A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT...
Transcript of A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT...
KUN JÓZSEF
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar
Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet
Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Neurofarmakológia Program
Doktori Iskola és Programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika
Témavezető: Prof. Dr. Helyes Zsuzsanna
2014
A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT
SZENZOROS NEUROPEPTIDEK EXPRESSZIÓJA ÉS SZEREPE BŐR ÉS BÉL GYULLADÁSOS FOLYAMATAIBAN
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
1
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ..................................................................................................................... 4
Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai .................................................. 6
I. Általános bevezetés .............................................................................................................. 7
1. A TRPV1 receptor .............................................................................................................. 7
2. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció .................................................................................... 12
3. A TRPA1 receptor ............................................................................................................ 14
4. Nem-neuronális TRP receptorok ..................................................................................... 16
5. A PACAP........................................................................................................................... 17
II. Általános célkitűzések ......................................................................................................... 19
1. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális TRPV1 csatornákat? .. 19
2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van a TRPV1 és a PACAP
közötti kapcsolatnak?.............................................................................................................. 19
3. Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben? ..................................... 19
III. A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális TRPV1 kifejeződésére patkány
szájnyálkahártyában és bőrben .................................................................................................. 20
1. Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 20
2. Célkitűzések..................................................................................................................... 22
3. Anyagok és módszerek .................................................................................................... 23
Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás .................................................. 23
Szövetminták előkészítése .................................................................................................. 24
mRNS expresszió vizsgálata ................................................................................................ 24
Immunhisztokémia .............................................................................................................. 24
Statisztika ............................................................................................................................ 25
4. Eredmények .................................................................................................................... 26
TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában ................................ 26
TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében ...................................................... 28
5. Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 34
IV. A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a kapszaicin által kiváltott
bőrgyulladásban .......................................................................................................................... 40
1. Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 40
2. Célkitűzések..................................................................................................................... 41
2
3. Anyagok és módszerek .................................................................................................... 41
Reagensek, vegyszerek ....................................................................................................... 41
Kísérleti állatok .................................................................................................................... 41
Akut gyulladás kiváltása ...................................................................................................... 42
Radioimmunassay ............................................................................................................... 43
A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben ............................................... 44
Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok ....................................................................... 44
Statisztika ............................................................................................................................ 45
4. Eredmények .................................................................................................................... 46
A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben ................................................................ 46
A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására .................... 48
PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására ............. 51
5. Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 52
V. A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben ........................................................................ 56
1. Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 56
2. Célkitűzések..................................................................................................................... 58
3. Anyagok és módszerek .................................................................................................... 58
Kísérleti állatok .................................................................................................................... 58
Klinikai minták ..................................................................................................................... 59
Egér DSS colitis modell ........................................................................................................ 59
Betegségaktivitási Index meghatározása ............................................................................ 60
Szövettani elemzés .............................................................................................................. 61
Immunhisztokémia .............................................................................................................. 62
Kvantitatív PCR .................................................................................................................... 63
Luminex RNS assay .............................................................................................................. 64
Luminex Multiplex Immunassay ......................................................................................... 64
Statisztika ............................................................................................................................ 65
4. Eredmények .................................................................................................................... 66
TRPA1 és TRPV1 génexpresszió ........................................................................................... 66
TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció ................................................................ 68
Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben ................................................................ 72
Szövettani pontozás az egér DSS modellben ...................................................................... 73
Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben ................................................................... 74
3
Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben................................................................... 75
Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben ..................................... 77
5. Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 81
VI. Új eredmények összefoglalása, következtetések ............................................................ 89
Függelék ...................................................................................................................................... 91
Irodalomjegyzék .......................................................................................................................... 94
Köszönetnyilvánítás .................................................................................................................. 113
Publikációs lista ......................................................................................................................... 114
4
Rövidítések jegyzéke
AC: adenilát-cikláz AITC: allil-izotiocianát ANOVA: analysis of variance/ variancia-analízis BCP: bromo-chloro-propane/ bróm-klór- propán BSA: bovine serum albumine/ borjú szérum albumin CAPS: capsaicin/ kapszaicin CCL5: chemokine (C-C motif) ligand 5/ kemokin (C-C motívum) ligand 5 (RANTES) CFA: complete Freund’s adjuvant/ teljes Freund adjuváns CGRP: calcitonin gene-related peptide/ kalcitonin gén-rokon peptid CLC2: chemokine (C-C motif) ligand 2/ kemokin (C-C motívum) ligand 2 (MCP-1) COX-2: ciklooxigenáz-2 Cq: quantification cycle/ kvantifikációs ciklus CXCL9: chemokine (C-X-C motif) ligand 9/ kemokin (C-X-C motívum) ligand 9 (MIG) DAB: diamino-benzidin DAG: diacil-glicerol DAI: disease activity index/ betegségaktivitási index DSS: dextran sulphate sodium/ dextrán-szulfát nátrium sója EC: extracelluláris tér EM: endomorfin GAPDH: glicerin-aldehid-3- dehidrogenáz GUSB: béta-glükuronidáz HPETE: hidroperoxi-eikoza-tetraénsav Hprt1: hipoxantin foszforibozil transzferáz 1 HT: hipotalamusz H2O2: hidrogén-peroxid IBD: inflammatory bowel diseases/ gyulladásos bélbetegségek IC: intracelluláris tér IFNɤ: gamma-interferon IL: interleukin IL-1β: interleukin-1 béta IL-1rn: interleukin-1 receptor antagonista gén (fehérje: IL-1RA) iNOS: inducable nitrogen-monoxide sytnhase/ indukálható nitrogén-monoxid szintáz IP3: inozitol-triszfoszfát i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris i.v.: intravénás KO: knock-out/ génhiányos LPA: lizofoszfatidsav MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1/ monocita kemoattraktáns protein-1 (CLC2) MIG: monokine induced by gamma interferon/ gamma-interferon által indukált monokin (CXCL9) MO: mustard oil/ mustárolaj
5
NADA: N-arachidonoil-dopamin NF-κB: nukleáris faktor-κB Nrf-2: nukleáris faktor eritroid 2 [NF-E2]-kapcsolt faktor 2 NKA: neurokinin A NKB: neurokinin B NK sejtek: natural killer sejtek/ természetes ölősejtek OLP: oralis lichen planus PA: foszfatidsav PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide/ hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid PAC1R: PACAP specifikus receptora PACAP WT: PACAP génhiányos egerek vad típusú megfelelője (CD1 törzs) PACAP (Adcyap1) KO: PACAP génhiányos/ PACAP knockout PACAP-IR: PACAP immunreaktivitás PC: foszfatidil-kolin PCR: polymerase chain reaction/ polimeráz láncreakció PE2: prosztaglandin E2 PG: pituitary gland/ agyalapi mirigy PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát PPE: plazma protein extravazáció PKC: protein kináz C PLC: foszfolipáz C qPCR: quantitative polymerase chain reaction/ kvantitatív polimeráz láncreakció PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride/ fenil-metil-szulfonil-fluorid RANTES: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted/ aktiváció hatására szabályozott, normál T-sejt-expresszált és szekretált (CCL5) ROS: reactive oxygen species/ reaktív oxigéngyökök RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction / reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció SAPE: streptavidin phycoerythrin/ sztreptavidin- fikoeritrin s.c.: subcutan SEM: standard error of the mean/ középérték közepes hibája SP: substance P/ P-anyag SST: szomatosztatin SSTR1/4: szomatosztatin 1/4 receptor TNBS: trinitro-benzol-szulfonsav TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa TRP: Tranziens Receptor Potenciál TRPA1: Tranziens Receptor Potenciál Ankirin 1 TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 ttkg: testtömeg kg UC: ulcerative colitis/ colitis ulcerosa UV-sugárzás: ultraibolya sugárzás VIP: vazoaktív intesztinális polipeptid VPAC1/VPAC2: a VIP és a PACAP közös receptorai WT: wild-type/ vad típus
6
Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai
Minden kísérleti eljárást az állatok védelmére és kíméletére vonatkozó, 1998. évi
XXVIII. törvénynek, valamint az állatkísérletek végzésére vonatkozó 243/1988. (XII.31.)
Kormányrendeletnek megfelelően hajtottunk végre. Kísérleteink összhangban voltak az
International Association for the Study of Pain és a Helsinki Nyilatkozat elveivel.
Vizsgálatainkat jóváhagyta a Pécsi Tudományegyetem Munkahelyi Állatkísérleti
Bizottsága a PTE állatkísérleti etikai kódexe alapján.
Engedélyszámok: BA 02/2000-16-2006 és BA 02/2000-2/2012 az állatkísérletek
számára; BA 02/2000-1/2012 a klinikai minták gyűjtésére.
Minden beteg beleegyező nyilatkozatot írt alá.
7
I. Általános bevezetés
1. A TRPV1 receptor
Az 1950-60-as években Magyarországon végzett kutatások alapján fedezték fel, hogy
az erős paprika csípős anyaga, a kapszaicin szelektíven aktiválja, illetve nagy dózisok
ismételt adása után károsítja a fájdalomérző idegvégződések egy hőérzékeny
csoportját [1,2]. A következő évtizedben szintén hazánkban született meg az a
koncepció, mely szerint a kapszaicin egy specifikus receptoron hat a
plazmamembránban [3], amely Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) néven
ismert 1997-es klónozása óta [4]. A patkány Trpv1 cDNS egy 95 kDa nagyságú, nem
szelektív kation csatorna alegységet kódol (1. ábra), amely a hátsó gyöki ganglionok
(DRG), a trigeminus és a vagus ganglionok kis átmérőjű szenzoros neuronjai jelentős
mértékben kifejeznek.
1. ábra
A TRPV1 receptor alegység funkcionális szerkezete a kulcs aminosavak megjelölésével.
Szolcsányi és Sándor, 2012 [5]. S1-6: transzmembrán domének; A: ankirin ismétlődés
domén; TRP: tranziens receptor potenciál domén, amely a TRP csatornákban konzervált
szerkezetű, és a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) által történő aktiváláshoz
szükséges; fekete kör: foszforilációs helyek, amelyek a protein kináz C (PKC) és a
protein kináz A (PKA) általi szenzitizáció hatóhelyei; LPA: lizofoszfatidsav.
8
A TRPV1 alegység hat transzmembrán doménnel és kiterjedt N-, C-terminális régiókkal
rendelkezik. Az alegységek tetramer és/vagy heteromer csatorna komplexeket
képeznek (2. ábra).
2. ábra
(A) A TRPV1 receptor alegység szerkezete. Kalia és Swartz, 2013 [6]. Négy alegység
alakítja ki a funkcionális receptor-ioncsatorna komplexet. (B) A patkány TRPV1
tetramer szerkezetének modellje, az extracelluláris oldal felőli nézetben. A négy
alegység (A, B, C, D) TM5 és TM6 transzmembrán hurokszerkezetű szakasza egy
központi pórust alakít ki. Lee és mtsai, 2011 [7]. (C) A TRPV1 háromdimenziós
szerkezetének elhelyezkedése a plazmamembránban. Moiseenkova-Bell és mtsai,
2008 [8].
9
Az N- és C- terminális, valamint egy intracelluláris régió a protein kináz A (PKA) és a
protein kináz C (PKC) feltételezett hatóhelyeit, az N-és C-terminális a
kalcium/kalmodulin komplex kötőhelyét, a C-terminális a foszfatidilinozitol-4,5-
biszfoszfát (PIP2) hatóhelyét tartalmazza. Ezek a foszforilációs és kötőhelyek
feltehetően szerepet játszanak a TRPV1 ioncsatorna deszenzitizációjában [9–11] (1.
ábra, 7. old.).
A TRPV1-et a kapszaicinen kívül fájdalmas hőinger (>43 °C) és protonok (pH <6,0),
valamint többféle gyulladás- és fájdalomkeltő endogén molekula aktivál (pl. N-
arachidonoil-dopamin: NADA, lipoxigenáz termékek, anandamid), vagy a perifériás
idegvégződésen szenzitizál (pl. bradikinin, adenozin-trifoszfát: ATP, idegi növekedési
faktor: NGF), illetve exogén vanilloidok aktiválnak [12,13]. Az utóbbi agonistacsoportba
tartozó kapszaicin és ultrapotens analógja, a reziniferatoxin (RTX) a receptor
intracelluláris és transzmembrán régióján hat (1. ábra, 7. old.) dózisfüggő módon [14].
Az RTX kémiai szerkezete magyarázza ultrapotens tulajdonságát [15] (3. ábra).
3. ábra
A kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-
nonénamid) és a reziniferatoxin
(RTX) molekulaszerkezete. Lee és
mtsai, 2011 [7]. A: 4-hidroxi-3-
metoxifenil; B: összekötő amid-
(kapszaicin) vagy észtercsoport
(RTX); C: lipofil oldallánc
(kapszaicin: nonenil; RTX: diterpén).
Az RTX legfontosabb farmakofórjai
az „A” régión kívül a C20 észter-, a
C3 ketocsoport és az ortofenil
csoport [7,15,16].
10
A TRPV1 izgatásával generált akciós potenciál következménye az érzőműködés és a
nocicepció kialakulása. Így egyfelől különböző szenzoros modalitások (fájdalom,
viszketés, hőérzékelés, stb.) jelátvitelét közvetítik (afferens funkció) (4. ábra). Másrészt
a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok aktiválása többféle, főleg gyulladáskeltő
szenzoros neuropeptid felszabadulásához vezet (lokális efferens funkció) [17,18].
Az aktivált perifériás végződésekből olyan neuropeptidek szabadulnak fel (P anyag,
neurokinin A: NKA, neurokinin B: NKB, kalcitonin gén-rokon peptid: CGRP), amelyek az
arteriolák erőteljes tágulatát, a venulákból lokális plazmafehérje-kiáramlást, valamint
gyulladásos sejtek aktivációját okozzák a beidegzési területen [19]. Az így létrejövő
neurogén gyulladás számos betegség kialakulásában szerepet játszik, úgy mint asthma
bronchiale, allergiás rhinitis, conjunctivitis és dermatitis, ekcéma, rheumatoid arthritis,
migrén, gyulladásos bélbetegségek [20–22].
4. ábra
A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója. Helyes, 2009 [23]. EM:
endomorfin. TRPA1: a TRPV1-rokon Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1.
11
Munkacsoportunk korábban bizonyította, hogy ezzel párhuzamosan az aktivált,
szenzoros idegvégződésből gyulladáscsökkentő hatású szomatosztatin is felszabadul,
amely a szisztémás keringésbe is bekerül (szenzokrin hatás). A szomatosztatin mellett
további szisztémás gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatású peptidek (pl.
endomorfinok) is felszabadulnak ezen rostokból aktiválásuk hatására [18,24] (4. ábra,
10. old.).
12
2. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció
A kapszaicin nem csak szelektíven aktiválja, hanem hosszabb vagy ismétlődő kezelés
után deszenzitizálja a „kapszaicin receptor” TRPV1-et expresszáló C-polimodális
nociceptorokat [1,18] (5. ábra). Az így létrejövő kemoanalgézia jelenségét használják ki
kísérleti eszközként, amikor a szenzoros TRPV1 funkció hiányát kívánják vizsgálni [18].
5. ábra
A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatása a TRPV1-et kifejező érzőideg-végződésre.
Anand és mtsai, 2011 [25].
Szisztémás TRPV1 deszenzitizációs kísérletekben az RTX-et részesítik előnyben a
kapszaicin helyett, mivel előbbit az állatok jobban tolerálják [15]. Az RTX a
kapszaicinhez képest 1000-szeres hatékonysággal képes deszenzitizációt kiváltani: a
szisztémás RTX dózis a 150-200 μg/kg, míg a kapszaicin dózisa a 150-200 mg/kg
tartományba esik [1,15,26–28]. A kapszaicin és az RTX nagyobbrészt más kötőhelyen,
eltérő mechanizmussal aktiválja a TRPV1 receptort (1. ábra, 7. old), ugyanakkor a Ca2+-
toxicitás következménye hasonló [29]. Aktiváláskor a TRPV1 elsősorban kalciumionokat
enged át a pórusán, amely az intracelluláris Ca2+-koncentráció és vele a membrán
depolarizáció növekedéséhez vezet. Trpv1 knock-out (KO) egerekkel végzett
vizsgálatok kimutatták, hogy az ioncsatorna kulcsfontosságú gyulladásos- és
13
fájdalomingerek integrálásában, amelynek köszönhetően célmolekulává vált a
gyógyszerfejlesztésben [15,18,30].
Lokálisan vagy szisztémásan alkalmazott nagydózisú kapszaicin kezelés reverzíbilis, de
hosszantartó analgéziát vált ki [1,18,31]. A kapszaicinnel ily módon deszenzitizált
állatok káros kémiai anyagok hatására nem mutatnak védőreflexet vagy gyulladást:
szisztémás kapszaicin előkezelés után a szenzoros idegvégződések stimulálása nem vált
ki akut neurogén gyulladást [32], amely arra utal, hogy a gyulladásos mediátorok (P-
anyag, NKA, CGRP) kiürülnek a fájdalomérző idegvégződésekből. Ezen szenzoros
neuropeptidek a neurogén gyulladás mellett simaizom kontrakciót váltanak ki, továbbá
szabályozzák az értónust, a nyálkaszekréciót és az immunfunkciókat [33].
14
3. A TRPA1 receptor
A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) a TRPV1-hez hasonló receptor-
ioncsatorna komplex a molekulaszerkezete, funkciója és lokalizációja szempontjából
[34] (6. ábra).
6. ábra
A TRPA1 és
TRPV1
receptor
felépítése.
Bessac és
mtsai, 2008
[35].
Jól ismert, hogy a TRPA1 és a TRPV1 nagymértékben koexpresszálódik a peptiderg,
afferens Aδ- és C-rostok egy alpopulációjában, amelyek sejttestje a dorzális,
trigeminális ganglionokban és bolygóideg érződúcaiban (ggl. jugulare, ggl. nodosum)
találhatóak [36–39]. A TRPV1-et kifejező neuronok 30-50%-a tartalmaz TRPA1-et is,
míg utóbbi ritkán található meg a TRPV1 nélküli neuronokban [40,41]. Az agy több
régiójában kimutatták a TRPV1-et [42–45] és a TRPA1 jelenlétére utaló adatok is
ismertek [44,46,47]. A TRPA1, TRPV1 általában nem-neuronális sejtekben is együtt
fordul elő (pl. epithelium, keratinociták) [13].
A TRPA1 nem szelektív Ca2+-csatornaként számos sejtszintű folyamatban tölt be
szerepet a szenzoros funkcióktól a homeosztázis fenntartásáig. A receptort a hideg
hőmérséklet (<17 °C), mechanikai ingerek, számtalan elektrofil, irritáns, csípős vegyület
aktiválja, közülük több a táplálékban is megtalálható (pl. fahéjaldehid, mentol, allil-
izotiocianát, allicin, stb.) [48] (7. ábra, 15. old.). Az előbbi exogén vegyületek mellett a
receptort a gyulladás, oxidatív stressz és szövetkárosodás során felszabaduló endogén
15
agonisták is képesek szenzitizálni/aktiválni [49–52]. A TRPA1 receptor lokalizációja és
funkcionális tulajdonságai alapján kulcsszerepet játszik akut és krónikus fájdalomban,
gyulladásban. Patofiziológiai jelentősége, potenciális gyógyszercélpont szerepe
felmerült többek között a légutak, a kardiovaszkuláris rendszer és a bél gyulladásos
betegségeiben [48].
7. ábra
A TRPA1 receptor néhány, a táplálékban megtalálható természetes exogén liganduma.
SuperPain Database, Charité Orvostudományi Egyetem, Berlin [53]. Az allicin a TRPV1
receptort is aktiválja [54].
16
4. Nem-neuronális TRP receptorok
A TRPV1 előfordulását eredetileg kizárólag neuronális struktúrákon feltételezték, az
elmúlt években azonban egyre több nem-neuronális sejttípuson is kimutatták: többek
között keratinocitákon, epidermiszben, hízósejteken, dendritikus sejteken, T-
limfocitákon, epithelsejteken, vaszkuláris endothelsejteken, ér simaizomsejteken, az
orrnyálkahártya szubmukózus mirigyeiben, az urotheliumban,
gyomornyálkahártyában, stb. [13,55–62]. In vitro kimutatták, hogy egyes sejeteken a
nem-neuronális TRPV1 receptorokat aktiválja a kapszaicin/RTX, gyulladásos
mediátorok, ultraibolya (UV) sugárzás és magas hőmérséklet, amely az extraneuronális
ioncsatorna funkcionális jelenlétére utal [63–68]. Ugyanakkor a nem-neuronális
receptorok szerepe a gyulladásos válaszok esetleges mediátoraként in vivo nem ismert.
A TRPA1 receptor extraneuronálisan megtalálható többek között enterokromaffin
sejtekben, a hasnyálmirigy béta-sejtjeiben, epidermális keratinocitákban,
melanocytákban, fibroblastokban, synoviocytákban, a vékony- és vastagbél
szöveteiben, arteriolák simaizomsejtjeiben, gyulladásos sejteken [13,62,69].
Mivel a nem-neuronális TRPV1/TRPA1 receptorok funkciója, élettani, illetve kórélettani
jelentősége tisztázatlan, az utóbbi években ez a kutatási irány az érdeklődés
középpontjába került. A neuronális TRPV1/A1 receptorokat célzó hatóanyagok
extraneuronális mellékhatásait nem ismerjük, emellett a nem-neuronális TRP
csatornák maguk is potenciális gyógyszercélpontok lehetnek. Az ér simaizomsejteken
lokalizálódó TRPV1 csatornák aktiválása vazokonstrikciót okoz, amely a
mikrocirkuláció, vérnyomás szabályozásában játszhat szerepet [69,70]. A
keratinocitákon expresszálódó TRPV1 izgatása, hasonlóan humán T-limfocitákhoz és
egér hízósejtekhez, gyulladáskeltő mediátorok felszabadulásához vezethet in vitro
[62,63,71,72], közülük számos szenzitizálhatja a szenzoros TRPV1-et [15,73]. Így a
keratinocitákon, gyulladásos sejteken kimutatott [13,62] TRPV1 és a szenzoros
idegrostok közötti interakciók modulálhatják a neurogén gyulladás folyamatait [74,75].
Az utóbbi években a nem-neuronális TRP csatornák, mint a farmakológiai kutatások
„forró” területe felé fordult érdeklődésünk. Munkacsoportunk kimutatta a TRPV1
expresszió növekedését a szájnyálkahártya keratinocitáin oralis lichen planusban (OLP)
[76], valamint hízósejteken asztmás orrpolipózisban [77].
17
5. A PACAP
A kapszaicin-érzékeny idegvégződésekben a gyulladáskeltő neuropeptidek mellett (pl.
CGRP, P-anyag, egyéb tachykininek, stb.) gyulladáscsökkentő peptidek is
expresszálódnak, például a PACAP. Utóbbi két különböző molekulaformában létezik:
PACAP-27 és PACAP-38 (8. ábra), túlnyomóan az utóbbi van jelen az emlős
szövetekben [78]. A PACAP a vazoaktív intesztinális peptid (VIP)/szekretin/glukagon
peptid szupercsalád leginkább konzervált szerkezetű tagja [78–81].
8. ábra
A PACAP-38 molekula
térszerkezete. Toyama
Egyetem, Japán [82].
A PACAP specifikus receptora a PAC1, amely mind Gs, mind Gq proteinekhez
kapcsolódhat, előbbi révén az adenilát-cikláz (AC) jelátviteli útvonalat, utóbbin
keresztül a foszfolipáz C (PLC) utat aktiválja. A VPAC1 és VPAC2 receptorok hasonló
mértékben kötik a PACAP-ot és VIP-et, és az adenilát ciklázt aktiválják, amely
megnövekedett cAMP termelődéshez vezet [78,83] (9. ábra, 18. old).
A PACAP és receptorai széles körben előfordulnak a szervezetben a központi és
perifériás idegrendszerben, valamint nem-neuronális sejtekben a perifériás
szervekben, pl. a bőrben és a bélrendszerben is [78,84,85]. Ezáltal a PACAP számtalan
fiziológiai és patofiziológiai folyamatban játszik szerepet, beleértve az immunfunkciók
modulálását, az erek integritását, a neuronális fejlődést és regenerációt, a circadian
ritmust, szaporodást, stb. [86–92]. A peptid alapvetően gyulladáscsökkentő,
neuroprotektív funkcióiról ismert, de a gyulladás, fájdalomkeletkezés irányába is
mediálhatja a patofiziológiai folyamatokat a különböző sejteken,
receptorvariánsokon/típusokon azonosított, ill. eddig nem ismert splice variánsokon
feltételezett “kombinatorikusan” pleiotróp hatásától függően [78,81,83,88,92–99] (9.
ábra, 18. old.).
18
9. ábra
A specifikus PACAP receptor PAC1R (legelterjedtebb ún. null variánsa), valamint a
PACAP/VIP receptor VPAC1/2 aktivációja által stimulált főbb intracelluláris jelátviteli
útvonalak. Dickson és mtsai, 2009 [83]. Aktiváció hatására mindhárom receptor képes
Gαs fehérjéhez kapcsolódni és cAMP szintézist indukálni. Ezen felül a három receptor a
foszfolipáz C enzimet (PLC) is képes aktiválni, amely a [Ca2+]i növekedéséhez vezet Gαq
(mindhárom receptor esetében) és Gαi fehérjéhez (VPAC1 és VPAC2 esetén) kapcsoltan.
A foszfolipáz D (PLD) aktivitás is stimulálható a három receptortípuson keresztül, ADP-
ribolizációs faktor (ARF) közvetítésével a VPAC1/2 receptorokon, és protein kináz C
(PKC) közvetítésével a PAC1R receptoron át. EC: extracelluláris tér; IC: intracelluláris tér;
PA: foszfatidsav; PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát; IP3: inozitol-triszfoszfát; DAG:
diacil-glicerol; PC: foszfatidil-kolin.
19
II. Általános célkitűzések
Doktori (PhD) munkámat 2009 szeptemberében kezdtem meg a Pécsi
Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai
Intézetében. Célom volt az alábbi kérdések megválaszolása:
1. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális
TRPV1 csatornákat?
Fájdalom- és gyulladás állatkísérletes modelljeiben a szenzoros neuronok szerepét
kapszaicin vagy RTX kezeléssel történő deszenzitizálással vizsgálják. Arra voltunk
kíváncsiak, hogy a kísérleti módszer valóban szelektív-e a TRPV1-pozitív szenzoros
neuronokra és nem károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat? RTX-
deszenzitizált és összehasonlításként sebészileg denervált patkányok bőr és
szájnyálkahártya mintáiban terveztünk TRPV1 fehérje- és génexpressziós vizsgálatokat.
