A2 -Técnicas histologicas e HQVal.ppt
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Instituto de Ciências BiológicasDepartamento de Morfologia
Citologia e Histologia Geral
Profa Valéria Ruiz de Souza
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Técnicas Histológicas
O termo “Técnicas Histológicas” refere-se ao
conjunto de metodologias empregadas para a
obtenção de material biológico
para estudo ao microscópio.
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Seqüência de etapas
Preparação do material para estudo aos microscópios de luz e eletrônicos
8. Coloração
9. Montagem
Remoção do órgão ou parte dele
Fragmentação do órgão em porções menores
Fixação
Desidratação
Inclusãoa. Em parafina para a MLb. Em plástico para a ME
Microtomiaa. Com navalha de aço para a MLb. Com navalha de vidro ou diamante para a ME
Colocação do cortea. Sobre lâminas de vidro para a MLb. Sobre grades e redes metálicas para a ME
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Coleta de Material
Consiste na obtenção do fragmento de órgão a ser estudado
O órgão é retirado do animal anestesiado e recortado em fatias
de no máximo 3 mm de espessura.
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• Deixar o fragmento coletado no líquido fixador, por tempo determinado, de acordo com a solução utilizada.
• Os líquidos fixadores variam desde uma substância química isolada, como o álcool, o formol, até as misturas fixadoras, como o Bouin.
Fixação
Processo que se destina a “matar” as células, procurando manter sua estrutura preservada, o mais próximo possível do que seria no animal vivo.
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• Desidratação - O material é imerso em vários banhos de álcool, em ordem crescente de concentração, até o álcool absoluto.
• Diafanização – O material é imerso em xilol, para clareamento.
• Imersão em parafina – O material é mantido em parafina líquida, a 58 graus (em estufa), por tempo determinado.
InclusãoA inclusão consiste em colocar o corte em fôrma, cobrindo-o com parafina líquida, que se fundirá à temperatura ambiente. Antes de incluir é necessário desidratar a peça, diafanizá-la e mergulhá-la em parafina líquida.
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Seqüência de etapas
Preparação do material para estudo aos microscópios de luz e eletrônicos
8. Coloração
9. Montagem
Remoção do órgão ou parte dele
Fragmentação do órgão em porções menores
Fixação
Desidratação
Inclusãoa. Em parafina para a MLb. Em plástico para a ME
Microtomiaa. Com navalha de aço para a MLb. Com navalha de vidro ou diamante para a ME
Colocação do cortea. Sobre lâminas de vidro para a MLb. Sobre grades e redes metálicas para a ME
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O bloco de parafina contendo o fragmento é colocado no suporte do micrótomo; após regular a espessura dos cortes em micrômetros, são retiradas fitas de parafina contendo o material.
Microtomia
Consiste na obtenção de cortes finos, que serão corados para observação
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Planos de observação das células(Dependentes do corte)
(Cedido pela Profa. Gleydes G. Parreira)
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Desenho esquemático da organização microscópica do fígado.
Corte histológico do fígado, observado ao microscópio de luz.
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.... são retiradas fitas de parafina contendo o material.
Microtomia
Consiste na obtenção de cortes finos, que serão corados para observação
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A colocação da fita de parafina em “banho-maria” a 40oC distende os cortes, que são recolhidos em lâminas de vidro.
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Coloração
É necessário corar para que células e tecidos possam ser identificados. Antes de corar é necessário desparafinizar e hidratar o corte.
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Consiste em mergulhar a lâmina contendo o corte no(s) corante(s), de acordo com o que se deseja corar;
Na montagem, uma gota de resina é colocada sobre a lamínula e esta é pressionada sobre a lâmina, protegendo o corte histológico.
Coloração e Montagem
Corantes
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Microscopia
Observação de células e tecidos ao microscópio
A lâmina deve ser colocada na platina do microscópio, com a lamínula voltada para a objetiva.
O foco deve ser ajustado para cada lente objetiva, utilizando-se os parafusos macro ou micrométrico.
