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TOTALE PAGINE 27

BIOLOGIA MOLECOLARE

ESTRAZIONE: AA077/C NON COMPRESA

HCV RNA REAL TI ME

QUALI TATI VO

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l.UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, 3 20090 SETTALA MI (Italy)Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37SITO INTERNET: www.nlm.it E-MAIL: [email protected]

NLM 6188 VER 07/09/11

AA896 50 TEST

MQI013-3

0459

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2N.B. :testo modificato rispetto alla precedente versione

:modified text compared with the previous version

UTILIZZO

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVO fornisce i reagenti necessari per la determinazionequalitativa della presenza del virus dellEpatite C (HCV RNA) in campioni di siero umanomediante Real Time RT-PCR della regione 5-UTR dellRNA virale.Nel kit viene fornito un Controllo Interno che, aggiunto ai campioni in fase di estrazione,permette di monitorare tutte le fasi del test.Questo prodotto va utilizzato in abbinamento al kit di estrazione di RNA codice NLMAA077/C Qiamp Viral RNA Mini Kit (da ordinare separatamente).LRNA estratto retrotrascritto e amplificato in un unico step di RT-PCR di circa 140minuti, utilizzando lo strumento Rotor Gene (Corbett Research).

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVO indicato per la diagnosi di infezione da HCVinsieme agli altri parametri di laboratorio (es. anticorpi, ALT, etc.) ed al quadro clinico delpaziente.Il dispositivo non va utilizzato come test di screening per la presenza di HCV RNA nei

donatori di sangue.

INTRODUZIONE

Il virus dellepatite C la principale causa di epatite acuta di origine virale che, nellamaggior parte dei casi, cronicizza ed evolve in cirrosi epatica ed epatocarcinoma1. HCV causa anche di patologie extraepatiche2-4

Il genoma virale costituito da RNA lineare a singola catena, con un solo open readingframe; in posizione 5 presenta una regione altamente conservata e non tradotta (5-UTR)che rappresenta il target per i test di biologia molecolare. La variabilit genetica dellaregione 5-UTR alla base della classificazione di HCV in diversi genotipi

.

5

Il virus si trasmette per via parenterale tramite contatto con sangue infetto. Lesposizione asangue infetto pu avvenire in seguito a trasfusioni anteriori al 1992, uso di siringheinfette, trapianto di organi solidi provenienti da donatori infetti, nascita da una madreinfetta, esposizione in ambito lavorativo, pratiche sessuali a rischio

.

6

.

Dopo una prima esposizione ad HCV, la presenza dellRNA virale nel sangue dei pazientipu essere rilevata nellarco di 1-3 settimane; linfezione acuta pu avere un decorsosevero ma raramente fulminante6

Sebbene linfezione acuta sia generalmente asintomatica, nell 85% dei casi circa sitrasforma in patologia cronica: la persistenza dellinfezione viene diagnosticata dallapresenza di HCV RNA nel sangue per almeno sei mesi

.

6

BIBLIOGRAFIA

.

1. Sarrazin C. Diagnosis of hepatitis C: update 2004. Journal of Gastroenterology and Hepatology (2004)19, S88-S93

2. Johnson RJ, Gretch DR, Yamabe H et al. Membranoproliferative glomerulonephritis associated withhepatitis C virus infection. N Engl J med 1993; 328: 465-470.

3. Agnello V, Chung RT, Kaplan RM. A role for hepatitis C virus infection in Type II cryoglobulinemia. NEngl J Med 1992; 327: 1490-1495.

4. Andreone P, Zignego AL, Cursaro C et al. Prevalence of monoclonal gammopathies with hepatitis Cvirus infection . Ann Intern Med 1998; 129: 294-298

5. Zein NN. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2000,p. 223-235.

6. National Institutes of Health, Consensus Conference Statement. Management of hepatitis C: 2002.

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PRINCIPIO DEL TEST

Il Test HCV RNA QUALITATIVO REAL TIME si basa su due processi:1. estrazione dellRNA virale2. retrotrascrizione, amplificazione e rivelazione della sequenza bersaglio mediante

Real Time RT-PCRIl kit provvisto di un Controllo Interno (CI) che, aggiunto a ciascun campione in fase diestrazione, permette di monitorare landamento di tutto il saggio.

1. Estrazione dellRNA viralePer lestrazione di HCV RNA e del Controllo Interno a partire da campioni di sieroumano si deve utilizzare Qiamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), come indicato inmetodica.

2. RT-PCR e Rivelazione

La regione 5-UTR stata scelta come target per lidentificazione del virus in campionidi siero umano poich si tratta di una regione altamente conservata fra i diversigenotipi di HCV.

Target selezionato per lamplificazione

Il Controllo Interno un trascritto di RNA sintetico contenente una regione perlappaiamento dei primers identica a quella della sequenza target di HCV ed unasequenza interna simile per lunghezza e composizione in basi alla sequenza di HCVma contenente una regione riconosciuta da una sonda specifica che permette didifferenziare lamplificato del CI da quello di HCV.

Successivamente alla fase di estrazione HCV RNA e CI sono retrotrascritti ed

amplificati in un unico passaggio di RT-PCR, utilizzando enzimi e reagentiopportunamente selezionati (enzima di amplificazione abbinato: tappo di colore viola).

Retrotrascrizione ed amplificazione

La Real Time PCR permette la rivelazione delle sequenze target durantelamplificazione stessa, utilizzando opportune sonde marcate con molecolefluorescenti.

Rivelazione

Nella mix di amplificazione ci sono due sonde specifiche, rispettivamente per ilControllo Interno e per la regione 5-UTR di HCV, marcate ciascuna con un fluoroforodonatore ed un fluoroforo accettore (secondo la chimica dual labeled probe).Il fluoroforo donatore diverso per le due sonde: FAM per HCV e JOE per il CI.

In presenza di una fonte luminosa, quando le sonde sono vicine, la fluorescenzaemessa dal fluoroforo donatore assorbita dal fluoroforo accettore. Durantelamplificazione le sonde si appaiano ciascuna al proprio target specifico esuccessivamente i fluorofori donatore ed accettore risultano essere lontani,permettendo cos che la fluorescenza del donatore possa essere rilevata alla sualunghezza donda specifica: in questo modo lamplificazione dellRNA virale e del CIpu essere monitorata nel corso della reazione.