2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van
a TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolatnak?
Ismert, hogy a) a specifikus TRPV1 agonista kapszaicin neurogén gyulladást vált ki a
bőrben, és hogy b) a PACAP szerepet játszik akut vazodilatációban gyulladásos
folyamatok során. Nem ismert azonban e kettő közti kapcsolat, és hogy a PACAP-nak
és specifikus PAC1R receptorának milyen szerepe van ebben a folyamatban. A PACAP
és a PAC1R fehérje és mRNS szintű expresszióját vizsgáltuk ezért a talpi, lábháti és háti
bőrben, valamint a TRPV1 és PACAP génhiányos egerekben kapszaicinnel kiváltott
neurogén, ill. összehasonlításként Komplett Freund adjuváns (CFA) segítségével
indukált sejtes immunválaszon alapuló gyulladásban.
3. Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben?
Elsőként a TRPA1 és a TRPV1 receptor lokalizációjára voltunk kíváncsiak az intakt és
gyulladt egér vastagbélben és humán klinikai mintákban, különös tekintettel azok
extraneuronális előfordulására. Majd Trpa1 KO egerekben dextrán-szulfát nátrium
sójával (DSS) kiváltott colitisben kívántuk vizsgálni a receptor szerepét, ill. a mögöttes
mechanizmusok felderítésére a lokális neuropeptid útvonalakat, valamint
citokinek/kemokinek szintézisét a disztális vastagbélben.
20
III. A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális
TRPV1 kifejeződésére patkány szájnyálkahártyában és
bőrben
Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012)
1. Irodalmi háttér, előzmények
A szenzoros rostok gyulladásban betöltött szerepét (neurogén komponens) vizsgáló
állatkísérletekben a szisztémás RTX előkezelést szelektív farmakológiai eszközként
alkalmazzák a TRPV1-pozitív érzőideg-végződések deszenzitizációjára [18]. A nem-
neuronális TRPV1 csatornák felfedezésével adódik a kérdés: az évtizedek óta
alkalmazott RTX deszenzitizáció vajon továbbra is szelektív kísérleti eszköznek
tekinthető-e, amely kizárólag a szenzoros neuronokat érinti, de a nem-neuronális
sejtekre nincs hatással? Keratinocitákon végzett in vitro vizsgálatok [100] alapján
feltételezhetjük, hogy a nem-neuronális TRPV1 receptorok és gazdasejtjeik intakt
állapotban maradnak szisztémás RTX kezelés után.
A kapszaicin és az RTX fontos farmakológiai eszközzé vált a perifériás szenzoros
neuronok szelektív aktiválásában, ill. ismételten, nagy dózisban történő alkalmazásuk
esetén ezen neuronok szelektív károsításában [15] (10. ábra, 21. old.).
A szenzoros idegvégződések RTX/kapszaicin nagydózisú vagy ismételt adása által
kiváltott deszenzitizációjához három mechanizmus vezet. (1) Receptor szintű
deszenzitizáció: az aktivált TRPV1 csatornán át beáramló Ca2+ ionáram a receptor
defoszforilációját okozza, amely csökkenti annak érzékenységét. (2) Ingerület
kialakulásának gátlása: a TRPV1 ismételt aktiválása és az ezzel járó kation beáramlás
közvetetten blokkolja a feszültségfüggő Na+-csatornákat, amely az akciós potenciál
kialakulása ellen hat. (3) Idegvégződés funkcionális károsodása: a mitokondriális
membrán depolarizációja az organellum duzzadásához és Ca2+ kiáramlásához vezet a
citoplazmába. Nagy dózisokban adott RTX tehát az idegvégződés funkcionális
károsodását okozza, ez a folyamat a deszenzitizáció, amelyet az idegvégződés fizikai
21
károsodása követhet, utóbbi a kémiai denerváció [10,25]. A deszenzitizáció
szinonimájaként használják az irodalomban a deszenzibilizáció kifejezést is, amely az
idegi-ingerületvezetési funkciók hiányát hangsúlyozza ki.
10. ábra
A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatásmechanizmusa a TRPV1-et kifejező érzőideg-
végződésekben. Anand és mtsai, 2011 [25].
Mivel a krónikus, súlyos fájdalommal járó állapotok kezelésében az eddigi TRPV1
antagonisták nem jutottak túl a II-es fázisú klinikai vizsgálatokon a mellékhatásaik
(elsősorban a fájdalmas hőküszöb emelkedése) miatt, előtérbe került a kapszaicin-
érzékeny idegvégződések deszenzitizációja mint terápiás eszköz. Ennek legfrissebb
irodalmát Nilius és Szállási (2014, [44]) tekintette át: a nagy dózisú (8%) kapszaicint
tartalmazó Qutenza bőrtapaszt jelenleg posztherpetikus neuralgia (PHN, övsömör
utáni idegzsába) és nem diabéteszes perifériás neuropátiás fájdalom kezelésére
alkalmazzák. A transzdermális kapszaicin terápia a TRPV1-pozitív szenzoros afferensek
reverzíbilis eliminációját okozza a bőrben, amely fájdalomcsillapító hatású [25]. Szintén
PNH-ban analgetikus hatású a nagykoncentrációjú (20%) kapszaicin folyadék
formuláció (NGX-1998), továbbá klinikai vizsgálatok alatt áll a zu-kapszaicin (kapszaicin
22
cisz-izomer; Civamid: ízületi fájdalom, migrén, cluster-fejfájás; Civanex krém: ízületi
fájdalom csillapítása COX-2 gátlóval kombinációban) [44]. Az RTX deszenzitizáció is újra
az érdeklődés középpontjába került, más módon nem kezelhető daganatos fájdalom
csillapításában, a bíztató állatkísérletek után I-es fázisú klinikai vizsgálat indult [44].
Vizsgálataink előtt nem volt ismert, hogy a szenzoros TRPV1 károsodását okozó
kapszaicin/RTX terápiák [44] károsítják-e a nem-neuronális TRPV1 receptorokat.
2. Célkitűzések
A fenti előzmények alapján vizsgálataink céljául tűztük ki patkány lábbőr és
szájnyálkahártya mintákban a nem-neuronális TRPV1 (1) jelenlétének, valamint (2)
expresszióváltozásának vizsgálatát RTX deszenzitizáció és sebészi denerváció után,
mRNS és fehérjeszinten. Azt szerettük volna kimutatni, hogy a szenzoros denerváció
valóban szelektíven a neuronálisTRPV1 receptorra hat-e.
23
3. Anyagok és módszerek
Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás
A kísérleteket felnőtt hím Wistar patkányokon (tömeg: kb. 300 g) végeztük. (11. ábra)
Az állatok egy csoportjában (n=6) a hátsó lábakon denerválást végeztünk, amellyel az
idegrostok degenerálódását idéztük elő. Nátrium-pentobarbitál (Euthasol; 40 mg/ttkg
i.p.; Produlab Pharma b. v., Hollandia) altatás alatt a patkányok jobb hátsó lábán a
comb magasságában elvágtuk a n. ischiadicust és a n. saphenust, ezzel denerváltuk a
végtagot. Az ellentétes hátsó végtagok szolgáltak kontrollként. A denerválás után öt
nappal a nátrium-pentobarbitállal túlaltatott állatokat feláldoztuk. A denervált és
kontroll hátsó lábak dorzális (szőrrel borított) és plantáris (szőrtelen) bőrét
kimetszettük, két darabra vágtuk kvantitatív qPCR és immunhisztokémiai vizsgálatok
céljára. Öt másik patkányt deszenzitizáltunk RTX (Sigma, St. Louis, MO, USA) kezeléssel:
30, 70, és 100 μg/ttkg RTX s.c., három egymást követő napon [101]. Öt állat fiziológiás
sóoldatot kapott kontrollként. Az állatokat két héttel később feláldoztuk, a hátsó lábak
dorzális és plantáris bőr-, és szájnyálkahártya mintáit kimetszettük qPCR és
immunhisztokémiai jelölés céljából. (11. ábra)
11. ábra
Kísérleti elrendezés.
24
Szövetminták előkészítése
Minden egyes kimetszett szövetmintát két darabra vágtunk, a szövetminta felét RNA
Later (Sigma-Aldrich Magyarország Kft, Budapest) folyadékba helyeztük, és −80°C-on
tároltuk, másik felét 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk
immunhisztokémiai jelölés céljára.
mRNS expresszió vizsgálata
Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml TRI reagensben (Molecular Research
Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk és a gyártó utasításainak
megfelelően teljes RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS mennyiségét és tisztaságát
Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc.,
Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1 µg totál RNS-t írtunk
át reverz transzkripcióval cDNS-re a RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Fermentas/Thermo Fisher Scientific, USA) segítségével, 5 µM oligo(dT)18 primerrel 20
μl térfogatban, a gyártó utasításainak megfelelően. Ezt követően kvantitatív PCR
(qPCR) detektálást hajtottunk végre Roche LightCycler készüléken TaqMan Universal
Master Mix (Applied Biosystems/LifeTechnologies, USA), TaqMan primerek és próbák
(patkány TRPV1-re specifikus, Rn00583117_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies,
USA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően (900 nM primer, 250nM
próba, 20 µl reakciótérfogatban; kétlépéses PCR program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C
1 perc, 40 ciklus). A mintákat triplikátumban mértük le, a génexpressziót a hipoxantin
foszforibozil-transzferáz-1 (Hprt1) gén transzkriptumaira normalizáltuk (patkány Hprt1-
re specifikus, Rn01527840_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies, USA). A relatív
génexpressziót a referenciagénhez képest számítottuk ki a szövettípusok közötti
összehasonlításra a 2-ΔCt képlettel.
Immunhisztokémia
A deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk
mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigén feltárás céljából. A szövetek
endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való
inkubációval gátoltuk. A másodlagos antitest nem specifikus kötődését
25
megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután
a metszeteket előbb 1:1000-es hígításban nyúl poliklonális anti-TRPV1 antitesttel (Kat.
szám: 2233; Tocris Bioscience, USA) inkubáltuk 1 órán keresztül, majd másodlagos
torma-peroxidázzal konjugált EnVision system anti-nyúl szekunder antitesttel (Dako-
Cytomation, Dako North America, USA) 30 percig. Végül a TRPV1 receptorok
immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10 percig, magfestést
hematoxilinnal végeztünk. Az elsődleges antitest szelektivitását Western blot
segítségével bizonyították [102]. Negatív kontrollként elsődleges antitest nélküli,
másodlagos antitest és kecskeszérum hozzáadásával inkubált metszetek szolgáltak,
mindhárom szövettípuson. A szájnyálkahártyában a TRPV1 receptorok
immunpozitivitását szemikvantitatív pontozással határoztuk meg egy, a kísérletekben
részt nem vevő patológus segítségével. Image Pro Plus 4.5 szoftverrel analizáltuk a
metszetekről készült képeket, és az immunspecifikus festődés alapján azonosítottuk az
pozitív pixeleket. Az adatokat a vizsgált régióban (epithelium, kötőszövet) százalékos
arányban adtuk meg. A dorzális mintákban az epidermális réteg nem bizonyult kellő
vastagságúnak a keratinocita szám pontos meghatározásához, ezért ezt csak a talpi
bőrmintákban végeztük el, az ImageJ 1.44p szoftverrel (National Institutes of Health,
USA).Az előhívás után kialakult specifikus immunfestési színre manuálisan beállítottunk
egy detektálási küszöbértéket az immunpozitív keratinociták azonosítására. Kijelöltük
az epidermális régiót és lemértük a területét, amelyet a pixelek számában ad meg a
szoftver, majd megszámoltuk a TRPV1-re specifikusan festődő keratinociták számát.
Minden egyes kontroll és kezelt állatból öt metszetet elemeztünk, metszetenként öt
fotó készült. Az adatokat egységnyi epidermisz területre (100 000 pixel) vonatkoztatott
TRPV1-pozitív keratinociták számaként adtuk meg.
Statisztika
Az eredményeket átlag±átlag szórása (SEM) formában fejeztük ki. A statisztikai analízis
során Mann-Whitney-próbát, a szövettípusok qPCR eredményeinek
összehasonlításakor Kruskal-Wallis és Dunn-féle többszörös összehasonlító próbát
alkalmaztunk, a p<0,05 értékeket tekintettük szignifikánsnak.
26
4. Eredmények
TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában
RTX kezelés
A Trpv1 receptor mRNS az előzetes várakozásaink szerint kimutatható volt qPCR-ral a
lábháti (12. ábra) és talpi bőrben (13. ábra), valamint a szájnyálkahártyában (14. ábra,
27. old.) mind az RTX-előkezelt, mind a kezeletlen kontroll állatokban. A relatív Trpv1
mRNS expresszió nem különbözött szignifikánsan a deszenzitizált és kontroll állatok
azonos típusú mintái között. A szövettípusok közül a szájnyálkahártya mutatja a
legmagasabb mértékű génexpressziót, amelyet a dorzális és plantáris bőr követ (15.
ábra). A Trpv1 szignifikánsan magasabb szinten expresszálódik a dorzális bőrben és két
nagyságrenddel magasabban a szájnyálkahártyában, a talpi bőrhöz képest.
12. ábra
A relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti
bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok
között. Nincs szignifikáns különbség a
kontroll és RTX-kezelt csoport között.
Mann-Whitney-próba.
13. ábra
Relatív Trpv1 génexpresszió a talpi
bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok
között. Nincs szignifikáns különbség a
kontroll és RTX-kezelt csoport között.
Mann-Whitney-próba.
27
14. ábra
Relatív TRPV1 génexpresszió a
szájnyálkahártyában a kontrol és RTX-
kezelt állatok között. Nincs szignifikáns
különbség a kontroll és RTX-kezelt
csoport között. Mann-Whitney-próba.
15. ábra
Relatív Trpv1 génexpresszió
összehasonlítása a szövettípusok között
a kezeletlen kontrollmintákban.
Kruskal-Wallis próba és Dunn-féle
többszörös összehasonlító próba: talpi
bőr vs. szájnyálkahártya **p<0,01.
Mann-Whitney próba lábháti vs. talpi
bőr #p<0,05.
Sebészi denerváció
A qPCR-ral mért Trpv1 mRNS expresszió mértéke hasonló volt a sebészileg denervált és
ellenoldali ép kontroll lábháti (16. ábra) és talpi (17. ábra, 28. old.) bőrminták között.
Nem volt különbség a vizsgált bőrterületek között.
16. ábra
Relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti
bőrben a kontroll és sebészileg denervált
láb között. Nincs szignifikáns különbség a
kontroll és denervált csoport között. Mann-
Whitney-próba.
28
17. ábra
Relatív Trpv1 génexpresszió a talpi
bőrben a kontroll és sebészileg denervált
láb között. Nincs szignifikáns különbség a
kontroll és denervált csoport között.
Mann-Whitney-próba.
TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében
RTX kezelés
A negatív kontrollként szolgáló szövetmetszetek, amelyeket csak a másodlagos
antitesttel és kecskeszérummal inkubáltunk, nem mutattak immunpozitivitást (18.
ábra, 29. old.; 19. ábra, 30. old.; 20. ábra, 31. old). Erős pozitív TRPV1 protein
immunfestést a lábi bőr keratinocitákon, a talpbőr kapilláris endothel sejteken, a
dorzális bőrben sebocitákon is (18. ábra, 29. old; 19. ábra, 30. old) kimutattunk.
Szájnyálkahártyában egyértelmű TRPV1 immunopozitivitást találtunk keratinocitákon,
valamint a kötőszövetben fibroblastokon, limfocitákon és érendothel sejteken (20.
ábra, 31. old). A TRPV1 immunfestődés intenzitása nem mutatott különbséget a három
szöveti régióban és nem változott RTX deszenzitizáció hatására. A TRPV1
immunpozitivitás szemikvantitatív értékelése a talpi bőr (21. ábra, 32. old.), valamint
szájnyálkahártya metszeteken (22. ábra, 32. old.) nem mutatott ki szignifikáns
különbséget az RTX-előkezelt és kontroll minták között.
29
18. ábra
Reprezentatív TRPV1-
specifikus
immunhisztokémiai
felvételek a (A) negatív
kontroll (elsődleges antitest
nélküli) lábháti bőr
szövetmetszetekről,
valamint a (B) kontroll és (C)
RTX-kezelt állatok lábháti
bőr mintáiról. Lépték: 500
µm.
A kezeletlen kontroll (B)
lábháti (szőrrel borított)
bőrminták TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyíl)
és sebocitákon (alsó nyíl).
A 3 egymást követő napon
30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.
RTX dózissal deszenzitizált
állatok (C) lábháti bőrmintái
szintén TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyíl)
és sebocitákon (alsó nyíl).
C
B
A
30
19. ábra
Reprezentatív TRPV1-
specifikus immunhisztokémiai
felvételek a (A) negatív
kontroll (elsődleges antitest
nélküli) talpi bőr
szövetmetszetekről, valamint
a (B) kontroll és (C) RTX-
kezelt állatok talpi bőr
mintáiról. Lépték: 500 µm.
A kezeletlen kontroll (B) talpi
(szőrtelen) bőrminták TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyíl)
és kapilláris
endothelsejteken (alsó nyíl).
A 3 egymást követő napon
30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.
RTX dózissal deszenzitizált
állatok (C) talpi bőrmintái
szintén TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyíl)
és kapilláris
endothelsejteken (alsó nyíl).
B
A
C
31
20. ábra
Reprezentatív TRPV1-
specifikus immunhisztokémiai
felvételek a (A) negatív
kontroll (elsődleges antitest
nélküli) szájnyálkahártya
szövetmetszetekről, valamint
a (B) kontroll és (C) RTX-
kezelt állatok
szájnyálkahártya mintáiról.
Lépték: 500 µm.
A kezeletlen kontroll (B)
állatok szájnyálkahártya
mintái TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (nyíl) és a
kötőszövetben.
A 3 egymást követő napon
30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.
RTX dózissal deszenzitizált
állatok (C) szájnyálkahártya
mintái szintén TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (nyíl) és a
kötőszöveti régióban.
B
C
A
32
21. ábra
RTX-kezelt állatok talpbőréből
készült metszetek TRPV1
szemikvantitatív
immunpontozása. 100 000
pixel epidermisz területre eső
TRPV1-pozitív keratinociták
száma. Átlag ± SEM. Nincs
szignifikáns különbség a
kontroll és RTX kezelt csoportok között. Mann-Whitney próba.
22. ábra
RTX-kezelt állatok
szájnyálkahártya metszetei
TRPV1 szemikvantitatív
immunpontozása. A TRPV1-
pozitivitás pontozása az epithel
rétegben és a kötőszövetben,
összetett pontszámként
összegezve. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és RTX kezelt
csoportok között. Mann-Whitney próba.
Sebészi denerváció
A keratinociták és kapilláris endothel sejtek specifikus immunfestődése a talpi bőrben
és a sebociták jelölődése a lábháti bőrben változatlan maradt sebészi denerváció után
(23. ábra, 33. old.). Nem találtunk különbséget a denervált és ép kontroll talpi
metszetek között szemikvantitatív TRPV1 immunpontozással (24. ábra, 34. old).
33
D
C
A 23. ábra
Reprezentatív TRPV1-specifikus
immunhisztokémiai felvételek a
sebészi denerváción átesett láb, ill. az
intakt ellenoldali hátsó végtag
bőrmintáiból. Lépték: 100 μm.
A (A) nem denervált hátsó lábháti
bőrminták TRPV1 festődése
keratinocitákon (felső nyíl) és
sebocitákon (alsó nyíl). A sebészileg
denervált állatok az idegátvágás után 5
nappal kerültek leölésre.
Az ép hátsó végtag (B) lábháti
bőrmintái szintén TRPV1
immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyíl) és
sebocitákon (alsó nyíl).
A (C) kontroll talpi bőrminták TRPV1
specifikus immunpozitivitást mutatnak
keratinocitákon (felső nyilak) és
kapilláris endothelsejteken (alsó
nyilak).
A (D) kontroll talpi bőrminták szintén
TRPV1 specifikus immunpozitivitást
mutatnak keratinocitákon (felső nyilak)
és kapilláris endothelsejteken (alsó
nyilak).
B
34
24. ábra
Sebészileg denervált és intakt
ellenoldali láb talpi bőréből
készült metszetek TRPV1
szemikvantitatív
immunpontozása. 100 000
pixel epidermisz területre
számított TRPV1-pozitív
keratinociták száma. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és denervált
csoport között. Mann-Whitney próba.
5. Megbeszélés, következtetések
Elsőként mutattuk ki patkány talpi és lábháti bőrben, továbbá szájnyálkahártyában a
TRPV1 receptor mRNS és fehérjeszintű jelenlétét. Keratinocitákon végzett in vitro
vizsgálatok [100] alapján előzetesen feltételeztük, hogy a nem-neuronális TRPV1
receptorok és az azokat tartalmazó sejtek épek maradnak szisztémás RTX előkezelés
után. Bizonyítottuk, hogy a szisztémás RTX kezelés kizárólag a neuronális TRPV1
receptorokra szelektív, mivel a szisztémás RTX deszenzitizáció, amely kémiai
denervációt eredményezett, nem változtatja meg a TRPV1 kifejeződését nem-
neuronális sejteken a patkány lábbőrben és a szájnyálkahártyában.
A n. ischiadicus és a n. saphenus átvágása patkány lábon comb magasságban, amely a
TRPV1-pozitív érzőideg-végződések degenerálódásával jár, nem befolyásolja a nem-
neuronális TRPV1 expresszióját a lábbőrben. Idegi ligációs vizsgálatok alapján a TRPV1
receptorproteinek a primér szenzoros neuronok sejttesteiben szintetizálódnak,
ahonnan ligandkötésre képes receptormolekulák formájában intraaxonális
transzporttal jutnak el a perifériára [73]. Ezért a TRPV1 mRNS jelenlétét a periférián
lokális, nem-neuronális eredetűnek tekintjük. A TRPV1 mRNS detektálása RTX-
előkezelt állatokból származó lábbőr és szájnyálkahártya mintákban bizonyítékot
szolgáltat a TRPV1 kizárólagosan nem-neuronális sejteken való jelenlétére. Specifikus
TRPV1 immunfestődés figyelhető meg keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken a
35
talpi bőrben, míg a lábháti bőrminták TRPV1-pozitív sebocitákat is tartalmaznak. A
szájnyálkahártya TRPV1 immunpozitivitást tartalmaz mind keratinocitákon, mind
kötőszöveti elemeken (fibroblastok, limfociták, érendothel sejtek). Az
immunhisztokémiai eredményeinket a TRPV1 receptorok lokalizációjáról alátámasztják
in vitro funkcionális irodalmi adatok: az általunk kimutatott TRPV1-pozitív sejttípusok
szelektív TRPV1 agonista vagy antagonista kezelés hatására megfelelő választ adtak
sejtkultúrában [63,68,102–105].
Szájnyálkahártyában a Hprt1 referenciagénhez viszonyított Trpv1 génexpresszió két
nagyságrenddel magasabb, mint a talpi bőrben. A detektált mRNS szintjét arányosnak
tekintjük a TRPV1-et kifejező sejtek számával, míg az egyes sejteken belüli kifejeződés
szintjével csak kismértékben [67]. A nagyobb számú keratinocita és a kötőszövet
további TRPV1-pozitív sejtjeinek (T-limfociták, fibroblastok) jelenléte magyarázhatja a
szájnyálkahártya legmagasabb génkifejeződését az általunk vizsgált szövettípusok
között. Az RTX által kiváltott deszenzitizáció a neurogén gyulladás hiányához vezet [15],
amely bizonyítja a neuronális TRPV1 receptorok funkcióvesztését. RTX kezelés után a
TRPV1 mRNS szint nem mutatott változást sem a bőr, sem a szájnyálkahártya
mintákban a megfelelő kontrollokhoz viszonyítva. Ismert, hogy magas vagy ismételt
szisztémás RTX dózisok hosszútávon károsítják a TRPV1-pozitív szenzoros neuronokat
[15]. A TRPV1 receptor mRNS-t detektáltuk nem-neuronális sejtekben az RTX-
előkezelés után, a változatlan mRNS szint ép sejtfunkcióra utal. Így bizonyítottnak
tekintjük, hogy a TRPV1-et kifejező nem-neuronális sejtek nem érzékenyek a
szisztémás RTX citotoxikus hatásaira. A lábbőr és szájnyálkahártya minták specifikus
immunfestése is bizonyította a TRPV1 receptorfehérje változatlan jelenlétét RTX
deszenzitizáció után. A talpi bőr és szájnyálkahártya metszetek szemikvantitatív TRPV1
immunpontozása nem mutatott különbséget az RTX-előkezelt és kontroll állatok
között.
Összességében a qPCR és immunhisztokémiai eredményeink alapján kimondhatjuk, az
általunk alkalmazott szisztémás RTX előkezelés elegendőnek bizonyult az idegkárosító
hatáshoz, a TRPV1-pozitív nem-neuronális sejtek károsítása nélkül. Ez az eredmény jól
korrelál az irodalmi adatokkal, amelyek szerint a nagy dózisú (>0,8 M kapszaicin [106]),
de nem az alacsony dózisú (<1 μM RTX; <10 μM kapszaicin [100]) vanilloidok
36
citotoxikus hatásúak humán keratinocitákra in vitro. A nagy dózisú vanilloidok
citotoxikus hatását nem-neuronális sejttenyészetekre nem TRPV1 receptor által
mediált folyamatnak tekintik [100,102].
A TRPV1 receptorok RTX által kiváltott hosszan tartó aktiválása az intracelluláris szabad
Ca2+ szint nagymértékű növekedéséhez vezet, amely a neuronális sejtekre citotoxikus,
míg a nem-neuronális sejtek tolerálják, vagy a kation beáramlás eleve kisebb
mértékű/rövidebb ideig tart. Ismert, hogy a nem-neuronális sejttípusok kisebb
sűrűségben fejezik ki a sejtmembránon a TRPV1 receptort a neuronális sejtekhez
képest [15,100], hiszen ebben az esetben nem szerepük akciós potenciál generálása. Ez
magyarázhatja az agonistára való kisebb érzékenységet. Keratinocitákon végzett in
vitro vizsgálat alapján [100] az RTX citotoxikus hatása a TRPV1 receptorexpresszió
szintjétől függ. Hozzájárulhatnak az RTX differenciális hatásához a neuronális és nem-
neuronális sejttípusok közötti strukturális különbségek, ill. a receptorok eltérő
érzékenysége. A mikrotubulus rendszer és kapcsolódó intracelluláris jelátviteli
komplexek szabályozzák a TRPV1 deszenzitizáció mértékét [74]. Elképzelhető, hogy
fejlődéstanilag különböző eredetű sejtekben ez a reguláció eltérően játszódik le.
