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Microbiologia GeneralTrimestre 16-P
8. Cinética microbiológica
CRECIMIENTO MICROBIANO Aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de
los microorganismos en el número de células o en la masa celular
El crecimiento de una población se mide a través de:
Métodos indirectos
Consumo de sustratos Formación de productos Métodos cinéticos Componentes celulares Actividades enzimáticas
Métodos directos
Número de células
Masa celular Peso seco: filtración, centrifugación Turbidez: DO de una suspensión de células
Cuenta directa: microscopio Cuenta en placa: solo células viables
azúcares CH4, etanol Respirometría (O2/CO2) ác. nucleicos, proteínas, lípidos, ATP deshidrogenasa
Estimación de CRECIMIENTO
La selección de un método para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de:
Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos) Propiedades del medio de cultivo Sensibilidad requerida Confianza del método Velocidad necesaria
Métodos de crecimiento
Medida del número de células Cuenta directa al microscopio: conteo de células totales
cámaras especiales para conteo Cuenta en placa: conteo solo de células viables
Medida de la masa celular Peso seco: se recupera la biomasa del medio de cultivo, se
seca y se pesa (filtración, centrifugación) Turbidez: cuantificación de la DO de una suspensión de células curva patrón con número conocido de células
Masa celular número de células se puede estimar uno para
conocer el otro
Cámaras de recuento
Cálculo de no. de células/mL:X células x 25 cuadros x 104 x
FD [=] número/cm3
1 mm0.2 mm
Cámara de Neubauer
Cámaras de recuento
Ventajas: Conteo rápido de microorganismos
Limitaciones: No se distinguen las células muertas de las vivas Células pequeñas son difíciles de distinguir Se requiere tiempo y habilidad Se requiere un microscopio de contraste de fases si las
células no están teñidas No es buen método para suspensiones muy diluidas (< 106
células/mL)
Cuenta en placa
Fundamento: cada célula viable forma una colonia UFC: se cuantifica el número de células a través del conteo de colonias
Ventaja: solo se cuentan las células viables las que pueden reproducirse (dividirse)
Dos técnicas (medios sólidos): Siembra en superficie ≤ 0.1 mL de muestra sobre la superficie del
medio
Vertido en placa 0.1 - 1.0 mL de muestra en la caja, se vierte el medio fundido (~45°C) y se homogeneiza
Colonias superficiales
Colonias superficialesColonias sub-superficiales
Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS
En los métodos de conteo en placa, el número de colonias: No debe ser muy alto para poder contarlas No debe ser muy bajo para que tenga significado
estadísticoNo. colonias 30 - 300
Muestra a contar
de caldo
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Incontable
Normalmente no se conoce el número de microorganismos viables dilucionesusualmente seriadas
Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS
Turbidimetría
Método más rápido (espectrofotómetro) Turbidez en una suspensión celular las células dispersan la luz
se cuantifica la luz transmitida No. de células DO (turbidez) número
de células turbidez (DO) Desventaja: problemas asociados al medio de
cultivo y a la presencia de partículasGRAVIMETRÍA
Se cuantifica el peso seco de una muestra Filtración (< 0.2 μm) de la suspensión de BM secado peso BM Centrifugación secado peso del precipitado Desventaja: incluye microorganismos muertos, materia orgánica,
polímeros extracelulares
8. Cinética microbiológica
CRECIMIENTO
Incremento ordenado de todos los constituyentes químicos de los microorganismos aumento en la
masa microbiana o en el número de células
FASES DE CRECIMIENTO
Fases de crecimientoExp Estacionaria Muerte
Tiempo
Crecim
iento
Cultivo en lote o “batch”
Lote (batch): el medio NO se renueva crecimiento en un volumen fijo que se altera continuamente por el crecimiento microbiano
Continuo: el medio se renueva constantemente número de células y estado metabólico constantes estado de equilibrio
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)
Adaptación o latencia: fase Lag Los microorg. adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones
ambientales se prepararan para reproducirse Esta fase se puede reducir/evitar:
Inoculo lo más activo posible fase exponencial de crecimiento
Medio de crecimiento de inoculo parecido al medio de prod.
