8. A kémiai biológia alapfogalmaichembiol.ttk.mta.hu/ea/MBA8ea.pdf · 8. Kémiai biológia S...

8. A kémiai biológia alapfogalmai

Jelzések bevitele, Bioortogonalitás.

Stop kodon szupresszió

8. Kémiai biológia

Szintetikus Kémia

Biokémia

Fluorofórok

Bioortogonalitás

N3

SO2

R

N

N N

N

OAc

OH

HO

OH

H

H

OHOHH H

OH

Kémiai biológia

Kémiai biológia

• Természetes, vagy mesterségesen előállított

biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel

• (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák)

• Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI)

• Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)

Jelzővegyületek – a jelzés

• Antigén-antitest kölcsönhatás

• Jelzett antitestek

• Genetikai bevitel (fúziós fehérjék)

• Fluoreszcens fehérjék, TAG-ek

• Szelektív reakció – bioortogonális kémia

• Biomolekula módosítása (metabolizmus, genetikai, kémiai)

• Jelzővegyület kapcsolása

Jelzett antitest – sejtalkotók

Jelzett antitest – tumor diagnózis

• Bowden, D. J.; Barrett, T. J. Clin. Imaging Sci. 2011, 1, 38

Jelzett antitest – tumor műtét

• https://www.youtube.com/watch?v=xYXbLjv5y7k

8

Protein Tags – fusion proteins

Peptide (small protein) sequences with unique activity

Can be added by recombinant DNA techniques

Fluorescent tags (GFPs)

Anchoring tags (His6)

Labeling tags (Cys4)

Enzymatic function for labeling (SNAP, Clip, Halo tags)

D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592

Fluoreszcens fehérjék – in vivo

• http://openspim.org/Team_SPIMApes

• Fluoreszcens fehérje gén+vizsgált fehérje gén = fúziós gén

• Fúziós fehérjét termelnek

• Csak a genomban közvetlenül kódolt molekulákra jó

Jelzővegyületek – fluoreszcens fehérjék – in vivo


Jelzővegyületek – fluoreszcens fehérjék – in vivo


• Transzgenikus neuronok

• Fúziós fehérjét termelnek

12TAG-ek: Snap and Clip tags

• A. Juillerat A, et al.(2003). Chem. Biol. 10, 313

O-6-Methylguanine-DNA methyltransferase activity

13Halo tag

• www.promega.co.uk

14Halo tag


15Halo tag

• G. V. Los et al. (2008) ACS Chem. Biol., 3, 373


16

Unnatural sequences of natural functions

• B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269

17



18



Nitrilotriacetic acid (NTA)

• Mainly for affinity chromatography

Bioortogonális bevitel

• Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív)

• Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba – nincs keresztreakció, „szervezetidegen” funkciók

• Gyors, kvázi kvantitatív („klikk”-reakciók)

- Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális „ártalmatlan” melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus

Bioortogonális modulok

• Célvegyület (biomolekula)

• „Kémiai hírvivő” – bifunkciós, biokompatibilismesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolhatóa cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedimotívumok, géntechnológia)

• Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)

Jelzés bevitele két lépésben

- Először a kémiai hírvivő,

majd a jelzés

- Kisebb módosítás,

kevésbé befolyásolja a

tulajdonságokat, könnyebb

bevinni

- Fluoreszcens jelzésnél

lehet pl. fluorogén jelzést

alkalmazni (nincs

háttérfluoreszcencia)

Kémiai hírvivő bevitele 22

D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592

• Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin)

• Staudinger ligáció (azid + foszfin)

• Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes

• Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)

Bioortogonális reakciók

Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció

• Gyors

• Szelektív

• Fluoreszcens termék (nincs

háttérfluoreszcencia)

• UV fény

Staudinger ligáció

• Biokompatibilis

• Lassú

• Spontán foszfin oxidáció

Staudinger ligáció

• Szerves oldószerek, vizes közeg, pH: 3-10

• ~100 %

• Nagyon gyors, regiospecifikus

• Cu toxicitás

Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3-

dipoláris cikloaddíció

• Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin)

• Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalékok (TBTA)



TBTA

• Glikoproteid jelölés

• Metabolikus módosítás

(Ac4ManAz)

29



Cu(I) mentes klikk reakció

• -C(sp3)-C(sp)- = 155-163°

• ~75,3 kJ/mol gyűrűfeszültség

• Nem szükséges Cu(I)

• Lassabb, bonyolult reagensek

+ R2 N3

N NN

R2

1,4 triazol

r.t.

