รูปแบบของความหลากหลายทางพันธุกรรมและพลวัต การถ่ายเทยีนของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรังโดยใช้

เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์

โดย ชฎาพร เสนาคุณและคณะ

โครงการวิจัยนี้ได้รบัการสนับสนุนการวิจัย งบประมาณแผ่นดิน (วช) ประจ าปีงบประมาณ 2557

มหาวิทยาลัยมหาสารคาม

รูปแบบของความหลากหลายทางพันธุกรรมและพลวัต การถ่ายเทยีนของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรังโดยใช้

เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์

คณะผู้วิจัย ดร.ชฎาพร เสนาคุณ

ดร.อิสราภรณ์ สมบุญวัฒนกุล ดร.วิภาวดี ได้ผลมาก นายคมกริช วงศ์ภาค า นายอารยะ เสนาคณุ นายสุรพล ยอดศิร ินายวรายุธ พิลาภ

โครงการวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนการวิจัย งบประมาณแผ่นดิน ประจ าปีงบประมาณ 2557

มหาวิทยาลัยมหาสารคาม

กิตติกรรมประกาศ งานวิจัยเรื่องรูปแบบของความหลากหลายทางพันธุกรรมและพลวัตการถ่ายเทยีนของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรังโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ ได้รับงบประมาณสนับสนุนจากงบประมาณแผ่นดิน (วช) ประจ าปี 2557 มหาวิทยาลัยมหาสารคาม

ผู้วิจัยขอขอบคุณเจ้าหน้าที่อุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี อุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ และกรรมการและเจ้าหน้าที่ส านักวิจัยอนุรักษ์ป่าไม้ กรมอุทยานแห่งชาติ สัตว์ป่าและพันธุ์พืช ที่ช่วยเหลือในการเก็บตัวอย่าง ติดต่อประสานงานและอ านวยความสะดวกในการเข้าเก็บตัวอย่าง ใน อุทยานแห่งชาติ

ขอขอบคุณนักศึกษาฝึกงาน จากมหาวิทยาลัยราชภัฎเลยและร้อยเอ็ด ที่ช่วยเหลือในการเก็บตัวอย่างและในห้องปฏิบัติการ

ขอขอบคุณอาจารย์และเจ้าหน้าที่ สถาบันวิจัยวลัยรุกขเวช มหาวิทยาลัยมหาสารคาม ที่ให้ความอนุเคราะห์ในการท าวิจัย และประสานงานเรื่องเอกสารงานวิจัย

ขอขอบคุณครอบครัว ที่เป็นก าลังใจและช่วยเหลือในการเก็บตัวอย่าง ผู้วิจัยหวังเป็นอย่างยิ่งว่างานวิจัยนี้จะเป็นประโยชน์ต่อผู้ที่สนใจศึกษาต่อไป

บทคัดย่อ การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมเพ่ือประเมินสถานภาพแหล่งพันธุกรรมและระบบสืบพันธุ์ของไม้ดัชนีส าคัญในป่าเต็งรัง ได้แก่ เต็ง รัง ยางเหียงและพลวง ด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ โดยเก็บตัวอย่างใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ จ านวน 121 หมายเลข น าเมล็ดพันธุ์มาเพาะต้นกล้า จ านวน 420 หมายเลข จากอุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี และอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ วัดพิกัดภูมิศาสตร์ทุกต้น เพ่ือหาระยะห่างการกระจายพันธุ์ น าใบมาสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี Doyle and Doyle (1987) ดัดแปลง และหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ ผลการสกัดดีเอ็นเอจากใบของพืชทั้ง 121 หมายเลขได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เพียงพอ แต่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอมีการปนเปื้อน ไม่สามารถน าดีเอ็นเอต้นแบบมาหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมได้ทั้งหมด การหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมจ านวน 14 ไพรเมอร์ พบว่ามี 6 ไพรเมอร์ ได้แก่ shc07 shc09 shc11 sle111 sle118 และ sle562 ที่ประสบความส าเร็จในการ cross -specice amplification โดยสามารถเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอและได้ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอมีแถบแบนขึ้นในต าแหน่งตรงเป้าหมาย แต่ตัวอย่างพืชส่วนใหญ่ที่น ามาสกัดดีเอ็นไม่สามารถใช้ในการศึกษาครั้งนี้ จึงท าให้ได้ข้อไม่เพียงพอที่จะน าไปวิเคราะห์ผลหาจ านวนอัลลีลเฉลี่ยต่อต าแหน่ง ร้อยละของยีนในสภาวะหลากรูปแบบ ค่าเฮเทอโรไซโกซิตี การทดสอบสมดุลฮาร์ดี-ไวน์เบิร์ก ค่าสัมประสิทธิ์เอฟ การวิเคราะห์รูปแบบผสมพันธุ์ อัตราการผสมข้าม และอัตราการผสมเลือดชิดได้ อย่างไรก็ตามการประเมินสภาพแหล่งพันธุกรรมไม้ป่า ซึ่งเป็นองค์ประกอบหนึ่งของความหลากหลายทางชีวภาพที่มีความส าคัญต่อการด ารงอยู่ของสิ่งมีชีวิตยังมีความส าคัญอย่างยิ่งโดยเฉพาะพืชที่เป็นดัชนีส าคัญในป่า จึงควรจะต้องหาวิธีการเพ่ือประเมินสภาพแหล่งพันธุกรรมของพืชป่าเหล่านี้ไว้ เพื่อให้ได้ข้อมูลที่จะน ามาใช้เป็นแนวทางในการอนุรักษ์แหล่งทรัพยากรชีวภาพต่อไป

ค าหลัก: ความหลากหลายทางพันธุกรรม เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโคแซทเทิลไลท์ ระบบสืบพันธุ์

การอนุรักษ์แหล่งทรัพยากรชีวภาพ

Abstract

A study to assess the genetic diversity, genetic resources and mating system of keystone specie in a deciduous dipterocarp forest including Shorea obtusa, Shorea siamensis, Dipterocarp obtusifolius and Dipterocarp tuberculatus using DNA microsatellite marker. 121 samples of leaves of candidate parent and 420 samples of seed of offspring were collected from Phatam National Park, Ubon Ratchathani and Thaithong National Park, Chaiyaphum. Coordinates all the measured for the distance distribution of species. The DNA extraction of leaves by Doyle and Doyle (1987) and adapted using for the appropriate primer PCR. The results was found that the quantity of DNA have a sufficient amount of DNA but the purity of the DNA of most sample plant were contamination and bad quality. The preliminary screening of 14 primer pairs, six primer pairs include shc07 shc09 shc11 sle111 sle118 and sle562 were selected as the suitable primer pairs for successful cross-species amplification. The PCR product showed the good banding and on in the expected size. Unfortunately, most of the DNA template sample plant cannot use in this study. There are not enough data to be analyzed for the number of alleles per locus, percentage of polymorphic loci, heterozygosity, test of Hardy – Weinberg equilibrium, F- coefficient, mating system pattern, crossing rate and rate of inbreeding. However, the assessment of forest genetic resources which is a component of biodiversity is vital to the existence of life are also important, especially in keystone species. We should find a way to assess the genetic resource of these plant. In order to get the information to be used as guidelines for conservation of biological resources of forests. Keywords: genetic diversity, DNA microsatellite marker, mating system,

conversation of biological resource

สารบัญ

หน้า บทที่ 1 บทน า 1 บทที่ 2 เอกสารงานวิจัยที่เก่ียวข้อง 3 บทที่ 3 วิธีด าเนินการวิจัย 6 บทที่ 4 ผลการศึกษา 11 บทที่ 5 สรุป อภิปรายผลและข้อเสนอแนะ 21 เอกสารอ้างอิง 23 ภาคผนวก 25

บัญชีตาราง

หน้า ตารางที่ 3.1 แสดงล าดับนิวคลีโอไทด์ ล าดับเบสแกน และขนาดของผลลผิตของพีซีอาร์

ของคู่ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา 10 ตารางที่ 4.1 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ของเต็งและรัง 16 ตารางที่ 4.2 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ ของยางเหียงและพลวง 17 ตารางที่ 4.3 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นกล้า (offspring) ของต้นรัง 18 ตารางที่ 4.4 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากเอมบริโอของผลเต็ง 19

บัญชีภาพประกอบ

หน้า ภาพที่ 3.1 แสดงพ้ืนที่เก็บตัวอย่างของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรัง 9 ภาพที่ 4.1 ลักษณะสัณฐานวิทยาของเต็ง 13 ภาพที่ 4.2 ลักษณะสัณฐานวิทยาของรัง 13 ภาพที่ 4.3 ลักษณะสัณฐานวิทยาของยางเหียง 14 ภาพที่ 4.4 ลักษณะสัณฐานวิทยาของพลวง 14 ภาพที่ 4.5 แสดงการเพาะเมล็ดพันธุ์ในสภาพเลียนแบบธรรมชาติของต้นรัง 15 ภาพที่ 4.6 แสดงการเพาะเมล็ดพันธุ์ในสภาพเลียนแบบธรรมชาติของต้นยางเหียง 15

บทที่ 1 บทน ำ

ความหลากหลายทางพันธุกรรม (Genetic diversity) เป็นองค์ประกอบส าคัญในกระบวนการทาง

วิวัฒนาการ จากทฤษฎีทางวิวัฒนาการท าให้ทราบว่าความหลากหลายทางพันธุกรรม มีความส าคัญและจ าเป็นอย่างยิ่งต่อการอยู่รอดของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด หากไม่มีความหลากหลายทางพันธุกรรม สิ่งมีชีวิตแต่ละชนิดจะไม่สามารถปรับตัวให้เข้ากับสิ่งแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลาได้ และจะค่อย ๆ สูญพันธุ์ไปในที่สุด (Hamrick et al., 1991) การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมจึงเป็นส่วนประกอบส าคัญอย่างหนึ่งในการอนุรักษ์ความหลากหลายทางชีวภาพ โดยเฉพาะในแถบเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ได้รับผลกระทบจากการลดลงของพ้ืนที่ป่า (Deforestation) และพ้ืนที่แบ่งแยกเป็นหย่อมขนาดเล็ก (Fragment forest) ท าให้ระบบนิเวศเปลี่ยนแปลงและเสียสมดุลทางธรรมชาติ และรูปแบบของความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีน และระบบสืบพันธุ์ของสิ่งมีชีวิตในพ้ืนที่ป่าเปลี่ยนแปลงไป การสูญเสียถิ่นที่อยู่อาศัยและการเปลี่ยนแปลงพ้ืนที่ ท าให้พันธุกรรมของพืชและสัตว์หลายชนิดเกิดเจเนติกส์ดริฟท์ (Genetic drif) และเกิดการผสมเลือดชิด (inbreeding) มากขึ้น ส่งผลให้ความหลากหลายทางพันธุกรรมลดลง (Slatkin, 1985; Murawski & Hamrick, 1992) ดังนั้นการวัดระดับและการกระจายความหลากหลายทางพันธุกรรมพืช เช่น การศึกษารูปแบบความหลากหลายทางพันธุกรรม (pattern of genetic diversity) โครงสร้างทางพันธุกรรม (genetic structure) การถ่ายเทยีน (gene flow) และกระบวนการสืบพันธุ์ (reproductive process) จึงถูกน ามาใช้ในการศึกษาและประยุกต์ใช้ในการศึกษาด้านพันธุ์ศาสตร์ป่าไม้และการวางแผนอนุรักษ์พันธุกรรมของพืชอย่างแพร่หลาย (Finkeldey & Hattemer, 2007; White et al., 2007)

