Herbst Winter 2020

UumlBERSICHTSARTIKEL

INNOVATION

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Eine Technologie macht Schlagzeilen und eroumlffnet neue Moumlglichkeiten

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COVID-19 Forschung mit NEB SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit und mehr

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bdquoGMP-graderdquo Reagenzien fuumlr die RNA Synthese 9

Highlights dieser Ausgabe

a scientific update

COVID-seq mit NEBNext Produkten fuumlr Oxford Nano- pore Technologies und Illumina

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Auszug aus Tech-Note Facilitating Detection of SARS-CoV-2 Directly from Patient Samples

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Luna RT-qPCR Reagenzien Jetzt durchstarten und sparen

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bdquoReboot your Benchrdquo Mit schnelleren Workflows und Kits von NEB

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33for22Klickbare Objekte im PDF sind durch folgedens Icon gekennzeichnet oder (im Flieszligtext) in orangener und kursiver Schrift dargestellt

2

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ndash Eine Technologie macht Schlagzeilen und eroumlffnet neue Moumlglichkeitenvon Joanne Gibson PhD New England Biolabs Inc

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein unverzichtbares Werkzeug in vielen molekular-biologischen Laboren und hat die Forschung und medizinische Diagnostik in den letzten Jahrzehnten grundlegend beeinflusst Im Laufe der Jahre hat diese Technik unglaubliche Fortschritte gemacht Bevor es Thermocycler gab saszligen die Forscher tatsaumlchlich noch mit einem Timer in der Hand an drei verschieden temperierten Wasserbaumldern und setzten die Roumlhrchen fuumlr jeden PCR Schritt - Denaturierung Annealing und Extension - von einem ins Naumlchste Und bevor die Thermocycler beheizte Deckel hatten wurde noch Mineraloumll auf die Reaktion geschichtet damit sie

Exponential Amplication

F3

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B2 B3B1c

F2cF3c F1c B1 B2 B3

F2

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B2

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B1

F1

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Loop B

Forward internalprimer (FIP)

Backward internalprimer (BIP)

BIP

Loop F

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F1

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Loop-Mediated Isothermal Amplification ndash LAMP

Polymerase Chain Reaction ndash PCR

Eine Moumlglichkeit zur einfacheren Nukleinsaumlure-Amplifikation ist die Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) (1) Vereinfacht ausgedruumlckt ist die LAMP eine effektive Methode zur Verviel-faumlltigung einer Zielsequenz in einer Reaktion bei konstanter Temperatur kombinierbar mit einer Vielzahl von einfachen Nachweismethoden

LAMP verwendet 4 bis 6 Primer mit 6 bzw 8 Bindestellen auf der Zielsequenz (Abbildung 1) Zwei Primer davon bewirken dabei gezielt selbsthybridisierende DNA-Schleifen Loops die zur sogenannten Hantelstruktur fuumlhren Die Hantel bietet dann zahlreiche neue Initiations-stellen fuumlr weitere Strangsynthesen und ist somit der Amplifikationskeim Die Polymerase fuumlr diese Reaktion muss zum einen bei houmlheren Tempera-turen aktiv sein um das Anneling zu erlauben und zum anderen den Gegenstrang waumlhrend der Amplifikation verdraumlngen Die Bst DNA Poly-merase Large Fragment (NEB M0275) eignet sich beispielsweise ideal fuumlr diese Anwendung Diese Besonderheiten von LAMP - also das bdquoHyper-primingldquo auf der Zielsequenz in Verbindung mit einer strangverdraumlngenden DNA-Polymerase - fuumlhren mit hoher Geschwindigkeit zu einerexponentiellen Amplifikation die nach nur 30Minuten mit verschiedenen Methoden nachge-wiesen werden kann NEBs Weiterentwicklungender Bst Polymerase haben dabei den Nutzwertder LAMP noch einmal gesteigert da sie deutlichrobuster gegen dUTP und gaumlngige Inhibitorensind Die erhoumlhte dUTP-Toleranz ermoumlglicht jetzterstmals fuumlr LAMP auch eine Carryover-Praumlven-

nicht verdunstete Die ersten Polymerasen mussten muumlhsam vor jedem Zyklus hinzugefuumlgt werden da sie hitzelabil waren und durch die hohen Tempera-turen im Denaturierungsschritt zerstoumlrt wurden Erst mit Einfuumlhrung der hitzestabilen Taq DNA Polymerase (M0273) konnte man die Polymerase einmalig fuumlr das gesamte Experiment hinzufuumlgen Der Reaktionsansatz wurde spaumlter durch die sog Hot Start Polymerasen noch anwenderfreund-licher Hier wird das Enzym erst nach Hitzedis-soziation eines Inhibitors aktiv was nicht nur die Vorbereitung der Reaktion bei Raum temperatur ermoumlglicht sondern auch die Spezifitaumlt der Ampli-fikation erhoumlht

Heute ist die PCR viel einfacher und effizienter geworden und die bevorzugte Methode zur DNA-Amplifikation Allerdings erfordert sie elektrische Geraumlte wie den Thermocycler und die Gelelek-trophorese zur Analyse Zwar gehoumlren diese heute quasi zur Grundausstattung jedes modernen Labors aber wenn die Probennahme nicht im Labor erfolgt kann der Transport zum naumlchsten Cycler schlichtweg zu lange dauern Hierfuumlr bie-ten sich alternative Nukleinsaumlureamplifikationen an ndash nicht etwa als Ersatz fuumlr die PCR sondern als Option fuumlr andere Anwendungsbereiche

tion bdquoalteldquo UTP-haltige Amplifikate werden durch das Enzym UDG vor Beginn der LAMP-Reaktion abgebaut Dies wurde bislang nur in der qPCR eingesetzt Und auch RNA-basierte LAMP-Reak-tionen sind moumlglich einfach durch Zugabe des WarmStart RTx-Enzyms das uumlbrigens in NEBs LAMP- Mastermixen eingesetzt wird

Der LAMP Reaktionsverlauf kann in Echtzeit verfolgt werden zB mit einem dsDNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff Fuumlr houmlheren Durchsatz bieten sich automatisierte Arbeitsablaumlufe an und Plattenlesegeraumlte oauml fuumlr Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen (2) LAMP wird auch auszligerhalb von Laboren angewendet man benoumltigt lediglich eine Waumlrmequelle beispielsweise ein Wasserbad bei 65degC Dabei ist eine moumlglichst ein-fache Auswertungsmethode der DNA-Amplifika-tion besonders hilfreich Verschiedene Detektions-methoden wurden hierzu bereits getestet zB das Ausfaumlllen von Magnesiumpyrophosphat oder die Farbaumlnderung eines Metallindikators Leider sind beide Methoden mit dem bloszligen Auge kaum zu erkennen und benoumltigen etwa 60 Minuten bevor die Detektion uumlberhaupt zuverlaumlssig moumlglich ist

NEBs Wissenschaftler haben nun eine clevere Loumlsung entwickelt (3) Waumlhrend der Amplifikation wird mit jedem dNTP das in den wachsenden DNA-Strang eingebaut wird ein Proton frei-gesetzt In leicht gepufferter Loumlsung fuumlhrt daher die erfolgreiche exponentielle Amplifikation zu einer pH-Absenkung um 2-3 Einheiten Ein pH-sensitiver Farbindikator im Ansatz macht die Amplifikation durch einfachen Farbumschlag von

Pink zu Gelb sichtbar Somit kann die LAMP auch auszligerhalb des Labors in abgelegenen Regionen in der Point-of-Care-Diagnostik oder in Hoch-durchsatzanalysen in Feldstudien besonders gut angewendet werden

