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Zbl. Bakt. Hyg., LAbt. Orig. A 247,323-332 (1980) Institut fur Allgemeine Hygiene und Bakteriologie, Zentrum flir Hygiene, Universitat Frei- burg i.Br. Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID®, einem nicht automatisierten Vier-Stunden-System Rapid Identification of Enterobacteriaceae with the MICRO-ID System WOLFGANG PEUCKERT und KLAUS PELZ Mit 1 Abbildung . Eingegangen am 18. Januar 1980 Abstract Micro-ID®, a new kit system for rapid identification of Enterobacteriaceae, was com- pared with a conventional media-system, the extended Enterotube® system (completed with arabinose, rhamnose and the Voges-Proskauer reaction), and partially with the API-20E® system. When the computer generated Identification Manual for Micro-ID was consulted the system showed complete agreement at the genus level, but differed in 5% at the species level. Problems arose from misidentifications by nonfermenting organisms. 15 turbid blood cultures with gramnegative rods were tested additionally. In 11 cases the Micro-ID pro- vided correct identification of the species and in further 3 cases of the genus. In summary Micro-ID is easy to handle and an accurate, convenient kit for the short- term identification of Enterobacteriaceae. Zusammenfassung Micro-ID® ist ein Vier-Stunden-System zur schnellen Identifizierung von Enterobakte- rien. 215 Enterobakterienstamme, isoliert aus klinischem Untersuchungsmaterial, wurden mit dem Micro-ID-System (MID), der konventionellen "Bunten Reihe", dem urn drei Reaktionen erweiterten Enterotube® und zum Teil mit API-20E® identifiziert. Zusatzlich wurden 15 positive Blutkulturen nach Anfertigen eines Grampraparates und ohne Sub- kultur direkt mit Micro-ID untersucht. Bei den 215 Stammen ergaben sich fur MID hin- sichtlich der Gattungsdiagnose eine vollstandige Dbereinstimmung mit den konventionellen Systemen und bei der Speziesdiagnose eine Abweichung von 5%, wenn das computer- erstellte Identifizierungs-Handbuch benutzt wurde. Die Direktbeimpfung aus den Blut- kulturen ergab 14mal Dbereinstimmung in der Gattungs- und 11 mal in der Speziesdiagnose. Auf Fehlbestimmungen durch nichtfermentierende gramnegative Stab chen mulSte geach- tet werden. MID erwies sich als leicht zu handhabendes, mit konventionellen Verfahren gut vergleichbares und zeitlich ausgesprochen gunstiges Identifizierungs-System fur Entero- bakterien.

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Zbl. Bakt. Hyg., LAbt. Orig. A 247,323-332 (1980)

Institut fur Allgemeine Hygiene und Bakteriologie, Zentrum flir Hygiene, Universitat Frei­burg i.Br.

Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID®, einem nicht

automatisierten Vier-Stunden-System

Rapid Identification of Enterobacteriaceae with the MICRO-ID System

WOLFGANG PEUCKERT und KLAUS PELZ

Mit 1 Abbildung . Eingegangen am 18. Januar 1980

Abstract

Micro-ID®, a new kit system for rapid identification of Enterobacteriaceae, was com­pared with a conventional media-system, the extended Enterotube® system (completed with arabinose, rhamnose and the Voges-Proskauer reaction), and partially with the API-20E® system. When the computer generated Identification Manual for Micro-ID was consulted the system showed complete agreement at the genus level, but differed in 5% at the species level. Problems arose from misidentifications by nonfermenting organisms. 15 turbid blood cultures with gramnegative rods were tested additionally. In 11 cases the Micro-ID pro­vided correct identification of the species and in further 3 cases of the genus.

In summary Micro-ID is easy to handle and an accurate, convenient kit for the short­term identification of Enterobacteriaceae.

Zusammenfassung

Micro-ID® ist ein Vier-Stunden-System zur schnellen Identifizierung von Enterobakte­rien. 215 Enterobakterienstamme, isoliert aus klinischem Untersuchungsmaterial, wurden mit dem Micro-ID-System (MID), der konventionellen "Bunten Reihe", dem urn drei Reaktionen erweiterten Enterotube® und zum Teil mit API-20E® identifiziert. Zusatzlich wurden 15 positive Blutkulturen nach Anfertigen eines Grampraparates und ohne Sub­kultur direkt mit Micro-ID untersucht. Bei den 215 Stammen ergaben sich fur MID hin­sichtlich der Gattungsdiagnose eine vollstandige Dbereinstimmung mit den konventionellen Systemen und bei der Speziesdiagnose eine Abweichung von 5%, wenn das computer­erstellte Identifizierungs-Handbuch benutzt wurde. Die Direktbeimpfung aus den Blut­kulturen ergab 14mal Dbereinstimmung in der Gattungs- und 11 mal in der Speziesdiagnose.

Auf Fehlbestimmungen durch nichtfermentierende gramnegative Stab chen mulSte geach­tet werden. MID erwies sich als leicht zu handhabendes, mit konventionellen Verfahren gut vergleichbares und zeitlich ausgesprochen gunstiges Identifizierungs-System fur Entero­bakterien.

