจแลว

2.1.3.2 วเคราะหปรมาณโลหะหนกจากผลตภณฑทไดจากการเพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

2.1.3.3 วเคราะหสารตานอนมลอสระจากผลตภณฑทไดจากการเพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

27

27 28

28

29 29 30 30 31 31 32 32

(6)

สารบญ (ตอ)

หนา

2.1.3.4 ศกษาความสามารถในการยบยงการเจรญของ แบคทเรยจากผลตภณฑทไดจากการเพาะเลยงเหด ในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะท เหมาะสม

2.1.4 การวางแผนการทดลอง 2.2 วสด และอปกรณ

2.2.1 วสด และอปกรณ 2.2.2 เครองมอ 2.2.3 สารเคม

บทท 3 ผลการทดลอง และวจารณผลการทดลอง 3.1 ผลการคดเลอกสายพนธเหดสมนไพร

3.1.1 ผลการเกบรวบรวมสายพนธเหดสมนไพร 3.1.2 ผลการวเคราะหการเจรญของเสนใยเหดสมนไพร ปรมาณสาร เอนโดพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan

3.1.2.1 ผลการทดสอบลกษณะการเจรญของเสนใยเหดสนไพร 3.1.2.2 การทดสอบการเจรญของเสนใยเหดสมนไพรในอาหาร

เหลวเอสพดบ 3.2 ผลศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรดของเหด

สมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม 3.2.1 ผลศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงจากโรงงานสกด น ามนปาลม 3.2.2 ผลการเตรยมเชอเรมตน 3.2.3 ผลการศกษาระยะเวลาทเหมาะสมของการเตรยม Seed inoculum 3.2.4 ผลการศกษาคาพเอชเรมตนทเหมาะสมของน าทงโรงงานสกด

น ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร 3.2.5 ผลการศกษาอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทเหมาะสมของน า

ทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร 3.2.6 ผลการศกษาอตราสวนแรธาตทเหมาะสมของน าทงโรงงานสกด

น ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

35 35 35 35 37 37 42 42 45

48 49 50

51

54

57

33 34

(7)

สารบญ (ตอ)

3.2.7 ผลการศกษาอตราการเตมอากาศทเหมาะสมของน าทงโรงงาน

สกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหด 3.3 ผลศกษาคณสมบตของสารพอลแซคคาไรดทไดจากการเพาะเลยงเหด

หลนจอในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม 3.3.1 ผลศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมท

ใชเปนอาหารส าหรบการเพาะเลยงหลงเกบเกยวผลผลตเสรจแลว 3.3.2 ผลวเคราะหปรมาณโลหะหนกจากผลตภณฑทไดจากการ

เพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

3.3.3 ผลวเคราะหสารตานอนมลอสระจากผลตภณฑทไดจากการเพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

3.3.4 ผลศกษาความสามารถในการยบยงการเจรญของแบคทเรยจากผลตภณฑทไดจากการเพาะเลยงเหดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

61 65 65

66 67 73

บทท 4 สรปผลการทดลอง และขอเสนอแนะ 4.1 สรปผลการทดลอง

4.1.1 ผลการคดเลอกสายพนธเหดสมนไพร 4.1.2 ผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลตสารพอลแซคคาไรด

ของเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม 4.1.3 ผลการศกษาคณสมบตของสารพอลแซคคาไรดทไดจากการ

เพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

4.2 ขอเสนอแนะ เอกสารอางอง ภาคผนวก ก วธเตรยมสารเคม และวธวเคราะห ภาคผนวก ข วธเตรยมสารเคม และวธวเคราะหกจกรรมของสารตานอนมลอสระ ภาคผนวก ค บทความวจยทน าเสนอทประชมวชาการ (Proceeding)

75 75 75 75 76 77 88 93 101

หนา

(8)

รายการตาราง

ตารางท หนา

1.1 2.1 2.2

2.3

3.1 3.2 3.3

3.4

3.5

ลกษณะของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม องคประกอบทางเคม และวธวเคราะหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม องคประกอบทางเคมและวธวเคราะหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมหลงเพาะเลยงเหดสมนไพรในสภาวะทเหมาะสม ชนดของโลหะหนก และวธวเคราะหผลตภณฑทสกดไดจากเสนใยเหด ทเพาะเลยงน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดสมนไพรทพบในเขตภาคใตตอนลาง ผลการวเคราะหองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ผลการวเคราะหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกอนและหลงการเพาะเลยง เสนใยเหด ความเขมขนของโลหะหนกทพบในสารสกดจากเสนใยเหดทเพาะเลยงใน น าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ผลการทดสอบการยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรยจากสารทสกดได จากเสนใยเหด

5 27 32 32 38 49 66

67 74

(9)

รายการตาราง (ตอ)

ตาราง ภาคผนวกท

หนา

ก.1 ก.2

ก.3 ก.4

ข.1

ข.2

ข.3 ข.4

ข.5 ข.6 ข.7 ข.8

การเตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคสทความเขมขนระดบตางๆ คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐานกลโคสทความเขมขน ระดบตางๆ การเตรยมสารละลายมาตรฐาน ß-1,3-glucan ทความเขมขนระดบตางๆ คา Fluorescence intensity ของสารละลายมาตรฐาน ß-1,3-glucan ทความเขมขนระดบตางๆ การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ (Total phenolic contents) คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน Gallic acid ทความเขมขนระดบตางๆ การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ (DPPH assay) คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขนระดบตางๆ การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ (ABTS assay) คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขนระดบ การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ (FRAP assay) คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขน ระดบตางๆ

89

89 91 92 93 94 95 96 97 98 99

100

(10)

รายการรป

รปท หนา

1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

กระบวนการสกดน ามนปาลม ลกษณะเสนใยของเชอรา โครงสรางของพอลแซคคาไรด โครงสรางของ ß-1,3-glucan ลกษณะโหลแกวทใชในการทดลอง ลกษณะการเจรญเสนใยของเหดสมนไพรเมอเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอ ในสภาวะมด ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 20 วน การเจรญเตบโตของโคโลนของเหดสมนไพรทเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอ ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส ปรมาณสารเอนโดโพลแซคคาไรดของตวอยางเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลว เอสพดบ ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10 วน ปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan ของตวอยางเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลว เอสพดบ ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10 วน ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทระยะเวลา Seed inoculum ตางๆ ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทระดบพเอชเรมตนตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทระดบพเอชเรมตนตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนตางๆ เมอ เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

4 9 20 21 28 43 43 46

47 52 53 54 56

57

(11)

รายการรป (ตอ)

รปท หนา 3.10

3.11

3.12

3.13

3.14

3.15

3.16

3.17

3.18

ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนแรธาตตางๆ (มลลโมลตอลตร) เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหองในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนแรธาตตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน ปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรดและเอนโดพอลแซคคาไรด ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน ปรมาณสาร Exo-ß-1,3-glucan และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน ความสมพนธระหวางปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดจากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ ความสมพนธระหวางความสามารถในการยบยงสาร DPPH จากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ ความสมพนธระหวางความสามารถในการยบยงสาร ABTS จากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ ความสมพนธระหวางปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ จากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ

59

60

62 63 65

69 70 72 73

(12)

รายการรป (ตอ)

รป

ภาคผนวกท

หนา

ก.1 ก.2 ข.1 ข.2 ข.3 ข.4

กราฟมาตรฐานกลโคส วเคราะหดวยวธ Phenol sulfuric colorimetric กราฟมาตรฐาน ß-1,3-glucan วเคราะหดวยวธ Aniline blue กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน Gallic acid กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT (DPPH assay) กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT (ABTS assay) กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT (FRAP assay)

91 93 95 97 99 101

1

บทท 1 บทน ำ

1.1 บทน ำตนเรอง ปาลมน ามนเปนพชเศรษฐกจทส าคญชนดหนงของประเทศไทย โดยมผลผลตปาลมน ามนมากเปนอนดบ 3 ของโลก รองจาก มาเลเซย อนโดนเซย มพนทปลกปาลมน ามนประมาณ 4.077 ลานไร โดยพนทรอยละ 87 อยในภาคใต และมโรงงานสกดน ามนปาลม ประมาณ 80 โรงงาน ซงสวนใหญอยในเขตภาคใต มก าลงการผลตประมาณปละ 10-12 ลานตนปาลมทะลาย (กรมการคาภายใน, 2555) ประเทศไทยมแนวโนมการใชน ามนปาลมในปรมาณเพมขน ท าใหปจจบนมการขยายพนทปลกปาลมเพมขนเฉลยรอยละ 8.01 ตอป ซงสอดคลองกบแผนพฒนาอตสาหกรรมปาลมน ามน และน ามนปาลม (ป 2551-2555) ทตงเปาการขยายพนทปลกปาลมใหได ปละ 500,000 ไร เพอลดภาวการณขาดแคลนน ามนปาลมภายในประเทศ (ส านกงานสถตแหงชาต, 2555) ในกระบวนการสกดน ามนปาลมตองใชน าเปนปรมาณมาก ท าใหเกดน าทงจากกระบวนการผลตเปนปรมาณมากเชนกน โดยในการผลตเพอใหไดน ามนปาลมดบ 1 ตน ตองใชน าถง 5,000-5,700 ลตร และมากกวารอยละ 50 ของน าทใชจะกลายเปนน าทงจากกระบวนการสกดน ามนปาลม จากการวเคราะหคณสมบตของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมพบวา ในน าทงมปรมาณของสารอนทรยสง ทง โปรตน ไขมน สารประกอบไนโตรเจน และแรธาต (Liew, 2015) จากคณสมบตของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมหากไมมการบ าบดกอนปลอยลงสแหลงน าธรรมชาต จะสงผลกระทบตอคณภาพน า และสรางปญหามลภาวะทางน าเปนอยางมาก เชน ท าใหปรมาณออกซเจนในน าลดลงสงผลใหน าเกดการเนาเสย และสงมชวตในน าไมสามารถอาศยอยได เปนตน และจากคณสมบตของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมดงทกลาวมา จงมการน าไปใชประโยชนในดานตางๆอยางแพรหลาย เชน การน าไปใชเปนป ย การน าไปใชเปนอาหารสตว การน าไปใชเปนแหลงอาหารเพาะเลยงจลนทรยเพอใหไดผลผลตเปน กาซชวภาพ กรดอนทรย เอนไซม และสารก าจดแมลง เปนตน (Wu et al., 2007) โรงงานสกดน ามนปาลมขนาดใหญมกมแนวทางในการจดการกบน าทงโดยน าไปผลตเปนกาซชวภาพ ซงจะตองใชเงนลงทนเพอจดท าระบบหมกกาซคอนขางสง ท าใหโรงงานขนาดเลกทมเงนลงทนนอยไมสามารถท าได จงมกปลอยใหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไปอยในระบบบ าบดน าเสยโดยตรง ท าใหไมกอใหเกดประโยชนกบโรงงาน ดงนนผวจยจงมความสนใจทจะน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาใชใหเกดประโยชน โดยใชเปนแหลงอาหารในการเพาะเลยงเหดหลนจอเพอผลตสารพอลแซคคาไรด ซงเปนวธการน าน าทงมาใชไดโดยตรง และสามารถน าไปประยกตใชไดงาย ไมตองใชเงนทนมากเพอท าการเพาะเลยง จงเปนอกทางเลอกหนงในการสนบสนนใหโรงงานขนาดเลกน าน าทงกลบมาใชใหเกดประโยชน เพอลดปรมาณน าเสยทจะปลอยออกสแหลงน าธรรมชาต

2

ปกตแลวเหดหลนจอจะพบไดนอยมากตามธรรมชาต และมอายการเกบเกยวทยาวนานกวาจะตดดอกมาสกดสารพอลแซคคาไรดได ดงนนการเพาะเลยงเหดหลนในอาหารเหลวจงเปนวธทชวยลดระยะเวลาในการผลตสารพอลแซคคาไรดจากเหดหลนจอได (Tang and Zhong, 2002) สารพอลแซคคาไรดในเหดหลนจอมสรรพคณชวยสงเสรมระบบภมคมกนของรางกาย ชวยในการยบยงการเจรญ และแพรกระจายของเนองอก ปองกนการเกดมะเรง ปองกนและควบคมระดบน าตาลในเลอด (Liu, 2015) สารพอลแซคคาไรดโดยเฉพาะ ß-1,3-glucan จากเหดหลนจอจงเปนทตองการของตลาดทวโลก หนาทโดยทวไปของ ß-1,3-glucan จะชวยสงเสรมหรอเพมระดบภมคมกนของรางกาย โดยกระตนการท างานของ T-cells, B-cells และเซลลเมดเลอดขาว กลแคนจงถกน ามาใชประโยชนทเกยวของกบอาหารเสรมสขภาพหรอใชเปนยาปองกน และยบยงโรครายแรงตางๆ เชน ยบยงเซลลมะเรง (Anti-cancer), ยบยงการตดเชอ (Anti-infective), โดยเฉพาะอยางยงโรคเอดส(HIV) ดวย (Wasser, 2002; Daba and Ezeronye, 2003; Silva 2003; Liu and Zhang, 2005) ดงนนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทมสวนประกอบของสารอาหารตางๆ และลกโนเซลลโลส ซงมคณสมบตใกลเคยงกบแหลงอาหารตามธรรมชาตของเหดหลนจอ และในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมสารประกอบฟนอลกปะปนอย ท าใหจลนทรยบางชนดไมสามารถเจรญในน าทง แตเหดหลนจอสามารถน ามาใชเปนแหลงอาหารได การน าน าทงมาใชเปนแหลงอาหารส าหรบเพาะเลยงเหดจงเปนอกทางเลอกหนงทสามารถน าน าทงมาใชใหเกดประโยชน และยงเปนการเพมมลคาใหกบของเหลอทงทเกดจากอตสาหกรรมในพนท อกทงยงชวยลดปรมาณของเสยจากการกระบวนการผลตทจะปลอยออกสสงแวดลอมไดอกดวย

1.2 กำรตรวจเอกสำร

1.2.1 กระบวนกำรสกดน ำมนปำลม การสกดน ามนปาลมในประเทศไทยแบงออกเปน 2 แบบ คอ การสกดแบบใชน า

และการสกดแบบไมใชน า แตวธการสกดทสามารถรองรบวตถดบไดในปรมาณมาก และใหผลผลตในรปของน ามนปาลมดบทมคณภาพ คอ การสกดแบบใชน า หลกการของกระบวนการสกดน ามนปาลมคอการสกดน ามนจากผลปาลมโดยใชไอน า และเครองอด น ามนปาลมทไดจะถกน าไปท าใหบรสทธโดยการแยกน ามนโดยใชแรงโนมถวง ดงรปท 1.1 (จนตนา, 2541)

ขนตอนในการสกดน ามนปาลมแบบใชน าเรมจากการน าทะลายปาลมสด (Fresh fruit bunches) เขาสข นตอนการนงปาลม (Sterilization) ดวยไอน าโดยใชไอน าทมอณหภม 140 องศาเซลเซยส การนงทะลายปาลมสดจะเปนการยบยงเอนไซมตามธรรมชาต และท าใหข วผลปาลมนม ผลปาลม (Fruit) หลดรวงออกจากทะลายปาลม (Bunches) ไดงาย นอกจากนยงชวยใหเนอเยอของผลปาลมยย งายตอการสกดน ามน ทะลายปาลมทผานการนงแลวจะเขาสข นตอน

3

การแยกผลปาลมออกจากทะลายปาลม (Stripping) โดยเครองแยกแบบหมน จากขนตอนนจะไดเปนทะลายปาลมเปลา ซงจะถกก าจดออกไป สวนผลปาลมทถกแยกออกจะถกสงตอไปยงขนตอนการยอยผลปาลม (Digestion) การยอยผลปาลมมวตถประสงคเพอท าใหเมลดปาลม (Nuts) แยกออกจากผลปาลม โดยใชไอน ารอน 90-100 องศาเซลเซยส ใชเวลาประมาณ 15-20 นาท หลงจากสนสดกระบวนการยอย ผลปาลมจะถกน าเขาสข นตอนการบบอด (Pressing) จากขนตอนนจะไดเปนน ามน (Crude oil) และเสนใยปาลม(Fibre) ทปนอยกบเมลดปาลมออกมา (Lam et al., 2002) ในสวนของน ามนจากขนตอนการบบอด จะปะปนไปดวยน า และของแขงทไมใชน ามน (Non oil solid) จะถกน าเขาสข นตอนการแยกดวยเครองหมนเหวยงตอไป น ามนจะถกปลอยใหไหลผานถงดกทราย (Sand trap tank) และตะแกรงรอน (Vibrating screen) เพอแยกทราย เสนใยปาลม และสงสกปรกออกกอนจะสงไปยงถงตกตะกอน (Settling tank) ทถงตกตะกอนจะมไอน ารอนท าใหถงมอณหภมประมาณ 90 องศาเซลเซยสเพอท าใหเกดการแบงชนของน า และน ามน โดยสวนของน ามนจะอยชนบนสด ตรงกลางจะเปนสวนของตะกอน (Sludge) ทผสมอยกบน า ชนลางสดจะเปนทราย และอนภาคอนๆทมน าหนกมาก น ามนในชนบนสดจะน าไปท าใหบรสทธ (Purification) โดยการหมนเหวยง (Centrifuge) เพอแยกน า และสงสกปรกออก สวนของตะกอนจะถกสงไปยงเครองแยกตะกอน (Decanter) เพอแยกน ามนออกจากน า และของแขงทไมใชน ามน สวนของเสนใยทผสมอยกบเมลดปาลมเรยกวา Press cake จะถกสงไปยงเครองแยกเพอแยกเสนใยปาลมออกจากเมลดปาลม เมลดปาลมทไดจะน าเขาสข นตอนการก าจดน าดวยเพอท าใหเมลดปาลมแหงแลวน าไปกะเทาะแยกเอากะลาปาลม (Shell) ออกจากเนอในเมลดปาลม (Kernel) (Amelia et al., 2009)

1.2.2 ปรมำณ และลกษณะของน ำทงจำกโรงงำนสกดน ำมนปำลม กระบวนการสกดน ามนปาลมตองใชน าเปนจ านวนมากเพอใชผลตไอน าส าหรบ

นงปาลมและท าใหน ามนปาลมบรสทธ จากการวเคราะหพบวา น ามนปาลมดบทผลตได 1,000 ลตร จะตองใชน า ถง 5,000-5,700 ลตร โดยมากกวารอยละ 50 ของน าทใชสดทายจะกลายเปนน าทงจากการสกดน ามนปาลม (Palm Oil Mill Effluent: POME) (Liew, 2015)

โดยน าทงจะเกดขนระหวางกระบวนการสกดน ามนซงมาจาก 5 ขนตอนหลกคอ (ธนกฤต พรหมทอง, 2552; Wu et al., 2010)

1) จากการนงปาลม เปนน าทงจากการอบทะลายปาลมดวยไอน าน าสวนนแมจะมน ามนอยแตมสารแขวนลอยต า และไมมสภาพเปนอมลชน จากกระบวนการนจะเกดน าทงขนประมาณ 0.9 ตนตอตนน ามนปาลม

2) จากการขนตอนการแยกน า และตะกอนออกจากน ามน น าทงสวนนเกดขนมากทสด และเปนน าทงทมของแขงแขวนลอยมาก

3) จากการลางท าความสะอาดเครองมอ ไดแก เครองแยกกรวดทราย เครองแยกน าและตะกอนออกจากน ามน และเครองเหวยงความเรวสง

4

4) จากการหลอเยนหมอก าเนดไอน าและเครองระเหย เปนน าทมของแขงแขวนลอยต ามาก และยงสะอาดอย สวนใหญมการหมนเวยนกลบมาใชใหม

5) จากเครองเหวยงความเรวสง ลกษณะน าทงจากการสกดน ามนปาลม (ตารางท 1.1) จะมสารแขวนลอยปะปนอยรอย

ละ 95-56 มน ามนรอยละ 0.6-0.7 และของแขงทงหมดรอยละ 4-5 โดยรอยละ 2-4 จะเปนของแขงทละลายน าไดจากการนงทะลายปาลม การแยกตะกอน และเครองไฮโดรไซโคลน น าทงทเกดขนจะมสารอนทรยทสามารถยอยสลายไดอยสงมาก ซงน าทงนสามารถท าใหออกซเจนในน าลดลงไดและกอใหเกดมลพษอยางอนไดอกดวย (Ahmed, 2015)

รปท 1.1 กระบวนการสกดน ามนปาลม ทมา : ดดแปลงจาก Lam และ Lee (2011)

การอบทะลายปาลมดวยไอน า

การแยกผลปาลมออก จากทะลายปาลม

การยอยผลปาลม

กะลา ปาลม

เครอง หมนเหวยง

กากตะกอน น ามน

กะเทาะ เมลด

ทะลายปาลมสด

ทะลายปาลมเปลา

เมลดปาลม

การอบแหง

น าทงจากการอบ ทะลายปาลมปาลม

น าทง

เนอใน เมลด

เสนใย

ถงตกตะกอน

เครอง แยกตะกอน

ถงเกบ น ามน

วสดคลมดน

เชอเพลง

เชอเพลง

น าทง

น าทง

nuts

5

ตำรำงท 1.1 ลกษณะของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม

Parameter Concentration (mg/L) pH 4.2 Oil and grease 4,000 Biochemical oxygen demand (BOD) 25,000 Chemical oxygen demand (COD 41,000 Total solids 40,000 Suspended solids 18,000 Total volatile solids 34,000 Ammoniacal nitrogen (NH3-N) 35 Total nitrogen (TN) 750 Phosphorous (P) 180 Potassium (K) 2,270 Magnesium (Mg) 615 Calcium (Ca) 439 Boron (B) 7.6 Iron (Fe) 46.5 Manganese (Mn) 2.0 Copper (Cu) 0.89 Zinc (Zn) 2.3

* ยกเวนคา pH ทไมมหนวยความเขมขน ทมา : Madaki และ Seng (2013)

นอกจากนยงพบวาในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมนนมสารประกอบฟนอลกซงเปนสารพษทสามารถพบไดในน าทงจากอตสาหกรรมหลายประเภท เชน อตสาหกรรมสงทอ อตสาหกรรมส เปนตน ในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมอาจพบสารประกอบฟนอลกความเขมขนสง (>1000 มลลกรมตอลตร) (Alam, et. al., 2009) Zabka และคณะ (2013) พบวาสารประกอบฟนอลจะมผลตอจลนทรยบางชนด โดยจะไปมผลยบยงการเจรญเตบโต ซงประสทธภาพในการยบยงจะขนอยกบชนด และความเขมขนของสารประกอบฟนอล

1.2.3 กำรใชประโยชนจำกน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม จากการวเคราะหคณสมบตทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม พบวาในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมองคประกอบของ ไขมน สารประกอบไนโตรเจน และแรธาต

6

ปรมาณสง ความส าคญของการศกษาคณสมบตของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกเพอน ามาพฒนาการใชประโยชนจากของเสยโดยใชวธการทางเทคโนโลยชวภาพ และพฒนากระบวนการจดการน าทงใหมประสทธภาพ การใชวธการทางเทคโนโลยชวภาพขนสงเพอน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาใชเปนการใหความส าคญตอแนวคดการปลดปลอยของเสยทเปนศนย และการใชนวตกรรมทกาวหนาเพอการพฒนาทย งยน โดยใหความส าคญกบการผลตกาซชวภาพ และผลตภณฑทไดจากกระบวนการหมก (Wu et al., 2009)

1) กำรใชน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมเปนอำหำรเลยงเชอในกระบวนกำรหมก ความเปนไปไดของการน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาเปนอาหารเลยงเชอเปน

ผลมาจากขอเทจจรงทวาน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมนนมความเขมขนของคารโบไฮเดรต โปรตน ไขมน สารประกอบไนโตรเจน และแรธาตอยสง (Liew, 2015) น าทงโรงงานสกดน ามนปาลมถกน ามาใชประโยชนเปนอาหารเลยงเชอเพอผลตผลตภณฑตางๆเชน ยาปฏชวนะ สารก าจดแมลงชวภาพ ตวท าละลาย โพลไฮดรอกซอลคาโนเอท และกรดอนทรย เปนตน (Wu et al., 2007)

Jamal และคณะ (2005) ศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการเปลยนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมใหไดเปนกรด Citric โดยใชเชอ Aspergillus niger A103 พบวา สภาวะทเหมาะสมคอ เมอใชอาหารทมสวนประกอบของสารตงตน น าทงโรงงานสกดน ามนปาลมรอยละ 2 แปงสาล รอยละ 2 กลโคส รอยละ 4 แอมโมเนยมไนเตรท รอยละ 0 ระยะเวลาหมก 5 วน โดยสามารถใหผลตกรด Citric ไดสงสด 5.37 กรมตอลตร

Alam และคณะ (2006) ศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการเปลยนรปน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมใหไดเปน Cellulase โดยใชเชอ Trichoderma harzianum พบวา สภาวะทเหมาะสมทสดคอ อณหภม 30 องศาเซลเซยส ความเขมขนของสารตงตนเทากบรอยละ 2 พเอชเทากบ 4 ใชหวเชอรอยละ 3 และความเรวในการกวน 200 รอบตอนาท โดยภายใตสภาวะดงกลาวสามารถผลตเอนไซมไดประมาณ 14 Filter Paper Unit/ml

Rasdi และคณะ (2009) ศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต Biohydrogen ทใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนสารตงตนโดยหมกรวมกบจลนทรยตามธรรมชาตทพบในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม พบวาสภาวะทเหมาสมตอการผลต คอ ทพเอชเทากบ 5.75 และความเขมขนของสารตงตนเทากบ 80 กรมตอลตร โดยสามารถผลตไฮโดรเจนไดสงสด 272 มลลลตรไฮโดรเจนตอกรมคารโบไฮเดรต และอตราการผลตสงสดเมอพเอชเทากบ 5.98 และและความเขมขนของสารตงตนเทากบ 80 กรมตอลตร โดยสามารถผลตไฮโดรเจนไดสงสด 98 มลลลตรไฮโดรเจนตอชวโมง

7

2) กำรน ำน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมมำใชเปนป ย การประยกตใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนป ยในดนเปนความคดแรกๆท

เกดขนเพอน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไปใชประโยชนแตไมสามารถท าไดเนองจากน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจะท าใหเกดการอดตน ปดกนการซมของน า และน าขง น าไปสสภาวะไรออกซเจน ท าใหเกดปญหากบดน และพชได จงใชวธการสรางระบบสระในแนวระนาบโดยใหมความกวางหนงในสามของระยะหางระหวางแถวปาลม มความลาดชนเลกนอยและตน มน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตลอดเวลา แทนการใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมรดลงไปโดยตรงบนหนาดน เพอลดปรมาณพนททเกดการอดตนจากอนภาคขนาดเลกในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม (Wood et al.,1979)

Agamuthu (1994) ใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนป ยในการปลกหญา เนเปยร (Pennisetum purpureum) สามารถใหผลผลตสงถง 3,276 กโลกรมตอไร ซงมากกวาการปลกทใชมลสตวเปนป ยทไดผลผลตเพยง 2,574 กโลกรมตอไร

Oviasogie และAghimien (2003) ยนยนวาการใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในดนจะชวยปรบปรงความสมบรณของดนใหดขนในดานขององคประกอบในดน เชน ฟอสฟอรส ไนโตรเจน แคลเซยม แมกนเซยม โซเดยม และโพแทสเซยม และอาจชวยเพมอนทรยวตถในดนในรปของฮวมสทเกดหลงจากการยอยสลาย และกลายเปนสวนประกอบของดน ซงจะสงผลใหเกดการเปลยนแปลงคณสมบตทางเคมของดน นอกจากนยงชวยในการเพมประสทธภาพของการผลตโดยท าใหรากของพชแขงแรงดวยการปรบปรงโครงสรางของดนท าใหไดผลต

3) กำรน ำน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมมำใชเปนอำหำรสตว การน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาใชแทนอาหารส าหรบสกร สตวปก และสตว

เคยวเอองก าลงไดรบความนยม นอกเหนอไปจากใบปาลม เสนใยปาลม และกากเนอในเมลดปาลมแลว น าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกมความส าคญอยางยงส าหรบการใชเปนอาหารสตวเคยวเออง (Devendra, 2004)

Hutagalung และคณะ (1977) ศกษาการใชน าทงโงรงงานสกดน ามนปาลมเปนอาหารส าหรบสกร สตรแรกประกอบดวย ตะกอนน าทงรอยละ 35 กากมนส าปะหลงรอยละ 34 กากเนอในเมลดปาลมรอยละ 17 และหญาปนรอยละ 17 สตรทสองประกอบดวย ตะกอนน าทงรอยละ 32 กากมนส าปะหลงรอยละ 32.5 กากเนอในเมลดปาลมรอยละ 17 หญาปนรอยละ 17 ซงอาหารทงสองสตรสามารถใชทดแทนขาวโพดไดรอยละ 50 ท าใหสามารถประหยดคาอาหารสกรได 25 สตางคตอตวตอวน

นอกจากนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมยงสามารถใชเปนอาหารเสรมในการเลยงสตวปก ในการผลตอาหารสตวสามารถใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมแทนขาวโพดไดถง รอยละ 50 ส าหรบอาหารสตวปก ส าหรบอาหารสกรสามารถใชทดแทนขาวโพดไดทงหมด (Ho, 1976) และยงมการน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาระเหยแหงเพอใชเปนอาหารสตว

8

อกดวย โดยระดบทเหมาะสมในการใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมาระเหยแหงในอาหารสตวปกเพอการเจรญเตบโตและการผลตไขอยทรอยละ 10-15 (Yeong and Azizah, 1987)

1.2.4 ขอมลทวไปเกยวกบเหดสมนไพร

1.2.4.1 ลกษณะทำงสณฐำนวทยำของเหด 1) หมวกของดอกเหด จะอยสวนบนสดของดอกเหด สวนใหญจะแผขนานราบไปกบพนดน โดยธรรมชาตจะเกดปละหน ถาสภาพแวดลอมเหมาะสม ไมมอะไรรบกวน ดอกเหดทโตแลวกจะอยในสภาพนน และสามารถเจรญไดอกในปตอๆไป เนอเหดคลายจก ไมกอก แตบางทอาจแขงเหมอนไม ดอกเหดในธรรมชาตเมอผาออกเนอดอกจะแบงเปนสองชน ชนบนจะมสเขมเหมอนเนอไม ชนลางจะเปนทส าหรบสรางสปอรจะมสออนลง 2) รส าหรบสรางสปอร เปนรเลกใตหมวก เมอดอกเหดมขนาดเลกอยบรเวณนจะอดแนนตดอยดวยกน มสแตกตางกนไปตามสายพนธ ขนาดของรจะมองเหนไดชดเมอดอกเหดเจรญเตบโตเตมทพรอมทจะปลอยสปอรออกมา ลกษณะของรหากใชกลองขยายสองด จะมลกษณะเปนรกลมเลกๆ เชอมตดกนม 4-5 รตอมลลเมตร ภายในรจะเปนทสรางสปอรของดอกเหด และจะปลอยออกมาเมอสปอรแกเตมท (อานนท, 2541) 3) สปอร โดยทวไปมสน าตาลขนาด 6-8 x 8.5-12.5 ไมโครเมตร ปลายดานหนงตดตรง ผวเรยบ ผนงหนา 2 ชน (อานนท, 2541) 4) กานดอก มหนาทชสวนของหมวกใหอยสงเหนอพน เปนทางล าเลยงอาหาร เหดหลนจอบางชนดมกานสน บางชนดไมมกาน บางชนดมขนาดบางเรยว บางครงอาจพบกานอยตรงกลางดอกแตไมบอย แตโดยทวไปจะอยเยองไปขางใดขางหนงหรอตดขอบหมวก (สาธต, 2539)

5) ฐานกานดอก เปนจดศนยรวมของเสนใยเหดทมารวมกน เพอทจะสรางดอก เมอมการพฒนาจนกระทงไดทแลว จะเกดเปนตมเลกๆขนแลวชจากพนกลายเปนกานชดอก ลกษณะของฐานเมอดอกเหดแกเตมท สวนฐานจะบานแผเลกนอยเพอยดเหนยวสวนกานใหแขงแรงขน (อานนท, 2541)

6) เสนใย เกดจากการเรยงตวตอกนของเซลลหลายๆเซลลจนเกดเปนเสนใย (Hypha) และเมอเสนใยรวมตวกนเปนกลมเรยกวา ไมซเลยม (Mycelium) เสนใยประกอบดวยผนงเซลล เยอหมเซลล และโพรโทพลาซม การเจรญของเสนใยเกดทางดานใกลปลาย โดยมการยดตวในบรเวณนน เสนใยจะมการแบงตวเวาเขามาในเซลล และเกดผนงกนโดยเยอหมเซลลคอดเขามา เกดเปนผนงไมสมบรณเพราะมรตรงกลางผนงเพอใหโพรโทพลาซมไหลเวยนถงกนได เสนใยสามารถแบงตามลกษณะผนงกนได 3 แบบ คอ เสนใยแบบไมมผนงกน เสนใยแบบมผนงกน และมนวเคลยสอนเดยวในแตละเซลล และเสนใยแบบมผนงกน และมนวเคลยสหลายอนในแตละเซลล (รปท 1.2) (นงลกษณ และปรชา, 2554)

9

รปท 1.2 ลกษณะเสนใยของเชอรา ทมา : นงลกษณ และปรชา, 2554

เสนใยของเหดสามารถแบงตามการเจรญเตบโตไดเปน 3 ระยะ (สาธต, 2539)