Abb 1 Schematische Darstellung der LAMP Reaktion

ORIGINALARTIKEL

3

in spaceColorimetric LAMP

telomereiss

Wolbachia

in the fieldColorimetric LAMP

dengue

weiter auf Seite 4

Es gibt kaum ein besseres Beispiel fuumlr die Vorteile einer Amplifikation vor Ort als die Arbeit des World Mosquito Program (WMP worldmosquitoprogramorg) dessen Forschung darauf abzielt Infektionskrank-heiten auszurotten

Dengue- Chikungunya- und Zika-Viren werden durch stechende blutsaugende Arthropoden uumlbertragen die den Virus von Mensch zu Mensch weitergeben Die Stechmuumlcke (Aedes aegypti) ist einer

dieser arboviralen Krankheitsuumlbertraumlger Die WHO schaumltzt dass 25 Milliarden Menschen in Dengue-Uumlbertragungsgebieten leben Dengue gehoumlrt damit zu den zehn groumlszligten globalen Bedrohungen fuumlr die Gesundheit und ist die sich am schnellsten ausbrei-tende durch Muumlcken uumlbertragene Krankheit

40-60 aller Insektenarten weltweit (einschlieszlig-lich Schmetterlinge und Libellen) fuumlhren in ihren Fortpflanzungszellen ein muumltterlich uumlbertragenes endosymbiotisches gramnegatives Bakterium namens Wolbachia pipientis Sobald ein Virus (zB Dengue) in die Wirtszellen eindringt verhindert die Anwesenheit von Wolbachia das virale Wachstum indem es die Replikation verlangsamt und die virale RNA schnellabbaut (4) wodurch Infektionen von Menschenverhindert werden Die Aedes aegypti-Muumlcke ist eine der wenigen Ausnahmen die Wolbachia normaler-weise nicht tragen Diesen Sachverhalt hat die WMP als potenzielle biologische Kontrollstrategie erkanntund bereits massive Anstrengungen unternommen um die Virus-Uumlbertragung in Dengue-endemischen Laumlndern Mittel- und Suumldamerikas sowie in Asien und im Pazifikraum durch die Verbreitung von Wolbachia-haltigen Moskitos zu stoppen Die Forscher injizierten dazu in Pilotexperimenten in Nordaustralien den

wMel-Stamm von Wolbachia aus Fruchtfliegen in Eier von Aedes aegypti und lieszligen diese nach einem kontrollierten Zeitplan frei Innerhalb weniger Monate enthielten fast 100 der Moskitos Wolbachia was auch uumlber Jahre hinweg stabil blieb (5)

Zum Screening nutzte das WMP LAMP in Feldana-lysen und verglich die Methode mit dem etablierten TaqMan-qPCR-Assay Die LAMP- Primer wurden zum Nachweis des wsp-Gens von zwei Wolbachia-Staumlmmen entwickelt Mit dem WarmStart Colorime-tric LAMP 2X Master Mix (NEB M1800) passenden Primern und der Ziel-DNA konnten Sie in nur 30 Minuten bei 65degC durch einen einfachen Farbwechsel zuverlaumlssig feststellen ob die Muumlcken mit dem Endosymbionten infiziert sind rosa = negativ (Muumlcke enthaumllt keine Wolbachia -DNA) gelb = positiv (Muumlcke enthaumllt Wolbachia -DNA) (6)

Das Screening von Stechmuumlcken vor Ort mittels colorimetrischer LAMP ist im Vergleich zum Taq-Man-qPCR-Assay kostenguumlnstiger und vermeidet den langwierigen Transport der Proben ins Analyselabor Die Ergebnisse liegen auszligerdem in Echtzeit vor was die Genauigkeit hinsichtlich der geografischen Lokalisierung der Wolbachia-Muumlcken entscheidend verbessert

Das Gebiet der Weltraumbiologie steckt zwar noch in den Kinderschuhen aber mit jedem Jahr werden

auf der Internationalen Raumstation (ISS) mehr biologische Experimente durchgefuumlhrt ndash zum Teil mit Hilfe von Studenten die diese Experimente im Rahmen des jaumlhrlichen Wettbewerbs ldquoGenes in Spacerdquo (httpswwwgenesinspaceorg) entwickeln Anfaumlnglich wurden die Experimente fuumlr die ISS- Besatzung noch auf der Erde vorbereitet bevor sie im Weltraum ausgefuumlhrt wurden um sie anschlie-szligend wieder auf der Erde zu analysieren und zu interpretieren Auf diese Weise wurde zB die erste PCR im Jahr 2016 an Bord der ISS im Weltraum durchgefuumlhrt (7) Die Astronauten der Station sollten die Reaktionen aber selber durchfuumlhren und analysieren koumlnnen ohne Proben zuruumlck zur Erde schicken zu muumlssen Im Maumlrz 2017 wurden daher erstmals auf der ISS colorimetrische LAMP-Experimente durchgefuumlhrt um eine spezifische repetitive Telomer-DNA-Sequenz nachzuweisen

Unser Tipp

NEB bietet praktische WarmStart LAMP Kits amp Master Mixe fuumlr zuverlaumlssige und sensitive DNARNA Detektion

Produkt NEB GroumlszligeWarmStart LAMP Kit (DNA amp RNA) E1700SL 100500 rnxs

Jetzt bestellen

Produkt NEB GroumlszligeWarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA amp RNA) M1800SL 100500

rnxs

Produkt NEB GroumlszligeWarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG M1804SL 100500

rnxs

Detaillierte Informationen Erklaumlrungen Tipps und Tricks finden Sie unter

wwwnebcomIsoAmp

(for carryover prevention)

(8) Telomere sind DNA-Proteinstrukturen an den Enden von Chromosomen die die chromo-somale Stabilitaumlt unterstuumltzen indem sie vor Abbau schuumltzen eine abnormale Telomerverkuumlrzung ist mit menschlichen Krankheiten assoziiert Die colorimetrischen LAMP-Assays zur Analyse der Telomerdynamik wurden dann vor Ort mit einem tragbaren Instrument miniPCRtrade durchgefuumlhrt Die Auswertung erfolgte direkt auf der Station durch den einfachen Farbwechsel als Indikator dokumen-tiert durch ein Foto der Roumlhrchen gegen ein weiszliges Blatt Papier Zur Kontrolle wurden alle Reaktionen auch mit herkoumlmmlicher PCR mittels Taq und Q5 DNA Polymerasen (NEB M0494) und noch einmal parallel auf der Erde durchgefuumlhrt und letztendlich das Resultat bestaumltigt Die sofortige Auswertung auf der ISS ist ein sehr beeindruckendes Beispiel fuumlr Einsatzmoumlglichkeiten auszligerhalb des Labors