Il Rotor Gene comprende in un singolo strumento un termociclatore per lamplificazionedel target ed un dispositivo per la rilevazione della fluorescenza durante i cicli di PCR.Un computer collegato al sistema raccoglie i dati di fluorescenza che vengono visualizzatiin un grafico mediate un apposito software.

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Figura 2: il dato grezzo riportato in un grafico come valori di fluorescenza rispetto al numero di cicli.

Dopo la raccolta dei dati viene effettuata lanalisi. Il dato grezzo normalizzato percorreggere il segnale di fondo, successivamente viene impostato il livello di soglia incorrispondenza del quale viene analizzato il segnale di fluorescenza.

Figura 3: il dato normalizzato riportato in un grafico in scala logaritmica come fluorescenza rispetto alnumero di cicli.

Il numero di cicli necessari ad un campione per raggiungere la linea di soglia chiamatoCT (ciclo soglia) ed in relazione alla quantit iniziale di RNA target: pi alto il titoloiniziale del target pi precocemente si ha linnalzamento del segnale di fluorescenza.

COMPOSIZIONE DEL PRODOTTO (Conservare a 20C)

Mix 1 5 x 125 lTris-HClKCl0,01 % gelatina

MgClPEG

2

dNTPs

Mix 2 5 x 70 lPrimersSonda per HCVSonda per IC

Transcrittasi Inversa (200 U/l) 1 x 20 lTris HCl

NaClEDTADTT

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NonidetGlicerolo

Inibitore Delle Ribonucleasi (40 U/l) 1 x 20 lHEPES-KOH

KClDTTGlicerolo

Controllo negativo 1 x 1000 lIl controllo negativo contiene siero di origine umana testato per HIV-Ab ed RNA, HCV-Abed RNA, HBS-Ag e DNA ed risultato negativo.Il controllo negativo deve essere estratto

Controllo positivo 5 x 14 lInibitore delle ribonucleasiRNA sinteticoIl controllo positivo pronto alluso per la fase di RT-PCR

Controllo interno 5 x 70 lInibitore delle ribonucleasiRNA sinteticoIl controllo interno deve essere aggiunto ad ogni campione ed al controllo negativoprima dellestrazione.

MODULARITA'

La modularit prevista di 5 sedute: 10 campioni + 1 Controllo Negativo + 1 Controllo

Positivo possono essere analizzati in ogni seduta. Se la modularit non viene rispettata ireagenti potrebbero essere insufficienti per effettuare il numero di test previsto.

STABILITA E CONSERVAZIONE

- Tutti i reagenti sono stabili sino alla data di scadenza riportata sulletichetta seconservati a -20C.

- Scongelare i reagenti in ghiaccio o a +4C.- Dopo lutilizzo, la Mix 1 e la Mix 2 sono stabili per un giorno se conservate a +4C o

sino alla data di scadenza se tenute a -20C. Questi reagenti possono esserericongelati e scongelati una volta sola.

- La Mix 2 contiene i fluorofori FAM e JOE che sono fotosensibili: evitare prolungateesposizioni alla luce.- La Master Mix deve essere utilizzata subito dopo la preparazione; dopo averla

dispensata nelle provette da PCR, la Master Mix rimanente va scartata. Evitareprolungate esposizioni alla luce.

- Ciascuna provetta di Controllo Interno sufficiente per 12 test; dopo lutilizzo, ilmateriale rimanente va scartato.

- Il Controllo Interno ed il Controllo Positivo sono templati ad RNA: si raccomanda discongelare tali reagenti appena prima delluso per garantirne lintegrit.

- Il Controllo Positivo pronto alluso per la RT-PCR: aggiungere la Master Mixdirettamente nella provetta contenente il CP scongelato, dopo aver dispensato i

campioni nelle rispettive provette onde evitare contaminazioni.

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RACCOLTA DEI CAMPIONI

LRNA virale viene isolato e purificato partendo da campioni di siero preparati entro 6 oredal momento del prelievo.- Raccogliere i campioni di sangue secondo le comuni precauzioni per i prelievi di

sangue.- Utilizzare provette sterili prive di anticoagulanti oppure provette con setto separatore

per siero. Lasciare coagulare il sangue a temperatura ambiente e centrifugare a 1000-1500 x g per 10-15 minuti per separare il siero.

- Prelevare il quantitativo di siero necessario per lestrazione dellRNA (140 l) sottocappa sterile operando in modo da evitare la degradazione dellRNA.

- Conservare i campioni a +4C fino al momento dellestrazione. Se non si procedeimmediatamente, si consiglia di porre i campioni a -20C fino a 72 ore prima dicongelarli a -80C.

- Evitare ripetuti congelamenti/scongelamenti dei campioni di siero.- I campioni vanno manipolati seguendo le buone pratiche di laboratorio e devono

essere considerati come pericolosi in quanto potenziale fonte di infezione.

PRECAUZIONI

- La procedura va eseguita utilizzando le buone pratiche di laboratorio ed i comunidispositivi di protezione individuale.

- Tutti i consumabili (puntali e provette) devono essere sterili. I puntali devono avere ilfiltro per evitare la contaminazione delle pipette. Utilizzare un nuovo puntale ogni voltache viene dispensato un volume.

- Eliminare il materiale monouso utilizzato, i guanti indossati e tutti i reattivi come rifiutispeciali.

- Il controllo negativo contiene siero di origine umana negativo per HIV-Ab ed RNA,HCV-Ab ed RNA, HBS-Ag e DNA. Tuttavia tale reagente deve essere maneggiatocome campione potenzialmente infettivo, utilizzando i dispositivi di protezioneindividuale.

- Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree preposte allesecuzionedel test.

- Se vi esposizione di occhi, cute o mucose alle sostanze utilizzate, lavareabbondantemente con acqua e contattare al pi presto un medico.

- Non utilizzare reagenti scaduti.- Non mischiare reagenti di lotti diversi.- Prestare attenzione alla modularit del dispositivo (10 campioni + 1 Controllo Negativo

+ 1 Controllo Positivo per 5 sedute). Lutilizzo del kit con una modularit inferioredetermina linsufficienza dei reagenti per poter eseguire tutti i test previsti.- Si consiglia di eseguire lanalisi in tre zone separate:

- Zona 1: pre-PCR (manipolazione dei campioni ed estrazione)- Zona 2: preparazione della Master Mix- Zona 3: post PCR (Real Time PCR)

- E opportuno assicurare una temperatura il pi possibile costante ed uniforme inlaboratorio ed evitare di posizionare gli strumenti in prossimit di fonti dicalore/raffreddamento che possano comprometterne il corretto funzionamento.