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Methoden, die auf Verkiirzung der bakteriologischen Diagnosezeit abzielen, sind wichtige Erganzungen der bestehenden Diagnoseverfahren. Einerseits sind es klini­sche Erfordernisse, die den Mikrobiologen veranlassen, eine Identifizierung in mog­lichst kurzer Zeit anzustreben. Andererseits konnen die neuen Methoden der Kurz­zeit-Sensibilitatstestung wie z. B. automatisch erstellte Antibiogramme oder die Friihablesung des Agar-Diffusionstestes bereits innerhalb von 5 Std. zu Aussagen fiihren, denen unbedingt eine zeitgleiche Identifizierung an die Seite gestellt werden sollte.

Mit dem Micro-ID®-System (General Diagnostics, Morris Plains, New Jersey) wird neuerdings die Moglichkeit der nicht automatisierten 4-Std.-Identifizierung von Enterobakterien angeboten. Dieses System, eine Weiterentwicklung des Patho-Tec®­Streifenverfahrens, erscheint wegen seiner kurzen Bebriitungszeit und der einfachen Handhabung als sinn volle Erweiterung der bisher zur Verfiigung stehenden diagno­stischen Verfahren. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, durch vergleichende Identifizierung von Enterobakterien mit dem Micro-ID-System und gebrauchlichen 18-Std.-Systemen die Zuverlassigkeit und die Einsatzmoglichkeiten von Micro-ID in der mikrobiologischen Diagnostik zu untersuchen.

Material und Methoden

Untersuchte Stamme. Untersucht wurden 215 Stamme von Enterobakterien, die im Zeit­raum Juni/Juli 1979 aus klinischen Untersuchungsmaterialien (Urin, Punktate, Wund­abstriche, Sputum, Stuhl) isoliert worden waren. Das Keimspektrum (Tab. 1) umfa15te nicht aile im Micro-ID-System identifizierbaren Spezies, war aber durchaus reprasentativ fiir ein diagnostisch-mikrobiologisches Labor. Zusatzlich wurden je vier Stamme der Gat­tungen Acinetobacter und Pseudomonas sowie ein Stamm Enterokokken getestet, urn das Reaktionsmuster bei irrtiimlicher Beimpfung mit Nicht-Enterobakterien kennenzulernen. 1m gleichen Zeitraum wurden au15erdem 15 positive Blutkulturen direkt im Micro-ID­System untersucht.

Micro-ID. Das Micro-ID-System besteht aus einem Kunststofftrager mit 15 separaten Kammern. In diesen Kammern befinden sich Filterpapierplattchen, die mit Reagenzien fiir folgende Reaktionen impriigniert sind: Voges-Proskauer, Nitratreduktase, Phenylalanin­desaminase, Schwefelwasserstoffbildung, Indolbildung, Ornithin- und Lysindecarboxylase, Malonatverwertung, Harnstoffspaltung, Askulin-Hydrolyse, {J-Galaktosidase sowie SpaI­tung von Arabinose, Adonit, Inosit und Sorbit (Tab. 2). Die Testkammern sind zu zwei Drittel mit Klarsichtfolie abgedeckt, das obere Drittel mit kleinen Mulden zur Proben auf­nahme ist mit einem Klappdeckel verschlossen (Abb. 1).

AIs Inokulum wird von den zu untersuchenden Kolonien eine Suspension in 0,9%iger NaCI hergestellt (Triibungsgrad nach McFarland 0,5-2). Hiervon werden ca. 0,2 ml in jede Kammer einpipettiert. Die zu testenden Kulturen solI ten nicht alter als 30 Std. sein, der verwendete Nahrboden hat nach unseren Erfahrungen keinen Einflu15 auf die Ergeb­lllsse.

Zur Bebriitung (4 Std., 37°C) werden die Micro-ID-Systeme aufrecht in einen Stander gestellt, dabei flie15t die Probensuspension aus den Inokulationsmulden in die Reaktions­kammern. Die Reaktionsausfalle werden anhand des Indikatorverhaltens beurteilt. AIs ein­ziges zusatzliches Reagenz miissen vor dem Ablesen zwei Tropfen 20%ige KOH zur Kam­mer mit der Voges-Proskauer-Reaktion hinzugefiigt werden. In den ersten fiinf Kammern sind die Indikatoren auf raumlich getrennten Plattchen aufgebracht, die vor dem Ablesen durch Drehen des Systems benetzt werden miissen.

Fiir die Keim-Identifizierung wird ein computerersteIItes "Identifizierungs-Handbuch" verwendet, wie es in ahnlicher Form auch fiir andere handelsiibliche Identifizierungs-

Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID® 325

MIC 00 lD II ..................

Abb.1. Micro-ID-Test-System. Der Deckel ist hochgeklappt, im oberen Drittel des Kunst­stofftragers sind die Mulden zur Probenaufnahme sichtbar. In den ersten flinf Kammern ist die raumliche Trennung der Indikatorplattchen von den Reaktionskammern zu er­kennen.

