日皮会誌:92 (8), 865-869, 1982 (昭57）

8－メトキシソラーレンとリボフラビン結合蛋白の

　　　　　　　結合様式について

志賀

志賀

暁子

　潔＊

松本

二科

　　　　　　　　　　　要　　旨

　リボフラビン結合蛋白（ＲＢＰ）と8－メトキツソラーレ

ン（8-ＭＯＰ）の相互作用を分光学的方法により検討し

た.

　ＲＢＰと8-MOPは１：１の割合で非共有結合的（可

逆的）に結合し，その解離定数は6,7×lO-'Mであっ

た. 8-MOP の 存在はＲＢＰとビタミンＢ，（ルミフラ

ビン）の結合に影響を与える．即ち8-ＭＯＰはRI!Ｐに

結合したルミフラピソ（Lf）の解離を促進させる．また

同様にLfは8-MOPのＲＢＰからの解離を促進する．

　これらの研究は分光学的に行えるので極めて精度よ

く，かつ短時間で測定することが可能であり，従ってこ

の反応系は8-MOP一蛋白相互作用研究のための良いモデ

ル系であると考えられる．

　以上のモデル実験に基き, 8-MOPの生体内移送につ

いて考察した　　　　・

　　　　　　　　　　　はじめに．

　8-MOPはその光増感作用を利用して尋常性白斑，乾

癖および菌状息肉腫等の治療に用いられる薬剤であり，

蛋白質との光化学的結合の機序についてはすでに報告が

ある1).経口的に投与された8-MOPが目的組織にどの

ようにして運ばれるかについては未だその詳細は明らか

でないが，投与された8-MOPが光照射に先だち血液内

蛋白と結合一解離する過程かその重要な部分をなしてい

名古屋保健衛生大学医学部皮膚科（主任　上田　宏

　教授）

　＊岡崎国立共同研究機構生理学研究所

　　Akiko Shiga, Syuichi Matsumoto, Hiroshi Ueda,

　　Kiyoshi Shiga, Yasuzo Nishina, Hiroshi Watari :

　　Ａmodel study of the transportation mechanism

　　of 8-methoxypsoraIen

昭和57年４月20日受理

別刷請求先:（〒470―11)愛知県豊明市沓掛町田

　楽ヶ窪1―98　名古屋保健衛生大学医学部皮膚科

　学教室　志賀　暁子

修一

安三＊

上田

亘

宏

弘＊

ることは十分に予想される.

　8-MOPを結合する蛋白として血清アルブミンが存在

することは既に指摘されているか2），本研究ではアルブ

ミソ以外にも特異的に8-MOPを結合する蛋白（ＲＢＰ）

が存在すること，および8-ＭＯＰとビタミ･ソＢzはRBP

に互いに措抗的に結合することを報告する．

　　　　　　　　　　材料と方法

　ＲＢＰは二科の方法により鶏卵白より精製した3）.本

法はアガロースにリボフラビン誘導体を固定したカラム

を用いるものであり（アフィニティークロマトグラフィ

ー），このようにして得られたＲＢＰはSDS-ポリアクリ

ルアミド電気泳動により純粋であることを確認してい

る．

　ビタミソB2の一種であるルミフラビン（Lf）は大阪

市立大学の松井邦夫教授より贈られた，その他の試薬は

半井化学薬品より購入した．

　吸収スペクトルは日立557二波長分光光度計により，

蛍光スペクトルは島津Rf-500蛍光分光光度計により測

定した．試料セルは光路長１ｃｍの石英セルを用いた．

　すべての測定は25°C, O.IMリソ酸緩衝液(pH7.0)

中で行づた．

　　　　　　　　　　　結　　果

　　（Ｌ）吸収スペクトルによる8-MOPとＲＢＰの結

合様式の解析

　8-MOPがＲＢＰと結合するか否かは吸収スペクト

ノ吋を測定することにより判定できる．図１にはRBP,

8-MOPおよび両者の混合物のスペクトルが示されて

いる. 8-MOP自身のスベクトルと両者混合した試料

のスペクトルは明らかに異っている．混合物の吸光度は

8-MOPのものに比べ350nm周辺では高い吸光度を，

310nm周辺では低い吸光度を示す．一方この波長領域

ではＲＢＰ自身の吸光度は無視できるので（図１），こ

れらの吸収スペクトルの変化は8-MOPとＲＢＰが結合

し, 8-MOPの電子状態に変化か生じたことを示す．こ

866

≪

志賀　暁子ほか

　　　　　　　　　　　　　λnm

図L　8-MOP, RBPおよび混合物の吸収スペクトル

　　CD 8-MOP (3.1×10゛5M）

　　C2) RBP （ 5,7×10-5M）

　（3）8-ＭＯＰ（3.1XIO-5M）十RBP ( 5.7×

　　　　10-5M）

　横軸は波長，縦軸は吸光度を示す．

≪４

［add RBPコ/［8-MOPコ

　　　●゛0　　　　　　　　5.