ORIGINALARTIKEL

3

4

grbv

Colorimetric LAMPin agriculture

COVID-19

ColorimetricLAMP duringa pandemic

Colorimetrische LAMP Tests werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit und der geringen Kosten (unter zwei Euro pro Reaktion) auch in der Landwirtschaft eingesetzt Das Grapevine Red Blotch Virus (GRBV) wird durch die Buckelzikade Spissistilus festinus verbreitet und plagt die Weinbauindustrie in Nord-amerika Es verursacht eine Ertragsminderung und Einbuszligen in der Qualitaumlt Bei infizierten Pflanzen koumlnnen zwar charakteristische Blattveraumlnderungen beobachtet werden doch sind diese allein kein zuverlaumlssiger Indikator fuumlr eine Infektion Es sind diagnostische Tests erforderlich Die Probenent-nahme ist dabei leicht einfach eine sterile Pipette in den Blattstiel einfuumlhren und anschlieszligend die Pipettenspitze in sterilem Wasser inkubieren Der colorimetrische LAMP-Test findet dann vor Ort

statt (13) Kein Vergleich mit dem Zeit- und Kosten-aufwand fuumlr ein herkoumlmmliches PCR-Screening auf GRBV Probenentnahme Transport ins Labor zweistuumlndige DNA-Extraktion PCR-Analyse und Ruumlckuumlbermittlung der Ergebnisse Zwar wurde berichtet dass die Sensitivitaumlt des LAMP-Tests um 2 Groumlszligenordnungen niedriger sein kann als bei herkoumlmmlicher qPCR der Vorteil der colorime-trischen LAMP liegt aber in ihrer einfachen und kostenguumlnstigen Anwendung und Auswertung Sie eroumlffnet neue Moumlglichkeiten als Alternative zur traditionellen PCR nicht nur fuumlr die medizinische Diagnostik Fuumlr alle die Gentests auszligerhalb spezialisierter PCR-Labore durchfuumlhren ist die colorimetrische LAMP mehr als eine Uumlberlegung wert

Abb 2 Colorimetrische LAMP bestaumltigt das Ergebnis einer RT-qPCR basierten SARS-CoV-2-Detektion an COVID-19-Patientenproben aus Wuhan China Dazu wurden RT-qPCR-positive Proben (1-6) bzw RT-qPCR-negative Proben (7) mit Primer-Sets fuumlr ORF1a (A) und GeneN (B) per colorimetrischem LAMP untersucht Der gelbe Farbumschlag belegt einen positiven Nachweis nach 30-minuumltiger Inkubation Die Probe 7 blieb auch im LAMP-Test wie erwartet rosa dh negativ N Negativkontrolle B Blindkontrolle ohne Template P Positivkontrolle (Plasmid als Template)

A ndash ORF1a

B ndash GeneN

Referenzen1 Notomi T et al (2000) Nucl Acids Res 2812 e63 PMID 108713862 Zhang Y et al (2020) BioTechniques DOI 102144btn-2020-00783 Tanner NA et al (2015) BioTechniques 58(2)59-68 PMID 256520284 Thomas S et al (2018) PLoS Pathogens 14 (3) e1006879 PMID 29494679

5 Ryan PA et al (2020) Gates Open Res 315476 Joubert DA and OrsquoNeill SL (2017) PLoS Negl Trop Dis 11e0005275

PMID 280520657 Boguraev AS et al (2017) NPJ Microgravity 3268 Rubenfien J et al (2020) FASEB BioAdvances 2160-165 PMID 32161905

9 Zhang Y et al (2020) medRxiv 202002262002837310 Anahtar MN et al (2020) medRxiv 202005122009563811 Dao Thi VL et al (2020) medRxiv 202005052009228812 Lalli MA et al (2020) medRxiv 202005072009354213 Romero JLR et al (2019) Arch Virol 164(5)1453-1457

Waumlhrend der aktuellen SARS-CoV-2 Pandemie ist ein schneller flaumlchendeckender Test auf den Infektions-erreger von entscheidender Bedeutung - nicht nur um symptomatische Faumllle zu testen sondern vor allem auch als Screening-Methode zB bei der Ruumlckkehr an den Arbeitsplatz und zur allgemeinen Uumlber-wachung des Infektionsgrades der Gesellschaft

Das SARS-CoV-2-Virus verursacht bekanntlich grip-peaumlhnliche Symptome sodass eine genaue molekulare

Diagnose fuumlr die Bestaumltigung der Infektion und die epidemiologische Uumlberwachung unerlaumlsslich sind RT-qPCR ist derzeit der Standard fuumlr die Diagnose akuter Infektionen und wird anhand von Proben aus dem oberen und unteren Respirationstrakt in akkreditierten Labors durchgefuumlhrt Die wissen-schaftliche Gemeinschaft arbeitet jedoch gemeinsam an der Entwicklung schnellerer alternativer Ansaumltze zum Nachweis dieses Erregers

NEBs Wissenschaftler konnten juumlngst einen colorimetrischen LAMP-Tests zum Nachweis von RNA aus dem SARS-CoV-2-Virus publizieren (9) Der Test wurde mit Proben aus Atemwegsabstrichen von bestaumltigten Infektionen von Patienten in Wuhan China durchgefuumlhrt (Abbildung 2) Die isotherme Amplifikation der SARS-CoV-2-RNA fuumlhrte dabei zu einem Farbwechsel von pink zu gelb (Abbildung 3) In weiteren Studien wurde die colorimetrische LAMP mit kommerziellen RT-qPCR-Tests verglichen (10) LAMP konnte auch direkt an Proben ohne RNA-Isolierung durchgefuumlhrt werden (11) sogar mit menschlichem Speichel (12) NEB hat vor kurzem einen entsprechenden Assay zur Anwendung in der Forschung herausgebracht das SARS CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit (NEB E2019) Weitere Einzelheiten finden Sie auf Seite 5 Die

colorimetrische LAMP hat ein enormes Potenzial als Uumlberwachungstest waumlhrend der Pandemie Sie verursacht geringe Kosten liefert schnelle Ergebnisse und ist sehr einfach in der Anwendung Die schnelle Probenvorbereitung und die Mobilitaumlt dieses Assays machen das System fuumlr alle Forscher interessant die bessere Moumlglichkeiten zur Praumlvention oder Ein-daumlmmung von Krankheiten suchen

Abb 3 NEBs SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay wurde nach Protokollempfehlung mit den angegebenen Kontrollen bzw auf positivem Material (dh humane Gesamt-RNA + synthetische SARS-CoV-2 RNA) bzw einer negativen Probe (nur humane Gesamt-RNA) durchgefuumlhrt Ein positiver Test dh die isothermale Amplifikation der SARS-CoV-2 RNA ist am Farbumschlag von Pink zu Gelb leicht und zuverlaumlssig erkennbar

TestsNTC

ControlsPC IC

NTC = Non-Template ControlPC = Positive ControlIC = Internal Control

Schneller und einfacher Farbumschlag zur SARS-CoV-2 RNA-Detektion per RT-LAMP

5

Detaillierte Informationen zu diesem Produkt finden Sie unter

wwwnebcomE2019

Waumlhrend die SARS-CoV-2 Pandemie uns alle weiterhin stark beeinflusst arbeitet New England Biolabs mit groszliger Sorgfalt daran die Sicherheit unserer Mitarbeiter und ihrer Familien zu gewaumlhr-leisten Gleichzeitig halten wir aber die geschaumlftliche Betriebsfaumlhigkeit aufrecht damit wir Sie als unsere geschaumltzten Kunden weiterhin ohne Einschraumlnkungen beliefern koumlnnen Auch unsere Kollegen vom technischen Support und vom Kundenservice sind wie gewohnt fuumlr Sie erreichbar

Obwohl unsere Produkte als Forschungsreagenzien (bdquoResearch use onlyldquo) vertrieben werden haben seit Ausbruch der Pandemie bereits diverse Kunden Forschungsreagenzien von NEB in mehr als 650 Veroumlffentlichungen Pre-Prints oder sogar FDA-EUA-Protokollen zitiert und eigene diagnostische Verfahren entwickelt und etabliert

Gerne beliefern wir auch Sie zur Entwicklung und Validierung Ihrer eigener Test- und Vakzinierungsansaumltze

