A diabetes mellitus egy lehetséges őssejtterápiája

Doktori értekezés

Urbán S. Veronika

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Prof. Habil. Uher Ferenc Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Tóth Sára egyetemi docens, Ph.D. Dr. Bodó Imre osztályvezető főorvos, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Prof. Falus András egyetemi tanár,

MTA rendes tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Darvas Zsuzsanna egyetemi docens, Ph.D.

Dr. Apáti Ágota Ph.D.

Budapest 2009

1

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke 4

1.Bevezetés (irodalmi háttér) 6

1.1. A diabetes mellitus 7

Elterjedés, típusok 7

Történeti áttekintés, a kezelés fejlődése 8

Szövődmények 9

1.2. Kuratív terápiás lehetőségek diabetes mellitusban 10

Hasnyálmirigy vagy sziget-transzplantáció 10

A diabetes mellitus őssejtterápiájának lehetőségei 12

β-sejtek embrionális őssejtekből? 12

β-sejtek felnőtt szövetek sejtjeiből, prekurzorokból, szöveti őssejtekből? 17

1.3. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) különleges tulajdonságai 26

Az MSC-k könnyen izolálhatóak 26

A plasztikus MSC tenyészetek sokáig fenntarthatóak 27

Az MSC-k a szervezetben mindenhol jelen vannak 27

Az MSC-k mobilitása és regeneratív képességei 28

Az MSC-k és az immunrendszer kapcsolata 29

2. Célkitűzések 33

3. Módszerek 35

3.1. A diabetes kísérletes előidézése 35

A diabetes állatmodellje 35

A vércukorszint, szérum inzulinszint és a testsúly követése 35

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt 36

3.2. A csontvelői magvas sejtek szeparálása 36

3.3. A cukorbeteg egerek transzplantációja csontvelői magvas sejtekkel 36

3.4. A mesenchymális őssejtek izolálása, tenyésztése 37

2

3.5. A mesenchymális őssejtek jellemzése 38

Áramlási cytométerrel végzett marker-vizsgálatok 38

Csont irányú differenciáltatás 38

Zsírsejt irányú differenciáltatás 39

3.6. A mesenchymális őssejtek transzplantációra történő felhasználása 39

3.7. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata 39

Az APC-k kinyerése 40

A T-lymphocyták izolálása 40

A sejtosztódás mérése 41

Gyógyszeres immunszuppresszió alkalmazása 41

3.8. Mikroszkópos vizsgálatok 41

Szövettan és immunhisztokémia 41

Kombinált immunhisztokémia és Y kromoszóma in situ hibridizáció 42

A csontvelői chimerizmus követése 43

3.9. Statisztikai analízis 43

4. Eredmények 44

4.1. Az 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljének kialakítása 44

4.2. A csontvelő-transzplantáció hatása a diabetes progressziójára és a beteg állatok túlélésére 47

4.3. Egér mesenchymális őssejtek (MSC-k) karakterizálása és differenciáltatása 52

4.4. A mesenchymális őssejtek és a csontvelői vérképző sejtek sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában 55

4.5. A kotranszplantációt követő gyógyulás mechanizmusának vizsgálata 63

A gyógyulás nem a donor BMC-k, vagy MSC-k inzulin-termelő β-sejtté való transzdifferenciálódásának köszönhető 63

Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ 66

5. Megbeszélés 71

6. Következtetések 81

3

7. Összefoglalás 84

Összefoglalás 84

Abstract 85

8. Irodalomjegyzék 86

9. Publikációk jegyzéke 98

10. Köszönetnyilvánítás 101

4

Rövidítések jegyzéke

Rövidítés angol magyar

APC - antigen presenting cell - antigén bemutató sejt

BMC vagy

BM sejt

- bone marrow cell - csontvelői magvas sejt

CFU-F - colony-forming unit

fibroblast

- fibroblast kolónia képző

CsA - cyclosporine A - cyclosporin A

DAB - diaminobenzidine - diaminobenzidin

DC - dendritic cell - dendritikus sejt

DMEM - Dulbecco’s modified Eagle’s

medium

- Dulbecco által módosított

Eagle-féle tápoldat

EDTA - ethylendiaminetetraacetate - etilén-diamin-tetra-acetát

ELISA - enzyme-linked

immunosorbent assay

- enzimhez kapcsolt

immunszorbens vizsgálat

ESC vagy

ES sejt

- embryonic stem cell - embrionális őssejt

FCS - fetal calf serum - foetális borjú szérum

FISH - fluorescent in situ

hibridisation

- fluorescens in situ

hibridizáció

FITC - fluorescein isothiocyanate - fluorescein isothiocyanát

GFP - green fluorescent protein - zöld fluoreszcens fehérje

GLP-1 - glucagon-like peptide-1 - glukagonszerű peptid-1

GVHD - graft versus host disease - graft versus host betegség

HBSS - Hank's Buffered Salt

Solution

- Hank-féle pufferált sóoldat

HE - haematoxylin-eosin - haematoxylin-eosin

HGF - hepatocyte growth factor - hepatocyta növekedési faktor

HSC - haematopoetic stem cell - haematopoetikus őssejt

5

IBMX - isobutyl-methylxanthine - Izobutil-metilxantin

ICM - inner cell mass - belső sejttömeg

ip - intraperitoneal - intraperitoneális (hasüregbe

adott)

MAPC - multipotent adult progenitor

cell

- multipotens felnőttkori

progenitor/előd sejt

MSC - mesenchymal stromal/stem

cell

- mesenchymális stróma/őssejt

NK-sejt - natural killer sejt - természetes ölő sejt

NOD - non-obese diabetic - nem-kövér cukorbeteg (egér

törzs elnevezése)

OVA - ovalbumin - ovalbumin

Pax4 - paired box 4 - paired box 4 (gén)

PBS - phosphate-buffered saline - foszfáttal pufferált sóoldat

Pdx-1 - pancreatic and duodenal

homeobox 1

- pancreaticus és duodenális

homeobox 1 (gén)

PECAM-1 - platelet endothelial cell

adhesion molecule

- vérlemezke-endothel sejt

adhéziós molekula

SCF - stem cell factor / steel factor

/ c-kit ligand

- őssejt faktor / steel faktor

/ c-kit ligand

SP-sejtek - side population cells - „side population” sejtek

SSC - standard saline citrate - citrát pufferált sóoldat

STZ - streptozotocin - streptozotocin

TBI - total body irradiation - egész test besugárzás

TBS - Tris-buffered saline - Tris-pufferált sóoldat

Treg - regulator T-cell - reguláló T-sejt

TZD - thiazolidinedion - thiazolidinedion

WHO - World Health Organisation - Egészségügyi Világszervezet

6

1.Bevezetés

(Irodalmi háttér)

A cukorbetegség (diabetes mellitus) az iparosodott országok lakosait

sújtjó vezető kórokok és halálokok egyike. Kialakulásáért az inzulin abszolút vagy

relatív hiánya okolható, melyben a működőképes β-sejtek csökkent mennyisége

és/vagy a szövetek inzulinrezisztenciája a fő tényező. Igaz ugyan, hogy a diabetes

napjainkra már egyike a legjobban kezelhető anyagcsere-betegségeknek, de még a

legkörültekintőbb ápolás mellett is előfordulhatnak hirtelen fellépő életveszélyes

állapotok, és gyakorlatilag elkerülhetetlenek a hosszú távú szövődmények.

Tényleges kuratív terápiát csak az elpusztult β-sejtek tartós pótlása jelenthetne.

Mára már jelentős számú Langerhans-sziget transzplantációt hajtottak

végre az egyes típusú cukorbetegség kezelésére. Ez az ígéretes lehetőség azonban

semmiképpen sem jelenthet a diabetesben szenvedő betegek milliói számára

megoldást. Ezért fordult a figyelem olyan új lehetőségek irányába, mint az

őssejtterápia. Embrionális vagy szöveti őssejtekből igyekeznek világszerte

transzplantálható szigetsejteket előállítani. Még elegánsabb megoldás lenne a

Langerhans-szigetek endogén regenerációjának serkentése, akár a szervezet saját

őssejtjeinek vagy progenitorainak, akár kívülről bevitt őssejteknek a segítségével.

Néhány szerző megfigyelte, hogy a csontvelő-transzplantáció - legalábbis

átmenetileg - gyógyíthatja a diabetest. A csontvelőből kinyerhető egyik

őssejttípus, a mesenchymális őssejtek (mesenchymal stromal/stem cell = MSC)

hatásának vizsgálata különösen érdekesnek ígérkezik, már csak újabban előtérbe

került immunszuppresszív tulajdonságaik miatt is. Akár hozzájárulnak ezek a

sejtek a szervezet regenerációs folyamataihoz, akár nem, figyelemreméltóak egy

olyan autoimmun eredetű sejtpusztulás terápiás lehetőségeinek kutatása során,

mint amilyen az egyes típusú diabetes is.

7

1.1. A diabetes mellitus

Elterjedés, típusok

A cukorbetegséget civilizációs betegségnek tartják, mely főleg a jóléti

társadalmakat sújtja. Terjedésének üteme járványszerű. Az 1990-es évek közepén

a világon a cukorbetegek száma már megközelítette a százmilliót. Jelenleg

legalább kétszázmillió ember szenved cukorbetegségben, és a WHO (World

Health Organisation) előrevetítései szerint, még ennek a számnak is a

megkettőződését várják 2025-re. Magyarország lakosságának 5%-a cukorbeteg és

ebből legalább kétszázezren szorulnak inzulinkezelésre.

A cukorbetegségnek számos oka lehet, de két alapvető típusát

különböztetjük meg. Az 1-es típusú (vagy inzulin-dependens) diabetes mellitust –

amitől a cukorbetegek körülbelül 10 %-a szenved - a hasnyálmirigy Langerhans-

szigeteiben található inzulintermelő β-sejtek pusztulása okozza. Súlyos T-sejt

közvetített autoimmun betegség. Progressziója során a beteg immunrendszere

megtámadja és elpusztítja a β-sejteket (Homo-Delarche és Drexhage 2004,

Narendran és mtsai 2005). A beteg saját inzulintermelése gyorsan, teljesen és

végérvényesen leáll, így az érintettek túlélése csak külső inzulin napi többszöri

bevitelével biztosítható. Az 1-es típusú diabetes jellemzően a kamaszkor elején

alakul ki, bár ritkán más életkorban is felléphet.

A 2-es típusú (vagy nem inzulin-dependens) diabetes mellitus kialakulása

gyakran, de nem minden esetben, összefügg az elhízással és egyre nagyobb számban

érinti a fiatalokat is. Az éveken át elhúzódó, lassan progrediáló inzulinrezisztencia és az

elégtelen inzulin-szekréció együttes fennállásának következtében létrejövő, bonyolult

anyagcsere betegség, mely többnyire összefüggésbe hozható az ún. metabolikus

szindrómával (Kim és Reaven 2004) és a szervezetben lejátszódó gyulladásos

folyamatokkal (Hotamisligil 2006). A metabolikus szindrómát az elhízás, a magas

vérnyomás, a magas vércukorszint és a diszlipidémia együttes fennállása jellemzi.

Újabb elméletek szerint az sem kizárható, hogy mitokondriális diszfunkciók állnak az

inzulin-szekréció és jelátvitel meghibásodásának hátterében legalábbis a betegek egy

részénél (Lowell és Shulman 2005). Esetenként a hasnyálmirigy exocrin degenerációja

8

(is) okolható a szigetsejtek pusztulásáért (Larsen 1993). A 2-es típusú diabetesre inkább

jellemző a családi halmozódás, mint az 1-es típusúra. Magyarországon a 60 év felettiek

15 %-a 2-es típusú cukorbeteg. Az időskori diabetes kezelése kezdeti stádiumban

főként diétával és orális vércukorszintcsökkentő szerekkel (antidiabetikumokkal),

később kiegészítő inzulin terápiával történik. Becslések szerint a 2-es típusú

cukorbetegség kialakulása során a β-sejtek száma általában mintegy 50%-al csökken

(Donath és Halban 2005). Az így előálló inzulintermelési elégtelenség kezelésére tehát,

legalábbis részben ugyanúgy megfelelő mód lenne a hiányzó sejtek visszapótlása, mint

az 1-es típusú diabetes esetében

Történeti áttekintés, a kezelés fejlődése

Noha a cukorbetegség terjedése csak napjainkra öltött járványszerű méreteket

már a Kr. e. 1500-ból származó egyiptomi Ebers-papiruszban említik, de ismert volt az

ősi kínai és indiai orvosok előtt is. A Kr. e. 200 körül élt Demetriosz görög orvos adta

a betegségnek a "diabetes" nevet a diabainein görög szóból kiindulva, mely

„túláradást”, vagyis fokozott vizeletürítést jelent. A "mellitus" jelző 1674-ben került az

elnevezésbe Thomas Willis angol orvos jóvoltából, aki a cukorbetegek vizeletét

megízlelve, édesnek találta azt. Paul Langerhans - akkor még orvostanhallgató - 1869-

ben írta le a hasnyálmirigy exocrin állományában szigetszerűen elhelyezkedő,

ismeretlen rendeltetésű sejtcsoportokat. A leírójukról elnevezett Langerhans-szigetek β-

sejtjeiből elsőként 1921-ben Frederick G. Banting és Charles B. Best vonták ki az

inzulint, melynek segítségével sikerrel kezeltek egy 13 éves, diabeteses comában fekvő

fiút. Munkájukért 1923-ban Nobel-díjat kaptak (King és Rubin G. 2003, Winkler 2002).

Az 1920-as évekig a cukorbetegséget csak különböző diétákkal tudták kezelni,

illetve ha a szervezet saját inzulintermelése teljesen leállt, akkor a betegség minden

esetben halálossá vált. Banting és Best eredményeit követően, közel 30 éven át

használtak állati eredetű (sertés, szarvasmarha) inzulint a betegség kezelésére.

Az inzulin az első peptid hormon melynek szerkezetét 1953-ban

Frederick Sanger leírta és ugyancsak az első engedélyezett rekombináns módon

előállított gyógyszer. Az Escherichia coli baktériumba bevitt emberi inzulin gén

segítségével előállított "humán" inzulin 1987-ben került a gyógyszerpiacra. 1991

9

óta élesztőbe (Saccharomyces cerevisae) bejuttatott DNS segítségével is gyártanak

inzulint (Raskin és Clements 1991). Napjainkra a géntechnológiával előállított

készítmények teljesen kiszorították a gyakran immunológiai komplikációkat okozó

állati inzulinokat. Magyarországon 1996-ban fejeződött be a cukorbetegek

átállítása humán inzulinokra, és azóta is sokat fejlődött a kezelés. Létrehoztak

olyan inzulin analógokat, melyek néhány aminosavban eltérnek az eredeti

szekvenciától és így megváltozik a felszívódásuk sebessége vagy hatásuk

időtartama. A gyors, közepes illetve az elhúzódó hatású inzulin analógok

megjelenése még rugalmasabbá tette a kezelést (Tamás 2002).

A sürgősségi állapotokat kivéve az inzulint általában bőr alá (subcutan)

fecskendezik. A beadás segédeszközeinek fejlődése egyre fájdalmatlanabb

befecskendezést, egyre pontosabb adagolást és mind nagyobb szabadságot

biztosítanak a betegek számára, bár a tűszúrás kiváltására (inzulinpumpa,

inhalációs inzulin) még nincsen széles körben lehetőség.

Szövődmények

A diabetes akut és krónikus szövődményekkel járhat. Inzulin-kezelés esetén

ezeknek az a legfőbb oka, hogy a lökésszerűen bevitt inzulin nem képes a sejtek

anyagcseréjének olyan finom szabályozására, mint a β-sejtekből - mindig az aktuális

glükóz terhelésnek megfelelően – felszabaduló, endogén inzulin. Az egészséges

szervezet β-sejtjei ugyanis nagyon pontosan érzékelik és követik a mindenkori

vércukorszintet és szekréciós granulumaikban felhalmozott, kristályos inzulinból éppen

annyit juttatnak a keringésbe, amennyit a homeosztázis fenntartása optimálisan igényel

(Lowell és Shulman 2005). A hirtelen fellépő szövődmények közül a hyperglycaemiás

coma többnyire a még kezeletlen 1-es típusú cukorbetegeknél kialakuló súlyos,

életveszélyes állapot. A hypoglycaemiás coma jellemzően az inzulin relatív

túladagolása miatt alakul ki, aminek következtében a vércukorszint túlzottan leesik. Az

idült szövődmények között szerepelnek a microangiopathia, a macroangiopathia és a

neuropathia (Halmos és Jermendy 2002). A microangiopathiás szövődmények

jellegzetes diabetes-specifikus eltérések és a kiserek (pl. vese, retina, agyi kiserek)

károsodását jelentik, ami veselégtelenséghez, vaksághoz, agyi infarktushoz vezethet. A

10

macroangiopathiás szövődmények lényegében atherosclerosist jelentenek, melynek

patomorfológiai értelemben véve nem megkülönböztethetőek az egészséges szénhidrát

anyagcseréjű egyének atherosclerosisától, és hasonlóan a nagy artériák (pl.

szívkoszorúér, végtagok erei) károsodása, mely a szövetek vérellátási zavarát okozva

szívinfarktust, alsó végtagi fekélyeket okozhat. A neuropathia egyrészt az érző és

mozgató gerincvelői idegek bántalma miatt, főleg a lábszárakon kialakuló

érzészavarokban (csökkent hő és fájdalomérzés, bizsergés, égő fájdalomérzet), reflex

kiesésekben és izomgyengeségben mutatkozik meg. Másrészt a vegetatív idegek

érintettsége miatt szívritmus problémák, nyelőcső és gyomor mozgászavarok, vizelet és

székletürítési gondok, férfiaknál merevedési zavarok alakulhatnak ki. Az ér és

idegkárosodások együtt vezetnek a hosszabb ideje cukorbetegek jellegzetes

szövődményéhez, a lábujjak, a láb és lábszár fekélyeihez. Ezekhez az elváltozásokhoz

gyakran társulnak gombás és bakteriális fertőzések, melyek súlyos szeptikus állapothoz,

majd halálhoz vezethetnek.

1.2. Kuratív terápiás lehetőségek diabetes mellitusban

Az utóbbi évtizedekben az élethosszig tartó kezelés eszközei és

gyógyszerei sokat fejlődtek ugyan, de a cukorbetegség életminőségre gyakorolt

negatív hatásai és a fenyegető hosszú távú szövődmények miatt, mégis indokoltak

azok az erőfeszítések, amelyek új – lehetőleg végleges gyógyulást jelentő –

kezelés(ek) kidolgozására irányulnak.

Hasnyálmirigy- vagy sziget-transzplantáció

Még mielőtt Banting és Best 1921-ben felfedezte volna az inzulint, már

ismert tény volt, hogy a hasnyálmirigyből kivonható egy anyag, mely képes

enyhíteni a diabetest. Ebből kiindulva hajtották végre az első hasnyálmirigy-

transzplantációt. Bristolban, 1894-ben Watson Williams egy bárány

hasnyálmirigyének darabját ültette egy ketoacidózisban szenvedő, 15 éves

cukorbeteg fiú bőre alá. Akkoriban még nem sokat tudtak arról a kilökődési

11

reakcióról, ami hamarosan bekövetkezett és természetesen immunszuppressziót

sem állt módjukban alkalmazni.

Azóta a transzplantációs lehetőségek rengeteget fejlődtek és több

változatuk kínálkozik (Merani és Shapiro 2006). Néhány cukorbeteg számára a

végleges gyógyulást jelenti egy egészséges hasnyálmirigy átültetése. A lehetséges

halott donorok száma azonban rendkívül korlátozott, a műtéti beavatkozás nehéz

és kockázatos, ráadásul a transzplantált betegek egész további életükben erős

immunszuppresszív kezelésre szorulnak. A teljes hasnyálmirigy transzplantációját

ezért az amúgy is vese-transzplantációra szoruló betegeknél, azzal együtt szokták

végrehajtani (Lipshutz és Wilkinson 2007). Csaknem 30 éve folynak

próbálkozások csak az endocrin területek átültetésére (Liu és Herold 2000), az

ezredfordulóig azonban megoldhatatlannak látszó technikai nehézségek

akadályozták az előrelépést. Végül 2000-ben Shapiro és mtsai (Shapiro és mtsai

2000) egy forradalmian új eljárással álltak elő. Az általuk kidolgozott ún.

„Edmonton protokoll”, amelynek során 3-4 halott humán donorból izolált

hasnyálmirigy szigeteket juttatnak be intravénásan egy-egy betegbe, kiküszöböli

ugyan a technikai nehézségeket, de nem változtat a donorhiányon és a kezelést

követő folyamatos immunszuppresszió szükségességén (Nanji és Shapiro 2004 ).

Az immunszuppresszió még akkor is jelentős kockázatokkal jár, ha sikerült

glucocorticoid-mentesen megoldaniuk. Ráadásul, a követéses tanulmányok azt

mutatják, hogy a szigetek a betegek többségénél néhány év elteltével már nem

működnek tovább, illetve felszívódnak (Ryan és mtsai 2005). A donorhiány miatt

újszülött malacból izolált szigetsejtekkel is folynak kísérletek, de az ilyen xeno-

transzplantáció humán terápiás eljárásokban történő alkalmazása még az előzőnél

is több nehézséget rejt magában, főleg a kilökődési reakció miatt (Rayat és mtsai

1999).

Összefoglalva elmondhatjuk tehát, hogy ezek a terápiás eljárások csak

nagyon kevés beteg számára jelentenek valódi alternatívát.

12

A diabetes mellitus őssejtterápiájának lehetőségei

A fentiekből következik, hogy sokan reménykedve figyelik az utóbbi

években robbanásszerűen fejlődő őssejtbiológia eredményeit. Betegek, klinikusok

és kutatók bíznak abban, hogy hamarosan képesek leszünk őssejtekből terápiás

célra alkalmas mennyiségű, inzulint termelő, és azt a vér glükóz

koncentrációjának függvényében a keringésbe juttató - azaz a mindenkori

vércukorszintnek megfelelően, szabályozottan működő - β-sejtet előállítani (Jones

és mtsai 2008). Mindezt lehetőleg olyan „saját” (autológ) őssejtekből, amelyek a

betegekben nem váltanak ki immunválaszt és nem hoznak létre tumort,

ugyanakkor akár évtizedekig élet- és működőképesek maradnak a szervezetben.

A következőkben azt szeretnénk bemutatni, hogy hol tartanak ma a

diabetes őssejtterápiáját célzó alap- és preklinikai kutatások. Kitérünk mind az

embrionális, mind a szöveti őssejtek β-sejt irányú differenciáltatásának és a

különböző ős- és/vagy β-sejt-transzplantációs protokollok kidolgozásának

eredményeire. A kutatások több irányban párhuzamosan folynak, hiszen ma még

senki sem tudja megmondani, melyik területen várható az igazi áttörés.

ββββ-sejtek embrionális őssejtekből?

Az embrionális őssejtek (embryonic stem cell = ESC, vagy ES sejtek), illetve

a belőlük kifejlesztett, gyakorlatilag korlátlan élettartamú sejtvonalak a hólyagcsíra

(blastocysta) állapotú embriók belső sejtcsomójából (inner cell mass = ICM)

származnak. Az ún. terápiás klónozás révén elméletileg olyan humán ICM sejtek is

nyerhetőek lennének, melyek immunológiai szempontból identikusak a beteg

szervezetének többi sejtjével, tehát autológ transzplantációt is lehetővé tehetnének. Az

ESC-k pluripotensek, vagyis mindhárom csíralemez irányába képesek differenciálódni,

így a szervezet minden érett sejttípusa, szövete és szerve kialakulhat belőlük (Gerecht-

Nir és Itskovitz-Eldor 2004). Elvben tehát ideális kiindulási anyagot jelentenek nagy

mennyiségű β-sejt előállításához (1. ábra).

13

1. ábra. β-sejtek előállítása embrionális őssejtekből sejttenyészetben

Meg kell említeni, hogy az emberi embriók felhasználásával kapcsolatban

súlyos etikai problémák merültek fel. A legszélsőségesebbektől eltekintve a

véleményezők alapvetően két táborra oszlanak. Sokak szerint semmi esetre sem

megengedhető az, hogy emberi embriókat pusztítsanak el kutatási célból, mert azok

mindegyike egy-egy emberi élet lehetőségét rejti magában, és ezáltal személyiségi

jogok illetik meg. Az ellentábor viszont arra hivatkozik, hogy csupán a mesterséges

megtermékenyítés céljára létrehozott, de aztán felhasználásra nem került, úgymond

felesleges embriókat használnák fel. Az amúgy is kidobásra ítélt sejtek védelmében

pedig nem indokolt beteg emberektől elvenni a gyógyulás reményét (Hug 2004). A két

vélemény ütköztetéséből az a félmegoldás született, pl. az Amerikai Egyesült

Államokban, hogy lehetővé teszik a már meglévő sejtvonalakon folyó kutatásokat, de

újabb embriók felhasználására a kormány nem nyújt támogatást az adófizetők pénzéből.

Magyarországon még nem született az embrionális őssejt vonalak létrehozására vagy

felhasználására vonatkozó törvény.