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)
Exponencial: fase Exp Condiciones óptimas para el
crecimiento los microorg. crecen y se multiplicanaumento logarítmico
La tasa de crecimiento es máxima y el tiempo de duplicación (td) es mínimo
La fase Exp no puede durar indefinidamente p. ej.: Si una bacteria con un td de 20 min crece a esa velocidad por 48 h
población equivalente a 4,000 veces el peso de la Tierra (peso de una bacteria: 10-12 g)
dx/dt = µx
CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)
Fase de muerte Generalmente también es logarítmica, pero más lenta que el
crecimiento Exp Tasa de muerte > tasa de crecimiento
Fase estacionaria El cultivo está limitado por
nutrientes y/o por acumulación de productos
Tasa de crecimiento = Tasa de muertedx/dt = 0
dx/dt = -kx
CULTIVO CONTINUO Quimiostato*: tipo más común de cultivo continuo
control de la densidad de población y la tasa de crecimiento del cultivo
Elementos para su control: Tasa de dilución adición
de medio fresco a un flujo constante
Nutriente limitantenutriente esencial (C/N) en cantidad limitada
Medio frescoAire/gas estéril
Regulador de flujo
Espacio con aireReactor
Cultivo
Efluyente con células
*Permite mantener la población celular en fase Exp por largos periodos
CULTIVO CONTINUO Tasa de dilución controla la tasa de crecimiento el microorganismo no crece suficientemente rápido
para igualar la tasa de dilución: lavado una parte de la población muere por falta de nutrientes
[nutriente limitante] controla la densidad celular (células/mL) [Nutriente] limitante
densidad celular
Concentración de sustrato
Tiempo de duplicación
Densidad celular (biomasa)
Tasa de dilución
8. Cinética microbiológica
DEFINICIONES
Crecimiento: incremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de células o en la masa celular
Tasa de crecimiento: cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo
Tiempo de duplicación (td): tiempo necesario para que a partir de una célula se formen dos (para que una célula se duplique)
Número de generaciones (n): número de divisiones celulares en un determinado tiempo = generaciones
8. Cinética microbiológica
Crecimiento exponencial
Durante la fase exponencial incremento de la población en el que el número de células se duplica cada cierto tiempo
Tiempo (h) No. células0
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0
1248
1632 64
128256512
1,024
td = tiempo de duplicación
1 21 22 23 24 ... 2n
2
2x2x2td
td 2x2
td1
Crecimiento exponencial
Representando lo anterior en forma gráfica:
01000200030004000
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
x = x0 2n
x = número o masa de individuostd = tiempo de duplicaciónn = número de divisiones celulares en un
determinado tiempo = generaciones
Si td es constante el crecimiento es exponencial
td td td td1 2 2x2 23 ... 2n
Crecimiento exponencial
Obtener información sobre la tasa de crecimiento a partir de curvas aritméticas es difícil escala logarítmica (línea recta): Fácil uso podemos estimar tiempos de duplicación (td) a
partir de resultados experimentales
0300060009000
120001500018000
0 2 4 6 8Tiempo (h)
x (No
. de c
élulas
)
0.02.04.06.08.0
10.0
0 2 4 6 8Tiempo (h)
ln (x )
m = 0.693/td
TIEMPO DE DUPLICACIÓN
El número de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por:
Donde:n = número de generacionest = tiempo de la fase Exptd = tiempo de duplicación
La concentración de biomasa después de un tiempo de crecimiento exponencial puede cuantificarse, en función de la biomasa inicial, a través de:
n = t/td
x = x0 2n Donde:x = número final de célulasx0 = número inicial de células
x = x0 2t/td
t/td = n = ln x – ln x00.693
0.693 t + ln x0 ln x – ln x0 = 0.693td t td
TIEMPO DE DUPLICACIÓNCon base en la Ec. ❸, si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos calcular el número de generaciones (n) y el tiempo de duplicación (td) para expresar la Ec. ❸ en términos de n:
x/x0 = 2t/td
ln (x/x0) = ln2 (t/td)ln (x/x0) = 0.693 (t/td)ln x =
Ec. de una línea recta
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 1 Con n expresado en términos de parámetros cuantificables (x y x0), puede calcularse el tiempo de duplicación (td). P. ej.:Calcula el td de un cultivo, considerando que:
x0 = 5 x 107 células x = 5 x 108 células t = 6 h
t/td = n = ln x – ln x00.693
t/td = 20.0 – 17.70.693