Ismert, hogy a heterológ módon kifejeztetett TRP csatornák farmakológiai
tulajdonságai eltérőek, amelyet a szignalizációs komponensek másfajta összetétele
okozhat [107]. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján a TRPV1 ioncsatornát a
külső plazmamembránban körülvevő lipid raft különböző összetétele részben felelős
lehet a kapszaicin/RTX differenciális hatásaiért szenzoros ganglionsejtekben és
transzfektált sejtvonalakban [108]. Korábban leírták, hogy a kapszaicin/RTX előkezelés
dózisfüggő módon deszenzitizálja az egér hízósejteket további vanilloid stimulustól, de
nem citotoxikus [72]. Kimutatták, hogy a patkány arteriola simaizomsejteken található
TRPV1 receptorok gyorsan (perceken belül) deszenzitizálódnak kapszaicin hatására in
vitro [109], amely behatárolja a Ca2+-toxicitás mértékét.
A fentieken túl eredményeink jól összeegyeztethetőek azon korábbi adatokkal is,
amelyek szerint a TRPV1 receptor által mediált vazodilatációs hatás megszüntethető
szisztémás kapszaicin kezeléssel, ugyanakkor a kapszaicin érösszehúzó hatása ezután is
megmarad vagy fokozódik [110]. Azóta tudjuk, hogy az érfal simaizomsejtjei
funkcionális TRPV1 receptorokat expresszálnak [55,69], így a nem-neuronális
37
ioncsatornák közvetíthetik az érösszehúzó hatásokat. Időközben igazolták, hogy
újszülött patkányokban a neuronális TRPV1 receptorokat anatómiailag és
funkcionálisan elimináló szisztémás kapszaicin kezelés (5 napon át összesen 300
mg/ttkg) nem befolyásolja a vázizom arteriolák TRPV1-et kifejező sejtjeit, azok
életképességét [109], amely összhangban van munkacsoportunk eredményeivel.
Kísérleteink másik szakaszában sebészi denervációval károsítottuk a TRPV1
receptorokat. A n. ischiadicus és n. saphenus idegek átvágása a lábon comb
magasságban a TRPV1-pozitív szenzoros idegvégződések degenerációját idézi elő [1].
Ez az eljárás csak a neuronális TRPV1 receptorokat károsítja fizikailag. Ez
magyarázhatja, hogy kísérletünkben miért maradtak épen a nem-neuronális eredetű
receptorok: hasonlóan a kémiai denerváláshoz, a sebészi denerválás sem volt hatással
a nem-neuronális Trpv1 mRNS expresszióra. Továbbá, a lábbőr minták specifikus
immunfestése szintén a TRPV1 receptorproteinek változatlan jelenlétét demonstrálja
sebészi denerválást követően keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken (talpi bőr),
és sebocitákon (lábháti bőr). A keratinocitákon található TRPV1 receptorok, hasonlóan
az idegvégződéseken jelenlévőkhöz, szöveti sérüléskor felszabaduló protonok és hő
által aktiválhatóak [64,65,111,112]. Ez azt sugallja, hogy elsődleges sejtes kémiai és
hőszenzor szerepet játszik a receptor [63]. Keratinocitákon és egyéb nem-neuronális
sejteken található TRPV1 receptorok lehetséges szerepe a gyulladásos folyamatokban
tisztázásra vár. TRPV1 stimulációja keratinocitákon prosztaglandin E2 és interleukin-8
felszabaduláshoz, megnövekedett COX-2 és mátrix metalloproteináz-1 expresszióhoz
vezet in vitro [63,65]. Az epidermális TRPV1 szerepet játszik abban a gyulladásos
válaszban, amelyet a bőrfelszín savas hámlasztása okoz [68]. Pro-inflammatorikus
mediátorok, amelyeket az epithelsejtek TRPV1 receptoraira ható káros környezeti
hatások szabadítanak fel, neurogén gyulladásos válaszhoz vezethetnek, részben a
szenzoros idegek TRPV1 csatornáinak aktiválásával/szenzitizálásával [30].
Munkacsoportunk korábban kimutatta [76] a keratinocita-TRPV1 expresszió
fokozódását egy szájüregi gyulladásos betegségben, oralis lichen planusban, amely a
fenti in vitro előzmények alapján okozati szerepet sugall ebben a kórképben. A T-
limfocitákból, amelyek TRPV1 specifikus festődését kimutattuk a szájnyálkahártyában,
38
a kapszaicin képes P-anyagot felszabadítani [71]. Nemrégiben igazolták a funkcionális
TRPV1 jelenlétét limfocitákon [62].
Következtetésként elmondhatjuk, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-
szenzitív neuronokra citotoxikus, így továbbra is a neuronális TRPV1 receptorokra
szelektív farmakológiai eszköznek tekinthetjük. Az ultrapotens kapszaicin analóg RTX
alkalmazásával kapott eredményeink alapján a primér szenzoros neuronokra szelektív
neurotoxinként alkalmazott kapszaicin nem károsítja az extraneuronális sejteket [18].
A vanilloid deszenzitizáció eliminálja a neuronális TRPV1 receptorokat. Ha megfordítjuk
a gondolatmenetet, mindez egyúttal megnyitja a lehetőséget a (kémiai denerválás
után is intakt) nem-neuronális TRPV1 receptorfunkció szelektív in vivo
tanulmányozására.
Az RTX/kapszaicin „nem specifikus”, azaz nem TRPV1 által mediált hatásait a
szervezetben több helyen leírták, a TRPV1 nem-neuronális sejteken történt
felfedezésével ezeket a vanilloid hatásokat újraértékelhetjük [15]. Jól ismert például,
hogy a TRPV1 aktiváció neurogén mechanizmusokon keresztül vazodilatációt [21], míg
bizonyos körülmények között vazokonstrikciót (mesentericus, coronaria és vázizom,
dura mater) okoz [69,103,113–115]. Ezen korábbi irodalmi adatok az érfalban
lokalizálódó TRPV1 összehúzó funkcióját sugallták, amely azóta igazolást nyert az
arteriola simaizomban [69,114] (míg az érendothelben a TRPV1 dilatációt okozó CGRP
felszabadítását mediálja [13]). Eredményeink alapján feltételezzük továbbá, hogy a
kapszaicin/RTX deszenzitizáción alapuló terápiák nem károsítják az extraneuronális
TRPV1 receptorokat, ill. az azokat kifejező sejteket (25. ábra, 39. old.).
39
25. ábra
Eredményeink összefoglalása.
40
IV. A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a
kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban
Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Martin Steinhoff, Baba Akemichi, Reglődi Dóra, Bíró Tamás Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1-mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban.
1. Irodalmi háttér, előzmények
A PACAP és más neuropeptidek kolokalizációját RT-PCR-ral és immunhisztokémiával
kimutatták kapszaicin-szenzitív neuronok sejttestében és végződéseiben [116–120].
Munkacsoportunk a közelmúltban bizonyította, hogy a PACAP-38 felszabadul in vitro a
kapszaicin-érzékeny afferensek stimulált perifériás végződéseiből [121] és in vivo a
szisztémás keringésbe [93]. A PACAP emberi bőrben való lokalizációját leírták a
dermális-epidermális határhoz közeli dermális idegrostokban, szőrtüszőkben,
véredényekben, és izzadságmirigyekben [78]. Továbbá, a nagy affinitással bíró PAC1
receptort (9. ábra, 18. old) is kimutatták. Kifejezett PACAP és PAC1 upregulációt
figyeltek meg psoriasisos betegekben, amely a PACAP szerepére utal a bőr gyulladásos
folyamataiban [122].
A számos vizsgálat ellenére, amely a PACAP gátló hatását mutatta ki sejtes gyulladásos
és immunválaszokra [123–128], viszonylag keveset tudunk a gyulladás neurogén
komponensére kifejtett hatásairól. Munkacsoportunk kimutatta korábban, hogy
exogén PACAP bejuttatása gátolja a szenzoros neuropeptidek felszabadulását és az ezt
követő akut neurogén gyulladást [93,121]. A PACAP-hiányos egerekkel végzett
vizsgálatok segítségével feltárhatóak az endogén PACAP funkciói gyulladásos
reakciókban in vivo. Néhány vizsgálat megnövekedett gyulladásos választ mutatott
PACAP génhiányos egerekben kiváltott colitis, autoimmun encephalomyelitis, légúti és
idegi gyulladás [88,129–134], továbbá allergiás kontakt dermatitisz modelljeiben [94].
41
2. Célkitűzések
Mivel korábban nem volt irodalomi adat a PACAP expresszióra, annak gyulladásban
bekövetkező változására és szerepére egér bőrben, a jelenlegi vizsgálat célja volt
ezekre választ keresni radioimmunassay és molekuláris biológiai módszerekkel. A
TRPV1 és a PACAP közötti lehetséges közvetlen kapcsolat vizsgálatára funkcionális
teszteket végeztünk génhiányos egereken két akut in vivo bőrgyulladás modellben,
amelyek mechanizmusa elkülöníthetően neurogén, ill. nem neurogén.
3. Anyagok és módszerek
Reagensek, vegyszerek
PACAP-38, kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-nonenamid), CFA és etidium bromid a Sigma
(USA), az etanol és a Tween 80 a Reanal (Budapest) gyártmánya. A molekuláris
biológiai vizsgálatokhoz a TRIzol és a primerek az Invitrogentől kerültek beszerzésre
(Invitrogen, Egyesült Királyság), az AMV reverz transzkriptáz a Promegától (USA), a
Thermal Cycler az Applied Biosystemstől (USA). A kapszaicint 10% etanol, 10% Tween
80 és 80% sóoldatban (0,9% NaCl) oldottuk fel 10 mg/ml törzsoldatba, amit tovább
higítottunk sóoldattal. A PACAP-38 antiszérum Prof. A. Arimura (Tulane University,
New Orleans, USA) nagylelkű ajándéka volt.
Kísérleti állatok
Kísérleteinket hím CD1 egereken (25-35g) végeztük, amelyeket a PTE ÁOK
Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Állatházában 24-25°C-on tartottunk, normál
élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. A kísérletek egy része során a CD1 törzsből
létrehozott PACAP génhiányos egereket [135] használtuk fel a kapszaicin és CFA-
kiváltotta lábduzzadás vizsgálatára, az endogén PACAP szerepének feltárására. A
TRPV1 receptor génhiányos egereket (Trpv1 KO) és C57Bl/6 vad típusú megfelelőiket a
Jackson Laboratories-tól szereztük be, a Charles-River Hungary Kft.-én keresztül. Az
altatást ketamin-xilazinnal (100 mg/kg ketamin i.p., Richter Gedeon NyRt., Budapest; 5
mg/kg xilazin i.p., Eurovet Animal Health BV, Hollandia) végeztük, majd a gerincvelő
megszakításával leöltük az állatokat és kimetszettük a bőrmintákat. A szövetmintákat
42
három darabra vágtuk, az egyik RNAlater (Sigma-Aldrich Kft., Budapest) folyadékba
került molekuláris biológiai vizsgálatokra, egy másikat lefagyasztottunk -20˚C-on
radioimmunassay mérésekhez, a fennmaradó részt formaldehidben fixáltuk.
Akut gyulladás kiváltása
Neurogén, ill. vegyes típusú gyulladásos reakciót váltottunk ki 50 μl kapszaicin (100
μg/ml, Sigma, USA) intraplantáris injekciójával, ill. teljes Freund-adjuvánssal (complete
Freund’s adjuvant: CFA; elölt Mycobacterium tuberculosis szuszpenziója
paraffinolajban; 50 μl, 1 mg/ml) a bal hátsó lábba. A megfelelő oldószer azonos
térfogata került befecskendezésre az ellenoldali lábba. Az egereket mélyaltatásban
kivéreztettük 24 órával a kapszaicin vagy CFA adása után. A hátsó lábból származó talpi
és lábháti, valamint háti bőrdarabokat, ill. kontrollként fül, agyalapi mirigy és
hipotalamusz szövetmintákat kettévágtuk a PCR és RIA mérésekhez (lásd lentebb) (26.
ábra). A kapszaicin és CFA által kiváltott lábduzzadás mértékének meghatározására a
láb térfogatát pletizmométer segítségével mértük meg (Ugo Basile Type 7140,
Comerio, Olaszország), a gyulladás kiváltása előtt és utána többször. Az ödémát a
kezdeti kontroll %-ában fejeztük ki (n=6-8 csoportonként) [136].
26. ábra
Kísérleti elrendezés.
43
Radioimmunassay
A PACAP-38-szerű immunreaktivitás (PACAP-38-LI) meghatározása egy specifikus és
érzékeny RIA technikával történt laboratóriumunkban [137]. A PACAP-24-38
peptidszármazékot a Szegedi Tudományegyetem Orvosi Vegytani Intézetében
szintetizálták. A „88111-3” PACAP-38 antiszérumot nyúlban termeltették, amelyhez
szintetikus peptideket konjugáltak szarvasmarha szérum albuminhoz vagy
tiroglobulinhoz, glutáraldehiddel vagy carbodiimiddel. Az így nyert antitest
nagymértékű specificitását és a C-terminálisára való érzékenységét keresztreakciós
vizsgálatokkal igazolták. Az antitest sem a PACAP-27-tel, sem más neuropeptiddel (VIP,
glukagon, szekretin) nem adott keresztreakciót [137].
A kimetszett bőrminták tömegét lemértük, és steril foszfát-pufferelt fiziológiás
sóoldatban (PBS) homogenizáltuk. 2 centrifugálást követően (4000 rpm, 10 perc, 4C,
majd 10000 rpm, 10 perc, 4C) történt a RIA meghatározás.
A PACAP 24-38 peptidszármazék 125I jódizotóppal való jelölését saját
laboratóriumunkban végeztük. A kalibrációs görbe elkészítéséhez szintetikus peptidet
használtunk, melyet 0-10000 fmol/ml koncentrációban mértünk az inkubációs
oldatokba. Az assay-t 1 ml 0,05 mol/l (pH 7,4) foszfátpufferben mértük össze, amely
0,1 mol/l nátrium-kloridot, 0,25 % (w/v) szarvasmarha szérum albumint (BSA) és 0,05
% (w/v) nátrium azidot tartalmazott. Az antiszérumot (100 μl, 1:10000 hígitás), a RIA
jelölőt (tracer) (100 μl 3000 cpm/cső) és a standardet (100 μl) vagy az ismeretlen
mintát, valamint az assay puffert polipropilén csövekbe mértük.
4°C-on 48-72 óráig történt inkubáció után az antitesthez kötött jelölt peptidet
tartalmazó frakciót elválasztottuk a szabad jelölt peptidektől olyan módon, hogy
csövenként 100 μl szeparálószuszpenziót (10 g mosott szén, 1 g dextrán, és 0,2 g
zsírmentes tejpor 100 ml desztillált vízben) mértünk hozzá. A mintákat 4°C-on 20
percig 3000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót óvatosan leöntöttük. A szénhez
kötött szabad peptidfrakció radioaktivitását NZ310 típusú gamma számlálóval mértük.
Ebből következtettünk az ellenanyaghoz kötött radioaktivitás értékére, majd a
kalibrációs görbéről leolvastuk az ismeretlen minta neuropeptid koncentrációját.
44
A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben
A PACAP (Adcyap1) és a PAC1 receptor (Adcyap1r1) mRNS-t szemikvantitatív reverz
transzkripciós (RT) PCR-ral határoztuk meg kapszaicin és CFA-kezelt egerekből
származó szövetmintában [104,138]. Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml
TRI reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk
és a gyártó utasításainak megfeleően totál RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS
mennyiségét és tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop
Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1
mikrogramm total RNS-t írtunk át reverz transzkripcióval cDNS-re a 15 U oAMV reverz
transzkriptáz enzimmel és 0,025 μg/μl random hexamer primerekkel. Ezt követte a PCR
amplifikáció (95 °C 2 perc, 35 ciklus: 94 °C 1 perc; 61,5 °C PACAP (Adcyap1) 1 perc /
62,5 °C PAC1 (Adcyap1r1) 90 s / 55,5 °C Gapdh 60 s, 72 °C 1 perc; 72°C 2 perc)
GeneAmp PCR System 2400 DNA Thermal Cycler készüléken. Primerek: PACAP
(Adcyap1) F 5’-GGGGCAAGTCTAGCTCCTCT-3’, R 5’-GGGTCTCCAGAAAATCCACA-3’;
PAC1 receptor (Adcyap1r1) F 5’-AGGCAATGAGTCGAGCATCT-3’, R 5’-
GTCTTTCCCTCTTGCTGACG-3’; Gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh), F: 5’-
ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’; R: 5’-GCTGACAATCTTGAGGGAGT-3’. A PCR
termékeket 1,5 %-os agaróz gélen detektáltuk etidium bromid nukleinsav festékkel (0,5
mg/ml), UV-fény alatt.
Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok
A talpi bőrszövet mintákat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd 0,1 M PBS-be
helyztük szobahőmérsékleten 1 órára, majd sorozatmetszeteket készítettünk.
Hematoxilin-eozin festést alkalmaztunk a rutin morfológiai vizsgálathoz. Az
immunhisztokémiai analízishez a mintákat PBS-ben öblítettük, permeabilizáltuk PBS-
ben oldott 0,1% Triton X-100-ban 5 percig, majd 0,1% BSA, 1% normal goat serum és
0,1% Na-azid PBS oldatában inkubáltuk, hogy a nem specifikus jelölést minimalizáljuk.
A metszeteket szobahőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át nyúlban termeltetett
anti-PAC1 antitesttel (1:100, Prof. Seiji Shioda nagylelkű ajándéka). PBS-ben történő
többszöri mosás után a metszeteket két órán keresztül sötétben inkubáltuk a
megfelelő Alexa Fluor ‘‘568’’ másodlagos antitesttel, amelyet szintén nyúlban
45
terneltettek (1:1000, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). A metszeteket PBS-ben
mostuk, Fluoromount-G-vel (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) rögzítettük őket.
Kontrollként az elsődleges antitest elhagyása szolgált, ebben az esetben nem
tapasztaltunk specifikus festődést a metszeteken. Digitális fényképeket készítettünk
egy CCD kamerával felszerelt Nikon Eclipse 80i mikroszkóp és a Spot software package
segítségével.
A szemikvantitatív immunfluoreszcencia meghatározásához a PAC1 intenzitást ImageJ
1.440 szofverrel mértük, az expresszió szintjét korrigáltuk a szöveti háttérrel. A
különböző csoportok közötti intenzitás összehasonlítására standardizáltuk a
paraméreket: minden egyes metszetet azonos körülmények között analizáltunk (a
felvétel időtartama, azonos beállítások, unit range: 250x250 pixel, metszetenként 10
mérés átlaga).
Statisztika
A PACAP-IR és mRNS adatok statisztikai elemzése Mann-Whitney U próbával történt. A
gyulladásos kísérletekből (ödémakeletkezés, PAC1 immunreaktivitás) származó adatok
elemzése ANOVA-val és Bonferroni post hoc teszttel történt. p<0,05-t fogadtunk el
szignifikánsnak minden esetben.
46
Háti bőr Talpi bőr Lábháti bőr Fül
4. Eredmények
A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben
Nem volt korábban irodalmi adat a PACAP és specifikus receptora, a PAC1
expressziójára egér bőrben. Ezért kísérleteinket ezek kimutatásával kezdtük. A PACAP-
38 immunreaktivitás (IR) radioimmunassay által megbízhatóan mérhető mennyiségben
van jelen a különböző egér bőrminták homogenizátumában (27. ábra). A
koncentrációja hasonló volt (20 és 25 fmol/mg nedves szövet) a talpi és lábháti bőrben
és a fülben. Ezzel ellentétben a PACAP-IR kifejezetten kisebb mintegy 7-8 fmol/mg volt
a háti bőrben.
27. ábra
PACAP-38 immunreaktivitás (PACAP-38-IR) radioimmunassay módszerrel történt
meghatározása különböző egér bőrterületekből származó homogenizátumokban.
47
28. ábra
(A) PACAP (Adcyap1) és (B)
PAC1 receptor (Adcyap1r1)
génexpresszió Gapdh
referenciagén arányában
különböző bőrrégiókban,
gél alapú PCR
denzitometriás értékelése
alapján. OD: optikai
denzitás. A hipofízis (PG) és
a hipotalamusz (HT)
szolgáltak pozitív
kontrollként. n=4-5 egér
csoportonként. Átlag ±
SEM.
A PACAP-IR jelenléte mellett a peptid a bőrben mRNS szinten is kimutatható volt (28.
ábra A). A Gapdh referenciagénhez képest számított relatív expressziója hasonló volt a
vizsgált bőrrégiókban. Ugyanakkor a háti bőrben mért PACAP mRNS expresszió nem
szignifikáns mértékben, de kisebb volt, mint más bőrterületeken, ellentétben a
peptidszinten mért eredménnyel. A PACAP mRNS szintje mintegy 4-5 ször nagyobb volt
a pozitív kontrollként használt hipotalamuszban és az agyalapi mirigyben.
A PACAP specifikus receptora, a PAC1 szintén kimutatható volt az egér bőrben (28.
ábra B). A PACAP-hoz hasonlóan, a PAC1 (Adcyap1r1) specifikus mRNS viszonylag
állandó expressziót mutatott a különböző bőrterületeken. Ezen felül a specifikus PAC1-
IR kimutatható volt a talpbőr papilláris rétegében (27. ábra, 50. old.), ahol a
felszínközeli erek és a hő-, fájdalom- és tapintási ingert felfogó szenzoros
idegvégződések találhatóak [139].
48
Kapszaicin CFA
Nem gyulladt Gyulladt Nem gyulladt Gyulladt
A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására
A következő lépésben meghatároztuk, hogy a neurogén (talpbőrbe adott kapszaicin
injekcióval kiváltott) vagy a túlnyomórészt nem neurogén (CFA-val kiváltott) gyulladás
befolyásolja-e a PACAP és a PAC1 receptor expresszióját. A kapszaicin szignifikáns,
több, mint kétszeres PACAP-38-IR növekedést idézett elő a talpi bőrben 24 órával a
beadása után, míg a kontralaterális, nem gyulladt oldalon nem volt változás. Ezzel
ellentétben a láb talpi felszínbe adott CFA injekció nem befolyásolta a PACAP-IR-t (29.
ábra).
29. ábra
PACAP-immunreaktivitás (PACAP-IR) radioimmunassay módszerrel történt
meghatározása gyulladt és nem gyulladt egér talpi bőrmintákban 24 órával a gyulladás
kiváltása után. A neurogén gyulladást intraplantáris kapszaicin injekcióval váltottuk ki,
míg a túlnyomórészt nem-neurogén gyulladást CFA adásával. A kontralaterális oldali
lábakat a megfelelő oldószerrel kezeltük. Átlag ± SEM, n=5-6 egér. *p<0,05 Mann-
Whitney U próba vs. megfelelő nem gyulladt minta.
49
30. ábra
(A) PACAP (Adycap1) és (B)
PAC1 (Adycap1r1) specifikus
mRNS transzkriptumok
gyulladt és nem gyulladt
egér talpi bőrben 24 órával
az intraplantáris kapszaicin
(Kap) vagy CFA injekció után.
A kontralaterális talp bőrét a
megfelelő oldószerrel
kezeltük, továbbá
kontrollként szolgált a nem
kezelt dorzális lábbőr. n=5
egér/csoport. Átlag ± SEM
relatív expresszió értékeket a
Gapdh arányában fejeztük ki.
*p<0,05 Mann-Whitney U
próba.
Az előbbi adatokkal összhangban a PACAP mRNS expresszió a gyulladt talpi bőrben
szintén szignifikánsan magasabb volt 24 órával a kapszaicinkezelés után, míg a CFA
injekciót követően nem mutatott változást (30. ábra A). Ehhez hasonlóan a PAC1
receptor mRNS szintén upregulálódott a kapszaicinre, de nem a CFA-ra adott
válaszként (30. ábra). Öszehasonlításként, a lábháti bőrben a PACAP és PAC1 receptor
mRNS változatlan maradt talpi bőr gyulladása esetén (30. ábra A, B).
50
31. ábra
A PAC1 receptorfehérje immunlokalizációja a talpi bőrben. A bal oldali panelek DAB
festéssel előhívott (A) kis nagyítású (lépték: 20 μm) és (B) nagy nagyítású. Az A panel
belső fotója a negatív kontrollt mutatja a PAC1 antitest blokkoló peptiddel való
inkubálás után végzett immunjelöléssel. A (C) panel PAC1 expresszió kvantitatív
értékelését mutatja az immunfluoreszcens metszeteken. A bőrgyulladást kapszaicinnel
(Kap.) vagy CFA adásával váltottuk ki vad típusú vagy PACAP (Adycap1) génhiányos
egerekben, kontrollként a megfelelő oldószer szolgált. n=6 egér/csoport, több
metszet/egér, átlag ± SEM (unit range: 250x250 pixel, 10 mérés/metszet átlaga).
Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc próba.
A PCR eredményekkel összhangban az immunhisztokémiai eredmények is azt mutatják,
hogy vad típusú egerekben a kapszaicin kiváltotta talpi bőrduzzadás hatására
jelentősen megnövekedett a PAC1 receptorfehérje jelenléte (31. ábra). Érdekes
módon, a RT-PCR eredményekkel ellentétben, a CFA kezelés szintén megnövelte a
PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest (31. ábra C).
51
PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására
Ezek után a kapszaicin feltételezett hatásmechanimusát vizsgáltuk PACAP és Trpv1
génhiányos egerek segítségével. Mind CD1, amelyen a PACAP hiányos egerek
alapulnak, mind C57Bl/6 vad típusú egerekben a potens és szelektív TRPV1 receptor
agonista kapszaicin jelentős mértékű lábduzzadást váltott ki (32. ábra A, B).
32. ábra
Intraplantáris kapszaicin (A, B) vagy CFA (C, D) adásával PACAP (Adycap) és TRPV1
génhiányos egerekben, és a megfelelő vad genotípusú (CD1, C57Bl/6)
alomtestvéreikben kiváltott gyulladás során a lábduzzadás dinamikája. A hátsó láb
pletizmométerrel mért térfogatnövekedése a gyulladás kiváltása előtti kiindulási érték
%-ában. Átlag ± SEM, n=5-6 egér/csoport; **p<0.01 ***p<0.001 vs. WT; egyutas
ANOVA és Bonferroni post hoc próba.