Valójában azonban, ha ezeket a súlyos etikai aggályokat félre is tesszük, sok

technikai probléma vár még megoldásra az ES sejtekkel kapcsolatban. Egyelőre még

Allogénββββ-sejtek

Autológββββ-sejtek

Blastocysta

Blastocysta

A betegtesti sejtje

SejtmagEnukleáltpetesejt

Sejtmagátültetés

Belsősejtmassza

Autológtranszplan-

táció

Allogéntranszplan-

tációES

sejtek

Differenciáltatás

ES sejtvonalelőállítása

Terápiás klónozás

14

nincs olyan hatékony protokoll, mely 100%-ban végdifferenciált sejteket lenne képes

létrehozni, ebből adódóan egy esetleges terápia során fennáll az ES sejtek ismert

tumorogenitásának veszélye. Kísérleti adatok szerint, ha a graftnak akár csak minden

egymilliomodik sejtje ES sejt marad, már szinte biztosan teratoma alakul ki a befogadó

szervezetben (Deb és Sarda 2008). A jelenleg alkalmazott tenyésztési módszerek

többségénél fenyeget az állati eredetű immunogénekkel és/vagy patogénekkel történő

szennyeződés lehetősége. A terápiás klónozás esetét kivéve számolnunk kell a szöveti

összeférhetetlenség következményeként előálló kilökődési reakcióval is (Gruen és

Grabel 2006).

Inzulin-termelő sejteket ugyan számos munkacsoportnak sikerült már

egér (Lumelsky és mtsai 2001, Hori és mtsai 2002, Kania és msai 2003, Kahan és

mtsai 2003), sőt emberi ES sejtekből is (Assady és mtsai 2001, Segev és mtsai

2004) előállítania in vitro kultúrában, az eredmények nem igazán meggyőzőek. A

legelső próbálkozások alapja a spontán differenciálódásnak induló, „multilineage”

ES sejtek közül a pancreatikus progenitorok kiválogatása és támogatása volt

(Lumelsky és mtsai 2001). A Lumelsky protokoll néven emlegetett eljárás

azonban zsákutcának bizonyult, ugyanis az általuk alkalmazott - nestin+ sejtekre

történő - válogatás nemcsak a pancreatikus, de a neuronális progenitoroknak is

kedvez. Ismert, hogy a neuronális és a pancreatikus differenciációt ugyanazok a

transzkripciós faktorok irányítják, de a kezdetben közös markerek csak a

szigetfejlődés köztes stádiumában vannak jelen, az érett szigeteket már nem

jellemzik. A vegyes tenyészet sejtjei nem válogathatóak szét és köztük csak kis

mennyiségű inzulin pozitív sejt található. Az inzulin-termelő sejtekben sincsenek

inzulin-szekréciós granulumok, a szekréció emiatt nem kontrollált, és csekély

mértékű. Néhány esetben még az is felmerült, hogy a kezdeti próbálkozásokkal

létrehozott ún. „β-sejtek” nem is differenciálódtak a megfelelő irányba, csupán

abszorbeálták az inzulint a tenyésztőfolyadékból (Rajagopal és mtsai 2003). Ezért

mindig igazolni kell, hogy a sejtek citoplazmájában inzulin specifikus mRNS,

inzulin tartalmú vezikulák és C-peptid (emberi sejtek esetén) vannak.

A további, azóta is folyó differenciáltatási próbálkozások célja az

embrionális ill. magzati történések mind pontosabb lejátszása. Ennek érdekében

elengedhetetlen a pancreas organogenezisének mind alaposabb felderítése,

15

melynek részleteit napjainkban is kutatják (Zaret 2008). Egyes kutatócsoportok

csak egy vagy néhány növekedési faktort, morfogént vagy extracelluláris mátrix

komponest alkalmaztak, így pl. Kubo és csoportja aktivint (Kubo és mtsai 2004),

Shi és csoportja aktivint és retinsavat (Shi és mtsai 2005), mások viszont

igyekeztek az embrionális fejlődés mind több ismert történését lépésről lépésre

reprodukálni (D'Amour és mtsai 2006). Egy másik megközelítést képviselnek azok

a kísérletek, melyekben a β-sejtek fejlődésében kulcsszerepet játszó transzkripciós

faktor(ok) – például a pancreatikus és duodenális homeobox 1 (Pdx-1) és/vagy a

paired box 4 (Pax4) - kifejeződését fokozták az őssejtekben (transzfekcióval vagy

más módon) (Blyszczuk és mtsai 2003, Miyazaki és mtsai 2003). Megint más

oldalról keresik a megoldást Kroon és mtsi, akik a humán ES sejttenyészeteket 4-6

hetes foetális pancreas szövetnek megfelelő sejtekké differenciáltatták, majd

cukorbeteg egerekbe implantálták. A speciális implantátumban a pancreatikus

endoderma irányába már elkötelezett sejtek fejlődése befejeződött, érett

szigetsejtekké alakulva képesek voltak fenntartani az állatok glükóz

homeosztázisát (Kroon és mtsai 2008)

Az ES sejtek β-sejt irányú in vitro differenciáltatásának egyik fő

problémája az, hogy a végeredmény mindig egy kevert sejtpopuláció, amin belül

kisebbségben vannak az inzulin-termelő sejtek. Ráadásul az egy sejtre eső

inzulintartalom ezekben a sejtekben is alacsonyabb, mint a Langerhans-szigetek β-

sejteiben és az inzulin-szekréció szabályozása sem teljesen egyezik a fiziológiás

szabályozással (Sipione és mtsai 2004). További komoly gondot jelent, hogy a

nem kellően differenciálódott, embrionális jellegű sejteket is tartalmazó

készítmények terápiás célra nem alkalmasak a teratóma képződés kockázata miatt.

A jelenlegi, már igen körültekintő módszerekkel „β-sejt irányba differenciáltatott”

ES sejteket cukorbeteg egerekbe oltva, vagy graftként beültetve megszüntethető

ugyan a hyperglycaemia, de az állatokban teratoma alakulhat ki, aminek

következtében hamarosan elpusztulnak. A teratoma képződés kockázatát tehát

feltétlenül ki kell zárni mielőtt az ES sejtek, illetve bármilyen belőlük

differenciáltatott sejt, orvosi alkalmazása komolyan szóba kerülhetne.

A klinikumban további, elsősorban immunológiai problémákkal is

számolni kell. Az állatkísérletek során megoldható, hogy a cukorbeteg és az ESC

16

donor egyed azonos genotípusú (szingén) legyen. Ilyenkor a recipiens állat

immunrendszere az adott ES sejt minden beültett utódsejtjét, legyen az bármilyen

irányba differenciálódott leánysejt, „sajátként” ismeri fel és befogadja. A betegek

esetében erre gyakorlatilag nincs esély. Így a transzplantáció után a recipiens

immunrendszere a számára „idegen” (allogén) ES sejtek utódsejtjeit is idegenként

fogja azonosítani és heves kilökődési reakcióval igyekszik majd megszabadulni

tőlük. A transzplantált beteg tehát, más szervtranszplantált betegekhez hasonlóan,

egész további életében drága és az életminőségét jelentősen rontó

immunszuppresszív kezelésre szorul majd. Ezt egyetlen módon, a jelenleg még

gyermekcipőben járó terápiás klónozással lehetne megelőzni. A terápiás klónozás

lényege, hogy a rendelkezésre álló – bármilyen genotípusú egyénből származó –

ES sejt magját eltávolítják és helyére a kezelendő beteg egy szomatikus sejtjének

magját ültetik (1. ábra). A kapott ES sejt és utódsejtjei ezután már a beteg örökítő

anyagát hordozzák és így csak az abban kódolt fehérjéket tudják előállítani.

Vagyis a klónozott sejt(ek) a beteg immunrendszere számára többé nem lesznek

idegenek. Hozzá kell tennünk, hogy terápiás klónozást emberi sejtekkel eddig még

nem sikerült véghezvinni. Ezen a téren, humán sejtekkel elért sikereiről beszámoló

munkacsoport eredményeit nem sokkal később visszavonta (Hwang és mtsai

2005). Arról sem feledkezhetünk meg, hogy az 1-es típusú diabetes mellitus

súlyos autoimmun betegség. Még ha elő is lehetne állítani szingén β-sejteket, az

ilyen betegek citotoxikus – T, NK, és NKT – sejtjei azokat éppúgy elpusztítanák a

beültetés után, mint ahogy azt az eredetiekkel tették. A 1-es típusú

cukorbetegségben szenvedő betegek tehát az inzulintermelő sejtek egyszeri

pótlásával – hacsak az autoimmun folyamatot nem sikerül közben megfékezni –

semmiképpen sem gyógyíthatók meg.

17

ββββ-sejtek felnőtt szövetek sejtjeiből, prekurzorokból, szöveti őssejtekből?

A szöveti (felnőttkori) őssejtek terápiás felhasználásának az ES sejtekkel

összehasonlítva számos előnye van. Elvben bármely betegből nyerhető, azaz nincs

szükség választott donorra. Ráadásul az autológ – a beteg saját őssejtjeivel végzett

- transzplantáció során kizárható a különböző fertőző betegségek átvitelének

lehetősége, nincsenek immunológiai komplikációk (kilökődés vagy graft versus

host betegség) és nem merülnek fel olyan etikai aggályok sem, mint az ESC-k

esetében. Így rendkívül ígéretesek azok a próbálkozások, amelyek a diabetes

csontvelő-transzplantációval történő gyógyítására irányulnak.

β-sejtek β-sejtekből, vagy prekurzoraikból

Számos próbálkozás történt maguknak a β-sejteknek in vitro

felszaporítására is beültetés céljából. Az emberi β-sejtek kultúrában megfigyelt

replikációs képessége azonban jóval kisebb, mint a rágcsálóké (Choi és mtsai

2004). Néhány munkacsoportnak sikerült szövetkultúrában tartott Langerhans-

szigetekből olyan dedifferenciálódott, osztódóképes sejteket előállítania,

amelyekben kifejeződik néhány mesenchymalis marker (nestin, vimentin) és már

nem termelnek sziget hormonokat. Ezek a sejtek többször átolthatók in vitro,

redifferenciáltatásuk β-sejtekké viszont máig megoldatlan. A bennük kifejeződő

inzulin specifikus mRNS mennyisége „redifferenciáltatás” után is legfeljebb

0,01%-a a normális β-sejtekének (Bonner-Weir és Sharma 2002, Gao és mtsai

2003). Az ún. hasnyálmirigy-őssejtek leírása óta pedig sokan abban is

kételkednek, hogy valóban β-sejtek dedifferenciálódása útján keletkeztek.

Multipotens, klonogén ős- és/vagy elődsejteket különböző módszerekkel sikerült

izolálni a hasnyálmirigyből (Dor és Melton 2008). Suzuki és mtsai (Suzuki és

mtsai 2004) áramlási cytometria segítségével azonosítottak egy rendkívül kicsi, c-

Met (a hepatocyta növekedési faktor (HGF) receptora) pozitív, de különböző

vérsejtfejlődési sorokra és endothel sejtekre jellemző markerekre negatív

sejtpopulációt az egér pancreasban. Az ezekből a sejtekből in vitro formálódott

kolóniák a sziget-, acinus- és ductus-sejtekre, valamint hepatocytákra és

18

gastrointestinalis sejtekre jellemző géneket expresszáltak. A belőlük

differenciálódó sejtek inzulin-termelő képességét azonban nem vizsgálták.

Seaberg és mtsai (Seaberg és mtsai 2004) - szintén egér hasnyálmirigy szigetekből

és a ductusokból – in vitro kolóniaképző képességük alapján izoláltak egy olyan

sejtpopulációt, amelynek tagjai a Langerhans-szigetekre és idegsejtekre jellemző

markereket hordoztak. Az egyes kolóniák differenciálódása során különböző

típusú ideg és gliasejtek, valamint hasnyálmirigy β-, α- és δ-sejtek keletkeztek. A

β-sejtek a környezet glükóz-koncentrációjától függő mennyiségű inzulint

szekretáltak. További előrelépést jelent ezen a területen, hogy emberi foetalis

pancreasból sikerült nagy mennyiségű multidrog-rezisztencia fehérjét expresszáló,

ún. SP (side population) sejteket izolálni, amelyek 2-3%-a kolóniaképzőnek

bizonyult, többször átoltható volt, és β-sejt irányba is képes volt differenciálódni

(Zhang és mtsai 2005). Természetesen az ilyen hasnyálmirigy őssejtek – ha

léteznek és egyszer megfelelő mennyiségben szaporíthatók, majd

differenciáltathatók lesznek is in vitro kultúrában – akkor sem nyerhetők majd

magából a betegből. Vagyis kizárólag allogén graftként, immunszuppresszió alatt

álló cukorbetegek transzplantációjára lesznek alkalmasak.

Nyilvánvaló, hogy a pancreas in vivo is rendelkezik bizonyos regenerációs

képességgel. Ismert tény, hogy a kifejlődött szervezetben fiziológiásan is változik a β-

sejtek száma. Növekvő, illetve csökkenő β-sejt tömeg kíséri a változó metabolikus

igényeket (Bonner-Weir 2000). Így például terhesség alatt, vagy elhízott de nem

cukorbeteg egyénekben megnövekedett sejtmennyiséget találunk, míg a

szénhidrátszegény diétával elért testsúlycsökkentéssel a sejtek száma is csökken. A 2-es

típusú diabetesben szenvedő betegekben jelentősen - átlagosan 50 %-al - csökken a β-

sejtek mennyisége (Butler és mtsai 2003), ami gyógyszeresen (pl. thiazolidinedionokkal

(TZD), javítható (Wajchenberg 2007). A veleszületetten autoimmun diabetesre

hajlamos egértörzs (non-obese diabetic mice = NOD egerek) egyedeinek 1-es típusú

diabetese meggyógyul, ha a β-sejteket pusztító autoimmun folyamatot sikerül

megállítani (Sherry 2006). Méreggel vagy direkt sebészeti úton történő pancreas-írtást

követő regenerációt is sikerült indukálni kísérleti állatokon (Bouwens 2006, Pasquali

2006). Az azonban nem világos, hogy az elpusztult β-sejtek regenerációja egyszerűen a

19

meglévő β-sejtek osztódásával (Dor 2006), vagy valódi neogenezissel, azaz ős- és/vagy

elődsejtek osztódásával és differenciálódásával történik (Bonner-Weir és Sharma

2002). Esetleg - az életkorral változó arányban - de mindkettő szerepet játszik az új β-

sejtek születésében (Bonner-Weir 2000, Gao és mtsai 2003). A méhen kívüli élet korai

időszakából vannak bizonyítékaink arra vonatkozólag, hogy maguk a β-sejtek is

rendelkezhetnek jelentős proliferatív képességekkel (Georgia és Bhushan 2004), ami

idővel valószínűleg visszaszorul, és ekkor kerülhetnek előtérbe az esetleges

progenitorok. De a szóba jöhető ős- és/vagy elődsejtek eredete és lokalizációja –

pancreason belüli (Hao 2006), vagy azon kívüli (esetleg csontvelői – ld.később) –

egyelőre tisztázatlan. Mindenesetre a diabetes őssejtterápiájának legkíméletesebb

módja valószínűleg az lenne, ha az endogén regenerációs folyamatot sikerülne

felerősíteni, és egyáltalán nem lenne szükség transzplantációra (Halban 2004). Ennek

első lépéseként értékelhetjük az exendin-4 sikeres bevezetését a 2-es típusú diabeteses

betegek kezelésében (Holst 2004). Az exendin-4 a GLP-1-hez hasonlóan működik. A

GLP-1 (glucagon-like peptide-1) az incretinek közé tartozik, melyek a béltraktus által,

táplálékfelvétel hatására termelődő peptidek. Az incretinek sokrétűen támogatják a

glükóz homeosztázist. Az exendin-4 GLP-1 receptor agonista, vagyis képes a GLP-1-

nek - G-protein kapcsolt - receptorát aktiválni. Ezáltal lassítja a gyomor ürülését,

gátolja a glükagon szekrécióját, és ami a diabetes kezelésében a legfontosabb: növeli a

β-sejtek glükóz érzékenységét, fokozza inzulin-szekréciójukat és sejtvédő,

antiapoptotikus valamint proliferatív hatással van rájuk. Az exendin-4 egy - kezdetben

csak a mexikói viperagyík (Heloderma suspectum) mérgező nyálából kivonható - anyag

szintetikus változata. Alkalmazásával jelentősen lassítható a 2-es típusú diabetes

progressziója.

β-sejtek májsejtekből

Egyes májsejtek transdifferenciáció révén szintén inzulin-termelő

sejtekké alakulhatnak. Cukorbeteg egereket pancreatikus és duodenális homeobox

1 (Pdx-1) gént tartalmazó adenovírussal fertőzve, az állatok májában Pdx-1 és

inzulin expressziót lehetett kimutatni, miközben megszűnt az STZ-indukálta

hyperglycaemia (Ferber és mtsai 2000). Emberi foetalis májsejteket szintén Pdx-1-

20

el, valamint telomeráz enzim génjével együttesen transzfektálva olyan

folyamatosan növekedő sejtvonalakat kaptak, amelyek nagy mennyiségben

termeltek és tároltak inzulint, immundeficiens, cukorbeteg egerekbe ültetve pedig,

megszüntették a diabetest (Zalzman és mtsai 2003). Ezzel a módszerrel tehát

elvileg egyetlen májból, sőt akár a beteg egyetlen májlebenyéből is igen nagy

mennyiségű szingén inzulin-termelő sejtet lehetne előállítani. A telomeráz enzimet

folyamatosan expresszáló sejtek azonban a normál sejteknél jóval könnyebben

transzformálódhatnak, azaz a tumorkeletkezés veszélye az ilyen sejtekkel kezelt

betegekben igen nagy lenne. Az sem világos, hogy milyen típusú májsejt alakulhat

inzulin-termelő sejtté. A legvalószínűbb, hogy erre csak az ún. ovális sejtek

képesek (Yang és mtsai 2002).

β-sejtek csontvelői őssejtekből

A csontvelő egy igen összetett, számos különböző felnőtt kori őssejtet

tartalmazó szövet. A folyamatos vérképzést biztosító haematopoeticus őssejtek

(hematopoetic stem cell = HSC) mellett mesenchymalis őssejteket (mesenchymal

stem/stromal cell = MSC) (részletesen ld. 26.o.), angioblastokat és ún.

haemangioblastokat is tartalmaz. A haemangioblastok a HSC-k, angioblastok és

valószínűsíthető, hogy egyes símaizom sejtek közös őssejtjei (Herzog és mtsai

2003). Többen feltételezik azonban, hogy mindez csak a jéghegy csúcsa és a

csontvelőben egy még fiatalabb, pluripotens – lényegében az ESC-khez hasonló –

az egyedfejlődés embrionális szakaszából „megmaradt” őssejtpopuláció is

található. Ezt a MAPC–nak (multipotent adult progenitor cell) elnevezett

csontvelői sejttípust eddig csak egyetlen csoportnak (Verfaillie 2002) sikerült

izolálni, pedig ha létezése többek által is igazolást nyerne, pluripotenciája miatt,

joggal kerülhetne a regeneratív orvoslás kutatásainak középpontjába. A MAPC

még mindhárom csíralemez irányába történő teljes differenciálódási képességét

megőrizte, így nem csak a mesenchymális őssejtek, de endodermális és

ectodermális őssejtek is differenciálódhatnak belőlük (2.ábra).

21

2. ábra. Csontvelői őssejttípusok

Az ábra Verfaillie (Verfaillie 2002) csoportjának elképzelése szerinti leszármazást

mutatják. A sejtek neve alatt jellemző markereiket soroltuk fel.

Nemrégiben egy másmilyen fenotípusú, de ugyancsak primitív,

embrionális jellegű sejttípust is azonosítottak a csontvelőben és számos más

szervből is izolálták. Ezeket a relatíve kicsiny méretű sejteket Ratajczak és mts.-i

írták le és nevezték el VSEL sejteknek (very small embryonic-like cells)

(Ratajczak és mtsai 2008). Sorolhatnánk még azokat az embrionális jellegűnek

talált sejteket, melyeket különböző szervekből csak egy-egy kutatócsoport tudott

izolálni, de másoknak - a körülmények pontos betartásával - sem sikerült

eredményeiket reprodukálni (Quesenberry és mtsai 2005). A nehézségek ellenére

nyilvánvalónak tűnik, hogy testszerte találhatóak a felnőtt szervezetben

pluripotens sejtek, de mivel a szöveti őssejteket igen nehézkes, sok esetben

lehetetlen sejtfelszíni markereik alapján beazonosítani, az adott szövet sejtjei

között, sokszor „megfoghatatlanok” maradnak. Izolálásuk nem egyszerű feladat.

22

Az őssejtek terápiás hatásaival kapcsolatosan is sok a bizonytalanság. A

diabetes kezelésére beadott csontvelői sejtek hatását vizsgáló eddigi állatkísérletek

rendkívül nehezen értékelhetők. A különböző munkacsoportok lényegében csak

abban értenek egyet, hogy az egerekben és patkányokban – általában

streptozotocin (STZ) segítségével előidézett (Banerjee és mtsai 2005), vagy az

adott beltenyésztett törzsben (például a NOD egerekben)(Lee és mtsai 2006)

öröklődő - diabetes csontvelői sejtek beadásával legalábbis időlegesen, de néha

véglegesen is gyógyítható. Banerjeenek és munkatársainak 3 egymást követő

csontvelő-transzplantációval sikerült javítaniuk az STZ-indukált diabetesen, míg

Lee csoportja nagyszámú MSC-vel ért el kedvező hatást NOD egereknél. A

gyógyulás vagy átmeneti javulás okát, a csontvelői sejtek kedvező hatásának

mechanizmusát illetően azonban már erősen megoszlanak a vélemények.

Ianus és mtsai (Ianus és mtsai 2003) szerint például egyes csontvelői

eredetű őssejtek a hasnyálmirigyben inzulin-termelő β-sejtekké

transzdifferenciálódnak (3.A ábra). Egy ilyen átalakulás azért is rendkívül érdekes

lenne, mert nem tartaná tiszteletben a csíralemezek közötti, sokáig

átjárhatatlannak hitt határokat. Erre csak egy valóban embrionális jellegű,

pluripotens sejt lenne képes. Ianus csoportja csontvelőhalált okozó dózisú

(myeloablatív) besugárzással kezelt egészséges nőstény egereket oltott GFP (green

fluorescecent protein = zöld fluoreszcens fehérje) transzgenikus hím állatokból

származó csontvelővel. A transzplantáció után 4-6 héttel a recipiens állatok

hasnyálmirigyének Langerhas-szigeteiben a sejtek 1,7-3%-a volt zölden

fluoreszkáló, Y kromoszómát hordozó és inzulint tartalmazó, azaz a donor

csontvelőből származó β-sejt. További technikai finomításokkal azt is igazolták,

hogy ezek a sejtek nem a donor eredetű csontvelői sejtek és a recipiens β-

sejtjeinek fúziójával jöttek létre, tehát egyértelműen transzdifferenciálódás történt.

Mindez véleményük szerint arra is igazolásul szolgálhat, hogy a csontvelő a nem

cukorbeteg állatokban, fiziológiás körülmények között is β-sejt forrásként

működik. A csontvelőből kis számban, de folyamatosan kilépő, keringő őssejtek

megtapadnak a hasnyálmirigyben és β-sejtekké alakulnak, amikor arra szükség

van a normális mértékű sejtpusztulás, vagy a megnövekedő metabolikus igények

miatt. Sajnos másoknak, hasonló kísérleti feltételek mellett, ezeket az

23

eredményeket nem sikerült megerősíteni (Choi és mtsai 2003, Lechner és mtsai

2004). A transzplantált állatok hasnyálmirigyében GFP+Y+inzulin+ sejteket még

STZ kezelés és részleges pancreas-írtás után sem találtak. Előfordultak ugyan

GFP+ sejtek a Langerhans-szigetekben, ezek azonban kivétel nélkül CD45-öt (egy

a leukocyta sejtfejlődési sorra jellemző markert), vagy von Willebrand faktort

(endothel markert) is kifejeztek. Semmiképpen sem lehettek tehát β-sejtek, csak

leukocyták és endothel sejtek.

Az utóbbi megfigyelések inkább Hess és mtsainak (Hess és mtsai 2003)

az eredményeivel vannak összhangban (3.B ábra). Ez a kanadai munkacsoport

immunhiányos egerekben STZ kezeléssel indukált diabetest, majd - szubletális

(nem myeloablatív) besugárzás után – GFP-transzgénikus donor állatokból

származó csontvelői sejtekkel, vagy azok c-kit+ frakciójával oltotta a beteg

állatokat. A c-kit (másik neve: CD117) egy citokinnek, a stem cell factornak

(SCF) a receptora, mely többek között a haematopoeticus őssejtek markere. A

következő négy hétben mind a teljes csontvelővel, mind a szeparált c-kit+

csontvelői sejtekkel transzplantált egerekben jelentősen csökkent a vércukorszint.

Az állatok hasnyálmirigyének össztömege és inzulin termelése növekedett, a

Langerhans-szigetekben az endogén (recipiens eredetű) β-sejtek osztódása

fokozódott. A kevés (2,5%) GFP+inzulin+ sejtben Pdx-1 specifikus mRNS-t nem

találtak, ezek a sejtek tehát valószínűleg a környezetükből vettek fel némi inzulint.