ป่าเต็งรัง หรือ Dry Deciduous Dipterocarpus Forest (DDF) มีพ้ืนที่ป่าประมาณ 30 % ในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ โดยเฉพาะประเทศไทยมีป่าเต็งรังที่เป็นระบบนิเวศอันเป็นเอกลักษณ์และเปราะบาง (ธวัชชัย สันติสุข, 2550; Ghazoul, 2007) ลักษณะป่าเต็งรังเป็นป่าโปร่ง ประกอบด้วยต้นไม้ผลัดใบขนาดกลางและขนาดเล็กขึ้นห่างๆ กระจัดกระจายไม่ค่อยแน่นทึบ พ้ืนป่ามีหญ้าและไผ่แคระจ าพวกไผ่เพ็ก ไผ่โจดขึ้นทั่วไป มีลูกไม้ค่อนข้างหนาแน่ ทุกปีจะมีไฟป่าเกิดขึ้นประจ า ท าให้ลูกไม้บางส่วนถูกไฟไหม้ตายทุกปี พรรณไม้เด่นและเป็นพืชดัชนีส าคัญ (Plant keystone species) ในป่ามี 5 ชนิด ได้แก่ เต็ ง (Shorea obtusa) รั ง (S. siamensis) ย า ง เหี ย ง (Dipterocarpus obtussifolius) ย า งก ร าด (D. intricatus) แ ล ะพลว ง (D. tuberculatus) ทั้งหมดเป็นพืชที่จัดอยู่ ในวงศไม้ยางนา (Dipterocarpaceae) พืชเหล่านี้ เป็นพืชที่มีความส าคัญทางเศรษฐกิจและระบบนิเวศ โดยระบบรากของไม้กลุ่มนี้มีการอาศัยอยู่แบบร่วมกันแบบพ่ึงพากับกลุ่มเชื้อเห็ดราไมคอร์ไรซาร์ ซึ่งเป็นแหล่งอาหารและสมุนไพรที่ส าคัญในป่าเต็งรัง พืชกลุ่มนี้มีการใช้ประโยชน์อย่างแพร่หลายเพราะมีเนื้อไม้ที่แข็งแรง นิยมน ามาใช้ในการก่อสร้าง ไม้ค้ ายัน และเฟอร์นิเจอร์ ส่วนชันยาง น ามาท าข้ีไต้จุดไฟและยาแนวเรือและถังน้ าไม้

ปัจจุบันการศึกษาพันธุกรรมและความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายชีวโมเลกุล มีศักยภาพมากข้ึนในการตอบค าถามทางนิเวศวิทยาที่เปลี่ยนแปลงไป โดยเฉพาะเครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซท

2

เทิลไลท์ หรือ Simple sequence repeats (SSRs) เป็นเครื่องหมายโมเลกุลที่ได้รับความนิยมในการศึกษาพันธุศาสตร์ประชากรของพืชและสัตว์หลายชนิด เพราะไมโครแซทเทิลไลท์ เป็นเครื่องหมายโมเลกุลที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอมีลักษณะเป็นล าดับเบสซ้ า ที่มีขนาด 1-6 คู่เบส กระจายอยู่ทั่วจีโนมในสิ่งมีชีวิต นอกจากนี้ยังเป็นเครื่องหมายที่เป็นการข่มร่วมกัน (codominant marker) มีพอลิมอร์ฟิซึมสูง (high polymorphism) และสามารถ cross-species amplification ได้ จึงได้รับความนิยมมากในการประยุกต์ใช้ในการศึกษาการแปรผันทางพันธุรรมทั้งพืชและสัตว์ (Selkoe & Toonen, 2006)

การศึกษาโครงสร้างทางพันธุกรรม ความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีน และระบบการสืบพันธุ์ โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลไมโครแซทเทิลไลท์ ในพืชดัชนีส าคัญของป่าเต็งรังในประเทศไทยได้แก่ เต็ง รัง ยางเหียง ยางกราดและพลวง ยังมีข้อมูลการศึกษาอยู่น้อยมาก เพราะผลกระทบทางพันธุกรรมที่มีต่อพืชที่เป็นดัชนีส าคัญในป่า มีพลวัตต่อสมดุลทางระบบนิเวศและสิ่งแวดล้อมอย่างมาก ดังนั้นข้อมูลที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้จึงเป็นส่วนหนึ่งในการน าไปใช้ในการวางแผนอนุรักษ์และจัดการแหล่งก าเนิดทางธรรมชาติของพืชเหล่านั้นได้ วัตถุประสงค์ของโครงกำรวิจัย

1. เพ่ือศึกษารูปแบบความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีนและระบบสืบพันธุ์ของไม้ดัชนี ส าคัญในป่าเต็งรัง

2. เพ่ือประเมินสภาพความโครงสร้างทางพันธุกรรมและความหลากหลายทางพันธุกรรม ตามแหล่งธรรมชาติ เพ่ือใช้เป็นข้อมูลพ้ืนฐานในการอนุรักษ์พืชดัชนีส าคัญของประเทศไทยในอนาคต

ขอบเขตของกำรวิจัย ศึกษารูปแบบความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีนและระบบสืบพันธุ์ของไม้ดัชนีส าคัญ

ในป่าเต็งรัง ได้แก่ เต็ง รัง ยางเหียง ยางกราด และพลวงโดยใช้เครื่องหมายชีวโมเลกุลไมโครแซทเทิลไลท์ ในเขตอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ อุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี และป่าชุมชนโคกข่าว จังหวัดมหาสารคาม

บทที่ 2 เอกสารงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง

พืชวงศ์ยางนา (Dipterocarpaceae sensu lato) เป็นพืชที่มีคุณค่าทั้งทางด้านเศรษฐกิจและนิเวศวิทยาอย่างมาก พบกระจายอยู่ใน 3 ทวีบ คือ เอเชีย อัฟริกาและอเมริกาใต้ พบมากตามแนวเส้นศูนย์สูตร มีรายงานค้นพบจ านวน 16 สกุล กว่า 510 ชนิด โดยเฉพาะในทวีปเอเชีย พบมากถึง 13 สกุล กว่า 470 ชนิด ในประเทศไทย พบจ านวน 8 สกุล 63 ชนิด มีการใช้ประโยชน์จากพืชวงศ์นี้ท้ังเนื้อไม้ เช่น ยางนา เต็ง รัง พะยอม ตะเคียน กระบาก พลวง ยางกราด และผลิตภัณฑ์จากไม้ เช่น ชันยาง เรซิน นอกจากนี้พืชในวงศ์นี้ยังมีผลต่อระบบนิเวศในป่า คือ มีการอยู่ร่วมกันของไมคอร์ไรซา โดยเฉพาะพวก ectomycorrhizal ซึ่งเป็นแหล่งอาหารและสมุนไพรที่ส าคัญ พืชดัชนีส าคัญ (Key stone species) ในป่าเต็งรัง จ านวน 5 ชนิด ได้แก่ เต็ง (Shorea obtusa) รัง (S. siamensis) ยางเหียง (Dipterocarpus obtussifolius) ยางกราด (D. intricatus) และพลวง (D. tuberculatus) จัดอยู่ในวงศไม้ยางนา (Dipterocarpaceae) โดยเฉพาะสกุล Shorea เป็นสกุลที่ใหญ่ที่สุดมีการกระจายพันธุ์ในศรีลงกา อินเดีย พม่า จีนตอนใต้ อินโดจีนและมาเลเซีย มีจ านวนมากถึง 188 ชนิด และ สกุล Dipterocarpus จ านวน 70 ชนิด ในประเทศไทย พบพืชในสกุล Dipterocarpus จ านวน 14 ชนิด Shorea จ านวน 21 ชนิด (Pooma, 2003)

ความหลากหลายทางพันธุกรรมมีความส าคัญและจ าเป็นอย่างยิ่งต่อการอยู่รอดของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด หากไม่มีความหลากหลายทางพันธุกรรม สิ่งมีชีวิตแต่ละชนิดจะไม่สามารถปรับตัวให้เข้ากับสิ่งแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลาได้ และจะค่อย ๆ สูญพันธุ์ไป จากการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของพืชในหลายพื้นที่ โดยเฉพาะในแถบเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ซึ่งได้รับผลกระทบจากการลดลงของพ้ืนที่ป่า และพ้ืนที่แบ่งแยกเป็นหย่อมขนาดเล็ก ส่งผลให้ระบบนิเวศเปลี่ยนแปลงและขาดสมดุลทางธรรมชาติ มีผลท าให้รูปแบบของความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีน และระบบสืบพันธุ์ของสิ่งมีชีวิตในพ้ืนที่ป่าเปลี่ยนแปลงไป