6.1) เสนใยเกดใหม จะมผนงกนเซลลบางๆ และแขนเชอมตอเซลล (Clamp connection) ผนงโปรงใส แตกกงกานออกไป เสนผานศนยกลางประมาณ 3.5-4.5 ไมโครเมตร อายจะสนมาก

6.2) เสนใยทแก เกดจากการรวมตวกนของเสนใยทเกดใหม จะมสหมนๆโปรงแสง จนมสน าตาลทอง ไมมผนงเซลล เสนผานศนยกลาง 3-5 ไมโครเมตร จะมกงกานแยกออกไป แตปลายกงกานจะแคบเขา ดเปนปลายแหลมเหมอนแส

6.3) เสนใยทรวมตวกน เปนเนอเยอสวนตางๆของดอกเหด ตรงจดผนงของรพวกนจะไมมส ผนงเซลลจะหนา มกจะโคงงอ มกงกาน และเสนผานศนยกลางทวไปประมาณ 1.5-2 ไมโครเมตร เสนใยตรงแถบหลงหมวกดอกจะเปนเซลลทคอนขางหนา ดานหนาจะมเสนผานศนยกลาง 25-30 ไมโครเมตร มผนงหนามาก อกปลายของเซลลจะคลายแปงตกตะกอนจบอย มเสนผานศนยกลาง 7-11 ไมโครเมตร สวนเสนใยทรวมตวกนเปนเนอทโคนดอกตดกบกานดอก จะมผนงเซลลหนา ไมมผนงกนเซลล เสนผานศนยกลาง 2-3.5 ไมโครเมตร เสนใยบางสวนจะผอมบาง แตกกงกานเหมอนกงไม ผนงเซลลหนา โปรงแสง ไมมผนงก นเซลล เสนผานศนยกลาง 1-1.5 ไมโครเมตร

1.2.4.2 องคประกอบและสำรออกฤทธทพบในเหดสมนไพร องคประกอบทพบในเหดหลนจอเปนสารตางๆทมความส าคญ และจ าเปนตอ

การสรางองคประกอบอนทจ าเปนตอการด ารงชวต โดยในเหดหลนจอจะมองคประกอบของคารโบไฮเดรตรอยละ 26-28 ไขมนรอยละ 5 กากใยรอยละ 59 โปรตนรอยละ 7-8 และเถา รอยละ 1.8 (Mau et. al., 2001) สารอนนทรยชนดอนๆ เชน Al, B, Ca, Cu, Fe, K, Na, Mg,

Septum Nucleus

Septum

10

Mn, Pb, Sn และ Zn และยงมองคประกอบทางอนทรยสารทนาสนใจ ไดแก กรดอนทรยในกลมไตรเทอรพนทส าคญ คอ กรดกาโนเดอรก กรดลซเนดก และกรดกาโนลซดก และสารประกอบเชงซอนหลายชนด เชน ไลโซไซม และโปรตเนส และสารประกอบน าตาลเชงซอน เชน BN3A, BN3B, และ BN3C (ชยนต, 2541)

ในดอกเหดหลนจอมสารประกอบหลายชนดทเปนประโยชนแกรางกายมนษย เชน (1-3)-ß-D-glucans ชวยยบยงการเกดเนองอก aminopolysaccharides ชวยยบยงการเกดเซลลมะเรง และ Ganoderic acid ชวยปองกนเซลลตบ เปนตน (Silva, 2003) (ตารางท 1.3) จงมการศกษาสารออกฤทธทเปนประโยชนแกรางกาย โดยตรวจสอบโครงสรางทางเคมซงสารออกฤทธทเปนประโยชนในปจจบนพบมากกวา 50 ชนด และจ าแนกไดดงน (สรพล และชวลต, 2539)

1) สารไตรเทอรพนอยดชนดขม (Bitter triterpenoid) เปนสารประกอบอนทรยทไมใชไขมนแตมคณสมบตคลายไขมน สารทมรสขมสวนใหญจะอยทดอก และกาน

2) พอลแซคคาไรด (Polysaccharide) เ ปนน าตาลโมเลกลใหญ ซง เ ปนสารประกอบเชงซอนทอาจเกาะตดกบโปรตนหรอสารอนๆ

3) สเตอรอยด (Steroids) มปรมาณอยเพยงเลกนอยแตเปนประโยชนตอรางกาย

4) กลมสารนวคลโอไทด (Nucleotide) มการคนพบสารอะดโนไซด (Adenosine) ในเหดหลนจอ และยงพบสารอารเอนเอ (RNA) ชนดหนงทมคณสมบตคลายอนเตอรเฟยรอน (Interferon- like substance)

5) สารประกอบเยอรมาเนยม (Germanium) เยอรมาเนยมเปนธาตแขงพบในโสมทวไป ในกระเทยม และพบมากในเหดหลนจอ

ซงสารออกฤทธทกลาวถงขางตนสามารถพบไดในเหดสมนไพรหลายชนดและสามารถน าไปใชประโยชนทางการแพทยไดหลากหลาย เชน เหดหลนจอเปนเหดสมนไพรทใชกนอยางแพรหลายในประเทศจนและญป นมานานแลวเพอรกษาโรคนานาชนดรวมทงโรคมะเรง สารส าคญทพบในเหดหลนจอ ไดแก Steroids, Lactones, Alkaloids, Polysaccharides และ Triterpenes ซงสารทเกยวกบเภสชวทยาทส าคญคอสารโพลแซคคาไรดทละลายไดในน า Goa และคณะ(2005)ไดศกษาคณสมบตของสารโพลแซคคาไรดทสกดดวยน าจากเหดหลนเจอ (Ganopoly) ตอการยบยงเซลลมะเรงของผปวยจ านวน 47 คนโดยใหสาร Ganopoly 54 กรมตอวน เปนเวลา 12 สปดาห พบวาผปวย 41 คน มปรมาณ Cluster determinant (CD)3, CD4, CD8 และCD5 เพมขน และในน าเหลองพบวาม Interleukin (IL)-2, IL-6 และ Interferon (IFN)- , Natural killer cells (NK) เพมขนดวยเชนกน สวนปรมาณของ IL-1 และ Tumor necrosis factor (TNF) จะลดลงจากผลการทดลองชใหเหนวา Ganopoly มผลตอการชวยเพมระดบภมคมกนของรางกาย (Immunomudolating) ซงภมคมกนนจะชวยใหรางกายสามารถยบยงการ

11

เจรญของเซลลมะเรงได นอกจากนในเหดหลนจอยงมสาร Triterpens ไมต ากวา 100 ชนด เปนสารทละลายไดในแอลกอฮอล จดอยในกลมของ Lanostane-type tripenoids เชน Ganoderic, Ganodernic, Lucidenic และ Ganolucidic acid และสารดงกลาวไดมการพสจนแลวว ามประสทธภาพสงในการรวมตวกบออกซเจน ซงคณสมบตเดนของสาร Triterpens เหลานคอ ปองกนและรกษาโรคความดนโลหตสง (Anti-hypertensive) ไดดพอๆกนกบคณสมบตในการปองกนและยบยงการเปนโรคภมแพ (Anti-allergic)

เหดแครงมชอวทยาศาสตรวา Schizophyllum commune Fr. มชอทองถนหลากหลายชอดวยกนเชน เหดตนตกแก เหดจก เหดยาง(ภาคใต) เหดแกน เหดตามอม (ภาคเหนอ) และเหดมะมวง(ภาคกลาง) เหดแครงเปนเหดทขนอยทวโลกและมตลอดป พบขนอยบนวสดหลากหลายชนดเชน ทอนไม กงไม และใบไมผ ในภาคใตพบมากบนทอนไมยางพารา ในเหดแครง 100 กรมจะมธาตเหลกสงถงประมาณ 280 มลลกรม ฟอสฟอรส 646 มลลกรม แคลเซยม 90 มลลกรม ไขมนรอยละ 0.5 และโปรตนรอยละ 17 (อนงค จนทรศรกล , 2546) นอกจากนยงพบวาเหดแครงมกรดอะมโนทจ าเปนตอรางกายหลายชนดเชน ซสตน (Cystine) กลตามน(Glutamine) และยงมสารโพลแซคคาไรดทส าคญไดแกกลแคนทชอวา Schizophyllan เปนจ านวนมาก (Manzi and Pizzoferrato, 2000; Kidd, 2000; Suwanno,2007, Sletmoen, et al., 2009 ) (Halpern and Miller, 2002 ; Wasser, 2002 ; Babitskaya, et al., 2003 ; Dada and Ezeronye, 2003 ; Goa, et al., 2005 ; Liu and Zhang, 2005 ; Yang and Zhang, 2009)

ปกตแลวเหดสมนไพรพบไดนอยในธรรมชาตและบางครงอาจมการปนเปอนจากสารเคมหรอจลนทรยตามธรรมชาต นอกจากนนเหดสมนไพรยงมอายการเกบเกยวนานกวาทจะตดดอกมาสกดเอาสารออกฤทธทางยา แตเนองจากความตองการสารสกดจากเหดสมนไพรมสง ดงนนจงมงานวจยทศกษาเทคนคการเพาะเลยงเสนใยเหดในอาหารเหลวเพอลดระยะเวลาในการผลตและควบคมการปนเปอนจากสารเคมและเชอจลนทรย Wagner และคณะ (2003) ไดอธบายถงเทคนคทใชในการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอวาสวนใหญใชวธการเพาะเลยงในอาหารเหลว (Submerged culture) เพอผลตสาร Polysaccharides และ Ganoderic acid โดยควบคมปจจยสภาพแวดลอมทจ าเปนตอการเจรญเชนอณหภม ปรมาณออกซเจนทละลายได และคาพเอชของสารอาหาร นอกจากนยงมงานวจยทศกษาแหลงอาหารอนเพอเพมปรมาณสารโพลแซคคาไรดแทนสตรอาหารสงเคราะหเดมทใชอย Babitskaya และคณะ (2003) ศกษาวธการผลต Biomass, Endo และ Exo-polysaccharides จากเหดหลนจอในสตรอาหารทมปรมาณแหลงสารคารบอนทระดบตางๆพบวา Endo และ Exo-polysaccharides ทผลตจากเสนใยเหดทเลยงในอาหาร Beer wort มระดบเพมมากขนกวาการเลยงในอาหาร Glucose-peptone สวนLactose, Starch, Cellulose, Glucose และ Xylose จดเปนแหลงอาหารทดส าหรบการผลต Biomass และ Eno-polysaccharides

12

Xiao และคณะ (2004) ศกษาสตรอาหารเหลวทเหมาะสมในการผลตเสนใยและสารโพลแซคคา-ไรดจากเหด Cordycep pruinusa พบวา สตรอาหารจะประกอบไปดวย potato starch รอยละ 2, sucroseรอยละ 2.5, soybean รอยละ 0.5, beef extract รอยละ0.5, yeast extract รอยละ 1, KCl รอยละ0.02, K2HPO4 รอยละ 0.1 และ MgSO4 . 7 H2O รอยละ0.05 โดยปรบพเอชของอาหารเลยงเชอเทากบ 7 ใชปรมาณเชอเรมตนรอยละ 5 เลยงในฟลาสกขนาด 250 มลลลตรทบรรจอาหารเหลว 50 มลลลตรและใสเมดลกปด (bead) จ านวน 15 เมดเพอชวยเพมประสทธภาพการกระจายตวของเซลล และการละลายไดของออกซเจน โดยท าการเลยงเชอ เปนเวลา 12 วน พบวาไดปรมาณมวลเซลล และสารโพลแซคคาไรด เทากบ 31.5 และ 4.2 กรมตอลตร ตามล าดบ

Kim และ คณะ (2005) ทดลองผลตชวมวลและสาร Exo-polysaccharides จากเหด Agrocybe cylindracea ในอาหารเหลวพบวาองคประกอบสารอาหารทเหมาะตอการผลตเสนใยประกอบดวย Maltose 80 กรมตอลตร, Martone A-1 6 กรมตอลตร, MgSO4 .7H2O 1.4 กรมตอลตร และ CaCl2 1.1 กรมตอลตร พเอชเรมตนเทากบ 4 แตองคประกอบของสารอาหารทเหมาะสมตอการผลต Exo-polysaccharides ประกอบดวย Maltose 60 กรมตอลตร, Martone A-1 6 กรมตอลตร, MgSO4 .7H2O 0.9 กรมตอลตร และ CaCl2 1.1 กรมตอลตร พเอชเรมตนเทากบ 6 โดยท าการเพาะเลยงบนเครองเขยาทความเรวรอบ 150 รอบตอนาท อณหภม 25 องศาเซลเซยส จะไดมวลเซลลสงสด 11.64 กรมตอลตร ทระยะเวลาการเลยงเซลล 9 วน สวนปรมาณ Exo-polysaccharides สงสดเทากบ 3 กรมตอลตร ทระยะเวลาการเลยงเซลล 10วน แตเมอทดลองขยายขนาดการเพาะเลยงเซลลดวยถงหมกขนาด 5 ลตร กลบพบวาองคประกอบของสารอาหารทเหมาะสม ประกอบดวย glucose 20 กรมตอลตร, KH2PO4 0.46 กรมตอลตร, K2HPO4 1 กรมตอลตร, MgSO4 .7H2O 0.5 กรมตอลตร, meat peptone 2 กรมตอลตร และ ยสตสกด 2 กรมตอลตร พเอชเรมตนเทากบ 5 จะไดปรมาณมวลเซลลสงสด 9.06 กรมตอลตร และไดปรมาณสาร Exo-polysaccharides สงสด 1.24 กรมตอลตร ทระยะเวลาการเลยงเซลล 9 วน

Cho และคณะ (2006) ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการผลตชวมวลและ Exo-polysaccharides จากเหด Tremella Funciformis ในถงหมกขนาด 5 ลตร พบวาสตรอาหารทเหมาะสมในการเพาะเลยงเชอประกอบดวย glucose 20 กรมตอลตร, tryptone 2 กรมตอลตร, KH2PO4 0.46 กรมตอลตร, K2HPO4 1 กรมตอลตร และ MgSO4 .7H2O 0.5 กรมตอลตร พเอชเรมตนเทากบ 8 ปรบความเรวของการหมนใบพดท 200 รอบตอนาท ใหอากาศท 2 vvm และควบคมอณหภมของน าหมกท 28 องศาเซลเซยส จะไดมวลเซลลของเหด Tremella Funciformis เทากบ 10 กรมตอลตร และปรมาณ Exo-polysaccharides เทากบ 2.28 กรมตอลตร ทระยะเวลาการเลยงเชอ 5 วน

Amano และคณะ (2007) ศกษาปจจยทางกายภาพตอการเจรญของเสนใยเหดหลนจอและการผลตสาร ß-1,3-glucan ในอาหารเหลวทสภาวะการเลยงแบบนง (static culture)

13

ในอาหาร MYS พบวาอณหภมทเหมาะสมส าหรบการเพาะเลยงเสนใยเทากบ 25 องศาเซลเซยส เลยงในสภาวะมดจะไดปรมาณมวลเซลลสงสด 5.8 กรมตอลตร และปรมาณ -1,3-glucan ทงหมดทงทสกดดวยน ารอนและสารละลายดางเทากบ 0.2 กรมตอกรมเซลลแหง

Pokhrel และ Ohga (2007) ศกษาปจจยทมผลตอการผลตเสนใยและสารโพลแซคคาไรดจากเหด Lyophyyllum decastes ส าหรบการเพาะเลยงในอาหารเหลวพบวาแหลงคารบอนทมผลตอการผลตเสนใยไดสงสดคอ น าตาลแลคโตส กลโคส และ ฟรคโตส โดยใหปรมาณมวลเซลลเทากบ 6.73, 6.36 และ 6.10 กรมตอลตร ตามล าดบ ส าหรบการผลตสารโพลแซคคาไรดทงชนดทผลตอยนอกเซลล และชนดทผลตอยในเซลล พบวาน าตาลกลโคสใหประสทธภาพสงสด เทากบ 1.65 กรมตอลตรและ 317 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ สวนแหลงไนโตรเจนพบวา ยสตสกดใหประสทธภาพสงสดส าหรบการผลตมวลเซลลและโพลแซคคาไรดชนดทผลตอยในเซลลใหผลผลตเทากบ 7.03 กรมตอลตร และ 325 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ และพเอชของสารอาหารเรมตนท 7 และ 8 ใหประสทธภาพสงสดในการสกดสารโพลแซคคาไรดทงชนดทผลตอยนอกเซลลและชนดทผลตอยในเซลล ปรมาณมวลเซลลทได เทากบ 1.73 กรมตอลตร 320 มลลกรมตอลตร และ 7.1 กรมตอลตร ตามล าดบ ทระยะเวลาการเลยงเซลล 10 วน บนเครองเขยา 125 รอบตอนาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส

Hao และคณะ (2010) ศกษาปจจยทเหมาะสมตอการเจรญเตบโตของเสนใยและการผลตสาร Exo-polysaccharides จากเหดแครง (Schizophyllum commune) พบวา องคประกอบของสารอาหารทส าคญและมผลตอการการเจรญของเสนใยและการสรางผลตภณฑ ได แ ก Sodium carboxymethycellulas, L-glutamic acid, vitamin B1 , naphthalene acetic acid, oleic acid และTween 80 เมอใชสารอาหารดงกลาวในการเพาะเลยงเสนใยเหดบนเครองเขยาทความเรว 150 รอบตอนาท ทอณหภม 26 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 วน จะไดปรมาณเสนใยเหด 25.93 กรมตอลตร และไดสาร Exo-polysaccharides 2.79 กรมตอลตร ตามล าดบ

1.2.4.3 กำรเพำะเลยงเหดสมนไพร เหดสมนไพรทพบในธรรมชาตนนโอกาสทจะพบเหดในสภาพสมบรณเหมาะกบ

การใชท าเปนยาคอนขางนอย เนองจากมกจะปนเปอนจากสภาพแวดลอมทเหดอาศยอย ดงนนการเพาะเลยงเหดสมนไพรจงเปนสงทจ าเปน (สาธต, 2539) ซงในปจจบนทวโลกไดมการเพาะเลยงเหดสมนไพรโดยใชวธการดงตอไปน เชน การเพาะบนทอนไม การเพาะในขวดหรอถงพลาสตก และการเพาะเลยงในอาหารเหลว เปนตน (Perumal et al., 2009)

1) กำรเพำะเลยงเหดหลนจอบนทอนไม ในระยะเวลาหลายปทผานมา มการศกษาจ านวนมากทพยายามหาวธทดทสดท

จะท าใหเหดมคณภาพมากขน ซงวธทดทสดทจะไดเหดหลนจอคณภาพดคอการเพาะเลยงบนทอนไม แตการเพาะเลยงบนทอนไมมขอจ ากดจากความหลากหลายของชนดไมทไมแนนอน

14

และทอนไมบางทอนตองแปรรปกอน และทอนไมยงมราคาแพงอกดวย นอกจากนยงตองการระยะเวลาทใชในการเพาะเลยงนานประมาณ 5-12 เดอน ถงจะเกบดอกเหดได (Perumal et al., 2009) เชน การเพาะเลยงเหดหอม เหดหลนจอ และเหดแครง เปนตน

ตวอยางเชนการเพาะเหดหลนจอบนทอนไมนยมท ากนในประเทศจน และญป น ไมทนยมน ามาเพาะเหดหลนจอเปนไมจ าพวกไมเนอแขงทมใบกวาง เชน ตนเชอรปา ไมทเหมาะสมควรมเสนผานศนยกลางประมาณ 8-15 เซนตเมตร โดยตดใหมความยาวประมาณ 1-1.5 เมตร ท าการเจาะรใหระยะหางระหวางรประมาณ 8-10 เซนตเมตร และระหวางแถวหาง 6-8 เซนตเมตร ใสเชอทเตรยมไวในรปดขผ งหรอจกพลาสตก ตอจากนนจงน าทอนไมเหลานกองไวในทรมลมไมโกรกประมาณ 1 เดอน เพอใหเสนใยเจรญเขาไปในเนอไม ทอนไมทมเสนใยเหดเจรญเตมแลวอาจน าเขาโรงเรอนแลวรดน าไดเลย จนกระทงเหดออกดอกเหมอนกบการเพาะเหดชนดอนๆบนตนไม หรออาจน าทอนไมไปฝงดน เปนวธการทนยมในประเทศจน วธการคอ ขดหลมกวางประมาณ 4-5 เมตร ลกประมาณ 2-3 นว จากนนวางทอนไมลงไปหางกนประมาณ 1 นว จากนนกลบดวยดนหนาประมาณ 1 นว หลงจากกลบดนแลวจงท าซมสงประมาณ 1 เมตร คลมดวยพลาสตก พนน าวนละ 1-2 ครงใหดนชนอยเสมอ รอจนกระทงมเหดเจรญขนเหนอดน (วสนณ, 2536)

2) กำรเพำะเลยงเหดในขวดหรอถงพลำสตก การเพาะเลยงเหดในขวดหรอถงพลาสตก ม 3 ขนตอนไดแก การผลตเชอใน

อาหารแขง การผลตเชอขยายจากเมลดธญพช และการผลตเชอเพาะ (กอนเชอ) (ลอชา และคณะ, 2553) ดงตอไปน

2.1) การผลตเชอในอาหารแขง เปนการเพาะเลยงเชอเหดโดยการแยกเชอเหดบรสทธดวยวธการเพาะเลยงเนอเยอหรอเพาะเลยงสปอรดอกเหดในอาหารแขง เชอเหดจะเจรญออกมาสามารถมองเหนไดดวยตาเปลา มลกษณะเปนเสนใยสขาว การผลตเชอในอาหารแขงเปนงานเรมตน และส าคญมากของการเพาะเลยงเหด เปนขนตอนทอาศยเทคนคทางจลชววทยา ซงประกอบดวย 3 ขนตอนคอ การเตรยมอาหารแขง การเตรยมดอกเหด และการแยกเนอเยอจากดอกเหดมาเลยงบนอาหารแขง

2.2) การผลตเชอขยายจากเมลดธญพช เชอเหดถอวาเปนหวใจทส าคญทสดในการเพาะเลยงเหด เพราะถาหากเชอเหดมคณภาพไมด ไมวาจะเปนสายพนธ อาหารเพาะเลยง อายเชอเหด เปนตน แมวาจะมวธการเพาะเลยงดอยางไร กไมสามารถท าใหไดรบผลผลตสงได ดงนนสงทตองระมดระวงเปนพเศษในการผลตเชอเหดคอ การปนเปอนเชอจลนทรย การผลตเชอขยายเปนขนตอนทตอเนองจากการผลตเชอในอาหารแขง และเปนการเพมปรมาณเชอเหดบรสทธใหมมากขน โดยการน าเสนใยของเชอเหดทเลยงบนอาหารแขงมาขยายเลยงในเมลดธญพชทไดผานการนงฆาเชอแลว เพอใหไดเชอเหดทพรอมจะปรบตวเขากบสภาพแวดลอม

15

เมลดธญพชทสามารถน ามาใชผลตเชอขยายเหดมหลายชนด เชน ขางฟาง ขาวโพด ขาวเปลอก เปนตน

2.3) การผลตกอนเชอเหด ใชวสดทเปนเศษพชมาเพาะ โดยน ามาใสขวดหรอถงพลาสตกอดใหเปนกอน ซงเหดเกอบทกชนดสามารถเพาะเลยงใหเกดดอกเหดไดจากกอนเชอทไดจากขเลอย

Veena และ Pandey (2011) ศกษาการน าฟางขาวมาใชเปนวสดเพาะเลยงเหดหลนจอ โดยทดลองน าฟางขาวผสมกบขเลอยรอยละ 0,22.5,45 และ 67.5 และร ารอยละ 10 จากการทดลอง สตรอาหารในแตละสตรจะใหผลไมตางกนทงดานระยะเวลาการผลตดอกเหด ความชน ผลผลตและลกษณะดอกเหด โดยสตรทใหผลผลตสงสดคอทอตราสวนของ ขเลอย :ฟางขาว:ร า เทากบ 22.5:67.5:10 โดยมคา Biological efficiency (BE) เทากบ รอยละ 29.9 รองลงมาคอทอตราสวนของ ขเลอย :ฟางขาว :ร า เทากบ 45:45:10 โดยมคา Biological efficiency (BE) เทากบรอยละ 27.3

3) กำรเพำะเลยงในอำหำรเหลว ขอไดเปรยบของการเพาะเลยงในอาหารเหลวคอ เสนใยทผลตไดจะใช

ระยะเวลาในการเพาะเลยงนอยกวา เพยงระยะเวลา2-3 สปดาห กสามารถน าเสนใยทผลตไดมาสกดกรดกาโนเดอรก และสารพอลแซคคาไรดได ในขณะทการเพาะเลยงแบบดงเดม ตองใชเวลาอยางนอย 3-5 เดอนในการผลตดอกเหด (Tang and Zhong, 2002) และสารพอลแซคคาไรดทผลตไดจากเสนใยจะมประสทธภาพมากกวาทผลตไดจากดอกเหด (Lee et al., 2007) แตปรมาณสารพอลแซคคาไรดทสกดไดนนในปรมาณน าหนกตวอยางทเทากนการสกดจากสวนดอกเหดจะไดปรมาณสารพอลแซคคาไรดมากกวาเมอเปรยบเทยบกบปรมาณทไดจากเสนใย (Heleno et al., 2012) ขนตอนในการเพาะเลยงเหดหลนจอในอาหารเหลวม 2 ขนตอนคอ การเลยงบนอาหารแขงและการเลยงในอาหารเหลว การเลยงบนอาหารแขงเปนการเกบรกษาเชอโดยท าการเลยงเชอบนอาหารพดเอทมสวนผสมของ Malt extract รอยละ 1 Yeast extract รอยละ 4 D-glucose รอยละ 0.4 และ Agar รอยละ 2 เลยงในตบมเปนเวลา 7 วน ทอณหภม 24-30 องศาเซลเซยส แลวน าไปเกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส หลงจากนนน าเชอทเลยงบนอาหารแขงครบ 7 วน มาตดเปน 5 ชน ขนาดชนละประมาณ 1 ตารางเซนตเมตร แลวใสลงในอาหารเหลวทผานการฆาเชอแลว 100 มลลลตร น าไปเลยงบนเครองเขยาทความเรว 100 รอบตอนาท ทอณหภม 24 องศาเซลเซยส (Berovic et al., 2003)

ในการเลอกใชชนดของอาหารในการเพาะเลยงนนมผลตอการเจรญเตบโตของเชอราโดยสตรอาหารทใชมนเทศ (Sweet potato) แทนอาหารส าเรจรปพดเอ (Potato dextrose agar)เชอราทเพาะเลยงจะมการเจรญเตบโตของเสนใยไดดกวา (Amadi and Moneke, 2012) ซงในมนเทศนนมสวนประกอบของน าตาลหลายชนด เชน ซโครส กลโคลส ฟรกโตส และมอลโตส (Chapman and Horvat, 1989) และจากการดดแปลงสตรอาหารเลยงเชอราของ Aoki และ

16

Jongjeen (2009) โดยใชอาหารสตรมนเทศผสมมนส าปะหลงในอตราสวน 1:1 พบวาเชอรามการเจรญเตบโตไมแตกตางกบอาหารมนฝรง

Lee และคณะ (2002) ท าการเพาะเลยงเหดหลนจอโดยใชหางเนยเปนอาหารเพาะเลยงพบวา การเพาะเลยงทอาหารมพเอชเทากบ 4.2 และอณหภม 28.3 องศาเซลเซยส จะใหสารพอลแซคคาไรดสงสดท 1.2 กรมตอลตร

4) ปจจยทมผลตอกำรเพำะเลยงในอำหำรเหลว 4.1) อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเปนคาท

บอกความยากงายในการยอยสลาย อาหารทมอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนสงมากจะมอตราการยอยสลายต า เนองจากความไมสมดลของปรมาณคารบอนตอไนโตรเจน โดยจลนทรยจะยอยสลายสารอนทรย เพอน าคารบอนไปเปนแหลงพลงงาน และน าไนโตรเจนไปใชในการสงเคราะหโปรตน (Sharma et al., 1997) Yuan และคณะ (2012) ศกษาการเพาะเลยงเหดหลนจอภายใตสภาวะทเหมาะสมเพอผลตเอกโซพอลแซคคาไรด โดยเลยงในฟลาสกขนาด 250 มลลลตร ทมอาหาร 100 มลลลตร เลยงในทมด บนเครองเขยาท 150 รอบตอนาท ทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 วน พบวา สภาวะทเหมาะสมทท าใหไดเอกโซพอลแซคคาไรดสงสดท 1.723 กรมตอลตร เมออาหารทใชมสวนประกอบของ กลโคลส 70 กรมตอลตร อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 10 ความเขมขนของ KH2PO4 เทากบ 2.5 กรมตอลตร และความเขมขนของ MgSO4 เทากบ 0.75 กรมตอลตร และสภาวะทเหมาะสมทสดทท าใหเสนใยเจรญเตบโตไดสงสดท 7.235 กรมตอลตร เมออาหารทใชมสวนประกอบของ กลโคลส 50 กรมตอลตร อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 25 ความเขมขนของ KH2PO4 เทากบ 1.5 กรมตอลตร และความเขมขนของ MgSO4 เทากบ 0.5 กรมตอลตร

4.2) การกวน และการเตมอากาศ อตราการกวนทเหมาะสมจะแสดงถงสมดลระหวางการถายโอนออกซเจนลงในอาหาร และความเคนเฉอน (Shear stress) เมอเพมความเรวในการกวนอตราการถายโอนออกซเจนและความเคนเฉอนกจะเพมขนดวย จากการทดลองของ Yang และ Liu (1998) โดยใชอตราการกวนท 50-250 รอบตอนาทกบขวดรปชมพ พบวา ความหนาแนนของชวมวลสงสดเมอความเรวการกวนเทากบ 100 รอบตอนาท แตปรมาณเอกโซพอลแซคคาไรด จะสงสดเมอความเรวการกวนเทากบ 150 รอบตอนาท แสดงใหเหนวาการเขยาทความเรวสงจะสนบสนนใหเกดผลตเอกโซพอลแซคคาไรด เนองจากเปนการลดการดดซบเอกโซพอลแซคคาไรด ทถกหลงออกมาบนผนงเซลล ท าใหไปกระตนการสงเคราะหเอกโซพอลแซคคาไรดเพมขน แมจะใชอตราการเขยาทคงทตลอดการหมกแตความหนดอาจเพมขนซงเปนผลมาจากความเขมขนของชวมวล และเอกโซพอลแซคคาไรดทเพมขน อาจท าใหตองมการเพมความเรวในการกวน

นอกจากน Fang และ Zhong (2002) ท าการศกษาเกยวกบความเขมขนของออกซเจนทละลายน าไดพบวา การผลตเอกโซพอลแซคคาไรดท Dissolved oxygen tension

17

(DOT) เทากบรอยละ 10 จะสงกวาท DOT เทากบรอยละ 25 และปรมาณของ เอนโดพอลแซคคาไรด และกรดกาโนเดอกรกในชวมวลกสงกวาดวยท DOT เทากบรอยละ 10

4.3) พเอชเรมตน การทดลองมกไมไดมการควบคมพเอชตลอดเวลา สวนใหญเปนการควบคมพเอชเรมตนทมผลตอการเจรญเตบโต และการผลตสารตางๆ จากการศกษาของ Fang และ Zhong (2002) พบวา หลงจากวนทส คาโปรไฟลของพเอชจะไดเหมอนกนแมวาจะใชคาพเอชเรมตนตางกนตงแต 3.5-7.0 โดยในชวงสวนแรกคาพเอชจะลดลงเปน 3.2 และคงทอยเปนเวลาหนงอาทตย หลงจากนน ประมาณวนท 10-14 เมอกลโคสใกลจะหมด เซลลจงไมสามารถผลตชวมวล และกรดกาโนเดอรกตอไปได ท าใหคาพเอชจะเพมขนอยางรวดเรวเปน 7 ในวนทายๆของการเพาะเลยง ผลผลตของชวมวลจะไดสงสดเมอคาพเอชเรมตนเทากบ 6.5 โดยจะไดชวมวล 17.3 กรมตอลตรโดยน าหนกแหง ผลผลตของกรดกาโนเดอรก ไดสงสดเมอคาพเอชเทากบ 6.5 โดยจะไดกรดกาโนเดอรก 1.2 มลลกรมตอ 100 มลลกรมน าหนกแหง สวนเอนโดพอลแซคคาไรด และเอกโซพอลแซคคาไรด จะไดผลผลตสงสดในชวงของคาพเอช 5.5-7.0 และ 3.5-4.5 ตามล าดบ

4.4) ความเขมขนของปรมาณน าตาลเรมตน การลดลงของอตราการเจรญเตบโตเฉลยของเหดหลนจอจะลดลงตามความเขมขนของกลโคสเรมตนทเพมขนมากกวา 35 กรมตอลตรและท าใหความดนออสโมตกในอาหารเพมขนดวย ซงแสดงใหเหนวาการเจรญเตบโตจะมประสทธภาพนอยเมอความเขมขนของน าตาลสง และความเขมขนของน าตาลเรมตนยงมผลตอขนาดของ Pellet ดวย ผลของความเขมขนน าตาลเรมตนตอการกระจายขนาด Pellet ทเลยงในอาหารเปนเวลา 8 วนพบวา ขนาดเสนผานศนยกลางของ Pellet จะเลกกวา 1.2 มลลเมตร ทความเขมขนของกลโคสเรมตนเทากบ 50 และ 65 กรมตอลตร ในขณะทขนาดเสนผานศนยกลางของ Pellet จะใหญกวา 1.6 มลลเมตร ทความเขมขนของกลโคสเรมตนเทากบ 20 กรมตอลตร (Fang and Zhong, 2002)