(Számuk is túl alacsony ahhoz, hogy megmagyarázza a vércukorszint

csökkenését). Ugyanakkor a hasnyálmirigy területére bejutott – jelentős számú –

donor eredetű GFP pozitív sejt 9,2%-a PECAM-1-et (platelet endothelial cell

adhesion molecule = vérlemezke-endothel sejt adhéziós molekula) fejezett ki, ami

az érfalat alkotó endothel sejtek jellemző markere. A szerzők feltételezik, hogy

ezek a donor eredetű, PECAM-1+ endothel sejtek bizonyos faktorok segítségével -

és nem elsősorban a keringés közvetlen javításával - fejtik ki hatásukat, azaz

fokozzák a recipiens saját β-sejtjeinek osztódását, vagyis a pancreas

regenerálódását. Ez azért sem meglepő, hiszen az endothel sejtek, illetve az

ezekből érkező paracrin jelzések meghatározó szerepe az endocrin pancreas

fejlődésében jól ismert az egyedfejlődés során (Lammert és mtsai 2003)

24

A harmadik lehetőség (3.C ábra), hogy csontvelő-transzplantáció után, az

eddig közelebbről nem meghatározott típusú, donor eredetű sejtek, a csontvelőbe

történt homingjukat követően, ismeretlen faktor(oka)t termelnek, amely(ek) a

keringéssel eljutnak a hasnyálmirigybe és ott biztosítják az endogén β-sejtek, vagy

azok prekurzorainak osztódását és a Langerhans-szigetek regenerációját (Li és

mtsai 2003). Ez a modell azokhoz az új megfigyelésekhez kapcsolható, amelyek

szerint egy adott szövet öregedő vagy sérült, endogén őssejtjeinek aktivitása és az

érintett szövet illetve szerv regenerációja fokozható, ha ezek az öregedő őssejtek

fiatal szöveti őssejtekkel, illetve azok mikrokörnyezetével kerülnek kapcsolatba

(Conboy és mtsai 2005). Vizsgálták azt is, hogy ezek az esetleges ismeretlen

faktorok közelebbről milyen természetű jelátviteli molekulák lehetnek. Például az

egyik valószínűsíthető ilyen anyag a hepatocyta növekedési faktor (hepatocyta

grow factor = HGF), amely ismert mitogén faktor (Izumida és mtsai 2005).

Minden esetre a hasnyálmirigy, illetve a β-sejtek csontvelő átültetés utáni

regenerációjában e szerint az elképzelés szerint is csak közvetett szerepet

játszanak a donor eredetű csontvelői őssejtek.

Ianus et al.J Clin Invest

2003,111:843.

Hess et al.Nat Biotechnol2003,21:763.

Li et al.Proc Natl Acad Sci USA

2003,100:12935.

BM sejtek ���� ββββ-sejtek ?

Transzdifferen-ciálódás

Új kapillárisokképződése ?

BM sejtek ���� endothelsejtek,endogén őssejtek

C-kit+ BMsejtek

TeljesBM

TeljesBM

A B C

3. ábra. A diabetes mellitus kezelése csontvelő transzplantációval: a jelzett munkacsoportok által feltételezett mechanizmusok (Magyarázat a következő oldalon)

25

3. ábra. A diabetes mellitus kezelése csontvelő transzplantációval: a jelzett

munkacsoportok által feltételezett mechanizmusok

(A villám jele az állatok felett a transzplantációt megelőző egésztest besugárzást jelképezi. Az

injekció a farokvénába juttatott sejteket mutatja)

A: A donor eredetű csontvelői őssejtek a hasnyálmirigyben inzulin-termelő β-sejtekké

transzdifferenciálódnak

B: A donor eredetű, PECAM-1+ endothel sejtek a hasnyálmirigyben bizonyos faktorok

segítségével, esetleg a keringés javításával is elősegítik a pancreas regenerálódását.

C: Donor eredetű, közelebbről nem meghatározott csontvelői sejtek, ismeretlen

faktorok segítségével elősegítik a pancreas regenerálódását.

A fentiek alapján tehát, vagy valamely csontvelői, vagy egyéb - endogén

eredetű - szöveti őssejt vesz részt a cukorbeteg állatok hasnyálmirigyének

regenerációjában csontvelő-transzplantáció után. Így joggal merül fel a kérdés,

hogy van-e reális esély inzulin-termelő sejtek, netán egész Langerhans-szigetek

előállítására valamely - lehetőleg autológ – csontvelői őssejtből kiindulva in vitro

kultúrában? Ha igen, akkor ezek a sejttenyészetben felszaporított és

differenciáltatott őssejtek vagy Langerhans-szigetek terápiás célra is alkalmasak

lennének-e?

A csontvelői őssejtek közül az MSC-k azok, amelyek viszonylag könnyen

izolálhatók, in vitro kultúrában nagyon jól szaporodnak és rendkívül plasztikusak.

Nikotinamid és exendin-4 tartalmú, azaz a β-sejtek osztódását és differenciálódását

támogató anyagokat tartalmazó tápfolyadékban tenyésztve őket számos, a β-sejtek

fejlődése során nélkülözhetetlen gén (inzulin I, inzulin II, Glut2, glükóz-kináz, Pdx-1 és

Pax6) kifejeződése kimutatható. Az ilyen sejtek pár hét alatt sziget-szerű képletekbe

rendeződnek, inzulint termelnek és cukorbeteg egerekbe, vagy patkányokba oltva

csökkentik a hyperglykaemiát és javítják a glükóz toleranciát (Tang és mtsai 2004,

Chen és mtsai 2004, Oh és mtsai 2004). Hasonló eredményt – inzulin-termelést - lehet

elérni, ha adenovírus vektor segítségével néhány, az endocrin pancreas fejlődése során

nélkülözhetetlen transzkripciós faktort (FOXA2, HLXB9, IPF1) fejeztetnek ki emberi

mesenchymalis őssejtekben (Moriscot és mtsai 2005). Úgy tűnik tehát, hogy lehetséges

működőképes, azaz a környezet glükóztartalmának megfelelő mennyiségű inzulint

26

szekretáló sejteket kialakítani csontvelői eredetű MSC-kből. Más szerzők azonban arra

hívják fel a figyelmet, hogy a fenti tenyésztési feltételek mellett az őssejteknek csak kis

része differenciálódik és az érintett sejtek sem termelnek terápiás szempontból

elégséges inzulint (Jahr, Bretzel (2003). Tisztázásra vár az is, hogy az így előállított

inzulin-termelő sejtek beültetés után vajon meddig életképesek a szervezetben. Kérdés,

hogy transzplantációjukkal végleges gyógyulást, vagy csak átmeneti javulást lehetne-e

elérni a betegekben.

Természetesen arról sem szabad megfeledkeznünk, hogy mind a

csontvelő-transzplantációs, mind a differenciáltatott MSC-kkel végzett

kísérleteket jórészt STZ-vel indukált, tehát 1-es típusú (autoimmun) diabetes-szerű

betegségben szenvedő állatokon végezték. Ismert tény, hogy csontvelő-

transzplantációval számos különböző autoimmun betegség eredményesen

gyógyítható (Burt és mtsai 2002). Ugyanakkor az MSC-knek önmagukban is

figyelemreméltó immunszuppresszív hatása van. Vagyis ezekben a kísérletekben a

sejtek kettős - egyrészt a β-sejtek regenerációjára, másrészt az autoimmun

folyamat gátlására - gyakorolt hatásával kell számolnunk, ami klinikai

szempontból igazán kedvező. A csontvelői sejtekkel történő transzplantáció

azonban csak akkor válhat terápiás eljárássá a cukorbetegek számára, ha rendkívül

kíméletes, nem myeloablatív kondicionálás mellett végezhető, hiszen a korántsem

kockázatmentes myeloablatív előkezelés nagy részüket – koruk, általános

egészségi állapotuk, vagy egyéb betegségeik miatt – mindenképpen kizárná a

kezelésből.

1.3. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) különleges tulajdonságai

Az utóbbi időben a mesenchymális őssejtteknek számos olyan különleges

tulajdonsága került napvilágra, ami miatt a regeneratív orvoslás szinte valamennyi

területén felfigyeltek rájuk (Krampera és mtsai 2006).

Az MSC-k könnyen izolálhatóak

Elsőként Friedenstein és mtsai (Friedenstein és mtsai 1987) írták le őket, mint

a csontvelőben található, in vitro kultúrában a tenyésztőedény felületéhez tapadva

növekedő (azaz adherens), fibroblast-szerű morfológiát mutató kolóniaképző sejteket,

27

amiket CFU-F-nek ( = colony-forming unit fibroblast) neveztek el. Bőr alá oltva ezeket

a sejteket olyan speciális mikrokörnyezetet tudnak kialakítani, amely biztosítja a

vérképző ős- és elődsejtek fejlődéséhez szükséges minimális feltételeket. Szerepük a

csontvelőben tehát elsősorban a vérképző elemeket körülvevő stroma állomány

kialakítása.

Mivel őssejtspecifikus sejtfelszíni markereket igen nehéz találni, az

őssejtek izolálása mindig nehéz feladat. Az MSC-k műanyag felületekhez való

kitapadási hajlama („plasztik adherenciája”) nagyon leegyszerűsíti ezt, és már ez a

technikai könnyebbség is vonzóvá teszi a sejttípust az őssejtbiológusok számára.

A csontvelőből kitapasztott stroma sejteket, miután benőtték a rendelkezésükre

álló felületet, trypsin és EDTA segítségével felszedjük, majd megfelelő hígítás

után új tenyésztőedényekbe oltjuk őket. Többszöri átoltás után egy morfológiailag

többé-kevésbé homogénnek tűnő, exponenciálisan növekedő sejttenyészetet

kapunk, amit – ha már nem tartalmaz vérképző elemeket - mesenchymális

sejtkultúrának tekinthetünk. Mivel az ilyen tenyészetekben a sejtosztódással

egyidejűleg mindig történik spontán differenciálódás is, valójában egy heterogén,

mesenchymális őssejtekből és a belőlük képződött tri- bi- és unipotens elődsejtek

keverékéből álló sejtkultúráról van szó.

A plasztikus MSC tenyészetek sokáig fenntarthatóak

Az MSC-k sok millió utódsejtet képesek létrehozni in vitro. Megfelelő

tenyésztési körülmények között elsősorban különböző mesodermalis-eredetű

sejtekké/szövetekké (pl.: a vérképzést támogató – un. myelosupportiv - stroma, csont,

porc, zsírszövet, inak, símaizom) képesek differenciálódni (Pittenger és mtsai 1999).

Bizonyos induktorok hatására akár ectodermalis (neuron, glia) (Azizi és mtsai 1998,

Sanchez-Ramos 2002, Woodbury és mtsai 2000) és endodermalis (inzulintermelő β-

sejtek, májsejtek) irányú differenciálódásra is kényszeríthetők (Oh és mtsai 2004,

Petersen 1999, Tang és mtsai 2004, Lakshmipathy és Verfaillie 2005). Hozzá kell tenni,

hogy a humán MSC-k nem halhatatlanok, az osztódások során öregszenek is,

plaszticitásuk fokozatosan csökken és végül senescenssé válnak. A C57Bl/6 egerekből

28

előállított MSC tenyészetek azonban több tucatszor átolthatók, és a senescencia

legcsekélyebb jelét sem mutatják, sokáig megőrzik plaszticitásukat, euploidiájukat.

Az MSC-k a szervezetben mindenhol jelen vannak

Az MSC-k nem csak a csontvelőben találhatók. Gyakorlatilag minden

eddig vizsgált szövetünkben, szervünkben előfordulnak (da Silva Meirelles és

mtsai 2006, Pierdomenico és mtsai 2005). Könnyen hozzáférhető forrásuk lehet

például minden zsírleszívásból származó szövetminta (Zuk és mtsai 2001), vagy a

köldökzsinór (Erices és mtsai 2000) is. Valójában igen nehéz pontosan

meghatározni, hogy mely sejtek is azok a mesenchymális őssejtek, és hogyan

tudjuk egyértelműen megkülönböztetni őket a belőlük származó fibroblastoktól

vagy akár a (valószínűleg szintén MSC-eredetű) pericytáktól (da Silva Meirelles

és mtsai 2008, Kovacic, Boehm 2008).

A különböző szövetekből izolált MSC-kkel régóta folyó, szerteágazó

kísérletek, illetve ezek sokszor egymásnak ellentmondó eredményei miatt az ISCT

(= International Society for Cellular Therapy) időszerűnek találta legalább azt

definiálni, hogy milyen sejteket is nevezhetünk MSC-knek (Dominici és mtsai

2006). A fenti nemzetközi szövetség 2006-ban a következő javaslatot tette:

nevezzük a mesenchymális ős-, vagy helyesebben stroma sejteknek (tekintettel a

mesenchymális sejttenyészetek heterogén voltára) mindazokat a sejteket amelyek:

• adherensek;

• CD105, CD73 és CD90 pozitívak, de nem hordoznak semmilyen,

vérképző ős- és elődsejtekre, illetve a különböző vérsejtfejlődési sorokra

jellemző felszíni markert (azaz CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a és

CD19 negatívak);

• csont-, porc- és zsírsejtekké egyaránt képesek differenciálódni.

Az MSC-k mobilitása és regeneratív képességei

Már korábban felfigyeltek arra, hogy minden csontvelő-transzplantált

beteg és kísérleti állat stromája recipiens eredetű (Rieger 2005). Kiderült, hogy a

sejttenyészetben felszaporított és a szervezetbe intravénásan visszajuttatott MSC-k

29

sem vándorolnak a csontvelőbe, hanem inkább szétszóródnak a különböző –

elsősorban sok kapillárist tartalmazó – szövetekben. Tetemes részük például a

tüdőben és a vesékben telepszik meg (Anjos-Afonso és mtsai 2004, Gao és mtsai

2001).

Ennek lehet egyszerű fizikai oka: a nagyméretű és könnyen összetapadó

sejtek elakadnak a szűk kapillárisokban. Más feltételezések szerint azonban az

MSC-k igazi „hazája” az erek falában található, ahol pericytákként funkcionálnak,

és ezért vándorlásuk („homing”-juk) is ide irányul (Zannettino és mtsai 2008).

Sérülés esetén viszont – kemotaktikus ingerek hatására - egy részük a sérült

szervekbe, szövetekbe vándorol, ahol kulcsszerepet játszik az adott szövet, illetve

szerv regenerációjában. Közvetlenül a sérülés helyére adva az őssejteket általában

még jobb eredmények érhetők el (Chamberlain és mtsai 2007). A számtalan sikeres

állatkísérlet után ma már folyik az „MSC terápia” klinikai kipróbálása is. Porc és

csontsérülések gyógyításával (Caplan 2005), szívinfarktuson átesett betegek

(Bunnell 2005, Zimmet és Hare 2005) és idegrendszert érintő károsodások (Bang

2005) kezelésével próbálkoznak különböző munkacsoportok. Még osteogenesis

imperfectában szenvedő gyermekekben is sikerült átmeneti javulást, a csont

alapállományának növekedését és a csonttörések gyakoriságának csökkenését elérni

MSC-k adásával (Horwitz és mtsai 1999). A terápiás hatás mechanizmusát azonban

nem ismerjük. Annyi bizonyos, hogy az MSC-k sokszor nem is épülnek be (vagy

legfeljebb igen kis számban) a sérült szövetbe, azaz nem transzdifferenciálódnak

tömegesen például szívizom sejtekké vagy neuronokká in vivo, hanem inkább

indirekt módon – az általuk termelt „trofikus” faktorok segítségével – indítják el a

károsodott szövetek regenerációját (Caplan, Dennis 2006).

Az MSC-k és az immunrendszer kapcsolata

Részben az állatkísérletek, részben a klinikai kipróbálás során derült ki,

hogy az MSC-k két további különleges sajátsággal is rendelkeznek:

• allogén (ugyanazon faj genetikailag eltérő másik egyede), sőt néha xenogén

(másik faj egyede) recipiensbe oltva sem váltanak ki erőteljes, a sejtek

kilökődésével járó immunválaszt, azaz nem, vagy alig immunogének.

30

• kifejezett – in vitro és in vivo egyaránt megfigyelhető - immunszuppresszív

hatásuk van (Bartholomew 2002, Uccelli 2006).

Mára már számos kísérlet bizonyítja, hogy a szövettenyészetben tartott

MSC-k minden, az immunválaszban fontos szerepet játszó sejt – T- és B-

lymphocyta, NK-sejt, és hivatásos antigén bemutató sejt (antigen presenting cell =

APC) - funkcióját képesek gátolni. A gátlás nem antigénspecifikus, MHC-

független és elsősorban feltehetően szolubilis faktorok révén valósul meg. A

sejtkommunikáció közvetítésével kapcsolatban számos anyag szóba került, több

elmélet látott napvilágot (melyeket a 4.ábra foglal össze) és további kutatások

folynak (Rasmusson 2006, Aggarwal és Pittenger 2005, Deng és mtsai 2005).

4. ábra A mesenchymális őssejtek (MSC) immunszuppresszív hatásának

feltételezett mechanizmusa

Rövidítések: Treg = reguláló T-sejt, DC = dendritikus sejt, NK-sejt = natural killer sejt,

IL =interleukin, PGE2 = prosztaglandin E2, M-CSF = makrofág kolónia-stimuláló

faktor, TGF-β = transzformáló növekedési faktor-β, HGF = hepatocyta növekedési

faktor, IFN-γ = interferon-γ, IDO = indolamin-2,3-dioxigenáz

31

Az in vitro kísérletek mellett számos állatmodellben - sőt néhány esetben

már betegekben is - igazolták, hogy az MSC-k képesek gátolni mind a saját, mind

a nem-saját antigének elleni, (auto- illetve alloantigén-specifikus) immunválaszt.

Elsőként páviánokon figyelték meg, hogy MSC-k systemás adásával

megnövelhető az allogén bőrgraftok túlélése (Bartholomew és mtsai 2002). Azóta

számos, főleg rágcsálókon előidézett autoimmun betegségmodell gyógyítása révén

az MSC-k immunszuppresszív működése további igazolást nyert (Gerdoni 2007,

Zappia 2005, Augello 2007). Így kerülhetett sor a humán gyógyászatban is

alkalmazásukra. 2004-ben Le Blanc és mtsai (Le Blanc és mtsai 2004) a „The

Lancet” című folyóiratban számoltak be az első, az MSC-k in vivo gyulladásgátló

és immunszuppresszív hatásán alapuló sikeres terápiás beavatkozásról. Egy 9

éves, akut lymphoid leukaemiája miatt allogén csontvelő-transzplantációval kezelt

kisfiúban rendkívül súlyos (IV. stádiumú), a bőrt, az emésztőrendszert és a májat

is érintő – gyógyszer rezisztens - akut graft versus host betegség (GVHD) alakult

ki. Ezt sikerült leküzdeni a gyermek édesanyjából (haploidentikus donor)

származó MSC-k ismételt intravénás adásával. Napjainkra az Egyesült

Államokban az FDA (Food and Drug Administration) már engedélyt adott több

„gyári” (Osiris Therapeutics, Inc.) MSC készítmény klinikai kipróbálására GVHD-

ban (fázis II/III), Crohn-betegségben (fázis II) és rheumatoid arthritisben (fázis

I/II). Az eddigi, korlátozott számú betegen végzett vizsgálat azt mutatja, hogy az

MSC kezelésnek - legalábbis viszonylag rövid távon - nincs káros mellékhatása, és

a beavatkozás során érvényesül az őssejtek szövet-regenerációt elősegítő

képessége is. Nem csak megállítják, vagy legalábbis lassítják a GVHD

progresszióját, hanem fokozzák a betegség következtében károsodott szövetek,

például a bélhám és a máj regenerációját is.

Összefoglalásként tehát elmondhatjuk, hogy az MSC-k megismerése

számtalan új – eddig nem is remélt – lehetőséggel kecsegtet a gyulladásos és

autoimmun betegségek kezelésében, valamint a regeneratív orvoslás és a szerv-

transzplantáció területén. Különösen immunszuppresszív hatásuk ígéretes, mivel

az MSC-k – mint láttuk – előszeretettel vándorolnak a sérült és/vagy gyulladt

szövetekbe, tehát aktivitásukat is elsősorban ott, lokálisan fejtik ki. Így, bár

immunszuppresszív hatásuk a jelenleg alkalmazott gyógyszerekéhez hasonlóan

32

nem antigén specifikus, alkalmazásuk remélhetőleg jóval kevesebb nem kívánatos

mellékhatással (toxicitás, a kórokozók elleni védelem gyengítése, stb.) jár.

A mindennapi gyógyító gyakorlatban történő alkalmazásukat

megkönnyítené, hogy adott beteg kezeléséhez nincs szükség feltétlenül autológ

őssejtekre, elvben bármely egészséges donor MSC-je felhasználható anélkül, hogy

gyógyszerekkel gátolnánk a recipiens immunrendszerének működését.

Az MSC-k regeneratív képességeik miatt az 1-es és a 2-es típusú

diabetesben szenvedő betegek β-sejtjeinek regenerációjában is szerepet

játszhatnak, de ha immunszuppresszív tulajdonságaikat is számításba vesszük,

akkor mindkét okból terápiás hatással bírhatnak autoimmun diabetesben. Ezért az

MSC-k hatásának vizsgálata különösen indolkolt a streptozotocinnal (STZ)

kialakított diabetes esetén, ugyanis ez az autoimmun diabetes modellje. Az STZ a

β-sejteket specifikusan pusztító méregként működik. Miközben belülről roncsolja

azokat, olyan antigéneket hoz felszínre, amelyek miatt egyúttal az autoreaktív T-

sejt válasz elindítójaként is szerepet játszik (Like és Rossini 1976, Paik és mtsai

1980, Kiesel és Kolb 1982). A T-sejt válasz ezután az addig nem érintett β-

sejteket is elpusztítja, illetve gátolja a regenerációt, mert az újonnan képződő β-

sejteket sem hagyja életben. A kialakuló T-sejt infiltráció nagyon hasonlít az 1-es

típusú diabetes kialakulása során megfigyelhetőhöz.

33

2. Célkitűzés

A diabetesben elpusztult β-sejtek pótlására világszerte folynak

kutatások, melyek vagy a beteg saját β-sejtjeinek támogatását és számuk

növelését célozzák, vagy β-sejteket kívánnak előállítani endogén vagy exogén

őssejtekből. Az eddigi egérkísérletek eredményei, melyekben β-sejtek pótlására,

vagy osztódásuk elősegítésére csontvelői magvas sejteket, esetleg többé-kevésbé

tisztított vérképző ős- és elődsejteket adtak, ellentmondásosak voltak, nem

minden esetben bizonyultak megismételhetőnek és a legkevésbé sem szolgálnak

egységes magyarázattal a gyógyulás mechanizmusára vonatkozólag. Munkánk

célja a frissen szeparált csontvelői magvas sejtek (bone marrow cell = BMC/ BM

sejt) és a csontvelői eredetű in vitro felszaporított mesenchymális őssejtek

(mesenchymal stem/stromal cell = MSC) szerepének vizsgálata cukorbeteg

egerekben.

1. A diabetes őssejtterápiájára vonatkozó kérdések vizsgálata előtt megfelelő

állatmodellre volt szükségünk. A streptozotocin (STZ) indukálta diabeteses

állatmodellt kívántuk alkalmazni. A betegség kialakulásának folyamatát a

vércukorszint, a szérum inzulinszint és a testsúly folyamatos mérésével tudtuk

nyomon követni. Terveztük, hogy a Langerhans-szigetek degenerálódását és az

inzulin szekréció csökkenését szövettani metszeteken immunhisztokémiai

módszerekkel is igazoljuk.

2. Az 1. pontban mért paraméterek alapján egyértelműen cukorbeteg

állatokon, mint az autoimmun diabetes állatmodelljén végzett

transzplantációs kísérleteink elsődleges célja annak a kérdésnek a tisztázása volt,

hogy a frissen szeparált csontvelői magvas sejtek valójában milyen hatással

vannak a betegség lefolyására, esetleg pancreas regenerációt is előidézhetnek-e.

Ha igen, akkor ez milyen mértékű ill. mennyire tartós? Az egérmodell sikeres

létrehozását követően mindenek előtt erre a kérdésre kerestük a választ.

34

Pontosan meg akartuk határozni a transzplantációt megelőző legkisebb, de még

hatásos besugárzási dózist, a transzplantáció ideális időpontját, valamint a -

terápiás szempontból leginkább hatásos - beadandó sejtszámot.

3. Tekintettel a mesenchymális őssejtek figyelemreméltó regeneratív és

immunszuppresszív tulajdonságaira, a 2. pontban célul kitűzött

transzplantációs kísérleteinket ki kívántuk egészíteni azzal, hogy a csontvelői

őssejtek egyik típusát, a mesenchymális őssejteket (mesenchymal stem/stromal

cell = MSC) in vitro felszaporított formában is alkalmazzuk. Az MSC-ket

plasztik adherenciájuk alapján szeparálva és in vitro tenyésztve akartuk

felszaporítani. Annak bizonyítására, hogy az így nyert sejtek azonosak az

International Society for Cellular Therapy által 2006-ban megfogalmazott

definícióban szereplő MSC-kel, illetve valóban multipotensek, áramlásos

cytométerben markereik alapján akartuk karakterizálni, majd adipocyta és

osteoblast irányba is differenciáltatni őket.

4. Az előzőleg in vitro kultúrában felszaporított MSC-ket önmagukban is be

akartuk juttatni a cukorbeteg állatok keringésébe ill. kotranszplantációt is

terveztünk, azaz a frissen szeparált csontvelői sejtekkel egyidejűleg MSC-ket is

be akartunk adni az állatoknak. A terápiás szempontból leginkább megfelelő

sejtszámokat kellő számú kísérlet eredményeként kívántuk meghatározni.

5. Ha bármelyik esetben és feltétellel átmeneti javulást vagy gyógyulást sikerül

megfigyelnünk, annak mechanizmusára vonatkozóan is terveztünk információkat

nyerni. Ebből a célból követni kívántuk a beadott sejtek sorsát. Igazolni kívántuk

a BMC-k „hazatalálását” (homingját) a csontvelőbe, és az ott kialakuló átmeneti

kevert chimerizmust. Keresni kívántuk még a MSC-k megtapadásának esetleges

nyomait, illetve ki akartuk mutatni immunszuppresszív működésüket.