ปัจจุบันการพัฒนาการศึกษาวิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมในประชากรพืชธรรมชาติโดยประยุกต์ใช้เครื่องหมายโมเลกุลทางพันธุกรรม (molecular genetic markers) เพ่ือหาค าตอบทางนิเวศวิทยากันอย่างแพร่หลาย ดังเช่น ไอโซเอนไซม์ (isoenzyme) RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP’s (Amplified Fragment Length Polymorphisms), PCR-SSR (Simple Sequence Repeat หรือ microsattellites), PCR-SSCP (Single Stranded Confirmation Polymorphisms), PCR-RELP’s และการถอดรหัสพันธุกรรม (DNA sequencing) (สุจิตรา จางตระกูล, 2543) ดังนั้นการศึกษาโครงสร้างของความหลากหลายทางพันธุกรรม การถ่ายเทยีน ตลอดจนระบบการสืบพันธุ์ ของพืชจึงเป็นสิ่งส าคัญ เพราะสามารถทราบการเปลี่ยนแปลงทางวิวัฒนาการของพืชและผลตอบสนองต่อสิ่งแวดล้อมที่ เปลี่ยนแปลงไป ท าให้น าข้อมูลไปใช้การวางแผนอนุรักษ์และจัดการแหล่งก าเนิดทางธรรมชาติของพืชได้ การศึกษา gene flow หรือ การถ่ายเทยีน การแลกเปลี่ยนยีน การเคลื่อนย้ายยีนหรือการแพร่กระจายของยีน ทั้งภายในประชากรและระหว่างประชากรของพืช เป็นข้อมูลทางพันธุกรรมที่ส าคัญที่ได้จากการส่งผ่านจากละอองเรณูไปยังเมล็ด เพราะประสิทธิภาพของการถ่ายเทยีนจากละอองเรณูไปยังเมล็ดมีความส าคัญต่อ

4

reproduction-effective population size เพราะขนาดของประชากรมีความส าคัญต่อรูปแบบของระยะห่างของการแปรผันทางพันธุกรรม และความแตกต่างทางพันธุกรรมในระหว่างประชากร การวิเคราะห์ Paternity analysis เป็นหนึ่งในวิธีการศึกษา pollen –mediated gene flow ในพืชที่ได้รับการนิยม เพราะสามารถศึกษาโครงสร้างพันธุกรรม ความหลากหลายทางพันธุกรรม และการถ่ายเทยีนในพืชได้ ดังการศึกษาเกี่ยวกับ โครงสร้างทางพันธุกรรมระหว่างความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม (genetic relatedness) กับระยะทาง พบว่ามีความสัมพันธ์แบบลบ อย่างมีนัยส าคัญ แสดงให้เห็นว่า เกิดจากการกระจายเมล็ดพันธุ์ที่จ ากัด พบในพืช Shorea leprosula, Dipterocarpus cornutus (Ratnam and Seng, 2003), Hopea dryobalanoides และ S. parvifolia (Takeuchi et al., 2004) และพืชเหล่านี้มีการกระจายเมล็ดพันธุ์โดยลมและมีการถ่ายละอองเรณูด้วยแมลง Fukue et al (2007) ได้ศึกษาผลกระทบของความหนาแน่นของป่าที่มีต่อการสืบพันธุ์และการถ่ายเทยีน ใน S. leprosula ในประเทศมาเลเซีย ซึ่งมีการลดจ านวนลงและแบ่งแยกเป็นกลุ่มจากกิจกรรมชองมนุษย์ พบว่าความหลากหลายทางพันธุกรรมและ allelic richness ไม่มีความแตกต่างกัน ในป่าที่สมบูรณ์ แต่พบว่าจ านวน rare allele ในต้นกล้าและต้นแม่ที่มีการผสมตัวเองมีความสัมพันธ์ในเชิงลบกับความหนาแน่นของประชากรต้นเจริญพันธุ์ และพบว่าประชากรของ S. leprosula ที่อยู่ในป่าที่มีความหนาแน่นอุดมสมบูรณ์มีการถ่ายเทละอองเรณูที่ความถี่ 200 เมตร ในขณะที่ประชากรที่มีความหนาแน่นของต้นเจริญพันธุ์ต่ าจะมีระยะทางมากกว่า ซึ่งการศึกษาครั้งนี้พบว่าความหลากหลายทางพันธุกรรมของ S. leprosula มีผลต่ออัตราการผสมตัวเอง การถ่ายเทยีน และพบว่าบางต้นของ S. leprosula มีระบบการผสมพันธุ์แบบเฉพาะ อาจจะเป็นแบบ Apomixis

การศึกษาระบบการสืบพันธุ์ (Mating system) โดยทั่วไปการศึกษาระบบการสืบพันธุ์ของพันธุ์ไม้ป่าในอดีตมักจะใช้เครื่องหมายไอโซเอนไซม์ ( isoenzyme markers) แต่ในปัจจุบันนิยมใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ ในการตรวจสอบดูว่าไม้ป่าแต่ละชนิดมีอัตราการผสมตัวเอง (selfing rate) เท่าไร ถ้าเมล็ดไม้ที่ได้จากหมู่ไม้ที่มีการผสมตัวเอง (Selfing) หรือ ผสมระหว่างต้นที่มีลักษณะทางพันธุกรรมใกล้ชิดกัน (inbreeding) จะมีเปอร์เซ็นต์การงอกต่ า กล้าไม้จะอ่อนไหว (sensitive) ต่อการถูกท าลายจากโรคและแมลงท าให้เปอร์เซ็นต์การรอดตายต่ า นอกจากนี้ ต้นที่รอดตายจะมีการเจริญเติบโตไม่ดีเท่าที่ควร ส่งผลให้ผลผลิตและปริมาตรเนื้อไม้ต่ ากว่าปกติ ดังตัวอย่างที่พบ inbreeding depression ในไม้ Picea abies (Eriksson et al., 1973) และในการศึกษาของ Scots pine seed orchard โดย Szmidt (1984) พบว่าอัตราผสมตัวเองมี 10.8% และ16% ใน Pinus sylvestris 16% (Yeh, 1989) ในการศึกษาในไม้สนสองใบ (Pinus merkusii) ซึ่งเป็นไม้สนเขตร้อนที่ขึ้นในประเทศไทย พบว่ามีอัตราของการผสมตัวเองสูงถึง 50% ( Changtragoon and Finkeldey, 1995) ส่วนในไม้สักมีอัตราการผสมตัวเองช่วงระหว่าง 2.5-14.1% (Changtragoon and Szmidt, 1999) ซึ่งแตกต่างกันไปในแต่ละต้นและหมู่ไม้ที่ขึ้นในแต่ละท้องที่ ในพืชวงศ์ไม้ยางนา (Dipterocarpaceae) ศึกษาอัตราการผสมข้ามของ Dryobalanops aromatic ในป่าปฐมภูมิและทุติยภูมิที่เกาะบอร์เนียว พบว่ามีอัตราการผสมข้ามอยู่ 0.794 ถึง 0.856 ทั้งสองป่ามีอัตราการผสมข้ามไม่แตกต่างกัน อย่างมีนัยส าคัญ (Kitamura et al., 1994) ขณะที่ Lee et al. (2000) ศึกษาระบบการสืบพันธุ์ของ D. aromatic ในป่าที่แตกต่างกัน 3 แบบ คือ ป่าปฐมภูมิ ป่าสัมปทาน และสวนป่าปลูก พบว่าอัตราการผสมข้า tm = 0.923 , 0.766 และ 0.661 ตามล าดับ จาการศึกษา

5

พบว่าอัตราการผสมข้ามในป่าปฐมภูมิสูงกว่าป่า 2 แบบ และพบว่าพืชชนิดนี้มีการผสมพันธุ์แบบ self-incompatibility นอกจากนี้ยังพบว่าป่าปฐมภูมิมีความหนาแน่นมากกว่าป่าสัมปทานและป่าปลูก ส่งผลต่อความหลากชนิดของผึ้งและแมลงที่เป็นพาหะในการผสมพันธุ์ด้วย Murawski and Bawa (1994) ศึกษาใน Stemonoporus oblonggifolius เป็นพืชถิ่นเดียวในประเทศศรีลังกา พบอัตราการผสมข้าม 0.898 และพบต้นที่เป็น Apomixes คือต้นที่เกิดจากการพัฒนาของการแบ่งเซลล์ของไข่ ที่ผิดปกติ ซึ่งเกิดมาจากเซลล์ของต้นแม่ที่มีโครโมโซม 2n มีการพัฒนาของต้นใหม่ขึ้นโดยไม่ได้การปฏิสนธิ Chaisurisri et al. (1997) ศึกษาโครงสร้างทางพันธุกรรมของไม้เคี่ยม (Cotylelobium melanoxylon Pierre) ในพ้ืนที่อนุรักษ์พันธุกรรมทุ่งค่าย จังหวัดตรัง (GRA) และในป่าธรรมชาติ 3 แหล่ง ของไม้เคี่ยม ด้วยเทคนิคไอโซไซม์ พบว่ไม้เคี่ยมในบริเวณ GRA มีความผันแปรทางพันธุกรรมสูงกว่าในป่าธรรมชาติ ค่าระยะห่างทางพันธุกรรมในพ้ืนที่ GRA มีค่าแตกต่างจากประชากรอ่ืน และเมื่อค านวณค่าเฉลี่ยระยะห่างทางพันธุกรรมจากป่า 3 แหล่ง มีค่าเพ่ิมขึ้น 0.1999 จาก 0.044 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มข้ึนของความหลากหลายทางพันธุกรรมใน GRA เป็นการเพิ่มข้ันจากต้นกล้าที่มาจากหลากหลายแหล่ง การแปรผันทางพันธุกรรมเป็นแบบชั่วคราว ซึ่งอาจเป็นสาเหตุของ loosely connection of temporal breeding และส่งผลต่อการถ่ายเทยีนในประชากรไม้เค่ียม การศึกษาการ cross-species cross-species amplification โดย Lee et al. (2010) ศึกษาการแปรผันของเครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ ใน Neobalanocarpus heimii (Dipterocarpaceae) ซึ่งเป็นพืชเศรษฐกิจที่ส าคัญในมาเลเซีย แต่มีการถูกลักลอบตัดมากขึ้นเพราะเนื้ อไม้มีคุณภาพสูง ท าให้มีโอกาสที่จะสูญพันธุ์ในอนาคตอันใกล้นี้ การศึกษาครั้งนี้จึงศึกษาเครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ที่มีพอลิมอร์พิซึมสูง ส าหรับ N. heimii การศึกษาใน 51 ไพรเมอร์ ที่พัฒนาขึ้นมาส าหรับพืชในวงศ์ Dipterocarpaceae พบว่า 12 ไพรเมอร์ ได้แก่ Nhe004, Nhe005, Nhe011, Nhe015, Nhe018, Hbi161, Sle392, Sle605, Slu044a, Shc03, Shc04 and Shc07 มีความจ าเพาะ พอลิมอร์พซึมสูง มีการถ่ายทอดลักษณะพันธุกรรมเพียงหนึ่งโลกัส ไม่มี null alleles และ mononucleotide repeat motifs ใน N. heimii ดังนั้นทั้ง 12 ไพรเมอร์ นี้จึงมีความเหมาะสมส าหรับพืช N. heimii ที่จะศึกษาความเชื่อมต่อระหว่างตัวอย่างพืชและแหล่งก าเนิดของพืชได้ และ Pandey and Geburek (2009) ศึกษาความส าเร็จของการ cross- amplification ของเครื่องหมายดีเอ็นเอ Shorea ไมโครแซทเทิลไลท์ จ านวน 27 ไพรเมอร์ ใน Shorea robusta Gaertn. ในประเทศเนปาล พบว่าสามารถได้แอมพลิคอน (amplicon) ในต าแหน่งเป้าหมาย (expected sizes) จ านวน 24 ไพรเมอร์ และได้เครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ที่มีพอลิมอร์ฟิซึมในระดับปานกลางถึงสูง (Na = 6-19) และเมื่อน ามาศึกษาค่าความหลากหลายทางพันธุกรรมในหนึ่งประชากร พบว่ามีค่าเฉลี่ยเฮเทอโรไซโกตจากการสังเกต ระหว่าง 0.49 -0.77 และค่าเฉลี่ยเฮเทอโรไซโกตที่คาดหมาย ระหว่าง 0.52-0.89 ซึ่งเครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ ดังกล่าวสามารถน ามาประยุกต์ใช้ในการศึกษาพันธุศาสตร์ประชากรในกลุ่ม Dipterocarp ได ้