Ihre Vorteilebull Schneller isothermaler 30 Min

Assay zur zuverlaumlssigen Detektionvon SARS-CoV-2

bull Gut sichtbarer Farbumschlag vonPink zu Gelb signalisiert erfolgreicheAmplifikation

bull Exzellente Spezifitaumlt und Sensitivitaumltdank optimierter LAMP-Primer fuumlrdie N- und E-Region des SARS-CoV-2 Genoms

bull Bequemer Reaktionsansatz beiRaumtemperatur dank WarmStartTechnologie

bull Schutz vor Uumlbertragskontaminationdurch den Einsatz von UDGdUTP

bull Kit inkl Primer Sets und Positiv-kontrollen

Jetzt bestellen

PRODUKT ARTNR GROumlSSE PREIS

SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit

E2019S 96 rxn 698 euro

Waumlhlen Sie NEB Produkte fuumlr

Virus Detection

RNA Extraction

Sequencing amp Epidemiology

Vaccine Development

SARS-CoV-2 Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit

LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ist eine sehr gute Alternative zur technisch auf-wendigeren PCR (siehe S 2-5) Nicht nur benoumltigt man weniger Ausstattung und Geraumlte ndash auch die Auswertung stellt sich deutlich einfacher dar

Mit dem neuen colorimetrischen Assay Kit (E2019) wird die direkte SARS-CoV-2 Detektion mittels Farbumschlag in nur ca 30 Min Wirklichkeit Einige unserer Kunden verwenden alternativ die Einzel-komponenten bzw die praktischen Master Mixe (M1800 M1804) oder auch das WarmStart LAMP Kit (DNA amp RNA) E1700 mit verschiedenen Detektionsoptionen inkl Fluoreszenz- und Truumlbungsmessung

Research Use Only

Abb Schemazeichnung des SARS-CoV-2 Genoms Die Pfeile markieren die Zielregion der Assay-Primer

5acute

30 kb

3acute

UT

R SORF1ab E M N

UT

R

S = Surface E = Envelope M = Membrane N = Nucleocapsid ORF

30min

1temp

=OR

amp

Eine stets aktuelle Liste mit NEB Produkten zur COVID-19 Detektion mittels RT-LAMP und RT-qPCR sowie

bull Application Notesbull ausgewaumlhlte (Kunden-)

Publikationenbull umfassende Protokolle

(teilweise FDA-EUA-zertifiziert)

finden Sie unter

wwwneb-onlinedeCOVID-19

COVID-19 Forschung mit NEB

6

Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit ndash jetzt mit oder ohne ROX

Ausgewaumlhlte (Kunden-)Publikationen und Protokolle zur SARS-CoV-2 Detektion finden Sie unter

wwwneb-onlinedeCOVID-19Detaillierte Produktinformationen und kostenfreie Testmuster finden Sie unter wwwneb-onlinedeluna

COVID-19 FORSCHUNG MIT NEB PRODUKTEN

Abb RT-qPCR an RNA der humanen GAPDH mit Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (E3006) Dazu wurde eine Verduumlnnungsreihe uumlber 8 Groumlszligenordnungen (1 μg ndash 01 pg Jurkat total RNA) mit je 8 Replikaten eingesetzt

Quantity (pg)

Cq

Efficiency = 966

R2 = 0999

34

28

26

24

32

30

22

20

01 1 10 102 103 104 105

36

20 ng

2 ng

02 ng

20 pg

2 pg

02 pg

NTC

Cycle2 383634323028262422201810864 40161412 42 44

1

01

n = 8

∆R

n

Amplification plot

Standard curve

Input

Ihre Vorteilebull Entwickelt entlang der renom-

mierten MIQE-Richtlinien fuumlr beste qPCR-Praxis

bull Modernste Enzymtechnologie fuumlr beste Performance Sensibilitaumlt und Zuverlaumlssigkeit in der One-Step RT-qPCR

bull Einfache und schnelle Protokolle dank cleverem Master Mix Format

bull Reaktionsansatz bei Raumtemperatur

bull Gut sichtbarer inerter blauer Farbstoff als Schutz vor Pipettierfehlern

bull E3006 Kompatibel mit allen gaumlngigen PCR-MaschinenE3007 geeignet fuumlr alle Maschinen ohne ROX-Normalisierung

bull Ideal fuumlr Routine-Analysen da kom-patibel mit optionalem Verdau von Uumlbertragskontaminationen durch thermolabile UDG

bull Guumlnstiger Preis

The choice of One-step kit is critical for sensitivity and at the same time a major cost factor We recommend the NEB Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (E3007) which is attractively priced and performs among the most sensitive One-step kits we tested

VIENNA COVID-19 DETECTION INITIATIVE (VCDI)

ldquordquo

Das NEB Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit E3006 und das Pendant in der No ROX-Formulierung (E3007) sind ein praktischer und zuverlaumlssiger 2x Master Mix der fuumlr die Detektion und Quantifizierung von RNA-Sequenzen mit Hydrolyse-Sonden (zB bdquoTaqManldquo Sonden) ua zur Quantifizierung von viraler RNA unter den strengen Regeln der MIQE-Guidelines optimiert wurde Sie enthalten alle notwendigen Enzyme und Komponenten fuumlr besonders zuverlaumlssige qPCR-Daten ausgehend von RNA

Beide Kits nutzen ein fuumlr diese Anwendung maszliggeschneidertes einzigartiges Designer-Enzym ndash die WarmStart LunaScript Reverse Transkriptase Diese ist besonders temperaturstabil und deutlich schneller als vergleichbare RTasen So werden in kuumlrzester Zeit zuverlaumlssig cDNAs generiert selbst im Falle komplexer RNA-Sekundaumlrstrukturen die durch die erhoumlhten Temperaturen zuverlaumlssig aufgeschmolzen werden Die neuartige RTase ist auch separat als praktischer Supermix inkl dNTPs RNase Inhibitor etc fuumlr optimale Two-Step Anwendungen erhaumlltlich (siehe Ruumlckseite)

NEBs Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kits bieten Ihnen exzellente Sensitivitaumlt Reproduzierbarkeit und RT-qPCR Performance

Jetzt bestellen

PRODUKT ARTNR GROumlSSE PREIS

Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit

E3006S LXE

200500 1000 2500 rxns

198 euro 448 euro 788 euro 1738 euro

Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (no ROX)

E3007E2500 rxns

1738 euro

LunaScript RT SuperMix Kit

E3010SL25100 rxns

125 euro 420 euro

7

Eingesetzte NEB Produkte

Die Extraktion von RNA ist in vielen Protokollen der erste Schritt der Virus-Detektion Wir empfehlen Ihnen das Monarch-Total-RNA-Miniprep-Kit (T2010) das mit einem neuen verkuumlrzten Protokoll in weniger als 1 h bereits erfolgreich auf verschiedenen Proben wie Speichel Mundschleimhautabstrichen oder Nasopharynx-Proben getestet wurde

Alternativ koumlnnen Sie mit den Monarch RNA Cleanup Kits (T2030 T2040) die urspruumlnglich fuumlr die AufreinigungKonzentration von RNA entwickelt wurden in Kombination mit dem Monarch DNARNA Protection Reagent (NEB T2011) virale RNA aus Speichel und Tupfern in weniger als 10 Min erfolgreich extrahieren Beide Monarch Kits koumlnnen Sie uumlbrigens mit nur geringfuumlgigen Protokollaumlnderungen auf dem QIACube und den KingFisher Flex-Plattformen automatisieren und so den Durchsatz nochmal erhoumlhen In jedem Fall erhalten Sie mit den Monarch Kits saubere und hoch-wertige RNA geeignet fuumlr alle Downstream-Nachweise durch RT-qPCR RT-LAMP oder andere MethodenVon NEB durch artifizielle nasopharyngeale Proben bestaumltigt