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MICROSCOPIA ÓPTICA
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Ampliação total = aumento da objetiva + aumento da ocular
Resolução: separação de detalhes
Limite de resolução: menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados
Limite de resolução do microscópio óptico: 0,2µm
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MÉTODOS HISTOQUÍMICOS PARA EVISENCIAR SUBSTÂNCIAS PRESENTES NAS CÉLULAS
COLORAÇÕES DE ROTINA: HE,Tricrômico de Gômori
COLORAÇÕES ESPECÍFICAS:Intensidade de cor proporcional à concentração
DNA: feulgenPolissacarídeos (glicogênio): PASRNA: ribonucleaseCatecolaminas: formaldeído (fluorescente)Proteínas: milton (tirosina) diaminoazobenzeno (triptofano)
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TÉCNICAS HISTOLÓGICAS (rotina)
CORANTES BÁSICOS: azul de toluidina, hematoxilina
CORANTES ÁCIDOS: eosina, orange G, fucsina ácida
Outros corantes: impregnação pela prata e ouro
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100m100m
EEP P
EE
EE
CI
CI
C
Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: hematoxilina e eosina
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100m
E
EE
P
P
P
PP
Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: tricrômico de gômori
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P
P
E
CC
100m
C
V
Tecidos epitelial e conjuntivoCorante: periodic acid shiff (PAS)
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TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS
CONCEITO: substância, radical, grupamentos químicos
PRINCÍPIOS:compostos não difusíveis – bom fixadorprodutos insolúveis – não se difundem nos reagentesEspecificidade e sensibilidade
CROMÓFORO E FLUORÓFOROFixação insolúvel corada ou fluorescente(histoquímica)
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SUBSTÂNCIAS IDENTIFICÁVEIS:
a)ìons: Fe+3 – ioniza Fe preso à proteínas
ferrocianeto de K + Fe+
fosfato – nitrato de prata
b) lípides: sudam IV – vermelho sudam negro
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SUBSTÂNCIAS IDENTIFICÁVEIS:
c) Carboidratos
•Radical vic-glicol – •glicogênio, glicoproteína neutra, sialomucina
•Radical carboxila – •glicosaminoglicana(GAG) ácido carboxilada, sialomucina
•Radical sulfato – •GAG ácido sulfatada
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SUBSTÂNCIAS IDENTIFICÁVEIS:
d) Ácidos nucléicos: DNA, Feulgen, RNA
e) Proteínas: aa, imunocitoquímica, ag/ac fluorescente
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EXEMPLOS1.PAS (periodic acid shiff)
*obtenção do reativo de shiff (fucsina básica + ác. Sulfuroso = shiff)
*Oxidação do vic-glicol carb. com vic-glicol + ácido periódico aldeído
*Reversão da cor do shiff – shiff + aldeído = PAS +
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Problema: e os outros carboidratos?
Teste: amilase salivar – enzima gliconeolítica PAS-
(?) PAS + : Alcian Blue AB + = sialomucina, também PAS +AB- = glicoproteína neutra, somente PAS+
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Microscopia de fluorescência
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ANTIGEN
epitope
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100m100mHematoxilina e eosina
P
PVV
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100m100m
Imunolocalização de colágeno VIMicroscopia de fluorescência
VV
P
PEE
EE
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Microscopia Eletrônica
Microscópio Eletrônico de Transmissão
Microscópio Eletrônico de Varredura
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
Alta resolução!
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Seqüência de etapas
Preparação do material para estudo aos microscópios de luz e eletrônicos
8. Coloração
9. Montagem
Remoção do órgão ou parte dele
Fragmentação do órgão em porções menores
Fixação
Desidratação
Inclusãoa. Em parafina para a MLb. Em plástico para a ME
Microtomiaa. Com navalha de aço para a MLb. Com navalha de vidro ou diamante para a ME
Colocação do cortea. Sobre lâminas de vidro para a MLb. Sobre grades e redes metálicas para a ME
![Page 42: A2 -Técnicas histologicas e HQVal.ppt](https://reader031.fdocuments.net/reader031/viewer/2022013121/5499048eac7959482e8b5748/html5/thumbnails/42.jpg)
Preparação de material para observação ao ME
Glutaraldeído e Tetróxido de ósmio
Fixação
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Inclusão
A inclusão de material biológico para observação ao ME é feita em resinas como epon, araldite.
![Page 44: A2 -Técnicas histologicas e HQVal.ppt](https://reader031.fdocuments.net/reader031/viewer/2022013121/5499048eac7959482e8b5748/html5/thumbnails/44.jpg)
Ultra-microtomia
O micrótomo deve ser regulado para obtenção de cortes semi-finos e finos.
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Cortes semi-finos
Telinhas contendo os cortes finos
Coloração/Contrastação
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Aquecimento de um cátodo
Liberação de elétrons
Focalização dos elétrons
Reflexão dos elétrons pelo objeto
IMAGEM
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Imagem observada
Micrografia eletrônica de núcleo celular
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NN
C
CC
1m
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C
N
LC
2m
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MET
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MEV
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
Análise em 3D
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Aquecimento de um cátodo
Liberação de elétrons
Focalização dos elétrons
Bobina de varredura
Desvio dos elétrons
IMAGEM
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MEV