บทที่ 3

วิธีการวิจัย

การเก็บตัวอย่างในพื้นที่ศึกษา

เก็บตัวอย่างในพ้ืนที่ศึกษาป่าเต็งรัง อุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ อุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี และป่าชุมชนโคกข่าว จังหวัดมหาสารคาม แปลงศึกษาขนาดพ้ืนที่ 1000 x 1000 เมตร

คัดเลือกป่าเต็งรังที่มีไม้ดัชนีส าคัญทั้ง 5 ชนิดเป็นไม้เด่นในแต่ละแปลง ได้แก่ เต็ง (Shorea obtusa) รัง (S.

siamensis) ย า ง เหี ย ง (Dipterocarpus obtussifolius) ย า งก ร าด ( D. intricatus) แ ล ะพลว ง ( D.

tuberculatus) ทั้งหมดเป็นพืชที่จัดอยู่ในวงศไม้ยางนา (Dipterocarpaceae) โดยท าเรื่องขออนุญาตเข้าเก็บ

ตัวอย่างในพ้ืนที่อุทยานแห่งชาติ จากส านักวิจัยการอนุรักษ์ป่าไม้และพันธุ์พืช กรมอุทยานแห่งชาติ สัตว์ป่า

และพันธุ์พืช โดยเก็บข้อมูลแปลงละ 30 ต้น ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง มากกว่า 30 ซม. มีระยะห่างกันอย่างน้อย

30 เมตร วัดพิกัดภูมิศาสตร์ด้วยเครื่อง GPS วัดระดับความสูงจากน้ าทะเล และวัดค่า dbh และคัดเลือกต้น

แม่พันธุ์ จ านวน 10 ต้น เก็บและเมล็ดจากต้นแม่พันธุ์ จ านวน 100 เมล็ดต่อต้น มาท าการเพาะเมล็ดในเรือน

เพาะช า

การสกัดดีเอ็นเอ

เก็บตัวอย่างใบอ่อนของไม้ดัชนีส าคัญทั้ง 5 ชนิด ได้แก่ เต็ง รัง ยางเหียง ยางกราด และพลวง ชนิดละ 30 ต้น ในแปลงศึกษาที่มาจากแหล่งก าเนิดทางธรรมชาติ และเก็บตัวอย่างใบอ่อนจากต้นกล้าที่เพาะเมล็ดจากต้นแม่

พันธุ์ จ านวน 200 ต้นกล้าต่อชนิด เก็บใบอ่อนใส่ในถุงพลาสติก ในกระติกน้ าแข็ง น าเก็บมาที่ห้องปฏิบัติการ และ

เก็บไว้ในอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส การสกัดดีเอ็นเอ โดยการน าตัวอย่างใบอ่อนของพืชมาล้างเพื่อก าจัดสิ่ง

สกปรกที่ติดอยู่บริเวณผิวใบ แล้วน ามาสกัดดีเอ็นเอ เก็บสารละลายดีเอ็นเอ ไว้ที่ ตู้ –20 องศาเซลเซียส โดย

วัดคุณภาพและปริมาณของสารละลายดีเอ็นเอ ด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิ เล็กโตรโฟริซีส (agarose gel

electrophoresis) และวิธีสเปกโตรโฟรโตมิเตอร์ (spectrophotometer ยี่ห้อ Beckman coulter รุ่น

DU 730)

วิธีการสกัดดีเอ็นเอ

การเตรียมดีเอ็นเอเพ่ือใช้ในการวิเคราะห์ด้วยเทคนิคไมโครแซทเทิลไลท์ ต้องได้ดีเอ็นเอท่ีมีคุณภาพดี

7

ไม่มีการปนเปื้อนจากสิ่งต่างๆ การทดลองครั้งนี้สกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีประยุกต์ Doyle and Doyle (1987)

ดัดแปลง โดยคัดเลือกใบพืชที่ไม่แก่จนเกินไป ประมาณ 0.2-0.5 กรัม บดในโกร่งบดยาที่มีไนโตรเจนเหลวให้

ละเอียด แล้วย้ายลงในหลอดทดลองขนาด 2 มิลลิลิตร จากนั้นเติม 2X CTAB buffer (2% CTAB, 1% PVP,

1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH8.0, 0.2% β-mercapto-ethanol) 800 ไมโครลิตร

น าไปบ่มที่เครื่องควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่าที่ 65 องศาเซลลเซียส นาน 1 ชั่วโมง หลังจากนั้นน าไปเติมใน

สารละลายที่มีส่วนผสมของคลอโรฟอร์มและไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ อัตราส่ วน 24 ต่อ 1 โดยปริมาตร

(chloroform:isoamy alcohol 24:1) ปริมาณ 800 ไมโครลิตร เพ่ือตกตะกอนและก าจัดโปรตีน เขย่าเบาๆ

ให้เป็นเนื้อเดียวกัน น าไปปั่นที่ความเร็ว 12000 รอบต่อนาที (rpm) เป็นเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิห้อง ย้าย

สารละลายชั้นบนใส่หลอดใหม่ขนาด 1.5 มิลลิลิตร ส่วนที่เหลือทิ้งไป ตกตะกอนและก าจัดโปรตีนด้วย

คลอโรฟอร์มกับไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ซ้ าอีก 1 รอบ เติมโพรพานอล (isopropananol) 0.6 เท่าของ

สารละลายใส เพ่ือตกตะกอนดีเอ็นเอ ผสมกันเบาๆ ให้เข้ากันแล้วน าไปแช่ที่ตู้ -20 องศาเซลเซียส 30 นาทีหรือ

ข้ามคืน น าไปปั่นที่ความเร็ว 12000 รอบต่อนาที (rpm) เป็นเวลา 20 นาที เทสารละลายชั้นบนทิ้งให้เหลือ

เฉพาะตะกอนที่ติดที่ก้นหลอด ล้างตะกอนด้วยแอลกอฮอล์ 70 % น าไปปั่นที่ความเร็ว 12000 รอบต่อนาที

(rpm) เป็นเวลา 10 นาที แล้วเทแอลกอฮอล 70 % ทิ้ง ระวังอย่าให้ตะกอนที่ก้นหลอดหลุดออกมา ล้าง

ตะกอนดีเอ็นเอด้วยแอลกอฮอล์ 70 % อีก 2 ครั้ง ปล่อยให้ตะกอนดีเอ็นเอแห้ง โดยเปิดฝาทิ้งไว้เป็นเวลา 30

นาที น ามาละลายใน 1x TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 ไมโครลิตร ก าจัดอาร์เอ็น

เอโดยการเติมเอนไซม์ RNase ความเข้มข้น 10 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 1 ไมโครลิตร แล้วน าไปบ่มที่

อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 คืน เก็บสารละลายที่สกัดได้ไว้ที่ตู้ -20 องศาเซลเซียส

การวัดคุณภาพและปริมาณดีเอ็นเอ

การวัดคุณภาพและปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (agarose fel electrophoresis) โดยเตรียมอะกาโรสเจลที่มีความเข้มข้น 1 % โดยน าอะกาโรส 0.3 กรัมมาหลอมให้ละลาย

ด้วยสารละลาย 1 x TBE buffer ปริมาตร 30 มิลลิลิตร แล้วเทลงในถาดเจลที่มีหวีเสียบไว้ ตั้งทิ้งไว้ให้เจลแข็ง

ตัวแล้วค่อยๆ ดึงหวีออกระวังอย่าให้เจลแตก น าเจลไปวางไว้ที่ horizontal chamber โดยให้ด้านที่มีช่องหวี

อยู่ด้านขั้วลบ แล้วเท 1 X TBE buffer ลงจนท่วมแผ่นเจล ผสมดีเอ็นตัวอย่างกับโหลดดิ้งบัฟเฟอร์ (6x

loading buffer :0.25 % bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol) ในอัตราส่วน

5 ต่อ 1 แล้วค่อยๆ หยอดตัวอย่างลงในช่องหวีด้วยไมโครปิเปต และหยอดดีเอ็นเอมาตรฐาน ขนาด 1 kb เพ่ือ

เปรียบเทียบ ปิดฝาอิล็กโทโฟริซิส chamber ท าการต่อขั้วไฟฟ้าเข้ากับเครื่อง power supply ใช้ความต่าง

ศักย์ไฟฟ้าคงที่ ที่ 75 โวลล์ เวลา 30 - 45 นาที ให้สีของโหลดดิ้งบัฟเฟอร์ เคลื่อนไปได้ 3 ใน 4 ส่วนของเนื้อ

เจล น าแผ่นเจลไปย้อมในสารละลายเอธิเดียมโบรไมด์ ( 1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) เป็นเวลา 10-15 นาที

8

จากนั้นล้างแผ่นเจล โดยแช่ในถาดที่มีน้ า เป็นเวลา 1 นาที น าแผ่นเจลไปส่องดูภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต

เปรียบเทียบความเข้มข้นกับดีเอ็นเอมาตรฐาน แล้วบันทึกภาพ

การหาปริมาณความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ ด้วยวิธีสเปกโตรโฟรโตมิเตอร์ โดยน า สารละลายดีเอ็นเอที่ต้องการหาความเข้มข้น 2 ไมโครลิตร ใส่ใน cuvette ชนิดที่ท าด้วย quartz

น าไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260 (A260) และ 280 (A280) นาโนเมตร อ่านค่าความ