　　　　　　　　　　Cadd RBPｺxiO^M

図３　吸光度変化を利用した8-ＭＯＰのＲＢＰによ

　る滴定曲線. 8-MOP (3 ×10-5M）

　　横軸（下）は加えたＲＢＰの濃度，横軸（上）

　は加えたＲＢＰの濃度と8-MOPの濃度の比．

　　縦軸は吸光度変化丿図中332nmと374nmは

　測定に用いた波長．ダ

の吸収スペクトルの変化は差スペクリレ法(複合体の吸

光度－8-ＭＯＰの吸光度)により拡大して観測ができる

　(図２)．これによれば330nmと372nm周辺に二つのピ

ークを示す変化がみられ, RBPの増加とともに複合体

形成が増加している．これを利用して8-MOPとRBP

の結合に関する滴定曲線を得ることが可能である．図３

には332nmと374nmの波長で得られた滴定曲線が示さ

れている．両者においてＲＢＰ‘の増加に伴い，ほぽ吸

光度が直線的に増大し, RBPと8-MOPの濃度がほぼ

≪

可

０

　　　　300　　一一　　　350　　　　　　400

　　　　　　　　　　　　λｎｍ

図2　8-MOP-RBP複合体と8-ＭＯＰとの差吸収

　スペクトル

　　8-MOPの吸収を基準とし複合体形成に伴う吸

　収変化を示すRBP自身の吸収はこの領域にな

　い．図中の印は吸光度差0.01を示す.

　　（1）基準線，試料室と標準室に3.1×10-5Mの

　　　　8-MOP.

　　(2) (0の試料室に1.2×10-５ＭＲＢＰが添加さ

　　　　れている.

　　(3) (1)の試料室に7.9×10-５Ｍ Ｏ RBP が加

　　　　えられている．

Ｉ：１になるところでもはや吸光度の変化がなくなる

　（この時点で全ての8-ＭＯＰはＲＢＰにより飽和された

ことになる）．このことはＲＢＰと8-MOPは１ｚｌの

割合で結合することを示す．また8-ＭＯＰとＲＢＰ複合

体をO.IM酢酸アソモニューム緩衡液(pH4.3, 5°Ｃ）

で透析することにより8-MOPを除去できる．このこと

より8-ＭＯＰとＲＢＰの結合は非共有結合によるものと

考えられる．

　（２）蛍光スペクトルによる８･ＭＯＰとＲＢＰの結合

様式の解析

　図4－（i）に8-ＭＯＰの蛍光スペクトル(350nm励

起）を示す. 8-MOP に ＲＢＰを加えるとそのスペクト

ルは大きく変化する（図4－（2））.ＲＢＰ自身は350nm

に吸収を示さず，この波長での励起では蛍光を示さな

い．従ってこのスペクトルの変化は両者の結合によるも

のであり, (1)でめ結論と一致する．蛍光スペクトルを

利用すれば，やはり両者の結合の滴定曲線が得られる

　（図5). RBPの増加とともに蛍光強度は直線的に減少

し，両者の濃度がほぼ１：Ｉになるところで飽和してい

8－タトキシソラーレソとリボフラビン結合蛋白の結合様式について

（Ｅｃｏｌ・Ｅｕｏｓｅ)ｄ

[add RBP]／【８

　　１

　　　　　　　　　　　　χΓvn

図４　8-MOPおよび8-MOP, RBP混合物の蛍光

　スペクトル.　　　　　　　，

　　(1) 8-MOP ( 8.6×10-6M）

　　(2) 8-MOP (8.6×10‘6M）　十　RBP

　　　　　(2.8×10’5M）励起光は350nmであり，

　　　　　この条件ではＲＢrは蛍光を示さない．

　　　　横軸は波長，縦軸は蛍光強度（単位は任

　　　　　意）．　＼

（Ｅｃｏｉｇ*ｕｊｕｏｓｅ）ｄ

Cadd ＲＢＰｺｘii）5［Ｍコ

図６　蛍光による8-MOPのＲＢＰによる滴定曲

　線．

　　図５と同じ（但8-MOP,RBPの濃度が異る）.

　8-MOP ( 8.6xlO"'M)

る．このことからも両者がｌ：１で結合していることが

示されている．

以上より反応式は次のように書かれる

　8-MOP+RBP^=！8-MOP 一RBP

　・（畿ｎ際…（Ａ）

　ここで8-ＭＯＰ一ＲＢＰは両者の複合体を示し, Kdmは

解離定数である．又Ｏはその分子種の濃度を示す.