35

3. Módszerek

3.1. A diabetes kísérletes előidézése

A diabetes állatmodellje

A diabetes előidézésére az egérmodelleket igénylő kutatások

„gold standard”-jaként számon tartott C57Bl/6 (B6) elnevezésű beltenyésztett

törzs nőstény egyedeit használtuk fel. Az állatokat az Országos Onkológiai

Intézettől vásároltuk. Az állatkísérletek az Országos Gyógyintézeti Központ

Munkahelyi Állatkísérleti Bizottsága által előírt szabályoknak megfelelően

folytak.

A 8-10 hetes nőstény C57Bl/6 egerek 5 egymást követő napon

testsúlykilogrammonként 50-50 mg streptozotocint (STZ) (Sigma-Aldrich, St.

Louis) kaptak intraperitoneálisan (ip). Az STZ oldatot minden oltás előtt frissen,

nátrium-citrát puffer (pH: 4,5) felhasználásával készítettük.

A testsúly, a vércukorszint, és a szérum inzulinszint követése

Az állatok testsúlyát laboratóriumi mérlegen, vércukorszintjüket

glükométerrel (Accu-Chek Active vércukorszint mérő, F. Hoffmann-La Roche,

Basel, Svájc) hetente két alkalommal mértük. A szérum inzulinszinteket

patkány/egér inzulinra specifikus ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Kit (Linco Research, St. Charles, MO) segítségével határoztuk meg, a gyártó

utasításait követve. Azokat az állatokat tekintettük cukorbetegnek, melyek éhezés

utáni vércukorszintje az STZ kezelés megkezdését követő 14. és a 15. napon

meghaladta a 10 mmol/l-t a. Alapnak tekintettük, hogy az egészséges C56Bl/6

egerek 6 órányi éhezést követő vércukorszintje 4-5 mmol/l.

36

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt

Ennek a vizsgálatnak a során az állatok négy órás éhezést

követően testsúlykilogrammonként 2 g glükózt kaptak intraperitoneálisan. A

cukor feldolgozását a vércukorszint 30 percenkénti mérésével követtük nyomon.

A glükóz tolerancia teszt azt mutatja, hogy a glükózterhelésre bekövetkező

vércukorszint emelkedés mennyi idő alatt esik vissza az éhezési értékre. A

beadott glükóz feldolgozásának sebességén keresztül tájékoztatást kaphatunk a β-

sejtek inzulin-kibocsátásáról, a szénhidrát-anyagcsere válaszkészségéről,

állapotáról. Ha ez az idő hosszabbodik, vagy jelentősen megnyúlik, azt jelenti,

hogy az állatok a diabetest megelőző glükóz intoleranciában szenvednek, vagy

már cukorbetegek.

3.2. A csontvelői magvas sejtek szeparálása

A szingén (C57Bl/6) hím egerekből származó csontvelői sejteket

közvetlenül a transzplantációjuk előtt nyertük ki az állatok comb- és

lábszárcsontjaiból. A túlaltatott állatokból kiemelt csontokat steril alkoholos

gézlapok felhasználásával alaposan megtisztítottuk a csonthártyától, az inaktól és

az izmoktól, majd steril HBSS (Hank's Buffered Salt Solution) oldatba helyeztük.

A csontok epiphysiseinél csipesz és kisolló használatával megnyitottuk a velőűrt,

majd injekciós tű és fecskendő segítségével, hideg HBSS oldattal többször

átöblítettük azt. Így alaposan kimostuk a csontokból a sejteket. A magvas sejtek

számát az így nyert szuszpenzióban Türk-oldattal (genciánibolya + ecetsav)

végzett festés után, Bürker-kamrában határoztuk meg.

3.3. A cukorbeteg egerek transzplantációja csontvelői magvas sejtekkel

A frissen szeparált csonvelői magvas sejtekkel azonnal elvégeztük

a transzplantációt. A sejteket 0,2 ml szérum mentes szuszpenzióban (HBSS vagy

fiziológiás sóoldatban) adtuk be a letálisan (900cGy) vagy szubletálisan (450,

250, vagy 150cGy) besugárzott diabeteses, valamint kontroll recipiens egerek

37

farokvénájába. (A besugárzás egy dózisban, 137Cs-forrásból származó, 80

cGy/perc intenzitású γ-sugárzással történt). A transzplantációt az STZ kezelés

megkezdése utáni 15. napon végeztük, kivéve azokat a kísérleteket, ahol ezt az

Eredmények fejezetben külön jeleztük.

3.4. A mesenchymális őssejtek izolálása, tenyésztése

Az MSC-k izolálását Peister és mtsai (Peister és mtsai 2004) által

leírt módszerrel, néhány apróbb módosítással végeztük. A csontvelőt a 3.2. ( „A

csontvelői magvas sejtek szeparálása”) pontban leírtakkal megegyezően nyertük

ki. A 8-10 hetes hím egerek femurjainak és tíbiáinak velőűrét hideg HBSS

oldattal átmostuk, majd – egy további mosás után - komplett

tenyésztőfolyadékban felszuszpendáltuk őket. Az itt használt komplett médium a

következőket tartalmazta: DMEM/F12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium

/F12, Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% foetális borjú szérum (fetal calf szérum =

FCS), 5 % ló szérum (Invitrogen), 50 U/ml penicillin, 50 µg/ml streptomycin

(Sigma-Aldrich), és 2 mM L-glutamin (Invitrogen). Egy-egy 25 cm2 letapadási

felületet nyújtó (T25-ös) tenyésztő edénybe (BD Falcon, Bedford, MA, USA) 7

ml, 2-5x106 sejt/ml-es szuszpenziót pipettáztunk. Az edényeket ezután 72 órára

37 Co-os hőmérsékletű CO2-termosztátba helyeztük. Az adherens sejteket 3-4

naponként friss tápfolyadékkal (a fenti komplett médiummal) láttuk el, miközben

azok osztódtak és lassan benőtték a tenyésztőedény alját. A kultúrákról 3-4 hét

múlva - amikor az adherens sejtréteg összefüggővé (konfluenssé) vált -

eltávolítottuk a tápfolyadékot, majd PBS-ben (phosphate-buffered saline)

mostuk. Ezt követően 1 mM EDTA-t (etilén-diamin-tetra-acetát, Sigma-Aldrich)

tartalmazó 0,25 %-os trypsinnel (Sigma-Aldrich) 5 percig, 37 Co-on inkubáltuk a

tenyészeteket. A trypsin/EDTA inkubáció hatására a sejtek leváltak az edény

felszínéről. A trypsines emésztést azonos térfogatú FCS hozzáadásával állítottuk

le. Egy ezt követő szérummentes (DMEM/F12 vagy Hank’s) médiumos felöntés

és 10 percig tartó, 1200-as percenkénti fordulatszámon végzett centrifugálás

(mosás) után egy 75 cm2-es tenyésztő edénybe (BD Falcon) szélesztettük a

sejteket. A későbbi átoltások ehhez hasonlóan történtek. A tenyészetekből a

38

haematopoeticus sejtek (CD45+, CD34+ és /vagy granulocyta-macrophag

kolónia képző sejtek) a 6. 7. átoltással teljesen eltűnnek, ugyanis az osztódások

során a vérképző sejtek eldifferenciálódtak és elöregedtek. Az elöregedő sejtek

nem adherensek, így azokat a tenyésztőfolyadék rendszeres cseréjével hetente

kétszer eltávolítottuk. Az egérből így nyert MSC tenyészetek nagyon sokáig –

több mint 100 átoltáson keresztül is - fenntarthatók voltak. Legalább 8

alkalommal in vitro átoltottuk a sejteket jellemzésük, illetve transzplantációra

történő felhasználásuk előtt.

3.5. A mesenchymális őssejtek jellemzése

Áramlási cytométerrel végzett marker-vizsgálatok

A trypsines emésztéssel felszedett MSC-ket 5x105 sejtet tartalmazó

mintákra osztottuk. A mintákat sötétben jelöltük egér Sca-1, CD44, CD73,

CD90.2, és CD34 elleni, fluorescein isothiocyanáttal (FITC), vagy

phycoerythrinnel (PE) konjugált monoklonális antitesttel, illetve biotinnal

konjugált anti-CD3, anti-CD45R/B220, anti-CD11b, anti-Ly-6G, és anti-TER-

119 monoklonális ellenanyaggal (valamennyi a BD PharMingen, San Diego, CA

terméke). Utóbbi esetben második reagensként PE-el jelölt streptavidint (Sigma-

Aldrich) alkalmaztunk. A megfestett sejteket PBS-ben mostuk, majd azonnal

analizáltuk FACScan flow cytométerben a Cell Quest software segítségével

(Becton-Dickinson. Mountain View, CA).

Csont irányú differenciáltatás

Az osteoblast irányú differenciálódás kiváltására Pittenger szerint

(Pittenger és mtsai 1999) jártunk el. A konfluens MSC tenyészeteket olyan

komplett médiumban tartottuk két héten át, amelyet hydrocortisonnal, β-

glycerophospháttal, és aszkorbinsavval (valamennyi a Sigma-Aldrichtól)

egészítettünk ki. Ennek az ún. osteogén médiumnak a pontos összetétele:

DMEM, 10% FCS, 2mM L-glutamin, 10-8 M hydrocortison, 10mM β-

39

glycerophosphat, 50 µg/ml aszkorbinsav, 100 IU penicillin és 50µg/ml

streptomicin. A pH (7,2) beállításához NaHCO3-t használtunk. A médiumot a

differenciáltatás során is 3-4 naponta cseréltük a tenyészeten.

Két hét elteltével a kalcium lerakódások megfigyelésére a tenyészeteket Alizarin

Red festékkel (Sigma-Aldrich) festettük meg és inverz mikroszkópban vizsgáltuk

(Olympus CK2, Olympus Optical Co., Tokió, Japán).

Zsírsejt irányú differenciáltatás

Az adipocyta irányú differencialódás kiváltására Pittenger szerint (Pittenger

és mtsai 1999) jártunk el. A konfluens MSC kultúrákat olyan komplett

médiumban tenyésztettük két héten át, amelyet dexamethasone-al és 3-isobutyl-

1-methylxanthine-nal (IBMX) (Sigma-Aldrich) egészítettünk ki. Ennek az ún.

adipogén médiumnak a pontos receptje: DMEM/F12, 10% FCS, 10-7 M

dexamethazone, 0,5 mM IBMX, 100 IU penicillin és 50 µg/ml streptomicin. A

pH (7,2) beállításához NaHCO3-t használtunk. A médiumot a differenciáltatás

során 3-4 naponta cseréltük a tenyészeten.

Ezt követően a sejteket 10%-os formalinban fixáltuk és Oil Red O (Sigma-

Aldrich) festékkel festettük, majd inverz mikroszkópban vizsgáltuk (Olympus

CK2).

3.6. A mesenchymális őssejtek transzplantációra történő felhasználása

Az MSC-ket ugyanúgy juttattuk az állatok farokvénáján keresztül

a keringésükbe, mint a BMC-ket. A kotranszplantációhoz az előzőleg

sejtkultúrában felszaporított MSC-ket a BM grafttal 0,2 ml szérum mentes

médiumban (HBSS-ben) összekevertük, majd így adtuk be a recipiens állatoknak.

3.7. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata

A T-sejt proliferációs méréseket, néhány módosítással, a Horwitz

és munkatársai (Horwitz és mtsai 2002) által leírt módon végeztük el.

40

Az APC-k kinyerése

Antigén prezentáló sejteket (antigen-presenting cell = APC) kezeletlen kontroll

és STZ-vel kezelt (a kezelés 8. napján) C57Bl/6 nőstény egerek lépéből

nyertünk. Az állatok lépét mechanikai módszerrel szétroncsoltuk. Az ezáltal

alaposan homogenizált lépsejt szuszpenziót NH4Cl-tartalmú pufferoldattal

végzett lizálás útján tisztítottuk meg a vörösvértestektől: 0,01 M TRIS (tris-

hydroxymethyl-amino-metan) és 8,3g/l ammónium klorid 7-es pH-jú steril

oldatában, mint hipotóniás lízispufferben 5 percig kezeltük a homogenizátumot.

A HBSS oldattal felhígított, majd lecentrifugált sejtek felülúszójával elöntöttük a

vörövértestek lizátumát. Az üledékben megmaradt sejteket 0,5 ml, 10% FCS-el

kiegészített DMEM-ben reszuszpendáltuk, majd a sejtek Bürker-kamrában

történő megszámolását követően úgy állítottuk be a higítást, hogy 107 sejt jusson

a szuszpenzió 1 ml-ébe. Ezután 4 órán keresztül, Petri csészékben, 37Co-on

inkubálva letapasztottuk az adherens sejteket, köztük az APC-ket. A le nem

tapadt sejteket hideg PBS-ben történő többszöri mosással távolítottuk el, míg az

adherens sejtekhez a felületről történő mechanikai eltávolítással (lekaparással)

jutottunk hozzá. Az ezzel az eljárással nyert, APC-kre nézve feldúsított

sejtpopulációt 15 Gy-el sugároztuk be a felhasználás előtt, meggátolva így

további esetleges osztódásukat.

A T-lymphocyták izolálása

A T-lymphocytákat az STZ-kezelt állatok hasnyálmirigyéből, illetve az előzőleg

ovalbuminnal (OVA) (Sigma-Aldrich) immunizált állatok lépéből nyertük a

kezeléseket követő különböző időpontokban (ld. az eredményeket bemutató

grafikonokon jelölve: 23.ábra). Az OVA kezelés állatonként 10 µg OVA és 1 mg

Al(OH)3 intraperitoneális beadását jelentette. Az egyes állatokból kiemelt

hasnyálmirigyeket, illetve lépeket külön-külön, mechanikai módszerrel, addig

homogenizáltuk, míg a sejteket nem sikerült annyira szeparálni egymástól, hogy

egyesével helyezkedjenek el a szuszpenzióban. A sejtek mosása után a Pan T

Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) anti-T sejt

41

ellenanyaggal fedett, mágnesezhető szemcséinek segítségével, a gyártó

utasításait követve, T-sejtekre nézve feldúsítottuk a szuszpenziót.

A sejtosztódás mérése

Az APC-ket és a T-sejteket ezután összekevertük és együtt inkubáltuk úgy, hogy

egy 96 lyukú tálca (BD Falcon) minden egyes lyukába 5x104 APC-t és 2x105 T-

sejtet tettünk. Ennek során esetenként szolúbilis antigéneket (pancreas szövet

kivonata, illetve ovalbumin) is adtunk a tenyészethez. Az inkubálást 72 órán át,

37Co-on folytattuk. Az inkubációs idő letelte előtt 18 órával a tenyészetekhez 1

µCi 3H-timidint adtunk. A sejtek learatása után az S fázison áthaladó sejtek

DNS-ébe beépült 3H-timidin relatív mennyiségét (cpm) folyadékszcintillátorban

mértük.

Gyógyszeres immunszuppresszió alkalmazása

Egy kiegészítő kísérlet során az állatok az STZ kezelés első napjától számított

10., 17., és 19. napon 10 mg/kg Cyclosporin A-t (Sandimmun) kaptak a bőr alá

oltva, melyet a Sandoztól (Novartis Hungaria Kft., Budapest) vásároltunk.

3.8. Mikroszkópos vizsgálatok

Szövettan és immunhisztokémia

A hasnyálmirigyből, májból és tüdőből származó szövetmintákat 4%-os,

semleges kémhatásúra pufferelt formalinban 3 órán át fixáltuk. Ezután paraffinba

ágyaztuk és 5 µm vastagra metszettük. A metszeteket haematoxylin-eosinnal

festettük (HE, Sigma-Aldrich). A formalinban fixált szövetekből készült

metszeteken immunhisztokémiai vizsgálatokat is végeztünk. Ehhez először

eltávolítottuk a paraffint és rehidratáltuk a szöveteket, majd hidrogén-peroxid

oldatban végzett inkubációval gátoltuk az endogén peroxidáz enzimek

aktivitását. Ezt követően monoklonális egér anti-inzulin IgG ellenanyagot

(Sigma-Aldrich) cseppentettünk a metszetekre (1:1000-es higításban) majd 15

42

perc elteltével biotinilált nyúl anti-egér IgG, valamint streptavidinnal konjugált

peroxidáz enzimet adtunk. Ezután a metszeteket - a gyártó utasításait követve -

diaminobenzidinnel (DAB) kezeltük (Peroxidase Kit; Dako, Glostrup, Denmark).

Végül a metszeteket hematoxylinnal is megfestettük és kontrasztosítottuk. Ha az

első ellenanyagot kihagytuk, nem tapasztaltunk háttérfestődést, tehát az

immunhisztokémia valóban inzulin-specifikus volt.

Kombinált immunhisztokémia és Y kromoszóma in situ hibridizáció

A hím egyedekből származó, inzulin tartalmú donor sejtek kimutatására, az STZ-

vel kezelt nőstény recipiensek szöveteiben, ugyanazon a metszeten alkalmaztunk

Y kromoszóma specifikus fluorescens in situ hibridizációt (FISH) és inzulinra

specifikus immunhisztokémiát (Albera és mtsai 2005). A formalinban fixált és

paraffinba ágyazott szövetekből készült metszeteket, a paraffin eltávolítását

követő rehidratálás után blokkoltuk Tris-pufferben (TBS) oldott zsírmentes

tejporral 1 órán át. TBS-el történt mosás után monoklonális egér anti-inzulin IgG

ellenanyagot (Sigma-Aldrich) cseppentettünk a metszetekre (1:1000-es

higításban). Egy órányi inkubálás után ezt alkalikus foszfatáz enzimmel kapcsolt

nyúl anti-egér IgG antitest (Sigma-Aldrich) követte (1:100-as higításban). Az

inkubációs idő itt is 1 óra volt. Az alkalikus foszfatáz működését Fast Red

(Sigma-Aldrich) festéssel tettük láthatóvá. Negatív kontrollként az első

ellenanyagot elhagyva ismételtük meg az eljárást.

A következőkben az Y kromoszómák kimutatását az egér Y kromoszóma

specifikus próbához kötött fluorescein isothiocyanáttal (FITC) (StarFish Y,

Cambio, Cambridge, UK), a gyártók utasításait követve, végeztük el. A

metszeteket desztillált vízzel történő mosás után 10 percig, 80 Co-on Na-

thiocyanátban inkubáltuk, majd 0.1 M-os sósavban oldott 0.4% pepsinnel 10

percig emésztettük. A emésztést glicin oldatban állítottuk le, majd PBS-el

mostuk a metszeteket. Ezután 4%-os parafolmaldehidben fixáltuk a mintákat,

felszálló alkoholsorban dehidratáltuk, és végül levegőn szárítottuk. Lefedés előtt

az előzőleg feloldott StarFish Y próba egy cseppjét juttattuk az így előkészített

metszetekre. A fedőlemezeket gumi cementtel rögzítettük, majd egy 60Co-on

végzett 10 perces denaturálás után egy éjszakás inkubálás következett 37Co-on.

43

A fedőlemezek eltávolítása után a metszeteket formamid oldatban átöblítettük, és

15 peren át 37Co-os, 1x-es vagy 2x-es töménységű SSC-ben (standard saline

citrát) (Invitrogen) mostuk. Ezután 10 perces, 0,05% Tween 20-at (Sigma-

Aldrich) tartalmazó SSC-vel végzett mosás következett 37 Co-on. Az SSC

feleslegét PBS-el távolítottuk el. Végül a metszeteket Vectashield médiumban

(Vector Lab. Burlingame, CA) 4',6-diamidino-2-phenylindollal (DAPI) festettük.

A reakció specificitását egészséges kontroll hím és nőstény egerek

hasnyálmirigyének metszeteivel történő összehasonlítás útján ellenőriztük.

A metszetek vizsgálatára egy Fview II digitális fényképezőgéppel ellátott,

Olympus BX51 epifluorescencia mikroszkópban (Olympus Europa, Hamburg,

Germany) került sor. A képeket 40-szeres nagyítással 0,75 NA lencsékkel

készítettük és az AnalySIS Pro programmal dolgoztuk fel.

A csontvelői chimerizmus követése

A standard citogenetikai eljárásokkal - belértve a hipotóniás KCl oldattal 37Co-

on, 20 percig tartó inkubációt és a fixációs lépéseket (ecetsav/metanol 1:3) –

előkészített csontvelői sejteken fluorescens in situ hibridizáció (FISH) analízist

végeztünk. Az egér Y kromoszómára specifikus, rodaminnal jelölt DNS-próbát a

Qbiogene-től (Irvine, CA) vásároltuk és a gyártó által javasolt módon

alkalmaztuk. A legjobb eredményeket akkor kaptuk, ha a próbát tartalmazó

keveréket 73Co-on, 5 percig denaturáltuk. A hibridizációt követően a mosási

lépéseket a formamidos eljárással végeztük. Mintánként legalább 50 magot

számoltunk meg.

3.9. Statisztikai analízis

A Student-féle t próbát alkalmaztuk a p értékek meghatározására. Az

eredményt akkor tekintettük szignifikánsnak, amikor a p értéke kisebb volt, mint

0.05. A Kaplan-Meier módszert használtuk a túlélési adatok megjelenítésére. A

kezelések kimenetelének összehasonlítása során a szignifikanciát a Mann-Whitney

féle U próba segítségével határoztuk meg.

44

4. Eredmények

4.1. Az 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljének kialakítása

A betegséget kis mennyiségű – összesen 50mg/kg – streptozotocin (STZ)

ismételt intraperitoneális adásával idéztük elő felnőtt, C57Bl/6 nőstény egerekben.

Az STZ kémiailag glükózamin-nitrozóurea. Mint alkalikus nitrozóurea főleg a

DNS-t teszi tönkre. A glükózamin része pedig hasonlít annyira a glükózra, hogy

egy glükóz transzport proteinen keresztül bejusson a sejtbe. Főleg a GLUT2

transzporter hajlamos glükózként kezelni az STZ-t. Ebből a transzporterből a

szervezet többi sejtjéhez viszonyítva igen sok van éppen a β-sejteken. Így az STZ

célzottan és belülről roncsolva pusztítja a β-sejteket. Közben olyan antigének

kerülnek a felszínre, amelyek autoimmun folyamatokat indítanak el. Ezért

alkalmas ez a módszer az 1-es típusú, vagy autoimmun diabetes modellezésére.

(Like és Rossini 1976, Reusser 1971)

A betegség kialakulását a vércukorszint emelkedésének, a szérum

inzulinszint csökkenésének, és a testsúly csökkenésének mérésével követtük

nyomon. Az összehasonlító szövettani és az immunhisztokémiai vizsgálatok

további bizonyítékkal szolgáltak az STZ kezelés miatt bekövetkező β-sejt

pusztulásra nézve. Az STZ kezelés megkezdésétől számított 7.nap után kezdődött

vércukorszint emelkedést a 35.napig követtük nyomon. Ekkor már 4-5-ször

magasabb reggeli vércukorértékeket (24.91+3.93 mM) mértünk a cukorbeteggé

vált egereknél a kezeletlen állatokban mért értékekhez (5.71+0.42 mM)

viszonyítva, ami egyértelműen súlyos hyperglycaemiás állapotot jelent (5.a.ábra).

A vércukorszint emelkedés mellett nyomon követtük a szérum inzulinszint

drasztikus csökkenését (5. b ábra), mely nyilvánvalóan a hyperglycaemiás állapot

kialakulásáért közvetlenül okolható. A vércukorszint emelkedés és a szérum

inzulinszint csökkenés – a diabetes pathomechanismusának megfelelően - együtt

járt a testsúly fokozatos csökkenésével (5. c ábra).

45

5. ábra. A diabetes kialakítása (vércukorszint, szérum inzulinszint, testsúly

követése)

A sterptozotocin (STZ) kezelést követően az állatok vércukorszintje jelentősen

megnőtt (a), aminek hátterében a szérum inzulinszintjének csökkenése (b) állt.

Ezzel párhuzamosan az állatok testsúlya jelentősen csökkent (c). (n >10 mellett az

átlagokat és a szórást ábrázoltuk.)

0 14 28 42

46

Az egészséges (6. a ábra) és cukorbeteg (6. b ábra) állatok

hasnyálmirigyeiből készült szövettani metszetek összehasonlító vizsgálatát a 21.

napon végeztük el. A cukorbeteg állatok pancreasában megfigyeltük a

Langerhans-szigetek jelentős méretbeli csökkenését, valamint azt is, hogy a még

megmaradt szigetsejtek is erősen piknotikus magvúakká váltak, ami a szintetikus

folyamatok visszaszorulására illetve a sejtek tömeges pusztulására utal.

6. ábra. A diabetes kialakítása (szövettani metszet)

Haematoxylin eosinos festéssel készült pancreas metszeten jól látszanak a

világosabbra festődő Langerhans-szigetek, melyeket a sötétebbre festődő exocrin

területek, az acinusok és ductusok vesznek körül. Megfigyelhetőek a kontroll állat

(a) és az STZ kezelésen átesett állat (b) szigetei közötti méret-, szerkezet-, és

festődésbeli különbségek.

Lépték: 20 µm

Emellett az inzulintermelő β-sejteket célzó, tehát inzulinra specifikus

immunhisztokémiai festést is végeztünk. Ez az eljárás megmutatta, hogy a

cukorbeteg egerekben (7. b ábra) az egészséges kontroll állatokhoz képest (7. a

ábra), már csak elenyésző számban találhatóak inzulin-pozitív sejtek.

47

7. ábra. A diabetes kialakítása (immunhisztokémia)

A peroxidáz enzimmel jelölt anti-inzulin ellenanyaggal végzett immunhisztokémia

jól mutatja az inzulin-termelés drasztikus csökkenését a kezelt állatokban, amit

láthatóan az inzulin-termelő sejtek pusztulása okoz. Megfigyelhető a kontroll állat

(a) és az STZ kezelésen átesett állat (b) inzulinra nézve pozitív β-sejtjeinek

jelentős számbeli eltérése.

