F. Zanon, R. Lava, M. Prenzato, C. Cecchinato

ARPAV –– DDipartimento Regionale Laboratori ipartimento Regionale Laboratori

Laboratorio Laboratorio PProvinciale di rovinciale di VVeneziaenezia

11°°°°°°°° MSMS--EnviDay EnviDay

Bologna, 13 maggio 2011Bologna, 13 maggio 2011

A methodology for determination

of priority phenolic compounds in

contaminated soils

by LC-APCI mass spectrometry

Origine sia industriale che naturale- intermedi/metaboliti di produzioni industriali: coloranti, farmaci,

pesticidi/biocidi, esplosivi, industria cartiera e del rivestimento materiale legnoso

- possibile fotodegradazione chimica dei fumi esausti auto- acidi umici Proprietà: tossicità e persistenza →→→→ PENTACLOROFENOLO

(sostanze prioritarie) Normativa di riferimento:D. Lgs. n.152/2006 parte IV, Titolo V, Allegato 5, Tab. 1

A Siti ad uso verde

pubblico, privato e residenziale (mg/kg ss)

B Siti ad uso

commerciale e industriale (mg/kg ss)

Fenoli non clorurati Metilfenolo (o,m,p) 0.1 25 Fenolo 1 60 Fenoli clorurati 2-clorofenolo 0.5 25 2,4 clorofenolo 0.5 50 2,4,6 triclorofenolo 0.01 5 pentaclorofenolo 0.01 5

PRETRATTAMENTO – CLEANUP – DETERMINAZIONE ANALITI CA

Estrazione: con solvente con estrattore Soxhlet (metodo EPA 3540c e 3541), sotto pressione (metodo EPA 3545), con ultrasuoni (metodi EPA 3550b e IRSA 19a), metodo ISO per il pretrattamento di composti organici (ISO 14507).

Purificazione e cleanup: su gel di silice (metodo EPA 3630c), mediante gel permeation (metodo EPA 3640a) o con un sistema di ripartizione acido/base (metodi EPA 3650b e IRSA 19a).

Analisi e determinazione: condotta mediante GC (metodo EPA 8041), GC/MS (metodo EPA 8270c) o HPLC UV (Quad. Ist. Ric. Acque, 64 – Metodo19a - Metodi Analitici per i fanghi, vol. 3). Esiste inoltre un metodo ISO per la determinazione di fenoli e clorofenoli ISO/CD 14154

Necessità di conciliare protocolli ufficiali, standardizzati con metodiche proposte in letteratura scientifica → progresso tecnico/scientifico per arrivare ad un metodo

robusto ed affidabile che scenda ai limiti imposti dalla legislazione, ma allo stesso tempo che sia realmente compatibile con le attività di un’agenzia di

controllo (numero di campioni analizzati e tempistiche d’analisi)

Metodi di determinazione

Letteratura scientifica:Introduzione di nuove metodiche di cleanup (SPE, SPME, MEA) e determinazione (LCMS)

- C. Mahugo Santana , Z. Sosa Ferrera, M.E. Torres Padròn and J.J. Santana Rodrìguez, , Molecules 14 (2009) 298-320- M.C. Alonso, D. Puing, I. Silgoner, M. Grasserbauer and D. Barcelò, Journal of Chromatography A, 823 (1998) 231-239- M.N. Sarrion, F.J. Santos, E. Moyano and M.T. Galceran, Rapid Communications in Mass Spectrometry 17 (2003) 39-48- O.Jàuregui, E. Moyano and M.T. Galceran, Journal of Chromatography A 823 (1998) 241-248

Sito di Porto Marghera

Necessità di conferma in massa per complessità della matrice da analizzare

FENOLO METIL FENOLI: 2-Methylphenol, 3-Methylphenol, 4-Methylphenol, 2,4-DimethylphenolNITRO FENOLI: 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, 2,4 DinitrophenolCLORO FENOLI: 2-Chlorophenol, 2,4-Dichlorophenol, 2,4,6-Trichlorophenol, Pentachlorophenol

