6 Crescimento microbiano
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CRESCIMENTOMICROBIANO
INTRODUÇÃO
Metabolismo microbiano = energia (ATP)
síntese de novas estruturas
tamanho celular
crescimento divisões
Meios de cultura adequados ...
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O CRESCIMENTO INDIVIDUAL
Ciclo que termina com a divisão da célula, gerando duas células-filhas independentes e autônomas
Cromossomo completo e cópias de todas as outras macromoléculas, monômeros, moléculas e íons inorgânicos
Divisão assexuada = FISSÃO BINÁRIA (bactérias)
Duração: f(fatores genéticos e ambientais)
Menor tempo: 20min (Escherichia coli) – cond. ideais
CRESCIMENTO POPULACIONAL
Prática: inicia com a inoculação de indivíduos no meio
Sistema semi-isolado (trocas gasosas com o ambiente)
Crescimento – divisão em 4 fases (curva de crescimento)
a = fase lag
b = fase log ou exponencial
c = fase estacionária
d = fase de declínio (morte)
no ou massa
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A FASE LAG• Alteração do meio – limitado (?) para nutritivo e novo
• Mudanças metabólicas – síntese de “novas” enzimas
• Etapa de crescimento individual (síntese de RNA, proteínas, polissacarídeos, fosfolipídeos, etc)
• Não há replicação de DNA !
• Aumento da massa celular mas NÃO do número de indivíduos
• Final da fase:Células estruturadas, início da síntese de DNA
aumento do número de células
FASE EXPONENCIAL (FASE LOG)
Divisão celular (replicação do cromossomo) em ritmo acelerado
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FASE EXPONENCIAL (FASE LOG)
Aumento da concentração de RNA e proteínas
Tempo de geração (TG) = tempo para duplicação
Síntese de DNA = até 2/3 do TG
Multiplicação em forma exponencial:
Número de indivíduos e massa da cultura dobram a cada geração:
x = xo.2n
logx = logxo + (0,301/g).t
x = no ou massa final
xo = no ou massa inicial
n = no de gerações
g = tempo de geração
t = tempo decorrido
Fase exponencial de crescimento, representada em escala semilog. O tempo de geração é o “g”.
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Exemplo de cálculo:
Partindo de uma cultura em fase exponencial com 108
bactérias por mL, deseja-se preparar outra cultura que tenha o mesmo número de células após 16 horas. O tempo de geração é de 2 horas.
n = t/g = 16/2 = 8 (número de gerações)
Densidade inicial a ser usada na segunda cultura:
x = xo.2n
108 = xo.28 = xo = 3,9 x 105 células por mL
FASE ESTACIONÁRIA• Início: condições inadequadas do meio para o
crescimento populacional.
acúmulo de produtos tóxicos (ácidos orgânicos)
• Degradação de reservas celulares e estruturas (!)
• Redução do número de ribossomos ...
• CARÊNCIA NUTRICIONAL = alterações metabólicas:
• Tamanho: células < (sobrevivência), massa =
• Composição química e estrutura: membrana menos permeável, > resistência à autólise, à T, pressão osmótica (resistência - formação de esporos) ...
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FASE DE DECLÍNIO
• Se o meio se mantiver inalterado = MORTE de células
• Impossibilidade de produção de energia (vida)
• Elevada produção de enzimas autolíticas
ruptura da parede celular
CRESCIMENTO CONTÍNUO E DESCONTÍNUO
• Culturas descontínuas: inoculação em um meio de cultura, desenvolvimento das 4 fases até a exaustão dos nutrientes.
• Culturas contínuas: (quimiostatos)
acréscimo de meio de cultura constantemente na fase exponencial, para evitar a exaustão de nutrientes.
retirada de células (meio de cultura “usado”)
Necessidade de manter pH, T, agitação, aeração, etc.
Usos:
indústrias: para obtenção de certos produtoslaboratórios de pesquisa: estabilidade genética
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Quimiostato
MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam o número de células:
Métodos diretos:
1) Contagem ao microscópio: lâminas marcadas e com volume conhecido. Método simples e rápido, mas impreciso, sem distinção de células mortas e vivas.
2) Câmaras eletrônicas: contagem em canal estreito. Método rápido e impreciso (agrupamentos...)
Métodos indiretos:
Unidades formadoras de colônias (UFC): Inóculo(suspensão diluída) em meio sólido, para formar colônias isoladas. Método demorado, somente organismos aeróbios e viáveis!
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MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é
proporcional à população:
Métodos diretos:
1) Massa seca: suspensão é centrifugada ou filtrada, secagem posterior e pesagem. Método simples e rápido, mas não distingue vivo do morto.
2) Proteína celular: suspensão centrifugada, precipitada com álcool ou ácido e determinação do conteúdo protéico. Método rápido, mas não separa célula morta daquela viva.
3) Dosagem de ATP: distingue células vivas. Método caro e sensível. Extração de ATP e quantificado por reação luminosa, cuja intensidade é proporcional à quantidade de ATP (células viáveis).
MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é
proporcional à população:
Métodos indiretos:
Turbidez, absorbância ou densidade óptica:A cultura recebe um feixe luminoso (colorímetros e espectrofotômetros) e, dentro de certos limites, a quantidade de luz transmitida é diretamente proporcional à massa microbiana.
Método muito usado (rápido e fácil), mas não separa células vivas de mortas e sofre interferência de substâncias que possam absorver luz (pigmentos ou muco extracelular)
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MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é
proporcional à população:
Métodos indiretos:
Turbidez, absorbância ou densidade óptica:A cultura recebe um feixe luminoso (colorímetros e espectrofotômetros) e, dentro de certos limites, a quantidade de luz transmitida é diretamente proporcional à massa microbiana.
Método muito usado (rápido e fácil), mas não separa células vivas de mortas e sofre interferência de substâncias que possam absorver luz (pigmentos ou muco extracelular)