Lépték: 20 µm

Az STZ β-sejteket pusztító hatásának további bizonyítéka, hogy

inzulinkezelés, vagy más terápia nélkül a beteg állatok a 4.-6. héten - a szénhidrát-

anyagcsere súlyos zavara következtében - elpusztultak (9. ábra).

4.2. A csontvelő-transzplantáció hatása a diabetes progressziójára és a beteg

állatok túlélésére

Miután a felnőtt, nőstény C57Bl/6 egerekben, STZ kezeléssel diabetest

idéztünk elő, első kérdésünk az volt, hogy frissen szeparált csontvelői eredetű –

elsősorban vérképző – ős- és progenitor sejtek transzplantációjával lassítható-e a

diabetes progressziója, illetve gyógyítható-e a betegség.

A csontvelői sejtek beadása előtt a recipiens állatok vérképző rendszerét

legalább részlegesen károsítani kell ahhoz, hogy legalább átmenetileg befogadják a

48

donor sejteket. Károsítás nélkül a graft sejtjei néhány nap alatt eltűnnének a

recipiens szervezetéből és nem lenne idejük annak a hatásnak a kifejtésére, amit

tanulmányozni szeretnénk. Az állatok túlélése és a későbbiekben lehetséges humán

terápiás felhasználás miatt meg kellett találnunk a károsításnak azt a legkisebb

mértékét, amely kísérleteink szempontjából még hatásos, de az állatok számára a

legkevésbé ártalmas, túlélési esélyeiket a lehető legcsekélyebb mértékben

befolyásolja.

A károsítást az egész testre kiterjedő röntgen besugárzással (total body

irradiation = TBI) valósítottuk meg, mely főleg az osztódó sejteket károsítja, ezért

a csontvelőre is pusztító hatással van.

A besugárzás és transzplantáció optimális időpontját úgy választottunk

meg, hogy a vércukorszint és szérum inzulinszint változások alapján már biztosak

lehettünk a cukorbetegség kialakulásában. Ez akkor következett be, amikor az

állatok vércukorszintje 2 egymást követő napon (a 14. és 15. nap) - elérte, vagy

meghaladta a 10 mmol/l értéket.

Az STZ kezelés megkezdésétől számított 15. napon tehát a cukorbeteg

állatokat egész test besugárzásnak tettük ki. A legkisebb hatásos dózis

meghatározása végett az egész test besugárzást az egyes állatcsoportoknál

különböző dózisokban alkalmaztuk: 900, 450, 250, vagy 150 centiGray (cGy). A

900 cGy jelenti a C57Bl/6 egerek számára a letális, csontvelőhalált okozó dózist,

ami teljes myeloablatiót idéz elő, vagyis ezt követően csontvelő-transzplantáció

nélkül az állatok hamarosan elpusztulnának a vérképző rendszer hiánya miatt. A

450, 250 ill. a 150 cGy-el végzett besugárzás szubletális dózist jelent, amit

követően a csontvelő saját sejtjeiből gyorsan képes regenerálódni.

A TBI után közvetlenül 106 magvas csontvelői sejtet (bone marrow cell =

BMC) adtunk intravénásan a cukorbeteg állatoknak, melyeket szingén C57Bl/6

hím állatok combcsontjából és sípcsontjából frissen szeparáltunk. A csontvelő-

transzplantációs kísérletek vázlata a 8. ábrán látható.

49

8. ábra. A csontvelő-transzplantációs kísérletek menete

C57Bl/6 nőstény egerek STZ kezelése, majd a TBI-t követő szingén csontvelő-

transzplantáció. Vizsgáltuk a kezeléseken átesett állatok túlélését, követtük

vércukor és szérum inzulinszint értékeiket.

Rövidítések: STZ = streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői magvas sejtek),

TBI = total body irradiation (egész test besugárzás), i.p.: intraperitoneális (hasüregbe

adott injekció)

A legmagasabb dózisú, letális TBI-t (900cGy) kapott cukorbeteg állatok

mindegyike – az azonnali csontvelő transzplantáció ellenére – hamarosan

elpusztult, noha az azonos dózissal besugárzott és transzplantált, de egészséges

kontroll állatok 6 hónapnál is tovább éltek (9. és 10. b, f ábra), vagyis a

transzplantáció során technikai hiba nem történt. A pusztulás hátterében az állhat,

hogy a cukorbeteg állatok nem bírták elviselni az erős méreg (STZ) és a 900 cGy

dózisú TBI együttes toxikus hatását.

A legalacsonyabb TBI (150cGy) alkalmazása, majd az azt követő

transzplantáció – a mért vércukorszint értékek emelkedésének tekintetében – nem

idézett elő különbséget a besugározatlan, transzplantálatlan, de szintén cukorbeteg

C57Bl/6

C57Bl/6

TBI 150-900 cGy

Szingén BMC transzplantáció

a 15.napon

Túlélélés ? Vércukorszint ?

Szérum inzulinszint ?

STZ kezelés (1-5. napon,

50 mg/kg/ ip.)

50

állatokéhoz képest. Mivel a transzplantációs kezelés nem volt hatással a

cukorbetegség lefolyására, az állatok hamarosan elpusztultak. (9. és 10. a, e ábra).

A vércukorszint értékek emelkedése azonban átmenetileg megállt, vagy

legalábbis lelassult azokban az esetekben, amikor a cukorbeteg egereket a közepes

dózisú besugárzással (250 vagy 450cGy) kezeltük a csontvelő-transzplantáció előtt

(10. d, c ábra). Ennek ellenére nem állt véglegesen helyre a vércukorszint, sőt 2-3

hét múlva gyors emelkedésnek indult és valamennyi egér elpusztult a

transzplantációt követő 8.-10. héten.

A mérsékelt dózisú (250 vagy 450cGy), szubletális besugárzást követő

csontvelő-transzplantáció tehát átmenetileg lassítja ugyan az STZ kezelt egerek

vércukorszintjének emelkedését és túlélési idejüket is meghosszabbítja 10-14

nappal, de tartós hatása nincs a diabetes alakulására.

0

9. ábra. Eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált kísérleti

állatok túlélése

Látható, hogy a cukorbeteg állatok közül azok élnek a legtovább, amelyek közepes

dózisú (450 ill. 250 cGy) besugárzást és BMC transzplantációt kaptak. (n=6)

Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának időpontja, Tr = 106 frissen

szeparált, szingén csontvelői magvas sejttel (bone marow cell=BMC) történő

transzplantáció időpontja

900 cGy+BMC

STZ+250 cGy+BMC STZ+150 cGy+BMC

STZ+450 cGy+BMC

STZ+900 cGy+BMC

STZ

6

5

4

3

2

STZ

Élő

álla

tok

szám

a

0 14 28 42 56 70 84 180 Túlélés (napok)

51

10.ábra. Eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált kísérleti

állatok vércukorértékeinek alakulása (magyarázat a következő oldalon)

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

900 cGy

106 BMC

Idő (hetek) Idő (hetek)

a b

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

900 cGy

106 BMC

Idő (hetek) Idő (hetek)

a b

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

450 cGy

106 BMC

Idő (hetek)

c

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

450 cGy

106 BMC

Idő (hetek)

c

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l 250 cGy

106 BMC

150 cGy

106 BMC

900 cGy

106 BMC

Idő (hetek) Idő (hetek) Idő (hetek)

e fd

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l

Vér

cuko

rszi

nt m

M/l 250 cGy

106 BMC

150 cGy

106 BMC

900 cGy

106 BMC

Idő (hetek) Idő (hetek) Idő (hetek)

e fd

52

10. ábra. Az eltérő mértékű besugárzásnak kitett, majd transzplantált

kísérleti állatok vércukorértékeinek alakulása

a: Az állatokat csak STZ-vel kezeltük (n=6) b-e: A cukorbeteg (STZ kezelt)

állatokat (n=6) a 15. napon 106 BMC-vel transzplantáltuk, miután 900 cGy (b),

450 cGy (c), 250 cGy (d) és 150 cGy (e) egésztest besugárzásnak (TBI) tettük ki

őket. f: Nem cukorbeteg egereket 900 cGy TBI-t követően 106 BMC-vel

transzplantáltunk (n=3). Minden szimbólum egy-egy állatot reprezentál. A szimbólum

eltűnése a diagramról az adott állat halálát mutatja. Az adatokat két független kísérlet

eredményeiből nyertük. Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának

időpontja, Tr = 106 frissen szeparált, szingén csontvelői magvas sejttel (bone marrow

cells = BMC) történő transzplantáció időpontja

4.3. Egér mesenchymális őssejtek (MSC-k) karakterizálása és differenciáltatása

A szingén (C57Bl/6), szemiallogén ((C57Bl/6xDBA/2)F1) és allogén (CD1

és CD1-TgEGFP) hím állatok csontvelői sejtjei közül izoláltuk a plasztik adherens

sejteket (ld. 3.4. alatt), majd a nyolcadik átoltás után karakterizáltuk azokat. A

sejtek fenotípusának vizsgálata a sejtfelszíni antigének, mint markerek

expressziója alapján áramlási cytométerben történt. A műszeres mérés előtt a

jellegzetes MSC markert (Sca-1) és a vérképző sejtfejlődési sorok tipikus

markereit (CD3, CD45R/B220, TER-119, GR-1, és11b) fluoreszkáló (fluorescein

isothiocyanáttal vagy phycoerythrinnel-jelzett) monoklonális ellenanyagokkal

jelöltük. Mint az a 11. ábrán látható a kultúrában felszaporított adherens sejtek

több mint 95%-ban pozitívak voltak az MSC-kre specifikus markerre (Sca-1), de

negatívak a többi csontvelői vérképző sejtfejlődési sor differenciációja során

megjelenő markerekre.

Izolált és felszaporított sejtek jellemzéséhez hozzá tartozott még

morfológiájuk megfigyelése és leírása. A 12.a ábrán láthatóak a Giemsával

festődő, kissé nyúlványos, adherens sejtek, melyek ebben a közel konfluens

tenyészetben még éppen megfigyelhető jellegzetes koncentrikus csoportokban

helyezkednek el. Ezeket a csoportosulásokat az osztódást követően együtt maradó

sejtek képezik.

53

11. ábra. Az MSC-k karakterizálása sejtfelszíni markereik alapján

a: a sejtek erősen pozitívak az Sca-1 MSC specifikus markerre b: a sejtek

negatívak a CD3, CD45R, TER-119, Gr-1, CD11b, vérképző sejtfejlődési sorokra

jellemző markerekre.

Az egyes ellenanyagokat egyenként vizsgáltuk, negatív kontrollként azonos izotípusba

tartozó, de indifferens (nem specifikus) ellenanyagot használtunk.

Az MSC tenyészetek további lényeges jellemzője még plaszticitásuk,

vagyis az a képességük, hogy a külső körülmények függvényében képesek

tulajdonságaikat megváltoztatni. A komplett tenyésztő médiumban tartott

tenyészetekben a stromasejtek, köztük az őssejtek és leszármazottaik is osztódnak

és differenciálódnak. Az újonnan keletkező sejtek folyamatosan és spontán

fibroblast-szerű sejtekké differenciálódnak, melyek idővel elöregszenek és

elpusztulnak. A leglassabban az őssejtek öregszenek el és ezek a leginkább

multipotensek is. Úgy is mondhatjuk, hogy ezek a legfiatalabbak. A tenyészetek

alakíthatósága a bennük lévő őssejteknek köszönhető. A tenyészetek plaszticitását,

vagyis őssejtjeinek multipotenciáját csont és zsírsejt irányba történő

eldifferenciáltatásukkal igazoltunk. A 8. átoltás után a sejteket 14 napig osteogén

ill. adipogén médiumban tartottuk. A médium eltávolítása után a tenyészeteket

megfestettük.

Az alizarinvörös festést elterjedten használják az extracelluláris mátrix -

csontképződést megelőző - kalcifikációjának kimutatására. Alizarin vörös

Kontroll

Sca-1

95%

Kontroll

CD3

CD45R

TER-119

GR-1

CD11b

a b

54

festékkel megfestve az előzőleg osteogén médiumban tartott kultúrát, a sejtek

között vörösre festődő kalcium lerakódásokat figyelhettünk meg, melyek az

osteoblasttá differenciálódott sejtek működését bizonyítják (12. b ábra).

Az olajvörös festék ismert módon vörösre színezi a zsírsavakat és a

triglicerideket. A két hétig adipogén médiummal kezelt sejtekben található

olajvörössel festődő vezikulumok nyilvánvalóan lipidcseppek, melyek jelenléte az

adipocytává történt differenciálódás bizonyítéka (12. c ábra).

12. ábra. Az MSC- karakterizálása morfológiájuk és plaszticitásuk alapján

a: A komplett tenyésztő médiumban tartott szubkonfluens MCS kultúra sejtjei a 8.

átoltás után Giemsával festve. (Eredeti nagyítás: 10x) b: A két hétig osteogén

médiumban tartott MSC-k osteoblastokká differenciálódtak: alizarinvörössel festve

kalcium lerakódásokat látunk a sejtek között. (Eredeti nagyítás: 10x) c: A két hétig

adipogén médiumban tartott MSC-k adipocytákká differenciálódtak: bennük nagy

számban zsírcseppek halmozódtak fel, melyeket olajvörös festéssel tettünk

láthatóvá. (Eredeti nagyítás: 20x)

55

4.4. A mesenchymális őssejtek és a csontvelői vérképző sejtek sikeresen

együttműködnek a diabetes gyógyításában

A szakirodalom szerint a szingén vagy allogén MSC-k képesek többféle

sérült szövettípus regenerálására (Krampera és mtsai 2006, Chamberlain és mtsai

2007, Caplan, Dennis 2006). Azt kívántuk megvizsgálni, hogy vajon az MSC-k

önmagukban, vagy nem frakcionált csontvelői magvas – elsősorban vérképző -

sejtekkel (BMC-kel) együttműködve képesek-e a pancreas endocrin működésének

helyreállítására. Ezért az STZ-vel kezelt állatokat – a legkisebb, még hatásosnak

bizonyult - 250 cGy szubletális dózissal egész test besugárzásnak tettük ki. Ezt

követően az állatok intravénásan – a farokvénájukon keresztül - MSC-ket kaptak,

vagy különböző mennyiségekben MSC-ket és BMC-ket egyszerre juttattunk a

keringésükbe. A BMC-k minden esetben C57Bl/6, tehát szingén hím donorból

származtak, míg az MSC-k lehettek szingén, szemiallogén, vagy allogén eredetűek.

A szemiallogén MSC-ket (C57Bl/6xDBA/2)F1 hím egerekből izoláltuk. Az allogén

MSC-k vagy CD1 egerekből, vagy – a még jobb követhetőség végett - ugyanennek

az egértörzsnek zöld fluoreszkáló fehérjére (enhanced green fluorescent proteinre

= EGFP) nézve transzgenikus hím egyedeiből (CD1-TgEGFP) származtak. A

kísérletek összefoglaló vázlata a 13. ábrán látható.

A cukorbeteg állatok vércukorszintje és szérum inzulin koncentrációja a 15.

napon, 250 cGy TBI-t követően beadott 5x105 - 106 BMC és legalább 5x104 – de

még jobb, ha 105 – szemiallogén MSC hatására gyorsan visszatért a normális

szintre (14. a, b, e ábra). Ezek az egerek több mint 16 hétig éltek inzulin-kezelés

nélkül, tehát a gyógyulás teljesnek és véglegesnek tekinthető (16. ábra).

Ha a 106 BMC adása mellett lecsökkentettük a beadott MSC-k mennyiségét

2.5x104-re, akkor a vércukor és a szérum inzulin szintek normalizálódásában

mutatkozó gyógyító hatás megszűnt (14. c). Ha az optimális MSC mennyiség

(105/állat) mellett a BMC-k számának csökkentésével próbálkoztunk, akkor 2x105

sejtszámnál már szintén megszűnt a gyógyító hatás (14. f). Önmagukban sem az

MSC-k (2x105), sem a BMC-k (106) nem voltak hatással a magas vércukorszintre

56

(14. d, 10. d ábra) és az alacsony szérum inzulinszintre (15. b, c ábra) illetve az

állatok túlélésére (16., 9. ábra).

A 16. és 17. ábra összefoglalóan bemutatja az állatok túlélését (ill. a

gyógyulást jelentő tartós túlélését is) a különböző sejtszámok alkalmazása esetén.

Először 106 BMC adása mellett az MSC-k mennyiségét változtattuk, illetve egyik

esetben csak MSC-kkel transzplantáltunk (16. ábra). Majd az optimálisnak

bizonyult 5x104 MSC adása mellett a BMC-k mennyiségét változtattuk (17. ábra).

Itt is jól látható, hogy a tartós gyógyuláshoz legalább 5x104 MSC és 106 BMC

együttes transzplantációja kellett.

13. ábra. A BMC-k és az MSC-k együttes transzplantációjának vázlata

A kétféle sejttípust az STZ kezelés megkezdésétől számított 15. napon, 250cGy

TBI-t követően, a farokvénán keresztül juttattuk az állatok keringésébe, majd a

felsorolt vizsgálatokat végeztük el.

Rövidítések: STZ = streptozotocin, i.p.: intraperitoneális (hasüregbe adott injekció), BMC

= bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális

őssejtek) TBI = total body irradiation (egész test besugárzás), FISH = fluorescent in situ

hibridisation, EGFP = enhanced green fluorescent protein

C57Bl/6

STZ kezelés (1-5. napon,

50 mg/kg/ip.)

C57Bl/6

TBI 250 cGy

(C57Bl/6xDBA/2)F1, CD1

CD1-TgEGFP

In vitro kultúra

Szingén BMC

Allogén MSC

kotranszplantáció a 15.napon

BMC

Túlélélés? Vércukorszint?

Szérum inzulinszint? Immunhisztokémia?

FISH? EGFP?

57

14. ábra. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) és a csontvelői sejtek (BMC-k)

sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában

(folytatás és magyarázat a következő oldalon)

58

14. ábra. A mesenchymális őssejtek (MSC-k) és a csontvelői sejtek (BMC-k)

sikeresen együttműködnek a diabetes gyógyításában

Az STZ kezelés első napjától számított 15. napon, 250 cGy TBI-t követően beadott

106 szingén BMC és 105 (a) vagy 5x104 (b) MSC együttes transzplantációja

normalizálja a vércukorszintet és tartós gyógyulást eredményez. A 2.5x104 MSC-

vel végzett kotranszplantáció már nem elegendő a gyógyuláshoz (c), míg

önmagukban alkalmazva az MSC-k semmilyen hatással nincsenek a vércukorszint

alakulására, még akkor sem, ha 2x105 számban alkalmazzuk azokat (d). Ha az

optimálisnak bizonyult MSC-k adása mellett lecsökkentjük a BMC-k számát,

szintén a gyógyító hatás megszűnését tapasztalhatjuk (e), (f). Az MSC-ket

C57Bl/6xDBA/2F1 hím egerekből nyertük (n=6).

Minden szimbólum egy-egy állatot reprezentál. A szimbólum eltűnése a diagramról az

adott állat halálát jelenti.

Rövidítések: STZ= streptozotocin, Tr = a (ko)transzplantáció időpontja, BMC = bone

marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális

őssejtek),

250cGy 2x105 BMC 105 MSC

250cGy 5x105 BMC 105 MSC

59

15. ábra. A cukorbeteg egerek szérum inzulin-szintje normalizálódott a BMC-

kel és MSC-kel végzett kotranszplantációt követően

a: 106 BMC-vel és 105 MSC-vel

b: csak 106 BMC-vel

c: csak 105 MSC-vel végzett transzplantáció

Az adatok az átlagokat és a szórásokat mutatják. ( n = 9)

60

16. ábra. A különböző számú MSC-vel transzplantált kísérleti állatok túlélése

106 BMC adása mellett az MSC-k mennyiségét változtattuk, illetve egyik esetben

csak MSC-kel transzplantáltunk. Látható, hogy a tartós gyógyuláshoz 106 BMC és

legalább 5x104 MSC együttes transzplantációja kellett. (n=6)

17. ábra. A különböző számú BMC-vel transzplantált kísérleti állatok túlélése

5x104 MSC adása mellett a tartós gyógyuláshoz legalább 5x105 BMC egyidejű

transzplantációja is kellett. (n=6)

Rövidítések: STZ = streptozotocin kezelés megindításának időpontja, Tr = transzplantáció időpontja, TBI = total body irradiation (egész test besugárzás)

Élő

álla

tok

szá

ma

STZ

Tr

6 5 4 3 2 1

STZ+TBI+5x104MSC+106BMC STZ+TBI+5x104MSC+5x105 BMC STZ+TBI+5x104MSC+2x105 BMC

0 14 28 42 56 70 84 180 Idő (napok)

Élő

álla

tok

szám

a 6

5

4 3

2

1

0 14 28 42 56 70 84 180 Idő (napok)

STZ Tr

STZ+TBI+106BMC+105MSC

STZ+TBI+106BMC+5x104MSC

STZ+TBI+106BMC+2.5x104MSC

STZ+TBI+2x105MSC

61

Az optimális számban történő alkalmazás esetén, a kétféle sejttípusnak a

diabetes gyógyításában kifejtett sikeres együttműködését bizonyítják a gyógyult

állatok glükóz tolerancia tesztjeinek a kontrollokéhoz nagyon hasonló eredményei

is (18. ábra). További megerősítő bizonyítékként szolgált a hasnyálmirigy

metszeteken vizsgált inzulin pozitív sejtek jelentős számbeli növekedése (19. c

ábra). A regenerálódott szigetek mérete és inzulintermelése csaknem elérte az

egészséges kontrollok metszeteiben megfigyelhetőt (19. a. ábra).

Megvizsgáltuk még azt is, hogy nem találhatóak-e inzulin pozitív sejtek

más szervekben is, de sem a májban, sem a lépben, sem a tüdőben, sem a

csontvelőben nem találtunk ilyeneket (az eredményeket nem mutatjuk).

18. ábra Glükóz tolerancia teszt

Az előzőleg éheztetett állatok 2g/kg glükózt kaptak intraperitoneálisan, majd a

jelzett időpontokban mértük a vércukorértékeket.

Barna oszlopok: egészséges kontroll állatok értékei

Kék oszlopok: STZ indukálta diabetesben szenvedő állatok értékei

Piros oszlopok: 5x104 MSC és 106 BMC együttes transzplantációját követő 12.

héten mért glükóz tolerancia teszt értékek

Az adatok az átlagokat és a szórásokat mutatják ( n = 15)

Kontroll

STZ (4. hét)

STZ/BMT+MSC (12. hét)

C57/Bl/6 2 g/kg

glukóz ip.

30

20

30 60 90 0

10

Idő (percek)

Vér

cuko

rszi

nt (

mM

/l)

62

19. ábra. Anti-inzulin ellenanyaggal végzett immunhisztokémia

Megfigyelhető a kontroll állat (a) és az STZ kezelésen átesett állat (b) inzulinra

nézve pozitív β-sejtjeinek jelentős számbeli eltérése. A kotranszplantált, gyógyult

állatok (c) Langerhans-szigeteinek mérete és inzulintartalma a 12. héten csaknem

azonos mértékű a kontrollokéval.

Lépték: 20 µm

Az eredményeket nem befolyásolta az alkalmazott MSC-k genetikai háttere.

Akár szingén (hím C57Bl/6 egerekből nyert), akár allogén (hím CD1 vagy CD1-

TgEGFP) egérből nyert MSC-ket használtunk a transzplantációhoz, éppúgy

együttműködtek a BMC-kel a kísérletesen előidézett diabetes gyógyításában, mint

a szemiallogén MSC-k (1.táblázat).

1. táblázat. Az MSC-k genetikai háttere nem befolyásolja a gyógyulás esélyeit

Mesenchymális őssejt forrás Gyógyult állatok száma/ kotranszplantált állatok száma

C57Bl/6 10/11 (C57Bl/6xDBA/2)F1 35/37 CD1 7/7 CD1-TgEGFP 9/9

A transzplantáció időpontja azonban jelentősen befolyásolta a betegség

kimenetelét. Ha a transzplantációt az STZ kezelés megkezdésétől számított 8.

napon végeztük, akkor 9-ből 6 állat élt még több mint 20 héttel is a beavatkozás

után. Amennyiben a transzplantáció a 15. napon történt, valamennyi - 9-ből 9 -

állat túlélt. A 22. napon transzplantált 9 állatból már csak 2 gyógyult meg, míg a

29.napon transzplantáltak egyikén sem segített a beavatkozás.

63

4.5. A kotranszplantációt követő gyógyulás mechanizmusának vizsgálata

A gyógyulás nem a donor BMC-k, vagy MSC-k inzulin-termelő β-sejtté való

transzdifferenciálódásának köszönhető

A továbbiakban azokat az állatokat vizsgáltuk, amelyeket az STZ kezelés

első napjához viszonyított 15. napon 250 cGy TBI-nek tettünk ki, majd 106 BMC-

vel és 105 MSC-vel transzplantáltunk és meggyógyultak.