12 analiti determinati

Phenol-d6, 2-Fluorophenol,

2,4,6-Tribromophenol

standard interni impiegati

Preparazione Campione(Metodo CNR IRSA Quad. 64, vol 3 1993

opportunemente modificato e integrato con SPE cleanup

1. Prelevare 2 g di terreno tal quale ben omogeneizzato

2. Aggiungere 0.5 mL di acido acetico

3. Estrarre in ultrasuoni per 30 minuti con 5 mL di acetonitrile per 3 volte

4. Filtrare a 0.2 µm, recuperare 5 mL di estratto e concentrare fino a 1 mL con evaporatore a centrifuga

5. Riportare a 5 mL con acqua milliQ a pH 2

6. Purificare con SPE Oasis HLBTM da 6 mL (200mg) precedentemente attivata con Metanolo

7. Seccare la cartuccia sotto vuoto

8. Eluire le cartucce con 5 mL di metanolo

9. Portare a piccolo volume con evaporatore centrifugo

10. Trasferire in vials per l’analisi

SPE Oasis HLBTM N-vinylpirrolidone-divinylbenzene copolymeric sorbent

Analisi in LC MS/MSCondizioni cromatografiche UFLC

XR SHIMADZU

Colonna: Restek Pinnacle C18 50x2.1 mm 1.9µm

Eluenti: H2O e CH3CN/MeOH 1:1Flusso: 0.20 mL/min

Volume iniezione: 20 µLTemperatura colonna: 50 gradi °C

Detector API 4000 TM AB SCIEX

Sorgente APCIGS1: 50.00 CUR: 40.00

TEMP: 370 °CIS: -4500.00 volts

Condizioni strumentali detector di massa

Analita Q1 Mass(Da)Padre Q3 Mass Figlio (Da) DP CE Rt

2-Chlorophenol 127 91 -50 -20 5.3phenol 93 65 -80 -26 3.92,4-Dimethilphenol 121 106 -40 -28 6.82-Methilphenol 107 92 -68 -28

3-Methilphenol 107 92 -68 -284-Methilphenol 107 92 -68 -28phenol-d6 98 70 -70 -27 3.92,4-Dinitrophenol 183 109 -65 -33 3.42-Nitrophenol 138 108 -55 -20 5.24-Nitrophenol 138 108 -63 -20 4.32-Fluorophenol 111 91 -65 -24 4.12,4-Dichlorophenol 161 125 -78 -30 8.9Pentaclorophenol 2 263 263 -65 -5 14.42,4,6-Tribromophenol 331 81 -57 -44 13.72,4,6-Trichlorophenol 195 159 -56 -30 12.3

5.0

Range di concentrazione

Analita Standard internoLimite inferiore

della curvaLimite superiore della

curvaAssegnato µg/L µg/L r

phenol phenol-d6 20 200 0.99982,4-Dichlorophenol 2,4,6-Tribromophenol 2 40 0.99902,4,6-Trichlorophenol 2,4,6-Tribromophenol 2 40 0.9999Pentaclorophenol 2,4,6-Tribromophenol 0.4 20 0.99942,4-Dimethylphenol 2-Fluorophenol 10 200 0.99972-Methylphenol 2-Fluorophenol3-Methylphenol 2-Fluorophenol

4-Methylphenol 2-Fluorophenol2-Chlorophenol 2-Fluorophenol 0.8 40 0.99972,4-Dinitrophenol 2-Fluorophenol 0.5 40 0.99992-Nitrophenol 2-Fluorophenol 4 20 0.99904-Nitrophenol 2-Fluorophenol 2 20 0.9987