R1R1

N NN

R2

R1

1,5 triazol

+

0.08[a] 0.05[a] 0.14 / 0.11[b] 0.22[a] 0.96[a] 0.24[a]

0.29 / 0.19[c]

clogP = 4,8

0.80[d]

clogP = 1,9

[a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril

(3:4 v/v)

F

F

R R

DIFO DIBOendo/exo BCN

R

N

OR

BARAC

CO2Me

COMBO

F

F

DIFBO

31

Ciklooktin reagensek

Koncentrációfüggés / szelektivitás

• U937 sejtek, FACS

O

N

O

OHO

N

O

COMBO-Flu

32

• 12.5 µM COMBO-Flu

• A-C ManNAz +

• D-E ManNAz –

• Magfesték (Hoechst 33342)

• Mosás nélkül !!

Membrán glikoproteid festés (ManNAz)

33

30 min

45 min

60 min

30 min

60 min

C

B

A

D

E

Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan

• Metabolikus

• Módosított metabolittal (pl. azido-cukor)

• Glikoziláció követése

• Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930• Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

• Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

Glikolizáció követése

Diels-Alder reakció

• Biokompatibilis

• Gyors

• Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)

Diels-Alder reakció

Bioortogonális funkciók genetikai bevitele -STOP kodon szupresszió

• Terminációs/nonszenz kodonok

• Nincs olyan tRNS, melynek antikodonja komplementer lenne velük→nem kötődik hozzá tRNS→leáll a fehérjeszintézis

• STOP kodont felismerő tRNS: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: • UAG: amber („különutas” baktériumoknál pl. Pyl)• UGA: opal• UAA: ochre

A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges

• Ortogonális tRNS-szintáz/tRNS pár

• Amber stop kodon a fehérjében

• Nem természetes aminosav

Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe – ortogonális tRNS/szintáz pár

Ortogonális tRNS/tRNS-szintáz kifejlesztése

Kémiai hírvivő genetikai beépítése

• Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878

Inzulin receptor - expresszió követése

• Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése

• Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

• Amfifil fehérjék szintézise baktériumban

• A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium)

• A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká

• A szerveződési folyamat valós idejű követése

• A hidrofil részhez GFP-t is toldanak

• Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása

• Nem természetes –bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése

• Hatóanyagok direkt szintézise a betegben

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése

• Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

Kémiai módosítás

• Egyedi motívumok reaktivitása (Cys4)

• -SH, Ar-OH, Trp-indol

Tyrosine specific tagging

HSA HSAlabs = 560 nm

lem = 700 nm

mega-Stokes, near infra-red dye

G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

HSA HSA

G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

Tyr specifikus jelölés

Cys jelölés

HSA HSA

G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Tetrahedron

2014, 70, 5961

Fluorogén jelzővegyületek

• Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens

– Minimális háttérfluoreszcencia

– Jobb jel / zaj arány

• Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297• Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370

Fluorogén jelzések

A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11,

3297.

400 450 500 550 600 650

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

No

rma

lize

d f

luo

resc

ence

in

ten

sity

/ a

.u.

l / nm

Fluorogén jelzővegyületek

A. Herner, G. E. Girona, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2014)Bioconjugate Chem. 25, 1370-1374.

523/630 nm 544/680 nm 588/744 nmlmax /lem

Vörös, közeli IR, mega-Stokes klikk festékek

• Nem citosztatikusak

• CHO sejtek jelölése:

• A, B, C:

azidomannoz-

aminnal nem kezelt

sejtek festés után

•D, E, F:

azidomannoz-

aminnal kezelt sejtek

festés után

• G, H, I:

azidomannoz-

aminnal kezelt sejtek

a festés után 5, 25 és

60 perccel

Fluorogén és távoli vörös jelzővegyületek

Knorr, G.; Kozma, E.; Herner, A.; Lemke, E. A.; Kele, P., Chem. Eur. J. 2016, 22, 8972

PET Jelzés• Pozitron jelzés (PET)

- Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18F)

- Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton

- Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség

- Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága,

egészségre káros, gyengébb felbontóképesség

MRI Jelzés

• NMR aktív nuklid (MRI)

- pl. Gd3+ komplexek, mágneses nanorészecskék

- jó kontraszt, nagy áthatolóképesség

- Korlátok:

- NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny,

gyengébb felbontás

Kombinált képalkotás

• Kombinált jelzések

• NIR fluorofór + PET

• Jó kontraszt + érzékeny detektálás

• Mélyszövetes képalkotás

8. A kémiai biológia alapfogalmaichembiol.ttk.mta.hu/ea/MBA8ea.pdf · 8. Kémiai biológia S...

Documents

Transcript of 8. A kémiai biológia alapfogalmaichembiol.ttk.mta.hu/ea/MBA8ea.pdf · 8. Kémiai biológia S...