A gyógyult egerek új β-sejtjei elméletileg kialakulhattak akár endogén,

vagy akár donor eredetű sejtekből is. A hasnyálmirigy metszeteken Y

kromoszómára specifikus fluorescens in situ hibridizáció (FISH) analízist,

valamint inzulinra specifikus immunfestési eljárást egyidejűleg alkalmaztunk. A

FISH próba specificitását és transzplantációs kísérletekben való alkalmazhatóságát

korábbi munkánkban már igazoltuk (Kertész és mtsai 2006). A donor eredetű

sejteket megmutató FISH-próba és a β-sejteket jelölő immunfestés együttes

alkalmazásával kívántuk eldönteni, hogy a donor BMC-k és/vagy MSC-k

szolgáltak-e kiindulási sejtként az új inzulin-termelő sejtek létrejöttéhez, vagy a

recipiens saját sejtjei. A mérés validáláshoz egészséges hím kontroll egerek

hasnyálmirigy metszeteit használtuk. Ezeken a metszeteken mind az acinus, mind a

szigetsejtek magjain egyértelműen látszott az Y kromoszómák pontszerű, zölden

fluoreszkáló festődése (20. a ábra). A cukorbeteg nőstény recipiensek esetében a

FISH analízist, a BMC és MSC transzplantációt követő 2. (20. b ábra) és a 82. (16.

c ábra) napon végeztük el. Az eredmény egyértelműen negatív lett, több mint 200

vizsgált metszetből egyetlen-egyen sem igazolódott hím eredetű (Y kromoszóma

pozitív) sejtek jelenléte a regenerálódó hasnyálmirigyben. A donor eredetű MSC-k

kimutatása a recipiensekben még akkor sem volt lehetséges, ha amellett, hogy a

donor ellenkező nemű még zöld fluorescens fehérjére (enhanced green

flourescence protein = EGFP) transzgenikus is volt (CD1-TgEGFP). A recipiens

hasnyálmirigyében egyetlen zölden fluoreszkáló sejtet sem találtunk. Az

eredmények tehát egyértelműen azt igazolják, hogy az új β-sejtek recipiens és nem

donor eredetűek.

64

20. ábra. A donorsejtek nem mutathatók ki a recipiensek regenerálódó

Langerhans-szigeteiben

sejtmagok: kékek (DAPI) / inzulin: vörös (immunhisztokémia) / Y-kromoszómák:

zölden fluoreszkálnak (FISH)

a: egészséges hím C57Bl/6 egér pancreas metszete (mint pozitív kontroll)

b: STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció 2.

napján

c: STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció 84.

napján

Lépték: 100 µm

Bizonyos azonban, hogy a donor-eredetű BMC-k és/vagy MSC-k eljutottak

(homingoltak) a recipiens csontvelőbe, mert ott Y-kromoszómát tartalmazó

sejteket találtunk. A csontvelő chimerizmusa (kevert jellege) a transzplantációt

követő 10. napon volt a legkifejezettebb (6-12% donor eredetű sejtet számoltunk

meg a recipiens csontvelőben), majd ezután gyorsan csökkent (21. a ábra).

Miközben a donor eredetű sejtek eltűntek, a magvas sejtek összmennyisége

fokozatosan nőtt (21. b ábra), ahogy a csontvelő regenerálódott a recipiens saját

sejtjeiből. Nem találtunk zöld fluoreszkáló fehérjét expresszáló MSC-ket a

transzplantált állatok csontvelejében, perifériás vérében, májában, tüdejében és

lépében sem.

65

21. ábra. Csontvelői chimerizmus az STZ kezelt, majd kotranszplantált

állatokban

a: A donor sejteket Y-kromoszóma specifikus FISH analízissel mutattuk ki és

számoltuk meg a recipiens csontvelejében. Látható, hogy a chimerizmus a

transzplantációt követő 10. napon a legkifejezettebb. Minden szimbólum egy-egy

állat adatát jelképezi (n=5)

b: A magvas csontvelői sejtek száma gyorsan nő a recipiens állatok femurjában.

Az adatok az átlagokat és szórásokat mutatják (n=5).

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a befogadó szervezetben

aktiválódott, endogén regeneratív folyamatok eredményezték a hasnyálmirigy

inzulin-termelő sejtjeinek visszatérését, valamint a vércukorszint és a szérum

inzulin-szint normalizálódását.

Meg kell jegyeznünk, hogy a máj, a lép, a gyomor, a belek, a tüdők, és a

csontvelő alapos vizsgálatával sem találtuk neoplasztikus elváltozás jeleit a

szingén BMC-kel és a szingén vagy allogén MSC-kel transzplantált egerekben.

66

Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ

A β-sejtek STZ-vel történő direkt roncsolásának következtében autoreaktív

T-sejtek aktiválódnak a kísérleti állatokban, melyek tovább rombolják a szigeteket

(Like és Rossini 1976, Paik és mtsai 1980). Ugyanakkor az MSC-k T-sejt választ

gátló immunszuppresszív hatásáról is többen beszámoltak (Gerdoni 2007, Zappia

2005, Augello 2007). Ezért arra a következtetésre jutottunk, miszerint lehetséges,

hogy az MSC-k, a β-sejt specifikus immunválasz gátlásával (is) hozzájárulnak a

szigetek integritásának endogén helyreállításához. Hipotézisünk bizonyítására a

22.ábrán látható kísérletet terveztük meg. Ennek során a cukorbeteg egerek

hasnyálmirigyeiből T-sejteket izoláltunk. Külön vizsgáltuk a csak BMC-kkel, a

csak MSC-kkel (23. d. és c ábra), valamint a kettő kombinációjával (23. b ábra)

transzplantált, és a nem transzplantált (23. a ábra) állatok hasnyálmirigyéből

származó T-sejteket. Ugyancsak STZ-vel kezelt állatok lépéből antigén bemutató

sejteket (antigen presenting cell = APC) izoláltunk. Ezek az APC-k csak azokat a

pancreasból származó, autoreaktív T-sejteket késztették intenzív proliferációra,

amelyek a nem transzplantált (23. a ábra), vagy a csak BMC-kkel transzplantált

állatokból származtak (23. c ábra). Ezzel szemben az akár kizárólag MSC-kkel (23.

d ábra), vagy akár BMC-kkel együtt adott (23. b ábra) MSC-kkel transzplantált

állatok T-sejtjeinek proliferációja egészen csekély mértékű volt.

Amint azt az előzőekben bemutattuk az MSC-ket önmagukban adva nem

érhető el gyógyulás, tehát az MSC-knek köszönhető immunszuppresszió

szükséges, de önmagában nem elegendő a gyógyuláshoz. A két sejttípus együttes

adása hozza csak meg a kívánt eredményt a β-sejt funkció tartós helyreállásában és

az állatok diabetesből történő felgyógyulásbában. Emellett szól az is, hogy

Cyclosporin A (CsA) adagolásával (10mg/testsúly kg, a 10. 17. és a 19.napon),

mely erős immunszuppresszív szer, az MSC-k nem helyettesíthetők kísérleti

rendszerünkben.

67

22. ábra. Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata (Az STZ-kezelt

állatok pancreasában található β-sejt specifikus T-sejtek kimutatására szolgáló

kísérletek vázlata)

Az STZ-vel kezelt állatok lépéből, a pusztuló β-sejtekből felszabaduló saját

antigéneket bemutató adherens sejteket nyertünk ki. Ezek a sejtek felhasználhatóak

voltak a β-sejt specifikus, autoreaktív T lymphocyták proliferációjának kiváltására.

A proliferációt triciált timidin felvételének mérésével követhettük nyomon.

Rövidítések: STZ = streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC =

mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek), TBI = total body irradiation (egész test

besugárzás) APC = antigén presenting cell (antigén bemutató sejt)

C57/Bl/6

STZ kezelés

C57Bl/6

TBI 15. nap, 250 cGy

In vitro kultúra

BMC MSC

Transzplantáció a 15. napon

C57Bl/6

STZ kezelés

Lép APC-k (a 8. napon)

T-sejtek a pancreasból

15 Gy

3H-timidin

Autoreaktív T-sejtek proliferációja

68

23. ábra. Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ (magyarázat a

következő oldalon)

69

23. ábra. Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ

a: STZ-vel kezelt, de nem transzplantált állatok pancreasából származó T-sejtek

β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata

b: STZ-vel kezelt, majd BMC-vel és MSC-vel kotranszplantált állatok

pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata

c: STZ-vel kezelt, majd csak BMC-vel transzplantált állatok pancreasából

származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata

d: STZ-vel kezelt, majd csak MSC-vel transzplantált állatok pancreasából

származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata

Kontrollként olyan APC-ket használtunk melyek STZ-vel nem kezelt állatok lépéből

származtak.

Rövidítések: STZ= streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC =

mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek),

Azt is ellenőriztük, hogy a 22. ábrán látható módon kivitelezett

proliferációs vizsgálat során valóban antigén specifikus - azaz esetünkben β-sejt

specikus - sejtszaporodást váltottunk-e ki. Előfordulhatott volna ugyanis, hogy a T-

sejtek intenzív osztódása mögött csak valamilyen ismeretlen, antigén-független

mitogén hatás áll, hibás pozitív eredményt okozva.

Az STZ kezelt (cukorbeteg), vagy ovalbuminnal (OVA) kezelt (nem

cukorbeteg) egerekből származó T-sejteket olyan APC-kkel kevertük össze,

amelyek szintén STZ kezelt (cukorbeteg), vagy kezeletlen kontroll állatok lépéből

származtak. (2.táblázat)

Az autoimmun T-sejtek proliferációját csak a cukorbeteg egerekből

származó APC-k tudták kiváltani, míg a kontroll állatok APC-inek nem volt ilyen

hatása. Ha a kontroll APC-ket in vitro β-sejt kivonattal kezeltünk, akkor azok is

képessé váltak, az autoimmun β-sejt specikus T-sejtek aktiválására. Tehát az STZ-

vel kezelt állatok lépéből kivont APC-k éppúgy β-sejt specikus antigéneket

prezentálnak mint az in vitro β-sejt kivonattal kezeltek.

70

2. táblázat. Az STZ-kezelt állatokból nyert antigén bemutató sejtek (APC-k)

β-sejt specifikus antigéneket mutatnak be

A táblázatban feltüntetett forrásokból a tenyésztő tálca lyukaiba 5x104 APC-t és

2x105 T-sejtet tettünk, valamint a jelölt esetekben szolubilis antigéneket - pancreas

kivonatot, illetve ovalbumint (OVA) - is adtunk a tenyészethez. A 72 órás 37 Co-

on végzett inkubáció befejezése előtt 18 órával a tenyészetekhez 1 µCi 3H-timidint

adtunk. A sejtek learatása után az S fázison áthaladó sejtek DNS-ébe beépült 3H-

timidin relatív mennyiségét (cpm) folyadékszcintillátorban mértük.

APC forrás T-sejt forrás Hozzáadott

szolubilis

antigén

3H-timidin beépülés (cpm/tenyészet) átlagok±szórás n=3

- 3255 ± 344

Pancreas kivonat 8762 ± 744

STZ-kezelt egerek

OVA 3420 ± 320

- 598 ± 52

Pancreas kivonat 604 ± 59

STZ-kezelt

egerek

OVA-kezelt egerek

OVA 4472 ± 418

- 505 ± 33

Pancreas kivonat 7010 ± 698

STZ-kezelt egerek

OVA 511 ± 64

- 523 ± 69

Pancreas kivonat 544 ± 61

Kezeletlen

Egerek

OVA-kezelt egerek

OVA 8245 ± 780

71

5. Megbeszélés

A cukorbetegségről szóló első lejegyzett, több mint 3500 éves

beszámoló óta a vele kapcsolatos tudásunk nagyon sokat fejlődött. A különböző

diabetes típusok kialakulásának patomechanizmusáról, a szövődményekről és a

kezelés változatos lehetőségeiről vaskos tankönyveket írtak, írnak (Halmos és

Jermendy 2002). Ismereteink és terápiás lehetőségeink fejlődése elsősorban annak

köszönhető, hogy a korábban ritka betegség sajnos már százmilliókat érint

világszerte.

Az 1-es és a 2-es típusú diabetes mellitusos esetek száma is növekszik,

de lényegesen nagyobb arányban fordulnak elő a 2-es típusú cukorbetegségben

szenvedő betegek. A szövetek inzulinrezisztenciája és a β-sejtek csökkenő

inzulintermelő képessége glükóz intoleranciához vezet, ami már felismerhető

tüneteket és szövődményeket okoz. A betegek β-sejtjeiknek átlagosan a fele

eközben elpusztul. A fokozatosan kialakuló betegség során több mód és alkalom

kínálkozik a különböző életmódbeli változtatásokra, gyógyszeres kezelésekre,

végül az inzulinpótlásra. Amióta az inzulinpótlás lehetősége a rendelkezésünkre

áll, még a β-sejtek gyors és teljes pusztulásával járó, 1-es típusú cukorbetegség is

jól kezelhető. Többé nem halálos betegség, mint volt az 1920-as évekig.

Világos azonban, hogy a kezelés nem egyenlő a gyógyulással. A

leglelkiismeretesebb diéta, a legszakszerűbb gyógyszeres kezelés, a leggondosabb

inzulin-adagolás mellett is fenyegetnek - ritkán az akut, de főleg - a krónikus

szövődmények. Nem is beszélve arról, hogy mennyire megkeseríti a betegek életét

az állandó odafigyelés és az ismétlődő tűszúrások. Mind az 1-es, mind a 2-es

típusú cukorbetegség hátterében, végső soron, az inzulin-termelő β-sejtek

pusztulása áll. A kívülről adagolt inzulin nem képes annyira pontosan követni a

szervezet percről percre változó igényeit, mint ahogy azt a β-sejtek által

megvalósuló szabályozás a betegség kialakulása előtt lehetővé tette (Lowell és

Shulman 2005).

Kézenfekvő tehát, hogy ténylegesen gyógyító (kuratív) terápiát az

jelentene, ha valahogyan ezeket az elveszett sejteket „fel lehetne támasztani” a

szervezeten belül rendelkezésre álló sejtekből, vagy valamilyen idegen forrásból

72

vissza lehetne pótolni őket. Az első lehetőség, az endogén regeneráció

gyógyszeres serkentése, mely kétségkívül a legkíméletesebb megoldásnak tűnik,

sajnos még nem teljesen megoldott. Kívülről származó sejtek bevitelére viszont

több lehetőség is kínálkozik. A már embernél is alkalmazott módszerek a teljes

hasnyálmirigy- illetve a sziget-transzplantáció. Ezeknek az eljárásoknak azonban a

tömeges alkalmazása, elsősorban a donorhiány miatt lehetetlen, de ellene szólnak

az immunszuppresszív kezelés hátrányai is.

Az állatkísérletek illetve az emberi sziget-transzplantációk

megmutatták, hogy akkor is működőképesek maradnak a β-sejtek, ha nincsenek a

hasnyálmirigy állományába ágyazva. Állatkísérletekben jól működnek a graftok

akár vesetokba oltva, vagy bőr alá ültetve (Kroon és mtsai 2008). Embernél az

Edmonton-protokoll során alkalmazott eljárással a máj portális keringésébe

injektálva a szigeteket, azok megtapadnak a máj szövetében, és működőképesek

maradnak, noha nem korlátlan ideig (Merani és Shapiro 2006). Ha sikerülne tehát

kellő számú inzulin-termelő sejtet előállítani, akkor azokat máshova bejuttatva is

képesek lennének feladatuk ellátására. Sajnos maguk a β-sejtek in vitro nem

szaporíthatóak fel, ezért fordult a figyelem - ezen a téren is - a mind népszerűbb

őssejtterápiás lehetőségek felé. Mind az embrionális, mind a szöveti őssejtekkel

világszerte folynak olyan kísérletek, melyek célja az in vitro β-sejt előállításra

alkalmas differenciáltatási protokollok kifejlesztése (Jones és mtsai 2008).

Az embrionális őssejtekkel folytatott kísérletek során egyre

kifinomultabban igyekeznek a kutatók az embrionális/magzati történések

reprodukálására a tenyésztőedényben. Néhány kutatócsoport eredményei tényleg

figyelemreméltóak (D'Amour és mtsai 2006, Kroon és mtsai 2008), de még

senkinek sem sikerült teljes egészében lejátszani azt a folyamatot in vitro, amely a

pancreas organogenezise során elvezet egy pluripotens sejttől a végdifferenciált β-

sejtig. Nincs tehát egyelőre olyan protokoll, amely maradéktalanul és teljes

mértékben eldifferenciáltatná a sejteket, így kiküszöböletlen maradt a teratoma-

képzés veszélye. Emellett továbbra is fennállnak az ismert etikai problémák és

nyitottak az immunológiai kérdések (Gruen és Grabel 2006).

A felnőtt - vagy szöveti - őssejtek életünk végéig, mint embrionális

maradványok ott bujkálnak differenciálódott szöveti sejtjeink között (Ratajczak és

73

mtsai 2008). Ezek kinyerésével a beteg olyan saját sejtjeihez juthatnánk hozzá,

melyek, kellően plasztikusak lévén, elméletileg akár β-sejtekké is

differenciáltathatóak. Ezzel a megoldással megszűnnének az etikai aggályok,

megoldódna a donorhiány, elkerülhetővé válna a kilökődési reakció. Sokan keresik

a lehetőséget az ún. hasnyálmirigy őssejtek izolálására és felszaporítására,

amelyekből azután β-sejtek is előállíthatóak lennének (Seaberg és mtsai 2004).

Megjegyzendő, hogy a kinyerésüket célzó számos próbálkozás ellenére a

hasnyálmirigy őssejtek létezése máig vitatott (Yalniz és Pour 2005, Hao 2006).

Mások a csontvelő mesenchymális őssejtjeit (MSC-it) (Morisot és mtsai 2005)

vagy a máj sejtjeit (Zalzman és mtsai 2003) szeretnék β-sejt irányú

differenciálódásra kényszeríteni.

Kicsit más irányzatot képviselnek azok, akik azt feltételezik, hogy

egyes szöveti őssejtek - akár előzetes differenciáltatás nélkül beadva is - képesek a

sérült szöveteket közvetve (szolúbilis faktorok útján), vagy közvetlenül

(hominggal) megtalálni és regenerálni. Ezt az elméletet továbbgondolva jutottak

néhányan arra a következtetésre, hogy talán az lehet a fiziológiás regeneráció

alapja is, hogy sérüléskor az endogén őssejtek mobilizálódnak, a sérülés helyére

vándorolnak és ott transzdifferenciálódva a pótlandó sejtekké alakulnak (Ianus és

mtsai 2003). Feltételezések szerint a csontvelői őssejtek is képesek többféle szövet

regenerálására, adott esetben akár a Langerhans-szigetekére is. Ezt az elképzelést

látszik alátámasztani több arról szóló beszámoló, hogy a csontvelő-transzplantáció

képes gyógyítani, de legalábbis átmenetileg javítani a diabetes állatmodelljeinek

cukorbetegségét (Banerjee és mtai 2005). A mechanizmus egyelőre vitatott. Az

elméletek szerint a szigetek regenerációja megvalósulhat nem csak a csontvelői

sejtek transzdifferenciációja, de akár valamely ismeretlen faktor(ok) termelése (Li

és mtsai 2003), esetleg új kapillárisok kialakítása által is (Hess és mtsai 2003).

Kísérleteinkben mi is ez utóbbi kérdést vizsgáltuk, vagyis a csontvelői

sejtek hatását a diabetes lefolyására illetve ennek a hatásnak a mechanizmusát. Az

STZ-vel indukált 1-es típusú diabetesben szenvedő egereken vizsgáltuk a

csontvelő-transzplantáció, majd a csontvelői sejtek és in vitro felszaporított MSC-

k együttes transzplantációjának hatását. Eredményeink megvitatása a Célkitűzés c.

fejezetben szereplő pontok szerint következik:

74

1. Kis dózisban adott, többszöri STZ kezelés hatására kísérleti állataink –

nőstény C56Bl/6 egerek - vércukorszint értékei gyorsan emelkedésnek indultak,

ugyanakkor testsúlyuk és szérum inzulinszint értékeik lecsökkentek. Mindez arra

utal, hogy az inzulin-termelés fokozatos megszűnésével párhuzamosan a

Langerhans-szigetek funkciója gyorsan elveszett. A szövettani metszetek és a

rajtuk végzett immunhisztokémia feltárta a szigetek drasztikus méretbeli

csökkenését, degenerációját és az inzulin pozitív sejtek jelentős megfogyatkozását.

Funkcionális és morfológiai adatok alapján is elmondható tehát, hogy

az 1-es típusú diabetes állatmodelljét C57Bl/6 egereinken, kisdózisú

streptozotocin (STZ) ismételt adásával sikeresen kialakítottuk.

2. Akkor tekintettük az állatokat cukorbetegeknek, amikor vércukorszintjük 2

egymást követő napon elérte a 10 mmol/l értéket. Ez az STZ kezelés

megkezdésétől számított 14. és 15. napra esett, ezért a csontvelő-transzplantáció

ideális időpontját a 15. napban határoztuk meg. A legkisebb, de még hatásos

besugárzási dózisnak 250 cGy bizonyult. Ez egy relatíve alacsony szubletális

dózis, az állatok olyan mérsékelt károsítását jelenti, melyből spontán módon, teljes

mértékben képesek regenerálódni. Ha a fenti feltételek mellett az állatok 106

frissen szeparált csontvelői sejtet (BMC-t) kaptak, akkor ez a transzplantáció - az

irodalmi adatokkal részben megegyezően (Banerjee és mtsai 2005, Ianus és mtsai

2003) - valóban képes volt átmenetileg lelassítani a vércukorszint értékek

emelkedésének ütemét. Az állatok 10-14 nappal tovább éltek, mint nem

transzplantált társaik, de végül elhatalmasodott rajtuk is a betegség és hamarosan

elpusztultak.

Az állatok mérsékelt károsítását követő, 106 frissen szeparált csontvelői

magvas sejttel (BMC) történt transzplantáció tehát egyértelműen lelassította

az STZ-vel előidézett diabetes progresszióját. A beadott sejtek

feltételezhetően valamilyen regeneratív folyamat támogatása vagy előidézése

révén érték el hatásukat, de ez a hatás semmiképpen nem nevezhető

tartósnak. Elmondhatjuk tehát, hogy a csontvelői sejtek önmagukban nem

elegendőek a diabetes kezelésére.

75

3. A csontvelői sejtek közül különösen figyelemre méltóak a könnyen

szeparálható és plasztikus mesenchymális őssejtek (MSC-k). A szakirodalomban,

sőt már egyes betegségek szabadalmaztatott őssejt-terápiájában is egyre gyakrabban

kerülnek szóba, mint gyógyító sejtek. Mára már bizonyított ténnyé vált az a

megfigyelés is, miszerint az MSC-k immunszuppresszív tulajdonsággal bírnak.

Emellett az MSC-k nem immunogének, vagyis az immunrendszer számára

gyakorlatilag láthatatlanok, tehát egy későbbi klinikai felhasználáshoz könnyen

elérhető, donor-független, ideális sejtforrásként szolgálhatnak. Miután az STZ indukálta

diabetes az 1-es típusú, azaz autoimmun diabetes modellje, azt vártuk, hogy a

feldúsított MSC-kel kiegészített csontvelőtranszplantáció növeli majd a regeneráció

esélyeit az immunszuppresszió révén. De annak lehetőségét sem zártuk ki, hogy akár

transzdifferenciálódás útján pótolva a β-sejteket, vagy esetleg valamely később

azonosítandó szolúbilis faktor termelése által járulnak hozzá az endocrin pancreas

funkciójának helyreállításához.

Az egér csontvelőből kinyert MSC-ket in vitro felszaporítottuk és

karakterizáltuk. Plaszticitásukat adipocytává és osteoblasttá történt

differenciáltatásukkal igazoltuk.

Sejtfelszíni markereik, morfológiájuk és plaszticitásuk alapján elmondható,

hogy az általunk használt sejtek azonosak az International Society for Cellular

Therapy által 2006-ban definiált MSC-kkel (Dominici és mtsai 2006).

4. Amint kellően bizonyítottnak láttuk, hogy tenyészeteink valóban MSC

tenyészetek, felhasználtuk azokat transzplantációs kísérleteink kiegészítésére: BMC-k

mellett egyúttal MSC-ket is beadtunk az állatoknak. A cukorbeteg állatok

vércukorszintje és szérum inzulin koncentrációja a 15. napon, mérsékelt károsítást

követően beadott 5x105 - 106 BMC és 5x104 - 105 MSC hatására gyorsan visszatért

a normális szintre. A szövettani metszeteken egyértelműen látszik, hogy a

kotranszplantációs kezelés hatására regenerálódó Langerhans-szigetek mérete

megközelíti az egészséges pancreasban találhatókét. Immunhisztokémiával jól

detektálható módon újra megjelennek a működőképes, inzulin-termelő β-sejtek. A

gyógyult állatok glükóz tolerancia teszt eredményei azonosnak mondhatóak a

kezeletlen kontroll állatok eredményeivel. A kezelés sikerességét nem befolyásolta

76

az MSC-k genetikai háttere, ami az MSC-k szakirodalomban leírt (Bartholomew

2002, Uccelli 2006) hypoimmunogén voltát támasztja alá. A gyógyult állatok több

mint 16 hétig éltek inzulin-kezelés nélkül, tehát a gyógyulás teljesnek és

véglegesnek tekinthető.

Világosan kiderül azonban a bemutatott eredményekből, hogy sem a

BMC-k, sem az MSC-k önmagukban nem elegendőek az állatok gyógyulásához.

Ebből következik, hogy a keverékként beadott, de kétféle (előéletű)

transzplantátum sejtjeinek együttműködése szükséges a szigetek regenerációjához.

Ez ellentmond azoknak a korábbi eredményeknek, amelyek szerint az

STZ-vel előidézett diabetes gyógyítására csontvelői magvas sejtek önmagukban is

képesek (Banerjee és mtsai 2005). Továbbá azzal a tanulmánnyal sincs

összhangban, mely szerint csupán humán MSC-k adása megvédte a pusztulástól

NOD/scid egerek β-sejtjeit (Lee és mtsai 2006). Az ellentmondások részben akár a

különböző kísérleti elrendezésből is fakadhatnak.