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MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI

ZONA 1

Cappa a flusso laminare verticaleSet dedicato di pipette a volume variabile

Puntali con filtro e provette sterili e monousoMicrocentrifugaZONA 2

Cappa a flusso laminare verticaleSet dedicato di pipette a volume variabilePuntali sterili con filtroProvette sterili da 0,2 ml con tappo piatto e parete sottileDNA polimerasi Hot Start (enzima abbinato: tappo di colore viola)

ZONA 3

RotorGene (Corbett Research)Rotor Gene Software

PROCEDIMENTO

ESTRAZIONE DELLRNA VIRALE

(Sistema raccomandato: Qiamp Viral RNA Mini kit Qiagen, cod. NLM AA077)

Per la preparazione, lutilizzo e lo smaltimento dei reagenti fare riferimento alle istruzioniduso specifiche del kit Qiagen.

1. Preparare il numero di provette da 1,5 ml da centrifuga necessario per i campioni ed il

controllo negativo da estrarre.2. Dispensare 560 l di Buffer AVL contenente lRNA carrier in ciascuna provetta.3. Aggiungere a ciascuna provetta 140 l del rispettivo campione e 5 l di Controllo

Interno; vortexare per circa 15 secondi.Per assicurare una lisi efficiente essenziale che il campione sia ben miscelato con ilBuffer AVLEvitare il contatto diretto tra il C.I. ed il campione di siero (lRNA del C.I. potrebbeessere degradato dagli enzimi del campione non ancora inattivati).

4. Incubare a temperatura ambiente (15-25C) per 10 minuti.10 minuti di incubazione a t.a. sono sufficienti a garantire una lisi completa delcampione; incubazioni pi lunghe non incidono sulla resa dellRNA estratto.

Gli agenti potenzialmente infettivi e le RNasi sono inattivati dal Buffer AVL.5. Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce dallinterno del tappo.

6. Aggiungere 560 l di etanolo (96-100%, non fornito) a ciascun campione, vortexare per15 sec. e centrifugare brevemente per rimuovere le gocce dallinterno del tappo.Contrassegnare le colonnine (fornite di provetta di raccolta) necessarie per il numero dicampioni lisati da processare.Usare solo etanolo perch altri tipi di alcool possono portare ad una riduzione dellaresa e della purezza dellRNA.

7. Per ogni campione dispensare 630 l della soluzione del passaggio 6 nella rispettivacolonnina senza toccarne il bordo, chiudere il tappo e centrifugare a 6000 x g per 1

minuto. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta (fornita) edeliminare quella contenente il materiale filtrato. Se la soluzione non passatacompletamente attraverso la membrana, ricentrifugare fino a completo filtraggio.

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8. Ripetere il passaggio 7.

9. Aprire con cautela le colonnine ed aggiungervi 500 l di Buffer AW1. Centrifugare a6000 x g per 1 minuto. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta(fornita) ed eliminare quella contenente il materiale filtrato.

10. Aprire con cautela le colonnine ed aggiungervi 500 l di Buffer AW2. Centrifugare a20000 x g per 3-4 minuti.

11. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta (non fornita) ed eseguireuna centrifugazione a 20000 x g per 2 minuti in modo da eliminare eventuali tracce dietanolo che possono inibire la reazione di amplificazione.

12. Porre ciascuna colonnina in una provetta da 1,5 ml da centrifuga pulita (non fornita) edeliminare quella contenente il materiale filtrato. Aprire con cautela le colonnine ed

aggiungervi 60 l di acqua sterile RNAsi-free ed incubare a temperatura ambiente per1-2 minuti. Assicurarsi che lacqua si depositi nel centro della colonnina, evitando ditoccare la membrana col puntale.

13. Centrifugare le colonnine a 6000 x g per 1 minuto.14. Eliminare le colonnine ed utilizzare lRNA eluito per i passaggi successivi.

LRNA pu essere tenuto a +4C se utilizzato immediatamente, altrimenti deve essereconservato a -20C fino a 72 ore o a -80C fino a 7 giorni.Si raccomanda di scongelare lRNA a +4C.

REAL TIME RT-PCR

Reagenti Volume per campioneMix 1 6,7 lMix 2 3,5 l

Inibitore Ribonucleasi 0,2 l

Trascrittasi inversa 0,2 lTaq 5 U/l (tappo viola) 0,4 l

- Preparare la Master Mix per il numero di campioni estratti (campioni + controllonegativo) + controllo positivo + 2 volumi (per avere una quantit di mix sufficiente pertutti i campioni da processare).

- Miscelare delicatamente e dispensare 11 l di Master Mix nelle provette da 0,2 mlprecedentemente contrassegnate.

- Aggiungere in ciascuna provetta 14 l del rispettivo RNA estratto e mescolarepipettando su e gi.

- Per ultimo scongelare il controllo positivo e aggiungervi direttamente la mix per evitare

cross contaminazioni.- Posizionare le provette nel Rotor Gene, aprire il programma e selezionare EditSamples per impostare la posizione delle provette.

- Selezionare Setting ed indicare il volume di reazione (25 l) ed il tipo di rotoreutilizzato (36 pozzetti).

- Selezionare Profile ed impostare il profilo di RT-PCR come segue:

Cycle Cycle PointHold @ 42C, 30 min 0 secsHold 2 @ 95 C, 10 min 0 secsCycling (45 repeats) Step 1 @ 95C, hold 15 secs

Step 2 @ 60C, hold 60 secs, acquiringtoCycling A(FAM/GREEN,JOE/YELLOW)

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- Selezionare View gain calibration ed impostare lautocalibrazione a 60C per icanali FAM/GREEN e JOE/YELLOW (Min reading 5 FI; Max reading 10 FI);selezionare Perform calibration before first acquisition.

- Premere Start.

ANALISI DEI DATI

Canale FAM/GREEN (HCV)- Selezionare Analysis, Quantitation, Cycling A.FAM/GREEN, Show.- Quando compare la finestra di analisi con il grafico, selezionare Dynamic Tube e

Slope Correct.- Inserire nella finestra Threshold il valore 0,01: lintersezione tra la linea di soglia e la

curva del campione rappresenta il valore di CT.- Nella finestra Results compare il valore di CT per i vari campioni: un valore di CT

presente per i campioni positivi ad HCV e per il controllo positivo; i campioni negativinon hanno CT.