4.5) อณหภม อณหภมทใชในการเพาะเลยงเหดหลนจอมตงแต 25-35 องศาเซลเซยส โดยทใชมากทสดจะอยท 30 องศาเซลเซยส ในการผลตสารพอลแซคคาไรด และอตราเจรญเตบโตของเสนใย อณหภมทเหมาะสมอยท 30 และ 35 องศาเซลเซยส (Fang and Zhong, 2002) ทระดบอณหภม 25 องศาเซลเซยส จะไดผลผลตของเอกโซพอลแซคคาไรดสง สวนการผลต เอนโดพอลแซคคาไรดตองการอณหภมระดบต า 10-15 องศาเซลเซยส (Lee et al., 2007)

4.6) ความหนาแนนของเชอเรมตน ความหนาแนนของเชอมผลตอกระบวนการหมก และความหนาแนนของชวมวลสดทาย โดยทความหนาแนนของเชอเทากบ 70-670 มลลกรมตอลตร จะอยในระยะแลกเฟส 1 วน ในขณะทความหนาแนนของเชอเทากบ 5 มลลกรมตอลตร จะอยในระยะแลกเฟส 4 วน ในสวนของความหนาแนนของชวมวลสดทายจะเพมขนจาก 13.6 กรมตอลตรทความหนาแนนของเชอเทากบ 70 มลลกรมตอลตร เปน 15.7 กรมตอลตรทความหนาแนนของเชอเทากบ 330 มลลกรมตอลตร และจะลดลงเหลอ 14.2 กรม

18

ตอลตรทความหนาแนนของเชอเทากบ 670 มลลกรมตอลตร นอกจากนความหนาแนนของเชอยงมผลตอการกระจายขนาดของ Pellet โดยในวนท 8 ของการหมก ทความหนาแนนของเชอเทากบ 670 มลลกรมตอลตร รอยละ 68.3 ของขนาด Pellet จะมเสนผานศนยกลางเลกกวา 1.2 มลลเมตร และทความหนาแนนของเชอเทากบ 70 มลลกรมตอลตร รอยละ 91.0 ของขนาด Pellet จะมเสนผานศนยกลางใหญกวา 1.6 มลลเมตร ผลของความหนาแนนเชอตอการกระจายขนาดของ Pellet จะสงผลตอการสรางผลผลต ปรมาณเอนโดพอลแซคคาไรดจะสงกวาใน Pellet ขนาดเลก ในขณะทปรมาณของกรดกาโนเดอรกจะสงกวาใน Pellet ขนาดใหญ ซงปรมาณกรดกาโนเดอรกในชวมวลจะสงขนเมอความหนาแนนของเชอเปน 70 มลลกรมตอลตร เนองจากทความหนาแนนนจะท าใหเกด Pellet ขนาดใหญ แมวาปรมาณของกรดกาโนเดอรกในชวมวลจะสงขน แตผลผลตรวมของกรดกาโนเดอรก จะดกวาเมอความหนาแนนของเชอเปน 170 มลลกรมตอลตร เนองจากมความหนาแนนของชวมวลสงขน (Fang et al., 1999)

4.7) สารยบยงการเกดฟอง ในการเพาะเลยงเหดดวยอาหารเหลวอาจเกดฟองขนไดจากการหมกของอาหาร โดยฟองทเกดขนอาจรบกวนการควบคมสภาวะของการหมกและอาจท าใหเกบเกยวผลผลตไดยากขน บางครงจงตองมการใชสารตานการเกดฟอง น ามนพชหลายชนดสามารถใชเปนสารตานการเกดฟองได และอาจเปนประโยชนตอการเจรญเตบโตของเหดอกดวย ผลจากการใชน ามนถวเหลอง น ามนถวลสง น ามนดอกค าฝอย น ามนขาวโพด น ามนทานตะวนและน ามนมะกอก ใสลงในอาหารเหลวประมาณ รอยละ 1 พบวา น ามนมะกอกชวยกระตนการเจรญเตบโตท าใหไดความหนาแนนของชวมวลสงสด ในทางกลบกนน ามนดอกค าฝอยท าใหไดปรมาณเอกโซพอลแซคคาไรดสงสด ขอดของการใชน ามนจากพชเปนสารตานการเกดฟองคอมตนทนต าและยงชวยกระตนการเจรญเตบโตและเพมผลผลตอกดวย อยางไรกตาม องคประกอบของน ามนพชจะแตกตางกนไปขนอยกบแหลงก าเนดและการปลก ความแตกตางเลกนอยดานองคประกอบของกรดไขมนอาจมผลตอการเจรญเตบโตของชวมวลระหวางการหมกได โดยผลของกรดโอเลอก ท าใหไดความหนาแนนชวมวลสงสด ตามมาดวย กรดปาลมตก และกรดสเตยรก ในชวงทายของการเพาะเลยงสวนใหญจะกระตนการผลตเอกโซพอลแซคคาไรดดวยการเตมกรดปาลมตกตามดวยกรดโอเลอก และกรดสเตยรก ทความเขมขนต ากวารอยละ 0.1 ลงไป กรดลโนเลอก จะยบยงการผลตเอกโซพอลแซคคาไรด เชนเดยวกบกรดสเตยรก ทความเขมขนสงกวา 0.1 ผลการตอบสนองตอกรดไขมนอาจแตกตางกนตามลกษณะทางสณฐานวทยาของเหด (Fang and Zhong, 2002; Yang et al., 2000)

4.8) สณฐานวทยาของเหด กระบวนการเมตาบอลซมของเหดมความสมพนธกบลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดเอง โดยในการเลยงทมการเขยา เหดจะเจรญเตบโตในลกษณะเปนPellet ซงการผลตสารตางๆจะมความสมพนธกบขนาดของขนาด Pellet เชน ผลผลตของกรดกาโนเดอรก ใน Pellet ทมขนาดใหญกวาปกตจะมผลตอการแพรของออกซเจนเนองจากขอจ ากดของออกซเจนในศนยกลางของ Pellet จะมผลตอการกระตนการผลตกรดกาโนเดอรกจากเซลลบรเวณนน ในขณะทความเขมขนของเอนโดพอลแซคคาไรดจะมความเขมขน

19

นอยกวา Pellet ทมขนาดใหญ ขนาดของ Pellet เปนผลมาจากตวแปรหลายๆอยางๆ เชน ความเขมขนของน าตาลในอาหาร การกวน และความหนาแนนของเชอ (Fang and Zhong, 2002) 4.9) แรธาต เปนสารอาหารทเหดตองการในปรมาณนอยแตขาดไมได แรธาตจะมผลตอการเจรญของเหดท าใหเหดเจรญไดตามปกต โดยเกยวของกบการท างานของเอนไซม ซงจะมผลตอผลตภณฑทเหดผลตได จากงานวจยของ Cui และ Zhang (2011) พบวา ความเขมขนของ Zn2+ และ Fe2+ ทเตมลงในอาหารมผลตอขนาดของ Pellet โดยเมอความเขมขนเพมขนขนาดของ Pellet จะมขนาดใหญขนดวย นอกจากนจากรายงานวจยของ Kim และคณะ (2005) พบวา Ca2+ มผลตอกจกรรมของเอนไซม ซงเกยวของกบการขยายตวของผนงเซลล และความสามารถในการแทรกซมของสารทเยอหมเซลล สวน Mg2+ เปนแรธาตทท าหนาทเปน Cofactor ในปฏกรยาทเกยวของกบเอนไซม นอกจากนยงชวยรกษาสมดลของเยอหมเซลล

1.2.5 สำรพอลแซคคำไรด และ ß-1,3-glucan

1.2.5.1 สำรพอลแซคคำไรด พอลแซคคาไรดเปนโพลเมอรทมสารกลมคารโบไฮเดรตเปนองคประกอบหลก

เกดจากโมโนแซคคาไรดตงแต 10 โมเลกลขนไปจนถง 1,000 โมเลกลมาเชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดก (รปท 1.3) พอลแซคคาไรดในธรรมชาตสวนใหญไมมส ไมมรส เมอละลายน าจะไดสารละลายคอลลอยด พอลแซคคาไรดเรยกอกอยางหนงวา ไกลแคน (Glycan) หมายถง สายแซคคาไรด ซงจะมความแตกตางกนตามชนดของโมโนแซคคาไรดทมาประกอบ ความยาวของสาย ชนดของพนธะทใชเชอม และระดบของกงกานสาขา ประเภทของพอลแซคคาไรด สามารถแบงไดเปน 2 กลม ตามโครงสราง คอ โฮโมพอลแซคคาไรด เปนพอลแซคคาไรดทประกอบดวยโมโนแซคคาไรดเพยงชนดเดยวมาเชอมตอกน ไดแก แปง ไกลโคเจน เซลลโลส เดกซแทรน เปนตน และเฮเทอโรพอลแซคคาไรด เปนพอลแซคคาไรดทประกอบดวยโมโนแซคคาไรดทมากกวาหรอเทากบสองชนดมาเชอมตอกนไดแก เพกตน อนลน กม และวน เปนตน นอกจากนยงแบงพอลแซคคาไรดไดเปน 2 กลมตามหนาทไดแก พอลแซคคาไรดทท าหนาทเปนแหลงสะสมพลงงาน (Storage polysaccharide) เชน แปง และไกลโคเจน และพอลแซคคาไรดทท าห นาท เ ปนโครงสราง ของผน ง เซลลพช และ เปลอกภายนอกของสตว ( Structural polysaccharide) เชน เซลลโลส และไคตน (ศภศษฏ, 2552)

20

รปท 1.3 โครงสรางของพอลแซคคาไรด ทมา : Urai และคณะ (2006)

สารทสกดไดจากเหดหลนจอสวนมากจะอยในรปของสารพอลแซคคาไรด และไตรเทอรพน ปรมาณของสารพอลแซคคาไรดทสกดไดจากดอกเหดหลนจอจะมประมาณ รอยละ 0.82 (น าหนกตอน าหนก) (Zhang and Lin, 2004) โดยสารพอลแซคคาไรดทไดจากเหดจะมคณสมบตโดยตรงทสามารถปองกนสาเหตทท าใหเกดมะเรง ยบยงการกระจายของเนองอก และปองกนระบบภมคมกน (Silva, 2003) จากผลการทดลองของ Ikekawa (2001) พบวา จากการทดลองในหนชดแรกทฉดสารกอมะเรงใหหน 36 ตว ซงเปนชดควบคม หลง 76 สปดาห หน 21 จาก 36 ตว เกดเนองอก การทดลองชดทสองฉดสารกอมะเรงใหหน 36 ตว และเลยงดวยอาหารทมสวนผสมของสารพอลแซคคาไรด รอยละ 5 หลง 76 สปดาห มหนเพยง 3 จาก 36 ตว เทานนทเกดเนองอก Gao และคณะ (2003) คดเลอกผปวยทเปนมะเรงตามอวยวะตางๆ 134 คน ใหทานอาหารเสรมทมสวนผสมของเหดหลนจอปรมาณ 1,800 มลลกรม เปนเวลา 12 สปดาห พบวา รอยละ 80 ของผปวยจะมการเปลยนแปลงภมคมกนของเซลล โดยมปรมาณและกจกรรมของ IL-2, IL-6 IFN-Y และ NK cell เพมขน และทดลองในผปวยมะเรงปอด 68 คน ใหทานอาหารเสรมทมสวนผสมของเหดหลนจอปรมาณ 1,800 มลลกรม เปนเวลา 12 สปดาห พบวากลมผปวยทไดรบอาหารเสรมมจ านวนของ NK cell และ T-cell เพมขน พอลแซคคาไรด เ ปนผลตภณฑปฐมภม (Primary product) ท เ กดจากกระบวนการเมทาบอลซมของจลนทรย (Wang et al., 2015) พอลแซคคาไรดหลายชนดสามารถผลตไดจากการเพาะเลยงเหดในอาหารเหลว (Kim et al., 2005) สวนใหญทไดจากเสนใยเปนเอนโดพอลแซคคาไรด และเอกโซพอลแซคคาไรด (Cheung, 1996) เอนโดพอลแซคคาไรดเปนพอลแซคคาไรดทสงเคราะหภายในเซลล เปนสารส าคญทท าใหเซลลอยรอดโดยสามารถใชเปนแหลงพลงงาน และแหลงคารบอนแกเซลลได ตองอาศยการสกด และการท าบรสทธเพอน าเอาออกมาจากเซลล (Hippe, 1991) สวนเอกโซพอลแซคคาไรด เปนพอลแซคคาไรดทจลนทรยหลงออกมาภายนอกเซลลใน 2 รปแบบคอ แคปซลซงยดตดอยกบผนงเซลล และในรปของเมอกซง

21

ปลดปลอยออกสสงแวดลอมรอบๆเซลล เอกโซพอลแซคคาไรดมหลากหลาย และมลกษณะเฉพาะทไมซ ากน มกมความซบซอนทางโครงสรางเคม ท าหนาทปองกนเซลลจากสารตานจลนทรย และท าใหเซลลสามารถทนตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสมได (Kumon, 1994)

1.2.5.2 ß-1,3-glucan สารพอลแซคคาไรดทไดจากเหดสวนมากจะอยในรปของกลแคน (Glucan) (Wasser, 2002) กลแคนเปนโพลเมอรของน าตาลกลโคสซงสามารถพบไดในสงมชวตทวไป โดยเฉพาะอยางยงทผนงเซลลของพช แบคทเรย ราและเหด โดยกลแคนสามารถจ าแนกไดตามชนดของสายพนธะทเชอมตอโมเลกลของน าตาลกลโคสดวยพนธะ α หรอ ß ในธรรมชาต ß-glucan เปนโครงสรางทพบมาก มโครงสรางคอโมเลกลของน าตาลกลโคสจะเชอมตอกนดวยพนธะ ß โดยทต าแหนงคารบอนท 1 ของน าตาลกลโคสตวแรกจะเชอมตอกบคารบอนตวท 3 ของน าตาลกลโคสตวทสองไดเปน ß-1,3-glucan ดงรปท 1.5 และหากโมเลกลของน าตาลกลโคสเชอมตอกนทคารบอนต าแหนงท 1 และ 4 หรอ 6 กจะได ß-1,4-glucan หรอ ß-1,6-glucan จากงานวจยสวนใหญพบวาโครงสรางน าตาลทพบมากในเหดโดยสวนใหญเปนน าตาลชนด ß-1,3-glucan (Manzi and Pizzoferrato, 2000; Suwanno, 2007)

รปท 1.5 โครงสรางของ ß-1,3-glucan ทมา : Mursito และคณะ (2010)

หนาทโดยทวไปของ ß-1,3-glucan จะเกยวกบสขภาพ โดยกลแคนจะชวยสงเสรมหรอเพมระดบภมคมกนของรางกาย โดยกระตนการท างานของ T-cells, B-cells และเซลลเมดเลอดขาว สงผลใหรางกายสามารถตานทานหรอปองกนเชอโรคและสงแปลกปลอมทจะเขาสรางกายไดดขน ดงนนกลแคนจงถกน ามาใชประโยชนทเกยวของกบอาหารเสรมสขภาพหรอใชเปนยาปองกน และยบยงโรครายแรงตางๆ เชน ยบยงเซลลมะเรง (Anti-cancer), ยบยงการตดเชอ (Anti-infect), โดยเฉพาะอยางยงโรคเอดส (HIV) และมงานวจยอกหลายฉบบยนยนวา ß-1,3-glucan ยงชวยเสรมและเพมความสมดลของระบบภมคมกนของรางกายอกดวย (Daba and Ezeronye, 2003; Liu and Zhang, 2005; Silva 2003; Wasser, 2002) และยงพบวา ß-1,3-glucan ทไดจากเชอรานนจะมประสทธภาพในการยบยงเนองอกสงกวา ß-1,3-glucan ทไดจากแหลงอน (Bohn and Bemiller, 1995)

22

1.) ผลของ ß-glucan ตอระบบภมคมกน ß-glucan จากเหดราบางชนดจะกระตนระบบภมคมกนจากจลนทรยทกอใหเกดโรคและจากผลกระทบทเปนอนตรายของสารพษในสงแวดลอมและสารกอมะเรง มนษยไมสามารถสงเคราะห ß-glucan เองได แตสารเหลานระบบภมคมกนของเรายอมรบแมไมไดสรางจากรางกายเอง รวมทงชกน าใหเกดการตอบสนองของระบบภมคมกนแตก าเนดและภมคมกนจ าเพาะ (Brown and Gordon, 2005) ผลตอระบบภมคมกนแตก าเนด ภมคมกนแตก าเนดมอยตงแตเราเกดและเปนภมคมกนไมจ าเพาะ มการตอบสนองตอโครงสรางของแอนตเจนหลายชนด ß-glucan บางชนดกระตนการท างานของ ฟาโกไซต โดยชกน าใหเกดการก าจดเชอโรคดวยกระบวนการฟาโกไซโตซส (Munz et al., 2005)

2.) ß-glucan กบการรกษาโรคมะเรง แมวาการรกษาโรคมะเรงดวยการผาตด การใชเคมบ าบด และการบ าบดดวยระบบภมคมกนจะมประสทธภาพ แตจากการศกษาไกกลการเกดมะเรงพบวาการรกษาดวยการไมผาตดมประสทธภาพมากกวา ß-glucan จากเหดราบางชนดมอทธพลตอการเกดและการพฒนาของมะเรง เชนขอมลทไดจากการทดลองในหนพบวา หนทไดรบ ß-glucan จะมขนาดของมะเรงเลกลงกวาหนกลมควบคม (Vetvicka and Yvin 2004) นอกจากน ß-glucan อาจชวยสรางความตานทานตอผปวยทรกษาโรคมะเรงดวยวธเคมบ าบดและการฉายรงส เชน ลดความเสยงตอการตดเชอทเพมขนของผปวยทเปน leukoponia (Harada et al., 2002)

3.) ß-glucan กบการรกษาโรคตดเชอ ปญหาหลกของการควบคมโรคตดเชอคอความตานทานของจลทรยตอยาปฏชวนะ ß-glucan จากเหดราบางชนดมผลตอจลนทรยกอโรคเกอบทงหมด โดยมผลตอกลไกของการปรบภมคมกน จากการทดลองของ Vetvicka และ Yvin (2004) ทดลองฉดเชอไวรสตบอกเสบในหน พบวา ß-glucan จะชวยใหเซลลทตดเชอเหลอรอดมากขนโดยไปยบยงการตายของเซลล และกระตนการท างานของฟาโกไซต

4.) ß-glucan กบการรกษาโรคเบาหวาน ß-glucan จากเหดราหลายชนดอาจลดระดบความเขมของน าตาลในเลอดหลงการรบประทานอาหารได โดยท าใหการบบตวของกระเพาะอาหารเพอดนอาหารลงสล าไสเลกชาลง ดงนนน าตาลจะคอยๆถกดดซม (Lo et al., 2006) เชนในการทดลองในหนทมรหสพนธกรรมของโรคเบาหวาน โดยใหอาหารทมสวนผสมของเหดรอยละ 20 พบวามการปองกนการเพมของระดบกลโคสในเลอดดวยการเพมความไวของอนซลน (Mayell, 2001)

5.) ß-glucan กบการรกษาบาดแผล ß-glucan จะไปกระตนการท างานของแมกโครฟาจ ซงอาจเปนประโยชนตอการรกษาแผล และลดแผลเปนหลงการผาตดหรอการบาดเจบ (Mayell, 2001)

23

1.2.6 สำรตำนอนมลอสระ (Antioxidant) สารตานอนมลอสระเปนสารทท าหนาทปองกนความเสยหายทเกดจากอนมลอสระ (Free radicals) สารอนมลอสระซงอาจเปนสาเหตของการเกดโรคตางๆ เชน โรคหลอดเลอดหวใจ ความผดปกตของระบบประสาท โรคเบาหวาน โรคไขขอ และโรคมะเรง เปนตน โดยสารตานอนมลอสระจะขดขวางการท างานของอนมลอสระดวยการยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชน (Oxidation) ทเกดขนในเนอเยอของรางกาย หรอชวยในการท าลายอนมลอสระ โดยจะปลอยอเลกตรอนใหแกอนมลอสระ ท าใหอนมลอสระทเปนสารอนตรายลดความอนตรายลงจนเซลลในรางกายสามารถก าจดออกไปเองได (Halliwell, 2009) สารตานอนมลอสระทพบไดมหลายชนด ซงสวนใหญมกเปนสารกลมสารประกอบฟนอลก (Vichitphan et al., 2007) สารตานอนมลอสระมทงทไดจากธรรมชาตมากมายหลายชนด สามารถพบไดในสงมชวตทวไป ทงจลนทรย สตว และพช ซงอาจอยในรปของเอนไซมบางชนดหรอสารอนๆ เชน วตามนอ วตามนซ เบตาแคโรทน เปนตน และสารตานอนมลอสระทเกดจากการสงเคราะหขนดวยกระบวนการสงเคราะหทางเคม เชน Butylated hydroxyl toluene (BHT), Butylated hydroxyl anisole (BHA) และ Gallic acid เปนตน (Sarma et al., 2010)

24

1.3 วตถประสงค 1.3.1 เพอส ารวจ คดแยกเชอบรสทธและวเคราะหปรมาณสารพอลแซคคาไรดของสาย

พนธเหดสมนไพรทพบในเหดพนเมองของภาคใตตอนลางโดยเนนจงหวดสงขลา พทลง ตรง สตล และจงหวดใกลเคยง

1.3.2 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเพอผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan

1.3.3 เพอเปนขอมลเบองตนส าหรบการขยายขนาดการเพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเพอผลตสารพอลแซคคาไรดในเชงพาณชย

1.4 ประโยชนทคำดวำจะไดรบ 1.4.1 ไดสายพนธสมนไพรในเขตจงหวดภาคใตตอนลาง ไดแก จงหวดสงขลา พทลง

สตล และตรง 1.4.2 ไดสภาวะทเหมาะสมในการเพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามน

ปาลม และปรมาณสารพอลแซคคาไรดในรปของ ß-1,3-glucan จากเหดหลนจอทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

1.4.3 เปนขอมลเบองตนส าหรบการน าของเสยทเกดจากการสกดน ามนปาลมมาใชประโยชนเปนอาหารในการเพาะเลยงเหดสมนไพรเพอผลตสารพอลแซคคาไรดในเชงพาณชย

1.4.4 เปนการเพมมลคาใหกบน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม และลดการปลดปลอยน าทงออกสสงแวดลอม

1.5 ขอบเขตกำรวจย 1.5.1 แยกเชอเหดสมนไพรทเกบไดจากเขตจงหวดทางภาคใตตอนลางไดแก สงขลา พทลง สตล และตรง ใหอยในรปเชอบรสทธ

1.5.2 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเพาะเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ไดแก การเตรยมเชอเรมตน คาพเอชเรมตนของน าทง อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน อตราสวนแรธาต และอตราการเตมอากาศ

1.5.3 ศกษาคณสมบตของสารพอลแซคคาไรดทไดจากการเพาะเลยงเหดสมนไพรในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ไดแก ความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระ และการยบยงการเจรญของแบคทเรย

25

บทท 2 วธกำรวจย

2.1 วธด ำเนนกำร

2.1.1 กำรคดเลอกสำยพนธเหดสมนไพร การเกบรวบรวมสายพนธเหดสมนไพรโดยการส ารวจ และเกบรวบรวมตวอยางดอกเหด

จากธรรมชาตทอยในบรเวณปาทสามารถเขาถงไดในเขตจงหวดทางภาคใตตอนลางไดแก สงขลา พทลง สตล และตรง ในชวงตนฤดฝน ระหวางเดอนพฤษภาคม ถงเดอนมถนายน พ.ศ. 2554 การเกบจะเลอกเกบดอกเหดทมลกษณะสมบรณ เพอน ามาแยกเชอเหดใหบรสทธโดยดดแปลงจากวธของ Stamets (2000) โดยน าดอกเหดฆาเชอดวยแอลกอฮอลรอยละ 70 แลวลางดวยน ากลนทผานการฆาเชอแลว 2-3 ครง ตดเนอเยอดอกเหดใหเปนชนเลกๆ วางบนอาหารแขงพดเอ (Potato Dextrose Agar: PDA) น าไปบมทอณหภม 25 องศาเซลเซยส จนเสนใยเจรญแลวท าการเขยเชอบนอาหารชนดเดยวกนซ าหลายๆ ครงจนไดเชอบรสทธ เกบตวอยางในอาหารแขงเอยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเพอไวใชตอไป

2.1.2 กำรวเครำะหกำรเจรญของเสนใยเหดสมนไพร ปรมำณสำรเอนโดพอลแซคคำไรด และ ß-1,3-glucan

2.1.2.1 กำรทดสอบลกษณะกำรเจรญของเสนใยเหดสมนไพร โดยน าเชอเหดสมนไพรทเพาะเลยงไวบนอาหารแขงพดเอจากขอ 2.1.1 ตดดวยคอร

กบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร แลวใชเขมเขยเชอยายชนวนวางลงบนอาหารแขงพดเอ (จานเพาะเชอมขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร) บมในทมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส วดขนาดเสนผานศนยกลางของเสนใยทเพมขนทกๆวน จนเสนใยเจรญเตมจานอาหาร

2.1.2.2 กำรทดสอบควำมสำมำรถของสำยพนธเหดพนเมองภำคใตทเจรญในอำหำรเหลวเอสพดบ

โดยน าเชอเหดสมนไพรทเพาะเลยงไวบนอาหารแขงพดเอจากขอ 2.1.1.1 ตดดวย คอรกบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร จ านวน 2 ชน เพาะเลยงในอาหารเหลว เอสพดบ (Sweet Potato Dextrose Broth: SPDB) ทประกอบดวย มนเทศ 250 กรม กลโคส 20 กรม เพปโทน 1 กรม วตามนบหก 0.5 กรม และแคลเซยมคลอไรด 1.3 กรม ตออาหาร 1 ลตร (สวทย และไซนะ, 2555) ปรมาณ 100 มลลลตร ในฟลาสกขนาด 500 มลลลตร เพาะเลยงในสภาวะนง (Static condition) และมด บมทอณหภม 25 องศาเซลเซยส จนเสนใยเจรญเตม ฟลาสก หลงจากนนกรองเสนใยดวยผาขาวบาง 1 ชน และลางดวยน ากลนทผานการฆาเชอแลว

26

3 ครง เสนใยทไดท าแหงแบบแชเยอกแขง (Lyophilization) วเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan

1) การสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด น าตวอยางเสนใยเหดทผานการท าแหงแบบแชเยอกแขงแลวมาสกดสารเอนโด

พอลแซคคาไรดตามวธของ Suwanno และคณะ (2005) โดยน าเสนใยเหดทผานการท าแหงแบบแชเยอกแขงแลว 1 กรม เตมน ากลน 5 มลลลตร ผสมใหเขากนน าไปใหความรอนทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ทความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 120 นาท แลวน าไปเตม Silicon dioxide 2 กรม บดดวยโกรงจนละเอยด จากนนเตมน ากลน 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงท 4,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท จะไดสารละลายใสสวนท 1 สวนของตะกอนน ามาเตมน ากลน 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงอกครง ไดสารละลายใสสวนท 2 สวนของตะกอนทเหลอน าไปเตมโซเดยมไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงท 4,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท ไดสารละลายใสสวนท 3 สวนของตะกอนน ามาเตมโซเดยมไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงอกครง ไดสารละลายใสสวนท 4 น าสารละลายใสทง 4 สวนทไดมารวมกน

2) การวเคราะหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด สารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดน ามาวเคราะหดวยวธ Phenols Sulfuric

Colorimetric โดยดดแปลงจากวธของ Dubois และคณะ (1956) ใชกลโคสเปนสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 0-200 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยมวธการวเคราะหดงตอไปน น าตวอยางทไดจากการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด 200 ไมโครลตร เตมสารละลายฟนอลความเขมขนรอยละ5 (ละลายฟนอล 5 กรม ในน ากลน ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร) ปรมาตร 1 มลลลตร เตมกรดซลฟวรกเขมขนปรมาตร 1 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไว 30 นาท วดคาการดดกลนแสงท 490 นาโนเมตร ดวยเครอง Spectrophotometer

3) การวเคราะหปรมาณ Endo-ß-1,3-glucan สารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดน ามาวเคราะหดวยวธ Aniline blue

ดดแปลงจาก Suwanno และคณะ (2005) โดยใช ß-1,3-D-glucan เปนสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 0 – 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร มวธการวเคราะหดงน น าตวอยางทไดจากการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด 400 ไมโครลตร ผสมกบโซเดยมไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 800 ไมโครลตร และผสมกบสยอม (Aniline blue) 4.8 มลลลตร น าไปวดคาการดดกลนแสงดวยเคร อ ง Fluorescence spectrophotometer ท ค ว ามยาวคล น Excitation 393 นาโน เมตร และ Emission 479 นาโนเมตร แลวค านวณคาตามสมการท 1

Fluorescence intensity = Total fluorescence – Auto fluorescence (1)

27

ในขนตอนการคดเลอกสายพนธเหดสมนไพรนจะคดเลอกมาใชเพยง 1 สายพนธเพอใชในขนตอนตอไป โดยคดเลอกสายพนธทสามารถเจรญไดด และใหผลผลตเปนสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ในปรมาณสงสด เพอน าไปพฒนาหาสภาวะทเหมาะสมในการเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอไป

2.1.2 ศกษำสภำวะทเหมำะสมตอกำรผลตสำรเอนโดพอลแซคคำไรดของเหดสมนไพรในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม

2.1.2.1 ศกษำองคประกอบทำงเคมของน ำทงจำกโรงงำนสกดน ำมนปำลม น าน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลมในเขตอ าเภอละง จงหวดสตล ทเกบจากตอนกลาง

ของระบบบ าบดน าทงแบบ Facultative pond โดยเกบจากบอท 3 ของระบบบ าบด ซงมทงหมด 6 บอ เนองจากปรมาณสารอนทรยทอยในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในบอแรกนน มปรมาณสงมากจนไมสามารถน าน าทงมาใชไดโดยตรง จงเกบตวอยางจากบอบ าบดท 3 เพอลดการใชน าสะอาดมาผสมกบน าทงเพอเจอจางความเขมขนของน าทงกอนน าไปใช ในการเกบตวอยางใชวธเกบแบบจวง (Grab sampling) น าทงทเกบไดใสในภาชนะพลาสตกแลวปดฝาใหสนท หลงจากนนน าไปแชเยนไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส กรองดวยผาขาวบางเพ อก าจดเศษใบไมและกงไมออก หลงจากนนน ามาวเคราะหองคประกอบทางเคมตามวธของ A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005) ดงตารางท 2.1

ตำรำงท 2.1 องคประกอบทางเคมและวธวเคราะหน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม

องคประกอบทำงเคม วธวเครำะห Chemical Oxygen Demand Total Solids Carbohydrate Total Kjeldahl Nitrogen Total Phosphorus Total Potassium Iron Phenols C:N ratio

Closed reflux, titrimetric method Total solids dried at 103-105 C Phenols sulfuric acid method Titrimetric method, Macro-Kjeldahl method Persulfate digestion method, Ascorbic acid method Atomic Absorption Spectroscopy Atomic Absorption Spectroscopy Total Phenolic contents (Folin ciocalteu method) CHNS-O Analyzer

ทมา : A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005)

28

2.1.2.2 กำรเตรยมเชอเรมตน ใชเชอเหดหลนจอทคดเลอกจากขอ 2.1.1 เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

ดวยวธ Disk inoculum โดยใชเชอเรมตนจากการเพาะเลยงเชอเหดสมนไพรบนอาหารแขง พดเอเปนเวลา 7 วน แลวตดเสนใยเหดดวยคอรกบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร จ านวน 5 ชนน าไปเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 15 นว x 5 นว (รปท 2.1 ก) เลยงในสภาวะนง และมด บมทอณหภมหอง เปนเวลา 16 วน แลวจงเกบเกยวเสนใยเหดดวยการกรองกบผาขาวบาง 1 ชน และลางดวยน ากลน 3 ครง น าเสนใยทไดท าแหงดวยวธแชเยอกแขง (Lyophilization) เพอน าไปวเคราะหน าหนกเสนใยแหงตอไป

รปท 2.1 ลกษณะโหลแกวทใชในการทดลอง (ก) โหลแกวแนวนอนส าหรบการเพาะเลยงแบบนง (ข) โหลแกวแนวตงส าหรบการเพาะเลยงแบบเตมอากาศ

2.1.2.3 กำรศกษำระยะเวลำทเหมำะสมของกำรเตรยม Seed inoculum ใชวธการเตรยมเชอเรมตนจากขอ 2.1.2.2 เพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบเปนเวลา

3, 5 และ 7 วน อตรารอยละ 7 โดยปรมาตร เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมปรมาตร 200 มลลลตร ในฟลาสกขนาด 500 มลลลตร เพาะเลยงบนเครองเขยา 120 รอบตอนาท ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 3 วน เปนระยะเวลา 9 วน กรองดวยผาขาวบาง 1 ชน และลางเสนใยดวยน ากลน 3 ครง กอนน าไปท าแหงแบบแชเยอกแขง วเคราะหน าหนกเสนใยแหงทเพมขนตามระยะเวลาทผานไป เพอคดเลอกระยะเวลาทเชอเรมตนสามารถผลตน าหนกเสนใยแหงไดสงสด

หมำยเหต ในขนตอนการทดลองหลงจากน ผวจยจะเลอกใชการเตรยมเชอเรมตนแบบ Seed inoculum ตามระยะเวลาทเหมาะทคดเลอกไดจากขอ 2.1.2.3 แตมการปรบเปลยนวธการ