ยาวคลื่นแสง และค่าความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ โดยอ่านจากค่าอัตราส่วนระหว่าง A260:A280 ถ้า

ค่าที่อ่านได้อยู่ระหว่าง 1.8-1.9 ถือว่าสารละลายดีเอ็นเอมีความบริสุทธิ์ ถ้าค่าอัตราส่วนมากกว่า

1.9 แสดงว่าสารละลายดีเอ็นเอที่ได้ปนเปื้อนด้วยอาร์เอ็นเอ แต่ถ้าค่าที่ได้มีอัตราส่วนน้อยกว่า 1.8

แสดงว่าสารละลายปนเปื้อนด้วยโปรตีน

การศึกษาความส าเร็จของการ cross- species amplification

การพัฒนาเครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ต้องใช้เวลาและมีค่าใช้จ่ายสูง ดังนั้นการศึกษาความส าเร็จ ของการ cross-amplification ของเครื่องหมายโมเลกุลในกลุ่มพืชใกล้เคียงกันจึงประหยัดทั้งเวลาและ

ค่าใช้จ่าย และสามารถน าผลที่ได้ไปประยุกต์ใช้ในพืชที่ต้องการศึกษาทางด้านอ่ืนๆ ได้ต่อไป ดังนั้นจึงศึกษา

ความส าเร็จของการ cross- amplification ของเครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ เพ่ือไพรเมอร์ที่

เหมาะสมและมีค่าโพลิมอร์ฟิซึมสูง เพื่อใช้ในการวิเคราห์ข้อมูลทางพันธุกรรมของไม้เต็ง รัง ยางเหียง ยางกราด

และพลวง โดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ที่มีการพัฒนามาก่อนในกลุ่มพืชกลุ่ม Dipterocarp

เช่น สกุล Shorea จ านวน 14 ไพร์เมอร์ ดังตารางที่ 3.1

การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ

น าสารละลายดีเอ็นเอท่ีเจือจางให้มีความเข้มข้น 25 นาโนกรัมต่อไมโครลิตร ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมสารละลายไพรเมอร์ 2 ชนิด คือ forword และ reverse ที่คัดเลือกเครื่องหมายไมโครแซทเทิลไลท์ที่

พัฒนามาจากพืชในสกุล Dipterocarpus และ Shorea ที่คาดว่ าจะสามารถน ามา cross- species

amplification ได้ ปริมาตร 5-25 พิโคกรัม เติมสารละลายบัพเฟอร์ส าหรับท าพีซีอาร์ ได้แก่ 10xPCR buffer,

100mMTris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2, 500mM KCl และเอนไซม์ Taq DNA polymerase) น าสารละลาย

ทั้งหมดเข้าเครื่องเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอ เพ่ือหาสภาวะที่เหมาะสมของอุณหภูมิในการจับเกาะ ขนาดผลผลิต

ของพีซีอาร์ และความเข้มข้นของแมกนีเซีมคลอไรด์ จากนั้นแยกชิ้นดีเอ็นเอ ด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรี

ซีส โดยใช้ตัวกลางชนิด non-denaturing polyacrylamide เปรียบเทียบกับดีเอ็นเอมาตรฐาน วิเคราะห์ผล

โดยดูขนาดชิ้นดีเอ็นเอ มีแถบแบนขึ้นในต าแหน่งเป้าหมาย (expected size) ที่ต้องการ การยืนยันขนาดของ

9

ล าดับเบสโดยการน าตัวอย่างขนาดผลิตผลดีเอ็นเอ ไปหาล าดับนิวคลีโอไทด์ ด้วยเครื่อง DNA Fragment

analysis

การวิเคราะห์ข้อมูล

วิเคราะห์จ านวนอัลลีลเฉลี่ยต่อต าแหน่ง (number of allele per locus, N) จ านวนอัลลีลต่อ ต าแหน่งที่แท้จริง (effective number of allele, ne) ค่าเฮเทอโรไซโกซิต ี (heterozygosity) การ

ทดสอบสมดุลฮาร์ดี-ไวน์เบิร์ก (Hardy-Weinberg Equilibrium) ค่าสัมประสิทธิ์เอฟ (F-coefficient) และการ

จัดแผนผังความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยใช้โปรแกรม FSTAT 2.9.3 (Goudet, 1995) และ โปรแกรม

Genepop web version 3.4 (Raymond AND Rousset, 1995)

วิเคราะห์รูปแบบผสมพันธุ์ อัตราการผสมข้าม อัตราการผสมเลือดชิด ของไมเ้ต็ง รัง ยางเหียง ยาง กราดและพลวง ด้วยวิธี mixed mating system model ด้วยโปรแกรม MLTR version 3.23 (Multiocus

Mating System Program) (Ritland, 2008)

วิเคราะห์ Paternity analysis เพ่ือตรวจสอบความเป็นพ่อ การถ่ายเทยีน และ pollen flow ด้วย โปรแกรม Cervus version 3.0.3 (Marshall et al., 1998; Kalinoski et al., 2007)

10

ภาพที่ 3.1 แสดงพ้ืนที่เก็บตัวอย่างของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรัง

11

ตารางที่ 3.1 แสดงล าดับนิวคลีโอไทด์ ล าดับเบสแกน และขนาดของผลลผิตของพีซีอาร์ของคู่ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา Locus Core sequence Complexity Type Primer sequence (5’ to 3’) Exp. Site

(bp) Shc01 (CT)8(CA) 10CT(CA) 4CTCA Compound Imperfect F:GCT ATT GGC AAG GAT GTT CA

R:CTT ATG AGA TCA ATT TGA CAG 152

Shc04 (CT)16 Simple Perfect F:ATG AGT AAC AAG TGA TGA G R:TAT TGA CGT GGA ATC TG

95

Shc07 (CT)8CA(CT)5CACCC(CTCA)3 CT(CA)10

Compound Imperfect F:ATG TCC ATG TTT GAG TG R:CAT GGA CAT AAG TGG AG

169

Shc09 (CT)12 Simple Perfect F:TTT CTG TAT CCG TGT GTT G R:GCG ATT AAG CGG ACC TCA G

197

Shc11 (CT)4TT(CT)5 Compound Imperfect F:ATC TGT TCT TCT ACA AGC C R:TTA GAA CTT GAG TCA GAT AC

166

Sle074a (CT)11 Simple Perfect F:ATC ACC AAG TAC CTA TCA TCA R:GCA ATGGCA CAC AGT CTA TC

124

Sle079 (CT)11 Simple Perfect F:GTT GTC TGT TCT TAC CAG GAA G R:GCA TAA GTA TCG TCG CCA

166

Sle105 (GA)12 Simple Perfect F:CTG TGT CAA AAT CAG TTA GGA CTT ACG AG R:GAG TCG ATT GCT TGT CTT CAC CC

145

12

Sle111a (GA)14 Simple Perfect F:GGA AAC TAC TGG AGC AGA GAC R:GGT GGG TAA TGG AGA ATG AG

153

Sle118 (GA)16 Simple Perfect F:AAA GCG TAC AAA TTC ATC A R:CTA TTG GTT GGG TCA GAA GG

170

Sle267 (GA)17 Simple Perfect F.CTT AAT TGT GAT GCC TGT TG R:TCT TGT ATT TAT GCT TCT CC

333

Sle303a (GA)12 Simple Perfect F:TCC TTA CAT GGA CTG AGA TTC ACC R:GTT TCA ATT ATG AGG GGA ACT GAT TTA C

286

Sle562 (GT)8 Simple Perfect F:TAT TAC ATT TTT CAA GTC AAG TC R:TAT TAC ATT TTT CAA GTC AAG TC

457

Sle566 (GA)13 Simple Perfect F:TGA GTA ACA AGT AAT GAG GG R:GCA GAG ATT GAA ACA GAA G

198

บทที่ 4 ผลการศึกษา

การคัดเลือกพื้นที่เก็บตัวอย่าง

จากการคัดเลือกพ้ืนที่ในการเก็บตัวอย่างพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรังทั้ง 5 ชนิด ได้แก่ เต็ง (Shorea obtusa) รัง (S. siamensis) ยางเหียง (Dipterocarpus obtussifolius) ยางกราด (D. intricatus) และพลวง (D. tuberculatus) (ภาพที่ 4.1-4.4) ในพ้ืนที่อุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี อุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ และป่าชุมชนโคกข่าว จังหวัดมหาสารคาม พบว่า ในพ้ืนที่อุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี มีการกระจายพันธุ์ของเต็ง รัง และยางเหียง และมีความเหมาะสมในการคัดเลือกเป็นพ้ืนที่ศึกษา ส่วนอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ มีการกระจายพันธุ์ของเต็ง ยางเหียง และพลวง มีความเหมาะสมในการคัดเลือกเป็นพ้ืนที่ศึกษา ส่วนในป่าชุมชนโคกข่าว มีการกระจายพันธุ์ของเต็ง รัง พลวง แต่มีการกระจายของต้นที่ไม่สม่ าเสมอ พบประปราย ยากต่อการเก็บตัวอย่างและศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรม จึงได้ตัดพ้ืนที่ในการศึกษาป่าโคกข่าวออกไป เพราะพ้ืนที่ในการศึกษาพืชที่เป็นดัชนีส าคัญในป่าเต็งรังทั้ง 4 ชนิดแล้ว คือ เต็ง รัง ยางเหียงและพลวง ส่วนยางกราด จากการส ารวจในพื้นที่ป่าทั้งสาม จะพบการกระจายพันธุ์เพียงเล็กน้อย และมีระยะห่าง เนื่องจากยางกราด เป็นพืชที่มีนิเวศวิทยาการกระจายพันธุ์ในบริเวณที่ราบและตามทุ่งนาโล่ง การศึกษาครั้งนี้จึงไม่ได้เก็บข้อมูลของยางกราด (ภาคผนวก แสดงรหัสต้นพ่อแม่พันธุ์และพิกัดภูมิศาสตร์ของเต็ง รัง ยางเหียงและพลวงในอุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานีและอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ)

การเพาะเมล็ดพันธุ์

จากการเก็บข้อมูลต้นเต็ง รัง ยางเหียงและพลวง แปลงละ 30 ต้น ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง มากกว่า 30 ซม. มีระยะห่างกันอย่างน้อย 30 เมตร วัดพิกัดภูมิศาสตร์ด้วยเครื่อง GPS วัดระดับความสูงจากน้ าทะเล และ

วัดค่า dbh และคัดเลือกต้นแม่พันธุ์ จ านวน 10 ต้น เก็บและเมล็ดจากต้นแม่พันธุ์ จ านวนประมาณ 100