Im Bereich NGS Library Prep setzen viele Forscher auf NEBNext Performance zB in diversen SARS-CoV-2 Sequencing Protokollen wie dem bdquoPCR tiling of COVID-19 virusldquo der Oxford Nanopore Technologiesrsquo Nanopore Community oder dem bdquoARTIC-NEB SARS-CoV-2 Library Prepldquo Protokoll fuumlr Illumina Plattformen

RNA Extraktion mit den Monarch Nucleic Acid Purification Kits

Detaillierte Produktinformationen Protokolle und kostenfreie Testmuster finden Sie unter

wwwneb-onlinedeMonarch

Ausgewaumlhlte (Kunden-)Publikationen und Protokolle fuumlr die ONT und Illumina Plattformen finden Sie unter

wwwnebcomCovid-Seq

Ihre Vorteilebull Effiziente und schnelle Extraktion

viraler RNA aus SpeichelWangenabstrichen und Nasen-Rachen-Proben

bull Ermoumlglicht den sensitiven Nachweisdurch RT-qPCR RT-LAMP und andere Methoden

bull Automatisierbar auf dem QIAcube undKingFisher Flex

PRODUKT ARTNR GROumlSSE PREIS

Monarch Total RNA Miniprep Kit

T2010S 50 preps 248 euro

Monarch RNA Cleanup Kit (10 μg)

T2030SL10100 preps

52 euro 284 euro

Monarch RNA Cleanup Kit (50 μg)

T2040SL10100 preps

50 euro 280 euro

Monarch DNARNA Protection Reagent

T2011L 56 ml 91 euro

PRODUKT ARTNR GROumlSSE PREIS

LunaScript RT SuperMix Kit E3010SL 25100 rxns 125 euro 420 euro

Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix M0494SXL 100500500 rxns 184 euro 728 euro 736 euro

NEBNext Ultra II End RepairdA-Tailing Module E7546SL 2496 rxns 262 euro 835 euro

NEBNext Ultra II Ligation Module E7595SL 2496 rxns 395 euro 1270 euro

NEBNext Quick Ligation Module E6056SL 20100 rxns 312 euro 1248 euro

BluntTA Ligase Master Mix M0367SL 50250 rxns 100 euro 400 euro

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina E7805SL 2496 rxns 665 euro 2526 euro

COVID-seq mit NEBNext Produkten fuumlr Oxford Nanopore Technologiesreg und Illuminareg Plattformen

Jetzt bestellen

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COVID-19 FORSCHUNG MIT NEB PRODUKTEN

Facilitating Detection of SARS-CoV-2 Directly from Patient Samples Precursor Studies with RT-qPCR and Colorimetric RT-LAMP Reagentsby Andrew N Gray PhD Guoping Ren PhD Yinhua Zhang PhD Nathan Tanner PhD and Nicole M Nichols PhD New England Biolabs Inc

Reagent tolerance to Universal Transport Medium (UTM)

Nasopharyngeal (NP) swabs are the predominant patient sample type recommended for SARS-CoV-2 diagnostic testing and are most commonly stored in Universal Transport Medium (UTM) prior to processing UTM tolerance is thus a critical reagent feature for direct detection of SARS-CoV-2 in patient samples We therefore tested the effects of UTM on candidate NEB reagents for viral RNA detection including the Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit LunaScript RT SuperMix Kit and WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA amp RNA)

In the case of the more rapid colorimetric RT-LAMP workflow a color change is observed in the presence of amplification (pink to yellow) Thus we also tested whether additional buffer present in UTM may inhibit color change and if the color of UTM itself (pink) may mask RT-LAMP color change at higher UTM volumes

Direct Detection of SARS-CoV-2 RNA Targets in Cell Lysates

Direct detection of SARS-CoV-2 in patient samples requires that reagents be resistant to inhibition by cell lysates and that viral RNA be protected from degradation by cellular RNases prior to detection To assess both these factors we lysed cells in the presence of synthetic SARS-CoV-2 RNA (vRNA) and then assessed detection and quantitation via both one-step RT-qPCR and colorimetric RT-LAMP (Figure 1) using purified vRNA alone as a control Cell lysis was carried out using the Luna Cell Ready Lysis Module which includes an RNA Protection Reagent to prevent RNA degradation

Summary of Results

RT-qPCR

bull UTM at up to 25 (vv) total reaction volume doesnot affect performance of either the Luna UniversalProbe One-Step RT-qPCR Kit (for One-Step viralRNA detection and quantitation) or the LunaScriptRT SuperMix Kit (for first-strand cDNA synthesisfrom viral RNA in Two-Step RT-qPCR workflows)

bull Synthetic SARS-CoV-2 viral RNA is protectedfrom degradation by cellular RNases during LunaCell Ready lysis protocols and during subsequentdetection and quantitation by Luna One-StepRT-qPCR

bull Detection and quantitation of viral RNA targetsusing the Luna Universal Probe One-StepRT-qPCR Kit is achievable with cell lysates atup to 2000 cell equivalents per 20 μl reaction

Colorimetric RT-LAMP

bull UTM at up to 8 (vv) total reaction volumeis tolerated for color change detection usingthe WarmStart Colorimetric LAMP 2X MasterMix (DNA amp RNA) and at up to 20 (vv) foramplification using alternative detection methods(eg fluorescence)

bull Detection and quantitation of viral RNA targetsusing colorimetric RT-LAMP can be achievedwith cell lysates at up to 200 cell equivalents per25 μl reaction

bull For color change detection Luna Cell Readylysates and other buffered lysates should be dilut-ed prior to addition to colorimetric RT-LAMPreactions We recommend adding 1 μl of a 110dilution per 25 μl reaction as a starting point

Discussion

The data presented in this application note is intended to serve as a starting point which we hope will enable further studies and test development Additional questions remain and development of direct diagnostics will ultimately require testing with COVID-19 patient samples NP swab samples contain not only UTM nasal epithelial cells (andor lysed cell contents) and viral particles but also mucus and other nasal mucosal secretions direct testing of samples will be required to determine whether these additional factors affect reagent performance andor viral RNA stability during testing workflows Additionally while naked synthetic RNA was used in our testing as a proxy most viral RNA in patient samples is seques-tered in proteinaceous capsids within enveloped virion particles This protects viral RNA from RNases secreted by nasal mucosa and thus helps prevent RNA degradation prior to testing however the virion envelope and enclosed capsid must ultimately be disrupted to enable viral RNA detection Despite these challenges a recent study demonstrated direct detection of SARS-CoV-2 RNA in patient samples using Luna One-Step RT-qPCR reagents (2)

References1 Zhang Y et al Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus

RNA Using Colorimetric LAMP medRxiv 2020022620028373 (2020) (preprint) doi1011012020022620028373

2 Bruce EA et al RT-qPCR Detection of SARS-CoV-2 RNA from Patient Nasopharyngeal Swab using Qiagen RNEasy Kits or Directly via Omission of an RNA Extraction Step bioRxiv 20200320001008 (2020) (preprint) doi10110120200320001008