Esempio:

No. Name Type Ct1 Campione 1 Unknown 26,162 Campione 2 Unknown 32,063 Campione 3 Unknown 35,064 Campione 4 Unknown 26,255 Campione 5 Unknown6 Negative Ctr CN7 Positive Ctr CP 27,15

Canale JOE/YELLOW (IC)- Selezionare Analysis, Quantitation, Cycling A.JOE/YELLOW, Show.- Quando compare la finestra di analisi con il grafico, selezionare Dynamic Tube e

Slope Correct.- Selezionare More setting e impostare come valore percentuale 10%. Se necessario

selezionare anche Ignore first 10 cycles- Inserire nella finestra Threshold il valore 0,01: lintersezione tra la linea di soglia e la

curva del campione rappresenta il valore di CT.- Nella finestra Results compare il valore di CT per i vari campioni: un valore di CT

presente per i campioni e per il controllo negativo; il controllo positivo non ha CT (acausa dellassenza del C.I.).

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Esempio:

No. Name Type Ct1 Campione 1 Unknown 28,622 Campione 2 Unknown 31,283 Campione 3 Unknown 31,24

4 Campione 4 Unknown 30,455 Campione 5 Unknown 30,366 Negative Ctr CN 30,527 Positive Ctr CP

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Considerare il CT di FAM e JOE per i controlli negativo e positivo ed interpretare ilrisultato come segue:

FAM Ct JOE Ct Interpretazione

Controllo negativo

Assente Presente Valido

Assente Assente Non valido*Presente Presente Non valido**

Controllo positivoPresente Assente Valido

Assente Assente Non valido*(*) Ipotesi di inibizione della RT-PCR o degradazione dellRNA in qualche passaggio dellaprocedura.(**) Possibile contaminazione.

Considerare il CT di JOE dei campioni ed interpretare i risultati come segue:

JOE Ct Interpretazione

CampionePresente Valido

Assente Non valido*(*) In assenza del segnale del C.I. nei campioni il risultato non pu essere confermato, quindi laseduta deve essere ripetuta. Tuttavia in presenza di HCV RNA ad alto titolo (Ct < 25) la possibileassenza di segnale del C.I. potrebbe essere dovuta alla competizione tra il target specifico di HCVed il C.I.; in questo caso il risultato positivo per HCV pu essere ritenuto valido.

Considerare il CT di FAM dei campioni validi ed interpretare il risultato come segue:

FAM Ct Interpretazione

CampionePresente HCV RNA positivoAssente HCV RNA < 390 UI/ml

AVVERTENZE- In caso di assenza del segnale atteso di JOE consigliabile ripetere la seduta.- Il controllo positivo non ha il C.I., quindi non ci si deve attendere il segnale di JOE.

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- In caso di contaminazione importante risalire allorigine (fase di estrazione e/o RT-PCR). Lutilizzo dei controlli forniti pu essere daiuto per assicurare le corretteprestazioni del test e per lidentificazione dellorigine di tale problema.

CARATTERISTICHE PRESTAZIONALISpecificit

La specificit del kit HCV RNA QUALITATIVO REAL TIME stata determinata utilizzando526 campioni di siero negativo per HCV provenienti da donatori di sangue. Non sono statiottenuti risultati falsi positivi. In accordo con tali dati la specificit del kit pari al 100%.

Sensibilit analitica

La sensibilit stata determinata analizzando sei diluizioni scalari di un campione HCVpositivo (genotipo 1b) calibrato con il Secondo Standard Internazionale HCV WHO (NIBSCcodice 96/798). Per le diluizioni stato utilizzato un siero negativo per HCV RNA edanticorpi anti-HCV.Lanalisi stata condotta in accordo col manuale duso, estrazione compresa. Comeindicato nella tabella sottostante, il limite di sensibilit del test HCV RNA QUALITATIVOREAL TIME di 390 UI/ml.

Diluizioni Numero di

repliche

Numero di

positivi

% Positivi

750 IU/ml 36 36 100 %

500 IU/ml 36 35 97,22 %

350 IU/ml 36 35 97,22 %

250 IU/ml 36 25 69,44 %

200 IU/ml 36 22 61,11%

150 IU/ml 25 11 44 %Probit 95 %* 391,54 IU/ml

*Lanalisi Probit stata eseguita con il programma SPSS for Windows Release 7.0

Sensibilit diagnostica

Per valutare la sensibilit diagnostica sono stati utilizzati 10 pannelli di seroconversione perHCV, testati con Roche Cobas TaqMan HCV Test come sistema di riferimento.Tutti i campioni sono risultati conformi allatteso.

Genotipi HCV

Il limite di sensibilit per i genotipi HCV stato determinato analizzando 66 campioni disiero positivi per HCV RNA con differente genotipo e carica virale (compresa nel range di

sensibilit del dispositivo).Lanalisi stata condotta in accordo col manuale duso, estrazione compresa.

Genotipo*N di

campioniRange di carica virale

(IU/ml)1a 6 2x10 - 1x101b 10 6,5x10 - >102a 9 1,2x10 1,2x102b 6 7x10 3,1x10

2a/2c 10 8x10 2,2x103a 12 5x10 - 4x10

4c/4d 10 1,2x10 - >10

5a 3 10*Il genotipo stato determinato mediante il dispositivo VERSANT HCV Genotype Assay (Bayer)

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Tutti i campioni testati hanno dato esito positivo, come atteso. Pertanto lefficienza dirilevazione di HCV RNA indipendente dal genotipo del campione.

Marcatori potenzialmente cross reattivi

Per valutare la potenziale cross reattivit del test HCV RNA QUALITATIVO REAL TIMEcon altri patogeni sono stati analizzati i seguenti campioni (provenienti da pazienti infetti):

Altri patogeni N di campioni analizzatiHGV 15

HCMV 1HIV 3HBV 5HTLV 2HPV 3

Herpes simplex Virus 3Chlamydia trachomatis 3

Tutti i campioni non-HCV testati hanno dato un risultato negativo. Il test HCV RNAQUALITATIVO REAL TIME non ha evidenziato una cross reattivit con altri patogeni.