52
A gyulladásos válasz a maximumát (25-30%) 2 órával az intraplantáris injekció után
érte el. Az ödéma fokozatosan 5-10%-ára csökkent az intraplantáris injekciót követő 24
órában (32. ábra A, B). PACAP-hiányos állatokban ez a kapszaicin által kiváltott akut
(túlnyomórészt neurogén) ödémakeletkezés szignifikánsan kisebb volt a kísérlet teljes
ideje alatt (32. ábra A). A várakozásoknak megfelelően a kapszaicin nem váltott ki
jelenős lábduzzadást Trpv1 KO egerekben (32. ábra B).
Intraplantáris CFA adása szintén a láb duzzadását eredményezte. A kinetikát tekintve a
lábduzzadás szignifikáns szintet (a kiindulási értékhez képest 25-35 %-os emelkedést)
ért el két órával az injekció beadása után, stabil maradt 6 órán keresztül, majd újra
emelkedett 45-55%-ra a 24 órás mérési pontnál, mindkét vad típusú törzsben (32. ábra
A, B). Fontos kiemelni, hogy a kapszaicinnel kiváltott válasszal ellentétben, nem volt
különbség a CFA-kiváltotta ödéma között sem a PACAP (Adcyap1), sem a Trpv1
génhiányos egerekben a megfelelő vad típusú csoportokhoz képest (32. ábra C, D).
5. Megbeszélés, következtetések
Eredményeink szolgáltatják az első bizonyítékot, hogy a PACAP-IR kimutatható az egér
bőr különböző területein. A koncentrációja viszonylag hasonló a lábháti és talpi
bőrben, valamint a fülben, míg a háti bőrben gyengébb PACAP-IR van jelen. A PACAP a
peptid jelenléte mellett mRNS szinten is kimutatható volt ezekben a bőrterületeken. A
Gapdh referenciagénhez képest közel azonos az expressziója a dorzális és plantáris
lábbőrben, és a fülben. A PACAP (Adcyap1) mRNS kismértékben, de nem szignifikánsan
kisebb a háti bőrben. A PACAP jelenlétét kimutatták korábban szenzoros idegekben
[140,141], szőrtüszőkben, vérerekben, verejtékmirigyekben [122], továbbá gyulladásos
sejtekben is [78]. A peptid jelentős mRNS szintű expressziója a bőrben arra utal, hogy
szintézise nem-neuronális sejtekben is végbemegy. A háti bőrben mérhető kisebb,
fmol/mg nedves szövettömegre számított PACAP-IR expresszió azzal magyarázható,
hogy a terület kevésbé beidegzett szenzoros idegekkel, ezáltal kevesebb neuronális
eredetű PACAP-ot tartalmaz, de a bőrszövet nagyobb vastagsága és az eltérő
szerkezete is szerepet játszhat.
53
A PACAP szignifikáns upregulációja megfigyelhető volt a talpi bőrben mind peptid,
mind mRNS szinten a kapszaicin adása után 24 órával. A kapszaicin szelektíven aktiválja
a TRPV1 ioncsatornát, amelyet nem csak szenzoros idegvégződéseken, hanem pl.
dendritikus sejteken és sebocitákon is leírtak a bőrben [142,143]. A TRPV1 aktiváció
hatására megnövekedett PACAP expresszió magyarázható a kapszaicin közvetlen
hatásával az extraneuronális TRPV1 receptorokra vagy a szenzoros idegekből
felszabaduló gyulladásos mediátorok közvetett hatásával. A P-anyagról és a CGRP-ről
kimutatták, hogy képesek stimulálni ezeket az epitheliális és gyulladásos sejteket, így
ezek potenciálisan megnövelhetik a PACAP szintézist bennük. Munkacsoportunk
korábban igazolta, hogy in vivo körülmények között a PACAP-38 a bőrben kapszaicin-
érzékeny rostokból felszabadul szisztémás TRPV1 aktiváció hatására [93]. Hasonlóan
kimutatta csoportunk a PACAP felszabadulását ezekből az afferensekből elektromos és
kémiai stimuláció hatására in vitro is [121]. Noha a szenzoros eredetű PACAP
hozzájárulhat a gyulladt bőrszövet-homogenizátumokban mért emelkedett
immunreaktivitáshoz, az mRNS szint esetében ezt nem tekintjük számbavehető
mértékű tényezőnek.
A kapszaicin-kiváltotta PACAP növekedéssel ellentétben, a CFA injekció nem
változtatta meg sem a peptid-IR, sem az mRNS koncentrációt. A CFA kezelés
megnövelte a PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest
az mRNS eredményekkel ellentétben. E mögött állhatnak poszttranszkripciós
mechanizmusok: elképzelhető a receptor mRNS megnövekedett féléletideje.
A kapszaicin akut, tisztán neurogén gyulladást vált ki nociceptív szenzoros idegrostok
egy alpopulációja aktiválásával a TRPV1 receptoron keresztül, amely során vazoaktív
neuropeptidek szabadulnak fel [19,20,144,145], köztük PACAP is. Ugyanakkor a CFA
krónikus, túlnyomórészt nem neurogén típusú gyulladásos választ idéz elő a
veleszületett immunrendszer, makrofágok, T-sejtek aktiválásával, amely sejtes
beszűrődéshez vezet. Mindebben a szenzoros elemek csak későbbi fázisban jutnak
szerephez [146,147].
A specifikus PACAP receptor PAC1 expressziója párhuzamosan változott a PACAP-pal,
amely azt jelezheti, hogy a receptor a peptid gyulladásos hatásait közvetíti.
54
A PACAP génhiányos egerekkel kapott eredményeink a lokálisan megemelkedett
PACAP in vivo funkcionális jelentőségét is feltárták akut vaszkuláris gyulladásos
válaszokban. A lokális, endogén PACAP potens gyulladáskeltő mediátornak bizonyult,
amely növeli az ödémaképződést neurogén, és nem nem-neurogén
mechanizmusoknak köszönhetően. A hátsó lábba intradermálisan beadott PACAP
extravazációt kiváltó hatását szintén leírták [95].
Ezzel ellentétben munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy i.p. injektált, alacsony
dózisú PACAP-38 peptid gátolja a TRPV1 vagy TRPA1 agonisták által kiváltott akut
neurogén plazma extravazációt vagy a carragenin által kiváltott “vegyes típusú”
gyulladást a patkány hátsó láb talpi bőrében [93,121]. Ez a gátló hatás a P-anyag és
CGRP szenzoros rostokból, valamint további gyulladásos mediátoroknak a szimpatikus
rostokból vagy sejtes forrásokból való felszabadulásának gátlásával indokolható.
Továbbá a PACAP közvetlen gátló hatása a vaszkuláris endotéliumra szintén
feltételezhető. Ezt a lehetőséget erősíti meg a PAC1 receptorok jelenléte
endothelsejteken [148], de számos adat arra utal, hogy a PACAP az érsimaizmot képest
ellazítani [120,149], függetlenül az endotheliumtól.
Ezen adatok alapján az endogén PACAP az akut neurogén ödéma előidézésével a
bőrben a gyulladás irányába hat, pro-inflammatorikus szerepű, míg az exogén peptid
gátló hatású a szenzoros neuronokból felszabaduló neuropeptidek szintjére [93,121].
Az utóbbi hatás nem az ismert PACAP receptorokon keresztül mediálódhat, mivel azok
az idegvégződésekre stimuláló hatású jelátviteli folyamatokat közvetítenek.
Magyarázatként ettől eltérő gátló hatású mechanizmusok és célpontok szolgálhatnak,
a szenzoros rostokon eddig nem azonosított receptor- vagy splice variánson keresztül.
Összegezve, bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin
közvetítette upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. PACAP-
hiányos egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a peptid a
TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora (33.
ábra, 55. old.).
55
[107–109,
138–140]
33. ábra
Eredményeink összefoglalása.
56
V. A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben
Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29.; DOI: 10.1371/journal.pone.0108164
1. Irodalmi háttér, előzmények
A gyulladásos bélbetegségek (inflammatory bowel diseases, IBD) a bélrendszer
leggyakrabban előforduló krónikus gyulladásos rendellenességeit foglalja magába.
Közéjük tartozik a colitis ulcerosa (UC) és a Crohn-betegség. A UC csak a vastagbelet
érinti, míg a Crohn-betegségben az egész gasztrointesztinális traktust érintheti a
krónikusan fennálló gyulladt állapot, de leggyakrabban a vékonybél disztális szakasza, a
csípőbél és a vastagbél érintett. Az IBD fő klinikai tünetei a hasi fájdalom, hasmenés,
gasztrointesztinális vérzés és testúlycsökkenés [150]. A dextrán nátrium-szulfát sója
(DSS) által kiváltott egér colitis az egyik leggyakrabban alkalmazott, nem genetikai IBD
modell. A DSS kémiai úton károsítja a bélnyálkahártyát (epitheliális barriert),
vastagbélgyulladást és fekélyesedést idéz elő, amely a nyálkahártyában a Lieberkühn-
féle kripták progresszív elvesztéséhez, a béllumen baktériumösszetételének
megváltozásához, valamint a gyulladásos sejtek aktiválásához vezetnek [151,152].
Az IBD az emésztőrendszer fájdalmas és az életminőséget jelentősen rontó, akár
életveszélyes betegségévé válhat. Az elérhető immunszupresszív terápiák komoly
mellékhatásokkal járhatnak, és a betegek egy csoportja visszaeső vagy kiújuló
betegségtől szenvednek. Mindezek hajtóerőt jelentenek, hogy megértsük az összetett
kórélettani mechanizmusokat, kulcsmediátorokat azonosítsunk, és új terápiás
célpontokat találjunk [153].
A kapszaicin-érzékeny idegrostok [18,154] az emésztőcsatornát is sűrűn beidegzik
[155,156]. Itt is peptid transzmitterek, pl. P-anyag, NKA, CGRP szabadul fel ezekből a
rostokból a TRPV1 aktiválás hatására [157]. A TRPV1-et kifejező, extrinsic (külső úton
beidegző) szenzoros neuronok szerepet játszanak a bélgyulladásban, azonban ennek
iránya ellentmondásos az IBD patogenezisében [158–165]. Az emésztőtraktusban a
57
TRPA1 különböző rendszerekben fordul elő: extrinsic elsődleges afferens neuronok,
intrinsic enterikus neuronok, ill. a nyálkahártya endokrin és epithelsejtjei [34,155,156].
A TRPA1 a béllumeben környezeti kemoszenzorként működik, és gasztrointesztinális
funkciókat modulál: fájdalomérzékelés, gyomortónus, a fűszeres ételek által kiváltott
telítettségérzés, motilitás és szekréció [34].
A TRPA1-aktiváció gyulladásos neuropeptidek felszabadulásához vezet (tachykininek:
P-anyag, NKA; CGRP) a szenzoros idegvégződésekből [166] és neurogén gyulladást
váltanak ki, amelyet vazodilatációt és plazma extravazációt követő ödéma, leukocita
aktiváció és migráció jellemez [17,18,167]. A trinitro-benzol-szulfonsav (TNBS) vagy
dextrán-nátrium-szulfát (DSS) vastagbélbe juttatása súlyos colitist vált ki, neurogén
komponenssel: CGRP és P-anyag szabadul fel az extrinsic szenzoros neuronokból [168–
170]. A CGRP szerepe protektívnek bizonyult vastagbélgyulladásban [168,169].
Irodalmi adatok szerint a P-anyag colitist kiváltó és fenntartó szerepű a DSS modellben,
valamint colitis ulcerosában szenvedő betegekben [168,171,172]. A P-anyag NK1
receptora upregulálódott a vastagbélben rágcsálókban kiváltott colitisben és IBD-ben
szenvedő emberekben [170,173,174]. Kutatócsoportunk kimutatta korábban, hogy az
NK1 receptor farmakológiai gátlása és a receptorgén hiánya egyaránt enyhítette az
egérben kiváltott vastagbélgyulladást [173].
A TRPA1 aktiváció P-anyag felszabadulást idéz elő, ugyanakkor a receptor IBD-ben
betöltött szerepe össszetett [175]. A TRPA1 irodalma colitis egérmodellben
ellentmondásos, egyaránt leírták gyulladáskeltő, gyulladáscsökkentő vagy hatás nélküli
szerepét is [168,176–178]. Munkacsoportunk kimutatta a 90-es években, hogy a
szenzoros TRPA1 aktivációja gyulladáscsökkentő peptidek, pl. szomatosztatin
felszabadulásához vezet, amely egy ellenregulációs „szenzokrin” hatást vált ki
[179,180]. A téma összetettségéhez hozzájárul, hogy a nem-neuronális TRPA1
csatornák élettani szerepét még nem ismerjük [13].
58
2. Célkitűzések
A jelen vizsgálat céljai a következők voltak:
1. A lokális neuronális és nem-neuronális TRPA1 mRNS és fehérjeexpresszió vizsgálata
a TRPV1-gyel összehasonlításban az ép és gyulladt egér disztális vastagbélben, továbbá
IBD-s betegek biopsziás mintáiban.
2. A TRPA1 szerepének vizsgálata receptor génhiányos egerekben DSS-sel kiváltott
vastagbélgyulladásban és a receptor által mediált citokin, neuropeptid és neuropeptid
receptor változások elemzése. A DSS által kiváltott egér colitis összevetése a humán
adatokkal , eredményeink transzlációs relevanciájának kiderítése érdekében.
3. Anyagok és módszerek
Kísérleti állatok
A 10 napos DSS kezelést hím, Trpa1 génhiányos (knock-out, KO) egereken [181]
hajtottuk végre, amelyek 8-10 generációra visszakeresztezésre kerültek C57BL/6
egerekkel, valamint azok vad típusú (wildtype, WT) megfelelőin. Az eredeti
heterozigóta (Trpa1+/-) tenyészpárokat Pierangelo Geppetti (Firenzei Egyetem)
bocsájtotta rendelkezésünkre. A Trpa1 WT és Trpa1 KO vonalakat külön tenyésztettük
tovább a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének Állatházában, 24–25
˚C-on, standard egértáppal és víz ad libitum fogyasztásával, 12 órás sötét ciklus alatt. A
kísérleti egerek 8-10 hetesek és 22-25 g közötti tömegűek voltak. Az eredeti Trpa1+/-
egerek utódjainak tenyészete, továbbá a kísérletek során használt egerek
genotipizálása PCR módszerrel történt [182].
59
Klinikai minták
A vastagbél biopsziás mintavétel a PTE Klinikai Központ I.sz. Belgyógyászati Klinikán
három betegcsoportból történt: 1. nem gyulladásos bélbetegség vagy szűrővizsgálatra
érkezett egyén (n=5); 2. vastagbél tumor (polypus coli, adenocarcinoma, n=8); 3. colitis
ulcerosa vagy Crohn betegség (n=10). A mintákat RNALater (Sigma-Aldrich Ltd,
Budapest) folyadékban tároltuk -80˚C-on a qPCR vizsgálatokhoz. Az immunhisztokémiai
mintákat formaldehidben tároltuk.
Egér DSS colitis modell
Krónikus vastagbélgyulladást (colitis) váltottunk ki WT és Trpa1 KO hím egerek
ivóvízébe 10 napon keresztül adagolt 2% dextrán-szulfáttal (DSS, MP Biochemical) (34.
ábra, 60. old.). A vad és KO állatokat véletlenszerűen osztottuk be egy csapvizet ivó
kontrollcsoportra (1-1 kontrollcsoport/genotípus, n=5/csoport) és DSS-t kapó
csoportokra (n=9 WT és n=9 KO). 3-3 vad és génhiányos egeret választottunk ki
véletlenszerűen a DSS-kezelés 3., 7. és 10. napján, amelyet előző éjjeli ételmegvonás
után, ketamin-xilazin mélyaltatásban (100 mg/kg ketamin i.p.; Richter Gedeon NyRt, 5
mg/kg xilazin i.p.; Eurovet Animal Health BV, Hollandia) leöltünk. A vastagbél disztális
harmadát kimetszettük a további vizsgálatok céljára [158,173].
60
34. ábra
Kísérleti elrendezés. PFA: paraformaldehid.
Betegségaktivitási Index meghatározása
A colitis klinikai tünetei (testtömeg-változás, székletkonzisztencia, széklet vértartalma)
a kezelés 1-10. napján pontozásra került. A széklet vértartalmát Hemocare teszttel
(Care Diagnostica, Ausztria) határoztuk meg. A 3 paraméter pontszámait átlagoltuk az
egyes egerek esetében, amellyel megkaptuk a Betegségaktivitási Indexet (Disease
Activity Index, DAI) [173] (1. táblázat, 61. old.).
61
Pont 0 1 2 3 4
Testtömeg-
csökkenés
0-0.9% 1-5% 5.1-10% 10.1-20% >20.1%
Széklet
vértartalma
(Hemocare test)
negatív világoskék
festődés
kék festődés véres
foltok/kék
festődés
teljesen
véres
Széklet
konzisztencia
normális normális/puha puha puha/vizes vizes
1. táblázat
Betegségaktivitási index számítási módja.
Szövettani elemzés
A disztális vastagbél-mintákat 40 mg/ml pufferelt formaldehidben fixáltuk,
metszeteket készítettünk (5 µm), majd hematoxilin-eozin festést végeztünk. Digitális
mikrofotókat készítettünk Olympus BX51 mikroszkóp és Olympus DP50 fényképezőgép
segítségével. A gyulladásos elváltozásokat patológus szakértő értékelte és pontozta
[173], aki nem vett részt a kísérletben (2. táblázat, 62. old.).
62
Pont 0 1 2 3 4
Gyulladás
súlyossága normális enyhe közepes súlyos -
Bélkripták
károsodása ép
egyharmad
arány
kétharmad
arány
kripták
eltűntek
mucosa
eltűnt
Gyulladás
kiterjedése
nem
gyulladt csak mucosa submucosa teljes bélfal -
Károsodott
terület aránya 0% 1-25% 26-50% 51-75% 76-100%
2. táblázat
A szövettani pontozás szempontjai.
Immunhisztokémia
Az immunhisztokémiai jelölést paraffinba ágyazott metszeteken végeztük. A
deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk
mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigénfeltárás céljából. A szövetek
endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való
inkubációval gátoltuk. A másodlagos antitest nem specifikus kötődését
megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután
a metszeteket poliklonális elsődleges antitesttel inkubáltuk 1 órán át: egér anti-CD68
(KP1) antitest: ab125212 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) 1:300 hígításban;
egér és humán TRPA1 antitest: ab68847 1:300 hígításban, a specificitását teszteltük az
immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab150297, 1:100 hígításban, Abcam,
Cambridge, Egyesült Királyság); egér TRPV1 antitest ab74813 1:300 hígításban, a
specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab190844
1:100 hígításban, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság; humán TRPV1 antitest:
GP14100 1:100 hígításban, a specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő
preadszorpcióval (P14100 1:10 hígításban, Neuromics, Edina, USA).
63
Ezek után másodlagos torma-peroxidázzal konjugált EnVision system megfelelő anti-
nyúl vagy anti-tengerimalac másodlagos antitesttel (Dako-Cytomation) 30 percig. Végül
a TRPV1 receptorok immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10
percig, magfestést hematoxilinnal végeztünk.
Kvantitatív PCR
Az RNA Later folyadékban (Sigma-Aldrich Kft.) -80°C-on tárolt mintákat 1 ml TRI
reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk.
Totál RNS-t izoláltunk a gyártó utasításainak megfeleően, a vizes fázis kinyeréséig. A
szövetmintákat 1 ml TRI Reagensben homogenizáltuk, majd 200 µl bróm-klór-propánt
(BCP, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) adtunk hozzá. A következő
lépésben kapott vizes fázisból RNS-t izoláltunk a Direct-zol RNA MiniPrep kit (Zymo
Research, Irvine, CA, USA) segítségével, a gyártó leírásának megfelelően. 400 µl vizes
fázishoz 400 µl abszolút etanolt adtunk, az elegyet az oszlopra mértük, majd mosási
lépések után 50 µl RNáz mentes vízben eluáltuk. A kinyert RNS mennyiségét és
tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc.,
Wilmington, DE, USA) segítségével állapítottuk meg. 1 µg total RNS reverz
transzkripcióját végeztük Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével, oligo dT-vel, 20 μl térfogatban, a gyártó
utasításainak megfelelően. Az így kapott cDNS mintákat MX3000P qPCR system
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és Maxima Master Mix (SYBR Green vagy
próba detektáláshoz, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). A PCR ciklusok
paramétereit a master mix gyártójának utasításai alapján állítottuk be (kétlépéses PCR
program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C 1 perc, 40 ciklus). Az alkalmazott assay-ket a 2.
függelék tartalmazza. Referenciagénként a béta-glükuronidáz (GUSB) és a GAPDH
szolgáltak, az Cq értékeik mértani közepét vettük. A primerek hatékonyságát
meghatároztuk, értékeik a 95-105% tartományba estek. A cDNS mintákat
duplikátumban mértük le, a minták Cq értékei átlagát vettük figyelembe a technikai
variabilitás csökkentése érdekében, a grafikonok a biológiai variabilitást ábrázolják. A
relatív génexpressziót a 2-ΔΔCt módszerrel számítottuk ki.
64
Luminex RNS assay
QuantiGene 2.0 Plex Assay (Plex Set 21491 MOUSE 8 plex Magnetic Beads; kat. szám:
321491; Affymetrix Inc./Panomics, USA) segítségével kvantifikáltuk 1 referenciagén
(beta-aktin) és 7 célgén mRNS szintjét (3. függelék) az egér disztális vastagbél
mintákból izolált totál RNS-ből (az RNS izolálás leírását lásd a Kvantitatív PCR-nál), a
gyártó instrukcióinak megfelelően. A befogó próbákat tartalmazó Luminex gyöngyöket
inkubáltuk overnight 20 μl RNS mintával (0,5 µg/µl) és a génspecifikus próbákkal.
Minden mintát duplikátumban mértünk le. A 2. napon hajtottuk végre a
jelamplifikálást: a mintákat inkubáltuk a pre-amplifikáló, amplifikáló, majd a jelölő
próbákkal. A detektálást streptavidin phycoerythrin (SAPE) hozzáadásával, majd a jel
leolvasásával végeztük el Magpix készülék (Luminex Corp., USA) segítségével. Az mRNS
expresszióváltozást a béta-aktin referenciagénhez normalizáltuk és a gyártó
utasításainak megfelelően számoltuk ki.
Luminex Multiplex Immunassay
A kimetszett és -80°C-on tárolt egér disztális vastagbél szövetmintákat a mérés
megkezdése előtt kiolvasztottuk, lemértük a tömegüket, és azonnal proteáz inhibitort
(10 mg/ml fenil-metil-szulfonil-fluorid: PMSF) tartalmazó PBS oldatba helyeztük, majd
homogenizáltuk. Ezután Triton X-100-at adtunk a mintákhoz (10 mg/ml
végkoncentráció) és centrifugáltuk (10000g, 5 perc) a sejttörmelék eltávolításához. A
Luminex Multiplex Immunoassay végrehajtása a korábban leírtaknak megfelelően
történt [183]. Az alábbi citokineket/kemokineket határoztuk meg (Milliplex Map Kit,
egyedi rendelésre összeállított, Millipore), amelyeket munkacsoportunk korábbi
mérései alapján [44] választottunk ki: 1. interleukin-1β (IL-1β); 2. monocita
chemotaktikus protein-1 (MCP-1, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 2: CLC2); 3.
monokine induced by gamma interferon (MIG, más néven chemokine, C-X-C motif
ligand 9: CXCL9); 4. regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
(RANTES, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 5: CCL5). A mérést a gyártó
utasításainak megfelelően végeztük el. Előzetes optimalizálást követően a mintákat
hígítás nélkül, vakon mértük le. Luminex100 készüléket használtunk és Luminex 100 IS
65
szoftverrel analizáltuk a gyöngyök medián fluoreszcens intenzitásértékeit. A mintákat
RPMI-1640 (GIBCO) oldatban (1% protease inhibitor keveréket tartalmazott)
homogenizáltuk, a mintákat 20 mg/ml koncentrációban mértük le, duplikátumban.
Minden minta, kontroll vagy standard 25 µl-ét 96 lyukú lemezre (a kit része) mértük,
25 µl antitesttel borított, fluoreszcens gyönggyel együtt. Biotinilált másodlagos
antitestet és streptavidin-PE-t adtunk a lemezre, a megfelelő inkubációs és mosási
lépések után. Az utolsó mosási lépés után 100 µl puffert adtunk minden egyes well-be.;
a lemezt a Luminex100 array reader készülékben inkubáltuk és olvastuk le, majd öt-PL
regressziós görbe segítségével ábrázoltuk a standard görbét. Az adatokat MasterPlex
szoftver segítségével elemeztük. A végeredményt pg/g nedves szövet formában adtuk
meg.
Statisztika
Az eredményeket átlag ± SEM formában fejeztük ki. Az állatok egy csoportban
egyszerre elemzett számának (n=3-5 állat/csoport) megfelelően nem paraméteres
statisztikai próbákat alkalmaztunk (Kruskal-Wallis és Mann-Whitney próba). A
Betegségaktivitási Index esetében, a két genotípus összehasonlításakor az egyszerre
elemzett nagyobb elemszám (n=14/genotípus) miatt, a normáleloszlás tesztelése után
(Kolmogorov-Smirnov próba) kétutas ANOVA-t és Bonferroni post hoc próbát
használtunk. A statisztikai számításokat GraphPad Prism 5.02 for Windows (GraphPad
Software, USA) szoftverrel végeztük. p<0,05 valószínűségi értékeket tekintettük
szignifikánsnak.
66
A B
A B
4. Eredmények
TRPA1 és TRPV1 génexpresszió
Egér DSS colitis
35. ábra
Trpa1 mRNS
expresszió 10
napos DSS
kezelés során
(A) qPCR és (B)
RNS assay
módszerrel.
Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; n=3-5/csoport.
A qPCR eredmények alapján a Trpa1 mRNS upregulálódott egerekben a DSS kezelés 7.
napján, a vizet ívó kontrollokhoz képest (35. ábra A). Az RNS assay adatai megerősítik
ezt az expressziós mintázatot (35. ábra B).
36. ábra
Trpv1 mRNS
expresszió 10 napos
DSS kezelés során
(A) qPCR és (B) RNS
assay módszerrel.
Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba; n=3-5/csoport.
A Trpv1 mRNS szintek WT egerekben qPCR (36. ábra A) és RNS assay (36. ábra B)
módszerrel sem mutattak statisztikailag szignifikáns változást a DSS kezelés hatására.
67
B A
Az RNS assay közvetlenül az mRNS-t detektálja, ellentétben a qPCR-ral. Utóbbi egy
további lépést (reverz transzkripció) is magában foglal, amely növeli a technikai
variabilitást. A két módszer egyező értékei validálják eredményeinket.