4800

480

48

0

copi

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Orf1a N-gene

A B A BPrimer set

WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix was used to detect SARS-CoV-2 RNA targets in cell lysates Human (HeLa) cells were lysed in the presence of synthetic vRNA using the Luna Cell Ready Lysis Module Lysates were then diluted 110 and 1 μl then added to each RT-LAMP reaction giving 48 to 4800 vRNA copies as indicated and 2 to 200 cell equivalents per reaction

Der folgende Text ist ein Auszug aus einer Application Note die im Zusammenhang mit der globalen Pandemie COVID-19 erschienen ist Fuumlr die vollstaumlndige Application Note besuchen Sie wwwneb-onlinedeSARS-CoV-2appnote

Introduction

In the United States most diagnostics approved to date under FDA Emergency Use Authorization (EUA) have employed RT-qPCR for hydrolysis probe-based (eg TaqMan) detection of viral targets in RNA purified from patient samples The inclusion of an up-front RNA purification step however adds to protocol time and cost per sample and overall can reduce testing throughput Diagnostics that are capable of robust detection directly from patient samples would therefore be highly advantageous potentially enabling testing that is faster cheaper higher-throughput and better positioned to scale for anticipated demand

To help accelerate diagnostics development efforts here we demonstrate detection of synthetic SARS-CoV-2 viral RNA targets using NEBrsquos RT-qPCR and colorimetric RT-LAMP reagents The colorimetric RT-LAMP work is a follow-up on a recent publication by researchers at NEB in collaboration with researchers at the Wuhan Institute of Virology in China demonstrating colorimetric RT-LAMP detection of SARS-CoV-2 viral RNA purified from patient samples (1) Further we evaluate two requisite features for direct detection from patient samples tolerance to Universal Transport Medium and resistance to inhibition andor RNA degradation in the presence of human cell lysates

FIGURE 1 Direct detection of SARS-CoV-2 RNA targets in cell lysates by RT-LAMP

Lesen Sie die vollstaumlndige Arbeit inkl Performancedaten etc als PDF-Download unter

wwwneb-onlinede SARS-CoV-2appnote

AUSZUG AUS TECH-NOTE

9

Seit uumlber 45 Jahren ist NEB weltweit fuumlhrend in der Entdeckung und Herstellung von Reagenzien fuumlr die Biowissenschaften Vertrauen Sie unserem enzymologischen Fachwissen und beziehen Sie Ihre Reagenzien fuumlr die Synthese hochwertiger RNA bei NEB - von der Template-Generierung und Trans-kription bis hin zum Capping Tailing und Cleanup nach der Synthese Alle NEB Produkte werden mit jahrzehntelanger Erfahrung und Know-How in der Molekularbiologie entwickelt und hergestellt

Fuumlr Ihre Impfstoffprojekte beispielsweise waumlhlen Sie Ihre Reagenzien in Forschungsqualitaumlt oder in bdquoGMP-gradeldquo um die Herstellung von mRNA vom Labor- bis zum kommerziellen Maszligstab zu realisieren Unsere optimierten HiScribe Kits ermoumlglichen Ihnen dabei bequeme in vitro Transkript-ions (IVT) Workflows und die Synthese von bis zu 180 microg RNA pro Reaktion

Unser Tipp Unsere Reagenzien in Forschungsqualitaumlt sind ideal zu Beginn Ihres Projekts Fuumlr anschlieszligende Upscaling- und Optimierungsprozesse stehen Ihnen die Reagenzien dann auch in bdquoGMP-gradeldquo zur Verfuumlgung zB zur Herstellung therapeutischer mRNA im Groszligmaszligstab

ldquoGMP-graderdquo ist eine Bezeichnung die NEB verwendet um Reagenzien zu beschreiben die in der NEB-Anlage in Rowley hergestellt werden Diese Anlage wurde fuumlr die Herstellung von Reagenzien un-ter strengeren Auflagen an Infrastruktur und Prozesskontrollen konzipiert um besondere Produktspezifikationen und Kundenanforderungen zu erreichen Reagenzien die im NEB-Werk Rowley hergestellt werden werden unter Einhaltung der Vorgaben der Qualitaumltsmanagementsysteme ISO 9001 und ISO 13485 produziert Gegenwaumlrtig werden von NEB jedoch weder Produkte hergestellt noch verkauft die als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe (APIs) bekannt sind Auch garantiert NEB nicht die Beachtung aller Vorschriften der aktuellen Good Manufacturing Practice (GMP) Vorschriften bei der Produktion

bdquoGMP-graderdquo Reagenzien fuumlr die RNA Synthese ndash Wir bringen Sie vom bdquoTemplateldquo zum bdquoTranscriptldquo

Haben Sie Fragen zu NEBs GMP-grade Reagenzien

Erfahren Sie mehr uumlber den Unterschied zwischen Forschungsreagenzien und bdquoGMP-gradeldquo Material unter

wwwnebcomGMP

TEMPLATE GENERATION

IN VITRO TRANSCRIPTION

RNA CAPPING

POLY(A) TAILING

RNA PURIFICATION

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase

HiScribetrade T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (with tailing)Monarch RNA

Cleanup Kit (10 microg)

dNTP solution mixes HiScribe T7 ARCA mRNA Synthesis KitE coli Poly(A)

PolymeraseMonarch RNA

Cleanup Kit (50 microg)

BspQI XbaI HindIII other restriction enzymes

amp cloning reagents

Inquire about custom restriction enzyme formulations with

Recombinant Albumin

HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit

Vaccinia Capping System

Monarch RNA Cleanup Kit (500 microg)

DNA Assembly NEBuilder HiFi DNA Assembly

Golden Gate Assembly

HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit

mRNA Cap 2acute-O- Methyltranferase

Lithium Chloride

HiScribe SP6 High Yield RNA Synthesis Kit

ARCA and other mRNA cap analogs

T3 amp SP6 RNA Polymerases

T7 RNA Polymerase

Hi-T7 RNA Polymerase

Companion Products Companion Products

RNase inhibitor (Murine)

Monarch RNA Cleanup Binding Buffer

RNase Inhibitor (Human Placental)

Monarch RNA Cleanup Wash Buffer

Pyrophosphatase Inorganic (E coli) Nuclease-free Water

Pyrophosphatase Inorganic (Yeast)

DNase I (RNase-free)

NTPs

COMING SOON

COMING SOON

Polymerases restriction endonucleases ligases

available in GMP-grade

COMING SOON

10

Ist Ihr Institut bzw Firma oder Universitaumlt bereits bdquoangekommen in der neuen Normalitaumltldquo

Oder arbeiten Sie noch im Homeoffice

Die notwendige neue Normalitaumlt ist sicher eine schwierige Aufgabe fuumlr uns alle Aber wer wenn nicht wir als bdquoGemeinschaft der Wissen-schaftlerinnenldquo koumlnnten diese Aufgabe besser und vorbildlicher angehen

Wir bei NEB sind daher weiterhin zuversichtlich und wuumlnschen Ihnen viel Erfolg bei der Umset-zung der neuen Konzepte

Starten Sie mit Ihren Forschungsprojekten neu durch ndash mit schnellen Reagenzien und Workflows von NEB

Der zentrale ULTRA II DNA WORKFLOW ndash schnell zuverlaumlssig nur wenige Pipettierschritte

End Repair dA-Tailing

Adaptor Ligation

Clean Up Size Selection

PCR Enrichment

Clean Up

Module E7546 Module E7595 part of kit E7103 Module M0544 part of kit E7103

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (E7645)

NEBNext Ultra II DNA Library Kit with Purification Beads (E7103)