ก ข

29

น าไปเพาะเลยงตอในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม โดยใชการเพาะเลยงในสภาวะนงแทนการเพาะเลยงบนเครองเขยา เนองจากอปกรณทใชเขยาในการทดลองมไมเพยงพอ

2.1.2.4 กำรศกษำคำพเอชเรมตนทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

ใชเชอเรมตนทเหมาะสมจากขอ 2.1.2.3 ในอตรารอยละ 7 โดยปรมาตร เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 15 นว x 5 นว (รปท 2.1 ก) โดยปรบคาพเอชเรมตนของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมดวยกรดซลฟวรก (ความเขมขน 10 โมลาร โดยผสมกรดซลฟวรกเขมขน 28 มลลลตร กบน ากลน แลวปรบปรมาตรใหได 1 ลตร) ใหเทากบ 4, 5, 6, 7 และ 7.93 (ชดควบคม) เพาะเลยงในสภาวะนง และมด ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 4 วน เปนระยะเวลา 16 วน หลงจากนนจงกรองแยกเสนใยทเพาะเลยงไดดวยผาขาวบาง 1 ชน ลางดวยน ากลน 3 ครง แลวน าไปท าแหงแบบแชเยอกแขง วเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ตามวธในขอ 2.1.1.2 เพอคดเลอกคาพเอชเรมตนทเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดด ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด

2.1.2.5 กำรศกษำอตรำสวนคำรบอนตอไนโตรเจนทเหมำะสมของน ำทงโรงงำน

สกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดสมนไพร ใชเชอเรมตนทเหมาะสมจากขอ 2.1.2.3 ในอตรารอยละ 7 โดยปรมาตร และสตรอาหาร

ทคดเลอกไดจากขอ 2.1.2.4 เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 15 นว x 5 (รปท 2.1 ก) นว โดยปรบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนของน าทงดรงงานสกดน ามนปาลมเทากบ 20, 40, 60 และ 80 ปรบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนโดยใชซโครส (C12H22O11) เปนแหลงคารบอน และใชแอมโมเนยมคลอไรด (NH4Cl) เปนแหลงไนโตรเจน ค านวณอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนตามวธของ Techobanoglous และคณะ (1993) โดยวธการค านวณอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนกรณทน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเทากบ 1 ลตร (สมมตใหอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเรมตนเทากบ 40 ตอ 1) สมมตวาน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมม C อย รอยละ 21 และ N รอยละ 1 ซโครสม C อย รอยละ 42 และ N รอยละ 0 ถาใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม 1 ลตร จะตองใชซโครส X กรม ดงนน

30

[Cซโครส+Cน าทง]÷[Nซโครส+Nน าทง] = 40÷1

[42(x) + 21]÷[0 + 1] = 40÷1 42x + 21 = 40 42x = 40-21 x = 19÷42 x = 0.45

ดงนนเมอตองการอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเรมตนเทากบ 40 ตอ 1 จะตองใชน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม 1 ลตร และซโครส 0.45 กรม

เพาะเลยงในสภาวะนง และมด ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 4 วน เปนระยะเวลา 16 วน หลงจากนนจงกรองแยกเสนใยทเพาะเลยงไดดวยผาขาวบาง 1 ชน ลางดวยน ากลน 3 ครง แลวน าไปท าแหงแบบแชเยอกแขง วเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดและ Endo-ß-1,3-glucan ตามวธในขอ 2.1.1.2 เพอคดเลอกอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดด ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด

2.1.2.6 กำรศกษำอตรำสวนแรธำตทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม

ตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดสมนไพร ใชเชอเรมตนทเหมาะสมจากขอ 2.1.2.3 ในอตรารอยละ 7 โดยปรมาตร และสตรอาหาร

ทคดเลอกไดจากขอ 2.1.2.5 เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 15 นว x 5 นว (รปท 2.1 ก) โดยในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจะเตมแรธาตอาหาร 4 ชนด ไดแก แคลเซยมคลอไรด (CaCl2) แมกนเซยมซลเฟต (MgSO4) ซงคคลอไรด (ZnCl2) และเฟอรสซลเฟต (FeSO4) ซงปรบความเขมขนของแรธาตใหไดในอตราสวน CaCl2:MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03 และ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร เพาะเลยง ในสภาวะน ง และมด ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 4 วน เปนระยะเวลา 16 วน หลงจากนนจงกรองแยกเสนใยทเพาะเลยงไดดวยผาขาวบาง 1 ชน ลางดวยน ากลน 3 ครง แลวน าไปท าแหงแบบแชเยอกแขง วเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดและ Endo-ß-1,3-glucan ตามวธในขอ 2.1.1.2 เพอคดเลอกอตราสวนแรธาตทเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดด ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด

31

2.1.2.7 กำรศกษำอตรำกำรเตมอำกำศทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดสมนไพร

ใชเชอเรมตนทเหมาะสมจากขอ 2.1.2.3 ในอตรารอยละ 7 โดยปรมาตร และสตรอาหารทคดเลอกไดจากขอ 2.1.2.6 เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 5 นว x 15 (รปท 2.1 ข) ปรบอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5, 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท (สมมตทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ในการเพาะเลยงจะใชอาหารน าทง 1 ลตร การเตมอากาศจะตองเตมใหไดปรมาตรอากาศ 0.5 ลตร ภายในระยะเวลา 1 นาท) เพาะเลยงในสภาวะมด ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 2 วน เปนระยะเวลา 8 วน หลงจากนนจงกรองแยกเสนใยออกจากอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมดวยผาขาวบาง 1 ชน

1) สวนทเปนเสนใยเหด น ามาลางดวยน ากลน 3 ครง แลวน าไปท าแหงแบบ แชเยอกแขง วเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ตามวธในขอ 2.1.1.2 เพอคดเลอกอตราสวนการเตมอากาศทเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดด ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด

2) สวนทเปนอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม น ามาสกดสารเอกโซพอลแซคคาไรด ดดแปลงจากวธของ Tang and Zhong (2003) และ Lee และคณะ (2007) ดงตอไปน น าตวอยาง 100 มลลลตร ผสมกบเอทานอล (รอยละ 95 ปรมาตรตอปรมาตร) 400 มลลลตร คนใหเขากนแลวตงทงไวใหตกตะกอนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง หลงจากนนน าไปหมนเหวยงทความเรว 6,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท เกบสวนทเปนตะกอนไว เตมโซเดยมไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 10 มลลลตร น าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง แลวเกบสวนทเปน Supernatant เพอน าไปวเคราะหปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรด และ Exo-ß-1,3-glucan ตามวธในขอ 2.1.1.2 เพอคดเลอกอตราสวนการเตมอากาศทเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดด ใหปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรด และ Exo-ß-1,3-glucan สงสด

2.1.3 ศกษำคณสมบตของสำรพอลแซคคำไรดทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดสมนไพรในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

2.1.3.1 ศกษำองคประกอบทำงเคมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมทใชเปนอำหำรส ำหรบกำรเพำะเลยงหลงเกบเกยวผลผลตเสรจแลว

วเคราะหองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมหลงใชเปนอาหารส าหรบเพาะเลยงเหดสมนไพรในสภาวะทเหมาะสม โดยน าน าทงทผานการกรองดวยผาขาวบางเพอน าเสนใยเหดออกแลว มาวเคราะหตามวธของ A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005) ดงตารางท 2.2

32

ตำรำงท 2.2 องคประกอบทางเคมและวธวเคราะหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมหลงเพาะเลยงเหดสมนไพรในสภาวะทเหมาะสม

องคประกอบทำงเคม วธวเครำะห

Chemical Oxygen Demand Total Kjeldahl Nitrogen Total Phosphorus Total Potassium Iron Phenols

Closed reflux, titrimetric method Titrimetric method, Macro-Kjeldahl method Persulfate digestion method, Ascorbic acid method Atomic Absorption Spectroscopy Atomic Absorption Spectroscopy Total Phenolic contents (Folin ciocalteu method)

ทมา : A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005) 2.1.3.2 วเครำะหปรมำณโลหะหนกจำกผลตภณฑทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดใน

น ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม วเคราะหปรมาณโลหะหนกทมอยในผลตภณฑทสกดไดจากเสนใยของเหดสมนไพรท

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม ตามวธของ A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005) ดงตารางท 2.3

ตำรำงท 2.3 ชนดของโลหะหนก และวธวเคราะหผลตภณฑทสกดไดจากเสนใยของเหด ทเพาะเลยงน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม

ชนดของโลหะหนก วธวเครำะห Iron Copper Cadmium

Atomic Absorption Spectroscopy Atomic Absorption Spectroscopy Atomic Absorption Spectroscopy

ทมา : A.O.A.C (2005) และ APHA, AWWA, WEF (2005)

2.1.3.3 วเครำะหสำรตำนอนมลอสระจำกผลตภณฑทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

1) การสกดสารส าหรบใชในการวเคราะห โดยใชวธสกดตามวธของ Elmastas และคณะ (2007) ดงน น าเสนใยเหดทอบแหงดวยอณหภม 40-50 องศาเซลเซยส 10 กรม ปนใหละเอยด ผสมกบเมทานอล 100 มลลลตร ตงทงไวบนเครองเขยาท 150 รอบตอนาท เปนเวลา 24 ชวโมง แลวกรองผานกระดาษ Whatman เบอร 4 กากหลงการกรองน ามาเตมเมทานอลเขยาและกรอง

33

อกครง น าสารสกดทกรองไดทงสองสวนมารวมกนแลวน าไประเหยทอณหภม 40 องศาเซลเซยส ดวยเครองระเหยตวท าละลายแบบหมน (Rotary evaporator) เกบสารทไดไวในขวดแกวสชาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ส าหรบน าไปวเคราะหสารตานอนมลอสระในขนตอนตอไป

2) การวเคราะหสารตานอนมลอสระ โดยน าสารทสกดไดละลายดวยเมทานอลใหไดความเขมขนเทากบ 100 ไมโครกรมตอมลลลตร แลวเจอจางใหไดความเขมขน 100, 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ แลวน าไปวเคราะหสารตานอนมลอสระ 4 วธ ดงตอไปน

2.1) วเคราะหสารประกอบฟนอลกทงหมด (Total Phenolic contents) ตามวธของ Chirinang และ Intarapichet (2009) โดยน าตวอยางทสกดได 100 ไมโครลตร เตมโซเดยมคารบอเนต 2 มลลลตร ตงทงไว 2 นาท เตม Folin-ciocalteau 100 ไมโครลตร ทงไว 30 นาท วดคาการดดกลนแสงท 765 นาโนเมตร ดวยเครอง Spectrophotometer

2.2) วธ 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH assay) ตามวธของ Elmastas และคณะ (2007) โดยน าตวอยางทสกดได 3 มลลลตร เตมสารละลาย DPPH 1 มลลลตร ต งท ง ไว 30 นาท วด ค าการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร ดวยเคร อง Spectrophotometer

2.3) วธ 2, 2’- Azino - bis (3 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulfonic acid) cation radical scavenging assay (ABTS assay) ตามวธของ Chirinang และ Intarapichet (2009) โดยน าตวอยางทสกดได 100 ไมโครลตร เตมสารละลาย ABTS 2 มลลลตร ตงทงไว 3 นาท วดคาการดดกลนแสงท 734 นาโนเมตร ดวยเครอง Spectrophotometer

2.4) ว ธ Ferric reducing antioxidant power (FRAP assay) ต ามวธข อ ง Chirinang และ Intarapichet (2009) โดยน าสารละลาย FRAP บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 8 นาท ปเปตมา 1.5 มลลลตร เตมน ากลน 150 ไมโครลตร เตมตวอยางทสกดได 50 ไมโครลตร ทงไว 10 นาท วดคาการดดกลนแสงท 593 นาโนเมตร ดวยเครอง Spectrophotometer

2.1.3.4 ศกษำควำมสำมำรถในกำรยบยงกำรเจรญของแบคทเรยจำกผลตภณฑท

ไดจำกกำรเพำะเลยงเหดในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

น าผลตภณฑทสกดไดจากเสนใยของเหดสมนไพรเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม ทดสอบความสามารถในการยบยงการเจรญของแบคทเรยดวยวธ Disc diffusion (Bauer et al., 1996) มขนตอนดงน

34

1) การ เตรยมเช อ Staphylococcus aureus (ATCC 25922) และ Escherichia coli (ATCC 25923) (เชอแบคทเรยทง 2 ชนด เปนสายพนธทมความสามารถในการกอโรคต า และไ ด ร บ ค ว า ม อ น เ ค ร า ะ ห ม า จ า ก ภ า ค ว ช า จ ล ช ว ว ท ย า ค ณ ะ ว ท ย า ศ า ส ต ร มหาวทยาลยสงขลานครนทร)

1.1) เขยเชอ Staphylococcus aureus (ATCC 25922) และ Escherichia coli (ATCC 25923) ลงบนอาหารแขง (Nutrient agar: NA) แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 18-24 ชวโมง

1.2) น าเชอทเตรยมไดจากขอ 1.1) มาประมาณ 2-3 โคโลน ใสในหลอดทดลองทมอาหารเหลว (Nutrient broth: NB) ปรมาตร 2 มลลลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6-8 ชวโมง

1.3) น าเชอจากขอ 1.2) มาเจอจางดวยอาหารเหลวใหไดความเขมขน 105-107 เซลลตอมลลลตร (CFU/ml) โดยปเปตเชอมา 1 มลลลตร เตมอาหารเหลวทผานการฆาเชอแลวลงไป 2-3 มลลลตร แลวน าไปวดความขนทความยาวคลน 660 นาโนเมตร ใหไดคาการดดกลนแสงเทากบ 5

1.4) ใชไมพนส าลทผานการฆาเชอแลวจมลงในหลอดทดลองทมเชอจากขอ 1.3) จากนนท าการ Swab ลงบนผวหนาของอาหารแขง Muller-Hinton agar (MHA) ใหทว ทงไว 3-5 นาท เพอใหสวนผวหนาของอาหารเลยงเชอแหง

2) การทดสอบตวอยาง น ากระดาษกรองทผานการซาเชอแลวขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 6

มลลเมตร วางลงบนจานเพาะเชอทเตรยมไวจากขอ 1.4) แลวหยดตวอยางลงบนแผนกระดาษกรอง 10 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 35-37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16-18 ชวโมง แลวน ามาวดเสนผานศนยกลางของบรเวณทไมมแบคทเรยขน (Inhibition zone) (Bauer et al., 1996)

2.1.4 กำรวำงแผนกำรทดลอง วางแผนการทดลองแบบ CRD (Complete Randomized Design) ทกชดการทดลองม

การท า 3 ซ า หาคาเฉลยและเปรยบเทยบความแตกตางทางสถตของขอมลดวยการวเคราะหความแปรปรวน (ANOVA: Analysis of Variance) เปรยบเทยบผลความแตกตางทางสถตของแตละคชดการทดลองดวยวธ LSD (Least Significant Difference) และ T-test ทระดบความเชอมนรอยละ 95

35

2.2 วสด และอปกรณ

2.2.1 วสด และอปกรณ 1) น าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

2) เหดสมนไพร (จากการเกบตวอยางในธรรมชาต) 3) ขวดพลาสตกส าหรบเกบตวอยางน า 4) Petri dish 5) กระดาษกรอง เบอร 1, 4, 42 และ GF/C (Whatman) 6) ผาขาวบาง (pore size ≈ 500 micron) 7) Flask และ Beaker 8) Pipette 9) Test tube 10) Cylinder

2.2.2 เครองมอ 1) Water bath (Meemmert W 760) 2) Desiccator (Sanplate 0070) 3) Drying oven (Contherm) 4) Analytical balance (Ohaus EOD 120) 5) pH meter (Russel 150 Labmate) 6) Spectrophotometer (Shimadzu UV-1601) 7) Distillation and digestion apparatus (Gerhardt) 8) Incubator (Memmert BM 700) 9) Shaker (Hedolph promax 2020) 10) HPLC (Agilent 1100) 11) Potary evaporator (Buchi R215) 12) Laminar air flow 13) Automatic pipette (Denville XL 3000i)

2.2.3 สำรเคม 1) Sodium hydroxide (Merck : Analytical) 2) Sodium chloride (Merck : Analytical) 3) Agar (Difco) 4) D-glucose (Ajax Finechem : Analytical) 5) PDA (Himedia : for in vitro diagnostics)

36

6) Dextrose (Himedia : for in vitro diagnostics) 7) Sodium hydrogen carbonate (Ajax Finechem : Analytical) 8) Sodium thiosulfate (Merck : Analytical) 9) Ammonium sulfate (Ajax Finechem : Analytical) 10) Potassium iodide (Ajax Finechem : Analytical) 11) Potassium persulfate (Ajax Finechem : Analytical) 12) Copper sulfate (Ajax Finechem : Analytical) 13) Sulfuric acid (Merck : Analytical) 14) Boric acid (Ajax Finechem : Analytical) 15) Potassium dichromate (Ajax Finechem : Analytical) 16) Mercuric sulfate (Rankem : Analytical) 17) Magnesium sulphate (Ajax Finechem : Analytical) 18) Nitric acid (Merck : Analytical) 19) Sodium hydrogen carbonate (Merck : Analytical) 20) Acetic acid (Sigma-Aldrich) 21) 2,2,-Azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfunic acid) (Fluka) 22) 2,6-Di-tert-butly-4-methlphenpl (Fluka) 23) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (Aldrich) 24) Ferric chloride (Merck : Analytical) 25) Folin-Ciocalteau reagent (Merck : Analytical) 26) Gallic acid (Sigma-Aldrich) 27) Methanol และ Ethanol (J.T. Baker) 28) 2,4,6-tri-2-pyridyl-2-triazine (Fluka)

37

บทท 3 ผลกำรทดลอง และวจำรณผลกำรทดลอง

3.1 ผลกำรคดเลอกสำยพนธเหดสมนไพร การทดลองในขนตอนนมวตถประสงคเพอคดเลอกสายพนธเหดสมนไพรทพบไดในเขตจงหวดภาคใตตอนลางไดแก สงขลา พทลง สตล และตรง ทใหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan สงสด เพอใชในการทดลองขนตอนตอไป

3.1.1 ผลกำรเกบรวบรวมสำยพนธเหดสมนไพร จากการลงพนทเกบตวอยางเหดสมนไพรในแหลงธรรมชาตพนทภาคใตตอนลาง

ของประเทศไทย จงหวด สงขลา พทลง ตรง และสตล พบเหดสมน 16 ชนด สามารถแบงลกษณะเหดออกเปน 4 กลม คอ กลมเหดหงหรอ เหดหมนร ไดแก เหดหลนจอขอบเหลอง เหดหลนจอหน เหดหลนจอกะละแมด า เหดหลนจอสด า เหดหลนจอน าตาลแดงด า เหดหงขาวเทา เหดหงน าตาลเหลอง เหดหงสสม เหดหงกรวย เหดหงพดแพรวา กลมเหดขรงนก ไดแก เหดถวย เหดดนหมมวงด า เหดตะป หรอ เหดดรรชนนางไม กลมเหดปะการง ไดแก เหดปะการงหนามสเทา กลมเหดหงครบเหดขอนขาว และ กลมเหดครบ ไดแก เหดโคน มลกษณะการเจรญทเจรญบนตนไม กงไมทพพง และบนพนดน สวนใหญเปนเหดมคณสมบตทางเภสชศาสตร ดงขอมลในตารางท 3.1 แตจากการส ารวจพบวามจ านวนสายพนธเหดสมนไพรทรวบรวมไดมปรมาณนอย เนองจากพนททสามารถเขาไปเกบรวบรวมตวอยางไดสวนใหญมความสมบรณของปานอย เชน สวนยางหรอปาทอยใกลชมชน และชวงระยะเวลาการเกบรวบรวมตวอยางทอยในชวงตนฤดฝน ซงอาจไมพบเหดหลนจอบางชนดทสามารถเจรญเตบโตไดดกวาเมอมความชนสงหรออยในชวงทมฝนตกมาเปนระยะเวลานาน

38

ตำรำงท 3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดสมนไพรจอทพบในเขตภาคใตตอนลาง

เหดสมนไพร พนทเกบตวอยำง ลกษณะทำงสณฐำนวทยำ

เหดหลนจอขอบเหลอง

(Ganoderma calidophilum)

เกบตวอย า ง เหดจากอ าเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา

ด อ ก เ ห ด ม ข น า ด 3-3.7 เซนตเมตร หมวกดอกมสมนวาว สน าตาลแดงถงสน าตาลเขม เนอด อ ก ส น า ต า ล เ ข ม ก น ไ ด มคณสมบตทางเภสชศาสตร

เหดหลนจอกาละแมด า ( Ganoderma dahlia)

เกบตวอยางจาก อ าเภอ เขาชยสน จงหวดพทลง

ด อ ก เ ห ด ม ข น า ด 8 x 16 เซนตเมตร ดอกเหดเปนรปพดครงวงกลม ผวหมวกมนวาวสน าตาลด า ถงด า ตานใตของดอกมสข า วถ ง ขาว เทา กน ได มคณสมบตทางเภสชศาสตร

เหดหลนจอน าตาลแดงด า (Ganoderma sp.)

เกบตวอยางจาก อ าเภอปาปอน จงหวดพทลง

ดอก เหดมขนาด 12.5 x 13.0 เซนตเมตร ดอกเหดมรปทรงคลายพด ขอบหยก ผวดอกมสน าตาลแดง ถง ด า มนวาว กานตดดานขางสเดยวกบหมวก กนได มคณสมบตทางเภสชศาสตร

เหดหงสสม ( Ganoderma valesiacum)

เกบตวอยาง จากอ าเภอ ควนโดน จงหวดสตล

ด อ ก เ ห ด ม ข น า ด 5.0-10.0 เซนตเมตร ดอกเหดมรปทรงคลายพด มสสมแดง สซดจางลงเ ม อ อ าย ม ากข น ด า น ใ ต ม สเดยวกบสผว หรอมสทเขมกวาสผว เปนซาโปรไฟอยกบตนไม

39

ตำรำงท 3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดหลนจอทพบในเขตภาคใตตอนลาง (ตอ)

เหดสมนไพร พนทเกบตวอยำง ลกษณะทำงสณฐำนวทยำ

เหดจวกง (Amauroderma rugosum (Blume. & T.Nees.) Tor.)

เกบตวอยาง จากอ าเภอ เมอง จงหวดสตล

เ ป น เ ห ด ท จ ด อ ย ใ น Order Ganodermatales มห ม วก เหดทรงกลม หรอทรงร ดอกเหดมขนาด 2.0-20 เซนตเมตร ผวเรยบมนวาว มกงอกออกมาจากตนไมใหญ

เหดตะป/ ดรรชนนางไม (Xylaria polymorpha)

เกบตวอยาง จากอ าเภอ เมอง จงหวดสตล

ดอกเหดกลมถงคอนขางกลม ขนาด 1.0-3.0เซนตเมตร มรปรางคลายกระบอก มกานสนมาก มสด าทงดอก

เหดดนหมมวงด า

(Daldania concentrica)

เกบตวอยางจาก อ าเภอปาปอน จงหวดพทลง

ดอกเหดกลมถงคอนขางกลม ขนาด 1.5-6.0 เซนตเมตร เกดเปนกลมหรอเดยว ผวเรยบสมวง มวงอมด า ถงสด า ผาภายในมวงขาวสลบด าเปนชนๆ ขอบนอกสดมสด า

เหดปะการงหนามสเทา (Clavulina cinerea)

เกบตวอย าง เหดจากอ า เ ภ อ รฐภม จงหวดสงขลา

ดอกเหดมทรงพ มส ง 4.5-8.0 เ ซ น ต เ ม ต ร ก ว า ง 2.5-3.0 เซนตเมตร ประกอบดวยแขนงหลายแขนงออกจากโคนเดยวกน ปลายกงแตกเปน 2 แฉก ปลายแหลมหรอท มสเทา

40

ตำรำงท 3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดหลนจอทพบในเขตภาคใตตอนลาง (ตอ)

เหดสมนไพร พนทเกบตวอยำง ลกษณะทำงสณฐำนวทยำ

เหดหลนจอสแดง

(Ganoderma lucidum)

เกบตวอย าง เหดจากอ าเภอหาดใหญ จงหวดสงขลา

ดอกเหดมขนาด3-3.5 ซม. มสน า ต า ลแดงถ ง สน า ต า ล เขม ลกษณะเปนรปพด ผวเรยบเปนมนวาว ขอบของดอกเหดมสขาวอมเหลอง กานดอกมสน าตาลเขม ยาวประมาณ 2.5-3.0 เซนตเมตร

เหดปะการงหนามมวง (Ramariopsis pulchella)

เกบตวอยางเหดจากอ าเภอรตภม จงหวดสงขลา

ดอกเหดเกอดเปนกลม เปนพม สงประมาณ 8 ซม. กวาง 7 ซม. ประกอบดวยกานหลายกานมกบดตว โคนกานอาจเชอมตอหรอแยก การแตกกงแตกเปน 2 แฉกเสมอ 3-4 ครง ลกษณะของงามแฉกเปนรปโคง ปลายของแขนงมน สมวงขนถงสครมอมชมพ เปราะ หกงาย สมวงไมเปลยนสเมอหก

เหดปะการงออนเหลองนวล

(Ramaria concolor)

เกบตวอยางเหดจากอ าเภอ รตภม จงหวดสงขลา

ดอกเหดขนาดกลางทรงพม แผกวาง 5-15 ซม. สงถง 10 ซม. ดอกรปรางและสคลายปะการงออน มโคน 1 โคน โคนอวน สเหลองหรอ เหลองอมน าตาลเหมอนกนตลอด แตกแขนงจากสวนโคน แขนงกลวง แขนกแตกออกเปนแฉก โคนแขนงสเหลองหมน ปลายแขนงมสเดยวกน ผวไมมรอยยน พบชวงกลางถงปลายฤดฝน

41

ตำรำงท 3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดหลนจอทพบในเขตภาคใตตอนลาง (ตอ)

เหดสมนไพร พนทเกบตวอยำง ลกษณะทำงสณฐำนวทยำ

เหดหงสมวงกหลาบ (Fomitopsis feei (Fr.) Ryv)

เกบตวอยางจาก อ าเภอ ควนโดน จงหวดสตล

ดอกเหดขนาดกวาง 3-10 ซม. ผวดอกสแดงถงส เทาชมพหรอน าตาลอมชมพ เมออายมากขนมขนละเอยด ผวเรยบ ผวดอกไมแตก ผวใตดอกออกสชมพ แลวเปลยนเปนสน าตาลแดง พบบนตอไม ออกดอกเดยวหรอเกาะกนเปนกลม ขอบดอกอาจเชอมตอกน พบบนตอไมสนมากกวาบนไมยนตนทวไป พบไดตลอดป

เหดหงเขาวงกตบาง (Daedaleopsis confragosa)

เกบตวอยางจาก อ าเภอควนโดน จงหวดสตล

ดอกเหดขนาด 3-15.5 ซม. รปรางแบนบางคลายพด ครงวงกลม ไมมกาน แขง ผวดอกไมเรยบ มวงแหวนสเขมออนซอนกน สฟางขาว เหลองอมน าตาลถงน าตาลอมสม ด าคล า ขอบหมวกบาง เนอดอกสขาวหรอน าตาลจาง ดานใตดอกมรยาวคลายครบ พบเปนกลมหรอเดยวบนไมเนอแขงทตายแลว

เหดหนงชาง

(Amauroderma amoiense)

เกบตวอยางจาก อ าเภอปาปอน จงหวดพทลง

ดอกเหดเกดดอกเดยวขนาด 20-25 ซม. ลกษณะดอกคอนขางกลม แผแบน ผวหมวกดอกปกคลมดวยขนเลกๆคลายก ามะหย มลกษณะเปนวงสน าตาลด าสลบน าตาลอมชมพ ผวเปนลอนคลนขนาดเลกสลบใหญตามรศมของดอก กานดอกตดตรงกงกลางดอกหรอ เยอง เลก นอย กานคอนขางกลม เนอดอกสจางกวาสผวดอก ใตหมวกมรสขาว เจรญมาจากรากไมทฝงจมดน

42

ตำรำงท 3.1 ลกษณะทางสณฐานวทยาของเหดหลนจอทพบในเขตภาคใตตอนลาง (ตอ)

เหดสมนไพร พนทเกบตวอยำง ลกษณะทำงสณฐำนวทยำ

เหดหลนจอด าดาน (Amauroderma rugosum)

เกบตวอยางจาก อ าเภอ ปาปอน จงหวดพทลง

ดอกเหดเกดดอกเดยวหรอเปนกลม ขนาดกวาง 4-4.5 ซม. ยาว 4-4.5 ซม. ดอกทรงจวก ผวหมวกดอกปกคลมดวยขนละเอยดคลายก ามะหย สน าตาลด าสลบจางมองดเปนวงซอนกน กานดอกตดตรงกลางหรอดานหลง เนอดอกสเหลองถงสเนอ ดานใตหมวกสขาวถงเทา ผวของรสขาวถงสครม เมอสมผสเปลยนจากสแดงสดเปนสด า เจรญเตบโตบนพนดน

3.1.2 ผลกำรวเครำะหกำรเจรญของเสนใยเหดสมนไพร ปรมำณสำรเอนโดพอลแซคคำไรด และ Endo-ß-1,3-glucan

3.1.2.1 ผลกำรทดสอบลกษณะกำรเจรญของเสนใยเหดสมนไพร จากผลการทดสอบการเจรญเตบโตของเหดสมนไพรทเกบไดจากภาคใตตอนลางทง 15

ชนด บนอาหารแขงพดเอเปนระยะเวลา 20 วน พบวาเชอเหดสมนไพร 7 ชนด ไดแก เหดตะป/ดรรชนนางไม เหดปะการงหนามสเทา เหดปะการงหนามมวง เหดปะการงออนเหลอง เหดดนหมมวงด า เหดหนงชาง และเหดหลนจอน าตาลแดงด า มการเจรญเตบโตบนอาหารแขงพดเอจนเตมจานเลยงเชอในระยะเวลาการเพาะเลยง 9-15 วน โดยมขนาดเสนผานศนยกลางของโคโลนของเสนใยเชอเหดสมนไพรอยท 9 เซนตเมตร สวนเหดสมนไพรทเหลอจะหยดการเจรญเตบทระยะเวลา 9-20 วน โดยมขนาดเสนผานศนยกลางของโคโลนของเสนใยเชอเหดสมนไพรอยในชวง 4.1-8.8เซนตเมตร (รปท 3.1)

ลกษณะเสนใยของเหดสมนไพรทกชนดทเจรญเตบโตบนอาหารแขงพดเอจะยดเกาะกนหนาแนนกบพนผวดานบนของตวอาหารแขง โดยเสนใยในระยะแรกของการเจรญเตบโตจะมสขาวเมอผานไป 10-12 วน เสนใยของเหดสมนไพรบางชนดจะมการเปลยนส โดยจะเรมเปลยนจากตรงกลางของโคโลนแลวคอยๆขยายไปเรอยๆ จนมสเขมเมอท าการเพาะเลยงครบ 20 วน เชน เหดหลนจอด าดาน เหดหนงชาง เหดหงสสม เหดหงมวงกหลาบ และเหดปะการงออนเหลองนวล สของเสนใยจะคอยๆเปลยนจากสขาวเปนสเหลองออนในวนทายๆของระยะเวลาการเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอ สวนเหดหลนจอกะละแมด าเสนใยจะเปลยนเปนสสมออนใน

43

วนทายๆของการเพาะเลยง เหดดนหมมวงด าและเหดปะการงหนามมวงจะเปลยนเปนสน าตาลออน และเหดตะป/ดรรชนนางไมจะเปลยนเปนสด าในวนทายๆของการเพาะเลยง(รปท 3.2) สทเกดขนเกดจากของเสยทเหดปลดปลอยออกมาจากกระบวนการเมตาบอลซมของเสนใยเหดทจะเปลยนน าตาลกลโคลสไปเปนคารบอนเพอนน าไปใชในการเจรญเตบโตของเสนใยเหด โดยจะเปลยนเปนสเหลองถงสน าตาลเขมเมอระยะเวลาการเพาะเลยงเพมขน (นงลกษณ สวรรณพนจ และปรชา สวรรณพนจ, 2552)

รปท 3.1 ลกษณะการเจรญเสนใยของเหดสมนไพรเมอเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอ ในสภาวะมด ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 20 วน

เหดหลนจอด าดาน

เหดหลนจอน าตาลแดงด า

เหดหลนจอขอบเหลอง

รปท 3.2 การเจรญเตบโตของโคโลนของเหดสมนไพรทเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอ

ขนำด

เสนผ

ำนศน

ยกลำ

งโคโลน

(ซ.ม)

ระยะเวลำ (วน)

44

ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส

เหดหลนจอสแดง

เหดหลนจอกะละแมด า

เหดจวกง

เหดหงสสม

เหดดนหมมวงด า

เหดหนงชาง

เหดหงเขาวงกตบาง

เหดปะการงหนาสเทา

เหดหงมวงกหลาบ

เหดตะป/ดรรชนนางไม

เหดปะการงหนามมวง

เหดปะการงออนเหลองนวล

รปท 3.2 การเจรญเตบโตของโคโลนของเหดสมนไพรทเพาะเลยงบนอาหารแขงพดเอใน สภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส (ตอ)

45

3.1.2.2 กำรทดสอบกำรเจรญของเสนใยเหดสมนไพรในอำหำรเหลวเอสพดบ จากการทดสอบความสามารถในการเจรญของเหดสมนไพรทเกบไดจากภาคใตตอนลาง

โดยเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ ในสภาวะนง และมด ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส พบวา เชอเหดสมนไพรทกสายพนธสามารถเจรญเตบโตไดดในอาหารเหลวเอสพดบ ประกอบดวยมนเทศ 250 กรม กลโคส 20 กรม เปปโทน 1 กรม วตามนบหก 0.5 กรม และแคลเซยมคลอไรด 1.3 กรม ตออาหาร 1 ลตร ในชวงแรกของการเจรญเตบโตเสนใยของเชอเหดจะมสขาวเมอเพาะเลยงไปได 5-8 วน และเสนใยของเชอเหดเจรญเตบโตจนเตมฟลาสกหลงการเพาะเลยงเปนระยะเวลา 10 วน ซงลกษณะสและความหนาแนนของเสนใยเหดจะเปลยนไปตามแตละชนดของเหด หลงจากเกบเกยวเสนใยเหดและน าไปท าแหงแวจงน าไปสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด ซงมผลการทดลองดงตอไปน

1) ผลกำรวเครำะหปรมำณสำรเอนโดพอลแซคคำไรด จากการวเคราะหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดจากเหดสมนไพรทเกบไดจากภาคใตตอนลางทง 15 ชนด ทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ พบวาเชอเหดหงเขาวงกตบาง เหดหลนจอขอบเหลอง เหดหนงชาง เหดหลนจอด าดาน และเหดจวกง ใหปรมาณสารเอนโด พอลแซคคาไรดสงสดอยในชวง 1,052.14-1,429.83 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง (รปท 3.3) โดยเชอเหดหงเขาวงกตบางจะใหปรมาณสารโพลแซคคาไรสงสดท 1,429.83 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหงรองลงมาคอเชอเหดหลนจอขอบเหลองท 1,231.14 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง เมอเปรยบเทยบกบเหดสมนไพรชนดอนๆ ไดแก เหดนางฟา เหดหหนสน าตาล เหดนางรมฮงการ และเหดเปาออ ทศกษาและวจยโดย สวทย สวรรณโณ และศรรวรรณ มากสวรรณ (2553) พบวาเหดสมนไพรดงกลาวมปรมาณสารโพลแซคคาไรดอยในชวง 190 -330 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง ซงมปรมาณสารโพลแซคคาไรดนอยกวาเหดหงเขาวงกตบาง เหดหลนจอขอบเหลอง เหดหนงชาง เหดหลนจอด าดาน และเหดจวกง ทใหปรมาณสารโพลแซคคาไรดสงสดในชวง 1,052.14-1,429.83 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง และเมอเปรยบเทยบกบปรมาณสารโพลแซคคาไรดทไดจากเหดหลนจอพนธลกผสม 5 สายพนธ ทศกษาวจยโดย มกดา คหรญ และปารชาต ภสวาง (2545) ซงพบวาปรมาณของโพลแซคคาไรดทไดจากเหดหลนจอพนธลกผสม 5 สายพนธอยในชวง 24,780-48.940 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง ซงมปรมาณมากกวาสารโพลแซคคาไรดทพบในเหดหงเขาวงกตบาง เหดหลนจอขอบเหลอง เหดหนงชาง เหดหลนจอด าดาน และเหดจวกง สวน

46

รปท 3.3 ปรมาณสารเอนโดโพลแซคคาไรดของตวอยางเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลว เอสพดบ ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10 วน

2) ผลกำรวเครำะหปรมำณสำร Endo-ß-1,3-glucan

ผลการวเคราะหปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan ทไดจากเสนใยแหงของเหดสมนไพรทง 15 สายพนธ ทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ พบวาเหดหลนจอขอบเหลอง เหดจวกง และเหดหลนจอกะละแมด าสามารถผลตสาร Endo-ß-1,3-glucan ปรมาณสงสดอยในชวง 7,064.88-9,021.56 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง (รปท 3.4) โดยเชอเหดหลนจอขอบเหลองใหปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan สงสดท 9,021.56 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง รองลงมาคอเชอเหดจวกงท 8,924.21 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง เมอเทยบกบปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan ทไดจากเหดตระกลนางรม (Pleurotus ostreatus, Pleurotus enyngii, Pleurotus pulmunarius) ซงอยในชวง 2,200-5,300 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลลแหง (Manzi and Pizzoferrato, 2000) เหดหลนจอขอบเหลอง เหดจวกง และเหดหลนจอกะละ แมด าจะมปรมาณสารเอนโดเบตากลแคนมากกวา

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

ตวอยำงเหดสมนไพร

โพลแ

ซคคำ

ไรด

(ไมโครก

รมตอ

กรมน

ำหนก

เซลล

แหง)

47

แตจากผลการวเคราะหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดจากเหดสมนไพรทง 15 สายพนธจะเหนไดวาปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด มคานอยกวาปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan ทงนเนองมาจากในขนตอนการวเคราะหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดนน ไดใชน าตาลกลโคสเปนสารละลายมาตรฐานเพยงชนดเดยวเพอเปรยบเทยบความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดได ซงในสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดนน ยงมน าตาลชนดอนทไมใชน าตาลกลโคสเปนสวนประกอบทผสมอยดวย เมอท าการวเคราะหจงไมมปรมาณน าตาลชนดอนๆ ท าใหผลการวเคราะหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดทไดมปรมาณนอยกวา (Wasser, 2002) ในการคดเลอกสายพนธเหดสมนไพร การวเคราะหสารพอลแซคคาไรดทได จะเลอกพจารณาเฉพาะสวนของสารพอลแซคคาไรดทไดจากสกดจากเสนใยเหดหลนจอซงอยในรปของสารเอนโดพอลแซคคาไรด เนองจากการทดลองทเลอก ใชวธการเพาะเลยงเสนใยเหดแบบนง ท าใหเสนใยเหดผลตสารพอลแซคคาไรดออกมาในรปของเอนโดพอลแซคคาไรดมากกวาเอกโซพอลแซคคาไรด จงเลอกพจารณาสารทผลตออกมาไดในสดสวนทมากกวา และอยากใหเกดความหลากหลายของงานวจย เนองจากงานวจยอนๆกอนหนานสวนใหญจะใหความสนใจเฉพาะสารเอกโซพอลแซคคาไรดเทานน (Lee et al., 2007)

รปท 3.4 ปรมาณสาร Endo-ß-1,3-glucan ของตวอยางเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ ในสภาวะมด อณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10 วน

0

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

9,000

10,000

ตวอยำงเหดสมนไพร

เบตำ

กลแค

น (ไม

โครก

รมตอ

กรมน

ำหนก

เซลล

48

จากผลการทดสอบความสามารถในการเจรญเตบโต การผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดสมนไพรทง 15 สายพนธ เหนไดวาเหดหลนจอขอบเหลองและเหดหลนจอกะละแมด ามความสามารถในการเจรญเตบโตในอาหารเหลวเอสพดบไดดกวาเหดสมนไพรสายพนธ โดยเฉพาะเหดหลนจอขอบเหลองนอกจากจะสามารถเจรญเตบโตไดดในอาหารเหลวเอสพดบแลวยงสามารถผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ไดปรมาณสงสด ดงนนจงคดเลอกเหดหลนจอขอบเหลองส าหรบใชในการทดลองขนตอนตอไป

3.2 ผลกำรศกษำสภำวะทเหมำะสมตอกำรผลตสำรพอลแซคคำไรดของเหดหลนจอในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม

3.2.1 ผลกำรศกษำองคประกอบทำงเคมของน ำทงจำกโรงงำนสกดน ำมนปำลม จากการศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม (จากบอท 3 ของระบบบ าบดน าทงแบบ Facultative pond พบวาคาพเอชเทากบ 7.93 คาซโอดเทากบ 7,286.4 มลลกรมตอลตร คาของแขงทงหมดอยท 13 ,620 มลลกรมตอลตร สวนปรมาณธาตอาหารอนๆในน าทง ไดแก คารโบไฮเดรต ไนโตรเจน ฟอสฟอรส โพแทสเซยม เหลก และสารประกอบฟนอล อยท 4.30, 436.66, 14.96, 280.10, 0.93 และ 80.40 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ (ตารางท 3.2) ตามรายงานของ Rupani และคณะ (2010) และ Wu และคณะ (2007) พบวา น าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมคาพเอชเทากบ 4.7 ของแขงทงหมดเทากบ 25,000 มลลกรมตอลตร ซโอดเทากบ 40,563 มลลกรมตอลตร สวนปรมาณแรธาตในน าทง ไดแก ไนโตรเจนทงหมด ฟอสฟอรสทงหมด เหลก โพแทสเซยม มคาเทากบ 750 , 180, 46.5, และ 2,270 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ สวน Bunrung และคณะ (2014) รายงานปรมาณของสารประกอบฟนอลในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไวท 965 มลลกรมตอลตร เมอเปรยบเทยบกนแลวองคประกอบทางเคมทวเคราะหไดจะมคาต ากวาคาทเคยรายงายไว เนองจากน าทงจากตอนกลางของระบบบ าบดจะเกดกระบวนการบ าบดไปบางบางสวนแลว ท าใหสารอนทรยทอยในน าทงมปรมาณความเขมขนลดลง แตยงคงเหลอสารอาหารสวนทเปนประโยชน ดงนนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมนาจะน าไปใชเปนอาหารส าหรบการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอได

49

ตำรำงท 3.2 ผลการวเคราะหองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

องคประกอบทำงเคม ปรมำณทพบในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม pH Chemical Oxygen Demand Total Solids Carbohydrate Total Kjeldahl Nitrogen Total Phosphorus Total Potassium Iron Phenols C:N ratio

7.93 7,286.4 mg/l 13,620 mg/l 4.30 mg/l 436.66 mg/l 14.96 mg/l 280.1 mg/l 0.93 mg/l 80.40 mg/l 21

3.2.2 ผลกำรเตรยมเชอเรมตน จากการคดเลอกสายพนธเหดหลนจอจากขอ 3.1 น าเชอเหดหลนจอทไดมา

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะนง ดวยวธ Disk inoculum พบวา เชอเหดหลนจอขอบเหลองไมสามารถเจรญไดเมอน าไปเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม จงไดท าการแกปญหาโดยเปลยนรปแบบการเตรยมเชอเรมตน ดวยการทดลองใชวธ Seed inoculum ทดแทนการเตรยมเชอเรมตนแบบเกา

โดยการน าเชอเหดหลนจอทเพาะเลยงไวบนอาหารแขงพดเอ ตดดวยคอรกบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร จ านวน 2 ชน เพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ ปรมาณ 100 มลลลตร ในฟลาสกขนาด 250 มลลลตร เพาะเลยงบนเครองเขยาทความเรว 120 รอบตอนาท ทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน หลงจากนนจงกรองแยก Seed และลางดวยน ากลนทผานการฆาเชอ 3 ครง แลวน า Seed ทไดใชเปนเชอเรมตน รอยละ 7 โดยปรมาตร เพอน าไปเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเชนเดยวกบวธ Disk inoculum พบวา วธการเตรยมเชอเรมตนแบบ Seed inoculum เสนใยเหดหลนจอขอบเหลองสามรถเจรญไดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม โดยเสนใยเหดจะเกดการเจรญเตบโตลอยอยบนผวหนาของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ลกษณะของเสนใยมสขาว จบตวกนเปนแผนบางๆ ใหน าหนกเสนใยแหง 0.6 กรมตอลตร หลงเพาะเลยงเปนระยะเวลา 16 วน

การเตรยมเชอดวยวธ Disk inoculum เสนใยเหดไมสามารถเจรญในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมได ทงนอาจเกดจากลกษณะของเชอทเปนเสนใยอยบนอาหารแขง เมอน าไปใสลงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมโดยตรงท าใหเชอตองเกดการปรบตวโดยจะอยในระยะ lag phase เปนระยะเวลานานเพอปรบตวใหเขากบสภาพของน าทงโรงงานสกดน ามน

50

ปาลม โดยวธนจะท าใหเชอเจรญเตบโตไดต าเนองจากมสภาวะกดดนสงจากสภาพแวดลอมของอาหารทเปลยนจากของแขงเปนของเหลว สวนวธการเตรยมเชอเรมตนแบบ Seed inoculum น เสนใยของเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบกอนแลวน าไปเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจะสามารถปรบตวไดมากกวาเนองจากสภาวะกดดนจากสภาพแวดลอมของอาหารนอยกวาจงท าใหเสนใยของเหดเจรญเตบโตไดสง นอกจากนลกษณะของเชอทเลยงในอาหารเหลวกอนจะเปน Pellet และมสารเมอกหมอยรอบๆ ซงสามารถชวยในการปรบตวเมออยในอาหารทอาจมสารพษไดดกวาเชอทอยลกษณะเปนเสนใยโดยทวไปจงมกใชวธ Pre-culture เพอใหเชอไดปรบสภาพ (Acclimatization) และท าใหไดผลผลตสดทายทดกวา (Wagner et al., 2003)

นอกจากนยงสงเกตไดวา ในขนตอนนเสนใยเหดหลนจอทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม จะใหปรมาณเสนใยนอยกวาทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ เนองจากในน าทงมปรมาณน าตาลทเปนองคประกอบทส าคญตอการเจรญของเสนใยนอยกวาในอาหารเหลวเอสพดบทมสวนผสมของมนเทศ โดยในมนเทศจะมน าตาลหลายชนดทสามารถใชเปนแหลงพลงงานได เชน ฟรกโทส กลโคส และซโครส เปนตน (Aoki and Jongjeen, 2009) หากน าน าตาลชนดเหลานไปเตมในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจะชวยในการเพมปรมาณเสนใยทผลตได

3.2.3 ผลกำรศกษำระยะเวลำทเหมำะสมของกำรเตรยม Seed inoculum จากการศกษาพบวา Seed inoculum ทเพาะเลยงเปนระยะเวลา 7 วน ใหน าหนก

เสนใยแหงของเชอเหดหลนจอขอบเหลองสงสด ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบ Seed inoculum ทระยะเวลาอนๆ โดย Seed inoculum ทระยะเวลา 7 วน ใหน าหนกเสนใยแหง 1.8 กรมตอลตร สวนทระยะเวลา 3 และ 5 วน ใหน าหนกเสนใยแหง 1.242 และ 1.430 กรมตอลตร หลงเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนระยะเวลา 9 วน (รปท 3.5) ซงผลการทดลองสอดคลองกบงานวจยของ Chandra และ shoji (2007) ทใชเชอเรมตนของ Lyophyllum decastes ทระยะเวลา 7 วน เพาะเลยงในอาหารวายเอฟเอม (Yeast fermentation medium: YFM) บนเครองเขยาความเรว 125 รอบตอนาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10 วน โดยใหน าหนกเสนใยแหงสงสดท 6.36 กรมตอลตร และปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดสงสดท 0.32 กรมตอกรมเสนใยแหง

Seed inoculum ทเพาะเลยงเปนระยะเวลา 7 วน เปนระยะเวลาทเหมาะสมเน องจากเปนชวงเวลาทเหดหลนจอขอบเหลองอยในชวง Log phase ซงเสนใยมการเจรญเตบโตอยางรวดเรว ท าใหไดปรมาณเสนใยแหงสงสดหลงน าไปเพาะเลยงตอในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม นอกจากนSeed inoculum ทระยะเวลา 7 วน จะมขนาด Pellet ใหญ

51

กวาทระยะเวลาอนๆ ท าใหสามารถปรบตวเขากบสภาพของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไดดกวา ดงนนจงเลอกใช Seed inoculum ทระยะเวลา 7 วน ในการศกษาขนตอนตอไป

รปท 3.5 ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทระยะเวลา Seed inoculum ตางๆ หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95

(p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 9 ของการทดลอง

3.2.4 ผลกำรศกษำคำพเอชเรมตนทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดหลนจอ จากการศกษาคาพเอชเรมตนของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบ 4, 5, 6, 7 และ 7.93 (ชดควบคม) เมอเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองโดยใชเชอเรมตนทเหมาะสมจากขอ 3.2.3 เพาะเลยงในสภาวะนง และมด ทอณหภมหอง เปนระยะเวลา 16 วน พบวา พเอชเรมตนของอาหารเทากบ 6 ใหน าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองสงสดเทากบ 1.201 กรมน าหนกแหงตอลตร ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทระดบพเอชเรมตนอนๆ โดยทระดบพเอชเรมตนเทากบ 4, 5 ,7 และ 7.93 ใหน าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลอง 0.752, 0.986, 0.875 และ 0.609 กรมน าหนกแหงตอลตร ตามล าดบ (รปท 3.6)

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

0 3 6 9

3 days-inoculum

5 days-inoculum

7 days-inoculum

น ำหน

กเสน

ใย(กรม

น ำหน

กแหง

ตอลต

ร)

ระยะเวลำ (วน)

a

b

c

52

รปท 3.6 ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทระดบพเอชเรมตนตางๆ เมอ

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

ผลการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองท

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 16 วน ทระดบพเอชเรมตนเทากบ 4, 5, 6, 7 และ 7.93 (ชดควบคม) พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสาร เอนโดพอลแซคคาไรด ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทระดบพเอชเรมตนอนๆ โดยทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดเทากบ 0.33 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง สวนทระดบพเอชเรมตน 4, 5 ,7 และ 7.93 ใหปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดเทากบ 0.25, 0.29, 0.21 และ 0.12 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.7 ก)

สวนผลการสกดสาร Endo-ß-1,3-glucan พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสาร Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทระดบพเอชเรมตนอนๆ โดยทระดบพเอชเรมตนเทากบ ใหปรมาณ Endo-ß-1,3-glucan เทากบ 0.15 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง สวนทระดบพ

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 4 8 12 16

pH 4 pH 5

pH 6 pH 7

pH 7.93

น ำหน

กเสน

ใย(กรม

น ำหน

กแหง

ตอ

ระยะเวลำ(วน)

a

bcde

53

เอชเรมตน 4, 5 ,7 และ 7.93 ใหปรมาณ Endo-ß-1,3-glucan เทากบ 0.07, 0.12, 0.12 และ 0.09 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.7 ข) ซงระดบพเอชทใหผลผลตสงสดสอดคลองกบงานวจยของ Fang และ Zhong (2002) พบวาในการการเพาะเลยง Ganoderma lucidum ทคาพเอชเรมตนเทากบ 6.5 ไดผลผลตของชวมวลสงสดท 17.3 กรมตอลตรโดยน าหนกแหง สวนเอนโดพอลแซคคาไรดไดผลผลตสงสดในชวงของคาพเอช 5.5-7.0 ซงคาพเอชเรมตนทเหมาะสมของอาหารจะมผลตอการละลายของเกลอในอาหาร รปราง และขนาดของเซลล การท างานของผนงเซลล การล าเลยงสารอาหาร กจกรรมของเอนไซม ซงจะชวยสงเสรมใหการสรางผลผลตของเซลลเพมขน (Elisashvili, 2012)

ก ข

รปท 3.7 ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด (ก) และ Endo-ß-1,3-glucan (ข) ของเหดหลนจอขอบเหลองทระดบพเอชเรมตนตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

จากผลการศกษาความสามารถในการเจรญเตบโต การผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด

และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 4, 5, 6, 7 และ 7.93 (ชดควบคม) เหนไดวา เหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 สามารถ

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 7.93

Endopolysaccharide

ปรมำ

ณเอนโดพ

อลแซ

คคำไรด

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

ระดบ pH

a

cb

d

e

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 7.93

Endo-ß-1,3-glucan

ปรมำ

ณ E

ndo-

ß-1,3

-gluc

an(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

ระดบ pH

a

c

bd

e

54

เจรญเตบโต ผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสด ซงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทระดบพเอชเรมตนอนๆ ดงนนจงคดเลอกน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 ส าหรบใชในการทดลองขนตอนตอไป

3.2.5 ผลกำรศกษำอตรำสวนคำรบอนตอไนโตรเจนทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดหลนจอ

จากการศกษาการเพาะเลยงเชอเหดหลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 40, 60, 80 และ 21 (ชดควบคม) โดยใชคาพเอชเรมตนทเหมาะสมจากขอ 3.2.4 เพาะเลยงในสภาวะนง และมด ทอณหภมหอง เปนระยะเวลา 16 วน พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถเจรญเตบโตไดดทสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนอนๆ โดยทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 16 เทากบ 2.276 กรมน าหนกแหงตอลตร สวนทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 60, 80 และ 21 น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 16 เทากบ 0.619, 1.624, 1.073 และ 0.450 กรมน าหนกแหงตอลตร ตามล าดบ (รปท 3.8)

ผลการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 16 วน ทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 40, 60, 80 และ 21 (ชดควบคม) พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนอนๆ โดยทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 มความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0.36 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง สวนทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 60, 80 และ 21 ความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0.18, 0.24, 0.19 และ 0.12 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง (รปท 3.9 ก)

สวนผลการสกดสาร Endo-ß-1,3-glucan จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 16 วน ทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 40, 60, 80 และ 21 (ชดควบคม) พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลต Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนอนๆ โดยท

55

อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 มความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 0.22 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง สวนทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 60, 80 และ 21 ความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 0.12, 0.14, 0.12 และ 0.09 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.9 ข) จากผลการทดลองทไดสอดคลองกบรายงานของ Lee และคณะ (2007) ทเพาะเลยงเหดหลนจอหชาง (Ganoderma applanatum KFRI 646) ใน Basal medium ทมการปรบระดบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน โดยใชความเขมขนของกลโคสคงทท 40 กรมตอลตร แลวปรบความเขมขนของไนโตรเจน พบวา เมอระดบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 43 จะผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรดปรมาณสงสด 2.4 กรมตอลตร และเมอระดบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนสงขนปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรดจะลดลง สวนปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรดการปรบระดบอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนไมมผลตอการผลต นอกจากนยงพบวาอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนซงมผลตอกระบวนการเมตาบอลซมของเหดหลนจอสแดงจะแตกตางกนเมอมสายพนธตางกน (Yuan et al., 2012)

รปท 3.8 ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน

ตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.8

0 4 8 12 16

C:N=20 C:N=40 C:N=60

C:N=80 C:N=21

น ำหน

กเสน

ใย (ก

รมน ำ

หนกแ

หงตอ

ลตร)

ระยะเวลำ(วน)

a

b

c

d

e

56

ก ข

รปท 3.9 ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด (ก) และ Endo-ß-1,3-glucan (ข) ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

การเลอกชวงของอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทใชในทดลองมคาสง เนองจากใน

กระบวนการการเจรญเตบโตของเสนใยเหดตองใชคารบอนเปนแหลงพลงงาน เมอคารบอนทไดจากอาหารหมดลงนน เสนใยจะน าสารพอลแซคคาไรดทเกบไวในเซลลมาใชเปนแหลงพลงงานทดแทน การเลอกใชอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทต าเกนไปอาจท าใหไดผลผลตของสารพอลแซคคาไรดลดลง (Hsieh et al., 2005)

ในการเพาะเลยงเหดแหลงคารบอนเปนองคประกอบหลกทส าคญในอาหารซงสงผลตอการเจรญเตบโตและกระบวนการผลตสารตางๆของเหด แหลงคารบอนสวนใหญทใชสวนใหญคอ กลโคส แลกโทส และซโครส จากงานวจยของ Tang และ Zhong (2002) พบวาแหลงคารบอนทใชในการเพาะเลยง Ganoderma lucidum มผลตอการผลตสารพอลแซคคาไรด และกรดกาโนเดอรก โดยในการผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด กรดกาโนเดอรก และน าหนกเสนใยแหง แหลงคารบอนทเปนแลกโทสจะใหผลผลตสงสด รองลงมาคอ กลโคส และซโครส ตามล าดบ สวนปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรด และอตราการเจรญตอวน แหลงคารบอนท

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

C:N=20 C:N=40 C:N=60 C:N=80 C:N=21

Endopolysaccharideปร

มำณเอนโดพ

อลแซ

คคำไรด

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

d

a

b

c

e

0.0

0.1

0.2

0.3

C:N=20 C:N=40 C:N=60 C:N=80 C:N=21

Endo-ß-1,3-glucan

ปรมำ

ณEn

do-ß

-1,3-

gluc

an (ม

ลลกร

มตอก

รมเสนใ

ยแหง

)

d

a

bc

e

57

เปนซโครสจะใหผลผลตสงสด รองลงมาคอ กลโคส และแลกโทส ตามล าดบ ซงในการน าไปประยกตใชในเชงพาณชยนน แหลงคารบอนทเปนซโครส เชน น าตาลทรายแดง (Brown sugar) จะมราคาต ากวากลโคส และแลกโทส สามารถชวยลดตนทนในการผลตได ซงจากงานวจยของ Chang และคณะ (2006) พบวาเมอเพาะเลยง Ganoderma lucidum โดยใชน าตาลทรายแดงเปนแหลงคารบอน จะใหน าหนกเสนใยแหง และปรมาณสารพอลแซคคาไรดสงกวาแหลงคารบอนทเปนกลโคส และแลกโทส

แหลงไนโตรเจนกเปนอกปจจยหนงทส าคญในอาหารเพาะเลยงเหด โดยไนโตรเจนมความส าคญตอกระบวนการสงเคราะหเอนไซมบางชนดและกระบวนการเมตาบอลซมในเหด แหลงไนโตรเจนสวนใหญทใชจะอยในรปของ แอมโมเนยมไนเตรตไอออน หรอสารอนทรย (เชน กรดอะมโน หรอโปรตน) อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนจงเปนปจจยส าคญทมผลตอการเจรญเตบโตของเสนใย และการสงเคราะหสารพอลแซคคาไรดในการเพาะเลยงเหดหลนจอ (Elisashvili, 2012)

จากผลการศกษาความสามารถในการเจรญเตบโต การผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 และอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 20, 40, 60, 80 และ 21 (ชดควบคม) เหนไดวา เหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 สามารถเจรญเตบโต ผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสด ซงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนอนๆ ดงนนจงคดเลอกน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 ส าหรบใชในการทดลองขนตอนตอไป

3.2.6 ผลกำรศกษำอตรำสวนแรธำตทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหดหลนจอ จากการศกษาการเพาะเลยงเชอเหดหลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอตราสวนแรธาต CaCl2:MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03, 6:0.5:1:0.06 และ 0:0:0:0 (ชดควบคม) มลลโมลตอลตร โดยใชคาพเอชเรมตนและอตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนทเหมาะสมจากขอ 3.2.5 เพาะเลยงในสภาวะนง และมด ทอณหภมหอง เปนระยะเวลา 16 วน พบวาเชอเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดดทสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนแรธาตอนๆ โดยทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 16 เทากบ 2.903 กรมน าหนกแหงตอลตร สวนทอตราสวนแรธาตเทากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03 และ 0:0:0:0 มลล

58

โมลตอลตร น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 16 เทากบ 2.227, 2.296 และ 0.610 กรมน าหนกแหงตอลตร ตามล าดบ (รปท 3.10)

รปท 3.10 ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนแรธาตตางๆ

(มลลโมลตอลตร) เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

ผลการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 16 วน ทอตราสวนแรธาต CaCl2 :MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03, 6:0.5:1:0.06 และ 0 :0:0:0 (ชดควบคม) มลลโมลตอลตร พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสารพอลแซคคาไรด ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนแรธาตอนๆ โดยทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร มความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0 .46 มลลกรม ต อกรม เสน ใยแหง ส วนทอต ราส วนแรธ า ต เท ากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03 และ 0:0:0:0 มลลโมลตอลตร ความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0.23, 0.30 และ 0.12 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง (รปท 3.11 ก)

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.0

0 4 8 12 16

3:0.1:0.3:0.0154.5:0.3:0.5:0.036:0.5:1:0.060:0:0:0

น ำหน

กเสน

ใย(กรม

น ำหน

กแหง

ตอลต

ร)

ระยะเวลำ (วน)

a

b

c

b

59

ก ข

รปท 3.11 ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด (ก) และ Endo-ß-1,3-glucan (ข) ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราสวนแรธาตตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 16 ของการทดลอง

สวนผลการสกดสาร Endo-ß-1,3-glucan พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลต

สาร Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนแรธาตอนๆ โดยทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร มความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 0.28 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง สวนทอตราสวนแรธาตเทากบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03 และ 0:0:0:0 มลลโมลตอลตร ความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 0.16, 0.19 และ 0.09 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง (รปท 3.11 ข) ผลการทดทองทไดมปรมาณสารเอนโดพอล แซคคาไรดนอยกวางานวจยของ Cui และ Zhang (2011) ทเพาะเลยง Ganoderma lucidum ใน Basal medium ทเตมแหลงแรธาตดวยสาร Na2SeO3, ZnSO4, MgSo4, FeSO4, และ CrSO4 ความเขมขน 25-200 ppm เลยงในสภาวะมด ทอณหภม 30 องศาเซลเซยส บนเครองเขยาความเรว 150 รอบตอนาท เปนระยะเวลา 5 วน

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Endopolysaccharide

อตรำสวนแรธำต (CaCl2:MgSO4:ZnCl2:FeSO4)

a

c

b

ปรมำ

ณเอนโดพ

อลแซ

คคำไรด

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

d

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Endo-ß-1,3-glucan

อตรำสวนแรธำต (CaCl2:MgSO4:ZnCl2:FeSO4)

a

cb

d

ปรมำ

ณEn

do-ß

-1,3-

gluc

an(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

60

พบวา Se2+ ทความเขมขน 20 ppm สรางสารเอนโดและเอกโซพอลแซคคาไรดสงสดทระดบ 183±10.2 และ 248±5.5 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ ในขณะท Zn2+ และ Fe2+ ทความเขมขน 50 ppm สรางสารเอนโดพอลแซคคาไรดสงสดทระดบ 170±0.8 และ 174±5.0 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ และสรางสารเอกโซพอลแซคคาไรดสงสดทระดบ 263±4.0 และ 254.3±8.0 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ สวน Mg2+ ไมมผลตอกระบวนการผลตสารพอลแซคคาไรด ตรงกนขามกบ Cr2+ ซงมผลตอการยบยงการผลตสารพอลแซคคาไรด นอกจากนยงพบวา ระดบความเขมขนของ Zn2+ และ Fe2+ ทเตมลงในอาหารมผลตอขนาดของ Pellet โดยเมอความเขมขนเพมขนขนาดของ Pellet จะมขนาดใหญขนดวย

จากงานวจยของ Kim และคณะ (2005) ทเพาะเลยง Agrocybe cylindracea ดวย Basal medium ในถงหมกขนาด 5 ลตร ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส อตราการเตมอากาศ 2 ลตรตอลตรตอนาท ความเรวการกวน 150 รอบตอนาท พเอชเรมตนเทากบ 6 เพาะเลยงเปนระยะเวลา 11 วน พบวา เมอเตม มอลโทส Martone A-1 MgSO4 และ CaCl2 ความเขมขนรอยละ 8, 0.4, 0.04 และ 0.11 ตามล าดบ จะผลตสารเอกโซพอลแซคคาไรดสงสดทระดบ 2.08 กรมตอลตร Ca2+ จะมผลตอกจกรรมของเอนไซมในเชอราซงเกยวของกบการขยายตวของผนงเซลล และความสามารถในการแทรกซมของสารทเยอหมเซลล สวน Mg2+ เปนแรธาตทจ าเปนตอเชอราในการท าหนาทเปน Cofactor ในปฏกรยาทเกยวของกบเอนไซม นอกจากนยงชวยรกษาสมดลของเยอหมเซลล

แรธาตหลายชนดเปนสงจ าเปนตอการเจรญเตบโตของจลนทรย เชน โพแทสเซยม โซเดยม แมกนเซยม แคลเซยม เหลก โคบอลต นกเกล ทองแดง สงกะส และโมลบดนม แรธาตจะมปฏกรยาตอเซลลของจลนทรย เปนสวนส าคญในกระบวนการเจรญเตบโต กระบวนการเมตาบอลซมของเซลล และกระบวนการสรางเอนไซมบางชนดทชกน าใหเกดกระบวนการผลตสารพอลแซคคาไรด จลนทรยบางชนดสามารถเกบสะสมแรธาตไวไดแมขณะนนในอาหารจะมแรธาตปรมาณนอย (Cui and Zhang, 2011)

จากผลการศกษาความสามารถในการเจรญเตบโต การผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan ของเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 และอตราสวนแรธาต CaCl2 :MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เ ท า กบ 3:0.1:0.3:0.015, 4.5:0.3:0.5:0.03, 6:0.5:1:0.06 และ 0:0:0:0 (ชดควบคม) เหนไดวา เหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 สามารถเจรญเตบโต ผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสด ซงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราสวนแรธาตอนๆ ดงนนจงคดเลอกน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราสวนแรธาตเทากบ 6:0.5:1:0.06 ส าหรบใชในการทดลองขนตอนตอไป

61

3.2.7 ผลกำรศกษำอตรำกำรเตมอำกำศทเหมำะสมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมตอกำรเพำะเลยงเสนใยเหด จากการศกษาการเพาะเลยงเชอเหดหลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอตราสวนแรธาต การเตมอากาศเทากบ 0.5, 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท (ลตรอากาศตอลตรอาหารตอนาท: vvm) โดยใชคาพเอชเรมตน อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน และอตราสวนแรธาตทเหมาะสมจากขอ 3.2.6 เพาะเลยงในสภาวะมด ทอณหภมหอง เปนระยะเวลา 8 วน พบวาเชอเหดหลนจอสามารถเจรญเตบโตไดดทสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราการเตมอากาศอนๆ โดยทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 8 เทากบ 2.308 กรมน าหนกแหงตอลตร สวนทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท น าหนกเสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองในวนท 8 เทากบ 1.644 และ 1.697 กรมน าหนกแหงตอลตร ตามล าดบ (รปท 3.12)

