ผลของเคอรควมน, ดเมตทอกซเคอรควมน และบสดเมตทอกซเคอรควมนตอการยบยงการแสดงออกของยน และการผลตโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวเพาะเลยงชนดตางๆ

สงหคำ ธมา1

ประสทธ ชนะรตน2ชฎารตน ดวงรตน3พรงาม ลมตระกล4

ทรงยศ อนชปรดา5

Inhibitory effect of curcuminoids on Wilms' tumor1 (WT1) gene and its protein expressionin leukemic cell linesTima S, Chanarat P, Daungrat C, Limtrakul P, Anuchapreeda S.Department of Medical Technology, Faculty of Associated Medical Sciences,Department of Pharmaceutical Science, Faculty of Pharmacy,Department of Biochemistry, Faculty of Medicine,Chiang Mai University, Chiangmai, 50200, ThailandSongkla Med J 2008;26(1):1-13

@งานวจยนไดรบทนสนบสนนจากสภาวจยแหงชาต และกองทนสนบสนนนกวจย มหาวทยาลยเชยงใหม1วท.ม. (เทคนคการแพทย) 2วท.ม. (พยาธวทยาคลนก), อาจารย 5ปร.ด. (ชวเคม), อาจารย ภาควชาเทคนคการแพทย คณะเทคนคการแพทย3Ph.D (Pharmaceutical Chemistry) with Honors, ผชวยศาสตราจารย สายวชาวทยาศาสตรเภสชกรรม คณะเภสชศาสตร4Ph.D (Biochemistry), รองศาสตราจารย ภาควชาชวเคม คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม อ.เมอง จ.เชยงใหม 50200 รบตนฉบบวนท 25 ธนวาคม 2549 รบลงตพมพวนท 19 กนยายน 2550

นพนธตนฉบบ

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ2

Abstract:Leukemia is a group of common hematological malignancies, and the expression of Wilms' tumor1 (WT1) gene and its

product in leukemic blast cells is very high compared with normal bone marrow cells. This study investigated the effect ofturmeric curcuminoids, including curcuminoid mixture, pure curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin, onWT1 gene expression in leukemic cell lines (K562, U937, HL-60, and Molt4). The cell lines were cultured in the presenceof 10 µM of curcuminoid that was not toxic to leukemic cells under our experimental conditions. WT1 mRNA and WT1protein levels were assessed by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis, respec-tively. The curcuminoid derivative which showed strong inhibitory effect on WT1 gene expression in this study was selected forstudy of its effect on WT1 gene expression using various concentrations which were nontoxic (5, 10, and 15 µM) to leukemiccell lines and incubating up to 3 days. Pure curcumin exhibited a strong inhibitory effect on WT1 mRNA and WT1 proteinexpression. Moreover, pure curcumin significantly decreased WT1 gene expression in both a concentration-dependent and atime-dependent manner (p<0.05). In summary, pure curcumin decreased both WT1 protein and WT1 mRNA levels inleukemic cell lines. It may be possible to use pure curcumin as a chemotherapeutic agent in human leukemic cancer.

Key words: curcuminoids, curcumin, Wilms' tumor1 gene, WT1, Leukemia

บทคดยอ:มะเรงเมดเลอดขาวเปนโรคมะเรงทางโลหตวทยาทพบไดบอย และพบวามการแสดงออกของยนวลมทเมอรวน (WT1) ทเพม

สงขนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวตวออนเมอเทยบกบเซลลเมดเลอดขาวในไขกระดกปกต การศกษานมงศกษาผลของสารสกดเคอรควมนอยดจากขมนชน ไดแก สารสกดเคอรควมน, ดเมตทอกซเคอรควมน, บสดเมตทอกซเคอรควมน และเคอรควมนอยดรวมตอการยบยงการแสดงออกของยน WT1 ในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว K562, U937, HL-60 และ Molt4 โดยทำการเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวกบสารสกดเคอรควมนอยดความเขมขน 10 µM ซงไมมพษตอเซลลมะเรงเมดเลอดขาวททำการทดสอบทำการตรวจสอบระดบการแสดงออกของ WT1 mRNA และโปรตนวลมทเมอรวน ดวยวธ RT-PCR และ Western blot ตามลำดบจากนนจงนำสารสกดทใหผลยบยงการแสดงออกของยน WT1 ทดทสด มาทำการศกษาตอโดยใชความเขมขนของสารสกดทไมเปนพษตอเซลลมะเรงเมดเลอดขาวททำการทดสอบ คอ 5, 10 และ 15 µM และระยะเวลาททดสอบคอ 1, 2 และ 3 วน เพอศกษาวาฤทธการยบยงเพมขนตามความเขมขนของสารสกด และระยะเวลาหรอไม จากการศกษาพบวาเคอรควมนมฤทธในการยบยงการแสดงออกของ WT1 mRNA และโปรตนวลมทเมอรวน ไดดทสด นอกจากนยงพบวาฤทธการยบยงของเคอรควมนยงเพมขนตามความเขมขนและระยะเวลาทเพมขน โดยพบวามความแตกตางอยางมนยสำคญทางสถต (p<0.05) จงสรปไดวาเคอรควมนเปนเคอรควมนอยดทมฤทธในการยบยงการแสดงออกของยน WT1 ทงในระดบ mRNA และโปรตนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวไดดทสด จงเปนไปไดวาอาจจะมการนำเคอรควมนมาใชเปนสวนประกอบในการรกษามะเรงเมดเลอดขาวในอนาคต