4 90 0.9994

Phenol Range 20-200 ppb

Curve di calibrazione

2,4-Dinitrophenol Range 0.5-40 ppb

Pentachlorophenol Range 0.4-20 ppb

Ripetibilità

QC2-Chloro phenol

phenol 2,4-Dimethyl phenol

(2,3,4) Methylphenol

2,4-Dinitro phenol

2-Nitro phenol

4-Nitro phenol

2,4-Dichloro phenol

Pentacloro phenol

2,4,6-Trichloro phenol

ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb

QC-12.5 µg/L 10.8 15.6 9.54 31.5 13.1 11.2 10.8 13.4 11.2 13

QC-12.5 µg/L 14.4 13.2 10.6 31.3 12 12 10.9 12.1 11.8 13.1

QC-12.5 µg/L 14.3 13.8 12.9 30.5 9.75 13.3 11.3 12 10.7 12.6

QC-12.5 µg/L 13.5 12.3 10.1 31.1 13.4 12.6 10.5 13.2 11.3 14.4

QC-12.5 µg/L 13.6 16.4 9.15 28.2 9.75 13 10.3 12 10.6 14.1

QC-12.5 µg/L 12.6 14.8 10.8 31.5 10.5 12.3 10.8 11.1 11.2 12.3

QC-12.5 µg/L 12.5 12.9 12.4 27.5 16.2 11.4 11.9 11.3 11.8 12.5

QC-12.5 µg/L 12.7 16.8 9.33 24.7 13 12.4 10.6 12.5 12.2 13.1

QC-12.5 µg/L 12.6 9.35 11.2 26.8 10.2 9.64 12.1 13.3 13.5 13.7

QC-12.5 µg/L 14.2 14.1 8.7 27.7 16.2 9.34 10.3 11.8 10.3 12

QC-12.5 µg/L 12.3 11.6 9.65 20.5 12.3 11.3 10.1 11.7 13 11

QC-12.5 µg/L 11.5 11.7 9.41 27.4 9.41 12.5 12.5 11 13.9 11.8

QC-12.5 µg/L 13.7 13 8.87 28.1 12.1 9.75 11.4 13.8 11.7 13.9

QC-12.5 µg/L 12.3 15.3 10.5 27.5 13.4 10.6 11.4 9.65 12.5 11.6

QC-12.5 µg/L 13.6 11.4 13.5 32.9 10.6 13.8 10.1 10.8 12.3 12.3

num valori 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15

Media 12.97 13.48 10.44 28.48 12.13 11.68 11.00 11.98 11.87 12.76

Dev.St 1.04 2.07 1.49 3.18 2.16 1.37 0.75 1.13 1.05 0.98

CV% Ripetibilita' (min 15 camp in 2 mesi) 8% 15% 14% 11% 18% 12% 7% 9% 9% 8%

RecuperiRecuperi calcolati con spike su terreno di 0.13 µg/g

Sample Name

2-Chloro phenol

phenol 2,4-Dimethyl phenol

(2,3,4)-Methyl phenol

2,4-Dinitro phenol

2-Nitro phenol

4-Nitro phenol

2,4-Dichloro phenol

Pentacloro phenol

2,4,6-Trichloro phenol

Gen-17-2011-Bianco1_terreno_purificato_1:10 0 0 14.3 0.539 0.076 0 0.127 0.133 0 0

Gen-17-2011-Bianco2_terreno_purificato_1:10 0 0 30.1 0.488 0.0932 0 0 0.124 0 0

Gen-17-2011-Spike2_terreno_purificato_1:10 68 69 69 144 31 63 63 69 59 76

Gen-17-2011-Spike3_terrenoOpurificato_1:10 73 77 75 158 47 76 70 69 68 74

Gen-17-2011-Spike2_terreno_purificato_1:10 82 80 53 156 41 79 65 64 61 75

Gen-17-2011-Spike3_terreno_purificato_1:10 79 74 86 179 45 88 66 70 68 83

Medie purificati 71 77 47 150 39 69 66 69 63 75

Recuperi Purificati 106% 115% 71% 74% 58% 104% 99% 102% 95% 112%

CV% 8 6 20 9 18 14 4 3 7 6

17-Gennaio-2011 Terreni

Analisi in HPLC Fluo/PDA UV

Condizioni cromatografiche HPLCWaters Alliance 2695

Colonna Spherisorb® ODS2 4.6x250 mm 5 µm

Eluenti: H2O 1% ac. acetico e CH3CN

Flusso: 1.20 mL/min

Volume iniezione: 20 µL

Detector fluorimetrico: λ ex 273 nm; λ em 308 nm

Detector PDA/UV 3 canali:

• a 280 nm per monocloro e diclorofenoli

• a 290 nm per 2,3,6 triclorofenolo e nitrofenoli

• a 300 nm per pentaclorofenolo

Tempo (min) % H2O % CH3CN

0 68 32

15 64 36

30 42 58

35 38 62

40 10 90

45 10 90

55 68 32

Confronto tra LC MS/MS e HPLC

Analita LOQ LCMS

(µg/L)

LOQ LCMS

mg/Kg s.s.