Klinikai minták
37. ábra
(A) TRPA1 és (B)
TRPV1 mRNS
expresszió aktív (+)
és inaktív (-) fázisú
IBD-ből származó
vastagbél
szövetmintákban, a gyulladás nélküli kontroll, illetve tumormintákhoz viszonyítva.
Átlag ± SEM. Kruskal-Wallis és Dunn post hoc próba: *p<0,05; n=5-8/csoport.
A TRPA1 mRNS szintje szignifikánsan megnőtt az aktív státuszú IBD-betegekben, míg az
inaktív állapotúakban nem (37. ábra A). A TRPV1 mRNS szignifikánsan csökkent az aktív
IBD betegekben a gyulladás nélküli csoporthoz képest (37. ábra B). Az
összehasonlításként használt tumoros vastagbél biopsziás mintákban kimutatható a
lokális TRPV1 és TRPA1 génexpresszió, de egyik sem mutat szignifikáns különbséget a
nem gyulladt kontrollokhoz képest (37. ábra).
68
TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció
Egér DSS colitis
69
38. ábra
Reprezentatív szövettani felvételek (A) TRPA1 és (B) TRPV1 antitest jelöléssel. Intakt,
nem gyulladt disztális vastagbél, és 7 napig DSS-t ivó egerek gyulladt bélszövete. Belső
kép: KP1 (anti-CD68) antitesttel jelölt makrofágok. Csillag: vastagbél lumen. Nyílak: a:
gyenge immunpozitivitás a nyálkahártya epithelsejtjein; b: jelentős immunpozitivitás a
nyálkahártya idegrostjai és vérerei régiójában; c: plexus myentericus idegrostok; d:
plexus myentericus ganglionok; e: submucous plexus. g: infiltrálódó leukociták; h:
kifejezett immunpozitivitás a gyulladásos leukocitákon; i: intersticiális plazmasejtek a
submucosában.
Immunhisztokémiai bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a TRPA1 receptor
immunpozitivitás megtalálható a nyálkahártya epithelsejtjein, a bélnyálkahártya
idegrostjai és vérerei környezetében, a myenterikus idegrostokon és ganglionokon a
vizet ivó, kontroll C57Bl/6 egerek disztális vastagbél metszetein (38. ábra A, 68. old.). A
DSS-kezelt egerek disztális vastagbél metszetei ezen felül TRPA1 immunfestődést
mutattak intersticiális makrofágokon és a plexius submucosus struktúráin. Az
infiltrálódó makrofágok jelenlétét megerősítettük a mucosában anti-CD68
immunjelöléssel. A TRPV1 receptort detektáltuk az enterikus ganglionokon, és gyenge
immunpozitivitás volt jelen az intakt, kontroll egerek disztális vastagbél metszeteiben
az epithelrétegben (38. ábra B, 68. old.). A DSS-kezelt állatok ezen felül TRPV1
immunjelölést mutatnak a plexus submucosában, a mucosa makrofágaiban, a
submucosa plazmasejtjeiben és jelentős immunfestődés volt jelen az epithelréteg
közeli fehérvérsejteken.
Humán disztális vastagbél
A kontrollként szolgáló, nem gyulladt vastagbél klinikai mintákban gyenge TRPA1 (39.
ábra, 70. old.) és TRPV1 (40. ábra, 71. old.) immunpozitivitást találtunk a bélkripták
epitheliumában. IBD betegekben TRPA1-pozitív immunjelölés volt kimutatható a
bélkripták neuroendokrin sejtjein, Paneth sejteken, makrofágokon és intersticiális
plazmasejteken. A TRPV1 immunfestést szintén kimutattuk intersticiális
plazmasejteken és makrofágokon. A neuroendokrin sejtek egy részén gyenge,
sporadikus TRPV1 immunjelölést detektáltunk.
70
39. ábra
Reprezentatív
mikrofotók TRPA1 -
specifikus antitesttel
jelölt klinikai
szövetmintákról. (A)
nem gyulladt
szövetminta. Nyílhegy:
kripta epithelsejtek.
(B) Colitis ulcerosa. a:
neuroendokrin
sejteknek megfelelő
granulált mirigysejtek;
b: Paneth sejtek; c:
intersticiális
makrofágok.
(C) Crohn betegség. a:
neuroendokrin
sejteknek megfelelő
granulált mirigysejtek;
d: infiltrálódó
plazmasejtek és
makrofágok.
B
A
C
71
40. ábra
Reprezentatív
mikrofotók TRPV1-
specifikus antitesttel
jelölt klinikai
szövetmintákról. (A)
Nem gyulladt
kontrollminta.
Nyílhegy: kripta
epithelsejtek;
(B) Colitis ulcerosa c:
intersticiális
makrofágok.
(C) Crohn betegség. d:
infiltrálódó
plazmasejtek és
makrofágok.
A
B
C
72
A
B
Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben
41. ábra
A. A betegségaktivitási index ábrázolása a DSS kezelés 10 napja folyamán Trpa1 WT és
KO genotípusú egerekben. Kétutas ANOVA genotípus faktor: ***p<0,0001; Bonferroni
post hoc próba: 8. nap **p<0,01; 9. nap *p<0,05. B. Az „A” grafikon görbe alatti
területeinek összehasonlítása a 10 napig DSS-t ivó állatok csoportjában. Mann-Whitney
próba *p<0,05.
73
A Betegségaktivitási Index (Disease Activity Index, DAI) szignifikánsan nagyobb volt a
TRPA1 receptor hiányában a 10 napos kísérlet során (kétutas ANOVA genotípus faktor,
görbe alatti terület), ill. a KO állatokban a WT genotípusúakhoz képest a 8. és 9. napon
(41. ábra, 72. old.).
Szövettani pontozás az egér DSS modellben
42. ábra
Hematoxilin-eozin festés intakt és 10 napig DSS-t ivó, vad genotípusú és Trpa1 K.O.
egerek disztális vastagbél mintáiból készült szövetmetszeteken. a: intakt bélkripta; b:
károsodott bélkripta; c: neutrofil infiltráció a mucosában; neutrofil infiltráció a
submucosában. Nagyítás: 100x; belső képek: 400x.
74
2% DSS kezelés gyulladást és szöveti károsodást okozott a szövettani (hematoxilin-
eozinnal festett) metszetek alapján, az intakt állatok ép kriptákat és nyálkahártya
epithelréteget tartalmazó szövettani felvételeihez képest (42. ábra, 73. old.). A
mucosában és a submucosában fokozott neutrofil infiltráció, a bélkripták elvesztése,
továbbá a nyálkahártya szerkezetének dezintegrációja volt megfigyelhető mindkét
genotípusban. A súlyossága és kiterjedtsége ezen patológiai elváltozásoknak
szignifikánsan nagyobb volt a TRPA1 receptor hiányában a 10. napon a WT egerekhez
képest (43. ábra).
43. ábra
A szövettani pontozás eredménye intakt és DSS-kezelt, WT és Trpa1 KO egerek disztális
vastagbél szövetmintáiból készült, hematoxilin-eozinnal festett metszetein. Kétutas
ANOVA és Bonferroni post hoc próba **p<0,01 WT vs. KO a 10. napon.
Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben
A TNF-α, BLC, M-CSF és IL-1 receptor antagonista citokinek/kemokinek
transzkriptumait kimutattuk az ép és gyulladt vastagbélmintákban (44. ábra, 75. old.).
A TNF-α (Tnf) génexpresszió upregulálódott a 3. napon mindkét genotípusban a nem
gyulladt kontrollhoz képest. A KO állatokban magasabb volt a TNF-α expresszió a vad
75
típusúakhoz képest. A BLC (Cxcl13) mRNS szintje szignifikánsan megnőtt a DSS kezelés
10. napján a KO egerekben, mind az azonos napon leölt vad állatokhoz, mind a
kezeletlen kontroll egerekhez képest. Az M-csf génexpresszió mindkét genotípusban
csökkent a 10. napon, a vad és génhiányos egerek között nem volt különbség. Az IL-1rn
génexpresszió nem változott szignifikánsan a vizet ivó kontrollcsoporthoz képest.
44. ábra
Intakt és DSS-kezelt, Trpa1 WT és KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban (A)
TNF-α, (B) BLC, (C) M-CSF, (D) IL-1rn citokin mRNS expresszió változása. Átlag ± SEM.
Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05 WT vs. KO. n=3-5/csoport.
Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben
A Luminex multiplex mikrogyöngy array módszer segítségével (45. ábra, 76. old.) az
egér disztális vastagbélmintákban detektált 4 citokin/kemokin közül az IL-1β protein
szignifikánsan kisebb mennyiségben volt jelen a vizet ivó kontroll KO állatokban, a
megfelelő vad típusú csoporthoz képest (45. ábra A).
A
C
B
D
76
45. ábra
Luminex multiplex mikrogyöngy array módszerrel detektált gyulladásos
citokin/kemokin (A: IL-1β, B: MCP-1, C: RANTES, D: MIG) fehérjexpressziós mintázat
intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban. Átlag
±SEM. Mann-Whitney próba *p<0,05, **p<0,01 vs. intakt kontroll; #p<0,05, ##p<0,01
WT vs. KO, n=3-5/csoport.
B
D
A
C
77
A DSS kezelés szignifikánsan megemelte a citokin szintjét mindkét genotípusban. A
kísérlet 3. és 7. napján szignifikánsan megnőtt az IL-1β szintje a KO állatokban, a
megfelelő intakt kontrollcsoporthoz képest. A 10. napon csökken a citokin expressziója
a KO egerekben a 7. naphoz képest, de még szignifikánsan magasabb marad a
megfelelő intakt kontrollhoz képest. A vad genotípusú állatokban az expressziója
csökken a 10. napra a vad intakt csoporthoz képest.
Az MCP-1 szintje szignifikánsan megnőtt a DSS-kezelt KO csoportban a 7. és 10. napon
mind a vizet ivó KO kontrollokhoz, mind a 10. napon a vad típusúakhoz képest (45.
ábra B). A RANTES koncentrációja szignifikánsan csökkent a DSS fogyasztás hatására a
10. napra mindkét genotípusban a megfelelő intakt kontrollokhoz képest (45. ábra C).
A vad és KO egerek mintáiban nem különbözött a RANTES szintje. A MIG expresszió
szignifikánsan megemelkedett a KO egerekben a 7. napon mind a vizet fogyasztó,
intakt KO, mind az azonos napi WT állatokhoz képest (45. ábra D).
Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben
46. ábra
qPCR módszerrel detektált Trpv1
génexpressziós profil intakt és DSS
kezelt, vad és Trpa1 KO egerek
disztális vastagbél szövetmintáiban.
Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba,
*p<0,05 vs. intakt kontroll; n=3-
5/csoport.
A Trpv1 mRNS expresszióját nem változtatta meg szignifikánsan a DSS kezelés a vad
genotípusú egerekben (46. ábra). A KO állatokban ugyanakkor szignifikánsan
csökkentette a DSS fogyasztás a Trpv1 génexpressziót a 10. napon.
78
47. ábra
qPCR és Luminex multiplex mikrogyöngy array módszerekkel detektált neuropeptid és
neuropeptid receptor génexpressziós profil intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek
disztális vastagbél szövetmintáiban. (A) Vip, (B) PACAP (Adcyap), (C) PAC1R
(Adcyap1r1), (D) VPAC1 (Vipr1), (E) VPAC2 (Vipr2), (F) Szomatosztatin, (G) Sstr1, (H)
Sstr4. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05, WT vs.
KO, n=3-5/csoport.
C
A B
D E
H G F
79
A szomatosztatin, PACAP és VIP neuropeptidek, valamint receptoraik (SSTR1, SSTR4,
PAC1, VPAC1, VPAC2) mRNS szinten kimutathatóak mind a nem gyulladt, mind a
gyulladt disztális vastagbélben (47. ábra, 79. old.). A vizet ivó intakt állatokban nincs
különbség a neuropeptid és receptor génexpressziós profilban a vad és Trpa1 KO
állatok között. A Vip génexpresszió szignifikánsan megnőtt mindkét genotípusban a
DSS kezelés hatására a saját intakt kontrollcsoportjaikhoz képest, de a 10. napon
jelentősen megnőtt a KO egerekben a WT egerekhez képest is (47. ábra A, 79. old.).
DSS kezelés hatására a PACAP (Adcyap1) mRNS szignifikánsan megnőtt a KO, de nem a
vad egerekben, a megfelelő intakt kontrollcsoportokhoz viszonyítva (47. ábra B, 79.
old.). A 10. napon a PACAP (Adcyap1) mRNS szintje szignifikánsan nagyobb volt a Trpa1
KO egerekben a vad típusúakhoz viszonyítva.
A PAC1 (Adcyap1r1), a VPAC1 (Vipr1) és a VPAC2 (Vipr2) transzkriptumai
kimutathatóak a vizet ivó és DSS-kezelt vad és KO állatokban (47. ábra C, D, E, 79. old.).
A VPAC1 (Vipr1) receptor expressziója szignifikánsan csökkent a KO csoportban a 10.
napon az intakt kontrollokhoz képest (47. ábra D, 79. old.). A PAC1 és VPAC2 szintjét
nem befolyásolta szignifikánsan a genotípus vagy a DSS kezelés (47. ábra C, E, 79. old.).
A lokális, leukocita eredetű szomatosztatin génexpresszió nem változott szignifikánsan
egyik genotípusban sem a DSS fogyasztás hatására, és a genotípusok között sem volt
különbség (47. ábra F, 79. old). Hasonlóan, a SSTR1 és a SSTR4 receptorok mRNS
expresszióját sem befolyásolta a DSS adása vagy a TRPA1 hiánya (47. ábra G, H, 79.
old.).
A P-anyagot és a NKA-t kódoló Tac1 gén, a NKB-t kódoló Tac3 gén és az NK1 receptort
kódoló Tacr1 gén expressziója kimutatható a nem gyulladt és a DSS-kezelt disztális
vastagbélben egyaránt (48. ábra, 81. old). A Tac1 és Tacr1, de nem a Tac3 mRNS
szignifikánsan kisebb a vizet kapó, intakt KO állatokban, a WT egerekhez képest. DSS
adás hatására, a Tac1 mRNS megemelkedett mindkét genotípusban. A 10. napon a
Tac1 génexpresszió szignifikánsan nagyobb volt a KO állatokban a vad típusúakhoz
képest. A Tac3 mRNS upregulálódott a KO egerekben a 10. napon mind az intakt KO,
mind a megfelelő WT egerekhez képest. A Tacr1 mRNS szignifikánsan megnőtt a DSS
kezelés hatására a 3., 7. és 10. napokon a KO állatokban.
80
A
B
48. ábra
Tachykinin és tachykinin receptor
génexpressziós profil intakt és DSS kezelt,
vad és Trpa1 KO egerek disztális
vastagbél szövetmintáiban. Átlag ± SEM.
Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt
kontroll; #p<0,05, ##p<0,01 WT vs. KO,
n=3-5/csoport. (A) Tac1 mRNS; (B) Tac3
mRNS; (C) NK1 (Tacr1) mRNS.
C
81
5. Megbeszélés, következtetések
TRPA1 és TRPV1 immunfestődést és génkifejeződést mutattunk ki egér és humán
vastagbélben. Gyulladás hatására a TRPA1, de nem a TRPV1 mRNS szignifikánsan
megemelkedett. A TRPA1 receptor protektív szerepét egyértelműen demonstráltuk
DSS colitis modellben a betegség aktivitási index és a szövettani pontozás alapján,
amelyeket a TRPA1 által mediált gyulladásos citokin és neuropeptid csökkenés is
alátámaszt.
A TRPA1 szerepe a viscerális fájdalom közvetítésében bizonyított [155,156,178,184–
187]. TRPA1 antagonisták klinikai vizsgálatok alatt állnak gyulladásos, neuropáthiás és
viszcerális fájdalom kezelésére [188]. Az IBD patogenezisében betöltött szerepére
ugyanakkor ellentmondó adatok állnak rendelkezésre: leírták a TRPA1 gyulladáskeltő
és gyulladásgátló hatást közvetítő szerepeit, valamint ezek hiányát is [168,177,178]. Az
általunk vizsgált, vizet ivó kontroll, vad genotípusú egerek vastagbélmintáiban
gyulladáskeltő mediátorok (P-anyag, NKA és NKB mRNS, IL-1β fehérje) szignifikánsan
nagyobb alapszintjét mértük a TRPA1 receptorgén-hiányos egerekhez képest. Ezt azzal
magyarázhatjuk, hogy a Trpa1 gén hiánya csökkenti a bél mikroflórájának és
metabolitjainak aktiváló/szenzitizáló hatását. Ez a TRPA1 folytonos, „tónikus”
aktiválására utal, amelynek a homeosztázis fenntartásában lehet szerepe. Mindez
megfelel az irodalomban leírt, P-anyag felszabadítással mediált gyulladáskeltő
szerepének [168,169]. Ezzel ellentétben adataink alapján azt gondoljuk, hogy
gyulladásos körülmények között a vastagbélben a TRPA1 szerepe eltolódik a
gyulladásgátlás irányába. Ismert, hogy a TRPA1 gyulladáscsökkentő szomatosztatin
felszabadulását mediálja [180], amely anti-inflammatorikus lehet gyulladásos
bélbetegségben is. A TRPA1-et expresszáló szenzoros rostok stimulációjakor
felszabaduló CGRP hiányában kiváltott kísérletes colitis súlyosabb [168,169].
Munkacsoportunk kimutatta, hogy a szenzoros TRPA1 specifikus aktiválása H2S-dal
CGRP felszabadulással jár, amely vazodilatációt okoz [189], valamint a H2S, részben a
TRPA1 aktiválásán keresztül, protektív lehet DSS colitisben [190].
A TRPA1 által közvetített gyulladásgátló szerep mechanizmusát illetően a DSS által
kiváltott egér colitisben, az NK1 receptor csökkent expresszióját mutattuk ki vad
genotípusú egerekben, a TRPA1 hiányos egerekhez képest. Az NK1 receptor (Tac1r)
82
mRNS szintjének növekedését írták le a TRPA1 agonista mustárolajjal (MO) kiváltott
colitisben [170], azonban TRPA1 hiányos egerekben nem vizsgálták a mustárolaj
hatását.
A TRPA1 védőhatást fejtjhet ki a gyulladáskeltő, IBD-ben is szerepet játszó P-anyag,
NKA és NKB [168,171,172,191–195] expressziójának csökkentésével. A TRPA1 jelenléte
csökkenti a PACAP és a VIP szintézisét a gyulladt vastagbélben, míg a PACAP/VIP
receptorok szintje nem változik szignifikánsan. Közelmúltbeli adatok a VIP
gyulladáskeltő szerepére utalnak DSS-colitisben, ugyanakkor más források heterogén
képet mutatnak a VIP kísérletesen kiváltott colitisben és humán IBD-ben való
expressziójáról és szerepéről [97,196–201]. A vastagbélben detektált VIP (Vip) és
PACAP (Adcyap1) mRNS-nek számos forrása van (enterikus neuronok, leukociták),
továbbá ezen peptidek többféle PACAP/VIP receptortípuson és variánson hatnak,
amelyek sejttípustól függően eltérő jelátviteli útvonalakhoz kapcsolódhatnak (10. ábra,
18. old.) [78,196]. Ezért további vizsgálatok tárgya lehet, hogy az általunk mért
szignifikáns PACAP és VIP szintézis emelkedés milyen szerepet játszik a vastagbél
gyulladásos folyamataiban.
Munkacsoportunk korábban nagyszámú citokin/kemokin (panel alapú) vizsgálatát
végezte el [173], amely alapján 8 mediátort választottunk ki a vastagbélgyulladás
jellemzésére kísérletünkben. Közülük három kifejeződésében nem találtunk
különbséget a WT és Trpa1 KO egerek között, így nem feltételezzük, hogy a TRPA1
mediálja a keletkezésüket:
RANTES és M-CSF: szintézisük szignifikánsan csökkent a DSS-kezelés 10. napjára,
mindkét genotípusban. A RANTES (CCL5) elsősorban T-limfociták által termelt, míg az
M-CSF-et leukociták széleskörűen expresszálhatják, utóbbi szerepe a monociták
aktiválása [202].
IL-RN: az anti-inflammatorikus, leukociták és epithelsejtek által is termelt interleukin-1
receptor antagonista citokin a DSS kezelés hatására emelkedő majd csökkenő
tendenciát mutatott mindkét egértörzsben [202].
További öt citokin genotípus szerint differenciáltan expresszálódott, a TRPA1 jelenléte
csökkentette szintézisüket:
83
TNF-α: korai gyulladásos citokin, amelyet leukociták termelnek. Diszregulációja
szerepet játszik IBD-ben; az anti-TNF-α terápia alkalmazása elterjedt [203,204].
Kimutatták, hogy DSS colitis modellben a korai immunválaszban játszik szerepet.
[152,205,206] A Th1/Th17 sejtek által mediált, magas TNF-α szinttel járó akut
gyulladást egy túlnyomórészt Th2 sejtek által dominált krónikus gyulladásos válasz
váltja fel, amely alacsonyabb TNF-α szinttel jár. Érdemes megemlíteni, hogy a TNF-α
fehérje mennyisége késéssel követheti a kísérlet 10. napján mért kisebb mRNS szintet,
azaz a géntermék még jelen lehet nagyobb mennyiségben. Eredményeink alapján a
TRPA1 receptor aktiválása csökkentheti a TNF-α szintézisét, amely hozzájárulhat a
receptor gyulladásgátló funkcióhoz.
MIG és MCP-1: a két leukocita attraktáns kemokin szintjét is szignifikánsan
csökkentette a TRPA1 aktiváció a gyulladásgátló hatásainak részeként.
IL-1β: gyulladáskeltő citokin, amelyet a veleszületett immunrendszer setjei (pl.
gyulladáskeltő M1 típusú makrofágok) mellett az enterikus neuronok is termelnek
[207]. Az IBD lefolyását súlyosbító szerepe jól ismert [208]. TRPA1 jelenlétében
szignifikánsan csökkent a szintje.
BLC (CXCL13): a szerepét kimutatták az IBD-ben keletkező aberráns limfoid szövet
kialakulásában [209], szintje csak a TRPA1 receptor hiányában emelkedett meg a DSS
kísérlet 10. napján.
Citokineket/kemokineket immunrendszer és más eredetű sejtek (epithelsejtek,
enterikus neuronok) is termelhetnek, így kifejeződésüket nem tudjuk minden kétséget
kizáróan sejttípushoz rendelni adataink alapján. Érdemes kiemelni, hogy a TRPA1
receptor jelenléte csökkentette a klasszikus úton aktivált, gyulladáskeltő M1 irányba
polarizált makrofágok által karakterisztikusan szekretált [202] IL-1β, MCP-1 (CCL2) és
TNF-α szintjét. Ugyanakkor a túlnyomórészt T-limfocita eredetű [202] RANTES
szintézisét nem mediálta a TRPA1 receptor.
Poole és mtsai [210] 2011-ben leírták a TRPA1 ioncsatorna jelenlétét és bizonyos
protektív hatásait az egér vastagbélben. Azt találták, hogy a neuronális TRPA1
aktiválása gátolja a spontán neurogén kontrakciókat és így a béltranzitot. A TRPA1
84
ilyen módon véd a gyulladásos mediátorok szenzitizáló/aktiváló hatásától. Az általunk
kimutatott és mások eredményeivel [170,211,212] korreláló TRPA1 génexpresszió
emelkedés egér és emberi vastagbél-mintákban az enterikus neuronok
receptorszintézisére utalhat. A TRPA1, TRPV1 receptorfehérjét kimutattuk a plexus
myentericusban és a plexus submucosusban. A Trpa1 mRNS upregulációja a DSS
kezelés 7. napján, de még nem a 3. napon a génexpresszió szintjén késleltetett választ
jelezhet. Kimutatták, hogy stimuláció hatására a TRPA1 receptorfehérje az
intracelluláris raktárakból a neuronok plazmamembránjába szállítódik [213]. Mivel a
citoplazmában már jelenlévő TRPA1 fehérjemolekulák kerülnek a membránba, az aktív
ioncsatorrnák száma a transzkripció azonnali növekedése nélkül is emelkedhet. A 10.
napon tapasztalt emelkedés hiánya a Trpa1 mRNS-t szintetizáló struktúrák
károsodásával magyarázható. Érdemes figyelembe venni, hogy az mRNS szint
csökkenését késéssel követheti a fehérjeszint változása. A makrofágokon található
TRPA1 receptornak gyulladáscsökkentő szerepet is tulajdonítanak [176], lásd lentebb,
ezen sejtek infiltrációja is hozzájárulhat a megnőtt Trpa1 génexpresszióhoz. A
mintáinkban detektált lokális Trpa1 mRNS kevésbé valószínű, hogy az extrinsic
szenzoros neuronokból ered, ezért nem informatív a vastagbelet beidegző dorzális
ganglionokban szintetizált TRPA1 csatornák szerepét illetően.
A Trpv1 esetében nem tapasztaltunk szignifikáns mRNS upregulációt a DSS kezelt vad
típusú állatokban, hasonlóan a mustárolajjal kiváltott colitishez [170]. Érdekes módon a
Trpa1 KO állatokban a DSS által okozott nagyobb gyulladással párhuzamosan a lokális
Trpv1 mRNS szignifikánsan csökkent a 10. napra. Az IBD betegek esetében szintén
csökkent TRPV1 mRNS expressziót detektáltunk, míg mások colitis ulcerosa
betegekben nem mértek változást [214]. További vizsgálatok szükségesek annak
tisztázására, hogy az általunk mért TRP mRNS szintekért az egyes sejttípusok milyen
arányban felelősek, hiszen a szövetmintáinkban a különböző sejtek mRNS expresszió
változásai eredőjét mértük.
Az extrinsic szenzoros TRPV1 receptorok gyulladáskeltő és gyulladáscsökkentő
funkciókat egyaránt mediálnak, upregulációjukat detektálták IBD-ben [158–
165,184,215–217]. A receptorfehérje intraaxonálisan transzlokálódik a perifériára [73],
ugyanakkor van adat arra vonatkozóan, hogy a TRPV1 mRNS kimutatható perifériás
85
axonokban [218]. Korábbi eredményeink szerint a bőrben és szájnyálkahártyában az
extraneuronális TRPV1 expressziót nem befolyásolja a primér szenzoros afferensek
kémiai vagy sebészi denervációja [219]. Továbbá, a nem neuronális TRP mRNS szintek
jóval alacsonyabbak a neuronális sejtekénél [15,100]. E mögött azt feltételezhetjük,
hogy az akciós potenciál kiváltásához nagyobb receptorsűrűségre van szükség, mint a
nem neuronális sejtekben ellátott szerepekhez. Mindezek alapján úgy gondoljuk,
enterikus neuronok járulnak hozzá túlnyomórészt a mintáinkban mért TRP mRNS
expresszióhoz. Az intrinsic enterikus TRPV1 jelenlétére egyre több bizonyíték van, de a
bélben betöltött excitatórikus/szekréciós szerepeit még nem tárták fel
[160,168,191,220–226].