คำสำคญ: เคอรควมนอยด, เคอรควมน, ยนวลมทเมอรวน, ดบบรวทวน, มะเรงเมดเลอดขาว

บทนำมะเรงเมดเลอดขาวหรอลวคเมยเปนมะเรงทางโลหตวทยา

เกดจากการแบงตวเพ มจำนวนของเซลลเมดเลอดตวออนทผดปกตอยางรวดเรวและไมสามารถควบคมได จากการศกษาทผานมาพบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวน (Wilms' tumor1;

WT1) ทเพมสงขนในเซลลเมดเลอดตวออนของผปวยมะเรงเมดเลอดขาวแทบทกชนด1 โดยพบวามระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวสงประมาณ 1,000ถง 100,000 เทา เมอเทยบกบระดบการแสดงออกในเซลลเมดเลอดขาวของไขกระดกคนปกต (normal bone marrow) และ

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.3

เซลลเมดเลอดจากกระแสเลอดของคนปกต (normal peripheralblood) ตามลำดบ2 นอกจากนยงมการศกษาพบวาระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนใน CD34+ leukemic cells มคาทสงกวาระดบการแสดงออกใน CD34+ normal cells อยางนอยประมาณ 10 เทา3 โดยปกตแลวยนวลมทเมอรวน เปนยนทกำหนดการสรางโปรตนวลมทเมอรวน ซงทำหนาทเกยวของกบกระบวนการเจรญเตบโตและพฒนาการของเซลลชนดตางๆ และสามารถตรวจพบระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลเมดเลอดขาวตวออนทงในกระแสเลอดและไขกระดก แตอยในระดบทตำมาก และมระดบลดตำลงเรอยๆ เมอเซลลเกดกระบวนการพฒนาการของเซลล (differentiation) ไปเปนเซลลเมดเลอดตวเตมวย4-5 ในขณะทจะมปรมาณการแสดงออกเพมขนในผปวยมะเรงเมดเลอดขาว1-2 โดยพบวาโปรตนวลมทเมอรวนมสวนเกยวของกบการแสดงออกของยนททำหนาทในกระบวนการแบงตวเพมจำนวนของเซลล (proliferation), การพฒนาการของเซลล และกระบวนการตายแบบอะพอพโตซส (apoptosis)ของเซลลมะเรงเมดเลอดขาว6-7 นอกจากนยงพบวาระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนยงเพมสงข นในผปวยมะเรงเมดเลอดขาวกลมทกลบมาเปนโรคอกครง (relapse case) จากการศกษาเหลานแสดงใหเหนวาการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนมความสำคญตอการเกดโรคมะเรงเมดเลอดขาว สารสกดเคอรคว-มนอยดจากขมนชนประกอบดวย เคอรควมน ดเมตทอกซ-เคอรควมน และบสดเมตทอกซเคอรควมน (รปท 1)8 มคณสมบตในทางการแพทยทหลากหลาย เชน ฤทธในการตานการอกเสบ(anti-inflammatory effect)9, ตานการตดเชอแบคทเรย (anti-bacterial agent)10, ตานกระบวนการออกซเดชน (anti-oxida-tion)11, และตานการเกดมะเรง (anticancer agent)12 นอกจากนยงมรายงานวจยพบวาสารสกดเคอรควมนอยดจากขมนชนมฤทธในการลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวของผปวยมะเรงเมดเลอดขาวดวย13-14 ดงนนการศกษานจงมวตถประสงคเพอศกษาผลของสารสกดเคอรคว-มนอยดแตละชนดตอระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว 4 ชนด คอ human erythroid leukemia(K562), human promyeloid leukemia (HL-60), humanmonocytic leukemia (U937) และ human lymphoblasticleukemia (Molt4) นอกจากนยงศกษาวาสารสกดทมฤทธในการลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนทมากทสดนนมฤทธเพมขนตามความเขมขนของสารสกดทเพมขน (5, 10 และ 15µM) และระยะเวลาทเพมขน (1, 2 และ 3 วน) หรอไม

วสดและวธการการเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนด K562,

HL-60, U937 และ Molt4ทำการเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 4 ชนด