Banerjee és munkatársai legalább 3 egymást követő BMC injekciót

találtak szükségesnek a sikeres kezeléshez (Banerjee és mtsai 2005), míg a mi

esetünkben egyetlen kotranszplantáció elegendő volt. Ismert, hogy maga a

csontvelő graft is tartalmaz néhány MSC-t: 1-10 MSC található 106 magvas

csontvelői sejt között. Nekünk ennél 10 000-szer több MSC-t kellett bejuttatnunk

a BMC-kkel egyidőben a gyógyulás eléréséhez. Bizonyos, hogy Banerjee és mtsai

3 egymást követő BMC transzplantációval sem tudtak ezt még csak megközelítő

számú MSC-t bejuttatni. Kérdés, hogy ők miért nem figyelték meg azt a – kezdeti

javulást követő, újbóli - visszaesést, ami nálunk jelentkezett, amikor csak BMC-

kkel transzplantáltunk.

Lee csoportja (Lee és mtsai 2006) nálunk lényegesen nagyobb számú

MSC-vel dolgozott, de frissen szeparált BMC-ket egyáltalán nem használtak. Ők

2,5x106 MSC-t juttattak a NOD/scid egerek szívének bal kamrájába a mellkasfalon

keresztül. Véleményük szerint a beadásnak ez a módja alkalmas a magas

sejtszámból adódó MSC-aggregáció okozta embólia kockázatának mérséklésére. A

mi kísérleteinkben a sejtek aggregálódása nem fenyegetett, mert maximum 2x105

MSC-t adtunk be, egyetlen injekcióban, a farokvénán keresztül. Ekkora sejtszám

mellett mi nem tapasztaltunk a betegség progressziójára gyakorolt hatást, bár a T-

77

sejt válasz gátlása kimutatható volt. Nem világos, hogy az MSC-k - Lee és

mtsainak eredményeiben leírt - protektív hatása csak a magas sejtszámnak

köszönhető, vagy a súlyosan immundeficiens és öröklődő diabetesben szenvedő

NOD/scid egerekben többé-kevésbé más mechanizmusok működnek, mint a

C57Bl/6 törzsben STZ-vel indukált diabetes esetében.

Az eredményeink tehát azt mutatják, hogy C57Bl/6 egerekben STZ-vel

előidézett diabetes legalább 5x105 szingén, csontvelői magvas sejt (BMC) és

legalább 5x104 szingén, szemiallogén vagy allogén, előzőleg tenyészetben

felszaporított mesenchymális őssejt (MSC) egyidejű adásával gyógyítható. A

gyógyító hatás eléréséhez a BMC-k és az MSC-k együttműködésére van

szükség, önmagában egyik sem bír tartós hatással.

5. Felvetődik a kérdés, hogy modellállatainkban milyen mechanizmussal

voltak képesek a csontvelői-eredetű sejtek a pancreatikus szövetek regenerációját

előidézni.

Vajon közvetlenül eltaláltak a sérülés helyére és betelepülve a befogadó

szervezet hasnyálmirigyébe újjáépítették a Langerhans-szigeteket, miközben

transzdifferenciálódás útján „egyszerűen” átvették az elpusztult sziget-sejtek

szerepét és helyreállították a szénhidrát homeosztázist? A mi eredményeink szerint

nem ez a lehetőség valósult meg. A regenerálódott hasnyálmirigyben sem Y

kromoszómát hordozó, sem EGFP+ donor eredetű, ugyanakkor inzulinra is pozitív

sejtet nem találtunk. Az új β-sejtek mindegyike recipiens eredetű volt. Ez Ianus és

munkatársai eredményeinek és elméletének (Ianus és mtsai 2003) ellentmondva,

arra utal, hogy a felnőttkori csontvelői eredetű sejtek differenciálódási képessége

már beszűkült annyira, hogy nem szolgálhatnak terápiásan, de feltehetőleg

fiziológiásan sem a β-sejtek pótlására.

Nemhogy az inzulin-termelő sejtek között, de sehol máshol sem a

pancreasban: sem az endocrin, sem az exocrin területeken nem volt egyetlen egy

kimutatható BMC vagy MSC sem a beadott sejtekből. Ez ellentmond Hess és

munkatársai elméletének, mely szerint a sérült pancreasba betelepülő donor-

eredetű sejtek, endothel markereket hordozó sejtekké alakulva, valamilyen rövid

hatótávolságú sejtkommunikációs kapcsolat útján segítik elő a recipiens sejtjeiből

78

bekövetkező regenerációt (Hess és mtsai 2003). Az elmélet alapja az endothel

sejteknek a későbbi endocrin sejtekkel való jól ismert szoros kapcsolata a pancreas

organogenezise során (Lammert és mtsai 2003). Eredményeink szerint a beadott

sejtek és a hasnyálmirigy sejtjei ezúttal nem kerültek - kimutatható számban ill.

tartósan - olyan közel egymáshoz, hogy egy ilyen paracrin vagy juxtacrin

kapcsolat állhasson a regeneráció hátterében.

A beadott sejtek sorsát tisztázandó, a nőstény állatok különböző szerveiből

származó metszeteken is elvégeztük az Y kromoszóma specifikus FISH analízist.

Zölden fluoreszkáló Y kromoszómát tartalmazó sejtekre azonban kizárólag a

csontvelőben találtunk. Ott ezek a sejtek átmeneti chimerizmust idéztek elő, mely

a transzplantációt követő 10. napon volt a legkifejezettebb (6-13%). A

csontvelőnek - a recipiens saját sejtjeiből történő - gyors regenerációjával

párhuzamosan a donor eredetű sejtek fokozatosan, mintegy 3 hét alatt teljesen

kiszorultak.

Li és munkatársai elgondolásainak jól megfeleltethetők az általunk

talált eredmények. Elméletük szerint a recipiens csontvelőbe betelepült sejtek

olyan ismeretlen szolúbilis faktorok útján képesek regenerációt előidézni, melyek

a keringés útján jutnak el a csontvelőből a sérült szövethez (Li és mtsai 2003).

Noha ezeknek a faktoroknak a mibenlétéről még nagyon keveset tudunk,

létezésükre több tanulmány enged következtetni. Izumida és munkatársai arról

számoltak be, hogy a transzplantált BMC-k hepatocyta növekedési faktor (HGF)

termelésük révén képesek támogatni az STZ-vel kezelt patkányok β-sejt

regenerációját (Izumida és munkatársai 2005).

Nem csak a beadott BMC-k, de nagyon valószínű, hogy az MSC-k is

termeltek olyan faktorokat, melyek szerepet játszhattak a szigetek

regenerációjának előidézésében. Ismert ugyanis, hogy az MSC-k bizonyos trofikus

hatások révén gátolni képesek a fibrózist és különböző citokinek termelése révén

serkentik az angiogenezist (Caplan és Dennis 2006). Ezeket az ismereteket számos

szívinfarktus (Bunnell 2005, Zimmet és Hare 2005), izületi porc és csontsérülés

(Caplan 2005, Horwitz és mtsai 1999), valamint stroke utáni (Bang 2005)

regenerációs területekről származó klinikai tanulmány is alátámasztja.

79

Az endocrin pancreasnak a Bevezetésben részletezett fiziológiásan is

működő regenerációs képességei (Bouwens 2006, Pasquali 2006)

elengedhetetlenek a graft által kiváltott, de a recipiens saját sejtjeiből megvalósuló

regenerációhoz is. Az azonban nem világos még, hogy vajon az újonnan

megjelenő inzulin-termelő sejtek a recipiensnek pontosan mely sejtjeiből

származnak. Mai ismereteink alapján, éppúgy lehetnek az STZ-kezelést túlélő

néhány β-sejt utódai (Dor 2006), mint egy más, nem is endocrin jellegű, hanem pl.

epitheliális sejt (Hao 2006) transzdifferenciálódásából létrejött sejt leszármazottai.

De az is elképzelhető, hogy keletkezésüket szöveti őssejtek proliferációja és

differenciálódása előzte meg (Bonner-Weir és Sharma 2002).

Egyértelmű tehát, hogy a kotranszplantációt követően megjelent új β-

sejtek recipiens eredetűek voltak. A donor BMC-k eltaláltak (homingoltak)

ugyan a recipiens csontvelőbe és ott átmenetileg chimerizmust idéztek elő, de

a hasnyálmirigy területén nem sikerült őket kimutatni. Feltételezhető, hogy a

BMC-k és az MSC-k olyan szolúbilis faktorokat termeltek, melyek

megindították a Langerhans-szigetek endogén regenerációját. Ezeknek a

faktoroknak a beazonosítása további vizsgálatokat igényel. Annak a

kérdésnek a megválaszolása, hogy a gyógyult állatok új β-sejtjei mely endogén

forrásból származhatnak, szintén a jövő feladata marad.

Az MSC-k másik lehetséges szerepe a degeneratív β-sejt pusztulás

megállításában nemrégiben felfedezett immunszuppresszív tulajdonságaikból

következik. In vitro és in vivo is többszörösen bizonyítást nyert, hogy ezek a

sejtek képesek gátolni mind az auto-, mind az alloantigének által kiváltott

immunválaszt (Bartholomew 2002, Uccelli 2006), sőt sikeresen alkalmazták őket

GVHD kezelésében (Le Blanc és mtsai 2004). Több autoimmun betegség

kezelésére folyik az MSC-k klinikai kipróbálása.

Bár az STZ-nek a β-sejteket célzottan pusztító hatása indítja el a

degeneratív folyamatokat, a pusztuló β-sejtekből felszabaduló saját antigének T-

sejt választ is indukálnak a kísérletes diabetes kialakulása során (Like és Rossini

1976, Paik és mtsai 1980). A kifejlődő autoimmun válasz pedig nem engedi

érvényre jutni többé az autoregeneratív folyamatokat. (Az autoimmun válasz

kialakulása miatt lehet az STZ indukálta diabetes a humán 1-es típusú diabetes

80

modellje.) A β-sejt specifikus immunválasz leállítása tehát, támogathatja mind a

még meglévő β-sejtek megmenekülését a pusztulástól, mind pedig az újonnan

létrejövő β-sejtek túlélését.

Mindezek tükrében érthetővé válik, hogy MSC-k jelenlétében, a mi

esetünkben is jelentősen csökkent a β-sejt specifikus autoimmun T-sejt válasz. T-

sejt proliferációt mérő kísérleteink eredményeiből kitűnik, hogy azoknak az STZ-

kezelt állatoknak a pancreasából hiányoznak a β-sejt specifikus T-sejtek, melyeket

MSC-kkel (illetve MSC-kkel is) kezeltünk. A kizárólag BMC-kkel kezelt állatok

pancreasában viszont még erőteljesebbnek mutatkozik a β-sejt specifikus T-sejtek

aktivitása, mint az egyáltalán nem transzplantált, de STZ-indukálta diabetesben

szenvedő egerekében. Ennek oka az lehet, hogy a BMC-k által kiváltott

regeneráció miatt az állatok tovább éltek, több idő volt az autoimmun válasz

kifejődésére és az újratermelődő β-sejtek miatt hosszabb ideig volt jelen a T-

sejteket odavonzó autoantigén is. A kizárólag MSC-kkel kezelt állatokban az

MSC-k hiába gátolták meg a T-sejtek aktivációját és osztódását, a betegséget már

nem voltak képesek megfékezni. Erre csak a kétféle graft együttműködése esetén

van lehetőség.

Korábbi vizsgálatokból úgy tűnik, hogy a különböző gyulladás-gátló

szerekkel végzett immunszuppresszió képes késleltetni vagy megakadályozni az 1-

es típusú diabetes kialakulását NOD egérben (Kodama és mtsai 2003). Mi is

megvizsgáltuk, hogy Cyclosporin A (CsA) adásával, tehát gyógyszeres

immunszuppresszióval elérhetünk-e cukorbeteg állatainknál hasonló sikereket. Azt

tapasztaltuk, hogy az MSC-k hatása nem helyettesíthető CsA-val. Ennek

hátterében az állhat, hogy az MSC-k gyulladáscsökkentő hatásuk mellett a

szövetregenerációs folyamatokban is részt vettek. Emellett a CsA komoly

mellékhatásai - úgy mint nephro- és hepatotoxicitása - is gátolhatták a

szövetregenerációt (Rezzani 2004).

Az MSC-knek a β-sejt pusztulás megakadályozásában, illetve az

endogén regeneráció elindításában betöltött szerepe tehát kettős: A BMC-

kkel együttműködve segítik a szövetregenerációt és egyidejűleg

immunszuppresszív hatásuk révén lehetővé teszik, hogy a kialakuló új β-

sejtek életben maradjanak.

81

6. Következtetések

1. Megállapítottuk, hogy szingén csontvelő graft (5x105 - 106 BMC/egér iv.) és

szingén, szemiallogén vagy allogén mesenchymális őssejtek (5x104 – 105 MSC/egér

iv.) egyidejű adásával a streptozotocin (STZ) indukálta 1-es típusú diabetes

gyógyítható. A kezelés hatására az addig súlyos hyperglycaemiás állapotban lévő,

roncsolt szigetekkel bíró egerek Langerhans-szigeteiben újra megjelennek az inzulin-

termelő sejtek és helyreáll a szénhidrát-anyagcsere. Önmagukban sem a BMC-k sem

pedig az MSC-k nem hatásosak. A siker eléréséhez a kétféle graft együttműködése

szükséges.

2. Mivel minden cukorbeteg (recipiens) állatunk nőstény volt, viszont a csontvelő-

graftokat és a mesenchymális őssejteket hím, illetve részben EGFP transzgenikus

egerekből izoláltuk, a beültetett donorsejtek sorsát követni tudtuk a recipiensek

szöveteiben. Így sikerült igazolnunk, hogy a hasnyálmirigy-szigetek regenerációja során

nem keletkeznek kettős - inzulinra (immunhisztokémia) és Y kromoszómára (in situ

FISH) vagy EGFP-re – egyaránt pozitív sejtek. A transzplantált csontvelői eredetű

sejtek tehát csak közvetett módon segítik a pancreas regenerációját, de ők maguk

nem transzdifferenciálódnak β-sejtekké.

3. Cukorbeteg és kontroll állataink hasnyálmirigyéből T-sejteket izoláltunk, amiket

olyan, ugyancsak STZ-vel kezelt állatok lépéből nyert adherens sejtekkel kevertünk

össze, amelyek felszínükön a méreg hatására elpusztuló β-sejtekből felszabaduló saját

antigéneket prezentálnak. Az ilyen kultúrákban két-három napos inkubálás után jól

mérhető az autoreaktív (azaz β-sejt specifikus) T lymphocyták osztódása (3H-timidin

felvétele). Megállapítottuk, hogy kísérleti állataink hasnyálmirigyében, a

cukorbetegség kialakulásával párhuzamosan, β-sejt specifikus, autoreaktív T-

sejtek is megjelennek. A csak BMC-kkel oltott cukorbeteg állatokban - mivel ezek az

egerek néhány héttel tovább élnek, mint nem transzplantált cukorbeteg társaik - a β-sejt

specifikus T-sejt válasz az állatok pusztulásáig erősödik. Egyértelmű tehát, hogy az

autoreaktív T-sejtek folyamatosan elpusztítják a BMC-transzplantáció hatására

képződő új β-sejteket és ezzel megakadályozzák a cukorbeteg állatok gyógyulását.

82

4. Ezzel szemben a BMC-kkel és MSC-kkel, vagy csak az utóbbiakkal transzplantált

egerek hasnyálmirigyében a T-sejt válasz elmaradt. Ebből arra következtetünk, hogy

két, párhuzamosan zajló, egymást erősítő folyamat vezetett az állatok

gyógyulásához. A grafttal bevitt MSC-k – a többi csontvelő-sejttel együttműködve

- részben a Langerhans-szigetek regenerációjának elindításában játszottak

szerepet. Másrészt – immunszuppresszív hatásuk révén – megakadályozták a β-

sejt specifikus T-sejt közvetítette immunválaszt, lehetővé téve az újonnan

keletkezett β-sejtek túlélését ebben a megváltozott immunológiai környezetben.

Végeredményben, ez a munka egy új terápiás protokoll lehetőségét

kínálja az 1-es típusú diabetes kezelésére. Szingén BMC-k és szingén,

szemiallogén, vagy akár allogén MSC-k egyidejű adása egyértelműen támogatja a

pancreatikus szövetregenerációt, képes helyreállítani a vércukorszintet és a szérum

inzulinszintet, tehát képes meggyógyítani és hosszú távú túléléshez segíteni az

STZ-vel indukált cukorbetegségben szenvedő egereket.

Az általunk itt kínált protokoll újdonságai és előnyei az eddig megjelentekhez

viszonyítva az alábbiak:

a) Az alkalmazott szubletális, alacsony dózisú besugárzás csak minimális

szövetkárosodást okoz, amiből spontán módon megtörténik a regeneráció.

b) Az egylépéses kotranszplantációs eljárás egyetlen intravénás injekcióval

kivitelezhető, anélkül, hogy a sejtek aggregációja miatt fellépő embólia

kockázatával kellene számolni.

c) A beadott MSC-k genetikai hovatartozása nem befolyásolja a

transzplantáció sikerességét, tehát nincs szükség választott donorra. Így a

sejtek felszaporítása már előre megoldható, azonnal bármely recipiens

számára rendelkezésre állhatnak.

d) Nincs szükség kiegészítő immunszuppresszió alkalmazására sem.

Eredményeink további – a gyógyulás pontos mechanizmusára vonatkozó -

kérdéseket is felvetnek. Tisztázandók még a kétféle graft együttműködésének

részletei. Milyen faktorokat termelnek a BMC-k és milyeneket az MSC-k? Milyen

83

jelátviteli mechanizmusokon keresztül és milyen sejtekre hatnak ezek a faktorok?

Milyen sejttípusból indul ki az endokrin pancreas regenerációja?

Fontos hangsúlyoznunk azt is, hogy egy esetleges humán terápiára

történő alkalmazás előtt számos további kérdés vár még tisztázása. Lényeges

különbségek lehetnek a humán autoimmun diabetesben és az egérben STZ-

indukálta diabetesben működő mechanizmusok között. Elképzelhető, hogy az

újonnan képződő β-sejtek védelmére emberben MSC-k többszöri adására lesz

szükség. Mielőtt az eljárást emberre is ki lehetne dolgozni, az egérnél nagyobb

testű, az emberhez evolúciós szempontból közelebb álló emlősökön végzett

további kísérletekre is szükség lenne.

84

7. Összefoglalás

Bevezetés: A diabetes mellitusban elpusztult β-sejtek pótlását célzó egyes tanulmányok

szerint a csontvelőben található sejtek serkentőleg hatnak a diabeteses állatok β-

sejtjeinek regenerációjára, más szakirodalmi adatok viszont cáfolják ezt. Célunk ezen

sejtek gyógyító hatásának közelebbi felderítése.

Módszerek: Nőstény, C57Bl/6 egereken, streptozotocinnal (STZ) előidézett

cukorbetegség szolgált az 1-es típusú diabetes modelljeként. A szubletálisan besugárzott

cukorbeteg egereknek frissen szeparált, ellenkező nemű egérből származó, szingén

csontvelői sejteket (bone marrow cell = BMC) és szingén vagy allogén mesenchymális

őssejteket (mesenchymal stromal/stem cell = MSC) juttattunk a keringésébe.

Eredmények: Megállapítottuk, hogy szingén BMC-k és szingén vagy allogén MSC-k

egyidejű adásával az STZ-indukált 1-es típusú diabetes gyógyítható. Egyetlen

kotranszplantációs injekció helyreállította a vércukor- és a szérum inzulinszintet,

egyidejűleg szövetregenerációt láttunk a pancreasban. Az újjáépült Langerhans-

szigetekben nem találtunk donor eredetű sejteket. A szövetregeneráció tehát nem

közvetlenül a graftból történt, hanem az egy endogén regenerációs folyamatot indított

el. Az MSC-kkel (is) transzplantált egerek hasnyálmirigyében az STZ-indukált diabetes

kialakulását egyébként kísérő autoreaktív T-sejt válasz elmaradt.

Következtetés: Két párhuzamos folyamat játszódik le a gyógyulás hátterében. A BMC-

k és az MSC-k megindítják a szervezet saját inzulin-termelő sejtjeinek regenerációját,

az MSC-k ugyanakkor gátolják az újonnan képződő β-sejtek elleni T-sejtes

immunválaszt. Ez a terápia, megfelelő módosításokkal humán klinikai alkalmazás

szempontjából is ígéretes.

85

Abstract

Introduction: Recent studies have suggested that the adult bone marrow harbours cells

that can influence β-cell regeneration in diabetic animals. Other reports, however,

contradicted these findings. Our aim was to elucidate this question.

Materials and Methods: To address this issue, we used an animal model with type 1

diabetes in which the disease was induced with streptozotocin (STZ) in female C57Bl/6

mice. Freshly prepared sex-mismatched bone marrow cells (BMC) and syngeneic or

allogeneic mesenchymal stem cells (MSC) were concomitantly administrated into

sublethally (250 cGy) irradiated diabetic mice.

Results: Blood glucose and serum insulin concentrations rapidly returned to normal

levels accompanied with efficient tissue regeneration after a single injection of a

mixture of 106 BMC/105 MSCs. Successful treatment of diabetic animals was not due to

the reconstitution of the damaged islet cells from the transplant since no donor-derived

β-cells were found in the recovered animals, indicating a graft initiated endogenous

repair process. Moreover, MSC injection caused the disappearance of β-cell-specific T

lymphocytes from diabetic pancreas.

Conclusion: We suggest that two aspects of this successful treatment regimen operate

parallelly in our model. First, BMCs and MSCs induce the regeneration of recipient-

derived pancreatic insulin-secreting cells. Second, MSCs inhibit T-cell-mediated

immune responses against newly formed β-cells. Thus, the application of this therapy in

human patients suffering from diabetes may be feasible.

86

8. Irodalomjegyzék

1. Aggarwal S, Pittenger MF. (2005) Human mesenchymal stem cells modulate

allogeneic immune cell responses. Blood, 105(4):1815-22.

2. Albera C, Polak JM, Janes S, Griffiths MJ, Alison MR, Wright NA,

Navaratnarasah S, Poulsom R, Jeffery R, Fisher C, Burke M, Bishop AE. (2005)

Repopulation of human pulmonary epithelium by bone marrow cells: a potential means to

promote repair. Tissue Eng, 11(7-8):1115-21.

3. Anjos-Afonso F, Siapati EK, Bonnet D. (2004) In vivo contribution of murine

mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions. J Cell

Sci, 117(Pt 23):5655-64.

4. Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, Tzukerman M.

(2001) Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes, 50(8):1691-1697.

5. Augello A, Tasso R, Negrini SM, Amateis A, Indiveri F, Cancedda R, Pennesi G.

(2005) Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by

activation of the programmed death 1 pathway. Eur J Immunol, 35(5):1482-90.

6. Azizi SA, Stokes D, Augelli BJ, DiGirolamo C, Prockop DJ.(1998) Engraftment

and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-

-similarities to astrocyte grafts. Proc Natl Acad Sci U S A, 95(7):3908-13.

7. Banerjee M, Kumar A, Bhonde RR. (2005) Reversal of experimental diabetes by

multiple bone marrow transplantation. Biochem Biophys Res Commun, 328(1):318-25.

8. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. (2005) Autologous mesenchymal stem cell

transplantation in stroke patients. Ann Neurol, 57(6):874-82.

9. Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, Ferrer K, McIntosh K, Patil S, Hardy

W, Devine S, Ucker D, Deans R, Moseley A, Hoffman R. (2002) Mesenchymal stem

cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.

Exp Hematol, 30(1):42-8.

10. Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, Wagner M, Roll U, St-Onge L, Wobus AM.

(2003) Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-

positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(3):998-

1003.

87

11. Bonner-Weir S, Sharma A. (2002) Pancreatic stem cells. J. Pathol, 197

(4):519−526

12. Bonner-Weir, S (2000) Perspective: Postnatal pancreatic cell growth.

Endocrinology, 2000, 141(6) 1926-1929

13. Bouwens L. (2006) Beta cell regeneration. Curr Diabetes Rev, 2(1):3-9.

14. Bunnell BA, Deng W, Robinson CM, Waldron PR, Bivalacqua TJ, Baber SR,

Hyman AL, Kadowitz PJ. (2005) Potential application for mesenchymal stem cells in the

treatment of cardiovascular diseases. Can J Physiol Pharmacol, 83(7):529-39.

15. Burt RK, Slavin S, Burns WH, Marmont AM. (2002) Induction of tolerance in

autoimmune diseases by hematopoietic stem cell transplantation: getting closer to a cure?

Blood, 99(3):768-84.

16. Butler AE, Janson J, Bonner-Weir S, Ritzel R, Rizza RA, Butler PC. (2003) Beta-

cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes,

52(1):102-10.

17. Caplan AI, Dennis JE. (2006) Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J

Cell Biochem, 98(5):1076-84.

18. Caplan AI. (2005) Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive

therapy in orthopedics. Tissue Eng, 11(7-8):1198-211.

19. Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. (2007) Concise review:

mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological

features, and potential for homing. Stem Cells, 25(11):2739-49.

20. Chen LB, Jiang XB, Yang L. (2004) Differentiation of rat marrow mesenchymal

stem cells into pancreatic islet beta-cells. World J Gastroenterol, 10(20):3016-20.

21. Choi JB, Uchino H, Azuma K, Iwashita N, Tanaka Y, Mochizuki H, Migita M,

Shimada T, Kawamori R, Watada H. (2003) Little evidence of transdifferentiation of

bone marrow-derived cells into pancreatic β cells. Diabetologia, 46(10): 1366–1374.