เมล็ดต่อต้น มาท าการเพาะเมล็ดในสภาพเลียนแบบธรรมชาติ คือการน าเมล็ดที่เก็บจากต้นแม่พันธุ์ มาวางไว้

บนดินและใช้ใบไม้ทับบนเมล็ด พอเมล็ดแทงรากออกมาจึงย้ายมาใส่ถุงด าขนาดเล็ก ดังภาพที่ 4.5-4.6 พบว่า

อัตราการงอกของเมล็ดรัง ประมาณ 70-90 % ยางเหียง ประมาณ 40-60 % ส่วนพลวงและเต็ง ประมาณ 30-

40 % ได้ท าการเก็บใบอ่อนของต้นกล้าของต้นแม่พันธุ์ ต้นละ 15-30 ใบ เพ่ือน ามาสกัดดีเอ็นเอ

การสกัดดีเอ็นเอ จากการสกัดดีเอ็นเอเพ่ือใช้ในการวิเคราะห์ไมโครแซทเทิลไลท์ ด้วยวิธี Doyle and Doyle (1987) ดัดแปลง พบว่าดีเอ็นเอที่ได้ในแต่ละต้นของพืชทั้ง 4 ชนิด ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอไม่ค่อยดีนัก ซึ่งเป็นอุปสรรคในการทดสอบหาไพร์เมอร์ที่เหมาะสมในการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอเป็นอย่างมาก ถึงแม้จะท าการ

12

ล้างตะกอนดีเอ็นเอด้วยแอลกอฮอล์แล้วก็ตาม หรือการท าซ้ าในขั้นตอนเติมคลอโรฟอร์มและไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ (chloroform:isoamy alcohol 24:1) เพ่ือตกตะกอนและก าจัดโปรตีนอีกครั้ง พบว่าปริมาณดีเอ็นเอน้อยลง และค่าความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอก็ไม่แตกต่างมากนัก ดังนั้นจึงได้หาวิธีสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีการเติม chloroform:phenol (1:1) เพราะสารละลายนี้จะช่วยให้โปรตีนเสื่อมสภาพและตกตะกอนแยกออกจกากรดนิวคลิอิก แต่ค่าความบริสุทธิ์ที่ได้ยังมีค่าน้อย ทั้งนี้อาจจะไม่ขึ้นกับสารเคมีมากนัก แต่อาจจะขึ้นกับความเหมาะสมของพืชแต่ละชนิดกับวิธีการสกัด และเทคนิคของผู้ท าการศึกษา จากตารางที่ 4.1 แสดงปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ของเต็งและรัง การสกัดดีเอ็นเอจากใบอ่อนของต้นเต็ง จ านวน 38 ต้น พบว่ามีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 88.950-4026.30 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 1.040-1.876 และมีเพียง 1 ต้น คือรหัสต้น 1122 เท่านั้นที่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ เท่ากับ 1.876 ที่มีความเหมาะสมในการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอต่อไป ส่วนการสกัดดีเอ็นเอจากต้นรัง จ านวน 30 ต้น พบว่ามีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 3.574-710.00 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 0.208-2.035 และมีเพียง 1 ต้น คือรหัสต้น 1240 เท่านั้นที่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ เท่ากับ 1.860 จากตารางที่ 4.2 แสดงปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ของยางเหียงและพลวง พบว่าสกัดดีเอ็นเอจากยางเหียง จ านวน 23 ต้น มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 10.498-547.58 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 0.336-3.538 และไม่มีผลการสกัดดีเอ็นเอจากต้นใดที่ได้ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเออยู่ในช่วง 1.8-1.9 มีเพียง 1 ต้น คือรหัสต้น 211 เท่านั้นที่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอใกล้เคียงกับค่า 1.912 ส่วนการสกัดดีเอ็นเอจากต้นพลวง จ านวน 30 ต้น มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 87.372-606.88 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 0.350-3.416 และมีเพียง 1 ต้น คือรหัสต้น 1505 เท่านั้นที่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอเท่ากับ 1.879

จากตารางที่ 4.3 แสดงปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นกล้า (offspring) ของต้นรัง จ านวน 2 ต้นแม่ คือ รหัสต้นที่ 1206 จ านวน 15 หมายเลข และรหัสต้น 1208 จ านวน 20 หมายเลข พบว่ารหัสต้น 1206 มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 76.26-1033.4 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 1.51-1.72 ส่วน ส่วนรหัสต้น 1208 มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 202.54-1145.0 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 1.38 -1.85 จากตารางที่ 4.4 แสดงปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากเอมบริโอของต้นเต็ง จ านวน 2 ต้นแม่ คือ รหัสต้นที่ 1112 จ านวน 17 หมายเลข และรหัสต้น 1113 จ านวน 20 หมายเลข พบว่ารหัสต้น 1112 มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 181.97-683.40 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 1.047-1.365 ส่วน ส่วนรหัสต้น 1113 มีปริมาณดีเอ็นเออยู่ในช่วง 84.236-226.84 ไมโครกรัมต่อเนื้อเยื้อใบอ่อน 1 กรัม และความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ อยู่ในช่วง 1.194-1.712

จากผลการสกัดดีเอ็นจากต้นพ่อแม่พันธุ์ของต้นเต็ง รัง ยางเหียงและพลวงและต้นกล้าของต้นเต็งและรัง พบว่าปริมาณดีเอ็นเอที่ได้มีความเหมาะสมในการน าไปเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอได้ แต่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอไม่มีความเหมาะสมในการไปเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ เนื่องจากการอ่านค่าอัตราส่วนระหว่าง A260:A280 มี

13

ค่าน้อยกว่าหรือมากกว่าในช่วง 1.8-1.9 ซึ่งพบว่าดีเอ็นเอมีการปนเปื้อนค่อนข้างสูง อาจเนื่องจากตัวอย่างของใบในแต่ละต้นที่เก็บมามีความอ่อนแก่ไม่เท่ากัน ส าหรับตัวอย่างที่เป็นใบอ่อน จะเป็นส่วนที่มีการแบ่งเซลล์สูง และภายในเซลล์มีการสะสมสารประกอบพวกโปรตีน คาร์โบไฮเดรตและสารประกอบอ่ืนๆ อยู่ภายในเซลล์ปริมาณน้อย ในขณะที่ใบแก่มีสารประกอบพวกแทนนิน แลพอลีแซ็กคาไรด์สะสมอยู่มาก ซึ่งจากการทดลองครั้งนี้ ผู้วิจัยได้พยายามหาวิธีที่จะได้ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดี โดยการท าความสะอาดด้วยแอลกอฮอล์ 70 % หลายครั้ง หรือการท าซ้ าในขั้นตอนคลอโรฟอร์มและไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ และการเพ่ิมขั้นตอนสกัดด้วยสารละลายฟีนอลต่อคลอโรฟอร์ม ก่อนการสกัดด้วยคลอโรฟอร์ม เพ่ือลดการปนเปื้อนของโปรตีน ผลในการวัดความบริสุทธิ์ของดีเอ็นก็ยังไม่ดีขึ้น อาจเป็นเพราะพืชในกลุ่มนี้มีมีการผลิตน้ ายางหรือเรซิน ซึ่งจะพบในช่วงที่ดูดน้ าใสส่วนบนออกจะพบมีเมือกใสสีเหลือง ซึ่งเป็นอุปสรรคส าคัญในการประยุกต์ใช้ดีเอ็นเอเพ่ือศึกษาพันธุศาสตร์ประชากรหรือความหลากหลายทางพันธุกรรมของไม้เต็ง รัง ยางเหียงและพลวงเป็นอย่างมาก

ภาพที่ 4.1 ลักษณะสัณฐานวิทยาของเต็ง

14

ภาพที่ 4.2 ลักษณะสัณฐานวิทยาของรัง

15

ภาพที่ 4.3 ลักษณะสัณฐานวิทยาของยางเหียง

ภาพที่ 4.4 ลักษณะสัณฐานวิทยาของพลวง

16

ภาพที่ 4.5 แสดงการเพาะเมล็ดพันธุ์ในสภาพเลียนแบบธรรมชาติของต้นรัง

ภาพที่ 4.6 แสดงการเพาะเมล็ดพันธุ์ในสภาพเลียนแบบธรรมชาติของต้นยางเหียง

17

ตารางที่ 4.1 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ของเต็งและรัง

รหัสต้น เต็ง รหัสต้น รัง ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์ ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์

1101 - - 1201 530.00 0.94 1102 (M) 339.84 1.137 1202 49.650 1.19 1103 1454.9 1.363 1203 311.34 0.95 1104 290.35 1.040 1204 233.00 1.12 1105 1503.6 1.337 1205 - - 1106 4026.3 1.329 1206 (M) - - 1107 465.24 1.064 1207 710.00 1.25 1108 1061.2 1.300 1208 (M) - - 1109 403.33 1.200 1209 (M) - - 1110 741.69 1.221 1210 - - 1111 577.44 1.331 1211 20.281 0.823 1112 (M) 333.66 1.096 1212 237.06 1.312 1113 (M) 333.15 1.085 1213 (M) 134.04 1.324 1114 389.80 1.399 1214 248.71 1.511 1115 97.232 1.432 1215 (M) 73.101 1.099 1116 518.36 1.107 1216 (M) 88.229 1.567 1117 (M) 313.17 1.324 1217 2016.4 1.64 1118 515.64 1.180 1218 209.51 1.64 1119 459.20 1.195 1219 (M) 17.843 0.913 1120 (M) 191.18 1.477 1220 192.01 0.487 1121 (M) 221.32 1.709 1221 - - 1122 (M) 104.73 1.876 1222 183.50 2.035 1123 (M) 519.90 1.086 1223 - - 1124 94.876 1.631 1224 (M) - - 1125 156.80 1.240 1225 84.542 0.784 1126 (M) 296.45 1.463 1226 (M) 208.85 1.186 1127 (M) 105.62 1.458 1227 1.173 1.161

18

1128 (M) 88.950 1.527 1228 40.106 0.692 1129 300.24 1.255 1229 - - 1130 (M) - - 1230 3.574 0.351 1131 (M) - - 1231 186.91 1.35 1132 315.16 1.506 1232 127.03 1.062 1133 322.43 1.244 1233 341.44 0.845 1134 180.28 1.498 1234 77.537 0.845 1135 409.94 1.208 1235 (M) - - 1136 950.11 1.137 1236 126.02 0.899 1137 256.15 1.089 1237 276.07 1.536 1138 343.43 1.161 1238 32.324 0.208 1139 196.07 1.097 1239 159.60 1.026 1140 (M) 321.77 1.131 1240 (M) 224.18 1.860 1141 206.69 1.167