ในอาหารเลยงเซลล RPMI 1640 (Roswell Park MemorialInstitute Medium) ทม fetal bovine serum ความเขมขน 10%,pyruvate ความเขมขน 110 มก./มล., HEPES ความเขมขน 10mM, penicillin ความเขมขน 100 units/mL และ streptomycinความเขมขน 100 กรม/มล. โดยทำการเพาะเล ยงในตท มคารบอนไดออกไซดรอยละ 5 มความชนสมพทธรอยละ 80 และมอณหภม 37 oC

สารสกดจากเคอรควมนอยดจากขมนชนทใชในการทดสอบ

สารสกดเคอรควมนนอยดจากขมนชนทใชในการทดสอบนเปนสารสกดเคอรควมนอยดรวม (curcuminoid mixture) ในชอCurcumin จากบรษทซกมา-อลดช (Sigma-Aldrich) และสารสกดเคอรควมนอยดจากขมนชนทสกดไดตามกรรมวธของสำนกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.)ทงเคอรควมนอยดรวม เคอรควมน ดเมตทอกซเคอรควมน และบสดเมตทอกซเคอรควมน โดยเมอจะนำมาทดสอบจะนำสารสกดเหลานมาละลายในสารละลาย dimethylsulfoxide (DMSO)

รปท 1 แสดงโครงสรางทางเคม (chemical structure) ของสารสกดเคอรควมน ดเมตทอกซเคอรควมน และบสดเมตทอกซเคอรควมน5

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ4

การเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวรวมกบสารสกดเคอรควมนอยดชนดตางๆ

ทำการเพาะเลยงเซลลในอาหารเลยงเซลล completedRPMI 1640 โดยใชปรมาณเซลลเรมตนเทากบ 1.5 x 105 เซลล/มล. สำหรบเซลล K562 (ไดรบความอนเคราะหจาก ดร.ฉายสรยศภวไล) และ 3.0x105 เซลล/มล. สำหรบเซลล U937, HL-60,และ Molt4 (ไดรบความอนเคราะหจาก รศ.ดร.วชระ กสณฤกษ)โดยกลมทดสอบจะเตมสารสกดเคอรควมนอยดชนดตางๆ ใหมความเขมขนสดทายเทากบ 10 µM ลงไป ในขณะทกลมควบคม(vehicle control) จะเตมเฉพาะ DMSO ในปรมาณความเขมขนทเทากบปรมาณความเขมขนของ DMSO ทใชในกลมทดสอบโดยความเขมขนสดทายของ DMSO เทากบรอยละ 0.04 ซงเปนความเขมขนทไมเปนพษตอเซลล ทำการเพาะเลยงเซลลเปนเวลา48 ชวโมง จากนนจงทำการเกบเกยวเซลลเพอทำการทดสอบหาระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนตอไป

การตรวจหาระดบการแสดงออกของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอ (WT1 mRNA) ในเซลลมะเรงชนดตางๆดวยวธ Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)

นำเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ ทผานการทดสอบมาทำการสกดอารเอนเอรวม (total RNA) ดวยนำยาสำเรจรปTRIzol® reagent (InvitrogenTM) ทำการตรวจหาความเขมขนและความบรสทธของอารเอนเอรวมทสกดได จากนนนำอารเอนเอรวมความเขมขน 1 µg มาศกษาการแสดงออกของยนโดยวธ RT-PCR โดยใชนำยาสำเรจรป SUPERSCRIPTTM One-Step RT-PCR (InvitrogenTM) โดยม primers และสภาวะ (condition)สำหรบศกษานคอ WT1 primers ประกอบดวย Sense primer คอ5’-GGCATCTGAGACCAG TGAGAA-3’, Anti-sense primerคอ 5’-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3’ และ GAPDHprimers ประกอบดวย Sense primer คอ 5’-CGAAGTCAAC-GGATTTGGTCGTAT-3’, Anti-sense primer คอ 5’-AGCC-TTCTCGGTGGTGAAGAC-3’

สวนสภาวะทใชในการเพมปรมาณ (amplification) ดงนคอขนตอนการสงเคราะห cDNA คอทอณหภม 60 oC เปนเวลา 30นาท, pre-denaturation ทอณหภม 94 oC เปนเวลา 2 นาทเพมปรมาณ cDNA ภายใตสภาวะดงน denaturation ทอณหภม94 oC เปนเวลา 1 นาท, primer annealing ทอณหภม 60 oCเปนเวลา 1 นาท และ primer extension ทอณหภม 72 oC เปนเวลา1 นาท รวมทงหมด 35 รอบ ตามดวย final extension ทอณหภม72 oC เปนเวลา 3 นาท จากนนทำการตรวจสอบโดยวธ gel electro-phoresis และวดความเขมของแถบทไดดวยเครอง scan densito-

meter ตอไป จากการทดลองนจะได PCR product ของยนวลมทเมอรวน และ GAPDH ทมขนาดเทากบ 474 bp และ 306bp ตามลำดบ