22. Choi Y, Ta M, Atouf F, Lumelsky N. (2004) Adult pancreas generates

multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells,

22(6):1070-84.

23. Conboy IM, Conboy MJ, Wagers AJ, Girma ER, Weissman IL, Rando TA.

(2005) Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic

environment. Nature, 433(7027):760-4.

88

24. da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. (2008) In Search of the in vivo

Identity of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, doi:10.1634/stemcells.2007-1122

25. da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. (2006) Mesenchymal stem

cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci, 119(Pt 11):2204-13.

26. D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG,

Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE.(2006) Production of pancreatic

hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol,

24(11):1392-401.

27. Deb KD, Sarda K.J (2008) Human embryonic stem cells: preclinical

perspectives. Transl Med., 6:7.

28. Deng W, Han Q, Liao L, You S, Deng H, Zhao RC. (2005) Effects of allogeneic

bone marrow-derived mesenchymal stem cells on T and B lymphocytes from BXSB

mice. DNA Cell Biol, 24(7):458-63.

29. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D,

Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. (2006) Minimal criteria for defining

multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy

position statement. Cytotherapy, 8(4):315-7.

30. Donath, MY, Halban PA. (2004) Decreased β-cell mass in diabetes: significance,

mechanisms and therapeutic implications. Diabetologia, 47: 581−589.

31. Dor Y, Melton DA. (2008) Facultative endocrine progenitor cells in the adult

pancreas. Cell, 132(2):183-4.

32. Dor Y.(2006) beta-Cell proliferation is the major source of new pancreatic beta

cells. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2(5):242-3.

33. Erices A, Conget P, Minguell JJ. (2000) Mesenchymal progenitor cells in human

umbilical cord blood. Br J Haematol, 109(1):235-42.

34. Ferber S, Halkin A, Cohen H, Ber I, Einav Y, Goldberg I, Barshack I, Seijffers R,

Kopolovic J, Kaiser N, Karasik A. (2000) Pancreatic and duodenal homeobox gene 1

induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced

hyperglycemia. Nature Med, 6(5):568−572.

35. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. (1987) Bone marrow

osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell

Tissue Kinet, 20(3):263-72.

89

36. Gao J, Dennis JE, Muzic RF, Lundberg M, Caplan AI. (2001) The dynamic in

vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells

Tissues Organs, 169(1):12-20.

37. Gao R, Ustinov J, Pulkkinen MA, Lundin K, Korsgren O, Otonkoski T. (2003)

Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation

in human adult pancreatic cell culture. Diabetes, 52(8):2007-15.

38. Georgia S, Bhushan A. (2004) Beta cell replication is the primary mechanism for

maintaining postnatal beta cell mass. J Clin Invest, 114(7):963-8.

39. Gerdoni E, Gallo B, Casazza S, Musio S, Bonanni I, Pedemonte E, Mantegazza

R, Frassoni F, Mancardi G, Pedotti R, Uccelli A. (2007) Mesenchymal stem cells

effectively modulate pathogenic immune response in experimental autoimmune

encephalomyelitis. Ann Neurol, 61(3):219-27.

40. Gerecht-Nir S, Itskovitz-Eldor J. (2004) The promise of human embryonic stem

cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 18(6):843-52.

41. Gruen L, Grabel L. (2006) Concise review: scientific and ethical roadblocks to

human embryonic stem cell therapy. Stem Cells, 24(10):2162-9.

42. Halban PA. (2004) Cellular sources of new pancreatic beta cells and therapeutic

implications for regenerative medicine. Nat Cell Biol, 6(11):1021-5.

43. Halmos T, Jermendy Gy. (szerk.), Diabetes mellitus elmélet és klinikum.

Medicina, Budapest, 2002: 381.-392, 406-408, 413-421, 478-488.

44. Hao E, Tyrberg B, Itkin-Ansari P, Lakey JR, Geron I, Monosov EZ, Barcova M,

Mercola M, Levine F. (2006) Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells

of the adult human pancreas. Nat Med, 12(3):310-6

45. Herzog EL, Chai L, Krause DS. (2003) Plasticity of marrow-derived stem cells.

Blood, 102(10):3483-93.

46. Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA, Bhatia

M. (2003) Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration. Nat

Biotechnol, 21(7):763-70.

47. Holst, J. J. (2004) Treatment of Type 2 diabetes mellitus with agonists of the

GLP-1 receptor or DPP-IV inhibitors. Expert Opin Emerg Drugs, 9(1):155-66.

48. Homo-Delarche F, Drexhage HA. (2004) Immune cells, pancreas development,

regeneration and type 1 diabetes. Trends Immunol, 25(5):222-229.

90

49. Hori Y, Rulifson IC, Tsai BC, Heit JJ, Cahoy JD, Kim SK. (2002) Growth

inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells.

Proc Natl Acad Sci U S A, 99(25):16105-10.

50. Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M,

Sussman M, Orchard P, Marx JC, Pyeritz RE, Brenner MK. (1999) Transplantability and

therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with

osteogenesis imperfecta. Nat Med, 5(3):309-13.

51. Horwitz MS, Ilic A, Fine C, Rodriguez E, Sarvetnick N. (2002) Presented antigen

from damaged pancreatic beta cells activates autoreactive T cells in virus-mediated

autoimmune diabetes. J Clin Invest, 109(1):79-87.

52. Hotamisligil GS. (2006) Inflammation and metabolic disorders. Nature,

444(7121):860-7.

53. Hug K. (2005) Sources of human embryos for stem cell research: ethical

problems and their possible solutions. Medicina (Kaunas), 41(12):1002-10.

54. Hwang WS, Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW,

Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS,

Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G.

(2005) Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts.

Science, 308(5729):1777-83. Visszavonva (!): Kennedy D. Science. 2006;

311(5759):335.

55. Ianus A, Holz GG, Theise ND, Hussain MA. (2003) In vivo derivation of

glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell

fusion. J. Clin. Invest, 111(6): 843–850.

56. Izumida Y, Aoki T, Yasuda D, Koizumi T, Suganuma C, Saito K, Murai N,

Shimizu Y, Hayashi K, Odaira M, Kusano T, Kushima M, Kusano M. (2005) Hepatocyte

growth factor is constitutively produced by donor-derived bone marrow cells and

promotes regeneration of pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun,

333(1):273-282

57. Jahr H, Bretzel RG. (2003) Insulin-positive cells in vitro generated from rat bone

marrow stromal cells. Transplant Proc, 35(6):2140-1.

58. Jones PM, Courtney ML, Burns CJ, Persaud SJ. (2008) Cell-based treatments for

diabetes. Drug Discov Today, doi: 10.1016/j.drudis.200806.014

91

59. Kahan BW, Jacobson LM, Hullett DA, Ochoada JM, Oberley TD, Lang KM,

Odorico JS. (2003) Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine

embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes,

52(8):2016-24.

60. Kania G, Blyszczuk P, Czyz J, Navarrete-Santos A, Wobus AM. (2003)

Differentiation of mouse embryonic stem cells into pancreatic and hepatic cells. Methods

Enzymol, 365:287-303.

61. Kertész Z, Vas V, Kiss J, Urbán VS, Pozsonyi E, Kozma A, Pálóczi K, Uher F.

(2006) In vitro expansion of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the

presence of immobilized Jagged-1 and early acting cytokines. Cell Biol Int, 30(5):401-5.

62. Kiesel U, Kolb H. (1982) Low-dose streptozotocin-induced autoimmune diabetes

is under the genetic control of the major histocompatibility complex in mice.

Diabetologia, 23(1):69-71.

63. Kim SH, Reaven GM. (2004) The metabolic syndrome: one step forward, two

steps back. Diab Vasc Dis Res, 1(2):68-75.

64. King KM, Rubin G. (2003) A history of diabetes: from antiquity to discovering

insulin. Br J Nurs., 12(18):1091-5.

65. Kodama S, Kühtreiber W, Fujimura S, Dale EA, Faustman DL. (2003) Islet

regeneration during the reversal of autoimmune diabetes in NOD mice. Science,

302(5648):1223-7.

66. Kovacic JC, Boehm M. (2008). Resident vascular progenitor cells: An emerging

role for non-terminally differentiated vessel-resident cells in vascular biology. Stem Cell

Res, doi: 10.1016/j.scr.2008.05.005

67. Krampera M, Pasini A, Pizzolo G, Cosmi L, Romagnani S, Annunziato F (2006)

Regenerative and immunomodulatory potential of mesenchymal stem cells.Curr Opin

Pharmacol, 6(4):435-41.

68. Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, Bang AG, Kelly OG, Eliazer S, Young H,

Richardson M, Smart NG, Cunningham J, Agulnick AD, D'Amour KA, Carpenter MK,

Baetge EE. (2008) Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells

generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol, 26(4):443-

52.

92

69. Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, Kouskoff V, Kennedy M, Woo S, Fehling

HJ, Keller G.(2004) Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in

culture. Development,131(7):1651-62.

70. Lakshmipathy U, Verfaillie C. (2005) Stem cell plasticity. Blood Rev, (1):29-38.

71. Lammert E, Cleaver O, Melton D. (2003) Role of endothelial cells in early

pancreas and liver development. Mech Dev, 120(1):59-64.

72. Larsen S. (1993) Diabetes mellitus secondary to chronic pancreatitis. Dan Med

Bull, 40(2):153-62.

73. Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, Götherström C, Hassan M, Uzunel M,

Ringdén O. (2004) Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party

haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 363(9419):1439-41.

74. Lechner A, Yang YG, Blacken RA, Wang L, Nolan AL, Habener JF. (2004) No

evidence for significant transdifferentiation of bone marrow into pancreatic β-cells in

vivo. Diabetes, 53(3): 616–623.

75. Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, Prockop DJ. (2006)

Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic

islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl Acad Sci U S A,

103(46):17438-43.

76. Li FX, Zhu JW, Tessem JS, Beilke J, Varella-Garcia M, Jensen J, Hogan CJ,

DeGregori J. (2003) The development of diabetes in E2f1/E2f2 mutant mice reveals

important roles for bone marrow-derived cells in preventing islet cell loss. Proc Natl

Acad Sci U S A, 100(22):12935-40.

77. Like AA, Rossini AA. (1976) Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new

model of diabetes mellitus. Science, 193(4251):415-7.

78. Lipshutz GS, Wilkinson AH. (2007) Pancreas-kidney and pancreas

transplantation for the treatment of diabetes mellitus. Endocrinol Metab Clin North Am,

36(4):1015-38.

79. Liu EH, Herold KC. (2000) Transplantation of the islets of Langerhans: new

hope for treatment of type 1 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab, 11(9):379-82.

80. Lowell BB, Shulman GI. (2005) Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes.

Science, 307(5708):384-7.

93

81. Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R. (2001)

Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to

pancreatic islets. Science, 292(5520):1389-94.

82. Merani S, Shapiro AM. (2006) Current status of pancreatic islet transplantation.

Clin Sci (Lond), 110(6):611-25

83. Miyazaki, S., Yamato, E., Miyazaki, J.(2003) Regulated expression of pdx-1

promotes in vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stem cells.

Diabetes, 53(4):1030-7.

84. Moriscot C, de Fraipont F, Richard MJ, Marchand M, Savatier P, Bosco D,

Favrot M, Benhamou PY. (2005) Human bone marrow mesenchymal stem cells can

express insulin and key transcription factors of the endocrine pancreas developmental

pathway upon genetic and/or microenvironmental manipulation in vitro. Stem Cells,

23(4):594-603.

85. Nanji SA, Shapiro AM. (2004) Islet transplantation in patients with diabetes

mellitus: choice of immunosuppression. BioDrugs, 18(5):315-28.

86. Narendran P, Estella E, Fourlanos S. (2005) Immunology of type 1 diabetes.

QJM, 98(8):547-56.

87. Oh SH, Muzzonigro TM, Bae SH, LaPlante JM, Hatch HM, Petersen BE. (2004)

Adult bone marrow-derived cells trans-differentiating into insulin-producing cells for the

treatment of type I diabetes. Lab Invest, 84(5):607-17.

88. Paik SG, Fleischer N, Shin SI. (1980) Insulin-dependent diabetes mellitus

induced by subdiabetogenic doses of streptozotocin: obligatory role of cell-mediated

autoimmune processes. Proc Natl Acad Sci U S A, 77(10):6129-33.

89. Pasquali L, Fan Y, Trucco M, Ringquist S. (2006) Rehabilitation of adaptive

immunity and regeneration of beta cells. Trends Biotechnol, 24(11):516-22.

90. Peister A, Mellad JA, Larson BL, Hall BM, Gibson LF, Prockop DJ. (2004)

Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice

vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential. Blood,

103(5):1662-8.

91. Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, Mars WM, Sullivan AK, Murase N,

Boggs SS, Greenberger JS, Goff JP. (1999) Bone marrow as a potential source of hepatic

oval cells. Science, 284(5417):1168-70.

94

92. Pierdomenico L, Bonsi L, Calvitti M, Rondelli D, Arpinati M, Chirumbolo G,

Becchetti E, Marchionni C, Alviano F, Fossati V, Staffolani N, Franchina M, Grossi A,

Bagnara GP. (2005) Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive

activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation, 80(6):836-42.

93. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD,

Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. (1999) Multilineage potential of

adult human mesenchymal stem cells. Science, 284(5411):143-7.

94. Quesenberry PJ, Dooner G, Colvin G, Abedi M. (2005) Stem cell biology and the

plasticity polemic. Exp Hematol, 33(4):389-94.

95. Rajagopal J, Anderson WJ, Kume S, Martinez OI, Melton DA. (2003) Insulin

staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science, 299(5605):363.

96. Raskin P, Clements RS Jr. (1991) The use of human insulin derived from baker's

yeast by recombinant DNA technology. Clin Ther, 13(5):569-78.

97. Rasmusson I. (2006) Immune modulation by mesenchymal stem cells. Exp Cell

Res, 312(12):2169-79.

98. Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Machalinski B, Ratajczak J, Kucia M. (2008)

Very Small Embryonic-Like (VSEL) Stem Cells: Purification from Adult Organs,

Characterization, and Biological Significance. Cell Rev, 4(2):89-99.

99. Rayat GR, Rajotte RV, Korbutt GS. (1999) Potential application of neonatal

porcine islets as treatment for type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci, 875:175-88.

100. Rezzani R. (2004) cyclosporin A and adverse effects on organs:histochemical

studies. Prog Histochem Cytochem, 39(2) 85-128

101. Rieger K, Marinets O, Fietz T, Körper S, Sommer D, Mücke C, Reufi B, Blau

WI, Thiel E, Knauf WU. (2005) Mesenchymal stem cells remain of host origin even a

long time after allogeneic peripheral blood stem cell or bone marrow transplantation. Exp

Hematol, 33(5):605-11.

102. Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR,

Shapiro AM. (2005) Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes,

54(7):2060-9.

103. Sanchez-Ramos JR. (2002) Neural cells derived from adult bone marrow and

umbilical cord blood. J Neurosci Res, 69(6):880-93.

95

104. Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, Asghar Z, Wheeler MB,

Korbutt G, van der Kooy D. (2004) Clonal identification of multipotent precursors from

adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology,

22(9):1115 – 1124.

105. Segev H, Fishman B, Ziskind A, Shulman M, Itskovitz-Eldor J. (2004)

Differentiation of human embryonic stem cells into insulin producing-clusters. Stem

Cells, 22(3):265-74

106. Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman

NM, Rajotte RV. (2000) Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes

mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med,

343(4):230-8.

107. Sherry NA, Kushner JA, Glandt M, Kitamura T, Brillantes AM, Herold

KC.(2006) Effects of autoimmunity and immune therapy on beta-cell turnover in type 1

diabetes. Diabetes, 55(12):3238-45.

108. Shi Y, Hou L, Tang F, Jiang W, Wang P, Ding M, Deng H.(2005) Inducing

embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three-step

approach with activin A and all-trans retinoic acid. Stem Cells, 23(5):656-62.

109. Sipione S, Eshpeter A, Lyon JG, Korbutt GS, Bleackley RC. (2004) Insulin

expressing cells from differentiated embryonic stem cells are not beta cells. Diabetologia,

47(3):499-508.

110. Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H. (2004) Prospective isolation of multipotent

pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes, 53(8):2143-52

111. Tamás Gy. Insulinkezelés. In: Halmos T., Jermendy Gy. (szerk.), Diabetes

mellitus elmélet és klinikum. Medicina, Budapest, 2002: 305.-332.

112. Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, Xia CQ, Litherland SA, Atkinson MA, Yang

LJ. (2004) In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from

murine bone marrow. Diabetes, 53(7):1721-32.

113. Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. (2006) Immunoregulatory function of

mesenchymal stem cells. Eur J Immunol, 36(10):2566-73.

114. Verfaillie CM (2002) Adult stem cells: assessing the case for pluripotency.

Trends in Cell Biology, 12(11):502-508

96

115. Wajchenberg BL. (2007) Beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical

treatment. Endocr Rev, 28(2):187-218.

116. Winkler G. A diabetes mellitus diagnózisa, In: Halmos T., Jermendy Gy. (szerk.),

Diabetes mellitus elmélet és klinikum. Medicina, Budapest, 2002: 43.-44.

117. Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. (2000) Adult rat and human

bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 61(4):364-70.

118. Yalniz M, Pour PM. (2005) Are there any stem cells in the pancreas? Pancreas,

31(2):108-18.

119. Yang L, Li S, Hatch H, Ahrens K, Cornelius JG, Petersen BE, Peck AB. (2002) In

vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone-

producing cells. PNAS, 99(12):8078-8083

120. Zalzman M, Gupta S, Giri RK, Berkovich I, Sappal BS, Karnieli O, Zern MA,

Fleischer N, Efrat S. (2003) Reversal of hyperglycemia in mice by using human

expandable insulin-producing cells differentiated from fetal liver progenitor cells. Proc

Natl Acad Sci USA, 100 (12): 7253−7258.

121. Zannettino AC, Paton S, Arthur A, Khor F, Itescu S, Gimble JM, Gronthos S.

(2008) Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular

phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol, 214(2):413-21.

122. Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, Benvenuto F, Bonanni I, Gerdoni E, Giunti

D, Ceravolo A, Cazzanti F, Frassoni F, Mancardi G, Uccelli A. (2005) Mesenchymal

stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell

anergy. Blood, 106(5):1755-61.

123. Zaret KS. (2008) Genetic programming of liver and pancreas progenitors: lessons

for stem-cell differentiation. Nat Rev Genet, 9(5):329-40.

124. Zhang L, Hu J, Hong TP, Liu YN, Wu YH, Li LS. (2005) Monoclonal side

population progenitors isolated from human fetal pancreas. Biochem Biophys Res

Commun, 333(2):603-608.

125. Zimmet JM, Hare JM. (2005) Emerging role for bone marrow derived

mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy. Basic Res Cardiol,

100(6):471-81.

97

126. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz

HP, Hedrick MH. (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for

cell-based therapies. Tissue Eng, (2):211-28.

98

9. Publikációk jegyzéke

A disszertációhoz kapcsolódó közlemények:

Folyóirat cikkek:

1. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Vas Virág, Kovács János, Uher Ferenc. (2006)

A diabetes mellitus őssejtterápiája: eredmények, lehetőségek és kérdőjelek.

Orvosi Hetilap, 147:791-797.

2. Zsuzsanna Kertész, Virág Vas, Judit Kiss, Veronika S. Urbán, Éva Pozsonyi,

András Kozma, Katalin Pálóczi, Ferenc Uher. (2006) In vitro expansion of long-

term repopulating hematopoetic stem cells in the presence of immobilized

Jagged-1 and early acting cytokines. Cell biology International, 30: 401-405.

(IF=1.363)

3. Veronika S. Urbán, Judit Kiss, János Kovács, Elen Gócza, Virág Vas, Éva

Monostori, Ferenc Uher. (2008) Mesenchymal Stem Cells Cooperate with Bone

Marrow Cells in Therapy of Diabetes. Stem Cells, 26: 244-253. (IF=7.531)

4. Kiss Judit, Urbán S. Veronika, Dudics Valéria, VasVirág, Uher Ferenc (2008)

A mesenchymális őssejtek és az immunrendszer – immunszuppresszió

gyógyszerek nélkül? Orvosi Hetilap, 149: 339-346.

Poszterek és előadások:

1. Kiss Judit, Vas Virág, Urbán S. Veronika, Monostori Éva, Uher Ferenc: A

galektin-1 gátolja a vérképző ős- és elődsejtek ciklofoszfamid és

granulocytakolónia-stimuláló faktor indukált mobilizációját. MIT XXXV.

Vándorgyűlése, Sopron, 2005 (poszter), Magy Immunol 4:23.

2. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Kovács János, Monostori Éva, Uher Ferenc:

A streptozotocin indukált 1-es típusú diabetes gyógyítható szingén

csontvelősejtek és in vitro kultúrában tenyésztett allogén mesenchymalis

őssejtek egyidejű transzplantációjával. MIT XXXV. Vándorgyűlése,

Sopron, 2005 (poszter), Magy Immunol 4:42.

99

3. Uher Ferenc, Kiss Judit, Urbán S. Veronika, és Vas Virág: Regeneratív

medicína és őssejtterápia: eredmények, lehetőségek és kérdőjelek. OGYK,

Intézeti Tudományos Nap, 2005 (előadás)

4. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Kovács János, Uher Ferenc: A

streptozotocin indukált 1-es típusú diabetes őssejtterápiája. OGYK, Intézeti

Tudományos Nap, 2006 (előadás)

5. Urbán S. Veronika, Kovács János, Kiss Judit, Vas Virág, Gócza Elen,

Monostori Éva, Uher Ferenc: Streptozotocin indukált (1-es típusú) diabetes

őssejtterápiája I. A modell. XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok,

Balatonfüred, 2007 (előadás)

6. Uher Ferenc, Kovács János, Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Gócza Elen,

Monostori Éva, Vas Virág: Streptozotocin indukált (1-es típusú) diabetes

őssejtterápiája II. A mechanizmus. XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok,

Balatonfüred, 2007 (előadás)

7. Kiss Judit, Nagy György, Kovács János, Urbán S. Veronika, Andrikovics

Hajnalka, Uher Ferenc: Őssejt plaszticitás és mitokondrium biogenezis.

XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007 (előadás)

8. Urbán VS, Kiss J, Kovács J, Vas V, Monostori É, Uher F: Cooperativity

between bone marrow cells and culture-expanded mesenchymal stem cell

during reversal of type-1 diabetes. International Society of Haematology

Congress of the European and African Division, Budapest, 2007 (poszter),

Blood Rev 21 (Suppl 1):S98 (No. 039) (IF=5.756)

9. Urbán V.S, Kiss J, Kovács J, Vas V, Monostori É, Uher F: Cooperativity

between bone marrow cells and culture-expanded mesenchymal stem cells

during reversal of type-1 diabetes. Magyar Őssejtkutatás Szimpózium

(ESTOOL), Budapest, 2008 (poszter)

10. Hegyi B, Sági B, Kiss J, Urbán V.S, Uher F: Phenotype, differentiation

potential and immunomodulatory activity of mesenchymal stromal cells

isolated from diverse mouse tissues. Magyar Őssejtkutatás Szimpózium

(ESTOOL), Budapest, 2008 (poszter)

100

A disszertációtól független közlemények:

1. Suhajdáné Urbán Veronika. Általános szövettan. In: Polgár Veronika (szerk.):

Szövettani alapismeretek (főiskolai tankönyv – S.E. E.F.K.) Budapest, 2003: 9-55

2. Mikala Gábor, Urbán S.Veronika, Masszi Tamás. (2007) A biszfoszfonátok

myeloma-ellenes hatásai. Pathology Oncology Research. 13 (S1): 24-32.

3. Suhajdáné Urbán Veronika. Az eukarióta sejt szerkezete és működése. In: Polgár

Veronika (szerk.) Alkalmazott biológia (főiskolai tankönyv – S.E. E.T.K.)

Budapest, 2008: 46-99.

4. Suhajdáné Urbán Veronika. A molekuláris genetika alapjai. In: Polgár Veronika

(szerk.) Alkalmazott biológia (főiskolai tankönyv – S.E. E.T.K.) Budapest, 2008:

249-260.

101

10. Köszönetnyilvánítás

Megköszönöm témavezetőmnek, Dr. Prof. Habil. Uher Ferencnek (Országos

Vérellátó Szolgálat) hogy lehetővé tette, hogy a vezetése alatt álló Őssejt-biológia

Osztályon dolgozhassak. Köszönet a szakmai irányításért, és a munkámhoz adott

segítségért.

Köszönöm Dr. Vas Virágnak és Kiss Juditnak – akik velem egyidejűleg

szintén PhD hallgatóként az Őssejt-biológia Osztályon dolgoztak - a sikeres

együttműködést és azt, hogy tudományos tapasztalataikat segítőkészen megosztották

velem.

Külön köszönet Ullrich Olgának és Renner Máriának az Őssejt-biológia

Osztály asszisztenseinek mindig precíz munkájukért.

A tudományos együttműködésért és önzetlen szakmai segítségért köszönettel tartozom:

Dr. Monostori Évának (MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai intézet)

Dr. Kovács Jánosnak és asszisztensének Sipos Saroltának (ELTE TTK Anatómiai,

Sejt és Fejlődésbiológiai Tanszék)

Dr. Gaál Dezsőnek (Országos Onkológiai Intézet Kísérletes Farmakológiai Osztály)

Dr. Gócza Elennek (MBK, Állatbiológiai Intézet, Gödöllő)

Köszönet a Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Tudományos

Bizottságának, hogy munkám eszközigényéhez hozzájárult.

Ez a munka nem jöhetett volna létre a NKTH (OMFB-00541/2004) támogatása nélkül.