　KI)･・を求めるには各分子種の濃度を滴定曲線より求

める必要があるが，図３，図５よりそれを求めるのはや

-MOP］

　　２

3　　4　　5

【:。iddRBPｺｘl♂Ｍ

867

図５　蛍光を利用した8-MOPのＲＢＰによる滴定

　曲線.

　　8･ＭＯＰ（2､7×10’5M）

　　横軸（下）は加えたＲＢＰの濃度、横軸（上）

　は加えたＲＢＰと8-MOPの濃度比．

　縦軸は蛍光強度（任意単位）.　　、

　350ninで励起し、510nmでの蛍光を測定．

咲

４

0

｡

λｎｍ

　　　　　　　　　　　　　　　λnm

図７　ルｉフラビソ(Lf), LfとＲＢＰの混合物お

　よびLf, RBP, 8-MOPの混合物の吸収スペクト

　フレ．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　．

　　（ａ）実線, Lf（ 3.7×10-６Ｍ）

　　　　　破線. Lf ( 3.7×10-6M）十RBP ( 3.1×

　　　　　10-６Ｍ）

　（b）実線, Lf ( 3.7×10-6M）

　　　　　破線. Lf ( 3.7×10-6M）十RBP ( 3.1×

　　　　　10-6M）＋8-ＭＯＰ（1.4×10~'M)