รปท 3.12 ลกษณะการเจรญของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 8 ของการทดลอง

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.4

0 2 4 6 8

0.5 vvm

1 vvm

1.5 vvm

น ำหน

กแสน

ใยแห

ง (กร

มตอล

ตร)

ระยะเวลำ (วน)

a

b

c

62

ผลการสกดสารเอกโซพอลแซคคาไรด จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 8 วน ทการเตมอากาศ เทากบ 0.5, 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสารเอกโซพอลแซคคาไรด ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราการเตมอากาศอนๆ โดยทการเตมอากาศเทากบ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท มความเขมขนของสารเอกโซพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0.540 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 และ 1.0 ลตรตอลตรตอนาท ความเขมขนของสารเอกโซพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 0.075 และ 0.280 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.13 ก)

ก ข

รปท 3.13 ปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรด (ก) และเอนโดพอลแซคคาไรด (ข) ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 8 ของการทดลอง

สวนผลการสกดสารเอนโดพอลแซคคาไรด พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตรา

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.5 1 1.5

Exopolysaccharide

อตรำกำรเตมอำกำศ (vvm)

เอกโซพ

อลแซ

คคำไรด

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

a

b

c

0

1

2

3

4

5

0.5 1 1.5

Endopolysaccharide

อตรำกำรเตมอำกำศ (vvm)

เอนโดพ

อลแซ

คคำไรด

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

a

cb

63

การเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราการเตมอากาศอนๆ โดยทการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท มความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 3.072 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท ความเขมขนของสารเอนโดพอลแซคคาไรดทสกดไดเทากบ 1.683 และ 1.942 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.13 ข) ผลการสกดสาร Exo-ß-1,3-glucan จากเสนใยเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ระยะเวลา 8 วน ทการเตมอากาศ เทากบ 0.5, 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสาร Exo-ß-1,3-glucan ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราการเตมอากาศอนๆ โดยทการเตมอากาศเทากบ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท มความเขมขนของสาร Exo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 40.962 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 และ 1.0 ลตรตอลตรตอนาท ความเขมขนของสาร Exo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 0.191 และ 18.784 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.14 ก) สวนผลการสกดสาร Endo-ß-1,3-glucan พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองสามารถผลตสาร Endo-ß-1,3-glucan ไดสงสดเมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทอตราการเตมอากาศอนๆ โดยทการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท มความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 37.570 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.0 และ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท ความเขมขนของสาร Endo-ß-1,3-glucan ทสกดไดเทากบ 15.218 และ 21.923 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ (รปท 3.14 ข) จากผลการทดลองจะเหนไดวาเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองสามารถเจรญไดดกวาเมอมปรมาณออกซเจนต า ซงสอดคลองกบรายงายวจยของ Kim และคณะ (2006) ทเพาะเลยง Ganoderma resinaceum ในถงหมกขนาด 5 ลตร ดวยอาหารทประกอบดวย กลโคส 35 กรมตอลตร เพปโทน 8 กรมตอลตร และแมงกานสคลอไรด 5 มลลโมลตอลตร ทอณหภม 30 องศาเซลเซยส พเอชเรมตนเทากบ 6 เพาะเลยงเปนระยะเวลา 4 วน ทอตราการเตมอากาศระดบตางๆ พบวา ทระดบการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ผลตปรมาณเสนใยสงสด 18.1 กรมตอลตร ในขณะทปรมาณสารเอกโซพอลลแซคคาไรดสงสดเทากบ 3.0 กรมตอลตร เมออตราการเตมอากาศเทา 1.0 ลตรตอลตรตอนาท ในการเพาะเลยงความเขมขนของน าตาลทเหลออยในถงหมกจะลดลงอยางรวดเรวในตอนตนของกระบวนการหมกซงตรงกนขามกบ

64

กระบวนการผลตเสนใย และสารเอกโซพอลแซคคาไรดทจะเพมขนอยางรวดเรว อตราการเตมอากาศในการเพาะเลยงเหดเปนปจจยส าคญทมผลตอกระบวนการผลตเสนใยและสารพอลแซคคาไรด โดยการเตมอากาศจะชวยในการสงผานสารตงตน ผลตภณฑ และออกซเจน เปนการรกษาสมดลความเขมขนของสารระหวางภายนอก และภายในเซลล ท าใหเกดกระบวนการหมกแบบใชอากาศอยางมประสทธภาพ (Elisashvili, 2012) อตราการเตมอากาศทสงท าใหในระหวางการเพาะเลยง Pellet ของเชอเหดจะเกดการเคลอนไหวไปมาอยตลอดเวลาคลายกบการเขยา ท าใหเชอเหดจะผลตสารพอลแซคคาไรดออกมาในรปของเอกโซพอลแซคคาไรดมากกวาเอนโดพอลแซคคาไรด เนองจากการทเซลลเคลอนทไปมาสารเอกโซพอลแซคคาไรดทผลตออกมาบนผนงเซลลไมสามารถเกดการดดซบเกบไวได ท าใหเกดการกระตนการสรางเอกโซพอลแซคคาไรดเพมขน (Yang and Liu, 1998)

ก ข

รปท 3.14 ปรมาณสาร Exo-ß-1,3-glucan (ก) และ Endo-ß-1,3-glucan (ข) ของเหดหลนจอขอบเหลองทอตราการเตมอากาศตางๆ เมอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทอณหภมหอง ในสภาวะมด เปนระยะเวลา 8 วน

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 8 ของการทดลอง

การทดลองในขนตอนนจงสรปไดวาการเพาะเลยงเหดหลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน าปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40

0

10

20

30

40

50

0.5 1 1.5

Exo-ß-1,3-glucan

อตรำกำรเตมอำกำศ (vvm)

c

b

a

Exo-

ß-1,3

-glu

can

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

0

10

20

30

40

50

0.5 1 1.5

Endo-ß-1,3-glucan

อตรำกำรเตมอำกำศ (vvm)

c

b

a

Endo

-ß-1

,3-gl

ucan

(มลล

กรมต

อกรม

เสนใ

ยแหง

)

65

และอตราสวนแรธาต CaCl2 :MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 6:0.5:1:0.06 มลลโมลตอลตร เมอใชอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ท าใหเชอเหดมน าหนกเสนใยแหง ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด และเมอใชอตราการเตมอากาศเทากบ 1.5 ท าใหเชอเหดมปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรดและ Exo-ß-1,3-glucan สงสด จากผลการทดลองการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจะเหนไดวา ปรมาณผลผลตทไดทง น าหนกเสนใย สารพอลแซคคาไรด และ ß-1,3-glucan นน มปรมาณนอยกวาเมอเปรยบเทยบกบงานวจยทอนๆ ทงนเนองจากในงานวจยอนๆ สวนใหญไดใชอาหารส าเรจรปในเพาะเลยง ซงอาหารส าเรจรปเปนอาหารทมสารอาหารทส าคญตอการเจรญของเสนใยเหดอยปรมาณมากกวาน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม และอาหารส าเรจรปยงไมมสารทอาจสงผลตอการยบยงเจรญของเสนใยเหด เชน สารประกอบฟนอล (Zabka et al., 2013) นอกจากนความแตกตางของสายพนธยงมผลตอการผลตสารออกฤทธทางชวภาพของเหดหลนจออกดวย (Papinutti, 2010)

3.3 ผลกำรศกษำคณสมบตของสำรพอลแซคคำไรดทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดหลนจอในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

3.3.1 ผลกำรศกษำองคประกอบทำงเคมของน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมทใชเปนอำหำรส ำหรบกำรเพำะเลยงหลงเกบเกยวผลผลตเสรจแลว

จากผลการวเคราะหองคประกอบทางเคมในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกอนและหลงการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลอง (ตารางท 3.3) พบวาน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกอนการเพาะเลยงทผานการปรบคาพเอชเรมตน อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจน และอตราสวนแรธาตแลวมคาซโอด ไนโตรเจน ฟอสฟอรส โพแทสเซยม และเหลก เทากบ 16,803, 411.60, 14.96, 280.1 และ 1.93 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ สวนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมหลงการเพาะเลยงมคา ซโอด ไนโตรเจน ฟอสฟอรส โพแทสเซยม เหลก และสารประกอบฟนอล เทากบ 11,362, 85.06, 21.00, 130.50, 2.44 และ 52.16 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ ซงเหนไดวาปรมาณองคประกอบทางเคมทอยในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม เชน ไนโตรเจน และโพแทสเซยม มปรมาณลดลงมาก เนองจากองคประกอบทางเคมเหลานเปนสวนทเสนใยเหดน าไปใชเปนอาหารเพอการเจรญเตบโต คาซโอดในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมมปรมาณลดลงเพยงเลกนอย เนองจากน าทงโรงงานงานสกดน ามนปาลมหลงการเพาะเลยงเสนใยเหดทน ามาวเคราะหนน ไดกรองเอาเฉพาะสวนทเปนเสนใยเหดออก ท าใหในน าทงยงมสวนของสารเอกโซพอลแซคคาไรด ซงเปนสวนทชวยเพมปรมาณคาซโอดในน าทงหลงการเพาะ เลยง เชนเดยวกนกบสารประกอบฟนอลทปรมาณความเขมขนในน าทงหลงการเพาะเลยงลดลง

66

เลกนอย สวนฟอสฟอรส และธาตเหลกทมปรมาณเพมขนนนอาจเกดจากเสนใยเหดทสามารถผลตธาตอาหารชนดนไดระหวางการเจรญเตบโต

ตำรำงท 3.3 ผลการวเคราะหน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมกอนและหลงการเพาะเลยง เสนใยเหด

องคประกอบทำงเคม ควำมเขมขน (มลลกรมตอลตร)

กอนกำรเพำะเลยง หลงกำรเพำะเลยง

Chemical Oxygen Demand Total Kjeldahl Nitrogen Total Phosphorus Total Potassium Iron Phenols

16,803 411.60 14.96 280.1 1.93 80.40

11,362 85.06 21.00 130.50 2.44 52.16

3.3.2 ผลกำรวเครำะหปรมำณโลหะหนกจำกผลตภณฑทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

จากผลการวเคราะหปรมาณโลหะหนกในสารทสกดไดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม พบวา มปรมาณเหลกเทากบ 0.39 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ทองแดงพบปรมาณนอยกวา 0.001 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง และแคดเมยมพบปรมาณนอยกวา 0.002 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง โลหะหนกทพบในสารสกดจากเสนใยเหดนน อาจมาจากการทเสนใยเหดดดซบเอาโลหะหนกเขาไปเกบไวในเซลลเมอตองน าอาหารซงเปนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมไปทมโลหะหนกปะปนอยไปใชในการเจรญเตบโต แตเมอเปรยบเทยบกบคามาตรฐานสารปนเปอนทพบในอาหาร (กระทรวงสาธารณะสข, 2557) พบวา สารทสกดไดมปรมาณโลหะหนกต ากวาคามาตรฐานทก าหนดไว ซงเหนไดวาสารทสกดไดมความปลอดภยในระดบหนงหากน าไปประยกตใชเปนสารสงเสรมดานสขภาพ (ตารางท 3.4)

67

ตำรำงท 3.4 ความเขมขนของโลหะหนกทพบในสารสกดจากเสนใยเหดทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

ชนดของโลหะหนก

ควำมเขมขน (มลลกรมตอกรมเสนใยแหง) คำมำตรฐำนสำรปนเปอน ในอำหำร

(กระทรวงสำธำรณสข, 2557) น ำทงโรงงำน

สกดน ำมนปำลม สำรทสกดไดจำก

เสนใยเหด

Iron Copper Cadmium

0.93

0.002 นอยกวา 0.003

0.39

นอยกวา 0.001 นอยกวา 0.002

ไมระบ (ไมควรบรโภคเกน 10 มลลกรมตอกโลกรมตอวน) 20 (มลลกรมตอกโลกรม) 0.05 (มลลกรมตอกโลกรม)

3.3.3 ผลกำรวเครำะหสำรตำนอนมลอสระจำกผลตภณฑทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

1) ผลกำรวเครำะหดวยวธ Total Phenolic content การวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดในสารทสกดไดจากเสนใยเหด

หลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสม โดยใชการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานความเขมขนของกรดแกลลก (Gallic acid) จากการค านวณปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดใหแสดงคาอยในรปของมลลกรมสมมลของกรดแกลลก (Gallic Acid Equivalent : GAE) ตอ 1 กรมสารสกด พบวาสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Endo-cellular product (สกดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม) ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดสงสด ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Exo-cellular product (สกดจากอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม) ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด 30.87 mg GAE/g สารสกด สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด 22.28, 12.21 และ 7.23 mg GAE/g สารสกด ตามล าดบ

สวนสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด 26.23 mg GAE/g สารสกด สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมด 16.54, 11.74 และ 7.10 mg GAE/g สารสกด ตามล าดบ (รปท 3.15) จากผลการทดลองปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดทสกดไดมปรมาณมากกวาเมอเทยบกบงานวจยของ

68

Heleno และคณะ (2012) ทศกษาปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดใน Gadoderma lucidum จากการสกดสารประกอบฟนอลกจากสวนตางๆของเหด เชน ดอกเหด สปอร และเสนใย พบวา ปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดทสกดไดปรมาณสงสดสกดไดจากสวนของดอกเหด มปรมาณเทากบ 28.64 mg GAE/g สารสกด สวนปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดทสกดไดจากสปอร และเสนใย มปรมาณเทากบ 14.94 และ 14.22 mg GAE/g สารสกด ตามล าดบ

รปท 3.15 ความสมพนธระหวางปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดจากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD

2) ผลกำรวเครำะหดวยวธ DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (DPPH assay)

การทดสอบความสามารถของสารสกดทไดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสมตอการยบยงสารอนมลอสระ DPPH โดยใชการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานความเขมขนของสาร BHT (Butylated hydroxy-toluene) พบวาสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร DPPH สงสด ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบสารสกดจากเสนใยเหดทอยใน Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Endo-cellular product ทความเขมขน 100

0

5

10

15

20

25

30

35

25 50 75 100

Endo-cellular product

Exo-cellular product

ควำม

เขมข

นของ

สำรป

ระกอ

บฟนอ

ลกทง

หมด

(มลล

กรมส

มมลข

องกร

ดแกล

ลกตอ

กรมส

ำรสก

ด)

ควำมเขมขนของสำรสกด (ไมโครกรมตอ

a

b

69

ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร DPPH รอยละ 84.70 สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร DPPH รอยละ 70.67, 40.84 และ 21.25 ตามล าดบ (รปท 3.16)

รปท 3.16 ความสมพนธระหวางความสามารถในการยบยงสาร DPPH จากสารทสกดไดกบความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ

หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD

สวนสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร DPPH รอยละ 87.11 สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร DPPH รอยละ 44.90, 18.93 และ 8.64 ตามล าดบ กอนหนานไดมรายงานผลการทดลองความสามารถในการยบยงสาร DPPH ของ Ganoderma lucidum จากงานวจยของ Chen และคณะ (2014) และ Shi และคณะ (2014) ทสกดสารพอลแซคคาไรดจาก Ganoderma lucidum ดวยวธสกดแบบ Ultrasonic พบวา มความสามารถในการยบยงสาร DPPH สงสดทระดบรอยละ 53.62 เมอสารพอลแซคคาไรดมความเขมขน 47.87 มลลกรมตอมลลลตร และมความสามารถในการยบยงสาร DPPH สงสดทระดบรอยละ 91.48 เมอสารพอลแซคคาไรดมความเขมขน 1.25 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ นอกจากน จากการทดลองของ Korzarki และคณะ (2012) ทสกดสารพอลแซคคาไรดจาก Ganoderma lucidum และ Ganoderma applanatum พบวา Ganoderma

0

10

20

3040

50

60

70

80

90

100

25 50 75 100

Exo-cellular product

Endo-cellular product

ควำมเขมขนของสำรสกด (ไมโครกรมตอมลลลตร)

a

b

รอยล

ะของ

กำรย

บยงสำร D

PPH

70

lucidum มความสามารถในการยบยงสาร DPPH สงสดทระดบรอยละ 94.8 เมอสารพอลแซคคาไรดมความเขมขน 2.5 มลลกรมตอมลลลตร และ Ganoderma applanatum มความสามารถในการยบยงสาร DPPH ระดบรอยละ 77.5-81.9 เมอสารพอลแซคคาไรดมความเขมขน 1.0-10.0 มลลกรมตอมลลลตร

3) ผลของกำร ว เครำะห ดวย ว ธ 2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) cation radical scavenging assay : (ABTS assay)

การทดสอบความสามารถของสารสกดทไดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสมตอการยบยงสารอนมลอสระ ABTS โดยใชการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานความเขมขนของสาร BHT (Butylated hydroxy-toluene) พบวาสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร ABTS สงสด ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร ABTS รอยละ 80.41 สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตรมความสามารถในการยบยงสาร ABTS รอยละ 76.01, 66.69 และ 62.55 ตามล าดบ

สวนสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร ABTS รอยละ 63.38 สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการยบยงสาร ABTS รอยละ 61.99, 58.53 และ 40.28 ตามล าดบ (รปท 3.17) จากงานวจยของ Shi และคณะ (2014) สกดสารพอลแซคคาไรดจาก Ganoderma lucidum ดวยวธ Ultrasonic พบวา สารพอลแซคคาไรดทสกดไดมมความเขมขน 1.25 มลลกรมตอมลลลตร และความสามารถในการยบยงสาร ABTS มากกวารอยละ 50

71

รปท 3.17 ความสมพนธระหวางความสามารถในการยบยงสาร ABTS จากสารทสกดไดกบ

ความเขมขนของสารสกดทระดบตางๆ หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95

(p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD ณ.วนท 10 ของการทดลอง

4) ผลของกำรวเครำะหวธ Ferric reducing antioxidant power (FRAP assay) การทดสอบความสามารถของสารสกดทไดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองท

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสมในการเปนตวรดวซของสารตานออกซเดชน โดยใชการวดปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ เปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานความเขมขนของสาร BHT (Butylated hydroxy-toluene) (ตวอยางทมปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ สงจะมความสามารถในการเปนตวรดวซสงเชนกน) พบวาสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ สงสด ซงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95 (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรป Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Endo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ 512.93 มลลกรมตอลตร สารสกดทมความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ 480.31, 473.57 และ 436.07 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ

สวนสารสกดจากเสนใยเหดทอยในรปของ Exo-cellular product ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ 294.51 มลลกรมตอลตร สารสกดทม

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

25 50 75 100

Exo-cellular product

Endo-cellular product

รอยล

ะของ

กำรย

บยง A

BTS

ควำมเขมขนของสำรสกด (ไมโครกรมตอมลลลตร)

a

b

72

ความเขมขน 75, 50 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ 207.86, 198.11 และ 190.31 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ (รปท 3.18) ซงมความเขมขนของ Fe 2+ นอยกวาเมอเปรยบเทยบกบงานวจยของ Kozarski และคณะ (2012) ทสกดสารพอลแซคคาไรดจาก Ganoderma lucidum และ Ganoderma applanatum พบวา สารพอลแซคคาไรดทสกดไดจาก Ganoderma applanatum มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ เทากบ 3,400 มลลกรมตอลตร และสารพอลแซคคาไรดทสกดไดจาก Ganoderma lucidum ความเขมขน 100-500 มลลกรมตอลตร มปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ เทากบ 5,000-20,000 มลลกรมตอลตร

รปท 3.18 ความสมพนธระหวางปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ จากสารทสกดไดกบความ

เขมขนของสารสกดทระดบตางๆ หมำยเหต คาเฉลยทตามดวยตวอกษรทตางกน มความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมนรอยละ 95

(p≤0.05) เมอเปรยบเทยบคาเฉลยรายค โดยวธ LSD

จากการทดลองในขนตอนนจะเหนไดวา Endo-cellular product มปรมาณความเขมขนของสารประกอบฟนอลกทงหมด ความสามารถในการยบยงสารอนมลอสระ DPPH และ ABTS และมปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ สงกวา Exo-cellular product จงท าให Endo-cellular product มความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระมากวา Exo-cellular product การทผลตภณฑสองชนดนมประสทธภาพไมเทากนอาจเนองมาจากลกษณะทางโครงสรางของสาร ß-glucan ทเกยวของกบการสลายพนธะเพอปลดปลอยอเลกตรอน ท าใหมผลตอการเกดปฏกรยาออกซเดชน โดยกลแคนทเปน ß-1,6-glucan โมเลกลของน าตาลจะเชอมตอกนทคารบอน ต าแหงท 6 ท าใหเกดการปลดปลอยของอเลกตรอนไดยากกวากลแคนทเปน ß-1,3-glucan ในสวนของ Exo-cellular product นนอาจมสวนประกอบของกลแคนทมลกษณะทางโครงสรางเปน

050

100150200250300350400450500550

25 50 75 100

Exo-cellular product

Endo-cellular product

ควำม

เขมข

นของ

Fe2+

(มลล

กรมต

อลตร

)

ควำมเขมขนของสำรสกด (ไมโครกรมตอมลลลตร)

a

b

73

ß-1,6-glucan มากกวาใน Endo-cellular product ท าใหปลดปลอยอเลกตรอนออกมาไดนอยกวา สงผลใหยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชนไดนอย จงมความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระนอยกวาดวย (Kagimura et al., 2015; Oliveira et al., 2015)

3.3.4 ผลกำรศกษำควำมสำมำรถในกำรยบยงกำรเจรญของแบคทเรยจำกผลตภณฑทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม

ผลการศกษาความสามารถในการยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรย E.coli และ S.aureus ตอการเกด Inhibition zone พบวาสารสกดจากเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในสภาวะทเหมาะสมในรปของ Exo-cellular product ไมสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย E.coli และ S.aureus ได สวนสารสกดในรป Endo-cellular product สามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย E.coli และ S.aureus ได โดยเกด Inhibition zone ขนาด 0.8 และ 0.7 เซนตเมตร ตามล าดบ (ตารางท 3.5) จากการทดลองของ Li และคณะ 2012 ซงสกด ESAC (Ethanol-soluble acidic components) จาก Ganoderma atrum แลวทดสอบความสามารถในการยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรย 4 ชนด คอ S.aureus, E.coli, B.subtilis และ P.vulgaris พบว า เกด Inhibition zone ขนาด 7.87±0.36, 7.53±0.30, 8.09±0.11 และ 6.15±0.45 ตามล าดบ โดยขนาดของ Inhibition zone จะเพมขนตามความเขมขนของ ESAC ทเพมขนดวย การยบยงการเจรญของเซลลแบคทเรยเกดจากสารทสกดไดนนมสวนประกอบของสารประกอบฟนอล ใน Endo-cellular product มความเขมขนของสารประกอบฟนอลมากกวา Exo-cellular product ท าให Endo-cellular product สามารถยบยงการเจรญของแบคทเรยไดมากกวา โดยสารประกอบฟนอลนนจะท าใหเยอหมเซลลของแบคทเรยถกท าลาย ท าใหองคประกอบภายในเซลลร วไหลออกมา การผานเขาออกของสารในเซลลผดปกต มผลท าใหเซลลตายได (นงลกษณ และปรชา, 2554)

74

ตำรำงท 3.5 ผลการทดสอบการยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรยจากสารทสกดไดจาก เสนใยเหด

ตวอยำง Inhibition zone (เซนตเมตร)

E.coli S.aureus

Exo-cellular product ไมเกด Inhibition zone ไมเกด Inhibition zone Endo-cellular product 0.8 0.7 Control (50% alcohol) 1.1 0.9

75

บทท 4 สรปผลกำรทดลอง และขอเสนอแนะ

4.1 สรปผลกำรทดลอง

4.1.1 ผลกำรคดเลอกสำยพนธเหดสมนไพร จากการลงพนทเกบตวอยางเหดสมนไพรตามแหลงธรรมชาตในพนทภาคใตตอนลาง

ไดแก สงขลา พทลง สตล และตรง พบเหดหลนจอ 4 สายพนธ ไดแก เหดหลนจอขอบเหลอง เหดหลนจอกาละแมด า เหดหลนจอสแดง และเหดหลนจอน าตาแดงด า ซงเหดหลนจอขอบเหลองสามารถเจรญเตบโตไดด โดยใหน าหนกเสนใยเทากบ 15.670 กรมน าหนกแหงตอลตร และยงสามารถผลตสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan ไดปรมาณสงสด เทากบ 1.23 และ 9.02 มลลกรมตอกรมน าเสนใยแหง ตามล าดบ เมอเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ ในสภาวะนง และมด ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 10

4.1.2 ผลกำรศกษำสภำวะทเหมำะสมตอกำรผลตสำรพอลแซคคำไรดของเหดสมนไพรในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลม

เมอใชการเตรยมเชอเรมตนแบบ Seed inoculum ทระยะเวลา 7 วน เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทระดบพเอชเรมตนเทากบ 6 อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากบ 40 และอตราสวนแรธาต CaCl2 :MgSO4:ZnCl2:FeSO4 เทากบ 6:0.5:1:0.06 เพาะเลยงในสภาวะนง และมด เปนระยะเวลา 16 วน เหดหลนจอขอบเหลองใหคาน าหนกเสนใยสงสดเทากบ 2.903 กรมน าหนกแหงตอลตร ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสด เทากบ 0.46 และ 0.28 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ

สวนทอตราการเตมอากาศเทากบ 0.5 ลตรตอลตรตอนาท ใหน าหนกเสนใยสงสดเทากบ 2.308 กรมน าหนกแหงตอลตร ปรมาณสารเอนโดพอลแซคคาไรด และ Endo-ß-1,3-glucan สงสดเทากบ 3.072 และ 37.570 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ ในขณะทอตราการเตมอากาศเทากบ 1.5 ลตรตอลตรตอนาท ใหปรมาณสารเอกโซพอลแซคคาไรด และ Exo-ß-1,3-glucan สงสดเทากบ 0.540 และ 40.962 มลลกรมตอกรมเสนใยแหง ตามล าดบ

4.1.3 ผลกำรศกษำคณสมบตของสำรพอลแซคคำไรดทไดจำกกำรเพำะเลยงเหดสมนไพรในน ำทงโรงงำนสกดน ำมนปำลมในสภำวะทเหมำะสม จากผลการทดลองพบวา สารสกดในรป Endo-cellular product มความสมารถในการเปนสารตานอนมลอสระมากกวาสารสกดในรป Exo-cellular product โดยใหปรมาณสารประกอบฟนอลกทงหมดสงสดเทากบ 30.87 mg GAE/g สารสกด คารอยละตอการยบยงสารอนมลอสระ DPPH และ ABTS สงสดเทากบ รอยละ 87.40 และ 80.41 ตามล าดบ และใหปรมาณความเขมขนของ Fe 2+ สงสดเทากบ 0.51 มลลกรมตอลตร นอกจากนสารสกดในรป

76

Endo-cellular product ยงสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย E.coli และ S.aureus ไดอกดวย โดยท าใหเกด Inhibition zone ขนาด 0.8 และ 0.7 เซนตเมตร ตามล าดบ

4.2 ขอเสนอแนะ 4.2.1 ในการเกบรวบรวมสายพนธเหดสมนไพรควรพจารณาถงชวงทเหดสามารถเจรญไดดทสด เพอสามารถรวบรวมสายพนธไดอยางครบถวน และทวถง 4.2.2 เพอการผลตใหไดผลผลตปรมาณมากขน อาจตองเพมสวนของสารอาหารอนๆ ลงไปในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม และลกษณะของสารพอลแซคคาไรดทตองการสามารถเลอกไดจากหลายๆปจจย เชน อตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนหรออตราการเตมอากาศ เปนตน เพอความสะดวกตอการผลต และการสกด 4.2.3 งานวจยนเปนการน าน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ทเปนของเหลอทงมาใชใหเกดประโยชนดวยการน ามาเปนอาหารเพาะเลยงเหดหลนจอทดแทนการใชอาหารส าเรจรป ซงยงมของเหลอทงชนดอนๆ อกทสามารถน ามาใชรวมกบน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมได

77

เอกสำรอำงอง

กรมการคาภายใน. การผลต การตลาด ปาลมน ามน ป 2554. http://agri.dit.go.th. (สบคนเมอวนท 24 กรกฎาคม 2555).

กรมควบค มมลพษ . ค ามาตรฐานน าท งท ร ะบายออกจากโรงงาน อตสาหกรรม . http://www.pcd.go.th. (สบคนเมอวนท 20 มถนายน 2555).

กระทรวงสาธารณสข. ประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 98 (พ.ศ. 2529 ) เรอง มาตรฐานอาหารทมสารปนเปอน. http://www.moph.go.th/ (สบคนเมอวนท 17 ธนวาคม 2557).

จนตนา แกวบรสทธ. 2541. การปรบปรงคณภาพน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลมโดยกระบวนการดดซบในชนตรง. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต , สาขาวชาการจดการสงแวดลอม, มหาวทยาลยสงขลานครนทร

ชยนต พเชยรสนทร. 2541. เหดหลนจอ. กรงเทพฯ: นวพลเอนเตอรไพรส. ทนวงศ แสงเทยน. 2552. การศกษาเหดและราในปาชายเลน. กรงเทพฯ : โรงพมพชมนม

สหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย จ ากด. ธนกฤต พรหมทอง. 2552. การก าจดสและสารอนทรยของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมดวยน า

หมกชวภาพและเฟนตนรเอเจนต. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต , สาขาวชาการจดการสงแวดลอม, มหาวทยาลยสงขลานครนทร

นงลกษณ สวรรณพนจ และ ปรชา สวรรณพนจ. 2554. จลชววทยาทวไป. กรงเทพฯ : ส านกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

นวฒ เสนาะเมอง. 2553. เหดปาเมองไทย: ความหลากหลายและการใชประโยชน. กรงเทพฯ: หางหนสวนจ ากดยนเวอรแซลกราฟฟกแอนดเทรดดง.

พนสข ประเสรฐพรรพ, เสาวลกษณ จตบรรเจดกล และ อรญ หนพงศกตตกล. 2533. กระบวนการผลต การใชประโยชนวสดเหลอทง และคณลกษณะของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม. วารสารสงขลานครนทร. 12: 169-176.

ลอชา วนรตน, อ านาจ เดชะ, ธรยทธ อนตะเสน, และ บญใจ ลมศลา. 2553. คมอการผลตเหดหลนจอและสปอรเหดหลนจอตามแนวทางเกษตรดทเหมาะสม. กรงเทพฯ: ส านกงานกจการโรงพมพ องคการทหารผานศกในพระบรมราชปถมภ.

วสนณ เพชรรตน.2536. การผลตเหด. ภาควชาการจดการศตรพช.คณะทรพยากรธรรมชาตมหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ศภศษฏ อรณรงสวสด. 2552. ชวเคมพนฐาน. กรงเทพฯ: ทอป. ศนยรวมขอมลสงมชวตในประเทศไทย. ขอมลสงมชวต. http://www.thaibiodiversity.org

(สบคนเมอวนท 21 กรกฎาคม 2555). สาธต ไทยทตกล. 2539. การเพาะเหดหลนจอ. กรงเทพฯ: ฟาอภย.

78

ส านกงานความหลากหลายทางชวภาพดานปาไม กรมปาไม. เหดรา. http://biodiversity.forest.go.th (สบคนเมอวนท 21 กรกฎาคม 2555).

ส านกงานสถตแหงชาต. ปาลมน ามนขาดแคลนหรอไม โดย ศนยสารสนเทศยทธศาสตรภาครฐ. http://service.nic.go.th. (สบคนเมอวนท 24 กรกฎาคม 2555).

สรพล รกประทม และ ชวลต สนตกจรงเรอง. 2539. เหดหลนจอ. กรงเทพฯ: ท.พ.พรนท. สวทย สวรรณโณ และ ไซนะ มเลง. 2555. การเพมประสทธภาพการผลตเสนใย และสาร

พอลแซคคาไรดทผลตภายในเซลลจากเหดแครง (Schizophyllum commune) โดยสภาวะของสารอาหารท เหมาะสม . วำรสำรวทยำศำสตร และเทคโนโลย มหำวทยำลยมหำสำรคำม. 31(4): 336-343.

อนงค จนทรศรกล. 2541. เหดเมองไทย. ไทยวฒนาพานช. กรงเทพฯ. อานนท เออตระกล. 2541. การเพาะเหดหลนจอ. กรงเทพฯ: ฟาอภย. (POME). Renewable and Sustainable Energy Reviews. 42: 1260-1278. A.O.A.C International. 2005. Official Methods of Analysis Of AOAC International (18thed.),

Methods 925.08. Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, Maryland USA.

Agamuthu, P. 1994. Composting of goat dung with various additives for improved fertilizwe capacity. World Journal Microbiology Biotechnology. 10: 194-198.

Ahmad, A. L., Ismail, S., and Bhatia, S. 2003. Water recycling from palm oil mill effluent (POME) using membrane technology. Desalination. 157: 87-95.

Ahmed, Y., Yaakob, Z., Akhtar, P., and Sopian, K. 2015. Production of biogas and performance evaluation of existing treatment process in palm oil mill effluent Alam, M. Z., Ameem, E. S., Muyibi, S. A., and Kabbashi, N. A. 2009. The factor affecting

the performance of activated carbon prepared from oil palm empty fruit bunches for adsorption of Phenols. Chemical Engineering Journal. 155: 191-198.