Sostanze potenzialmente interferenti

Dati non disponibili

Tasso globale di errore del sistema che porta a risultati falso-negativi

Per valutare la possibilit della presenza di falsi negativi 105 campioni di siero positivo perHCV sono stati analizzati (3 x 95% valore di soglia positivo = 1,20E+03 UI/ml); in ogniseduta stato analizzato anche un campione negativo.Il siero di partenza stato ottenuto diluendo in siero umano negativo un campione altopositivo calibrato con il Secondo Standard Internazionale HCV WHO (NIBSC codice

96/798).Tutti i campioni positivi per HCV testati hanno dato un risultato positivo, quindi il dispositivoHCV RNA QUALITATIVO REAL TIME non ha riportato falsi negativi.

Confronto con il sistema COBAS AMPLICOR HCV-ROCHE

Le prestazioni del dispositivo HCV RNA QUALITATIVO REAL TIME sono stateconfrontate con quelle del sistema Cobas Amplicor (Roche) mediante lanalisi di 48campioni positivi e 4 negativi per HCV RNA.I campioni positivi sono risultati tutti positivi, i campioni negativi hanno dato esito negativo.La tabella seguente riporta la carica virale ed il genotipo dei campioni positivi per HCVanalizzati:

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CampioneCarica virale

(IU/ml)Genotipo Campione

Carica virale(IU/ml)

Genotipo

1 4,4E+05 1b 25 4,2E+06 1a2 1,5E+05 1b 26 3,4E+06 1b

3 6,5E+05 4c/4d 27 2,8E+06 2a4 9,3E+04 1b 28 1,7E+05 1b5 4,4E+05 1b 29 7,0E+04 1b6 1,9E+06 3a 30 5,4E+04 2a/2c7 4,4E+02 1b 31 3,9E+04 1b8 3,1E+06 1b 32 2,6E+04 1b9 6,5E+02 4c/4d 33 7,3E+03 3a10 2,3E+06 1b 34 7,0E+03 1b11 1,2E+06 1b 35 5,9E+02 1b12 4,1E+03 1b 36 5,2E+02 3a13 8,4E+02 1b 37 7,0E+02 1b14 3,3E+03 4c/4d 38 7,0E+02 1b

15 9,6E+05 1b 39 6,1E+02 1b16 4,3E+02 4c/4d 40 7,0E+02 1b17 2,3E+04 1b 41 5,5E+02 1b18 2,3E+03 1b 42 5,6E+02 2a/2c19 5,4E+02 2a/2c 43 4,1E+04 1b20 7,3E+02 3a 44 2,5E+06 4c/4d21 6,4E+02 1b 45 4,2E+02 1b22 6,4E+02 1b 46 4,1E+03 1b23 4,6E+02 1b 47 8,4E+02 1b24 7,3E+04 3a 48 3,3E+06 1b

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MOLECULAR BIOLOGY

EXTRACTION: AA077/C NOT INCLUDED

HCV RNA REAL TI ME

QUALI TATI VE

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l.HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, 3 20090 SETTALA MI (Italy)Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37WEB: www.nlm.it E-MAIL: [email protected]

NLM 6188 VER 07/09/11

AA896 50 TEST

MQE013-3

0459

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INTENDED USE

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST provides reagents for the qualitative detectionof C hepatitis virus (HCV) RNA in human serum samples by Real Time RT-PCR of the 5-untranslated region (5-UTR).An Internal Control is provided to monitor all the procedure.This device must be used in association with RNA extraction kit NLM code AA077/CQiamp Viral RNA Mini Kit (to be ordered separately).Viral RNA is retrotranscribed and amplified in one step RT-PCR of about 140 minutes,using Rotor Gene (Corbett Research).

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST is intended for use in conjunction with clinicalpresentation and other laboratory markers (HCV-Ab, ALT, etc) for the diagnosis of HCVinfection in patients.The device is not intended for use as a screening test for the presence of HCV RNA inblood donors.

INTRODUCTION

Hepatitis C virus is the main etiologic agent of acute viral hepatitis that can lead, in mostpatients, to liver cirrhosis and then to hepatocellular carcinoma1. HCV can also causeextrahepatic diseases2-4

HCV genome is a linear single strand RNA with one ORF (Open Reading Frame); in 5position there is an untranslated highly conserved region (5-UTR) that represents thetarget for viral molecular biology detection. The 5-UTR genetic eterogeneity amongdifferent HCV strains determines the classification into different genotypes

.

5

HCV has a parenteral transmission through exposure to infected blood. This exposure canoccur in the context of blood transfusion before 1992, injection drug use, solid organtransplantation from infected donors, birth to an infected mother, occupational exposure toinfected blood, high-risk sexual practice

.

6

After initial exposure, HCV RNA can be detected in patients blood within one to threeweeks; acute infection can be severe but rarely is fulminant

.

6

Although generally asymptomatic, about 85% of the acute infections become chronic:persistence of HCV infection is diagnosed by the detection of HCV RNA in the blood for atleast six months

.

6

REFERENCES

.

1. Sarrazin C. Diagnosis of hepatitis C: update 2004. Journal of Gastroenterology and Hepatology (2004)

19, S88-S932. Johnson RJ, Gretch DR, Yamabe H et al. Membranoproliferative glomerulonephritis associated withhepatitis C virus infection. N Engl J med 1993; 328: 465-470.

3. Agnello V, Chung RT, Kaplan RM. A role for hepatitis C virus infection in Type II cryoglobulinemia. NEngl J Med1992; 327: 1490-1495.

4. Andreone P, Zignego AL, Cursaro C et al. Prevalence of monoclonal gammopathies with hepatitis Cvirus infection. Ann Intern Med1998; 129: 294-298

5. Zein NN. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2000,p. 223-235.

6. National Institutes of Health, Consensus Conference Statement. Management of hepatitis C: 2002.

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PRINCIPLES OF THE PROCEDURE

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST is based on two processes:1. Viral RNA extraction2. Reverse transcription, amplification and detection of target sequence using Real Time

RT-PCR

REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST provides an Internal Control that must beadded to each sample in the extraction phase in order to monitor all the procedure.

1. Viral RNA extractionHCV and IC RNA extraction from human serum samples must be done using QiampViral RNA Mini Kit (Qiagen) as described in the Instructions for use.

2. RT-PCR and Detection

The HCV RNA 5-UTR region has been chosen as target to detect the HCV presencein human serum samples because it is highly conserved among HCV genotypes.