A gyulladás TRPA1 és TRPV1 pozitív fehérvérsejtek akkumulációját okozta, amelyek
közül nagyszámú sejtet makrofágként azonosítottunk anti-CD68 immunfestéssel a
nyálkahártyarétegben. Az infiltrálódó makrofágok szerepet játszanak az IBD
kiváltásában és fenntartásában [227]. Eredményeink alapján nagyobbrészt M1 típusú
gyulladásos makrofágok által jellemzően szekretált citokinek/kemokinek szintjét
csökkentette a TRPA1 receptor jelenléte. Ez lehet a szenzoros TRPA1 közvetítésével
felszabaduló, gyulladáscsökkentő szomatosztatin „szenzokrin” hatása közvetve vagy
közvetlenül a makrofágok szomatosztatin receptorain [228].
Ugyanakkor ismert in vitro irodalmi adat a makrofágok saját TRPA1 csatornái részleges
anti-inflammatorikus szerepére is, ennek funkcionális jelentőségét in vivo gyulladásos
folyamatokban még nem tárták fel [176]. A gyulladáscsökkentő szerep lehetőségét
alátámasztja továbbá, hogy leírták TRPA1 agonisták (kurkumin, szulforafán,
fahéjaldehid, hidroxi-fahéjaldehid, tiocianátok) és a TRPV1-aktiváló kapszaicin, ill. a
mindkét receptort izgató gingerol gyulladáscsökkentő hatását egér/patkány
makrofágokban, humán monocitákban/makrofágokban in vitro [229–236]. A TRPA1
agonisták anti-inflammatorikus hatása makrofágokban a gyulladáskeltő útvonalak
gátlásában (NF-κB, PKCα, indukálható nitrogén-monoxid szintáz: iNOS, reaktív oxigén
gyökök: ROS, leukotriének, prosztaglandinok, hidrolítikus enzimek, IL-1, IL-1β, IL-6,
miRNS-155) valamint az antioxidáns útvonalak aktiválásában (Nrf2 transzkripciós
faktor-hemoxigenáz-1; peroxinitrit elleni védelem) nyilvánult meg; a TNF-α szintézisére
ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. Ezen közlemények egy része a TRPA1
86
ioncsatorna felfedezése, exogén ligandumainak feltérképezése előtt született vagy
pusztán nem vizsgálták a TRPA1 szerepét. Ezért tisztázásra vár, vajon a protektív
hatásokat valóban a TRPA1 receptor mediálja-e? Munkacsoportunk a közelmúltban
mustárolajjal (ill. kapszaicinnel) vad típusú és génhiányos egerek peritoneális
makrofágjain szelektíven kiváltott Ca2+-beáramlás detektálásával bizonyította a
funkcionális TRPA1 (ill. TRPV1) jelenlétét [237].
A nem gyulladt, kontrollként szolgált biopsziás mintákban gyenge TRPA1 és TRPV1
immunpozitivitást találtunk a bélkripták epitheliális sejtjeiben, hasonlóan az egér
vastagbélhez. Az IBD-betegek szövetmintáiban az intesztinális kripták neuroendokrin
sejtjei festődtek TRPA1 antitesttel. Az egérhez hasonlóan a humán disztális
vastagbélben található fehérvérsejtek TRPV1 és TRPA1 immunfestődést mutattak. IBD-
betegek vastagbél metszetein a Lieberkühn-féle kriptákban Paneth sejtek és granulált
neuroendokrin sejtek TRPA1 immunfestődést produkáltak. A sejteken lokalizálódó
TRPA1 receptorok szerepet játszhatnak a colitis modulálásában a szerotonin és
melatonin felszabadulás szabályozásával [238–240].
Mivel a TRPA1 receptort izgatják a táplálékban, különösen a fűszernövényekben
előforduló egyes elektrofil, irritáló, csípős vegyületek, feltehetjük a kérdést: megfelelő
étrenddel javítható-e a betegek állapota? Nilius és Appendino irodalmi
összefoglalójában (2013) részletesen áttekintette a TRP csatornák, a fűszerek és az
egészségi állapot kölcsönhatásait [241]. Ezek alapján elmondható: a fűszernövények
hatóanyagait komplex polifarmakológia jellemzi, azaz hatásukat egyszerre több
molekuláris célponton fejtik ki, ill. a bioaktív anyagok sajátságainak megfelelően
hatásuk egyszerre lehet előnyös és kedvezőtlen. A piperin (feketebors) és az allicin
(fokhagyma) például a TRPA1 mellett az IBD-ben pro-inflammatorikus szerepűnek
bizonyuló TRPV1-et is aktiválja [54,242]. A TRPA1-et izgató kurkuminnak (kurkuma)
100-nál több molekuláris célpontja létezik az emberi szervezetben [241,243]. A TRPA1
agonista allil-izotiocianát (mustár, retek, torma, wasabi) fogyasztása 10-25 mg/ttkg
koncentrációban enyhíti az egér DSS-colitis tüneteit [244], bár ebben a TRPA1 receptor
szerepe tisztázásra vár. Ugyanakkor a vastagbélbe adott 0,5% mustárolaj akut colitist
vált ki egérben [170]. Evolúciós perspektívából szemlélve nem tekinthető véletlennek,
hogy ezek az elektrofil, irritáns vegyületek fájdalmas ingert váltanak ki.
87
Epidemiológiai tanulmányok alapján negatívan korrelál az IBD előfordulásával, így
kismértékű védőhatást sugall a zöldségek fogyasztása [245,246]. A számos konyhakerti
növényt magába foglaló káposztafélék családja például gazdag TRPA1-izgató szerves
kénvegyületekben. Közülük a szulforafánnal történő előkezelés (25 mg/ttkg per os)
enyhíti a DSS-colitis tüneteit egérben [247], de itt a TRPA1 szerepét nem ismerjük. Az
epidemiológiai vizsgálatokban szintén előnyösnek mutatkozó olivaolajban a TRPA1
ligandum oleocanthal van jelen [248,249]. Adódik a kérdés, vajon a jótékony exogén
agonistákat „terápiás dózisban” tartalmazó táplálékmennyiség elfogyasztható-e
reálisan, főképpen hosszútávon és különös tekintettel a gyakran erős aromára?
Óvatosságra int az is, hogy célzott étrenddel eddig nem tudtak átütő javulást elérni
IBD-betegek állapotában a klinikai tapasztalatok alapján [250]. Tisztázásra vár, hogy az
exogén aktivátorok a szenzoros vagy a lokális (autonóm idegrendszer, epithel-,
neuroendokrin sejtek, leukociták) TRPA1 receptorokra hatnak. Figyelembe kell venni
továbbá a táplálékban található TRPA1 agonisták szisztémás hatását, a májban, ill. a
mikroflóra által a bélben keletkező metabolitjaikat, valamint az örökítőanyag egyéni
eltéréseit (nutrigenomika).
A TRPA1 csatorna lokalizációja a vastagbél különböző sejttípusain (extrinsic szenzoros
neuronok, enterikus /intrinsic/ neuronok, neuroendokrin sejtek, leukociták,
plazmasejtek), gyulladás hatására egérben és emberben hasonló upregulációja,
továbbá egy krónikus colitismodellben tapasztalt egyértelmű gyulladáscsökkentő
szerepe fontos protektív szerepre utal IBD-ben.
A TRPA1 anti-inflammatorikus szerepe mögött a lokális P-anyag, NKA, NKB és NK1
receptor, továbbá a feltehetően makrofág eredetű citokin/kemokinszintézis
csökkenése állhat adataink alapján. Továbbá mindezek hátterében feltételezhetjük a
szenzoros TRPA1 szomatosztatin és CGRP felszabadításával kifejtett
gyulladáscsökkentő szerepét.
Az egérből származó és a klinikai vastagbél minták egybevágó TRPA1 expressziós
mintázata állatkísérletes eredményeink transzlációs relevanciájára utal. A TRPA1
általunk bizonyított protektív szerepe a gyulladásos betegségek kutatásában
perspektívával kecsegtet (49. ábra, 88. old.).
88
49. ábra
Eredményeink összefoglalása.
89
VI. Új eredmények összefoglalása, következtetések
1. Az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra citotoxikus, nem
károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat a patkány talpi, lábháti bőrben és
szájnyálkahártyában. A Ca2+-toxicitás hiánya nem-neuronális sejteken a kisebb TRPV1
receptorsűrűségre, eltérő sejtstruktúrára, az ioncsatorna eltérő érzékenységre utalhat.
Továbbra is szelektív farmakológiai eszközként tekinthetünk az RTX/kapszaicin-
deszenzitizációra, amellyel a szenzoros TRPV1 funkciók vizsgálhatók kísérletesen.
Eredményeink az sugallják, hogy az RTX/kapszaicin deszenzitizáción alapuló terápiák
nem károsítják extraneuronálisan a TRPV1-et, ill. az ioncsatornát kifejező sejteket.
2. a. Bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin közvetítette
upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. b. PACAP-hiányos
egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a TRPV1 aktiváció
által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora. Ennek hátterében a
PACAP arteriola dilatációt és plazmafehérje extravazációt növelő hatása állhat.
3. a. Egér colitis és humán gyulladásos bélbetegségben számos neuronális és nem-
neuronális sejt expresszálja a TRPA1 receptort; b. a TRPA1 protektív DSS-colitis
egérmodellben; c. a receptor aktivációja csökkenti a lokális, gyulladáskeltő
tachykininek és számos citokin/kemokin szintjét. Mindebben fontos szerepet játszhat a
makrofágfunkciók gátlása, amelyben a sejteken lokalizálódó TRPA1 közvetlen funkciója
is lehetséges. A TRPA1-aktiváció hatására a szenzoros neuronokból felszabaduló
szomatosztatin és CGRP szerepe elképzelhető a protektív hatás közvetítésében
bélgyulladásban. A TRPA1 ígéretes célpont lehet a gyulladásos bélbetegségek
kutatásában.
Dolgozatom legfontosabb eredményeinek összefoglalásaként (50. ábra, 90. old.)
elmondható, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra
citotoxikus, a TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos
mediátora a PACAP, valamint a TRPA1 protektív egér DSS-colitis modellben.
90
50. ábra
A dologozat legfontosabb új eredményeinek összefoglalása.
91
Függelék
1. függelék
A TRPA1 és TRPV1 specifikus antitestek szelektivitásának tesztelése. Részletesen lásd
Anyagok és módszerek, V. Fejezet.
92
Gén Accession Assay
Hu
má
n
GAPDH NM_001256799
NM_002046
(2) Hs02758991
GUSB NM_000181 (2) Hs00939627_m1
TRPV1 NM_018727
NM_080704
NM_080705
NM_080706
(2) Hs00218912_m1
TRPA1 NM_007332 (2) Hs00175798_m1
Eg
ér
Gapdh NM_008084 (1) Mm.PT.39a.1
Gusb NM_010368 (1) Mm.PT.39a.22214848
Trpv1 NM_001001445 (1) Mm.PT.56a.13426135
Trpa1 NM_177781 (2) Mm00625268_m1
Vip NM_011702 (1) Mm.PT.56a.32346790
Adcyap1
(PACAP)
NM_009625 (1) Mm.PT.56a.31241204
Sst NM_009215 (2) Mm00436671_m1
Cxcl13 (BLC) NM_018866 (1) Mm.PT.56.31389616
Il1rn (IL-1RA) NM_001039701 (1) Mm.PT.56.43781580
Tac1 NM_009311 (3) F 5′- AAATGTGCGCTATGAGGAATGA -3′
R 5′- GGAAACATGCTGCTAGGAATACAAA -3′
Tac3 NM_001199971 (3) F 5′-TCTGGAAGGATTGCTGAAAGTG-3′
R 5′-GTAGGGAAGGGAGCCAACAG-3′
Tacr1 (NK1) NM_009313 (3) F 5′-TGGACTCTGATCTCTTCCCCAACA-3′
R 5′-GGACCCAGATGACAAAGATGACCA-3′
Tnf NM_013693 (3) F 5′-CCCAGACCCTCACACTCAGAT-3′
R 5′-TTGTCCCTTGAAGAGAACCTG-3′
Csf1 NM_007778
NM_001113529
NM_001113530
(3) F 5′-GGCTTGGCTTGGGATGATT-3′
R 5′-AGGCGTGGAGGGGGAAAAC-3′
2. függelék
Az egér és humán vastagbél minták qPCR analíziséhez használt primerek és hidrolízis
próbák listája. (1): Integrated DNA Technologies, Inc. (Iowa, USA); (2): Life
Technologies (Kalifornia, USA); (3): [251,252]. GAPDH (gliceraldehid 3-foszfát
dehidrogenáz); GUSB (béta-glükuronidáz); TRPV1 (tranziens receptor potenciáll
vanilloid 1); TRPA1 (tranziens receptor potenciáll ankirin 1); Vip (vazoaktív intesztinális
polipeptid); Adycap1 (hipofízos adenilát cikláz aktiváló polipeptid, PACAP); Sst
(szomatosztatin); Cxcl13 (kemokin (C-X-C motívum) ligand 13 azaz B-limfocita
kemoattraktáns, BLC); Il1rn (interleukin-1 receptor antagonista, IL-1RA); Tac1
(tachykinin 1); Tac3 (tachykinin 3); Tacr1 (tachykinin 1 azaz neurokinin receptor 1); Tnf
(tumor nekrózis faktor α); Csf1 (macrophage colony stimulating factor 1, M-CSF).
93
Gén Teljes név Accession
Trpv1
transient receptor potential
cation channel, subfamily V,
member 1
NM_001001445
Trpa1
transient receptor potential
cation channel, subfamily A,
member 1
NM_177781
Actb actin-beta NM_007393
Adcyap1r1
adenylate cyclase activating
polypeptide 1 receptor 1
(PAC1)
NM_007407
Vipr1 vasoactive intestinal peptide
receptor 1 (VPAC1) NM_011703
Vipr2 vasoactive intestinal peptide
receptor 2 (VPAC2) NM_009511
Sstr1 somatostatin receptor 1 NM_009216
Sstr4 somatostatin receptor 4 NM_009219
3. függelék
A Quantigene 2.0 Plex RNA Assay módszer segítségével detektált egér gének.
94
Irodalomjegyzék
1. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967) Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br J Pharmacol Chemother 31: 138–151.
2. Jancsó N (1960) Role of the nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull Millard Fill Hosp: 53–77.
3. Szolcsanyi J, Jancso-Gabor A (1975) Sensory effects of capsaicin congeners. Part II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type compounds. Arzneimittelforschung 26: 33–37.
4. Caterina MJ, Schumacher M a, Tominaga M, Rosen T a, Levine JD, et al. (1997) The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389: 816–824.
5. Szolcsányi J, Sándor Z (2012) Multisteric TRPV1 nocisensor: a target for analgesics. Trends Pharmacol Sci 33: 646–655.
6. Kalia J, Swartz KJ (2013) Exploring structure-function relationships between TRP and Kv channels. Sci Rep 3: 1–9.
7. Lee JH, Lee Y, Ryu H, Kang DW, Lee J, et al. (2011) Structural insights into transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) from homology modeling, flexible docking, and mutational studies. J Comput Aided Mol Des 25: 317–327.
8. Moiseenkova-Bell VY, Stanciu L a, Serysheva II, Tobe BJ, Wensel TG (2008) Structure of TRPV1 channel revealed by electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 7451–7455.
9. Alawi K, Keeble J (2010) The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation. Pharmacol Ther 125: 181–195.
10. Vyklický L, Nováková-Tousová K, Benedikt J, Samad A, Touska F, et al. (2008) Calcium-dependent desensitization of vanilloid receptor TRPV1: a mechanism possibly involved in analgesia induced by topical application of capsaicin. Physiol Res 57 Suppl 3: S59–S68.
11. Szallasi A, Cortright DN, Blum C a, Eid SR (2007) The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat Rev Drug Discov 6: 357–372.
12. Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V (2007) Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther 114: 13–33.
13. Fernandes ES, Fernandes M a, Keeble JE (2012) The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves. Br J Pharmacol 166: 510–521.
95
14. Calixto JB, Kassuya C a L, André E, Ferreira J (2005) Contribution of natural products to the discovery of the transient receptor potential (TRP) channels family and their functions. Pharmacol Ther 106: 179–208.
15. Szallasi A, Blumberg PM (1999) Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms. Pharmacol Rev 51: 159–211.
16. Appendino G, Ech-Chahad A, Minassi A, Bacchiega S, De Petrocellis L, et al. (2007) Structure-activity relationships of the ultrapotent vanilloid resiniferatoxin (RTX): the homovanillyl moiety. Bioorg Med Chem Lett 17: 132–135.
17. Szolcsányi J (1996) Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions : facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanisms. Prog Brain Res 113: 343–359.
18. Szolcsányi J (2004) Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology. Neuropeptides 38: 377–384.
19. Holzer P (1998) Implications of Tachykinins and Calcitonin Gene-Related Peptide in. Digestion 43: 269–283.
20. Maggi CA (1995) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog Neurobiol 45: 1–98.
21. Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S (2008) The concept of neurogenic inflammation. BJU Int 101 Suppl : 2–6.
22. Geppetti P, Holzer P (1996) Neurogenic inflammation. CRC Press.
23. Helyes Z (2009) Szenzoros neuropeptidek szerepének vizsgálata légúti és ízületi gyulladás, valamint fájdalom állatkísérletes modelljeiben - MTA doktori értekezés.
24. Helyes Z, Pinter E, Szolcsanyi J (2009) Regulatory role of sensory neuropeptides in inflammation. In: Kovacs M, Merchentahler I, editors. Neuropeptides and Peptide Analogs. Kerala, India: Research Signpost, Vol. 661. pp. 111–141.
25. Anand P, Bley K (2011) Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. Br J Anaesth 107: 490–502.
26. Sugimoto T, Xiao C, Ichikawa H (1998) Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res 807: 147–154.
27. Ohtori S, Chiba T, Takahashi K, Ino H, Yamagata M, et al. (2000) Neonatal capsaicin treatment decreased substance P receptor immunoreactivity in lamina III neurons of the dorsal horn. Neurosci Res 38: 147–154.
96
28. Maggi C, Patacchini R, Tramontana M, Amann R, Giuliani S, et al. (1990) Similarities and differences in the action of resiniferatoxin and capsaicin on central and peripheral endings of primary sensory neurons. Neuroscience 37: 531–539.
29. Szolcsányi J, Pintér E (2013) Transient receptor potential vanilloid 1 as a therapeutic target in analgesia. Expert Opin Ther targets 17: 641–657.
30. Gunthorpe MJ, Szallasi A (2008) Peripheral TRPV1 receptors as targets for drug development: new molecules and mechanisms. Curr Pharm Des 14: 32–41.
31. Jancsó G, Kiraly E, Jancsó-Gábor A (1977) Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature 270: 741–743.
32. Pinter E, Szolcsanyi J (1995) PLASMA EXTRAVASATION IN THE SKIN AND PELVIC ORGANS EVOKED BY ANTIDROMIC STIMULATION OF THE LUMBOSACRAL DORSAL ROOTS OF THE RAT. Neuroscience 68: 603–614.
33. Helyes Z, Elekes K, Sándor K, Szitter I, Kereskai L, et al. (2010) Involvement of preprotachykinin A gene-encoded peptides and the neurokinin 1 receptor in endotoxin-induced murine airway inflammation. Neuropeptides 44: 399–406.
34. Nilius B, Appendino G, Owsianik G (2012) The transient receptor potential channel TRPA1: from gene to pathophysiology. Pflugers Arch 464: 425–458.
35. Bessac BF, Jordt S-E (2008) Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation and reflex control. Physiology (Bethesda) 23: 360–370.
36. Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, et al. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112: 819–829.
37. Jordt S, Bautista DM, Chuang H, Meng ID, Julius D (2004) Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260–264.
38. Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J (2005) Nociceptor and hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J Neurosci 25: 4052–4061.
39. Spahn V, Stein C, Zöllner C (2014) Modulation of transient receptor vanilloid 1 activity by transient receptor potential ankyrin 1. Mol Pharmacol 85: 335–344.
40. Kobayashi K, Fukuoka T, Obata K, Yamanaka H, Dai Y, et al. (2005) Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J Comp Neurol 493: 596–606.
41. Storti B, Bizzarri R, Cardarelli F, Beltram F (2012) Intact microtubules preserve transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) functionality through receptor binding. J Biol Chem 287: 7803–7811.
97
42. Steenland HW, Ko SW, Wu L-J, Zhuo M (2006) Hot receptors in the brain. Mol Pain 2: 34.
43. Han P, Korepanova A V, Vos MH, Moreland RB, Chiu ML, et al. (2013) Quantification of TRPV1 protein levels in rat tissues to understand its physiological roles. J Mol Neurosci 50: 23–32.
44. Nilius B, Szallasi A (2014) Transient receptor potential channels as drug targets: from the science of basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev 66: 676–814.
45. Tóth A, Boczán J, Kedei N, Lizanecz E, Bagi Z, et al. (2005) Expression and distribution of vanilloid receptor 1 (TRPV1) in the adult rat brain. Brain Res Mol Brain Res 135: 162–168.
46. Doihara H, Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Kojima R, Yokoyama T, et al. (2009) Molecular cloning and characterization of dog TRPA1 and AITC stimulate the gastrointestinal motility through TRPA1 in conscious dogs. Eur J Pharmacol 617: 124–129.
47. De Moura JC, Noroes MM, Rachetti VDPS, Lobão-Soares B, Preti D, et al. (2014) The blockade of transient receptor potential ankirin 1 (TRPA1) signaling mediates antidepressant- and anxiolytic-like actions in mice. Br J Pharmacol 1: 1–26.
48. Bautista DM, Pellegrino M, Tsunozaki M (2013) TRPA1: A gatekeeper for inflammation. Annu Rev Physiol 75: 181–200.
49. Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, et al. (2004) Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849–857.
50. Taylor-Clark TE, McAlexander M a, Nassenstein C, Sheardown S a, Wilson S, et al. (2008) Relative contributions of TRPA1 and TRPV1 channels in the activation of vagal bronchopulmonary C-fibres by the endogenous autacoid 4-oxononenal. J Physiol 586: 3447–3459.
51. Takahashi N, Mizuno Y, Kozai D (2008) Molecular characterization of TRPA1 channel activation by cysteine-reactive inflammatory mediators. Channels 2: 1–12.
52. Takahashi N, Mori Y (2011) TRP Channels as Sensors and Signal Integrators of Redox Status Changes. Front Pharmacol 2: 58.
53. SuperPain Database (n.d.). http://bioinformatics.charite.de.
54. Salazar H, Llorente I, Jara-Oseguera A, García-Villegas R, Munari M, et al. (2008) A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci 11: 255–261.
55. Birder LA, Kanai AJ, Groat WC De, Kiss S, Nealen ML, et al. (2001) Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. PNAS 98: 13396–13401.
98
56. Denda M, Fuziwara S, Inoue K, Denda S, Akamatsu H, et al. (2001) Immunoreactivity of VR1 on epidermal keratinocyte of human skin. Biochem Biophys Res Commun 285: 1250–1252.
57. Lazzeri M, Vannucchi MG, Zardo C, Spinelli M, Beneforti P, et al. (2004) Immunohistochemical evidence of vanilloid receptor 1 in normal human urinary bladder. Eur Urol 46: 792–798.
58. Seki N, Shirasaki H, Kikuchi M, Himi T (2007) Capsaicin induces the production of IL-6 in human upper respiratory epithelial cells. Life Sci 80: 1592–1597.
59. Saunders CI, Kunde D a, Crawford A, Geraghty DP (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) and 2 (TRPV2) in human peripheral blood. Mol Immunol 44: 1429–1435.
60. Charrua A, Reguenga C, Cordeiro JM, Correiade-Sá P, Paule C, et al. (2009) Functional transient receptor potential vanilloid 1 is expressed in human urothelial cells. J Urol 182: 2944–2950.
61. Stander S, Moormann C, Schumacher M, Buddenkotte J, Artuc M, et al. (2004) Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures. Exp Dermatol 13: 129–139.
62. Bertin S, Aoki-Nonaka Y, de Jong PR, Nohara LL, Xu H, et al. (2014) The ion channel TRPV1 regulates the activation and proinflammatory properties of CD4(+) T cells. Nat Immunol.
63. Southall MD, Li TAO, Gharibova LS, Pei Y, Nicol GD, et al. (2003) Activation of Epidermal Vanilloid Receptor-1 Induces Release of Proinflammatory Mediators in Human Keratinocytes. 304: 217–222.
64. Lee H, Caterina MJ (2005) TRPV channels as thermosensory receptors in epithelial cells. Pflugers Arch 451: 160–167.
65. Li WH, Lee YM, Kim JY, Kang S, Kim S, et al. (2007) Transient receptor potential vanilloid-1 mediates heat-shock-induced matrix metalloproteinase-1 expression in human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 127: 2328–2335.
66. Lee YM, Li WH, Kim YK, Kim KH, Chung JH (2008) Heat-induced MMP-1 expression is mediated by TRPV1 through PKCalpha signaling in HaCaT cells. Exp Dermatol 17: 864–870.
67. Saunders CI, Fassett RG, Geraghty DP (2009) Up-regulation of TRPV1 in mononuclear cells of end-stage kidney disease patients increases susceptibility to N-arachidonoyl-dopamine (NADA)-induced cell death. Biochim Biophys Acta 1792: 1019–1026.
68. Denda S, Denda M, Inoue K, Hibino T (2010) Glycolic acid induces keratinocyte proliferation in a skin equivalent model via TRPV1 activation. J Dermatol Sci 57: 108–113.
99
69. Kark T, Bagi Z, Lizanecz E, Pásztor TE, Erdei N, et al. (2008) Tissue-Specific Regulation of Microvascular Diameter : Opposite Functional Roles of Neuronal and Smooth Muscle Located Vanilloid Receptor-1. Mol Pharmacol 73: 1405–1412.
70. Czikora Á, Lizanecz E, Bakó P, Rutkai I, Ruzsnavszky F, et al. (2012) Structure-activity relationships of vanilloid receptor agonists for arteriolar TRPV1. Br J Pharmacol 165: 1801–1812.