Alam, M. Z., Karim, M. I. A., Hamisan, A. F., Jamal, P., and Jalal, K.C. A. 2006. Liquid state bioconversion of palm oil mill effluent for cellulose production: statistical optimization of process conditions. International conference on Natural Resources Engineering and Technology: 226-232.

Alexopoulos, C. J., Mims. C. W., and Blackwell, M. 1996. Introductory mycology. 4th ed. New York: John Wiley and sons.

Amadi, O. C., and Moneke, A. N. 2012. Use of starch containing tubers for the formulation of culture media for fungal cultivation. African Journal of Microbiology Research. 6(21): 4527-4532.

79

Amelia, L., Wahab, D. A., and Hassan, A. 2009. Modelling of palm oil production using fuzzy expert system. Expert Systems with Applications. 36: 8735-8749.

Anong, C., Poonpilai, S., Uthaiwan, S., Saisamorn, L., Ahchara, P., Niwat, S., Charida, P., Vasan, P., Uraporn, S., Kittima, D., Usa, K., Sutheera, T., and Sulichet, T. 2011. Checklist of Mushroom (basidiomycetes) in Thailand. ONEP Biodiversity series. 20: 255-261.

Aoki, S. K., and Jongjeen, J. 2009. Study of a modified for cellulolytic fubgi isolated from soil. Agricultural Science Journal. 40: 425-428.

APHA, AWWA and WEF. 2005. “Standard Methods for Examination of Water and Wastewater”. American Public Heaith Association, American Water Work Association and Water Environment Federation (21thed.). Washington DC., USA.

Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., and Truck, M. 1966. “Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method”. American Jourmal of Clinical Pathology. 45: 493-496.

Berovic, M., Habijanic, J., Zore, I., Wraber, B., Hodzar, D., Boh, B., and Pohleven, F. 2003. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass and immunostimulatory effects of fungal polysaccharides. Journal of Biotechnology. 103: 77-86.

Bohn, J.A., and Bemiller, J. N. 1995. (1-3)-ß-D-Glucans as biological response modifier: a review of structure functional activity relationship. Carbohydrate Polymers. 28: 3-14.

Bollag, J. M., Shuttleworth, K. l., and Anderson, D. H. 1988. Laccase-mediated detoxification of Phenolsic compounds. Applied Environmental Microbiology. P. 3086-3091.

Brown, G. D., and Gordon, S. 2005. Immune recognition of fungal ß-glucans. Cellular Microbiology. 7: 471–479.

Bunrung, S., Prasertsan, S., and Prasertsan, P. Decolorization of biogas effluent from palm oil mill using combined biological and physical methods. 2014. Kasetsart Journal. 48: 95-104.

Chan, K. W., Watson, I., and Lim, K. C. 1980. Use of oil palm waste material for increase production. Soil science and Agricultural development. 213-42.

80

Chang, M. Y., Tsai, G. J., and Houng, J. Y. 2006. Optimization of the medium composition for the submerged culture of Ganoderma lucidum by Taguchi array design and steepest ascent method. Enzyme and Microbial Technology. 38: 407-414.

Chapman, G. W., and Horvat, R. J. 1989. Determination of nonvolatile acid and sugar from fruits and sweet potato extracts by capillary GLC and GLC/MS. Journal Agricultural and Food Chemistry. 37: 947-950.

Chen, T. Q., Wu, Y. B., Wu, J. G., Ma, L., Dong, Z. H., and Wu, J. Z. 2014. Efficient extraction technology of antioxidant crude polysaccharides from Ganoderma lucidum (LingZhi), ultrasonic-circulating extraction integrating with superfine-pulverization. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 45: 57-62.

Cheung, P. C. K. 1996. The hypocholesterolemic effect of extracellular polysaccharide from the submerged fermentation of mushroom. Nutrition Research. 16: 1953-1957.

Chirinang P. and Intarapichet K. O. 2009. Amino acids and antioxidant properties of the oyster mushroom, Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju. Sciene Asia Journal. 35: 326-331.

Cui, Y. H., and Zhang, K. C. 2011. Effect of metal ions on the growth and metabolites production of Ganoderma lucidum in submerged culture. African Journal of Biotechnology. 10(56): 11983-11989.

Daba, A. S., and Ezeronye, O. U. 2003. Anti-cancer effect of polysaccharides isolated from higher basidiomycetes mushroom. African Journal of Biotechnology. 2(12): 672-678.

Daniel, S. 2003. Ganoderma lucidum (Reishi) in cancer treatment. Integrative Cancer Therapies. 2(4): 358-364.

Devendra, M. T. 2004. Integrated tree crops-ruminants systems-potential importance of the oil palm. Outlook Agricultural. 33: 157-66.

Dubois, M., Gilles, K.A.,Hamilton, J.K.,Rebers, P.A., and Smith,F.1956.Colometric method for determination of sugar and related substance. Analytical Biochemistry. 28:350-356

Elisashvili, V. 2012. Submerged cultivation of medicinal mushroom: Bioprocesses and products (Review). International Journal of Medicinal Mushrooms. 14(3): 211-239.

81

Elmastas, M. 2007. Determination of antioxidant activity and antioxidant compounds in wild edible mushrooms. Journal of Food Compossition and Analysis. 337-345.

Fang, Q. H., and Zhong, J. J. 2002. Two-stage culture process for improved production of ganoderic acid by liquid fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum. Biotechnology Progress. 18(1): 51-54.

Fang, Q. H., Tang, Y. J., and Zhong, J. J. 1999. Significance of inoculation density control in production of polysaccharide and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum. Process Biochemistry. 37: 1375-1379.

Gao Y. H, Sai X. H, Chen G. L, Ye J. X, and Zhou S. F. 2003. A randomized, placebo-controlled, multi-center study of Ganoderma lucidum (W. Curt.: Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae) polysaccharides (Ganopoly) in patients with advanced lung cancer. International Journal Medicinal Mushrooms. 5: 368–81.

Habib, M. A. B., Yusoff, F. M., Phang, S. M., Ang, K. J., and Mohamed, S. 1997. Nutritional values of chironomid larvae grown in palm oil mill effluent and algal culture. Aquaculture. 158: 182-188.

Halliwell, B. 2009. The wanderings of a free radical. Free Radical Biology and Medicine. 46(5): 531-542.

Harada, T., Miura, N. N., Adachi, Y., Nakajima, M., Yadomae, T., and Ohno, N. 2002. IFN-gamma induction by SCG, 1,3- ß -D-glucan from Sparassis crispa, in DBA/2 mice in vitro. Journal of Interferon and Cytokine Research. 22: 1227–1239.

Heleno, S. A., Barros, L., Martins, A., Queiroz, M. J. R. P., Buelga, C. S., Ferreira, I. C. F. R. 2012. Fruiting body, spores and in vitro produrced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal: A comparative study of the antioxidant potential of Phenolsic and polysaccharidic extracts. Food Research International. 46: 135-140.

Hippe, H., Andreesen, J. R., and Gottschalk, G. 1991. The Genus Clostridium Nonmedical in The Prokaryotes, 2nd ed. New York: Springer. pp: 1800⎯1866.

Ho, C. C., Tan, Y. K., and Wang C. W. 1984. The distribution of chemical constituents between the soluble and the particulate fraction of palm oil mill effluent and its significance on its utilization/treatment. Journal of Agricultural Wastes. 11: 61-71.

82

Hsieh, C., Tseng, M. H., and Liu, C. J. 2005. Production of polysaccharides from Ganoderma lucidum (CCRC 36041) under limitations of nutrients. Enzyme and Microbial Technology. 38: 109-117.

Hutagalung, R. I., Chang, C. C., Toh, K. M., and Chan, H. C. 1977. Potential of palm oil mill effluent as feed for growing-finishing pigs. Planter. 53: 2-9.

Ikekawa, T. 2001. Beneficial effects of edible and medicinal mushrooms in health care. International Journal Medicinal Mushrooms. 3: 291–298.

Jamal, P. Alam, M. Z., Ramlan, M., Salleh, M., and Nadzir, M. M. 2005. Screening of Aspergillus for citric acid production from palm oil mill effluent. Journal of Biotechnology. 4(4): 275-278.

Kagimura, F. Y., Cunha, M. A. A., Theis, T. V., Malfatti, C. R. M., Dekker, R. F. H., Barbosa, A. M., Teixeira, S. D., and Salome, K. 2015. Carboxymethylation of (1-6)-ß- glucan (lasiodiplodan): Preparation, characterization and antioxidant evaluation. Carbohydrate Polymers. 127:390-399.

Kim, H. M., Kim, S. W., Hwang, H. J., Park, M. K., Mahmoud. Y. A. G., Choi, J. W., and Yun, J. W. 2006. Influence of agitation intensity and aeration rate on production of antioxidative exopolysaccharides from submerged mycelial culture of Ganoderma resinaceum. Journal of Microbiology and Biotechnology. 16(8): 1240-1247.

Kim, H. O., Lim, J. M., Joo, J. H., Kim, S. W., Hwnag, H. J., Choi, J. W., and Yun, J. W. 2005. Optimization of submerged culture condition for the production of mycelia biomass and exopolysaccharides by Agrocybe cylindacae. Bioresource Technology. 96: 1175-1182.

Ko, Y-T., and Lin, Y-L. 2004. 1,3- ß -glucan Quantification by fluorescence microassay and analysis of its distribution in food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52: 3313-3318.

Kozorski, M., Klaus, A., Niksic, M., Vrvic, M. M., Todorovic, N., Jakovljevic, D., and Griensven, L. 2012. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharide extracts from the widely used mushroom Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Lentinus edodes and Trametes versicolor. Journal of Food Composition and Analysis. 26: 144-153.

83

Kumon, H., Tomoshika, K., Matunaga, T., Ogawa, M., and Ohmori, H. A. 1994. Sandwich cup method for the penetration assay of antimicrobial agents through Pseudomonas exopolysaccharides. Microbiology Immunology. 38: 615-619.

Lam, M. K., and Lee, K. T. 2011. Remewable and sustainable bioenergies production from palm oil mill effluent (POME): Win-win strategies toward better environmental protection. Biotechnology Advances. 29: 124-141.

Lama, L., Nicolaus, B., Calandrell, V., Manca, M. C., Romano, I., and Gambacorta, A. 1999. Effect of growth conditions on endo- and exopolymer biosynthesis in Anabaena cylindrical 10C. Phytochemistry. 42: 655-659.

Lee, K. M., Lee, S. Y., and Lee, H. Y. 1999. Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor. Journal Bioscience and Bioengineering. 88: 646–50.

Lee, W. Y., Park, Y. K., Ahn, J. K., Ka, K. H., and Park, S. Y. 2007. Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganoderma applatum. Enzyme and Microbial Technology. 40: 249-254.

Li, W. J., Nie, S. P., Liu, X. Z., Zhang, H., Yang, Y., Yu, Q., and Xie, M. Y. 2012. Antimicrobial properties, antioxidant activity and cytotoxicity of ethanol-soluble acidic componentsnfrom Ganoderma atrum. Food and Chemical Toxicology. 50: 689-694.

Liew, W. L., Kassim, M. A., Muda, K., Loh, S. K., and Affam, A. C. 2015. Conventional methods and emerging wastewater polishing technologies for palm oil mill effluent treatment: A review. Journal of Environmental Management. 149: 222- 235. Liu, G. Q., and Zhang, K. C. 2005. Mechanisms of the anticancer action of Ganoderma

lucidum (Leyss.ex Fr.) Karst.: A new understanding. Journal of Intigrative Plant Biology. 47: 129-135.

Liu, Y. J., Du, J. L., Cao, L. P., Jia, R., Shen, Y. J., Zhao, C. Y., Xu, P., and Yin, G. J. 2015. Anti-inflammatory and hepatoprotective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on carbon tetrachloride-induced hepatocyte damage in common carp (Cyprinus carpio L.). International Immunopharmacology. 25: 112-120. Lo, H. C., Tsai, F. A., Wasser, S. P., Yang, J. G., and Huang, B. M. 2006. Effects of

ingested fruiting bodies, submerged culture biomass, and acidic polysaccharide

84

glucuronoxylomannan of Tremella mesenterica Retz.:Fr. on glycemic responses in normal and diabetic rats. Life Science. 78: 1957–1966.

Madaki, Y. S., and Seng, L. 2013. Palm oil mill effluent (POME) from Malaysia palm oil mills: waste or resource. International Journal of Science, Evironment and Technology. 2(6): 1138-1155.

Manzi, P., and Pizzoferrato, L. 2000. Beta-glucan inedible mushroom. Food Chemistry. 68: 315-318.

Mau J. L, Lin H. C, and Chen C. C. 2001. Non-volatile components of several medicinal mushrooms. Food Research International. 34: 521–526.

Mayell, M. 2001. Maitake extracts and their therapeutic potential. Alternative Medicine Review. 6: 48–60.

Munz, C., Steinman, R. M., and Fujii S. 2005. Dendritic cell maturation by innate lymphocytes: coordinated stimulation of innate and adaptive immunity. Journal of Experimental Medicine. 202: 203–207.

Mursito, B., Jenie, U. A., Mubarika, S., Kardono, L. B. S. 2010. Isolation of ß-(1-3) Glucan Compound from the Water Extract of Indonesian Jamur Tanduk (Termitomyces eurirrhizus Berk). Pakistan Journal of Biological Sciences. 13: 847-851

Nguyen, V. T., Tung, N. T., Cuong, T. D., Hung, T. M., Kim, J. A., Woo, M. H., Choi, J. S., Lee, J. H., and Min B. S. 2015. Cytotoxic and anti-angiogenic effects of lanostane triterpenoids from Ganoderma lucidum. Phytochemistry Letters. 12: 69-74.

Oliveira, K. S. M., Bastiani, M. D., Cordeiro, L. M. C., Costa, M. F., Teledo, K. A., Lacomini, M., Barbosa, A. M., Dekker, R. F. H., and Nascimento, V. M. G. 2015. (1-6)- and (1-3)(1-6)-ß-glucans from Lasiodiplodia theobromae MMBJ: Structural

characterization and pro-inflammatory activity. Carbohydrate Polymers. 133:539-546. O-Thong, S., Prasertsan, P., Karakashev, D., and Angelidaki, I. 2008. Thermophilic

fermentative hydrogen production by the newly isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum PSU-2. International Jounal of Hydrogen Energy. 33: 1204-1214.

Oviasogie, P. O., and Aghimien, A. E. 2003. Macronutrient status and speciation of Cu, Fe, Zn, and Pb in soil containing palm pil mill effluent. Global Journal Pure Applied Science. 9: 71-80.

85

Papinutti, L. 2010. Effect of nutrient, pH and water potential on exopolysaccharide production by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex. Bioresource Technology. 101: 1941-1946.

Perumal, K. 2009. Indigenous technology on organic cultivation of Reishi. Shri AMM Murugappa Chettiar Research Center.

Rasdi, Z., Rahman, N. A. A., Aziz, S. A., Yee, P. L., Yusoff, M. Z. M., Ling, C. M., and Hassan, M. A. 2009. Statistical optimization of biohydrogen production from palm oil mill effluent by natural microflora. Journal of Biotechnology. 3: 79-86.

Roupas, P., Keogh, J., Noakes, M., Margetts, C., and Tarloy, M. 2012. The role of edible mushrooms in health: Evaluation of the evidence. Journal of Functional Foods. 4:687-709. Sarma, A. D., Mallick, A. R. and Ghosh, A. K. 2010. Free radicals and their role in different

clinical conditions: An overview. International Journal of Pharma Sciences and Research. 1(3): 185-192.

Sharma, V. K., Canditelli, M., Fortona, F. and Cornacchia, G. 1997. Processsing of urban and agro-industrial residues by aerobic composting: Review. Energy Conversion and Management. 38(5): 453-478.

Shi, M., Yang, Y., Hu, X., and Zhang, Z. 2014. Effect of ultrasonic extraction conditions on antioxidative and immunomodulatory activities of Ganoderma lucidum polysaccharide originated from fermented soybean curd residue. Food Chemistry. 155: 50-56.

Silva, D. 2003. Ganoderma lucidum (Reishi) in cancer treatment. Integrative cancer Therapies. 2(4): 358-364.

Stamets, P. 2000. Growing gourmet and medicinal mushroom. Speed Press. Berkeley, California. USA. Pp. 574.

Suwanno, S. 2007. Effect of light on mycelium growthof Ganoderma lucidum Karst. Doctoral Dissertation. Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi, Japan. Pp. 133.

Suwanno, S., Nakamura, K., Amano, Y., Shida, M., and Horiuchi, I. 2005. Development of the method for efficient disruption and rapid extraction on the ß -1,3-glucan determination from the mycelia of Ganoderma lucidum. Japanese Society of Mushroom Science and Biotechology. 13: 83-93.

86

Tang, Y. J. and Zhong, J. J. 2002. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology. 31: 20-28.

Tang, Y. J. and Zhong, J. J. 2003. Role of oxygen in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology. 32: 478-484.

Tchobanoglous, G.,Thesisen, H., and Vilal, S. 1993.Integrated solid waste management engineering principle and management Issues. Mcgraw-Hill, Inc. p. 987.

Urai, M., Aizawa, T., Anzai, H., Ogihara, J., Iwabuchi, N., Neilan, B., Couperwhite,I., Nakajima, M., and Sunairi, M. 2006. Structural analysis of an extracellular polysaccharide produce by a benzene tolerant bacterium, Rhodococcus sp. 33. Carbohydrate Research. 341(5): 616-623.

Veena, S. S., and Pandey, M. 2011. Paddy straw as a substrate for the cultivation of Lingzhi or Reishi medicinal mushroom, Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.) P. Karst. In india. Journal of medicinal mushrooms. 13(4): 397-400.

Vetvicka, V., and Yvin, J. C. 2004. Effects of marine ß -1,3 glucan on immune reactions. International Immunopharmacology. 4: 721–730.

Vichitphan, S., Vichitphan., K., and Sirikhansaeng, P. 2007. Flavonoid content and antioxidant activity of Krachai-dun (Kaempferia parviflora) wine. KMITL Science and Technology. 7: 97-105.

Wagner, R., Mitchell, D. A., Sasaki, G. L., Amazonas, M. A. L. A., and Berovic, M. 2003. Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides. Food Technology and Biotechnology. 41: 371-382.

Wang, J., Zhao, X., Yang, Y., Zhao, A., and Yan, Z. 2015. Characterization and bioactivities of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW32. International Journal of Biological Macromolecules. 74: 119-126.

Wasser, S. P. 2002. Medicinal mushroom as a source of antitumor and immunomudulating polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology. 60: 258-274.

Wood, B. J., Pillai, K. R., and Rajaratnam, J. A. 1979 Palm oil mill effluent disposal on land. Agricultural wastes. 1: 103-127.

87

Wu, T. Y., Mohammad, A. W., Jahim, J.Md., and Anuar, N. 2007. Palm oil mill effluent (POME) treatment and bioresources recovery using ultrafiltration membrane: Effect of pressure on membrane fouling. Biochemical Engineering Journal. 35: 309-317.

Wu, T. Y., Mohammad, A. W., Jahim, J.Md., and Anuar, N. 2009. A holistic approach to managing palm oil mill effluent (POME): Biotechnological advances in the sustainable reuse of POME. Biotechnology Advances. 27: 40-52.

Wu, T. Y., Mohammad, A. W., Jahim, J.Md., and Anuar, N. 2010. Pollution control technologies for the treatment of palm oil mill effluent (POME) through end-of-pipe processes. Journal of Environmental Management. 91: 1467-1490.

Xu, P., Ding, Z., Qian, Z., Zhao, C., and Zhang, K. 2008. Improved production of mycelial biomass and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum SB97 using complex media. Enzyme and Microbial Technology. 42: 325-331. Yang, F. C., and Liau, C. B. 1998. The influence of environmental conditions on

polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in submerged cultures. Process Biochemistry. 33: 547-553.

Yang, F. C., Ke, Y. F., and Kuo, S. S. 2000. Effect of fatty acid on the mycelia growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures. Enzyme and Microbial Technology. 27: 295-301.

Yeong, S. W., and Azizah, A. 1987 Effect of processing on feeding values of palm oil mill effluent (POME) in non-ruminants. Society of Animal Production. 302-306.

Yuan, B., Chi, X., and Zhang, R. 2012. Optimization of exopolysaccharides production from a novel strain of Ganoderma lucidum CAU5501 in submerged culture. Brazilian Journal of Microbiology. 490-497.

Zabka, M. and Pavela, R. 2013. Antifungal efficacy of some natural Phenolsic compounds against significant pathogenic and toxinogenic filamentous fungi. Chemosphere. 93: 1051-1056. Zha, X. Q., Luo, J. P., Jiang, S. T., and Wan, J. U. 2007. Enhancement of polysaccharide

production in suspension culture of protocorm-like bodies from Dedrobium huoshanense by optimization of medium composition and feeding of sucrose. Process Biochemistry. 42: 344-351.

Zhang, H. N., and Lin, Z. B. 2004. Hypoglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides. Acta Pharmacologica Sinica. 25(2): 191-195.

88

ภำคผนวก ก วธเตรยมสำรเคม และวธวเครำะห

ก.1 สตร และวธกำรเตรยมอำหำรเลยงเชอ Sweet Potato Dextrose Broth (SPDB) (สวทย และไซนะ, 2555) มนเทศ (Sweet potato) 250 กรม เพปโตน (Peptone) 1 กรม วตามนบหก (Pyridoxine) 0.5 กรม แคลเซยมคลอไรด (Cacl2) 1.3 กรม น าตาลกลโคส (C6H12O6) 20 กรม ตมมนเทศ 250 กรม ในน ากลน 500 มลลลตร กรองเอาสวนเนอของมนเทศออก น าทไดน ามาเตมเพปโตน 1 กรม วตามนบหก 0.5 กรม แคลเซยมคลอไรด 1.3 กรม และน าตาลกลโคส 20 กรม ปรบปรมาตรดวยน ากลนใหได 1 ลตร กอนใชน าไปฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ทความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท ก.2 กำรว เครำะหปรมำณสำรเอนโดพอลแซคคำไรด ดวยว ธ Phenol sulfuric

colorimetric (Dubois et al., 1956) สำรเคม

1. กรดซลฟวรก (H2SO4) ความเขมขนรอยละ 95 2. สารละลายฟนอล (Phenol) ความเขมขนรอยละ 5 เตรยมโดยละลายฟนอล

5 กรม ในน ากลน 50 มลลลตร แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร 3. สารละลายกลโคส (C6H12O6) ความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร เตรยม

โดยละลายกลโคส 0.1 กรม ในน ากลน 50 มลลลตร แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร วธกำร

1. เตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคส โดยน าสารละลายกลโคสความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร เจอจางใหไดความเขมขน 0-500 ไมโครกรมตอลตร ดงตารางภาคผนวกท ก.1

2. ปเปตตวอยางและสารละลายมาตรฐานกลโคส 200ไมโครลตร ลงในขวดสชา 3. เตมสารละลายฟนอล (รอยละ 5) ลงไป 100 ไมโครลตร 3. เตมกรดซลฟวรก ความเขมขนรอยละ 95 ลงไป 1 มลลลตร ทงไวท

อณหภมหองประมาณ 30 นาท 4. น าไปวดคาการดดกลนแสงท A490 nm ดวยเครอง Spectrophotometer

89

ตำรำงภำคผนวกท ก.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานกลโคสทความเขมขนระดบตางๆ

ควำมเขมขนสำรละลำยมำตรฐำนกลโคส

(ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตรสำรละลำยกลโคส ควำมเขมขน 1 มลลกรมตอ

มลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตรน ำกลน (มลลลตร)

0 100 200 300 400 500

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5

ตำรำงภำคผนวกท ก.2 คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐานกลโคสทความเขมขน ระดบตางๆ

Glucose concentration (µg/ml)

Absorption (490 nm) Absorption-Blank

0 0.5974 0

100 0.8036 0.2062

200 0.9548 0.3574

300 1.0490 0.4516

400 1.1893 0.5919

500 1.3278 0.7304

90

รปภำคผนวกท ก.1 กราฟมาตรฐานกลโคส วเคราะหดวยวธ Phenol sulfuric colorimetric ก.3 วธกำรวเครำะหปรมำณสำร Endo-ß-1,3-glucan ดวยวธวเครำะห Aniline blue

(ดดแปลงจาก Suwanno, et al., 2005)

สำรเคม 1. Aniline blue (รอยละ 0.1) เตรยมโดยละลาย Aniline blue 1.0 กรม ในน ากลน 500 มลลลตร แลวปรบปรมาตรจนครบ 1 ลตร 2. กรดไฮโดรคลอรก (HCl) 1 โมลาร เตรยมโดยตวง HCl (ความเขมขนรอยละ 37) ปรมาตร 82.92 มลลลตร ละลายในน ากลนแลวปรบปรมาตรใหได 1 ลตร 3. NaOH Glycin buffer เตรยมโดยละลาย Glycin 150.14 กรม ละลายในน ากลน 500 มลลลตร แลวปรบปรมาตรใหได 1 ลตร ปรบพเอชใหเทากบ 9.5 ดวย NaOH 2 โมลาร 4. Total Fluorescence ผสมสารเคมทเตรยมไวในอตราสวน Aniline blue (รอยละ 0.1): (HCl) 1 โมลาร: NaOH Glycin buffer เทากบ 40: 21: 59 มลลลตร 5. Auto Fluorescence ผสมสารเคมทเตรยมไวในอตราสวน น ากลน: (HCl) 1 โมลาร: NaOH Glycin buffer เทากบ 40: 21: 59 มลลลตร

วธกำร 1. เตรยม Stock solution ของ ß-1,3-glucan โดยละลาย ß-1,3-glucan 0.01 กรม ในน ากลน 5 มลลลตร แลวปรบปรมาตรใหได 10 มลลลตร (ความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร) เจอจางใหไดความเขมขนระดบตางๆ (0-1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร) ตารางภาคผนวกท ก.3 2. ปเปตสารละลายมาตรฐานแตละความเขมขนจาก Stock solution 400 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลองโดยแยกเปน 2 ชด คอ Total Fluorescence และ Auto Fluorescence

y = 0.0014x R² = 0.9887

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 100 200 300 400 500

Abso

rptio

n (4

90 n

m)

Glucose concentration (µg/ml)

y = 0.0014x R2= 0.9887

Glucose concentration (µg/ml)

Abso

rptio

n (4

90 n

m)

91

3. เตม NaOH (1 โมลาร) ปรมาตร 800 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลองทง 2 ชด เขยาใหเขากน 4. เตมสารละลาย Total Fluorescence และ Auto Fluorescence ในหลอดทดลอง 4.8 มลลลตร เขยาใหเขากน 5. น าไปบมในอางน ารอน (Water bath) ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนระยะเวลา 20 นาท จากนนน ามาตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท 6. น าไปวดคา Fluorescence intensity ดวยเครอง Fluorescence spectrophotometer ดวยความยาวคลน Excitation 393 นาโนเมตร และ Emission 479 นาโนเมตร

Fluorescence inrensity = Total Fluorescence - Auto Fluorescence ตำรำงภำคผนวกท ก.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน ß-1,3-glucan ทความเขมขน ระดบตางๆ

ควำมเขมขนสำรละลำยมำตรฐำน ß-1,3-glucan (ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตร Stock solution ควำมเขมขน 1 มลลกรมตอ

มลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตร NaOH (1 โมลำร) (มลลลตร)

0 100 200 400 800 1,000

0 0.5 1.0 2.0 4.0 5.0

5.0 4.5 4.0 3.0 1.0 0

ตำรำงภำคผนวกท ก.4 คา Fluorescence intensity ของสารละลายมาตรฐาน ß-1,3-glucan ท

ความเขมขนระดบตางๆ ß-1,3-glucan

concentration (µg/ml)

Total fluoresc

ence

Total fluorescence-

Blank

Auto fluorescence

Auto fluorescence-

Blank

Fluorescence intensity

(T-A)

0 1.5021 0 0.9988 0 0 100 12.9003 11.3982 1.2552 0.2564 11.1418 200 21.7024 20.2003 1.5895 0.5907 19.6096 400 33.1772 31.6751 2.0633 1.0645 30.6106 800 49.3545 47.8524 2.1732 1.1744 46.6780 1000 58.9022 57.4001 2.2296 1.2308 56.1693

92

รปภำคผนวกท ก.2 กราฟมาตรฐาน ß-1,3-glucan วเคราะหดวยวธ Aniline blue

y = 0.0524x + 5.5272R² = 0.9718

0

10

20

30

40

50

60

70

0 200 400 600 800 1000

Fluor

esce

nce

inten

sity

(T-A

)

ß-1,3-glucan concentration (µg/ml)

y = 0.0524x +5.572 R2= 0.9718

ß-1,3-glucan concentration (µg/ml)

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(T-A

)

93

ภำคผนวก ข วธเตรยมสำรเคม และวธวเครำะหกจกรรมของสำรตำนอนมลอสระ

ข.1 วธกำรวเครำะหสำรประกอบฟนอลกทงหมด (Total Phenolsic contents) ตามวธของ Chirinang และ Intarapichet (2009)

สำรเคม 1. เตรยมสารละลายมาตรฐาน Gallic acid ความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยละลาย Gallic acid 0.1 กรม ในเมทานอล 50 มลลลตร แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร 2. เตรยม Folin-Cciocalteau 5 มลลลตร ผสมกบเมทานอล 5 มลลลตร (อตราสวน 1:1) 3. เตรยม Na2CO3 2 กรม ละลายในน า DI 100 มลลลตร

กำรเตรยมสำรละลำยตวอยำง ละลายสารสกดทสกดไดจากเสนใยเหดหลนจอ 0.01 กรม ดวยเมทานอล ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร เพอใชเปน Stock solution (ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร) แลวน ามาเจอจางใหไดความเขมขนตางๆ ปรมาตร 1 มลลลตร ดงตารางภาคผนวกท ข.1

ตำรำงภำคผนวกท ข.1 การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ

ควำมเขมขน สำรละลำยตวอยำง

(ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตร Stock solution ควำมเขมขน 100

ไมโครกรมตอมลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตร น ำกลน

(มลลลตร)

25 50 75 100

0.25 0.50 0.75 1.00

0.75 0.50 0.25 0

วธกำร 1. เตรยมตวอยางสารทสกดไดความเขมขนรอยละ 25-100 และสารละลายมาตรฐาน Gallic acid ความเขมขน 0-120 ไมโครกรมตอมลลลตร ความเขมขนละ 100 ไมโครลตร 2. เตมสารละลาย Na2CO3 2 มลลลตร ในตวอยาง และสารละลายมาตรฐานแตละความเขมขน แลวตงทงไวทอณหภมหอง 2 นาท 3. เตม Folin-Ciocalteau 100 ไมโครลตร แลวตงทงไวทอณหภมหอง 30 นาท

94

4. วดคาการดดกลนแสงท A765 nm ดวยเครอง UV/Vis Spectrophotometer

ตำรำงภำคผนวกท ข.2 คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน Gallic acid ทความ เขมขนระดบตางๆ

ควำมเขมขนของ Gallic acid (µg/ml) Absorbance (765 nm)

0

20

40

60

80

100

120

0.0012

0.0364

0.1266

0.1997

0.2731

0.4048

0.4814

รปภำคผนวกท ข.1 กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน Gallic acid

y = . .0041x -. .1/ R² . 7 0

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0 20 40 60 80 100 120

Abso

rban

ce (7

65 n

m)

gallic acid (µg/ml) Gallic acid concentration (µg/ml)

y = 0.0014x +0.0314 R2= 0.9842

Abso

rban

ce (7

65 n

m)

95

ข.2 วธกำรวเครำะห 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH assay) ตามวธของ Elmastas และคณะ (2007)

สำรเคม 1. เตรยมสารละลายมาตรฐาน BHT ความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยชงสารละลาย BHT 0.01 กรม ละลายดวยเมทานอล ปเปตใสขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยเมทานอลใหมความเขมขน 0-120 ไมโครกรมตอมลลลตร 2. เตรยม 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 0.1 มลลโมล โดยชงสาร 0.0039 กรม ละลายในเมทานอล ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร กำรเตรยมสำรละลำยตวอยำง ละลายสารสกดทสกดไดจากเสนใยเหดหลนจอ 0.01 กรม ดวยเมทานอล ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร เพอใชเปน Stock solution (ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร) แลวน ามาเจอจางใหไดความเขมขนตางๆ ปรมาตร 3 มลลลตร ดงตารางภาคผนวกท ข.3 ตำรำงภำคผนวก ข.3 การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ (DPPH assay)

ควำมเขมขน สำรละลำยตวอยำง

(ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตร Stock solution ควำมเขมขน 100

ไมโครกรมตอมลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตร น ำกลน

(มลลลตร)

25 50 75 100

0.75 1.50 2.25 3.00

2.25 1.50 0.75 0

วธกำร 1. เตมตวอยางหรอสารละลายมาตรฐาน 3 มลลลตร 2. เตมสารละลาย DPPH ความเขมขน 0.1 มลลโมล 1 มลลลตร เขยาใหเขากนแลวตงทงไวในทมดทอณหภมหอง 30 นาท 3. วดคาการดดดกลนแสงท A517 nm ดวยเครอง UV/Vis Spectrophotometer

96

ตำรำงภำคผนวกท ข.4 คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขน ระดบตางๆ ควำมเขมขนของ BHT (µg/ml)

Absorbance (517 nm) % Remaining % Inhibition

0

20

40

60

80

100

120

0.6898

0.5292

0.4195

0.3191

0.2300

0.1552

0.0833

0.00

76.72

60.81

46.26

33.34

22.50

12.08

0.00

23.28

39.19

53.74

66.66

77.50

87.92

รปภำคผนวกท ข.2 กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT

y = . .7137x + 710 R² . 7 .7

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% In

hibi

tion

BHT (µg/ml)