ทำการวเคราะหผลการทดลองทไดและเปรยบเทยบผลของเคอรควมนอยดชนดตางๆ ในการยบยงการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวแตละชนด เมอทำการวเคราะหขอมลและทราบแลววาเคอรควมนอยดชนดใดมผลทดทสดในการยบยงการแสดงออกของยนวลมทเมอรวน แลวใหนำเคอรควมนอยดชนดนนมากระจายความเขมขน (5, 10 และ 15µM) และระยะเวลาทใชในการทดสอบ (1, 2 และ 3 วน)แลวทดสอบดวาการยบยงการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนขนอยกบความเขมขนของสารสกดเคอรควมนอยด (dose depen-dent manner) และระยะเวลาทใชในการทดสอบ (time depen-dent manner) หรอไมตอไป โดยการแตละการทดสอบจะทำซำ3 ครง เพอยนยนผลการทดลอง

การตรวจหาระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงชนดตางๆ ดวยวธ Western blot analysis

นำเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ ทผานการทดสอบมาทำการสกดโปรตนจากนวเคลยส (nuclear protein) ดวยนำยาสำเรจรป NE-PER® Nuclear and cytoplasmic extractionreagents (PIERCE) ทำการหาปรมาณความเขมขนของโปรตนทสกดไดดวยวธ Lowry method15 หลงจากนนจงนำโปรตนทสกดไดจากแตละการทดลองปรมาณ 100 µg มาทำการตรวจสอบโดยวธ Western blot ซงตรวจสอบโดยใช rabbit polyclonal anti-WT1 antibody (Santa Cruz Biotechnolygy; USA) และ goatanti-rabbit IgG HRP conjugate (Promega; USA) ตามลำดบจากนนทำการตรวจสอบผลโดยใช SuperSignal® West Pico TrialKit (PIERCE) ผลทไดนำไปวดความเขมของแถบทไดโดยใชเคร อง scan densitometer นอกจากน สวนของการควบคมปรมาณของโปรตนทใชในการทดลอง ไดใช rabbit polyclonalanti-GAPDH antibody (Santa Cruz Biotechnolygy; USA) และgoat anti-rabbit IgG HRP conjugate (Promega; USA) ตามลำดบเพอตรวจวดการแสดงออกของโปรตน GAPDH ซงใชเปนตวควบคมปรมาณโปรตนในการทดลองน จากการทดลองนจะไดแถบโปรตนวลมทเมอรวน และ GAPDH ทมขนาดเทากบ 48-54กโลดาลตน (kDa) และ 37 kDa ตามลำดบ

ทำการวเคราะหผลการทดลองทไดและเปรยบเทยบผลของเคอรควมนอยดชนดตางๆ ในการยบยงการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวแตละชนดเมอทำการวเคราะหขอมลและทราบแลววาเคอรควมนอยดชนดใดมผลทดทสดในการยบยงการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวน

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.5

แลวจงทำการทดสอบวาสารสกดเคอรควมนอยดชนดนนมฤทธในการยบยงการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวน ขนอยกบความเขมขนของสารสกดเคอรควมนอยด (dose dependent manner)และระยะเวลาทใชในการทดสอบ (time dependent manner)หรอไมตอไป โดยการแตละการทดสอบจะทำซำ 3 ครง เพอยนยนผลการทดลอง

การวเคราะหขอมลทางสถตนำผลการทดลองทไดมาหาคาเฉลยของระดบการแสดงออก

ของยนและโปรตนวลมทเมอรวน ซงขอมลทไดอยในรปของMEAN ± SE หลงจากนนนำมาวเคราะหความแตกตางทางสถตโดยใช one-way ANOVA โดยทำการเปรยบเทยบผลการทดสอบดวยเคอรควมนอยดแตละชนดกบชดควบคมเพอวเคราะหวาเคอรควมนอยดชนดใดมคายบยงการแสดงออกของทงยนและโปรตนวลมทเมอรวนไดดทสด และการยบยงเปนไปตามความเขมขนและระยะเวลาทเพมขนหรอไม

ผลการศกษาผลของสารสกดเคอรควมนอยดชนดตางๆ ตอระดบ

ของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวจากการตรวจหาระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอ

ในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 4 ชนด พบวาเซลลทง 4 ชนดมระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอทสง (รปท 2ก) และพบวา

สารสกดเคอรควมนอยดทกชนดสามารถลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 4 ชนดเมอเปรยบเทยบผลการทดลองระหวางเคอรควมนอยดทง 3 ชนดพบวา เคอรควมนมฤทธในการยบยงการแสดงออกของยนวลม-ทเมอรวนมากทสด ตามดวย บสดเมตทอกซเคอรควมน และดเมตทอกซเคอรควมน ตามลำดบ โดยสารสกดเคอรควมน มฤทธในการลดระดบของยนวลมทเมอรวนอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) ในเซลล K562, U937, HL-60และ Molt4 โดยคดเปนรอยละ 59, 43, 37 และ 17 ตามลำดบเมอเทยบกบชดควบคม (รปท 3)

