การทําเอนไซมใหบรสิุทธ์ิ

นลิน วงศขัตติยะเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิทยาศาสตร

มหาวิทยาลัยแมโจ

ทําไมตองทําเอนไซมใหบริสุทธิ์

ทําไมตองทําใหบริสุทธิ์

เพื่อทราบการทํางานของเอนไซม-ทราบเมตาบอลิซึม และวิถีของเอนไซม, จะไดรูปฏิกิริยา ไคเนติกส การควบคุมการทํางาน

หากทราบการทํางานในภาวะปกติแลว เมื่อมีภาวะไมปกติจะไดแกไขและทราบขอมูลไดตรงจุด เชน ภาวะไมมีเอนไซม แลคเตส ยอยนม

สามารถออกแบบยา ที่เปน 3D structure ได

เพิ่มมูลคาใหตัวเอนไซม เปนยา

อื่นๆอีกมากมาย

Vdo Tipranavir

Enzyme/protein purification

สกัดเอนไซมจากไหน?

เซลลพืช เซลลสัตว เซลลจุลินทรีย น้ําเลี้ยงเซลล subcellular fractions (e.g. mitochondria, membranes)

ทําอยางไรใหคงสภาพกิจกรรมของเอนไซมเหมือนเดิม

Physical boundaries of protein stability

pH, Temperature, salt concentration, oxygen sensitivity, storage, mechanical forces

ทําเอนไซมใหบริสุทธิ์มีขั้นตอนอยางไร

สกัดเอนไซมใหออกมาอยูในรูปของของเหลว

ทําเอนไซมใหบริสุทธิ์ดวยขั้นตอนการแยกสารตางๆ

ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม

ทําเอนไซมใหอยูในรูปของเหลวไดอยางไรDisruption and homogenization of cells, tissue, etc

ใชเทคนิคตางๆ เชน shearing, grinding, sonication,

French pressure cell disruption

Isolation of organelles; solubilization of membranes

Excreted proteins

เอนไซมจากธรรมชาติอาจจะมีนอย ทําใหเพิ่มขึ้นไดอยางไรRecombinant DNA technology is a very useful tool for

protein purification

for 'overproduction' of proteins using expression vectors

for application of 'tags' to proteins

for excretion of proteins into the culture medium

Protein purification - Aims

Sufficient purity and quantity

Maintained biological activity

Fast and simple

Good economy

Enzyme/protein purificationแลวจะวัดคาอะไรบาง

How is purification measured?

Specific activity

Purification table

Physical methods: SDS-PAGE, gel filtration

Purification table Total amount of enzyme (U):

Activity (U.ml-1) x volume (ml)

Specific activity (U.mg-1):

Activity (U.ml-1) / protein content (mg.ml-1)

Purification fold:

Specific activity of enzyme after a purification step / specific activity before that step

%recovery

Activity x 100/activity at the initial step

Enzyme/protein purificationวิธีทําใหโปรตีนบริสุทธิ์

1. Precipitation methods

2. Separation based on molecular size

3. Separation based on charge

4. Separation based on specific interaction with other biomolecules

5. Separation based on other principles

ตัวอยาง

1. Ammonium sulfate precipitation

2. Gel filtration

3. Ion-exchange chromatography

4. Bio-affinity chromatography

5. Hydrophobic interaction chromatography

การตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม

Quantitation of total protein

Spectrophotometry method

Chemical method

Lowry method

Bardford method

Assay of enzymatic activity

Substrate reduction

Product production

Ammonium sulfate precipitation

การละลายของโปรตีนจะเปลี่ยนแปลงไปตามความเขมขนของประจุ (ionic strength ซึ่งแปลงาย ๆ วาความเขมขนของประจุ) และความเขมขนของเกลือในสารละลาย โดยการละลายของโปรตีนเพิ่มขึ้นเมื่อใชความเขมขนของเกลือต่ํา ๆ เรียกปรากฏการณนี้วา การเพิ่มการละลายดวยเกลือปริมาณนอย (salting-in) แตเมื่อเพิ่มความเขมขนของประจุหรือเพิ่มความเขมขนของเกลือ การละลายของโปรตีนจะเริ่มลดลง และที่ความเขมขนของประจุสูง ๆ การละลายของโปรตีนจะลดลงจนถึงจุดที่โปรตีนตกตะกอนเกือบสมบูรณในสารละลาย ปรากฏการณนี้เรียกวา การตกตะกอนดวยความเขมขนของเกลือที่ใสลงไปในสารละลาย (salting-out)

โปรตีนกับไอออนของเกลือเขาแยงจับโมเลกุลอิสระของน้ํา กลาวคือ ที่ความเขมขนของเกลือสูง ๆ พันธะโมเลกุลของน้ําจะถูกจับดวยไอออนของเกลือเปนสวนใหญ พันธะโมเลกุลของน้ําจึงไมเพียงพอที่จะจับกับโปรตีน ทําใหโปรตีนจับกันเองมากกวาจับกับโมเลกุลของน้ํา และตกตะกอนในสารละลาย

What do you need to do?

What technique do you want to use?

Ion exchange

Size exclusion

Hydrophobic interaction

Affinity

Ion exchange chromatography

Separates compounds based on their charges

Resin type Cation exchanger Anion exchanger

Net charge of compound of interest

+ -

Charge of resin - +

Size exclusion chromatographyGel filtration (by size)

Size exclusion chromatography/gel filtration

Separates molecules by size

Hydrophobic interaction chromatography

Separates molecules based on their hydrophobicity

Affinity chromatography

The desired molecules bind to the matrix-bound ligand while other components of the mixture that have no affinity for the ligand are washed through the column