Amplification target

The internal control is a synthetic RNA transcript with primer binding regions identicalto those of HCV target sequence, an internal sequence of similar length and basecomposition as the HCV target sequence and a unique probe binding region thatdifferentiates the IC amplicon from the target amplicon.

Following extraction step, RNA is retrotranscribed and amplified in one-step RT-PCR,using appropriate enzymes and buffer conditions (amplification enzyme assigned:violet cap).

Reverse transcription and Amplification

Real Time PCR allows target sequences detection during amplification itself, usingsuitable probes labeled with fluorescent dyes. In the amplification mix there are twospecific probes, respectively for the Internal Control and for HCV 5-UTR region,labeled with a reporter dye and a quencher dye (dual labeled probe chemistry). Thefluorescent reporter dye is different for the two probes: FAM for HCV and JOE for IC. Inpresence of a light source, when the probes are close to each other, the fluorescenceemitted by the reporter dye is absorbed by the proximal quencher. During theamplification each probe matches to its specific target, then the reporter and thequencher dyes appear to be distant. When they are separated the fluorescence of the

reporter can be detected at its specific wavelength: in this way the amplification of viralRNA and IC can be monitored as the reaction proceeds.

Detection

Rotor Gene comprises in a single instrument a thermal cycler for target amplification and afluorometer for the detection of fluorescence during the cycling process.A computer connected with the Real Time machine collects fluorescent data that isdisplayed in a graph through a specific software.

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Figure 2: raw data is plotted on a graph of fluorescence versus cycle number

Following raw data collection, analysis is carried out. Raw data is normalized to correct thebackground signal, then a threshold level can be set: this is the level at which fluorescencedata is analyzed.

Figure 3: the normalized data is plotted on a log scale graph of fluorescence versus cycle number

The number of cycles it takes for a sample to reach the threshold level is named CT-value(threshold cycle) and it is related to the initial amount of target RNA: the higher target titerthe earlier the fluorescent signal comes out.

REAGENTS COMPOSITION (Store at 20C)

Mix 1 5 x 125 lTris-HClKCl

0,01 % gelatinMgClPEG

2

dNTPs

Mix 2 5 x 70 lPrimersHCV probeIC probe

Reverse transcriptase (200 U/l) 1 x 20 lTris HClNaClEDTA

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DDTNonidetGlycerol

Ribonuclease Inhibitor (40 U/l) 1 x 20 lHEPES-KOHKClDDTGlycerol

Negative Control 1 x 1000 lNegative Control is human serum non reactive for HIV-Ab and RNA, HCV-Ab and RNA,HBS-Ag and DNA.Negative Control must be extracted.

Positive Control 5 x 14 lRibonuclease InhibitorSynthetic RNAPositive Control is ready-to-use for RT-PCR step.

Internal Control 5 x 70 lRibonuclease InhibitorSynthetic RNAInternal control must be added to each sample and to the negative control beforeextraction step.

MODULARITY

Reagents are provided for five distinct runs; 10 samples + 1 Negative Control + 1 PositiveControl can be analysed in each run. If modularity isnt respected reagents could not beenough for the number of tests declared.

STABILITY AND STORAGE

- All the reagents are stable up to the expiry date indicated on the label when storedat -20C.

- Thaw all the reagents on ice or at +4C.- Once used, Mix 1 and Mix 2 are stable for up to one day if stored at +4C or until

expiration date if stored at -20C. These reagents can be refrozen and thawed only

once.- Mix 2 contains FAM and JOE fluorophores that are photosensitive: avoid prolongedexposure to light.

- Master Mix must be used immediately after preparation; once dispensed in PCRtubes, the remaining reagent must be discarded. Avoid prolonged exposure to light.

- Each IC tube contains reagent for 12 tests; once used, the remaining IC must bediscarded.

- Internal and Positive Controls are RNA templates: it is recommended to thaw themjust before use in order to preserve their integrity.

- Positive Control is RT-PCR ready-to-use: add Master Mix directly to thawed PC tube,after samples RNA dispensing in PCR tubes to avoid cross contamination.

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SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING

Viral RNA is isolated and purified from human serum specimens prepared within 6 hoursfrom blood collection.- Collect blood observing universal precautions for venipuncture- Collect blood in sterile tubes with no anticoagulants or in serum separator tubes. Allow

blood to clot at room temperature and centrifuge (1000-1500g) within 10-15 minutes toseparate serum.

- Aliquot 140 l of serum for RNA extraction using vertical down-flow airbox andoperating to avoid RNA degradation.

- Store samples at 4C until extraction step. If they are not processed immediately storethem in sterile tubes at -20C for up to 72 hours prior to freezing at -80C.

- Avoid repeated freeze-thaw cycles of serum samples- Perform the procedure using universal precautions and handle samples as if capable of

transmitting infection.

PRECAUTIONS- Handle this product according to established good laboratory practices and universal

precautions; wear personal protective apparel, including disposable gloves, throughoutthe assay procedure. Dispose gloves as biohazardous waste.

- All disposable items (tips and tubes) must be sterile. Use aerosol-resistant pipette tipsto avoid pipettes contamination. Use a new tip every time a volume is dispensed.

- Discard all used material as bio hazardous waste.- The negative control is a human serum sample non reactive for HIV-Ab and RNA,

HCV-Ab and RNA, HBV HbsAg and DNA. However it should be handled as potentiallyinfectious and should be treated with the necessary safety precautions.

- Do no eat, drink, smoke or apply cosmetics in areas where reagents or specimens arehandled.

- In case of contact with reagents rinse immediately with water and seek medical advice.- Do not use device after its expiration date.- Do not mix reagents from different lots.- Pay attention to device modularity (10 samples + 1 Negative Control + 1 Positive

Control for 5 runs): if the modularity is not respected the reagents could be insufficientfor all the 50 tests.

- Its recommended to perform the assay in three different areas:- Area 1: pre-PCR (samples handling and extraction)- Area 2: RT-PCR Mix preparation.

- Area 3: post-PCR (Real Time PCR)- It is advisable to have constant and uniform laboratory temperature, avoid toplace the instruments near heating/cooling sources that may compromise theright working.

MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED

AREA 1Vertical downflow airboxPrecision pipettes setSterile aerosol barrier tips and tubes

Microcentrifuge

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AREA 2Vertical downflow airboxPrecision pipettes setSterile aerosol barrier tips0,2 ml flat-cap thin-wall sterile PCR tubes

DNA polymerase Hot Start (enzyme assigned: violet cap)

AREA 3RotorGene (Corbett Research)Rotor Gene Software

ASSAY PROCEDURE

VIRAL RNA EXTRACTION

(Recommended Extraction method: NLM cod. AA077 Qiamp Viral RNA Mini kit,Qiagen)

Refer to Qiagen instructions for use for preparation, handling and disposal of reagents.

1. Prepare the necessary amount of 1,5 ml microcentrifuge tubes (samples and negativecontrol).

2. Pipet 560 l of AVL Buffer containing RNA Carrier into each 1,5 ml microcentrifugetube.

3. Add 140 l of sample and 5 l of Internal Control to the AVL Buffer / RNA Carrier andmix by pulse-vortexing for 15 seconds.To ensure efficient lysis, it is essential that the sample is mixed thoroughly with BufferAVL.Avoid the direct contact between serum and IC (IC RNA could be degraded by samplesenzymes not yet inactivated)

4. Incubate at room temperature (15-25C) for 10 minutes.Viral particles lysis is complete after 10 min incubation at room temperature. Prolongedtimes have no effect on yield or quality of the purified RNA.Potentially infectious agents and RNases are inactivated by AVL buffer.

5. Briefly centrifuge tubes to remove drops from the inside of the lid.6. Add 560 l of ethanol (96-100%, not provided) and mix again by pulse-vortexing for 15

sec. After mixing, briefly centrifuge tubes to remove drops from the inside of the lid.Prepare enough columns (with 2 ml collection tube provided) to process all lysedsamples. Only ethanol should be used since other alcohols may reduce RNA yield

and purity.7. Carefully apply 630 l of the solution from step 6 to each spin column without wettingthe rim, close the cap and centrifuge at 6000 x g for 1 min. Place the spin column in aclean 2 ml collection tube (provided) and discard the tube containing the filtrate. If thesolution has not completely passed through the membrane, centrifuge again until all ofthe solution has passed through.

8. Repeat step 79. Carefully open the spin column and add 500 l of AW1 Buffer. Close the cap and

centrifuge at 6000 x g for 1 min. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube(provided) and discard the collection tube containing the filtrate.

10. Carefully open the spin column and add 500 l of AW2 Buffer. Close the cap and

centrifuge at full speed (20000 x g ) for 3-4 min.

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11. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube (not provided) and discard thecollection tube with the filtrate. Centrifuge at full speed for 2 min to eliminate residualethanol that may inhibit amplification reaction.

12. Place the spin column in a clean 1,5 ml microcentrifuge tube (not provided). Discardthe collection tube containing the filtrate. Carefully open the spin column and add 60 l

of sterile RNase-free water. Incubate at room temperature for 1-2 min. Be sure thatsterile RNase-free water is deposited in the centre of the column membrane.

13. Centrifuge at 6000 x g for 1 min.14. Discard the column and use RNA eluted to further steps.

RNA can be stored at +4C if immediately used, otherwise must be frozen at -20C for upto 72 hours or at -80C for up to 7 days.It is recommended to thaw RNA at +4C.

REAL TIME RT-PCR

Reagents Volume per sampleMix 1 6,7 lMix 2 3,5 l

Ribonuclease Inhibitor 0,2 lReverse Transcriptase 0,2 l

Taq 5 U/l (violet cap) 0,4 l

- Prepare Master Mix for the number of RNA extracted (samples and negative control) +positive control +2 volumes (to have enough Master Mix for all the samples).

- Mix gently and dispense 11 l in the flat cap test tubes previously marked.

- Add 14 l of extracted RNA to each tube and mix pipetting up and down.- At last thaw the positive control and add directly the mix to avoid cross contaminations.- Place test tubes in the RotorGene rotor, click on Edit Samples window and set up

tube position.- Click on Setting window and indicate the PCR reaction volume (25 l) and the rotor

used (36 wells).- Click on Profile window and set up the RT-PCR profile as follows:

Cycle Cycle PointHold @ 42C, 30 min 0 secsHold 2 @ 95C, 10 min 0 secs

Cycling (45 repeats) Step 1 @ 95C, hold 15 secsStep 2 @ 60C, hold 60 secs, acquiringtoCycling A(FAM/GREEN,JOE/YELLOW)

- Click on View gain calibration and set up autocalibration at 60C for FAM/GREENand JOE/YELLOW channels (Min reading 5 FI; Max reading 10 FI); select Performcalibration before first acquisition.

- Click on Start.

RAW DATA ANALYSIS

FAM/GREEN Channel (HCV)- Click on Analysis window and select Quantitation, Cycling A.FAM/GREEN,

Show.

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- When the analysis graph appears select Dynamic Tube and Slope Correct.- Put in the Threshold window 0,01 value: the intersection between threshold line and

the samples curves is the CT-value.- In the Results window results obtained from the experiment are shown: a CT-value is

present for the HCV positive samples and the positive control; negative samples have

no CT.

Example:

No. Name Type Ct1 Sample 1 Unknown 26,162 Sample 2 Unknown 32,063 Sample 3 Unknown 35,064 Sample 4 Unknown 26,255 Sample 5 Unknown6 Negative Ctr CN7 Positive Ctr CP 27,15

JOE/YELLOW Channel (IC)- Click on Analysis window and select Quantitation, Cycling A.JOE/YELLOW,

Show.- When the analysis graph appears select Dynamic Tube and Slope Correct.- Select More setting and choose 10%. If necessary, select also Ignore first 10 cycles- Put in the Threshold window 0,01 value: the intersection between threshold line and

the samples curves is the CT-value.- In the Results window results obtained from the experiment are shown: a CT-value is

present for the samples and the negative control, the positive control have no CT(because of the absence of IC).