Reboot Your Bench Checklist

VOR DER RUumlCKKEHR INS LABORo Informieren Sie sich uumlber geltende Rahmenbedingungen

o Bestimmen Sie einen Mitarbeiter zur Koordination der neuen Richtlinien

o Kontrollieren Sie sich regelmaumlszligig auf Krankheitssymptome

o Stellen Sie ausreichend Schutzausruumlstung zur Verfuumlgung

o Planen Sie Ihre Arbeiten vor sodass Sie die Laborzeit effizient nutzen koumlnnen

o Welche Arbeiten koumlnnen Sie auch im Homeoffice erledigen Schreiben Meetings Bestellungen

o Staffeln Sie die Arbeits- und Pausenzeiten Ihres Teams

o Begrenzen Sie die Personenzahl pro Raum sorgen Sie fuumlr mindestens 15 m Abstand und richten Sie Einbahnstraszligen ein

o Erstellen Sie einen Raumplan mit diesen Maszlignahmen fuumlr Arbeits- und Pausenbereiche

o Gemeinsam genutzte Geraumlte benoumltigen einen Nutzungsplan und muumlssen regelmaumlszligig gereinigt werden

o Kontaktieren Sie Ihre PoststelleApothekeZentrallager um Abholung und Abgabe von Post Paketen oder Material zu koordinieren

o Entwickeln Sie einen Plan fuumlr Besucher einschlieszliglich Vertriebsmitarbeiter raten Sie im Zweifel von persoumlnlichen Besuchen ab und nutzen stattdessen Videokonferenzen

o Schulungsmaterial und Protokolle zu den neuen Regelungen helfen bei der Umsetzung

o Machen Sie sich mit Reise- und Pendlervorschriften vertraut

o Melden Sie sich bei Konferenzen und Messen an Viele dieser Veranstaltungen bieten auch eine virtuelle Teilnahme an

IM LABORo Persoumlnliche Sicherheit

ndash Handhygiene einhalten

ndash Abstand voneinander halten

ndash Beruumlhren Sie nicht Ihr Gesicht

ndash Tragen Sie Mund-Nasen-Schutz und Handschuhe

ndash Laborkittel haumlufiger waschen

ndash Schaffen Sie mehr Moumlglichkeiten zur Haumlndedesinfektion

o Geraumlte und Reagenzien

ndash Stellen Sie sicher dass Ihre Geraumlte funktionieren und kalibriert sind

ndash Aktualisieren Sie Steuerungs-Software fuumlhren Sie ggf Updates durch

ndash Stellen Sie haumlufig benutzte Geraumlte ggfs an neue Standorte sodass sie mit 15 m Sicherheitsabstand gleichzeitig genutzt werden koumlnnen

ndash Erwaumlgen Sie eine regelmaumlszligige Grundreinigung des Labors

ndash Spuumllen Sie die Wasserleitungen vor der ersten Nutzung

ndash Vergewissern Sie sich dass Sicherheitsausruumlstung wie Feuerloumlscher Dusch- und Augenspuumllstationen uumlberpruumlft sauber und funktionstuumlchtig sind

Wash your hands frequently

Reboot Your Benchwith this friendly reminder

Wear masks

Reboot Your Benchwith this friendly reminder

Wir helfen Ihnen bei der Ruumlckkehr in die neue Normalitaumlt im Labor und haben Ihnen ein paar Sicherheitstipps und Hinweisschilder zusammengestellt

Schnellere NGS Library Prep mit den modularen NEBNext Workflows und Kits

Zuruumlck im Labor ndash oder auf dem Weg dahin

Praktische Sicherheitstipps und Hinweisschilder finden Sie

unter wwwneb-onlinedeRebootYourBench

bull bdquoHands-onldquo Zeit lt15 Minbull Dauer 230 ndash 300 h gesamt

Vom zentralen NEBNext Ultra II DNA Workflow gehen Sie ganz einfach uumlber zubull Directional amp non-directional RNA-seqbull Single CellLow Input RNA Library Prepbull Enzymatic Methyl-seq (bisulfite-free)bull Enzymatic DNA Fragmentation System

Ihre Vorteile

bull Ein schneller zentralerWorkflow fuumlr eine Reihe verschiedener Anwendungen

bull Optimierte und modulareWorkflows mit wenigerPipettierschritten und schnellerenProtokollen

bull Geringe Inputmengen wenigerPCR-Zyklen extrem einheitlicheGC-Coverage

REBOOT YOUR BENCH

Room capacity ___________________

Reboot Your Benchwith this friendly reminder

Sanitize equipment after every use

Reboot Your Benchwith this friendly reminder

Follow social distancing ndash stay 15 meters apart

Reboot Your Benchwith this friendly reminder

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Wie Sie mit NEBNext Produkten Zeit Geld und Nerven sparen erfahren Sie unter

wwwneb-onlinedeUltra-2

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Q5 High-Fidelity DNA PolymerasesQ5 bietet nicht nur die houmlchste Genauigkeit aller kommerziell verfuumlgbarer PCR Polymerasen sondern ermoumlglicht auch schnellste PCRs mit nur 10 Sekundenkb bei Templates bis 20 kb Laumlnge

AMPLIFICATION

Quick CIP (M0525)Vollstaumlndige Dephosphorylierung in nur 10 Min mit schneller Hitzeinaktivierung

Quick Blunting Kit (E1201)Glaumltten Sie verdaute DNA-Enden nach weniger als 30 Min bei Raumtemperatur

END MODIFICATION

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621) Cloning Kit (E5520)Schnelle und gerichtete AssemblierungKlonierung von multiplen Fragmenten in nur 15 Minuten

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2) (E1601) NEB Golden Gate Assembly Kit (BsmBI v2) (E1602) Effiziente und gerichtete Assemblierung von multiplen Fragmenten in einer einzigen Reaktion

SEAMLESS CLONING

NEB Turbo Competent E coli (High-Efficiency) (C2984)Erhalten Sie Bakterienkolonien in nur 65 h nach einer 5 minuumltigen Transformation

TRANSFORMATION

LIGATION

Instant Sticky-end Ligase Master Mix (M0370)Speziell formuliert fuumlr sofortige Ligation uumlberhaumlngender Enden Einfach DNA dazu mischen und sofort transformieren Fertig

BluntTA Ligase Master Mix (M0367) Schnellligation fuumlr Einzelbase-Uumlberhaumlnge und blunt ends in nur 15 Min

Quick Ligation Kit (M2200)Ligiert Uumlberhaumlnge wie glatte DNA-Enden in nur 5 Min bei Raumtemperatur

Monarch DNA Purification KitsReinigen Sie hochqualitative DNA auf (zB in nur 5 Min mit dem PCR amp DNA Cleanup Kit) Nachhaltig designt mit umweltfreundlichen Materialien und weniger Plastikverbrauch

PURIFICATION

Waumlhrend das Klonieren in der Vergangenheit ein zeitaufwendiger und muumlhsamer mehrstufiger Prozess mit vielen Unbekannten war haben wir fuumlr Sie sowohl die Reagenzien als auch die Protokolle deutlich schneller gemacht Heute ist Klonieren mit NEB in nur einem Tag bereits Realitaumlt

Beschleunigen Sie Ihre Cloning Ansaumltze

Proteinexpression mit Vollgas ndash NEBExpress Cell-free E coli Protein Synthesis System