ตารางที่ 4.2 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นพ่อแม่พันธุ์ของยางเหียงและพลวง

รหัสต้น ยางเหียง รหัสต้น พลวง ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์ ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์

201 115.42 1.649 1501 - - 202 - - 1502 387.44 2.914 203 1.257 0.336 1503 606.88 2.954 204 87.626 1.165 1504 611.40 2.455 205 36.451 1.318 1505 465.34 1.879 206 13.835 1.073 1506 429.36 1.197 207 3.525 0.428 1507 329.50 1.323 208 35.00 1.160 1508 533.84 2.148 209 - - 1509 465.82 1.478 210 12.598 0.975 1510 443.95 3.416 211 303.00 1.912 1511 - - 212 547.58 1.983 1512 390.38 1.504 213 80.127 1.066 1513 462.35 1.937

19

214 38.076 1.457 1514 572.44 1.670 215 114.85 1.267 1515 367.86 1.954 228 42.312 1.140 1516 566.95 1.670 229 - - 1517 437.28 2.387 230 - - 1518 428.15 2.484 231 280.88 1.954 1519 455.50 2.180 232 155.48 1.265 1520 602.38 1.245 233 20.478 2.629 1521 399.63 2.075 234 43.257 2.076 1522 602.38 1.245 235 - - 1523 399.63 2.075 236 44.866 1.746 1524 453.65 2.761 237 10.498 4.077 1525 - - 238 249.20 1.036 1526 493.10 3.265 239 99.402 1.743 1527 469.21 2.152 240 11.685 3.538 1528 426.00 2.608 1529 576.04 2.847 1530 598.79 2.334 1531 107.95 0.419 1532 97.058 0.799 1533 87.372 0.350

ตารางที่ 4.3 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบของต้นกล้า (offspring) ของต้นรัง

รหัสต้น แม่พันธุ์รังต้นที่ 1206 รหัสต้น แม่พันธุ์รังต้นที่ 1208 ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์ ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์

1206-1 689.89 1.71 1208-1 751.04 1.63 1206-2 1033.4 1.72 1208-2 286.67 1.85 1206-3 76.26 1.57 1208-3 871.81 1.40 1206-4 520.20 1.69 1208-4 1145.0 1.61 1206-5 - - 1208-5 694.51 1.39 1206-6 264.84 1.56 1208-6 397.91 1.58 1206-7 664.74 1.65 1208-7 664.44 1.42

20

1206-8 255.19 1.61 1208-8 298.12 1.70 1206-9 309.33 1.63 1208-9 294.20 1.57 1206-10 165.11 1.55 1208-10 289.12 1.60 1206-11 316.96 1.72 1208-11 414.68 1.47 1206-12 114.24 1.51 1208-12 202.54 1.38 1206-13 210.71 1.66 1208-13 364.09 1.40 1206-14 223.95 1.55 1208-14 683.00 1.66 1206-15 140.75 1.55 1208-15 458.71 1.76 1206-16 219.85 1.52 1208-16 919.53 1.73 1208-17 971.84 1.41 1208-18 417.69 1.78 1208-19 939.53 1.45 1208-20 479.95 1.62

ตารางที่ 4.4 ปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากเอมบริโอของผลเต็ง

รหัสต้น แม่พันธุ์เต็งต้นที่ 1112 รหัสต้น แม่พันธุ์เต็งต้นที่ 1113 ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์ ปริมาณ (µg/g) ความบริสุทธิ์

1112-1 625.87 1.112 1113-1 84.236 1.533 1112-2 301.61 1.115 1113-2 92.450 1.476 1112-3 181.97 1.365 1113-3 126.71 1.357 1112-4 491.38 1.104 1113-4 124.05 1.366 1112-5 370-37 1.149 1113-5 86.659 1.468 1112-6 294.44 1.047 1113-6 704.40 1.194 1112-7 358.34 1.206 1113-7 130.71 1.519 1112-8 664.14 1.153 1113-8 133.61 1.712 1112-9 337.90 1.267 1113-9 111.27 1.604 1112-10 457.46 1.153 1113-10 143.32 1.706 1112-11 683.40 1.178 1113-11 70.638 1.448 1112-12 340.86 1.224 1113-12 89.780 1.521

21

การศึกษาหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ จากการคัดเลือกดีเอ็นเอที่มีความบริสุทธิ์ของ เต็ง รัง ยางเหียง และพลวง มาศึกษาความส าเร็จของการ cross- amplification ของเครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ เพ่ือหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมและมีค่าโพลิมอร์ฟิซึมสูง เพ่ือใช้ในการวิเคราห์ข้อมูลทางพันธุกรรมของไม้เต็ง รัง ยางเหียง และพลวง โดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ที่มีการพัฒนามาก่อนในกลุ่มพืช สกุล Shorea จ านวน 14 ไพร์เมอร์ พบว่า มีจ านวน 6 ไพรเมอร์ ได้แก่ shc07 shc09 shc11 sle111 sle118 และ sle562 ที่สามารถเพ่ิมปริมาณพีซีอาร์และและได้ขนาดของผลผลิต expected size ตรงกับต าแหน่งไพรเมอร์ที่น ามาศึกษา แต่จากการผลการทดลองในครั้งนี้พบว่า ปัจจัยส าคัญในการหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอในครั้งนี้ คือความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ นั่นคือ เมื่อน าตัวอย่างพืชที่มีความบริสุทธิ์ดีเอ็นเอ จากค่าอัตราส่วนระหว่าง A260: A280 ที่ไม่อยู่ใน 1.7-1.9 แล้วนั้นพบว่าไม่สามารถเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอได้ ซึ่งสอดคล้องกับ มลิวรรณ นาคขุนทดและคณะ (2542) ได้ศึกษาอนุกรมวิธานของพืชสกุลมังคุดบางชนิด โดยการตรวจลายพิมพ์ดี เอ็นเอได้ใช้ความเข้มข้นของดีเอ็นเอต้นแบบ 100 นาโนกรัมต่อปริมาตรสุทธิ 15 ไมโครลิตร พบว่านอกจากความเข้มข้นของดีเอ็นเอต้นแบบแล้วความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอก็มีผลต่อการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ เช่น อาจจะมีสารประกอบพวกโพลิแซ็กคาไรด์ หรือพอลิฟีนอลปนเปื้อนอยู่ สารดังกล่าวจะไปยับยั้งเอนไซม์ polymerase ท าให้การสังเคราะห์ดีเอ็นเอลดลง ซึ่งจะเห็นว่าการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอของพืช ขึ้นกับปัจจัยของพืชในแต่ละชนิดที่ต้องการในปริมาณไม่เท่ากัน ตั้งแต่คุณภาพของดีเอ็นเอต้นแบบ ปริมาณไพรเมอร์ที่ใช้ ความจ าเพาะของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอต้นแบบ และสภาวะอุณหภูมิ การตั้งโปรแกรมอุณหภูมิและจ านวนรอบก็มีความส าคัญต่อการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ นั้นคือ พืชแต่ละชนิดจะมีความเหมาะสมต่อการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอไม่เหมือนกัน

ผลการศึกษาครั้งนี้สามารถที่สามารถเพ่ิมปริมาณพีซีอาร์และและได้ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอ มีแถบแบน

ขึ้นในต าแหน่งเป้าหมาย (expected size) ที่ต้องการ จ านวน 6 ต าแหน่งหรือ 6 ไพรเมอร์จากทั้งหมด 14

ไพรเมอร์ ด้วยวิธีการแยกชิ้นดีเอ็นเอด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟริซิส ที่มีความเข้มข้น 1 % ความต่าง

ศักย์ไฟฟ้าคงที่ ที่ 75 โวลล์ เวลา 45 นาที แต่อย่างไรก็ตามตัวอย่างท่ีน ามาศึกษาท้ัง 4 ชนิด ได้แก่ เต็ง รัง ยาง

1112-13 650.02 1.145 1113-13 226.88 1.304 1112-14 383.28 1.187 1113-14 143.78 1.388 1112-15 492.79 1.162 1113-15 135.42 1.555 1112-16 312.81 1.040 1113-16 169.59 1.368 1112-17 328.82 1.050 1113-17 146.36 1.530 1113-18 186.41 1.344 1113-19 156.64 1.720

22

เหียงและพลวง ในแต่ละกลุ่มประชากร ยังไม่สามารถหาวิธีในการสกัดดีเอ็นเอให้มีความบริสุทธิ์ได้มากกว่า 80

% ของกลุ่มประชากร ผลผลิตพีซีอาร์ของตัวอย่างจึงไม่สามารถน าไปแยกชิ้นดีเอ็นเอด้วยตัวกลาง non-

denaturing polyacrylamide เพ่ือหาขนาดชิ้นดีเอ็นเอ ข้อมูลในการศึกษาครั้งนี้จึงไม่เพียงพอเพ่ือน าไป

วิเคราะห์ผลหาจ านวนอัลลีลเฉลี่ยต่อต าแหน่ง (number of allele per locus, N) ร้อยละของยีนในสภาวะ

หลากรูปแบบ (percentage of polymorphic loci) ค่าเฮเทอโรไซโกซิตี (heterozygosity) การทดสอบ

สมดุลฮาร์ดี-ไวน์เบิร์ก (Hardy-Weinberg Equilibrium) ค่าสัมประสิทธิ์เอฟ (F-coefficient) หรือการวิเคราะห์

รูปแบบผสมพันธุ์ อัตราการผสมข้าม อัตราการผสมเลือดชิด ของไมเ้ต็ง รัง ยางเหียง ยางกราดและพลวงได้

บทที่ 5 สรุป อภิปรายผล และข้อเสนอแนะ

สรุป และอภิปรายผล

1. เก็บตัวอย่างใบและผลของต้นพ่อและแม่พันธุ์ จ านวน 121 หมายเลข ได้แก่ เต็ง จ านวน 38 หมายเลข รัง จ านวน 30 หมายเลข ยางเหียง จ านวน 23 หมายเลข และยางกราด จ านวน 30 หมายเลข และน าเมล็ดพันธุ์มาเพาะต้นกล้า จ านวน 420 หมายเลข จากอุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี และอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ วัดพิกัดภูมิศาสตร์ทุกต้น เพ่ือหาระยะห่างการกระจายพันธุ์ และน าใบมาสกัดดีเอ็นเอและหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ เพ่ือเป็นข้อมูลในการวิเคราะห์หาความหลากหลายทางพันธุกรรมของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรัง ผลการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี Doyle and Doyle (1987) ดัดแปลง ทั้ง 4 ชนิดหรือ 4 กลุ่มประชากรได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสม แต่ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอมีการปนเปื้อน ไม่สามารถน าดีเอ็นเอต้นแบบมาหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมได้ท้ังหมด