LOQ HPLC

mg/Kg s.s.

Limite 152/A

mg/Kg s.s.

Limite 152/B

mg/Kg s.s.

phenol 20 0.30 0.05 1 60

2,4-Dichlorophenol 2 0.03 0.5 0.5 50

2,4,6-Trichlorophenol

2 0.03 0.5 0.01 5

Pentaclorophenol 0.4 0.01 1.0 0.01 5

2,4-Dimethylphenol 10 0.15 0.05 non assegnato non assegnato

2-Methylphenol

4 0.06

0.05

0.1 253-Methylphenol

0.054-Methylphenol

2-Chlorophenol 0.8 0.01 0.5 0.5 25

2,4-Dinitrophenol 0.5 0.03 0.5 non assegnato non assegnato

2-Nitrophenol 4 0.06 0.5 non assegnato non assegnato

4-Nitrophenol 2 0.03 0.5 non assegnato non assegnato

Confronto con MR

RM 112 Valore dichiarato

mg/Kg s.s.

Valore LCMS

mg/Kg s.s.

Valore HPLC

mg/Kg s.s.

phenol 2.45 ± 1.63 1.06 ± 0.23 1.62 ± 0.08

2-chlorophenol 2.38 ± 1.44 1.83 ± 0.32 2.02 ± 0.11

4-nitrophenol 5.66 ± 4.32 7.93 ± 1.15 9.97 ± 0.31

2,4-dichlorophenol 2.53 ± 1.11 3.77 ± 0.67 2.24 ± 0.14

pentachlorophenol 5.05 ± 4.05 8.74 ± 2.33 7.90 ± 0.31

RM 117 Valore dichiarato

mg/Kg s.s.

Valore LCMS

mg/Kg s.s.

Valore HPLC

mg/Kg s.s.

2-nitrophenol 8.08 ± 2.72 7.55 ± 0.5 8.49 ± 0.24

2,4-dichlorophenol 8.02 ± 1.98 7.80 ± 0.71 6.24 ± 0.32

2,4,6-trichlorophenol 4.25 ± 1.01 4.50 ± 0 3.77 ± 0.09

pentachlorophenol 6.99 ± 4.74 7.90 ± 0.71 15.16 ± 0.99

Analisi di campioni reali

# ID

(mg/Kg s.s.)

135573 135574 135575 135439 135440 135441 135443

phenol 0.22 0.24 0.09 0.29 <LOD <LOD <LOD

methylphenol isomers 0.07 0.04 <LOD 0.07 <LOD <LOD <LOD

2-chlorophenol <LOD <LOD * <LOD <LOD * <LOD * <LOD * <LOD *

2,4,6-trichlorophenol <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD *

pentachlorophenol <LOD <LOD <LOD 0.01 0.01 0.16 0.11

Peso t.q. (g) 2.464 2.574 2.493 3.006 2.793 2.598 3.503

RS 105°C % 82.7 83.7 80.1 83.0 83.6 74.7 77.0

Frazione % <2mm 96.1 75.7 100 98.1 100 100 100

* Valori risultati >LOD in HPLC, ma non confermati in LCMS

Ulteriori sviluppi del metodoFenolo

Phenol

Colonna ammidica Colonna C18

Conc.

10 µg/LConc.

20 µg/L

Utilizzando la colonna ammidica Supelco Ascentis® RP Amide 15 cm X 2.1 mm 2.7 µm si ottengono picchi molto piu’ stretti e separazioni ottimali per alcuni isomeri

2-, 3- e 4-chlorophenol

4-chloropheno3-chlorophenol

Colonna ammidica Colonna C18

2-chlorophenol

Conc.

0.8 µg/L

Conc.

0.8 µg/L

Conc.

2 µg/L

Considerazioni finali

1. Il metodo sviluppato consente la determinazione simultanea del fenolo e dei suoi metil, nitro e cloro derivati in matrice complessa con elevata sensibilità e selettivitàcaratteristica del detector di massa, senza ricorrere alla derivatizzazione

2. LOQ adeguati ai limiti di legge per gli analiti ricercati

3. Metodo utilizzabile in un laboratorio di controllo ambientale (metodica “veloce”) per un elevato numero di campioni