ผลของสารสกดเคอรค วมนท ความเขมขน และระยะเวลาตางๆ ตอระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว

เม อนำสารสกดเคอรค วม นซ งม ฤทธ ลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนมากทสด มาทำการทดสอบกบเซลลเมดเลอดขาวแตละชนด โดยทำการกระจายความเขมขนเปน5, 10 และ 15 µM ซงไมเปนพษตอเซลล พบวาสารสกดเคอรควมนสามารถลดระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลเมดเลอดขาวท ง 4 ชนด และยงพบวาระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอมปรมาณลดลงตามความเขมขนของสารสกดเคอรควมนทเพมมากขนอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) (รปท 4)

รปท 2 แสดงระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอ (ก) และโปรตนวลมทเมอรวน (ข) ในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ

Marker(bp)

K562 U937 HL-60 Molt4

500

250

WT1 (474 bp)GAPDH (360 bp)

Marker(kDa) K562 U937 HL-60 Molt4

GAPDH

WT1

705545

453525

ก

ข

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ6

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, Sig = เคอรควมนอยดรวม (ซกมา-อลดช), Mix = เคอรควมนอยดรวม, Cur = เคอรควมน, De = ดเมตทอกซเคอรควมน,Bis = บสดเมตทอกซเคอรควมน, DW = นำกลน (internal control), * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต (p<0.05)

รปท 3 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนอยดแตละชนดตอระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ

K562

U937

HL-60

Molt4

Marker(bp)

K562

500250

WT1GAPDH

กCont Sig Mix Cur De Bis DW

Marker(bp)

U937

WT1GAPDH

ขDW Cont Sig Mix Cur De Bis

500250

Marker(bp)

HL60

WT1GAPDH

คDW Cont Sig Mix Cur De Bis

500250

Marker(bp)

Molt4

WT1GAPDH

งDW Cont Sig Mix Cur De Bis

500250

100

80

60

40

20

0Vehiclecontrol

Sig Mix Cur De Bis

K562U937HL-60Molt4

10 µM Curcuminoids treated cells

*

**

*

*

**

**

จ

%W

T1 m

RNA

level

นอกจากนเมอทำการเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ รวมกบสารสกดเคอรควมนทความเขมขน 10 µMเปนเวลา 1, 2 และ 3 วน พบวาสารสกดเคอรควมนสามารถลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวท ง 4 ชนดได และพบวาสามารถลดปรมาณวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอตามระยะเวลาทเพ มข นอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) (รปท 5)

ผลของสารสกดเคอรควมนอยดชนดตางๆ ตอระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว

จากการศกษาระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 4 ชนด พบวามเพยงเซลล K562 และMolt4 เทานนทมระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนในปรมาณทมากพอและสามารถทำการตรวจวดได ในขณะทไมสามารถตรวจพบระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวน

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.7

ในเซลล U937 และ HL-60 (รปท 2ข) ดงนนจงใชเซลล K562และ Molt4 มาเปนเซลลตนแบบในการศกษาผลของสารสกดเคอรควมนอยดตอระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนตอไป จากการทดลองพบวาสารสกดเคอรควมนอยดทกชนดทใชในการทดสอบสามารถลดระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวน ทงในเซลล K562 และ Molt4 โดยหากจะเปรยบเทยบระหวางผลของเคอรควมนอยดทง 3 ชนดพบวา

เคอรค วมนมฤทธ ในการยบย งการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนมากทสด ตามดวย บสดเมตทอกซเคอรควมน และดเมตทอกซเคอรควมน ตามลำดบ โดยสารสกดเคอรควมนมฤทธในการลดระดบของโปรตนวลมทเมอรวนไดอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) ในเซลล K562 และMolt4 โดยคดเปน 48 และ 90 เปอรเซนต ตามลำดบ เมอเทยบกบชดควบคม (รปท 6)

Marker(bp)

K562

WT1GAPDH

ก DW Cont 5 10 15 (µM)

500250

Marker(bp)

HL60

WT1GAPDH

ค DW Cont 5 10 15 (µM)

500250

Marker(bp)

U937

WT1GAPDH

ข DW Cont 5 10 15 (µM)

500

250

Marker(bp)

Molt4

WT1GAPDH

ง DW Cont 5 10 15 (µM)

500250

K562U937HL-60Molt4

100

80

60

40

20

0

จ

%W

T1 m

RNA

level

Vehicle control 5 µM 10µM 15µM

Concentration of pure curcumin

K562U937HL-60Molt4

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, DW = นำกลน (internal control), * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต(p<0.05)

รปท 4 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนทความเขมขนตางๆ ตอระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ

*

*

* *

*

* **

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ8

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, DW = นำกลน (internal control), * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต(p<0.05)

รปท 5 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนทเวลาตางๆ ทใชในการทดสอบตอระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ

10µM pure curcumin treated cells

ผลของสารสกดเคอรควมนทความเขมขนและระยะเวลาตางๆ ตอระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว

เมอนำสารสกดเคอรควมนซงมฤทธลดระดบของโปรตนวลมทเมอรวนมากทสด มาทำการทดสอบกบเซลลเมดเลอดขาวแตละชนด โดยทำการกระจายความเขมขนเปน 5, 10 และ 15µM พบวาสารสกดเคอรควมนสามารถทจะลดระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลเมดเลอดขาวทง 2 ชนด เปนแบบเพมขน

ตามความเขมขนของสารสกดเคอรควมนทเพมมากขนอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) (รปท 7)

นอกจากนเมอทำการเพาะเลยงเซลลมะเรงเมดเลอดขาวชนดตางๆ รวมกบสารสกดเคอรควมนทความเขมขน 10 µMเปนเวลา 1, 2 และ 3 วน พบวาสารสกดเคอรควมนสามารถลดระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 2 ชนดเปนแบบตามระยะเวลาทเพมขนอยางมนยสำคญทางสถตทคาความเชอมนท 95% (p<0.05) (รปท 8)

Marker(bp)

K562

WT1GAPDH

กDW Cont 5 10 15 (days)

500250

Marker(bp)

HL60

WT1GAPDH

คDW Cont 5 10 15 (days)

500250

Marker(bp)

U937

WT1GAPDH

ข DW Cont 5 10 15 (days)

500250

Marker(bp)

Molt4

WT1GAPDH

งDW Cont 5 10 15 (days)

500250

K562U937HL-60Molt4

100

80

60

40

20

0

จ

%W

T1 m

RNA

level

Vehicle control 1 day 2 days 3 days

K562U937HL-60Molt4

*

*

*

*

**

*

*

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.9

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, Sig = เคอรควมนอยดรวม (ซกมา-อลดช), Mix = เคอรควมนอยดรวม, Cur = เคอรควมน, De = ดเมตทอกซเคอรควมน,Bis = บสดเมตทอกซเคอรควมน, * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต (p<0.05)

รปท 6 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนอยดแตละชนดตอระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว K562และ Molt4

K562Molt4

100

80

60

40

20

0

ค

%W

T1 m

RNA

level

Sig Mix Cur De Bis

10µM pure curcumin treated cells

Vehiclecontrol

K562Molt4

Marker(kDa)

K562

WT1

ก

Cont Sig Mix Cur De Bis705545

10µM curcumin treated cells

705545

GAPDH

Marker(kDa)

Molt4

WT1

ข

Cont Sig Mix Cur De Bis705545

10µM curcumin treated cells

705545

GAPDH

วจารณสารสกดเคอรควมนอยดท งหมดท ใชในการทดลอง

สามารถทจะลดระดบของวลมทเมอรวนเอมอารเอนเอ และโปรตนวลมทเมอรวนไดในเซลลมะเรงทนำมาทดสอบและเมอเปรยบเทยบระหวางสารสกดเคอรควมนอยดทง 3 ชนด พบวาเคอรควมนมความสามารถสงสดในการลดระดบของทงวลมทเมอรวนเอมอาร-เอนเอและโปรตนวลมทเมอรวน รองลงมาคอ บสดเมตทอกซ-เคอรควมน และดเมตทอกซเคอรควมน ตามลำดบ จากผลการทดลองนเปนไปไดวาลกษณะโครงสรางทางโมเลกลของสารสกดทงสามชนดทแตกตางกน (รปท 1) มผลตอฤทธของ

สารสกดทงสามชนด โดยโครงสรางโมเลกลของเคอรควมนจะประกอบดวยสวนสำคญสามสวนดวยกน คอ hydroxyl groupมคณสมบตเปน antioxidant ของเคอรควมน สวนทสองเปนketone groups ซงมสองตำแหนง บางครงเรยกวา diketone และสวนทสามเปน double bond ซง ทงสวนของ diketone และ doublebond นมคณสมบตเกยวของกบการทำหนาทตานการอกเสบตานสารกอกลายพนธ และตานมะเรง สวนโครงสรางของดเมต-ทอกซเคอรควมน พบวามหม methoxyl เพยง 1 ตำแหนง ในขณะทบสดเมตทอกซเคอรควมนพบวาไมมหม methoxyl

**

*

*

**

*

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ10

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต (p<0.05)

รปท 7 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนทความเขมขนตางๆ ตอระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวK562 และ Molt4

Marker(kDa)

K562

WT1

ก

Cont 5µM 10µM 15µM705545

Concentrations of pure curcumin

705545

GAPDH

Marker(kDa)

Molt4

WT1

ข

Cont 5µM 10µM 15µM705545

Concentrations of pure curcumin

705545

GAPDH

K562Molt4

100

80

60

40

20

0

ค

%W

T1 m

RNA

level

Vehiclecontrol

5µM 10µM 15µM

Concentrations of pure curcumin

K562Molt4

จากการศกษาของ Lee และคณะ16 พบวา การม vanilylmoiety และ ketone group อยในโครงสรางของ [6]-Gingerolในพชตระกลขงและมโครงสรางพนฐานเหมอนกบโครงสรางของเคอรควมนอยดมสวนสำคญในการเหนยวนำใหเซลล HL-60เกดการตายแบบอะพอพโตซส นอกจากน Simon และคณะ17