M neg bGalS bGal SP6 FLuc BglA CitS vGFP GMK DHFR CALM

200

100

60

25

15

Finden Sie detaillierte Informationen zum schnellen Klonieren mit NEB unter

wwwneb-onlinede FastCloning

High-Fidelity (HF) Restriktionsenzyme bis uumlber 64000-fach genauer dank reduzierter Staraktivitaumlt optionale Schnellverdaus und houmlchste Pufferkompatibilitaumlt (CutSmart Puffer)

Time-Saver Restriktionsenzymegt195 Enzyme sind Time-Saver qualifiziert und erlauben optionale Schnellverdaus in nur 5ndash15 Min

DIGESTION

Detaillierte Produktinformationen finden Sie unter

wwwnebcomE5360

Ihre Vorteile

bull Zellfreie Proteinsynthese in nur2ndash4 h mit Ausbeuten ~05 mgml

bull Geeignet fuumlr Proteine von17 bis 230 kDa

bull Moumlgliche Templates kodierendePlasmid DNA linearer DNAoder mRNA

Abb SDS-PAGE Analyse einer Protein Synthese mit dem NEBExpress Cell-free E coli Protein Synthesis System

50 microl Protein Synthese Reaktionen mit 250 ng Template DNA wurden fuumlr 3 Stunden bei 37degC inkubiert Je 2 microl wurden pro Reaktion auf ein 10 ndash 20 Tris-Glycin Gel aufgetragen Die roten Punkte markieren jeweils das exprimierte Protein M = Unstained Protein Standard Broad Range P7717 bdquoNegldquo = Negativ-Kontrolle ohne DNA Template

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PRODUKT ARTNR GROumlSSE PREIS

NEBExpress Cell-free E coli Protein Synthesis System

E5360SL10 rxns 100 rxns

210 euro 1700 euro

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12

wwwneb-onlinede

Impressum

NEB Aktuell erscheint zweimal im Jahr Sollten Sie Anregungen oder Fragen haben die in der naumlchsten Ausgabe erscheinen koumlnnten kontaktieren Sie bitte die Marketing amp Sales Abteilung von NEB

Bei Irrtuumlmern oder Druckfehlern keine Haftung Sonderpreise sind nicht weiter rabattierbar Alle Aktionen dieses Heftes sind nur guumlltig bei Angabe des jeweiligen Promo-Codes bei Bestelleingang und bis zum 31122020 Die vollstaumlndigen Bedingungen fuumlr alle Aktionen finden Sie unter wwwneb-onlinede Es gelten die allgemeinen Geschaumlftsbedingungen der New England Biolabs GmbH Alle Preise freibleibend zzgl der gesetzlichen MwSt

Bei Bestelleingang werktags (Mo-Do) bis 1600 Uhr erhalten Sie Ihre Ware am naumlchsten Tag Bestellungen die vor einem WochenendeFeiertag eingehen werden am kommenden MontagWerktag versendet

Sie haben die uumlberlegenen Luna qPCR-Reagenzien noch nicht getestet

Fordern Sie gerne Ihr kostenloses Muster an wwwneb-onlinedeluna

Jetzt mit Luna Universal (RT)-qPCR Produkten schnell durchstarten und dabei richtig sparenFuumlr die RNA Quantifizierung (One-Step)

Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (Dye)E3005SL E3005XE

200500 rxns (20 microl) 10002500 rxns (20 microl)

218 euro 498 euro 869 euro 1924 euro

Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitE3006SL E3006XE

200500 rxns (20 microl) 10002500 rxns (20 microl)

198 euro 448 euro 788 euro 1738 euro

Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (no ROX) E3007E 2500 rxns (20 microl) 1738 euro

Fuumlr die RNA Quantifizierung (One-Step) direkt an kultivierten Zellen

Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit (Dye) E3030S 100 lysis amp 500 PCR rxns 898 euro

Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit E3031S 100 lysis amp 500 PCR rxns 854 euro

Luna Cell Ready Lysis Module E3032S 100 lysis rxns 450 euro

Fuumlr die DNA Quantifizierung

Luna Universal qPCR Master Mix (Dye)M3003SL M3003XE

200500 rxns (20 microl) 10002500 rxns (20 microl)

105 euro 237 euro 424 euro 948 euro

Luna Universal Probe qPCR Master MixM3004SL M3004XE

200500 rxns (20 microl) 10002500 rxns (20 microl)

88 euro 198 euro 364 euro 812 euro

Fuumlr die cDNA-Synthese in Two-Step RT-qPCR Protokollen (zusammen mit M3003 oder M3004)

LunaScript RT SuperMix Kit E3010SL 25100 rxn (20 microl) 125 euro 420 euro

Der LunaScript RT SuperMix Kit bietet Ihnen die schnellste und zuverlaumlssigste Erststrang-cDNA-Synthese

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 50 60 65 70 75Time (min)

LunaScript

SuperScriptreg IV VILOtrade

Maxima H Minus

iScripttrade

BioScripttrade

GrandScript

qScriptreg

qScript XLT

SuperScript III VILO

95

85

55

50

46

42

25

Temp (degC)LunaScriptreg

Random primerannealing amp partial extension

2 min 25deg

cDNA synthesis

10 min 55deg

RT inactivation

1 min 95deg

Abb Vergleich der Herstellerempfehlungen fuumlr cDNA-Synthese Das LunaScript RT SuperMix Kit ermoumlglicht Ihnen die schnellsten und kuumlrzesten Protokolle und toleriert die houmlchsten Temperaturen die zum sicheren Aufschmelzen inhibierender RNA-Sekundaumlrstrukturen benoumltigt werden

Volle Kraft voraus ndash mit den schnellen und zuverlaumlssigen Luna Universal RT-qPCR Kits

New England Biolabs GmbHBruumlningstr 50 Geb B85265926 FrankfurtMain GermanyTel +49(0)69305-23140Fax +49(0)69305-23149

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HAUPTQUARTIERUSANew England Biolabs IncTelephone (978) 927-5054

Toll Free (USA Orders) 1-800-632-5227Toll Free (USA Tech) 1-800-632-7799Fax (978) 921-1350infonebcom

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33fuumlr22

Sparen SieSparen Siemit NEBmit NEBViele Produkte aus diesem Heft (und mehr) bieten wir Ihnen derzeit in der besonders guumlnstigen bdquo3 fuumlr 2ldquo Aktion an Bestellen Sie bis zum 31122020 drei unterschiedliche oder drei gleiche Aktions-produkte mit dem Promo-Code bdquo3fuumlr2ldquo und zahlen Sie nur zwei

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Fuumlr schnellste und zuverlaumlssige RT-qPCR empfehlen wir Ihnen NEBs Luna Universal RT-qPCR Kits Diese wurden unter Beruumlcksichtigung der strengen Empfehlungen der bdquoMIQE-guidelines for good qPCR practiceldquo entwickelt auf Performance optimiert und auf diversen Templates validiert

Zur zuverlaumlssigen RNA-Quantifizierung nutzen Sie die Luna One-Step RT-qPCR Kits E3005 E3006 oder E3007 (s S 6) Wenn Sie stattdessen Two-Step Protokolle bevorzugen waumlhlen Sie das LunaScript RT SuperMix Kit (enthaumllt bereits dNTPs Primer und RNase Inhibitor etc E3010) in Kombination mit den Luna Universal Dye oder Luna Universal Probe qPCR Master Mixes (M3003 bzw M3004)

Fuumlr den direkten RNA-Nachweis in kultivierten Saumlugetier- und Insektenzelllinien empfehlen wir die Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kits (E3030 und E3031) die alle notwendigen Komponenten fuumlr den direkten RNA-Nachweis und die Quantifizierung ohne vorgeschaltete RNA-Aufreinigung enthalten