　　他は図１と同じ．

868

１

志賀　暁子ほか

図8　u, uとＲＢＰおよびLf, RBP, 8-MOP混

　合物の蛍光スペクトル.-

　　(1) Lf(3.6×10-7M）

　　(2) Lf ( 3.5×10-7M）十RBP( 6.5×10-7M）

　　（3）Lf（3.2XIO-7M）十RBP ( 5.8×10-6M）

　　　　＋8-ＭＯＰ（L4×10-5M）

　　励起光廠450nmを用いているので，生ずる蛍

　.光はLfに･よる．

　　他は図４と同じ．

や困難がある．これらの図ではＲＢＦの増加に伴い，両

者の比か１：１の点に向って直接的に滴定曲線が変化し

ているが／このことは加えたＲＢＰのほぽ全量が8-MOP

に結合していることを示し，この条件下ではＲＢＰの濃

度をよい精度で決定できない．しかしこの困難は用いる

8-MOPおよびＲＢＰの濃度を下げることにより除去

でき，図６にそのような条件下での滴定曲線が示されて

いる．これを利用して解離定数Ｋｍ４ｶ;り,7×lO-'Mと

決定された．　　　　　　ト

　(3) 8-MOP存在下でのビタミンB2のＲＢＰに対

する結合

　人血液中にもＲＢＰは存在し，本研究で用いたRBP

と同様にこれらはビタミソＢ，の貯蔵，運搬の役割を

アルブミンと共に担っている4）.従って8-MOPのRBP

に対する結合かビタミソB2のＲＢＰに対する結合に与

える影響を調べておくことは大切である．ここではビタ

ミソB2誘導体の一種であるルミフラビソ（Lf）を用い

て検討した．

　図7（ａ）にはLfおよびLfとＲＢＰの混合物の吸

収スペクトルを示す．両者のスペダトルには明らかに異

CHs

｜Ｏ　Ｈ

ＮＶ

Ｏ

Ｎ　Ｎ

がＥ　Ｅ

0CH3

○

　　　　　図9　Lfと8-ＭＯＰの分子構造式

　　　左；Lf，

　　　右; 8-MOP,

いがあるが，これはLfとＲＢＰが可逆的に結合するた

めであることが既に錦見ら5)によ･り報告されている．ま

た図7(b)には更に8-MOPを加えたものが示されて

いるが，明らかに(ａ)に比べ吸収スペクトルの変化は

小さくなっており, 8-MOPの存在下ではLfのRBP

への結合か押えられている．言い換えれば, RBP に8-

ＭＯＰとLfが同時に結合した状態は，それぞれか１個

結合した状態に比べ熱力学的に不安定であることを示

す．従ってLfの濃度を増加させると8-MOP―RBP複

合体が解離の方向に向うこともこの実験から結論でき

る．これについては考察でさらに検討する．

　同様のことを蛍光スペクトルを利用して観測した(図

８)．この場合励起光は450nmを用いているので, RBP

および8-MOPは蛍光を示さず，Lfのみが発光する．

図8－(1)はLfの蛍光を示す．これにＲＢＰを加えると

LfとＲＢＰは結合しそのため蛍光が減少する(図８－

(2)).これに更に8-MOPを加えたものか図8―(3)に示

されているが，明らかに蛍光強度が回復し, Lf―RBP

複合体よりLfが解離していることがみられる．このこ

とは前に示した吸収スペクトルによる結論を強く支持す

るものである．

　なおこれらの条件下では, Lf と 8-MOPを混合して

も吸収，蛍光スペクトル共に変化を生ぜず，この両者は

結合していないことが分った．

　　　　　　　　　　　考　　察

　血液中に吸収されたビタミソB2は主としてアルブミ

ンと結合するが，それ以外にもこれを特異的に結合する

蛋白(ＲＢＰ)の存在が知られており，生理的条件下ではこ

れはアルブミンの補助的役割をはたしていることが報告

されている4).またある種の疾病(hypoanalbuminemia

やmultiple myeloma)の場合にはＲＢＰの重要性は高く

なることも指摘されている町

　血中にとりこまれた8-MOPも同様に主にアルブミン

と結合するものと理解されている力び)，今回明らかにな

ったように8-ＭＯＰもやはりＲＢＰにも結合する．しか

も興味のあることには，アルブミンに対する解離定数は

8－メトキシソラーレソとリボフラビン結合蛋白の結合様式について

3×10-=Mであるのに対し2），ＲＢＰに対する解離定数は

6.7×10’7Mである．即ちＲＢＰの方が親和性が約50倍

高いことになる．これらのことは，ビタミソB2の場合と

同様に, 8-MOPの結合，移送にＲＢＰがアルブミンめ補

助的役割をはたしている可能性を示唆するものである．

　更に大切なことはLfと8-ＭＯＰが措抗的にＲＢＰに

結合することである．図９に両者の分子構造を示すが両

者の構造（分子の大きさも含め）はよく類似している.

LfのＲＢＰに対する結合力としてイソアロキサジソ核

と蛋白中の有核アミノ酸の重層構造（もっと広い意味

では疎水結合）が重要な因子5）と考えられているが，8-

ＭＯＰの構造類似性よりこれもまた同様の結合をしてい

る可能性が大きい．そうであれば両者はＲＢＰに措抗的

に結合することになり，今回の結果と矛盾しない．

　さて両者か措抗する場合その反応式は次のように書か

れる．

怒号E武撫ご。。ご

ﾚ,。，

　（Ｂ）については式（Ａ）と全く同じである．またLf-

ＲＢＰはLfとＲＢＰの複合体を示す. Kdlは次の通り

である．　エ

　Ｋ　＿〔ＲＢＰ〕〔Lf〕　　I）１‾｛LfニRBPレ　Ｏは濃度を示す．

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

I）吉川邦彦，榊原　茂．守　宣男，水野信行，

　　Pull-Soon Song:　8-Methoxypsoralen　と蛋白質

　　との光化学的結合の機序について．一日皮会誌，

　　89 :　417―421, 1979.

2) Artuc, M., Stuettgen, G., Schalla,χV., Schaefer,

　　H. & Gazith, J.:Reversible binding of 5- and

　8-methoxypsoralen to human serum proteins

　　(albumin) and to epidermis in vitro,ＢｒｉtiｓhJ･.

　　Der。1.,101: 669-677, 1979.

3）二科安三：リボフラビン結合タソパク質の精製

869

　上式を仮定した場合, Kdm(これは本論文で6.7×I0-'

Mと求まっている)を与えて，かつ図8 ― 3を利用す

ればKdlは計算により求められるが，今回Kdl=2.2

×10-≫M,即ち結合定数になおせば1/K = 4.5×107M'1と

計算された．この値はＲＢＰとLfの滴定曲線より錦見

ら5)が直接求めた値2.4×lO'M-'と極めてよい一致を示

し，上記反応式の正当性を更に支持するものである．

　以上のことは，Lfの存在か8-ＭＯＰとＲＢＰの結合

程度に影響を与え，また8-ＭＯＰの存在はLfとRBP

の結合程度に影響を与えるごとを意味する(8-ＭＯＰが

無限大になればLfは全てRBP より解離する．また逆

も同様である)．即ち，両薬剤はその代謝過程に互いに

影響を与えるものと思われるが，その臨床的意義に関す

る定量的な検討は今後の課題である．

　生体内では極めて多種類の分子が共存しているので，

薬剤り作用機構を完全に理解することはむつかしい問題

であるが，本研究で示した系は良いモデル系となり得

る．特に.分光学的に反応を追跡できる場合には，アイソ

トープ等の使用を必要としないので，簡単な設備のもと

で精度よく短時間で反応の追跡が可能である．その意味

においても，二のモデル系を用いて8-MOPの作用機構

の研究を展開させたいと考えている．

臓

　　及びその性質。大阪大学医学雑誌，29 :　109―

　　117, 1977.　　　　　し･

4) Merrill, A.H., Froehlich, J.A. & McCormick,

　　D.B.:　Isolation and identification of alter-

　　native riboflavin-binding proteins from human

　　plasma, Bioch｡阿.j咄咄，25: 198-206, 1981.

5) Nishikimi, M. & Kyogoku, Y.:Flavin-protein

　　interaction in egg white flavoprotein,Ｊ. Ｂｉｏｃｈ.，

　　73: 1233-1242, 1973･