พบวาหม diketone ทพบในโครงสรางของเคอรควมนอยดมความสำคญในการตานกระบวนการแบงตวและเพมจำนวนของเซลลอกดวย ดงนนจากผลการศกษานจงสามารถสรปไดวา หมmethoxyl และ diketone ในโครงสรางของเคอรควมนอยดมสวนเกยวของกบฤทธในการยบยงการแสดงออกของยนวลมทเมอรวน

นอกจากนผลการศกษาทไดจากการทดลองน พบขอสงเกตวาfunctional group ทเกยวของกบการยบยงการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนนนนาจะเกยวของกบหม methoxyl ในเคอรคว-มนอยดแตละชนดกลาวคอ เคอรควมนมปรมาณหม methoxylทมากทสดและมฤทธในการยบยงไดมากทสด นอกจากนในสวนของผลการศกษาท ไดจากดเมตทอกซเคอรควมนซ งมฤทธ ในการยบยงนอยทสดนน อาจจะเปนไปไดวาความไมสมดลกนของหม methoxyl ในโครงสรางของดเมตทอกซเคอรควมนอาจจะเกยวของกบฤทธในการยบยงนกเปนได อยางไรกตามยงคงตองมการศกษาเกยวกบสมมตฐานนอกตอไป

*

*

*

**

*

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.11

หมายเหต: Cont = กลมควบคม, * แสดงถงผลการทดสอบทมความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยสำคญทางสถต (p<0.05)

รปท 8 แสดงผลของสารสกดเคอรควมนทเวลาตางๆ ทใชในการทดสอบตอระดบของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว K562 และ Molt4

10µM pure curcumin treated cells

จากผลการทดลองน พบวาไมสามารถตรวจวดระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวสองชนด ไดแก U937 และ HL-60 แมจะสามารถตรวจพบระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวน ทงนอาจจะเกดขนเน องจากการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวทง 4 ชนดมระดบทแตกตางกน โดยจากการศกษาของInoue และคณะ3 ไดทำการศกษาระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนใน leukemic cell line ชนดตางๆ พบวาเซลลแตละชนดมระดบการแสดงออกทแตกตางกนออกไป จงอาจจะ

สงผลใหมระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนท แตกตางกนได นอกจากนวธการทดสอบทใชในการทดลองนอาจจะมความสามารถไมมากพอทจะตรวจวดระดบโปรตนวลมทเมอรวนทมปรมาณนอยๆ ภายในเซลลมะเรงเมดเลอดขาว U937 และHL-60 ได เชน ศกษาระดบโปรตนวลมทเมอรวนในเซลล K562และ Molt4 นนใชวธการ Western blot analysis กสามารถทจะตรวจวดไดแลว13, 18-19 ในขณะทการศกษาในเซลล HL-60 นนตองอาศยวธการ Immunoprecipitation มาชวยจงจะตรวจวดได20

นอกจากนกระบวนการหลงการเกดทรานสเลชน (post-translation)

Marker(kDa)

K562

WT1

ก

Cont 1 2 3 (days)705545

10µM pure curcumin treated cells

705545

GAPDH

Marker(kDa)

Molt4

WT1

ข

Cont 1 2 3 (days)705545

10µM pure curcumin treated cells

705545

GAPDH

K562Molt4

100

80

60

40

20

0

ค

%W

T1 m

RNA

level

Vehiclecontrol

1 days 2 days 3 days

K562Molt4

* *

**

**

สงขลานครนทรเวชสาร เคอรควมนอยดยบยงยนวลมทเมอรวนในมะเรงเมดเลอดขาวปท 26 ฉบบท 1 ม.ค.-ก.พ. 2551 สงหคำ ธมา, ประสทธ ชนะรตน, ชฎารตน ดวงรตน และคณะ12

ของเซลลมะเรงแตละชนดอาจจะสงผลตอระดบการแสดงออกของโปรตนวลมทเมอรวนทแตกตางกนออกไปได อยางไรกตามจำเปนตองมการศกษาเพมเตมตอไป

สรปจากการศกษาสามารถสรปไดวา สารสกดเคอรคว-

มนอยดทงหมดทใชในการทดสอบนมความสามารถในการลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอรวนในเซลลมะเรงเมดเลอดขาวไดในระดบทแตกตางกน โดยเคอรควมนมความสามารถในการลดระดบการแสดงออกของยนวลมทเมอร-วนไดดทสดทงในขนตอนของกระบวนการ transcription และtranslation นอกจากนยงพบวาฤทธของสารสกดเคอรควมนยงขนอยกบความเขมขน และระยะเวลาทใชในการทดสอบอกดวย จงมความเปนไปไดทจะนำการศกษานมาทำการศกษาตอในทางคลนกกบเซลลมะเรงเมดเลอดขาวของผปวยเพอนำไปสการใชสารสกดเคอรควมนจากขมนชนมาใชเปนสวนประกอบในการรกษาผปวยมะเรงเมดเลอดขาวตอไปในอนาคต

เอกสารอางอง1. Sugiyama H. Wilms' tumor gene WT1: its oncogenic

function and clinical application. Int J Hematol 2001;73:177-87.

2. Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, Nakagawa M, YamagamiT, Miwa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and anew marker for the detection of minimal residual diseasein acute leukemia. Blood 1994;84:3071-9.

3. Inoue K, Ogawa H, Sonoda Y, Kimura T, Hideaki S,Oka Y, et al. Aberrant overexpression of the Wilmstumor gene (WT1) in human leukemia. Blood 1997;89:1405-12.

4. Maurer U, Brieger J, Weidmann E, Mitrou PS, HoelzerD, Bergmann L. The Wilms' tumor gene is expressed ina subset of CD34+ progenitors and downregulated earlyin the course of differentiation in vitro. Exp Hematol1997;25:945-50.

5. Baird PN, Simmons PJ. Expression of the Wilms' tumorgene (WT1) in normal hemopoiesis. Exp Hematol 1997;25:312-20.

6. Menke AL, van der Eb AJ, Jochemsen AG. The Wilms'tumor 1 gene: oncogene or tumor suppressor gene? IntRev Cytol 1998;181:151-212.

7. Menssen HD, Renkl HJ, Rodeck U, Maurer J, Notter M,Schwartz S, et al. Presence of Wilms' tumor gene (WT1)transcripts and the WT1 nuclear protein in the majorityof human acute leukemias. Leukemia 1995;9:1060-7.

8. Chearwae W, Wu CP, Chu HY, Lee TR, Ambudkar SV,Limtrakul P. Curcuminoids purified from turmeric powdermodulate the function of human multidrug resistanceprotein 1 (ABCC1). Cancer Chemother Pharmacol 2006;57:376-88.

9. Lantz RC, Chen GJ, solyom AM, Jolad SD, TimmermannBN. The effect of turmeric extracts on inflammatorymediator production. Phytomedicine 2005;12:445-52.

10. Kim KJ, Yu HH, Cha JD, Seo SJ, Choi NY, You YO.Antibacterial activity of Curcuma longa L. against methi-cillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytother Res2005;19:599-604.

11. Miquel J, Bernd A, Sempere JM, Diaz-Alperi J, RamirezA. The curcuma antioxidants: pharmacological effects andprospects for future clinical use. A review. Arch GerontolGderiatr 2002;34:37-46.

12. Aggarwal BB, Kumar A, Bharti AC. Anticancer poten-tial of curcumin: preclinical and clinical studies. Anti-cancer Res 2003;23:363-98.

13. Anuchapreeda S, Limtrakul P, Thanarattanakorn R,Sittpreechacharn S, Chanarat P. Inhibitory effect ofcurcumin on WT1 gene expression in patient leukemiccells. Arch Pharm Res 2006;29:80-7.

14. Anuchapreeda S, Wikan N, Tima S, Thanarattanakorn R,Sittpreechacharn S, Limtrakul P. Effect of curcumin onWT1 gene expression in human leukemic cells. J MedTech Assoc Thailand 2005;33:1252-64.

15. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Proteinmeasurement with the Folin-Phenol reagents. J Biol Chem1951;193:265-75.

16. Lee E, Surh YJ. Induction of apoptosis in HL-60 cellsby pungent vanilloids, [6]-gingerol and [6]-paradol.Cancer Lett 1998;134:163-8.

Songkla Med J Curcuminoids inhibited Wilms' tumor1 gene in leukemic cellVol. 26 No. 1 Jan.-Feb. 2008 Tima S, Chanarat P, Daungrat C, et al.13

17. Simon A, Allais DP, Duroux JL, Basly JP, Durand-Fontanier S, Delage C. Inhibitory effect of curcuminoidson MCF-7 cell proliferation and structure-activity relation-ships. Cancer Lett 1998;129:111-6.

18. McCann S, Sullivan J, Guerra J, Arcinas M, Boxer LM.Repression of the c-myb gene by WT1 protein in T andB cell lines. J Biol Chem 1995;270:23785-9.

19. Dechsukhum C, Ware JL, Ferreira-Gonzalez A, WilkinsonDS, Garrett CT. Detection of a novel truncated WT1transcript in human neoplasia. Mol Diagn 2000;5:117-28.

20. Algar EM, Khromykh T, Smith SI, Blackburn DM,Bryson GJ, Smith PJ. A WT1 antisense oligonucleolideinhibits proliferation and induces apoptosis in myeloidleukemia cell lines. Oncogene 1996;12:1005-14.