Example:

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No. Name Type Ct1 Sample 1 Unknown 28,622 Sample 2 Unknown 31,283 Sample 3 Unknown 31,244 Sample 4 Unknown 30,455 Sample 5 Unknown 30,36

6 Negative Ctr CN 30,527 Positive Ctr CP

RESULT INTERPRETATION

Check FAM and JOE Ct for negative and positive controls and interpret results asfollows:

FAM Ct JOE Ct Interpretation

NegativeControl

Absent Present Valid

Absent Absent Invalid*Present Present Invalid**

Positive

Control

Present Absent Valid

Absent Absent Invalid*(*) Hypothesis of RT-PCR inhibition or RNA degradation in one of the procedure steps(**) Possible contamination

Check samples JOE Ct and interpret results as follows:

JOE Ct Interpretation

SamplePresent ValidAbsent Invalid*

(*) In absence of IC signal sample result cant be confirmed, therefore sample run should berepeated. Nevertheless in presence of HCV RNA high titer (Ct < 25) the possible absence of ICsignal could be due to the competition between HCV specific target and Internal Control target; in

this case sample positive result can be considered as valid.

Check FAM Ct for valid samples and interpret results as follows:

FAM Ct Interpretation

SamplePresent HCV RNA positiveAbsent HCV RNA < 390 IU/ml

WARNING- In case of absence of expected JOE signal it is advisable to repeat the assay.- Positive Control hasnt Internal Control, therefore JOE signal is not expected.

- When contamination events occur its important to find out the source (extractionand/or RT-PCR steps). Controls provided can be very useful to ensure the correct testperformance and to find out contamination origin.

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PERFORMANCE CHARACTERISTICSSpecificity

The specificity of REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST was determined byanalysing 526 HCV negative serum samples from blood donors. No false positive results

were obtained.According to the results the specificity of the assay is 100%.

Analytical sensitivity

Sensitivity was determined by analysing six dilution levels of an HCV positive clinicalspecimen (genotype 1b) calibrated with the HCV WHO Second International Standard(NIBSC code 96/798).For the dilutions a serum negative for HCV RNA and antibodies was used. The analysiswas performed according to instructions for use, RNA extraction included. As shown intable below, the detection limit of REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TEST is 390IU/ml.

Diluitions Number ofreplicates Number ofpositives % PositivesRate750 IU/ml 36 36 100 %500 IU/ml 36 35 97,22 %350 IU/ml 36 35 97,22 %250 IU/ml 36 25 69,44 %200 IU/ml 36 22 61,11 %150 IU/ml 25 11 44 %

Probit 95 %* 391,54 IU/ml*Probit Analysis done with SPSS for Windows Release 7.0

Diagnostic sensitivity

Diagnostic sensitivity was evaluated by analising 10 HCV seroconversion panels, testedwith Roche Cobas TaqMan HCV Test as reference system.All the samples gave a result as expected.

HCV Genotypes detection efficiency

The HCV Genotypes detection efficiency was determined by analysing 66 HCV RNApositive serum samples of different genotypes and viral load (in the range of devicedetection).Tests were done according to instructions for use.

Genotype*Nr of

samples

Range of viral load

(IU/ml)1a 6 2x10 - 1x101b 10 6,5x102 - >1062a 9 1,2x104 1,2x1062b 6 7x103 3,1x105

2a/2c 10 8x103 2,2x1063a 12 5x102 - 4x106

4c/4d 10 1,2x103 - >1065a 3 106

* Samples genotype was determined using VERSANT HCV Genotype Assay (Bayer)

All the tested samples gave a positive result, as expected. Therefore detection efficiency is

independent of HCV genotype.

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Potential cross reactive markers

To evaluate the potential cross reactivity of REAL TIME HCV RNA QUALITATIVE TESTwith other pathogens the following samples (from infected patients) were analysed:

Other pathogens Nr of samples testedHGV 15

HCMV 1HIV 3HBV 5

HTLV 2HPV 3Herpes simplex Virus 3

Chlamydia trachomatis 3

All the Non-HCV samples tested gave a negative result. Therefore REAL TIME HCV RNAQUALITATIVE TEST showed no cross reaction with other pathogens.

Potentially interfering substances

Data not available.

Whole system failure rate leading to false-negative resultsTo evaluate the whole system failure rate leading to false negative results 105 HCVpositive serum samples were analysed (3 x 95% positive cut-off concentration = 1,10E+03IU/ml); in each run one negative control was added.The starting serum was obtained diluting in human negative serum a high positive clinicalspecimen calibrated with the HCV WHO Second International Standard (NIBSC code96/798).All the HCV positive samples tested gave a positive result, therefore REAL TIME HCVRNA QUALITATIVE TEST doesnt lead to false-negative results.

Comparsion with COBAS AMPLICOR HCV-ROCHE

The performance of the REAL TIME HCV QUALITATIVE TEST was compared to COBASAMPLICOR TEST (ROCHE) by analysing 48 HCV positive and 4 negative clinicalsamples.All the positive samples gave a positive result and the four negative were found negative.

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The following table summarizes viral load and genotype of the positive samples used inthis evaluation:

SampleViral Load

(IU/ml)Genotype Sample

Viral Load(IU/ml)

Genotype

1 4,4E+05 1b 25 4,2E+06 1a2 1,5E+05 1b 26 3,4E+06 1b3 6,5E+05 4c/4d 27 2,8E+06 2a4 9,3E+04 1b 28 1,7E+05 1b5 4,4E+05 1b 29 7,0E+04 1b6 1,9E+06 3a 30 5,4E+04 2a/2c

7 4,4E+02 1b 31 3,9E+04 1b8 3,1E+06 1b 32 2,6E+04 1b9 6,5E+02 4c/4d 33 7,3E+03 3a10 2,3E+06 1b 34 7,0E+03 1b11 1,2E+06 1b 35 5,9E+02 1b12 4,1E+03 1b 36 5,2E+02 3a13 8,4E+02 1b 37 7,0E+02 1b14 3,3E+03 4c/4d 38 7,0E+02 1b15 9,6E+05 1b 39 6,1E+02 1b16 4,3E+02 4c/4d 40 7,0E+02 1b17 2,3E+04 1b 41 5,5E+02 1b18 2,3E+03 1b 42 5,6E+02 2a/2c

19 5,4E+02 2a/2c 43 4,1E+04 1b20 7,3E+02 3a 44 2,5E+06 4c/4d21 6,4E+02 1b 45 4,2E+02 1b22 6,4E+02 1b 46 4,1E+03 1b23 4,6E+02 1b 47 8,4E+02 1b24 7,3E+04 3a 48 3,3E+06 1b

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EuropeanConformity

In vitrodiagnostic

device

InternalControl

ICINTERNAL

CONTROL

Use by

Positivecontrol

Site ofmanufacturin

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number

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