71. Lai J, Douglas SD, Ho W (1998) Human lymphocytes express substance P and its receptor. J Neuroimmunol 86: 80–86.
72. Bíró T, Maurer M, Modarres S, Lewin NE, Brodie C, et al. (1998) Characterization of Functional Vanilloid Receptors Expressed by Mast Cells. Blood 91: 1332–1340.
73. Szallasi A, Nilsson S, Farkas-Szallasi T, Blumberg PM, Hökfelt T, et al. (1995) Vanilloid (capsaicin) receptors in the rat: distribution in the brain, regional differences in the spinal cord, axonal transport to the periphery, and depletion by systemic vanilloid treatment. Brain Res 703: 175–183.
74. Ferrandiz-Huertas C, Mathivanan S, Wolf C, Devesa I, Ferrer-Montiel A (2014) Trafficking of ThermoTRP Channels. Membranes (Basel) 4: 525–564.
75. Flockerzi V, Nilius B (2014) TRPs: truly remarkable proteins.
76. Bán Á, Marincsák R, Bíró T, Perkecz A, Gömöri É, et al. (2010) Upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid Type-1 Receptor Expression in Oral Lichen Planus. Neuroimmunomodulation 17: 103–108.
77. Tóth E, Kun J, Perkecz A, Tornoczky T, Gerlinger I, et al. (2014) Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors in chronic rhinosinusitis. Rhinology 52: 625.
78. Vaudry D, Falluel-Morel A, Bourgault S, Basille M, Burel D, et al. (2009) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Its Receptors: 20 Years after the Discovery. Pharmacol Rev 61: 283–357.
79. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minaminot N, Ueharas A, et al. (1989) ISOLATION OF A NOVEL 38 RESIDUE-HYPOTHALAMIC POLYPEPTIDE WHICH STIMULATES ADENYLATE CYCLASE IN PITUITARY CELLS. Biochem Biophys Res Commun 164: 567–574.
80. Arimura A (1998) Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems. Jpn J Physiol 48: 301–331.
81. Arimura A (2007) PACAP: the road to discovery. Peptides 28: 1617–1619.
82. Faculty of Science, University of Toyama http://www.sci.u-toyama.ac.jp/ (n.d.).
83. Dickson L, Finlayson K (2009) VPAC and PAC receptors: From ligands to function. Pharmacol Ther 121: 294–316.
100
84. Somogyvari-Vigh A, Reglodi D (2004) Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide : A Potential Neuroprotective Peptide. Curr Pharm Des 10: 2861–2889.
85. Tan Y-V, Waschek J a (2011) Targeting VIP and PACAP receptor signalling: new therapeutic strategies in multiple sclerosis. ASN Neuro 3.
86. Ohtaki H, Nakamachi T, Dohi K, Shioda S (2008) Role of PACAP in ischemic neural death. J Mol Neurosci 36: 16–25.
87. Rácz B, Gasz B, Borsiczky B, Gallyas F, Tamás A, et al. (2007) Protective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in endothelial cells against oxidative stress-induced apoptosis. Gen Comp Endocrinol 153: 115–123.
88. Reglodi D, Kiss P, Szabadfi K, Atlasz T, Gabriel R, et al. (2012) PACAP is an endogenous protective factor-insights from PACAP-deficient mice. J Mol Neurosci 48: 482–492.
89. Reichenstein M, Rehavi M, Pinhasov A (2008) Involvement of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the mechanism of antidepressant action. J Mol Neurosci 36: 330–338.
90. Shimakura S-I, Kojima K, Nakamachi T, Kageyama H, Uchiyama M, et al. (2008) Neuronal interaction between melanin-concentrating hormone- and alpha-melanocyte-stimulating hormone-containing neurons in the goldfish hypothalamus. Peptides 29: 1432–1440.
91. Lenti L, Domok F, Kis D, Zimmermann A (2008) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide ( PACAP ) preserves pial arteriolar dilation to hypercapnia and N-methyl-D-aspartate ( NMDA ) after global cerebral ischemia in piglets. FASEB J 22: 1151.
92. Tamas A, Reglodi D, Farkas O, Kovesdi E, Pal J, et al. (2012) Effect of PACAP in Central and Peripheral Nerve Injuries. Int J Mol Sci 13: 8430–8448.
93. Helyes Z, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, et al. (2007) Inhibitory effect of PACAP-38 on acute neurogenic and non-neurogenic inflammatory processes in the rat. Peptides 28: 1847–1855.
94. Kemény A, Reglodi D, Cseharovszky R, Hashimoto H, Baba A, et al. (2010) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide deficiency enhances oxazolone-induced allergic contact dermatitis in mice. J Mol Neurosci 42: 443–449.
95. Cardell LO, Stjärne P, Wagstaff SJ, Agustí C, Nadel J a (1997) PACAP-induced plasma extravasation in rat skin. Regul Pept 71: 67–71.
96. Markovics A, Kormos V, Gaszner B, Lashgarara A, Szoke E, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice. Neurobiol Dis 45: 633–644.
97. Yadav M, Huang M-C, Goetzl EJ (2011) VPAC1 (vasoactive intestinal peptide (VIP) receptor type 1) G protein-coupled receptor mediation of VIP enhancement of murine experimental colitis. Cell Immunol 267: 124–132.
101
98. Chen Y, Zhou Z, Wang Z, Gao H, Zheng X (2004) On PACAP-aggravated experimental acute pancreatitis. J Biomed Eng 21: 964–969.
99. El Zein N, Badran B, Sariban E (2008) The neuropeptide pituitary adenylate cyclase activating polypeptide modulates Ca2+ and pro-inflammatory functions in human monocytes through the G protein-coupled receptors VPAC-1 and formyl peptide receptor-like 1. Cell Calcium 43: 270–284.
100. Pecze L, Szabó K, Széll M, Jósvay K, Kaszás K, et al. (2008) Human Keratinocytes Are Vanilloid Resistant. PLoS One 3: 1–10.
101. Bánvölgyi A, Pálinkás L, Berki T, Clark N, Grant AD, et al. (2005) Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor in a cutaneous contact allergic dermatitis model. J Neuroimmunol 169: 86–96.
102. Athanasiou A, Smith P a, Vakilpour S, Kumaran NM, Turner AE, et al. (2007) Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun 354: 50–55.
103. Porszasz R, Porkolab A, Ferencz A, Pataki T, Szilvassy Z, et al. (2002) Capsaicin-induced nonneural vasoconstriction in canine mesenteric arteries. Eur J Pharm 441: 173–175.
104. Bodó E, Kovács I, Telek A, Varga A, Paus R, et al. (2004) Vanilloid receptor-1 (VR1) is widely expressed on various epithelial and mesenchymal cell types of human skin. J Invest Dermatol 123: 410–413.
105. Engler A, Aeschlimann A, Simmen BR, Michel B a, Gay RE, et al. (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) in synovial fibroblasts from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Res Commun 359: 884–888.
106. Ko F, Diaz M, Smith P, Emerson E, Yj K, et al. (1998) Toxic effects of capsaicin on keratinocytes and fibroblasts . PubMed Commons. J Burn Care Rehabil 19: 409–413.
107. Liedtke WB, Heller S (2007) TRP Ion Channel Function in Sensory Transduction and Cellular Signaling Cascades. Liedtke WB, Heller S, editors CRC.
108. Szoke E, Börzsei R, Tóth DM, Lengl O, Helyes Z, et al. (2010) Effect of lipid raft disruption on TRPV1 receptor activation of trigeminal sensory neurons and transfected cell line. Eur J Pharmacol 628: 67–74.
109. Czikora Á, Rutkai I, Pásztor ET, Szalai A, Pórszász R, et al. (2013) Different desensitization patterns for sensory and vascular TRPV1 populations in the rat: expression, localization and functional consequences. PLoS One 8: e78184.
110. Donnerer J, Lembeck F (1982) Analysis of the effects of intravenously injected capsaicin in the rat. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 320: 54–57.
102
111. Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, et al. (2002) Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun 291: 124–129.
112. Radtke C, Sinis N, Sauter M, Jahn S, Kraushaar U, et al. (2011) TRPV channel expression in human skin and possible role in thermally induced cell death. J Burn Care Res2 32: 150–159.
113. Dux M, Sántha P, Jancsó G (2003) Capsaicin-sensitive neurogenic sensory vasodilatation in the dura mater of the rat. J Physiol 552: 859–867.
114. Lizanecz E, Bagi Z, Pásztor ET, Papp Z, Edes I, et al. (2006) Phosphorylation-dependent desensitization by anandamide of vanilloid receptor-1 (TRPV1) function in rat skeletal muscle arterioles and in Chinese hamster ovary cells expressing TRPV1. Mol Pharmacol 69: 1015–1023.
115. Szolcsanyi J, Oroszi G, Nemeth J, Szilvassy Z, Blasig IE, et al. (2001) Functional and biochemical evidence for capsaicin-induced neural endothelin release in isolated working rat heart. Eur J Pharmacol 419: 215–221.
116. Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-immunoreactivity in human spinal cord and dorsal root ganglia. Brain Res 721: 233–237.
117. Zhang Y, Malmberg a B, Yaksh TL, Sjölund B, Sundler F, et al. (1997) Capsaicin-evoked release of pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) from rat spinal cord in vivo. Regul Pept 69: 83–87.
118. Fahrenkrug J, Hannibal J (1998) PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING POLYPEPTIDE IMMUNOREACTIVITY IN CAPSAICIN-SENSITIVE NERVE FIBRES SUPPLYING THE RAT URINARY TRACT. Neuroscience 83: 1261–1272.
119. Møller M, Fahrenkrug J, Hannibal J (1999) Innervation of the rat pineal gland by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-immunoreactive nerve fibres. Cell Tissue Res 296: 247–257.
120. Hannibal J, Fahrenkrug J (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in intrinsic and extrinsic nerves of the rat pancreas. Cell Tissue Res 299: 59–70.
121. Németh J, Reglödi D, Pozsgai G, Szabó A, Elekes K, et al. (2006) Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143: 223–230.
122. Steinhoff M, McGregor GP, Radleff-Schlimme A, Steinhoff A, Jarry H, et al. (1999) Identification of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and PACAP type 1 receptor in human skin: expression of PACAP-38 is increased in patients with psoriasis. Regul Pept 80: 49–55.
103
123. Kodali S, Friedman I, Ding W, Seiffert K, Wagner J a, et al. (2003) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibits cutaneous immune function. Eur J Immunol 33: 3070–3079.
124. Peters EMJ, Ericson ME, Hosoi J, Seiffert K, Hordinsky MK, et al. (2006) Neuropeptide control mechanisms in cutaneous biology: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol 126: 1937–1947.
125. Gomariz RP, Juarranz Y, Abad C, Arranz A, Leceta J, et al. (2006) VIP-PACAP system in immunity: new insights for multitarget therapy. Ann N Y Acad Sci 1070: 51–74.
126. Ding W, Wagner J a, Granstein RD (2007) CGRP, PACAP, and VIP modulate Langerhans cell function by inhibiting NF-kappaB activation. J Invest Dermatol 127: 2357–2367.
127. Ding W, Manni M, Stohl LL, Zhou XK, Wagner J a, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating peptide and vasoactive intestinal polypeptide bias Langerhans cell Ag presentation toward Th17 cells. Eur J Immunol 42: 901–911.
128. Tan Y-V, Abad C, Wang Y, Lopez R, Waschek J a (2013) Pituitary adenylate cyclase activating peptide deficient mice exhibit impaired thymic and extrathymic regulatory T cell proliferation during EAE. PLoS One 8: e61200.
129. Armstrong BD, Abad C, Chhith S, Cheung-Lau G, Hajji OE, et al. (2008) Impaired nerve regeneration and enhanced neuroinflammatory response in mice lacking pituitary adenylyl cyclase activating peptide. Neuroscience 151: 63–73.
130. Azuma Y-T, Hagi K, Shintani N, Kuwamura M, Nakajima H, et al. (2008) PACAP provides colonic protection against dextran sodium sulfate induced colitis. J Cell Physiol 216: 111–119.
131. Nemetz N, Abad C, Lawson G, Nobuta H, Chhith S, et al. (2008) Induction of colitis and rapid development of colorectal tumors in mice deficient in the neuropeptide PACAP. Int J Cancer 122: 1803–1809.
132. Tan Y-V, Abad C, Lopez R, Dong H, Liu S, et al. (2009) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide is an intrinsic regulator of Treg abundance and protects against experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci 106: 2012–2017.
133. Abad C, Waschek J a (2011) Immunomodulatory roles of VIP and PACAP in models of multiple sclerosis. Curr Pharm Des 17: 1025–1035.
134. Elekes K, Sandor K, Moricz A, Kereskai L, Kemeny A, et al. (2011) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays an anti-inflammatory role in endotoxin-induced airway inflammation: in vivo study with gene-deleted mice. Peptides 32: 1439–1446.
135. Hashimoto H, Shintani N, Baba A (2006) New insights into the central PACAPergic system from the phenotypes in PACAP- and PACAP receptor-knockout mice. Ann N Y Acad Sci 1070: 75–89.
104
136. Boros M, Kemény Á, Sebők B, Bagoly T, Perkecz A, et al. (2013) Sulphurous medicinal waters increase somatostatin release: It is a possible mechanism of anti-inflammatory effect of balneotherapy in psoriasis. Eur J Integr Med 5: 109–118.
137. Jakab B, Reglodi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, et al. (2004) Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Methods 61: 189–198.
138. Dobrosi N, Tóth BI, Nagy G, Dózsa A, Géczy T, et al. (2008) Endocannabinoids enhance lipid synthesis and apoptosis of human sebocytes via cannabinoid receptor-2-mediated signaling. FASEB J 22: 3685–3695.
139. De Falco M, Pisano MM, Luca A De (2014) Embryology and Anatomy of the Skin. Skin Cancer - Current Clinical Pathilogy. Springer Netherlands. pp. 1–15.
140. Moller K, Zhangj Y, Lurs AA, Lund RSJ, Uddman RJ (1993) PITUITARY ADENY LATE CYCLASE ACTIVATING PEPTIDE IS A SENSORY NEUROPEPTIDE: IMMUNOCYTOCHEMICAL AND IMMUNOCHEMICAL EVIDENCE. Neuroscience 57: 725–732.
141. Mulder H, Jongsma H, Zhang Y, Gebre-medhin S, Sundler F, et al. (1999) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Islet Amyloid Polypeptide in Primary Sensory Neurons. Mol Neurobiol 19: 229–253.
142. Tóth BI, Géczy T, Griger Z, Dózsa A, Seltmann H, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling as a regulator of human sebocyte biology. J Invest Dermatol 129: 329–339.
143. Tóth BI, Benko S, Szöllosi AG, Kovács L, Rajnavölgyi E, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling inhibits differentiation and activation of human dendritic cells. FEBS Lett 583: 1619–1624.
144. Holzer P (1988) LOCAL EFFECTOR FUNCTIONS OF CAPSAKIN-SENSITIVE SENSORY NERVE ENDINGS: INVOLVEMENT OF TACHYKININS, CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE AND OTHER NEUROPEPTIDES. Neuroscience 24: 739–768.
145. Szolcsányi J (1996) Neurogenic inflammation, reevaluation of axon reflex theory. In: Geppetti P, Holzer P, editors. Neurogenic inflammation. Boca Raton: CRC Press. pp. 33–42.
146. Qin HY, Sadelain MW, Hitchon C, Lauzon J, Singh B (1993) Complete Freund’s adjuvant-induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol 150: 2072–2080.
147. Allison AC (2008) Effects of Adjuvants on Different Cell Types and Their Interactions in Immune Responses. In: Wolstenholme GEW, Knight J, editors. Ciba Foundation Symposium 18 - Immunopotentiation.
148. Abu-Hamdan MD, Drescher MJ, Ramakrishnan N a, Khan KM, Toma VS, et al. (2006) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC1-R) in
105
the cochlea: evidence for specific transcript expression of PAC1-R splice variants in rat microdissected cochlear subfractions. Neuroscience 140: 147–161.
149. Dalsgaard T, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen CR, Ottesen B (2003) VIP and PACAP display different vasodilatory effects in rabbit coronary and cerebral arteries. Regul Pept 110: 179–188.
150. Rubin DC, Shaker A, Levin MS (2012) Chronic intestinal inflammation: inflammatory bowel disease and colitis-associated colon cancer. Front Immunol 3: 107.
151. Solomon L, Mansor S, Mallon P, Donnelly E, Hoper M, et al. (2010) The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comp Clin Path 19: 235–239.
152. Perše M, Cerar A (2012) Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol 2012: 718617.
153. McLean MH, Neurath MF, Durum SK (2014) Targeting Interleukins for the Treatment of Inflammatory Bowel Disease-What Lies Beyond Anti-TNF Therapy? Inflamm Bowel Dis 20: 389–397.
154. Szolcsányi J (1982) Capsaicin type pungent agents producing pyrexia. Pyretics and Antipyretics. pp. 437–478.
155. Holzer P (2011) TRP channels in the digestive system. Curr Pharm Biotechnol 12: 24–34.
156. Holzer P (2011) Transient receptor potential (TRP) channels as drug targets for diseases of the digestive system. Pharmacol Ther 131: 142–170.
157. Holzer P (1992) Peptidergic sensory neurons in the control of vascular functions: mechanisms and significance in the cutaneous and splanchnic vascular beds. Rev Physiol Biochem Pharmacol 121: 49–146.
158. Szitter I, Pozsgai G, Sandor K, Elekes K, Kemeny A, et al. (2010) The role of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptors in dextran sulfate-induced colitis in mice. J Mol Neurosci 42: 80–88.
159. Lee J, Yamamoto T, Kuramoto H, Kadowaki M (2012) TRPV1 expressing extrinsic primary sensory neurons play a protective role in mouse oxazolone-induced colitis. Auton Neurosci 166: 72–76.
160. Holzer P (2004) Vanilloid receptor TRPV1: hot on the tongue and inflaming the colon. Neurogastroenterol Motil 16: 697–699.
161. Fujino K, Takami Y, de la Fuente SG, Ludwig K a, Mantyh CR (2004) Inhibition of the vanilloid receptor subtype-1 attenuates TNBS-colitis. J Gastrointest Surg 8: 842–847; discussion 847–848.
162. Kimball ES, Wallace NH, Schneider CR, D’Andrea MR, Hornby PJ (2004) Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Neurogastroenterol Motil 16: 811–818.
106
163. Massa F, Sibaev A, Marsicano G, Blaudzun H, Storr M, et al. (2006) Vanilloid receptor (TRPV1)-deficient mice show increased susceptibility to dinitrobenzene sulfonic acid induced colitis. J Mol Med (Berl) 84: 142–146.
164. Goso C, Evangelista S, Tramontana M, Manzini S, Blumberg PM, et al. (1993) Topical capsaicin administration protects against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in the rat. Eur J Pharmacol 249: 185–190.
165. Vinuesa AG, Sancho R, García-Limones C, Behrens A, ten Dijke P, et al. (2012) Vanilloid receptor-1 regulates neurogenic inflammation in colon and protects mice from colon cancer. Cancer Res 72: 1705–1716.
166. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, et al. (2007) 4-Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1. PNAS 104: 13519–13524.
167. Brain SD, Williams TJ, Tippins JR, Morris HR, MacIntyre I (1985) Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature 313: 54–56.
168. Engel M a, Leffler A, Niedermirtl F, Babes A, Zimmermann K, et al. (2011) TRPA1 and substance P mediate colitis in mice. Gastroenterology 141: 1346–1358.
169. Engel M a, Khalil M, Siklosi N, Mueller-Tribbensee SM, Neuhuber WL, et al. (2012) Opposite effects of substance P and calcitonin gene-related peptide in oxazolone colitis. Dig Liver Dis 44: 24–29.
170. Kimball ES, Prouty SP, Pavlick KP, Wallace NH, Schneider CR, et al. (2007) Stimulation of neuronal receptors, neuropeptides and cytokines during experimental oil of mustard colitis. Neurogastroenterol Motil 19: 390–400.
171. Engel MA, Becker C, Reeh PW, Neurath MF (2011) Role of sensory neurons in colitis: increasing evidence for a neuroimmune link in the gut. Inflamm Bowel Dis 17: 1030–1033.
172. Bernstein C, Robert M, Eysselein E (1993) Rectal Substance P Concentrations Are Increased in Ulcerative Colitis But Not in Crohn ’s Disease . Am J Gastroenterol 88: 908–913.
173. Szitter I, Pintér E, Perkecz A, Kemény A, Kun J, et al. (2014) Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with gene-deleted mice and the selective receptor antagonist netupitant. Inflamm Res DOI 10.100.
174. Goode T (2000) Neurokinin-1 receptor expression in inflammatory bowel disease: molecular quantitation and localisation. Gut 47: 387–396.
175. Kaneko Y, Szallasi A (2013) Transient Receptor Potential (TRP) channels: a clinical perspective. Br J Pharmacol.
107
176. Romano B, Borrelli F, Fasolino I, Capasso R, Piscitelli F, et al. (2013) The cannabinoid TRPA1 agonist cannabichromene inhibits nitric oxide production in macrophages and ameliorates murine colitis. Br J Pharmacol 169: 213–229.
177. Pozsgai G, Helyes Z, Pinter E (2013) P42 Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis. Nitric Oxide 31: S53–S54.
178. Cattaruzza F, Spreadbury I, Miranda-Morales M, Grady EF, Vanner S, et al. (2010) Transient receptor potential ankyrin-1 has a major role in mediating visceral pain in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298: G81–G91.
179. Szolcsányi J, Helyes Z, Oroszi G, Németh J, Pinter E (1998) Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br J Pharmacol 123: 936–942.
180. Szolcsanyi J, Pinter E, Helyes Z, Petho G (2011) Inhibition of the Function of TRPV1-Expressing Nociceptive Sensory Neurons by Somatostatin 4 Receptor Agonism: Mechanism and Therapeutical Implications. Curr Top Med Chem 11: 2253–2263.
181. Bautista DM, Jordt S-E, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, et al. (2006) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 124: 1269–1282.
182. Knowlton WM, Bifolck-Fisher A, Bautista DM, McKemy DD (2010) TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain 150: 340–350.
183. Nedvig K, Weber G, Nemeth J, Kovacs K, Reglodi D, et al. (2012) Changes of PACAP immunoreactivities and cytokine levels after PACAP-38 containing intestinal preservation and autotransplantation. J Mol Neurosci 48: 788–794.
184. Akbar a, Yiangou Y, Facer P, Walters JRF, Anand P, et al. (2008) Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut 57: 923–929.
185. Kondo T, Oshima T, Obata K, Sakurai J, Knowles CH, et al. (2010) Role of transient receptor potential A1 in gastric nociception. Digestion 82: 150–155.
186. Yu Y-B, Yang J, Zuo X-L, Gao L-J, Wang P, et al. (2010) Transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) and ankyrin-1 (TRPA1) participate in visceral hyperalgesia in chronic water avoidance stress rat model. Neurochem Res 35: 797–803.
187. Feng B, La JH, Schwartz ES, Gebhart GF (2012) Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 302: G1085–G1098.
188. Brederson J-D, Kym PR, Szallasi A (2013) Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol 716: 61–76.
108
189. Pozsgai G, Hajna Z, Bagoly T, Boros M, Kemény Á, et al. (2012) The role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptor activation in hydrogen-sulphide-induced CGRP-release and vasodilation. Eur J Pharmacol 689: 56–64.
190. Pozsgai G, Helyes Z, Pintér E (1998) Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis: 100.
191. Holzer P, Holzer-Petsche U (2001) Tachykinin receptors in the gut: physiological and pathological implications. Curr Opin Pharmacol 1: 583–590.
192. Menzies JR, McKee R, Corbett a D (2001) Differential alterations in tachykinin NK2 receptors in isolated colonic circular smooth muscle in inflammatory bowel disease and idiopathic chronic constipation. Regul Pept 99: 151–156.
193. Renzi D, Pellegrini B, Tonelli F, Surrenti C, Calabrò A (2000) Substance P (neurokinin-1) and neurokinin A (neurokinin-2) receptor gene and protein expression in the healthy and inflamed human intestine. Am J Pathol 157: 1511–1522.
194. Evangelista S, Tramontana M, Maggi C a (2008) Spatial and temporal expression of tachykinins and NK1- and NK2-receptor gene during TNB induced colitis in rats. Neuropeptides 42: 663–670.
195. Sanger GJ (2004) Neurokinin NK1 and NK3 receptors as targets for drugs to treat gastrointestinal motility disorders and pain. Br J Pharmacol 141: 1303–1312.
196. Vu JP, Million M, Larauche M, Luong L, Norris J, et al. (2014) Inhibition of Vasoactive Intestinal Polypeptide (VIP) Induces Resistance to Dextran Sodium Sulfate (DSS)-Induced Colitis in Mice. J Mol Neurosci 52: 37–47.
197. Todorovic V, Janic B, Koko V, Micev M, Ja N, et al. (1996) Colonic vasoactive intestinal polypeptide (VIP) in ulcerative colitis--a radioimmunoassay and immunohistochemical study. Hepatogastroenterology 43: 483–488.
198. Abad C, Juarranz Y, Martinez C, Arranz A, Rosignoli F, et al. (2005) cDNA array analysis of cytokines, chemokines, and receptors involved in the development of TNBS-induced colitis: homeostatic role of VIP. Inflamm Bowel Dis 11: 674–684.
199. Sigalet DL, Wallace LE, Holst JJ, Martin GR, Kaji T, et al. (2007) Enteric neural pathways mediate the anti-inflammatory actions of glucagon-like peptide 2. J Mol Neurosci 293: 211–221.
200. Lakhan SE, Kirchgessner A (2010) Neuroinflammation in inflammatory bowel disease. J Neuroinflammation 7: 37.
201. Newman R, Cuan N, Hampartzoumian T, Connor SJ, Lloyd a R, et al. (2005) Vasoactive intestinal peptide impairs leucocyte migration but fails to modify experimental murine colitis. Clin Exp Immunol 139: 411–420.
202. Thomson AW, Lotze MT, editors (2003) The Cytokine Handbook, Two-Volume Set. Gulf Professional Publishing.
109
203. Brynskov J, Foegh P, Pedersen G, Ellervik C, Kirkegaard T, et al. (2002) Tumour necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) activity in the colonic mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut 51: 37–43.
204. Deleporte A, Viennot S, Dupont B, Giletta C, Allaire M, et al. (2013) Efficacy of anti-TNF-alpha monoclonal antibodies in inflammatory bowel disease treatment. Int J Interf Cytokine Mediat Res 5: 11–31.
205. Bauer C, Loher F, Dauer M, Mayer C, Lehr HA, et al. (2007) The ICE inhibitor pralnacasan prevents DSS-induced colitis in C57BL/6 mice and suppresses IP-10 mRNA but not TNF-alpha mRNA expression. Dig Dis Sci 52: 1642–1652.