t/td = 3.3 td = t/3.3 td = 6 h/3.3 = 1.8 h
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2A partir de una tabla de datos: número de células vs. tiempo Podemos calcular td de una gráfica semi-
logarítmica durante la fase Exp (crecimiento exponencial)
En donde la pendiente (m) = 0.693/td
t (h) x (células) ln x0 10 2.3
0.5 10 2.31.0 10 2.31.5 15 2.72.0 30 3.42.5 60 4.13.0 120 4.83.5 240 5.54.0 480 6.24.5 960 6.95.0 1920 7.65.5 3840 8.36.0 7680 8.96.5 15360 9.67.0 20200 9.97.5 21000 10.08.0 20800 9.98.5 20650 9.99.0 18400 9.89.5 14350 9.6
10.0 10250 9.2
ln x = 0.693 t + ln x0tdy = mx + b
05000
10000150002000025000
0 2 4 6 8 10
x (No. d
e célu
las)
Tiempo (h)
02468
1012
0 2 4 6 8 10
ln (x)
Tiempo (h)
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2
Pendiente = m = 1.386 Entonces, cómo
calculamos td?:
m = 0.693/td1.386 = 0.693/tdtd = 0.693/1.386td = 0.5 h
02468
1012
0 2 4 6 8 10ln (
x )Tiempo (h)
m = 0.693/td
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3
Se desea propagar un cultivo de Escherichia coli, cuyo tiempo de duplicación es de 20 min, estime: El número de generaciones de E. coli después de 10 h
de fase Exp El número de células producidas si el medio se inocula
con una célula, suponiendo que la fase Exp no termina
t/td = n = ln x – ln x00.693
n = t/td n = 10 h/0.33 h n = 30.3
td (h) = 20 min 1 h = 0.33 h60 min1. Convertir td a horas o t a minutos
2. Cálculo del número de generaciones (n)
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 33. Cálculo del número de células producidas (x) si se inocula
con 1 célula (x0) Usando las ecs. (2) o (3):
x = 1 * 230.3x = x0 2n x = x0 2t/td
x = 1.3 x 109 células
t/td = n = ln x – ln x00.693 Usando la ec. (4):
30.3 = ln x – ln (1)0.693
ln x - 0 = 30.3(0.693) ln x = 20.9 x = exp(20.9)
x = 1.3 x 109 células
TIEMPO DE DUPLICACIÓN: ejemplos
Microorganismo Temperatura (°C)
Tiempo de duplicación (min)
Bacillus stearothermophilus 60 11Escherichia coli 37 20Bacillus subtillis 37 27
Streptococcus lactis 37 30Pseudomonas putida 30 45
Lactobacillus acidophilus 37 75Mycobacterium tuberculosis 37 360Bradyrhizobium japonicum 25 400
Anabaena cylindrica(cianobacteria) 25 840
Treponema pallidum(espiroqueta) 37 1980 (33 h)
8. Cinética microbiológica
µ
Tasa de crecimiento específica
Tasa específica de crecimiento = μ μ es la tasa (velocidad) a la cual una población microbiana se
duplica en un tiempo determinado (fase Exp) μ está definida por:
μ = Δx 1 = 1 dxΔt x x dt
Tasa de crecimiento específicaEn una gráfica aritmética de x vs. tiempo:
μ = pendiente entre 2 puntos el no. de células promedio en esos 2 puntos
m = y2 - y1x2 - x1
t (h) x (células)0 1
0.5 21.0 41.5 8
m = 4 - 2 (células) = 4 células1.0 - 0.5 (h) h
(2 + 4)/2 = 3 células
= 4 (células/h)3 células μ = 1.33 h-1
050
100150200250
0 1 2 3 4 5Tiempo (h)
x (No
. de c
élulas
)
Pendiente:
No. células promedio:
μFase Exp
Tasa de crecimiento específicaDe acuerdo con lo anterior:
dx = μ dtx
ln x - ln x0 = μ t
ln x = μ tx0
μ = 0.693td
dx = x0 xdt = t0 tsi integramos:
Despejando dx/x:
x = x0 eµt
OJO: t tiempo que dura la fase exponencial
Y, con base en el crecimiento Exp:
y = m x + b ln x = 0.693 t + ln x0td La pendiente (m) = μ
μ = Δx 1 = 1 dxΔt x x dt
Tasa de crecimiento específica
Para corroborar que µ en el ejemplo 1 sea correcta: Con la ec. (8)
Despejamos td:
µ = 0.693td
µ = 1.33 h-1
td = 0.5 htd (h) = 0.6931.33 h-1
8. Cinética microbiológica
PROBLEMA 1Si la concentración celular al inicio de la fase Exp en un cultivo es de 1 x 104 cel/mL y después de 4 h de crecimiento Exp hay 1 x 108 cel/mL. Calcular:
a) La tasa específica de crecimiento (m)b) El tiempo de duplicación (td)c) El número de generaciones (n)
Datos: x0 = 1 x 104 cel/mL x = 1 x 108 cel/mL t = 4 h
ln x - ln x0 = µt
Para calcular (a), podemos usar la ec. (6):
ln (1 x 104) = 9.2ln (1 x 108) = 18.4
(18.4 - 9.2)/4 [h] = µ
µ = 2.3 h-1
PROBLEMA 1
Para calcular (b), usamos la ec. (8): µ = 0.693td
td = 0.3 htd (h) = 0.6932.3 h-1
Para calcular (c), usamos la ec. (4):
n = 13.3n = 18.4 - 9.20.693
n = ln x – ln x00.693
PROBLEMA 2Un fermentador que se inocula con 2 x 106 cel/mL inicia su fase de crecimiento Exp después de 2 h. ¿Cuánta biomasa se produce después de 12 h si la bacteria tiene un td de 3.5 h y la fase Exp no termina? Datos:
td = 3.5 h x0 = 2 x 106 cel/mL t = 12 – 2 [h] = 10 h x = ?