2. การคัดเลือกดีเอ็นเอต้นแบบที่มีปริมาณและคุณภาพดีของ เต็ง รัง ยางเหียงและพลวงเพ่ือหาหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมจ านวน 14 ไพรเมอร์ พบว่ามี 6 ไพรเมอร์ ได้แก่ shc07 shc09 shc11 sle111 sle118 และ sle562 ที่สามารถท าปฏิกริรยาพีซีอาร์เพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอและได้ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอ มีแถบแบนขึ้นในต าแหน่งตรงเป้าหมาย (expected size)

3. การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอไมโครแซทเทิลไลท์ครั้งนี้ ตาม

ตัวอย่างที่น ามาศึกษาทั้งหมด 4 ชนิด ได้แก่ เต็ง รัง ยางเหียงและพลวง ในแต่ละกลุ่มประชากร ยังมี

ข้อมูลไม่เพียงพอที่จะน าไปวิเคราะห์ผลหาจ านวนอัลลีลเฉลี่ยต่อต าแหน่ง (number of allele per

locus, N) ร้อยละของยีนในสภาวะหลากรูปแบบ (percentage of polymorphic loci) ค่าเฮเทอ

โรไซโกซิตี (heterozygosity) การทดสอบสมดุลฮาร์ดี-ไวน์เบิร์ก (Hardy-Weinberg Equilibrium)

ค่าสัมประสิทธิ์เอฟ (F-coefficient) หรือการวิเคราะห์รูปแบบผสมพันธุ์ อัตราการผสมข้าม อัตราการ

ผสมเลือดชิดได้

ข้อเสนอแนะ

1. ควรหาวิธีการสกัดดีเอ็นให้ได้ปริมาณและคุณภาพที่ดีของพืชทั้ง 4 ชนิด คือเต็ง รัง ยางเหียงและพลวง เพ่ือจะได้ดีเอ็นเอต้นแบบที่มีคุณภาพดีในการหาไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการเพ่ิมขนาดของชิ้นดีเอ็นเอ มีแถบแบนขึ้นในต าแหน่งตรงเป้าหมาย เพ่ือใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลด้านความหลากหลายทางพันธุกรรมและระบบสืบพันธุ์ของพืชเหล่านี้ต่อไป

2. การประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมและระบบสืบพันธุ์ของพืชดัชนีส าคัญในป่าเต็งรัง ซึ่งเป็นป่าที่พบมากที่ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทย ยังมีความส าคัญอย่างยิ่งและยังมีข้อมูล

22

การศึกษาอยู่น้อยมาก ซ่ึงจากข้อมูลการศึกษาที่ผ่านมาความหลากหลายทางพันธุกรรม และระบบการสืบพันธุ์ของไม้ป่าหลายชนิดสามารถน ามาเป็นแนวทางในการวางแผนการอนุรักษ์แหล่งพันธุกรรมไม้ป่าและพืชป่าที่อยู่ตามระบบนิเวศของป่าชนิดต่างๆ ได้แตกต่างกันไป กล่าวคือหากแหล่ง (ประชากร) ใดของชนิดพันธุ์ที่ศึกษามีความหลากหลายทางพันธุกรรมสูง ก็มีความเหมาะสมที่จะถูกคัดเลื อกให้เป็นแหล่งอนุรักษ์พันธุกรรมในถิ่นก าเนิด เป็นต้น ดังนั้นการศึกษาวิจัยทางด้านพันธุศาสตร์ป่าไม้ระดับโมเลกุล จึงควรมีการศึกษาอย่างยิ่งเพราะการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมไม้ป่าโดยการใช้เครื่องหมายดีเอนเอ สามารถประเมินสถานะภาพทรัพยากรทางพันธุกรรมป่าไม้ได้ และยังเป็นข้อมูลเพ่ือใช้ในการวางแผนการอนุรักษท์รัพยกรป่าไม้ที่ส าคัญอย่างยิ่ง

23

เอกสารอ้างอิง ธวัชชัย สันติสุข. 2550. ป่าของประเทศไทย. กรมอุทยานแห่งชาติ สัตว์ป่าและพันธุ์พืช, กรุงเทพฯ. มลิวรรรณ นาคขุนทด, สุรินทร์ ปิยะโชคคณากุล, สุมน นาสุธน, สมศักดิ์ อภิสิทธิวาณิช. 2542. การศึกษา

อนุกรมวิธานของพันธุ์สกุลมังคุดบางชนิดโดยการตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ. ใน รายงานผลการวิจัยด้านความหลากหลายทางชีวภาพในประเทศไทย, กรุงเทพ: โครงการพัฒนาองค์ความรู้และศ฿กษานโยบายการจัดการทรัพยากรชีวภาพแห่งประเทศไทย; หน้า 639-644

สุจิตรา จางตระกูล. 2543. พันธุศาสตร์ป่าไม้, หน้า 345-360. ใน: บทความบริทัศน์งานวิจัยด้านความ หลากหลายทางชีวภาพในประเทศไทย (Review of Bidiversity Research in Thailand).

Changtragoon S. and Finkeldey R. 1995. Patterns of genetic variation and characterization of the mating system of Pinus merkusii in Thailand. Forest Genetics 2 (2) : 87-97.

Changtragoon S. and Szmidt AE. 1999. Genetic diversity of Teak by means isoenzyme gene markers, 13p. In : International Teak Conference : Teak Beyond Year 2000, 23-25 August 1999, Empress Hotel, Chiang Mai, Thailand .

Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin; 19: 11-15. Eriksson G, Schelander B and Akebrand V. 1973. Inbreeding depression in an old experimental plantation of Picea abies. Hereditas 73 : 185-193. Finkeldey R and Hattemer HH. 2007. Tropical Forest Genetics. Berlind Heidelberg,

Springer-Verlag. Ghazoul, J. 1997. The poliination and breeding system of Dipterocarpus obtusifolius

(Dipterocarpaceae) in dry deciduous forests of Thailand. 31, 901-916. Goudet J. 1995. FSTAT: A program to estimated and test gene diversities and fixation

indices, version 2.9.3. [Online]. Available from: www/unil.ch/izea/software/fstat [Cited 13 March 2010].

Hamrick, J.L., M.J.W. Godt, D.A. Murawski and M.D.Loveless. 1991. Correlations between species Traits and allozyme diversity: implications for conservation biology, Pp. 75-86. In Falk, D.A.; K.E. Holsinger eds. Genetics and Conservation of Rare Plants. Oxford, New York.

Kalinowski, ST, Taper ML, Marshall TC. 2007. Revising how the computer Program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology , 16, 1099 - 1006.

24

Kitamura K, Rahman MYBA, Ochai Y, Yoshimaru H. 1994. Estimation of the outcrossing rate on Dryobalanops aromatic Gaertn. F. in primary and secondary forest in Brunei, Borneo, Southeast Asia. Plant Species Biology, 9,

Lee SL, Wickneswari R, Mahani M, Zakri AH. 2000. Genetic diversity of a tropical tree species, Shorea leprosula Miq. (Dipterocarpaceae), in Malaysia: Implications for conservation of genetic resources and tree improvement. Biotropica, 32(2), 213 - 224.

Marshall TC, Slate J, Kruuk LEB, Pemberton JM. 1998. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, 7, 639 - 655.

Murawski DA and Bawa KS. 1994. Genetic structure and mating system of Stemonoporus oblonglifolius (Dipterocarpaceae) in Sri Lanka. American Journal of Botany, 81, 155 - 160.

Murawski DA and Hamrick JL. 1992. The mating system of Cavanillesia platanifolia under extremes of flowering tree density: a test of predictions. Biotropica, 24, 99 - 101.

Pandey M and Geburek T. 2009. Successful cross-amplification of Shorera microsatellite reveals genetic variation in the tropical tree, Shorea robusta Gaertn. Pooma R, 2003. Dipterocarpaceae in Thailand: Taxonomic and Biogeographicial Analysis. Ph.D. Thesis. Kasetsart University, Thailand. Slatkin M. 1985. Rare alleles as indicators of gene flow. Evolution, 39, 53 - 63. Selkoe KA and Toonen RS. 2006. Microsatellites for ecologist: practical guide to using and evaluating microsatellite marker. Ecology Letter, 9, 615 - 629. Szmidt, A.E. 1984. Genetic studies of Scots pine (Pinus sylvestris L.) domestication by means

of isozyme analysis. Ph. D. Thesis. The Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Forest Genetics and Plant Physiology, Umeao ISBN 91-576-2123-3.

Ratnam W and Seng HW. 2003. Determination of genetic relatedness of selected individual trees of Shorea leprosula Miq. and Dipterocarpus cornunus Dyer in forest seed production areas. Tropics , 13(2),139 - 149.

Raymond M and Rousset F. 1995. Genepop Web Version 3.4.0 [online]. Available from: www.genepop.curtin.edu.au/genepop [Cited 20 March 2010].

Ritland K. 2008. MLTR: Multilocus mating system program version 3.2. [Online].

25

Available from: http://genetics.forestry.ubc.ca/ritland/programs [Cited 22 December 2010].

Takeuchi Y, Ichikawa S, Konuma A, Tomaru N, Niiyama K, Lee SL, Muhammad N, Tsumura Y. 2004. Comparison of the fine-scale genetic structure of three

dipterocarp species . Heredity, 92, 323 - 328. White TL, Adams WT, Neale DB. 2007. Forest Genetics. UK, CAB International.

ภาคผนวก

ภาพที ่4.7 แสดงรหัสต้นพ่อแม่พันธุ์และพิกัดภูมิศาสตร์ของเต็ง (Shorea obtusa) ในอุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี

ภาพที่ 4.8 แสดงรหัสต้นพ่อแม่พันธุ์และพิกัดภูมิศาสตร์ของรัง (Shorea siamensis) ในอุทยานแห่งชาติผาแต้ม จังหวัดอุบลราชธานี

ภาพที ่4.9 แสดงรหัสต้นพ่อแม่พันธุ์และพิกัดภูมิศาสตร์ของยางเหียง (Dipterocarpus obtusifolius) ในอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ

ภาพที่ 4.10 แสดงรหัสต้นพ่อแม่พันธุ์และพิกัดภูมิศาสตร์ของพลวง (Dipterocarpus tuberculatus) ในอุทยานแห่งชาติไทรทอง จังหวัดชัยภูมิ