% In

hibi

tion

BHT concentration (µg/ml)

y = 0.7137x +6.9327 R2= 0.9809

97

ข.3 ว ธกำรว เครำะห 2, 2’- Azino - bis (3 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulfonic acid) cation radical scavenging assay (ABTS assay) ต า ม ว ธ ข อ ง Chirinang แ ล ะ Intarapichet (2009)

สำรเคม 1. เตรยมสารละลายมาตรฐาน BHT ความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยชง

สารละลาย BHT 0.01 กรม ละลายดวยเมทานอล ปเปตใสขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยเมทานอลใหมความเขมขน 0-120 ไมโครกรมตอมลลลตร

2. เตรยมสารละลาย ABTS ความเขมขน 7 มลลโมล โดยการชงสาร ABTS 0.1 กรม ละลายดวยน า DI ปเปตใสขวดปรบปรมาตรขนาด 25 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน า DI

3. เตรยม K2S2O8 ความเขมขน 2.45 มลลโมล โดย ชงสาร 0.0066 กรม ละลายดวยน า DI ปเปตใสขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน า DI

4. เตรยม ABTS Stock solution โดย ผสม ABTS 7 มลลโมล กบ K2S2O8 2.45 มลลโมล อตราสวน 1:0.5 แลวทงไวทอณหภมหอง 12-16 ชวโมง เกบไวในขวดสชาได 2-3 วน

5. เตรยม ABTS Working solution โดย เจอจาง ABTS Stock solution ดวยน า DI ใหไดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 734 นาโนเมตร ใหมคาประมาณ 0.7-0.9 ตองเตรยมใหมทกครงกอนใช กำรเตรยมสำรละลำยตวอยำง ละลายสารสกดทสกดไดจากเสนใยเหดหลนจอ 0.01 กรม ดวยเมทานอล ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร เพอใชเปน Stock solution (ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร) แลวน ามาเจอจางใหไดความเขมขนตางๆ ปรมาตร 1 มลลลตร ดงตารางภาคผนวกท ข.5

ตำรำงภำคผนวกท ข.5 การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ

ควำมเขมขน สำรละลำยตวอยำง

(ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตร Stock solution ควำมเขมขน 100

ไมโครกรมตอมลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตร น ำกลน

(มลลลตร)

25 50 75 100

0.25 0.50 0.75 1.00

0.75 0.50 0.25 0

98

วธกำร 1. เตรยมตวอยางและสารละลายมาตรฐาน BTH ความเขมขน 0-120 ไมโครกรมตอ

มลลลตร 2. เตมสาร ABTS Working solution 2 มลลลตร ในแตละตวอยาง แลวตงทงไวท

อณหภมหอง 3 นาท 3. วดคาการดดดกลนแสงท A734 nm ดวยเครอง UV/Vis Spectrophotometer

ตำรำงภำคผนวกท ข.6 คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขน ระดบตางๆ

ควำมเขมขนของ BHT (µg/ml)

Absorbance (734 nm) % Remaining % Inhibition

0

20

40

60

80

100

120

0.7992

0.5917

0.4259

0.3390

0.2826

0.1978

0.1489

0.00

74.04

53.29

42.42

35.36

24.75

18.63

0.00

25.96

46.71

57.58

64.64

75.25

81.37

รปภำคผนวกท ข.3 กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT

y = 0.7137x + 6.9327R² = 0.9809

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

% In

hibi

tion

BHT concentration (µg/ml)

99

ข.4 ว ธกำรวเครำะห Ferric reducing antioxidant power (FRAP assay) ตามวธของ

Chirinang และ Intarapichet (2009) สำรเคม

1. เตรยมสารละลายมาตรฐาน BHT ความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยชงสารละลาย BHT 0.01 กรม ละลายดวยเมทานอล ปเปตใสขวดปรบปรมาตรขนาด 10 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยเมทานอลใหมความเขมขน 0-120 ไมโครกรมตอมลลลตร 2. เตรยม Acetate buffer ความเขมขน 300 มลลโมล pH 3.6 โดย ชง CH3COONa 1.5 กรมละลายในกรดแอซตก 8 มลลลตร ปรบปรมาตรดวนน า DI ใหครบ 500 มลลลตร 3. เตรยม FeCl3 ความเขมขน 20 มลลโมล โดย ชง FeCl3 0.054 กรม ละลายดวยน า DI ปรบปรมาตรใหครบ 10 มลลลตร 4. เตรยม TPTZ โดย ชง TPTZ 0.0312 กรม ละลายในกรดไฮโดรคลอรกความเขมขน 40 มลลโมล ปรบปรมาตรใหได 10 มลลลตร 5. เตรยมสารละลาย FRAP โดย ผสม Acetate buffer:FeCl3:TPTZ ในอตราสวน 20:2:2 มลลลตร กำรเตรยมสำรละลำยตวอยำง ละลายสารสกดทสกดไดจากเสนใยเหดหลนจอ 0.01 กรม ดวยเมทานอล ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร เพอใชเปน Stock solution (ความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร) แลวน ามาเจอจางใหไดความเขมขนตางๆ ปรมาตร 1 มลลลตร ดงตารางภาคผนวกท ข.7

ตำรำงภำคผนวกท ข.7 การเตรยมสารละลายตวอยางทความเขมขนระดบตางๆ

ควำมเขมขน สำรละลำยตวอยำง

(ไมโครกรมตอมลลลตร)

ปรมำตร Stock solution ควำมเขมขน 100

ไมโครกรมตอมลลลตร (มลลลตร)

ปรมำตร น ำกลน

(มลลลตร)

25 50 75 100

0.25 0.50 0.75 1.00

0.75 0.50 0.25 0

100

วธกำร 1. น าสารละลาย FRAP บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 8 นาท ปเปต 1.5 มลลลตร ใสหลอดทดลอง 2. เตมน า DI 150 ไมโครลตร 3. เตมตวอยางหรอสารละลายมาตรฐาน BHT 50 ไมโครลตร ทงไวทอณหภมหอง 10 นาท 4. วดคาการดดดกลนแสงท A593 nm ดวยเครอง UV/Vis Spectrophotometer

ตำรำงภำคผนวกท ข.8 คาการดดกลนแสงของสารละลายมาตรฐาน BTH ทความเขมขน ระดบตางๆ

ควำมเขมขนของ BHT (µg/ml) Absorbance (593 nm)

0

20

40

60

80

100

120

0.2063

0.2530

0.3126

0.3586

0.3831

0.4631 0.4814

รปภำคผนวกท ข.4 กราฟมาตรฐานของสารละลายมาตรฐาน BHT

y = . .0024x + . 0/.0R² . 7 7

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0 20 40 60 80 100 120

Abso

rban

ce (59

3 nm

)

BHT (µg/ml)

y = 0.0024x +0.2102 R2= 0.9869

Abso

rban

ce (5

93 n

m)

BHT concentration (µg/ml)

101

ภำคผนวก ค บทควำมวจยทน ำเสนอทประชมวชำกำร (Proceeding)

รชฎาพร ศรรตน และสวทย สวรรณโณ. 2558. ความเปนไปไดของการเพาะเลยงเสนใยเหด หลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ในการประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 53 วนท 3-6 กมภาพนธ 2558. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร.

การเจรญเตบโตของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม Growth of Ganoderma calidophilum mycelia in palm oil mill effluent

รชฎาพร ศรรตน1*, สวทย สวรรณโณ1 Radchadaporn Sirirad1*, Suvit Suwanno1

บทคดยอ งานวจยนมวตถประสงคเพอศกษาการเจรญเตบโต การผลตสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคนของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลอง (Ganoderma calidophilum) ทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ซงมองคประกอบทางเคมไดแก คาพเอช 7.93 ซโอด 7,286.4 มลลกรมตอลตร คาของแขงละลายน าไดทงหมด 11,720 มลลกรมตอลตร ของแขงแขวนลอยทงหมด 1,900 มลลกรมตอลตร คารโบไฮเดรต 4.30 มลลกรมตอลตร ไนโตรเจน 436.66 มลลกรมตอลตร ฟอสฟอรส 14.96 มลลกรมตอลตร โพแทสเซยม 280.10 มลลกรมตอลตร และ เหลก 0.93 มลลกรมตอลตร การเตรยมเชอเรมตนใชเทคนค Seed inoculum ดวยการเพาะเลยงเสนใยในอาหารเหลวเอสพดบบนเครองเขยา 120 รอบตอนาท ทอณหภมหองเปนเวลา 7 วน ใช Seed inoculum รอยละ 7 โดยปรมาตรเพาะเลยงในอาหารน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทปรบคาพเอชเรมตนเทากบ 6 บมในสภาวะนง ทอณหภมหอง เปนเวลา 16 วน พบวาเชอใหน าหนกเสนใยแหงสงสด 1.2 กรมตอลตร ใหปรมาณสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคน 330 และ 148.12 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเสนใยแหง ตามล าดบ

ABSTRACT The objective of this research was to study mycelium growth, polysaccharide and ß-glucan production of Ganoderma calidophilum cultivated in palm oil mill effluent. The palm oil mill effluent had the chemical characteristics including pH 7.93, Chemical Oxygen Demand 7,286.4 mg/l, Total Dissolve Solid 11,720 mg/l, Total Suspended Solid 1,900 mg/l, Carbohydrate 4.30 mg/l, Total Kjeldahl Nitrogen 436 .66 mg/l, Total Phosphorus 14.96 mg/l, Total Potassium 280.10 mg/l and Iron 0.93 mg/l. The initial inoculum was prepared by seed inoculum technique. The technique was done by cultivation the mycelium in Sweet Potato Dextrose Broth (SPDB) and placed on a rotary shaker (120 rpm) at room temperature for 7 days. The 7 % by volume of seed inoculum was cultivated in palm oil mill effluent which adjusted initial pH to 6. The culture was incubated in a static condition at room temperature for 16 days. It was found that the cultivation method gave maximum mycelium dry weight at 1.2 g/l and polysaccharide and ß-glucan contents at 330 and 148.12 µg/g, respectively. Key Words: Ganoderma calidophilum, palm oil mill effluent, polysaccharide, ß -glucan *Corresponding Author; E-mail address: Hidemisou@gmail.com 1คณะการจดการสงแวดลอม มหาวทยาลยสงขลานครนทร สงขลา 90112 1Faculty of Environmental Management, Prince of Songkla University, Songkhla 90112.

ค าน า ในกระบวนการสกดน ามนปาลมตองใชน าเปนปรมาณมาก และปรมาณน ามากกวารอยละ 50 ของน าทใช

ในกระบวนการสกดจะกลายเปนน าทง (Ahmad et al., 2003) จากผลการวเคราะหองคประกอบของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม พบวาในน าทงมปรมาณของสารอนทรยสง ทงโปรตน ไขมน สารประกอบไนโตรเจน และแรธาต (Ho et al., 1984) จงมการน าไปใชประโยชนในดานตางๆอยางแพรหลาย เชน การน าไปใชเปนป ย การน าไปใชเปนอาหารสตว การน าไปใชเปนแหลงอาหารเพาะเลยงจลนทรยเพอใหไดผลผลตเปนกาซชวภาพ กรดอนทรย เอนไซม สารก าจดแมลง (Wu et al., 2007) ดงนนน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจงนาจะเหมาะส าหรบใชเปนอาหารเพาะเลยงเสนใยเหดเชนเดยวกน โดยปกตแลวเหดหลนจอจะพบไดนอยมากตามธรรมชาตและมอายการเกบเกยวทยาวนานกวาจะตดดอกมาสกดสารโพลแซคคาไรดได ดงนนเทคนคการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอในอาหารเหลวจงเปนวธทชวยลดระยะเวลาในการผลตสารโพลแซคคาไรดได (Tang and Zhong, 2002) สารโพลแซคคาไรดจากเหดหลนจอมสรรพคณชวยสงเสรมระบบภมคมกนของรางกาย ชวยในการยบยงการเจรญและแพรกระจายของเนองอก ปองกนการเกดมะเรง ปองกนและควบคมระดบน าตาลในเลอด (Wasser, 2002) สารโพลแซคคาไรดโดยเฉพาะ ß-1,3-glucan จากเหดหลนจอจงเปนทตองการของตลาดโลก ประกอบกบน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทมสวนประกอบของสารอาหารตางๆและลกโนเซลลโลส ซงมคณสมบตใกลเคยงกบแหลงอาหารตามธรรมชาตของเหดหลนจอ งานวจยนจงสนใจศกษาการเจรญเตบโต การผลตสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคนของเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

อปกรณและวธการ

การศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม น าน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลมในเขตอ าเภอละง จงหวดสตล ทเกบจากตอนกลางของระบบบ าบดน า

ทงแบบ facultative pond (บอท 3) ใชการเกบแบบจวง (grab sampling) น าทงทเกบไดใสในภาชนะพลาสตกแลวปดฝาใหสนท หลงจากนนน าไปแชเยนไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส กรองดวยผาขาวบางเพอก าจดเศษใบไมและกงไมออก หลงจากนนน ามาวเคราะหองคประกอบทางเคมไดแก pH, Chemical Oxygen Demand (COD), Total Dissolved Solid (TDS), Total Suspended Solid (TSS), Carbohydrate, Total Kjeldahl Nitrogen (TKN), Total Phosphorus (TP), Total Potassium (TK) และ Iron (Fe) ตามวธของ APHA, AWWA, WEF (2005) การทดสอบวธการเตรยมเชอเรมตน เชอเหดหลนจอขอบเหลองทไดรบความอนเคราะหจากหองปฏบตการเทคโนโลยชวภาพสงแวดลอม คณะ การจดการสงแวดลอม มหาวทยาลยสงขลานครนทร ซงคดแยกเชอบรสทธจากดอกเหดหลนจอขอบเหลองทไดจากแหลงธรรมชาตในเขตจงหวดภาคใตตอนลาง โดยเปรยบเทยบระหวางการใชเชอเรมตน 2 วธ คอ วธ disk inoculum และ seed inoculum ดงน

- วธ Disk inoculum ใชเชอเรมตนจากการเพาะเลยงเชอเหดหลนจอขอบเหลองบนอาหารแขงพดเอเปนเวลา 7 วน แลวตดเสนใยเหดดวยคอรกบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร จ านวน 5 ชนน าไป

เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจ านวน 1 ลตร ซงบรรจในโหลแกวขนาด กวาง x ยาว x สง เทากบ 5 นว x 15 นว x 5 นว เลยงในสภาวะนง (static condition) ทอณหภมหอง เปนเวลา 16 วน แลวจงเกบเกยวเสนใยเหดดวยการกรองและลางดวยน ากลน 3 ครง น าเสนใยทไดท าแหงดวยวธแชเยอกแขง (lyophilization) เพอน าไปวเคราะหน าหนกเสนใยแหงตอไป

- วธ Seed inoculum ใชเชอเรมตนจากการน าเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงไวบนอาหารแขงพดเอ ซงตดดวยคอรกบอเรอรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.4 เซนตเมตร จ านวน 2 ชน เพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ (Sweet Potato Dextrose Broth: SPDB) ทประกอบดวย มนเทศ 250 กรม น าตาลเดกโตรส 20 กรม เปปโตน 1 กรม วตามนบหก 0.5 กรม และแคลเซยมคลอไรด 1.3 กรม ตอน า 1 ลตร (สวทย และ ไซนะ, 2555) ปรมาณ 100 มลลลตร ในฟลาสกขนาด 250 มลลลตร เพาะเลยงบนเครองเขยาทความเรว 120 รอบตอนาท ทอณหภมหอง เปนเวลา 3 วน หลงจากนนจงกรองแยก seed และลางดวยน ากลนทผานการฆาเชอ 3 ครง แลวน า seed ทไดใชเปนเชอเรมตน รอยละ 7 โดยปรมาตร เพอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเชนเดยวกบวธ Disk inoculum การศกษาการเจรญเตบโตของเชอเรมตนในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม

ใช Seed inoculum ทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบเปนเวลา 3, 5 และ 7 วน อตรารอยละ 7 โดยปรมาตร เพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมปรมาตร 200 มลลลตร ในฟลาสกขนาด 500 มลลลตร เพาะเลยงบนเครองเขยา 120 รอบตอนาท ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 3 วน เปนระยะเวลา 9 วน กรองและลางเสนใยดวยน ากลน 3 ครง กอนน าไปไดท าแหงแบบแชเยอกแขง เพอวเคราะหน าหนกเสนใยแหงทเพมขนตามระยะเวลาทผานไป (น าหนกทเพมขน = น าหนกสดทาย - น าหนกเรมตน) การศกษาคาพเอชเรมตนท เหมาะสมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลอง

ปรบคาพเอชเรมตนของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมใหเทากบ 4, 5, 6 และ 7 เพอทดลองเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลองเทยบกบ control ทมพเอช 7.93 โดยใช Seed inoculum ทเหมาะสมจากผลการทดลองกอนหนาน เพาะเลยงในสภาวะนง ทอณหภมหอง เกบตวอยางทกๆ 4 วน เปนระยะเวลา 16 วน หลงจากนนจงกรองแยกเสนใยทเพาะเลยงไดลางดวยน ากลน 3 ครง แลวน าไปท าแหงแบบแชเยอกแขง เพอวเคราะหน าหนกเสนใยแหง ปรมาณโพลแซคคาไรด และเบตากลแคน ตอไป การสกดและวเคราะหสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคน

1. การสกดสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคน ท าการสกดเสนใยแหงของเหดหลนจอขอบเหลองตามวธของ Suwanno et al. (2005) โดยน าเสนใยเหดท

ผานการท าแหงแบบแชเยอกแขงแลว 1 กรม เตมน ากลน 5 มลลลตร ผสมใหเขากนน าไปใหความรอนทอณหภม 120 องศาเซลเซยส ทความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 120 นาท แลวน าไปเตม silicon dioxide 2 กรม บดดวยโกรงจนละเอยด จากนนเตมน ากลน 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงท 4,000 รอบตอนาท เปนเวลา 20 นาท จะไดสารละลายใสสวนท 1 สวนของตะกอนน ามาเตมน ากลน 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงอกครง ไดสารละลายใสสวนท 2 สวนของตะกอนทเหลอน าไปเตมโซเดยม ไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงท 4,000 รอบตอ

นาท เปนเวลา 20 นาท ไดสารละลายใสสวนท 3 สวนของตะกอนน ามาเตมโซเดยมไฮดรอกไซด (1 โมลาร) 5 มลลลตร น าไปหมนเหวยงอกครง ไดสารละลายใสสวนท 4 น าสารละลายใสทง 4 สวนทไดมารวมกน

2. การวเคราะหสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคน 2.1 วเคราะหปรมาณสารโพลแซคคาไรดดวยวธ Phenol-Sulfuric Colorimetric โดยดดแปลงจาก

วธของ Dubios et al. (1956) ซงใชกลโคสเปนสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 0 – 200 ไมโครกรมตอมลลลตร วดคาการดดกลนแสงท 490 นาโนเมตร ดวยเครอง spectrophotometer (Shimadzu รน UV-1601)

2.2 วเคราะหปรมาณ ß -glucan ดวยวธ Aniline blue (Suwanno et al., 2005) โดยใช ß -1,3-D-glucan (Fluka) เปนสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 0 – 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง fluorescence spectrophotometer ทความยาวคลน excitation 393 นาโนเมตร และ emission 479 นาโนเมตร (fluorescence intensity = total fluorescence – auto fluorescence) การวางแผนการทดลอง

วางแผนการทดลองแบบ CRD (Complete Randomized Design) ชดการทดลองละ 3 ซ า และวเคราะหความแปรปรวน (ANOVA) ตามแผนการทดลองทวางไว เพอเปรยบเทยบความแตกตางทางสถตของคาเฉลยแตละชดการทดลองโดยวธ DMRT (Duncan’s New Multiple Range Test)

ผลการทดลองและวจารณ

ผลการศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลม จากการศกษาองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมจากระบบบ าบดแบบ facultative บอ

ท 3 พบวาคาพเอชเทากบ 7.93 คาซโอดเทากบ 7,286.4 มลลกรมตอลตร คาของแขงละลายน าไดทงหมดและของแขงแขวนลอยทงหมดอยท 11,720 และ 1,900 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ สวนปรมาณธาตอาหารอนๆ ในน าทง ไดแก คารโบไฮเดรต ไนโตรเจน ฟอสฟอรส โพแทสเซยม และเหลก อยท 4.30, 436.66, 14.96, 280.10, 0.93 มลลกรมตอลตร ตามล าดบ เมอเปรยบเทยบคาทวเคราะหไดกบงานวจยทเกยวของกบองคประกอบทางเคมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมสวนใหญพบวามคาต ากวา ทงนเนองจากตวอยางน าทงทใชน ามาจากระบบบ าบดน าเสยตอนกลาง ซงมการบ าบดและยอยสลายสารอนทรยไปบางบางสวนแลว ท าใหสารอนทรยทอยในน าทงมปรมาณความเขมขนลดลง แตยงคงเหลอปรมาณสารอาหารทเปนประโยชน เชน คารโบไฮเดรต ไนโตรเจน และธาตอาหารทสามารถใชเปนแหลงอาหารในการเจรญเตบโตของเสนใยเหดทดแทนแหลงอาหารตามธรรมชาตได ผลการทดสอบวธการเตรยมเชอเรมตน

จากการศกษาพบวา วธ Disk inoculum เชอเหดไมสามารถเจรญไดเมอน าไปเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม (Figure 1a) ทงนอาจจะเนองจากเชอจะอยในระยะ lag phase เปนระยะเวลานานเพอปรบตวใหเขากบสภาพของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม โดยวธนจะท าใหเชอเจรญเตบโตไดต าเนองจากมสภาวะกดดนสงจากสภาพแวดลอมของอาหารทเปลยนจากของแขงเปนของเหลว สวนวธ Seed inoculum เสนใยเหดจะเกดการเจรญเตบโตลอยอยบนผวหนาของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม ลกษณะของเสนใยมสขาว จบตวกนเปนแผนบางๆ

(Figure 1b) ใหน าหนกเสนใยแหง 0.6 กรมตอลตร หลงเพาะเลยงเปนระยะเวลา 16 วน ซงวธ Seed inoculums น เสนใยของเหดทเพาะเลยงในอาหารเหลวเอสพดบ กอนแลวน าไปเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมสามารถปรบตวไดมากกวา เนองจากสภาวะกดดนจากสภาพแวดลอมของอาหารนอยกวาท าใหเสนใยของเหดเจรญเตบโตไดสง โดยทวไปมกใชวธ Pre-culture เพอใหเชอไดปรบสภาพและท าใหไดผลผลตสดทายทดกวา (Wagner et al., 2003)

Figure 1 Characteristic of Ganoderma calidophilum mycelial growth in palm oil mill effluent at room temperature for 16 days: a. Disk inoculum and b. Seed inoculum.

ผลการศกษาการเจรญตบโตของเชอเรมตนในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลม พบวาการเตรยม Seed inoculum ดวยการเพาะเลยงในอาหารเอสพดบเปนเวลา 7 วน กอนน าไปใชเปนเชอ

เรมตนในการเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมเปนระยะเวลา 9 วน เชอเหดสามารถใหคาน าหนกเสนใยแหงเพมขนสงสดเทากบ 1.43 กรมตอลตร ซงคาน าหนกเสนใยแหงทเพมขนดงกลาวมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบ Seed inoculum ทใชเวลาเตรยม 3 และ 5 วน (Figure 2) ทงน เนองจากระยะเวลาทใชในการเตรยม seed inoculum มผลตอขนาดของ pellet โดยทระยะเวลา 7 วน seed inoculum จะมขนาดเสนผานศนยกลางของ pellet 0.99 เซนตเมตร ซงมขนาดใหญกวาทระยะเวลา 5 วน และ 3 วน ทมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.66 เซนตเมตร และ 0.36 เซนตเมตร ตามล าดบ ทงนเนองจากขนาดของ pellet ทใหญกวาจะสงผลให seed inoculum สามารถปรบตวและทนตอสภาพแวดลอมของอาหารทเปลยนไปไดดกวา จงท าใหเสนใย Ganoderma calidophilum สามารถเจรญเตบโตและสรางน าหนกเสนใยแหงมากขนเชนกน จากงานวจยของ Ding et al., 2012 ทเตรยม seed inoculum จากเชอ Ganoderma lucidum ในอาหาร seed medium (กลโคส 20 กรมตอลตร เปปโตน 10 กรมตอลตร โพแทสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 4.5 กรมตอลตร และ แมกนเซยมซลเฟต 2 กรมตอลตร) พบวา ขนาดของ pellet สามารถแบงไดเปน 3 ขนาด คอ ขนาดเลก (S) จะพบในวนแรกของการเพาะเลยง ขนาดกลาง (M) จะเกดในระยะเวลาการเพาะเลยง 2-6 วน และ ขนาดใหญ (L) ทระยะเวลาการเพาะเลยง 7-9 วน ซงจากผลการทดลองขนาดของ pellet ทระยะเวลา 7 วน มขนาดใหญกวา pellet ทระยะเวลาการเพาะเลยง 5 และ 3 วน เชนกน

b

a

ผลการศกษาคาพเอชเรมตนท เหมาะสมของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมตอการเพาะเลยงเสนใยเหดหลนจอขอบเหลอง

จากการศกษาพบวา ทระดบพเอชเรมตนของอาหารเทากบ 6 เชอเหดหลนจอขอบเหลองใหคาน าหนกเสนใยแหงสงสด 1.2 กรมตอลตร ทระยะเวลาการเพาะเลยง 16 วน ซงคาทไดมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทระดบคาพเอชเรมตนอนๆ โดยทระดบพเอชเรมตนเทากบ 4, 5 ,7 และ 7.93 เชอเหดใหคาน าหนกเสนใยแหงเทากบ 0.752, 0.986, 0.875 และ 0.609 กรมตอลตร ตามล าดบ ทเวลาเพาะเลยง 16 วน (Figure 3)

ผลการวเคราะหสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคน

พบวาเชอเหดหลนจอขอบเหลองทเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมพเอชเรมตนเทากบ 6 สามารถผลตสารโพลแซคคาไรด และสารเบตากลแคนไดสงสดเทากบ 330.00 และ 148.12 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเซลล

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

0 3 6 9

inoculum 3 days

inoculum 5 days

inoculum 7 days

a

b

c

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 4 8 12 16

pH 4 pH 5pH 6 pH 7control (pH 7.93)

Time (d)

a

bcde

Figure 2 Effect of seed inoculum preparation on mycelial dry weight of Ganoderma calidophilum cultivated with palm oil mill effluent on a rotary shaker (120 rpm) at room temperature for 9 days.

Figure 3 Effect of different initial pH of palm oil mill effluent on mycelial dry weight of Ganoderma calidophilum, cultivated at static condition and room temperature.

Time (d)

Incr

easin

g dr

y weig

ht (g

/l)

Myce

lium

dry

weig

ht (g

/l)

แหง ตามล าดบ ซงมคาความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p≤0.05) เมอเปรยบเทยบกบทคาพเอช เรมตนของน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมในระดบอนๆ (Figure 4) ซงสอดคลองกบงานวจยของ Lee et al. (1999) ทเพมระดบพเอชเรมตนของสารอาหารวายเอฟเอมในการเพาะเลยง Ganoderma lucidum จากพเอช 3 เปนพเอช 6 โดยการเพาะเลยงดวยวธการใหอากาศบนเครองเขยาทความเรว 150 รอบตอนาท อณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วน พบวาเชอสามารถผลผลตสารเอกโซโพลแซคคาไรดเพมขนจาก 4.1 กรมตอลตร เปน 20.1 กรมตอลตร และสอดคลองกบงานวจยของ Fang and Zhong (2002) เพาะเลยง Ganoderma lucidum ในอาหารวายเอฟเอมทปรบคาพเอชเรมตนเทากบ 6.5 พบวาเชอใหผลผลตของชวมวลสงสดท 17.3 กรมตอลตรโดยน าหนกแหง สวน Endo-polysaccharide จะใหผลผลตสงสดในชวงของคาพเอช 5.5-7.0 ซงคาพเอชเรมตนทเหมาะสมของอาหารจะมผลตอการละลายของเกลอในอาหาร รปรางและขนาดของเซลล การท างานของผนงเซลล การล าเลยงสารอาหาร กจกรรมของเอนไซม ซงจะชวยสงเสรมใหการสรางผลผลตของเซลลเพมขน (Vladimir, 2012)

สรป การใชเชอเรมตนแบบ Seed inoculum เสนใยของเหดหลนจอขอบเหลองสามารถเจรญเตบโตในน าทง

โรงงานสกดน ามนปาลมไดดกวาการใชเชอเรมตนแบบ Disk inoculum การเตรยม Seed inoculum ทเพาะเลยง เสนใยเหดหลนจอขอบเหลองในอาหารเหลวเอสพดบเปนเวลา 7 วน กอนน าไปใชเปนเชอเรมตนรอยละ 7 โดยปรมาตร เพอเพาะเลยงในน าทงโรงงานสกดน ามนปาลมทปรบคาพเอชเรมตนเทากบ 6 พบวาเชอเหดใหน าหนก เสนใยแหง 1.2 กรม ใหปรมาณสารโพลแซคคาไรดและเบตากลแคนเทากบ 330 และ 148.12 ไมโครกรมตอกรมน าหนกเสนใยแหง ตามล าดบ ซงเทคนคการเตรยม Seed inoculum และคาพเอชเรมตนทเหมาะสมนสามารถใชเปนขอมลเบองตนส าหรบการประยกตใชในกระบวนการผลตสารโพลแซคคาไรดในเชงพาณชย และเปนวธการหนงของการลดปรมาณน าทงจากโรงงานสกดน ามนปาลมทจะปลอยสสงแวดลอมไดอกทางหนง

050

100150200250300350400

pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 7.93

Polysaccharide

β-1,3-D-glucana

cb

BA

d

E eDC

Figure 4 Effect of different initial pH of palm oil mill effluent on polysaccharide and ß-1,3-D-glucan contents of Ganoderma calidophilum cultivated at static condition and room temperature.

Conc

entra

tion

(µg/

g dr

y weig

ht)

pH level

กตตกรรมประกาศ งานวจยนไดรบทนอดหนนงานวจยจากทนบณฑตศกษา มหาวทยาลยสงขลานครนทร ปงบประมาณ 2554

และทนอดหนนการวจยงบประมาณแผนดน มหาวทยาลยสงขลานครนทร ปงบประมาณ 2555 - 2556

เอกสารอางอง

สวทย สวรรณโณ และ ไซนะ มเลง. 2555. การสงเสรมการผลตเสนใยและสารโพลแซคคาไรดจากเหดแครง (Schizophyllum commune) โดยสภาวะของสารอาหารเพาะเลยงทเหมาะสม. วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยมหาสารคาม 31(4): 335-342.

Ahmad, A. L., S. Ismail, and S. Bhatia. 2003. Water recycling from palm oil mill effluent (POME) using membrane technology. Desalination 157: 87-95.

APHA, AWWA and WEF. 2005. “Standard Methods for Examination of Water and Wastewater”. American Public Heaith Association, American Water Work Association and Water Environment Federation (21thed.). Washington DC., USA.

Ding, Z. Y., Q. Wang, L. Peng, L. Zhang, Z. G. Gu, G. Y. Shi and K. C. Zhang. 2012. Relationship between mycelium morphology and extracellular polysaccharide production of medicinal mushroom Ganoderma lucidum in submerged culture. Journal of Medicinal Plants Research. 6(14): 2868-2874.

Dubios, M., K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers and F. Smith. 1956. Colometric method for determination of sugar and related substance. Analytical Biochemistry 28:350-356.

Fang, Q. H., and J. J. Zhong. 2002. Two-stage culture process for improved production of ganoderic acid by liquid fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum. Biotechnology Progress 18(1): 51-54.

Ho, C. C., Y. K. Tan and C. W. Wang. 1984. The distribution of chemical constituents between the soluble and the particulate fraction of palm oil mill effluent and its significance on its utilization/treatment. Journal of Agricultural Wastes 11: 61-71.

Lee, K. M., S. Y. Lee, and H. Y. Lee. 1999. Bistage control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganoderma lucidum in an air-lift fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering. 88: 646–50.

Suwanno, S., K. Nakamura, Y. Aman, M. Shida and I. Horiuchi. 2005. Development of the method for efficient disruption and rapid extraction on the ß -1,3-glucan determination from the mycelia of Ganoderma lucidum. Japanese Society of Mushroom Science and Biotechology 13: 83-93.

Tang, Y. J. and J. J. Zhong. 2002. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology. 31: 20-28.

Vladimir, E. 2012. Submerged cultivation of medicinal mushroom: bioprocesses and products (review). International Journal of Medicinal Mushroom 14(3): 211-239.

Wagner, R., D. A. Mitchell, G. L. Sasaki, M. A. L. A. Amazonas and M. Berovic. 2003. Current techniques for the cultivation of Ganoderma lucidum for the production of biomass, ganoderic acid and polysaccharides. Food Technology and Biotechnology 41: 371-382.

Wasser, S. P. 2002. Medicinal mushroom as a source of antitumor and immunomudulating polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology 60: 258-274.

Wu, T. Y., A. W. Mohammad, J. Md. Jahim and N. Anuar. 2007. Palm oil mill effluent (POME) treatment and bioresources recovery using ultrafiltration membrane: Effect of pressure on membrane fouling. Biochemical Engineering Journal 35: 309-317.