Para calcular x, primero necesitamos calcular m ec. (8):
µ = 0.693td
µ = 0.2 h-1µ (h-1) = 0.6933.5 h
Calculamos x con las ecs. (6) o (7): x = x0 eµt
x = (2 x 106 cel/mL) e(0.2*10) x = (2 x 106 cel/mL) * (7.4)x = 1.5 x 107 cel/mL
PROBLEMA 3La bacteria Streptococcus lactis tiene un tiempo de duplicación de 0.5 h a 37°C. Si se inoculó un fermentador con 1 x 108 células/mL ¿Cuánta biomasa se producirá después de 300 min de crecimiento Exp? Datos:
td = 0.5 h x0 = 1 x 108 cel/mL t = 300 min x = ?
Primero tenemos que pasar TODO a las mismas unidades:
300 min 1 h = 5 h60 min
Podemos calcular x con la ec. (2), pero primero necesitamos calcular n x = x0 2n t/td = n
n = 5 h/0.5 h n = 10
PROBLEMA 3
Sustituimos n en la ec. (2)x = x0 2n n = 10 x0 = 1 x 108 cel/mL
x = (1 x 108) x 210 x = (1 x 108) x (1024)x = 1.02 x 1011 cel/mL
PROBLEMA 4¿Cuánto tiempo tarda un cultivo en alcanzar una concentración de biomasa de 17 g/L si se inoculó con una concentración de 0.4 g/L y la tasa específica de crecimiento fue de 0.8 h-1?
Datos: x0 = 0.4 g/L x = 17 g/L μ = 0.8 h-1
t = ?
Podemos calcular t con la ec. (5):ln x - ln x0 = µ t ln (17) = 2.83
ln (0.4) = -0.92
t = [2.83 - (-0.92)] / 0.8 h-1
t = (ln x - ln x0)/µ
t = 3.75 / 0.8 h-1
t = 4.7 h
En un experimento de laboratorio se obtuvieron los datos de crecimiento de Escherichia coli que se muestran en la tabla. Con base en ellos, calcula:
a) La tasa específica de crecimiento (µ) t (h) x (células)0 1.0E+041 1.1E+042 1.5E+043 1.5E+054 1.0E+065 1.9E+076 2.6E+087 4.2E+088 5.5E+089 5.3E+0810 4.5E+0811 1.5E+0812 2.0E+07
ln x9.29.39.611.913.816.719.419.920.120.119.918.816.8
0.E+001.E+082.E+083.E+084.E+085.E+086.E+08
0 2 4 6 8 10 12Tiempo (h)
X
b) El tiempo que tarda en duplicarse la población de E. coli y el número de generaciones
58
1114172023
0 2 4 6 8 10 12Tiempo (h)
ln X
Identificamos la fase Exp
PROBLEMA 5
La pendiente de la recta es μ: μ = 2.4 h-1
μ = 0.693/td, entonces: td = 0.3 h
n = t/td, entonces: td = 0.3 h t = ??? t = tiempo que dura la fase exp
t = 6 - 2 [h] = 4 hn = 14n = 4 h / 0.3 h