206. Alex P, Zachos NC, Nguyen T, Gonzales L, Chen T-E, et al. (2009) Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis. Inflamm Bowel Dis 15: 341–352.
207. Tixier E, Galmiche J-P, Neunlist M (2006) Intestinal neuro-epithelial interactions modulate neuronal chemokines production. Biochem Biophys Res Commun 344: 554–561.
208. Li L, Liu Z, Yang X, Yan H, Bao S, et al. (2013) Bioluminescence imaging for IL-1β expression in experimental colitis. J Inflamm (Lond) 10: 16.
209. Carlsen HS, Baekkevold ES, Johansen F-E, Haraldsen G, Brandtzaeg P (2002) B cell attracting chemokine 1 (CXCL13) and its receptor CXCR5 are expressed in normal and aberrant gut associated lymphoid tissue. Gut 51: 364–371.
210. Poole DP, Pelayo JC, Cattaruzza F, Kuo Y-M, Gai G, et al. (2011) Transient receptor potential ankyrin 1 is expressed by inhibitory motoneurons of the mouse intestine. Gastroenterology 141: 565–575, 575.e1–e4.
211. Izzo A, Capasso R, Aviello G, Borrelli F, Romano B, et al. (2012) Inhibitory effect of cannabichromene, a major non-psychotropic cannabinoid extracted from Cannabis sativa, on inflammation-induced hypermotility in mice. Br J Pharmacol 166: 1444–1460.
212. Yang J, Li Y, Zuo X, Zhen Y, Yu Y, et al. (2008) Transient receptor potential ankyrin-1 participates in visceral hyperalgesia following experimental colitis. Neurosci Lett 440: 237–241.
213. Schmidt M, Dubin AE, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A (2009) Nociceptive signals induce trafficking of TRPA1 to the plasma membrane. Neuron 64: 498–509.
214. Keszthelyi D, Troost FJ, Jonkers DM, Helyes Z, Hamer HM, et al. (2013) Alterations in mucosal neuropeptides in patients with irritable bowel syndrome and ulcerative colitis in remission: a role in pain symptom generation? Eur J Pain 17: 1299–1306.
215. Engel M a, Khalil M, Mueller-Tribbensee SM, Becker C, Neuhuber WL, et al. (2012) The proximodistal aggravation of colitis depends on substance P released from TRPV1-expressing sensory neurons. J Gastroenterol 47: 256–265.
110
216. Yiangou Y, Facer P, Dyer NHC, Chan CLH, Knowles C, et al. (2001) Vanilloid receptor 1 immunoreactivity in inflamed human bowel Variant Creutzfeldt-Jakob disease in an elderly patient. Lancet 357: 1338–1339.
217. Matsumoto K, Lo MW, Hosoya T, Tashima K, Takayama H, et al. (2012) Experimental colitis alters expression of 5-HT receptors and transient receptor potential vanilloid 1 leading to visceral hypersensitivity in mice. Lab Invest 92: 769–782.
218. Tohda C, Sasaki M, Konemura T, Sasamura T, Itoh M, et al. (2001) Axonal transport of VR1 capsaicin receptor mRNA in primary afferents and its participation in inflammation-induced increase in capsaicin sensitivity. J Neurochem 76: 1628–1635.
219. Kun J, Helyes Z, Perkecz A, Bán Á, Polgár B, et al. (2012) Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. J Mol Neurosci 48: 795–803.
220. Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethö G, Holzer-Petsche U, et al. (2004) Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur J Pharmacol 500: 143–157.
221. Matsumoto K, Kurosawa E, Terui H, Hosoya T, Tashima K, et al. (2009) Localization of TRPV1 and contractile effect of capsaicin in mouse large intestine: high abundance and sensitivity in rectum and distal colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 297: G348–G360.
222. Patapoutian A, Tate S, Woolf CJ (2009) Transient receptor potential channels : targeting pain at the source. Nat Rev Drug Discov 8: 55–68.
223. Chan CLH, Facer P, Davis JB, Smith GD, Egerton J, et al. (2003) Sensory fibres expressing capsaicin receptor TRPV1 in patients with rectal hypersensitivity and faecal urgency. Lancet 361: 385–391.
224. Holzer P (2003) Acid-sensitive ion channels in gastrointestinal function. Curr Opin Pharmacol 3: 618–625.
225. Anavi-goffer S, Mckay NG, Ashford MLJ, Coutts AA (2002) Vanilloid receptor type 1-immunoreactivity is expressed by intrinsic afferent neurones in the guinea-pig myenteric plexus. Neurosci Lett 319: 53–57.
226. Holzer P (2004) TRPV1 and the gut : from a tasty receptor for a painful vanilloid to a key player in hyperalgesia. Eur J Pharmacol 500: 231–241.
227. Steinbach EC, Plevy SE (2014) The role of macrophages and dendritic cells in the initiation of inflammation in IBD. Inflamm Bowel Dis 20: 166–175.
228. Patel YC (1999) Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol 20: 157–198.
111
229. Joe B, Lokesh BR (1997) Effect of curcumin and capsaicin on arachidonic acid metabolism and lysosomal enzyme secretion by rat peritoneal macrophages. Lipids 32: 1173–1180.
230. Ippoushi K, Azuma K, Ito H, Horie H, Higashio H (2003) [6]-Gingerol inhibits nitric oxide synthesis in activated J774.1 mouse macrophages and prevents peroxynitrite-induced oxidation and nitration reactions. Life Sci 73: 3427–3437.
231. Ippoushi K, Itou H, Azuma K, Higashio H (2002) Effect of naturally occurring organosulfur compounds on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages. Life Sci 71: 411–419.
232. Wagner AE, Boesch-Saadatmandi C, Dose J, Schultheiss G, Rimbach G (2012) Anti-inflammatory potential of allyl-isothiocyanate--role of Nrf2, NF-(κ) B and microRNA-155. J Cell Mol Med 16: 836–843.
233. Lee T-Y, Lee K-C, Chen S-Y, Chang H-H (2009) 6-Gingerol inhibits ROS and iNOS through the suppression of PKC-alpha and NF-kappaB pathways in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages. Biochem Biophys Res Commun 382: 134–139.
234. Lee SH, Lee SY, Son DJ, Lee H, Yoo HS, et al. (2005) Inhibitory effect of 2’-hydroxycinnamaldehyde on nitric oxide production through inhibition of NF-kappa B activation in RAW 264.7 cells. Biochem Pharmacol 69: 791–799.
235. Lee H-S, Kim B-S, Kim M-K (2002) Suppression effect of Cinnamomum cassia bark-derived component on nitric oxide synthase. J Agric Food Chem 50: 7700–7703.
236. Chao LK, Hua K-F, Hsu H-Y, Cheng S-S, Lin I-F, et al. (2008) Cinnamaldehyde inhibits pro-inflammatory cytokines secretion from monocytes/macrophages through suppression of intracellular signaling. Food Chem Toxicol 46: 220–231.
237. Kun J, Helyes Z, Szitter I, Kemény Á, Ernszt D, et al. (2013) TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS. Period Biol 115: 38.
238. Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Doihara H, Kojima R, Okada H, et al. (2009) TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3408–3413.
239. Ahern GP (2011) 5-HT and the immune system. Curr Opin Pharmacol 11: 29–33.
240. Chojnacki C, Wiśniewska-Jarosińska M, Kulig G, Majsterek I, Reiter RJ, et al. (2013) Evaluation of enterochromaffin cells and melatonin secretion exponents in ulcerative colitis. World J Gastroenterol 19: 3602–3607.
241. Nilius B, Appendino G (2013) Spices : the savory and beneficial science of pungency . Rev Physiol Biochem Pharmacol 164: 1–76.
242. Vriens J, Appendino G, Nilius B (2009) Pharmacology of vanilloid transient receptor potential cation channels. Mol Pharmacol 75: 1262–1279.
112
243. Leamy AW, Shukla P, McAlexander M a, Carr MJ, Ghatta S (2011) Curcumin ((E,E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) activates and desensitizes the nociceptor ion channel TRPA1. Neurosci Lett 503: 157–162.
244. Davaatseren M, Hwang J-T, Park JH, Kim M-S, Wang S, et al. (2014) Allyl isothiocyanate ameliorates angiogenesis and inflammation in dextran sulfate sodium-induced acute colitis. PLoS One 9: e102975.
245. Sakamoto N, Kono S, Wakai K, Fukuda Y, Satomi M, et al. (2005) Dietary Risk Factors for Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis 11: 154–163.
246. Chapman-Kiddell C, Davies PSW, Gillen L, Radford-Smith GL (2010) Role of diet in the development of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 16: 137–151.
247. Wagner AE, Will O, Sturm C, Lipinski S, Rosenstiel P, et al. (2013) DSS-induced acute colitis in C57BL/6 mice is mitigated by sulforaphane pre-treatment. J Nutr Biochem 24: 2085–2091.
248. Peyrot des Gachons C, Uchida K, Bryant B, Shima A, Sperry JB, et al. (2011) Unusual pungency from extra-virgin olive oil is attributable to restricted spatial expression of the receptor of oleocanthal. J Neurosci 31: 999–1009.
249. Bennett SM, Hayes JE (2012) Differences in the chemesthetic subqualities of capsaicin, ibuprofen, and olive oil. Chem Senses 37: 471–478.
250. Yamamoto T (2013) Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol 29: 216–221.
251. Berger A, Paige CJ (2005) Hemokinin-1 has Substance P-like function in U-251 MG astrocytoma cells: a pharmacological and functional study. J Neuroimmunol 164: 48–56.
252. Berger A, Tran AH, Paige CJ (2007) Co-regulated decrease of Neurokinin-1 receptor and Hemokinin-1 gene expression in monocytes and macrophages after activation with pro-inflammatory cytokines. J Neuroimmunol 187: 83–93.
113
Köszönetnyilvánítás
Mindenekelőtt szeretném hálámat kifejezni témavezetőmnek, Helyes Zsuzsanna
professzornak, hogy bevezetett a kutatás világába és szakmai, személyes
példamutatásával, pozitív szemléletével korábban nem remélt távlatok elérésére
sarkallt. Hálás köszönetem Pintér Erika professzornak, intézetvezetőnek, Doktori Iskola
és Programvezetőnek, aki gyakorlatilag szintén témavezetőmként, kutatói és emberi
értékek átadásával ösztönzött. Köszönöm Szolcsányi János Professzor Úrnak, hogy
mindvégig figyelemmel kísérte munkámat és iránymutatásokkal látott el.
Köszönöm Dr. Kemény Ágnes és Dr. Szőke Éva lelkes segítségét. Külön köszönöm Hírné
Perkecz Anikónak és Bagoly Teréznek a nélkülözhetetlen munkát, és nem utolsósorban
odaadó asszisztensemnek, Buzási Ádámné Annának az együtt töltött vidám perceket.
Köszönöm Dr. Szitter István, Dr. Sándor Katalin, Dr. Tékus Valéria és Olaszné Zádor
Csilla állatkísérletekben való közreműködését. Köszönet illeti továbbá a Farmakológiai
és Farmakoterápiai Intézet valamennyi munkatársát, az összes kutatót, PhD hallgatót,
az asszisztenseket és állatgondozókat, hogy munkámat kivételesen segítőkész,
támogató légkörben végezhettem.
Eredményeim nem jöhettek volna létre külső együttműködők nélkül. Köszönöm Dr.
Bíró Tamásnak (Debreceni Egyetem) az értékes kooperációt, Dr. Szabadfi Krisztinának
(TTK Kísérletes Állattani és Neurobiológiai Tanszék), Dr. Kereskai Lászlónak (Pathologiai
Intézet) és Dr. Gaszner Balázsnak (Anatómiai Intézet) a szövettani munkában nyújtott
segítséget. Köszönettel tartozom a klinikai mintákért Dr. Szabó Imrének, Dr. Vincze
Áronnak és Dr. Gódi Szilárdnak (I. sz. Belgyógyászati Klinika), továbbá a metodikai
segítségért az Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet munkatársainak: Dr.
Polgár Beátának, Dr. Palkovics Tamásnak és Kiss Áginak. Külön köszönöm Nagy Ágnes
és Kovács Sándor (PTE SzKK Növénybiológiai Csoport) szakmai és baráti támogatását.
Végül, nem lehetek eléggé hálás családomnak, akik mindvégig támogattak és
megfelelő hátteret biztosítottak a munkámhoz.
Köszönöm a Nemzeti Kiválóság Program Apáczai Csere János Doktoranduszi Ösztöndíj
(TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001) támogatását.
114
Publikációs lista
Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények
Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012) IF: 2,504
Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1-mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban. IF: 6,372
Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29., DOI: 10.1371/journal.pone.0108164 IF: 3,534
Az értekezés alapját képező közlemények kumulatív impakt faktora: 6,038.
Független idézők száma: 4.
Egyéb teljes közlemények
Szitter István, Pintér Erika, Perkecz Anikó, Kemény Ágnes, Kun József, Kereskai László, Claudio Pietra, John P. Quinn, Andreas Zimmer, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Helyes Zsuzsanna Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with gene-deleted mice and the selective receptor antagonist netupitant Inflamm. Res. (2014) 63:399–409 IF: 2,143
115
Markovics Adrienn, Kormos Viktória, Gaszner Balázs, Arvin Lashgarara, Szőke Éva, Sandor Katalin, Szabadfi Krisztina, Tuka Bernadett, Tajti János, Szolcsányi János, Pintér Erika, Hitoshi Hashimoto, Kun József, Reglődi Dóra, Helyes Zsuzsanna Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice. NEUROBIOLOGY OF DISEASE 45: pp. 633-644. (2012) IF: 5,403, független idézők: 15.
Az értekezés alapját képező konferencia prezentációk
J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd
Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes
UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 RECEPTOR IN THE
INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON
The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection
and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology,
Budapest, 2014. szeptember 24-26. (poszter)
J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd
Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes
UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE
INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON AND ITS PROTECTIVE ROLES
The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection
and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology,
Budapest, 2014. szeptember 24-26. (előadás)
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, É. Szőke, É. Sághy, D. Ernszt, T. Bagoly, A. Perkecz, K.
Pohóczky, A. Markovics, V. Tékus, E. Pintér
TRPA1 RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS
BY DECREASING TACHYKININ AND INFLAMMATORY CYTOKINE EXPRESSIONS
Semmelweis Symposium 2013: Molecular mechanisms and therapeutic targets in
inflammatory diseases, Budapest, 2013. november 7-9. (poszter)
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K.
Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN
DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS
Magyar Immunológiai Társaság 42. Vándorgyűlése, Pécs, 2013. október 16-18. (poszter)
116
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K.
Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE
SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS
Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013.
szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter)
Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V.
Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro
CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1- MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP
The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye,
ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. Pécs. (előadás)
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér
A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) és vanilloid 1 (TRPV1) receptor mRNS
expresszió gyulladásos bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát (DSS) által indukált egér colitis
modellben
A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos
Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és
Sporttudományi Kar (poszter)
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR
mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-
INDUCED COLITIS IN MICE
Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide
Conference, 2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter)
J. Kun, E. Pintér, I. Szitter, I. Szabó, Sz. Gódi, A. Perkecz, Zs. Helyes
A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSZIÓVÁLTOZÁSA
GYULLADÁSOS BÉLBETEGSÉGBEN (IBD) ÉS DEXTRÁN-SZULFÁT ÁLTAL INDUKÁLT EGÉR COLITIS
MODELLBEN
Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a
Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012.
június 10-13. (poszter)
J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter
A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) receptor expresszióváltozása gyulladásos
bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát kiváltotta egér colitisben
Kisfaludy Lajos Alapítvány előadóülés, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., Budapest, 2013.
április 15. (előadás)
117
J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter
EXPRESSION CHANGE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR
IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS IN MICE
6th European Congress of Pharmacology (EPHAR), Granada, Spanyolország, 2012. július 17-20.
(poszter)
J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Á. Bán, B. Polgár, J. Szolcsányi, E. Pintér
EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION
OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT
International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged
(poszter)
J. Kun, E. Pintér, A. Perkecz, J. Szolcsányi: "EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY
DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL
VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT"
The 8th International Medical Postgraduate Conference, Károly Egyetem Orvostudományi Kar,
Hradec Kralove, Cseh Köztársaság, 2011. november 10-12. (előadás)
Egyéb konferencia prezentációk
E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, Z. Piski, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér
Nem-neurális tranziens receptor potenciál VANILLOID 1 (TRPV1) - azaz kapszaicin receptor - és
ANKYRIN 1 (TRPA1) receptorok jelenléte orrpolipózisban, asztmás betegcsoporton
A MAGYAR FÜL-, ORR-, GÉGE ÉS FEJ-, NYAKSEBÉSZ ORVOSOK EGYESÜLETE 43.
KONGRESSZUSA, TAPOLCA, 2014. OKTÓBER 15-18. (előadás)
A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes
Role of TRPV1 and TRPA1 ion channels in cigarette smoke-induced chronic airway
inflammation model of the mouse
20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014.
szeptember 7-10. (poszter)
K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are
expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium
20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014.
szeptember 7-10. (poszter)
118
J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.
E. Pongrácz, Zs. Helyes
CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL
ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-
DIMENSIONAL MODEL
20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014.
szeptember 7-10. (poszter)
J. Kun , D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.
Pongrácz, Zs. Helyes
CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL
ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-
DIMENSIONAL MODEL
Joint Meeting of the Federation of European Physiological Societies (FEPS) and the Hungarian
Physiological Society, Budapest, 2014. August 27-30. (poszter)
E. Toth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter
EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND ANKYRIN 1
(TRPA1) RECEPTORS IN CHRONIC RHINOSINUSITIS
25th Congress of the European Rhinologic Society in conjunction with 32ndInternational
Symposium of Infection & Allergy of the Nose; Amszterdam, Hollandia, 2014. június 22-26.
(előadás)
K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1
(TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium
Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013.
szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter)
A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J.
Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced
trigeminovascular activation in mice
NEUROINFLAMMATION: A satellite symposium to the regional FENS meeting. Konferencia
helye, ideje: Prága, Csehország, 2013.09.08-2013.09.11. (poszter)
A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J.
Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes
PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN
NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE
The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye,
ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. (poszter)
119
K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR ÉS A MAKROFÁG
MIGRÁCIÓT GÁTLÓ FAKTOR (MIF) HORMONFÜGGŐ EXPRESSZIÓ-VÁLTOZÁSAI PATKÁNY
ENDOMETRIUMBAN
A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos
Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és
Sporttudományi Kar (poszter)
I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs.
Helyes.
ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES
WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST
Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide
Conference
2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter)
D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, D. Ernszt, T. Kovács, E. J. Pongracz
Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke- induced
experimental model systems.
9thJános Szentagothai Inredisciplinary Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 3-4
May 2013 (poszter)
D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, E. J. Pongrácz
Expression levels of Wnt5a and Wnt11 molecules in cigarette smoke-exposed in vitro and in
vivo inflammation models.
The Student Scientific Conference on Biotechnology and Biomedicine. Brno, Czech Republic,
10-12 April 2013 (előadás)
J. Kun, K. Pohóczky, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
The presence and estrogen-mediated upregulation of the TRPV1 receptor in rat endometrium
Magyar Biokémiai Egyesület (MBKE), a Magyar Genetikusok Egyesülete (MAGE) és a Sejt- és
Fejlődésbiológiai Szakosztály közös konferenciája: Molekuláris Élettudományi Konferencia,
2013. április 5-7, Siófok (poszter)
D. Feller, J. Rapp, J. Kun
Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke-exposed
experimental model systems.
9th International Biomedical Croatian Student Summit, University of Zagreb, Croatia, 20-23
March 2013 (előadás)
D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Pongrácz
A Wnt szignálmolekulák expressziójának vizsgálata dohányfüst indukálta in vivo és in
vitro kísérleti modellrendszererekben.
XVIII. Bolyai Konferencia, Budapest, 2013. március 23-24. (poszter)
120
Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, C. J. Paige, E. Pintér, J. Kun, J. Szolcsányi, Zs.
Helyes
Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory and neuropathic pain models of the mouse
A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter)
K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
A TRPV1 receptor jelenléte és ösztrogén kezelés hatására történő expresszió-növekedése
patkány endometriumban
A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter)
E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornóczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér
NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1)-AZAZ KAPSZAICIN
RECEPTOR- ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOROK JELENLÉTE KRÓNIKUS RHINOSINUSITISBEN
Magyar Fül-, Orr-, Gége és Fej-, Nyaksebész Orvosok Egyesülete 42. Kongresszusa, Pécs, 2012.
okt. 17-20. (előadás)
D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz
The expression of the wnt11 and wnt5a signal molecules in cigarette smoke-exposed airway
inflammation models.
Janos Szentagothai Memorial Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 29-30
October 2012 (poszter)
V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi
Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels
mediate mustard oil-induced hyperalgesia in mice
1st International Doctoral Workshop on Natural Sciences, Pécsi Tudományegyetem, 2012.
október 3. (előadás)
Á. Bán, J. Kun, A. Perkecz, E. Pintér
A tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) és a tranziens receptor potenciál ankyrin 1
(TRPA1) receptorok expressziójának összehasonlítása orális lichen planusban
Magyar Fogorvosok Egyesülete, Árkövy Vándorgyűlés, Pécs, 2012. szeptember 20-22. (előadás)
D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz
THE EXPRESSION OF THE WNT11 AND WNT5A SIGNAL MOLECULES IN CIGARETTE SMOKE-
INDUCED AIRWAY INFLAMMATION MODELS
The 22nd Annual BioCity Symposium - PERSONAL GENOMICS FROM TECHNOLOGIES TO
APPLICATIONS, Turku, Finnország, 2012. augusztus 23-24. (poszter)
121
V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi
A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1)
IONCSATORNÁK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA MUSTÁROLAJJAL KIVÁLTOTT NOCIFENZÍV
VISELKEDÉSBEN ÉS AKUT GYULLADÁSOS HIPERALGÉZIÁBAN
Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a
Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012.
június 10-13. (poszter)
Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, J. Kun, E. Pintér, J. Szolcsányi, Zs. Helyes
A HEMOKININ-1 FONTOS SZEREPET JÁTSZIK A HIPERALGÉZIA KIALAKULÁSÁBAN KÜLÖNBÖZŐ
GYULLADÁSOS ÉS DEGENERATÍV KÓRKÉPEK EGÉRMODELLJEIBEN
Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a
Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012.
június 10-13. (poszter)
Á. Ban, J. Kun, A. Perkecz, E. Pinter
COMPARISON OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND TRANSIENT
RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSION IN ORAL LICHEN PLANUS
Europerio 7 – Coference of the European Federation of Periodontology, Bécs, Ausztria, 2012.
június 6-9. (poszter)
V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes
ROLE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 AND ANKYRIN 1 (TRPV1 AND
TRPA1) ION CHANNELS IN THERMONOCICEPTION IN MICE
International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged
(poszter)
P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke,
A. Tamás, D. Reglődi
NEUROBEHAVIOURAL DEVELOPMENT IN PACAP KNOCKOUT NEWBORN MICE
International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged
(poszter)
J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter
NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1)
RECEPTOROK JELENLÉTE RHINOSINUSITISBEN
Magyar Farmakológiai, Anatómus, Mikrocirkulációs, Élettani Társaságok közös tudományos
konferenciája (FAMÉ), PTE ÁOK, Pécs, 2011. június 8-11 (poszter)
J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter
EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1 (TRPV1) AND
ANKYRIN 1 (TRPA1) IN NASAL POLYPOSIS
The 8th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer
Neuropeptide Conference, Boston, 2011. május 22-25. (poszter)
122
J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T.
F. Molnar, Zs. Helyes
EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG
CANCER
The 7th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer
Neuropeptide Conference, Pécs, 2010. június 21 - 24. (poszter)
Idézhető kivonatok (absztraktok)
E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pinter
Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors
in chronic rhinosinusitis
Rhinology (2014) 52:S25:625; IF: 2,8
J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J.
E. Pongrácz, Zs. Helyes
CIGARETTE SMOKE EXPOSURE UPREGULATES TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1
ION CHANNELS IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-DIMENSIONAL
MODEL
J Mol Neurosci (2014) 53:S175; IF: 2,757
A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes
ROLE OF TRPV1 AND TRPA1 ION CHANNELS IN CIGARETTE SMOKE-INDUCED CHRONIC AIRWAY
INFLAMMATION MODEL OF THE MOUSE
J Mol Neurosci (2014) 53:S174; IF: 2,757
K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are
expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium
J Mol Neurosci (2014) 53:S179; IF: 2,757
A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J.
Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes
PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN
NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE
J Mol Neurosci (2013) 51:S220; IF: 2,757
Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V.
Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro
CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1-MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP
J Mol Neurosci (2013) 51:S190; IF: 2,757
123
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR
mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-
INDUCED COLITIS IN MICE
J Mol Neurosci (2013) 51:S159; IF: 2,757
I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs.
Helyes
ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES
WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST
J Mol Neurosci (2013) 51:S165; IF: 2,757
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K.
Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE
SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS
PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 38. (2013); IF: 0,2
K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes
Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1
(TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium
PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 46. (2013); IF: 0,2
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K.
Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér
TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN
DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS
IMMUNOLÓGIAI SZEMLE V:(3) p. 32. (2013); IF: 0
P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke,
A. Tamás, D. Reglődi
Neurobehavioral development in PACAP knockout newborn mice
JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504
J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter
Expression of transient receptor potential receptors vanilloid 1 (TRPV1) and ankyrin 1 (TRPA1)
in nasal polyposis
JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) pp. S197-S198. (2012); IF: 2,504
B. Sandor, D. Hobor, P. Kiss, K. Szabadfi, D. Makovics, A. Matkovics, J. Farkas, M. Wlaschits, A.
Jungling, B. Kaszas, J. Kun, A. Nagy, R. Gabriel, D. Reglodi, A. Tamas
Comparative examination of tooth development in wild type and PACAP deficient mice
JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504
124
V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes
Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion
channels in thermonociception in mice.
CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012); IF: 1,247
J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter
THE PRESENCE OF NON-NEURAL TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1
(TRPV1) AND ANKYRIN 1 (TRPA1) IN RHINOSINUSITIS
ACTA PHYSIOLOGICA 202:(S683) pp. 64-65. (2011); IF: 0,453
J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T.
F. Molnar, Zs. Helyes
EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG
CANCER
NEUROPEPTIDES 44:(6) p. 542. (2010); IF: 2,036
Az összes publikáció (teljes közlemények és kivonatok) kumulatív impakt faktora IF: 47,331 Független idézők: 19