TabelIe 1. Art und Anzahl der getesteten Stamme

Enterobakterien

Escherichia coli Citrobacter diversus Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter agglomerans Enterobacter cloacae Enterobacter hafniae Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumoniae Serratia liquefaciens Serratia marcescens Proteus mirabilis Proteus morganii Proteus rettgeri Proteus vulgaris Providencia alcalifaciens Providencia stuartii Salmonella

(verschiedene Serovars) Salmonella typhi Shigella Yersinia enterocolitica

Anzahlder Stamme

57 3

15 2 6

20 6 1

29 2 7

11 18 7

11 2 2 7

1 1 7

Nicht-Enterobakterien (n = 9)

Gattung Acinetobacter Gattung Pseudomonas Enterokokken

Aus Blutkulturen isolierte Stamme (n = 15)

Escherichia coli Enterobacter cloacae Serratia liquefaciens Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Acinetobacter anitratus

Anzahl der Stamme

4 4 1

7 2 2 2 1 1

systeme mitgeliefert wird. Die 15 Kammern werden in 5 gleiche Gruppen unterteilt, deren Reaktionen je nach Aus£aIl verschiedene Ziffern erhalten. Addiert konnen fiir jede Gruppe Ziffern zwischen 0 und 7 entstehen ("octal code number").

Flir den resultierenden £iin£stelIigen Code kennt das Handbuch flinf grundsatzliche Ant-

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Tabelle 2. Die 15 im Micro-ID-System enthaltenen Reaktionen (rechte Spalte: Kammernummern; mittlere Spalte: auf dem Testsystem verwendete Ab­kurzungen)

Voges-Proskauer-Reaktion VP 1 Harnstoff-Spaltung U 9 Nitrat-Reduktase N 2 Askulin-Hydrolyse E 10 Phenylalanin-Desaminase PD 3 tJ-Galaktosidase ONPG 11 Schwefelwasserstoff-Bildung H 2S 4 A"b;oo.o l ARAB 12 Indol-Bildung I 5 Adonit Saure- ADON 13 Ornithin-Decarboxylase OD 6 Inosit bildung IN OS 14 Lysin-Decarboxylase LD 7 Sorbit SORB 15 Malonat-Verwertung M 8

worten: 1. Speziesdiagnose, 2. Gattungsdiagnose ohne Speziesangabe, 3. zwei oder mehr Keime als mogliche Spezies "non separated", 4. den Hinweis auf Mischkulturen. Als 5. Moglichkeit konnen Ziffern entstehen, die im Handbuch nicht vorkommen. Das zur Zeit vorliegende Identifizierungs-Handbuch fur Micro-ID nennt zu jeder angegebenen Zif­fer vier Keime (uberwiegend Spezies, gelegentlich Gattungen, vereinzelt Hinweise auf mog­liche Mischkulturen). Fur jede Angabe ist die Wahrscheinlichkeit des Reaktionsmusters innerhalb der angegebenen Spezies (Gattung) genannt (LFR = likelihood fraction) und dazu noch die Angabe, mit welcher Wahrscheinlichkeit der genannte Keirn sich von einer anderen Spezies oder Gattung abhebt (PNOR = normalized probability). Diesen Angaben folgt ein Priidikat zur Qualitat der angegebenen Identifizierung (z.B. "excellent identifica­tion, excellent separation, atypical reactions are minor"). Fur die erste Keimangabe sind aufSerdem die abweichenden Reaktionen mit den entsprechenden Erwartungswerten ge­nannt. Bei nicht eindeutiger Identifizierung wird auf Zusatzreaktionen zur Abgrenzung hingewiesen. Allerdings werden auch Wahrscheinlichkeiten von uber 99% angegeben mit dem Hinweis auf weitere Keime, deren Wahrscheinlichkeiten im O,OO-Bereich liegen.

Vergleichs-Systeme. 188 der 215 im Micro-ID getesteten Stamme wurden mit einer "Bunten Reihe" als Rohrchentest nach Edwards u. Ewing (7) identifiziert. Sie enthielt neb en allen im Micro-ID vertretenen Reaktionen noch zusatzlich die Tests auf Arginindecarboxy­lase, Zitratverwertung. Dextrosespaltung (einschliefSlich Gasbildung) und Rhaml'osespal­tung. Die Rohrchen wurden sechs Tage bei 37 DC bebrutet. Die Erstablesung erfolgte nach 18 Std., verzogert positive Reaktionen wurden bis zum sechsten Tag noch bewertet und zur Identifizierung herangezogen. Nicht im Rohrchentest untersucht wurden 20 Starn me, die mit dem API-20E-System identifiziert worden waren, und sieben Stamme von Y. entero­colitica.

Parallel zur "Bunten Reihe" wurden aIle Stamme (mit Ausnahme der Salmonellen) auch mit dem Enterotube®-System getestet, erweitert umd die Reaktionen Voges-Proskauer, Arabinose- und Rhamnosespaltung. Fur die Stamme von Y. enterocolitica wurde neben der serologischen Testung je ein Enterotube bei 30 und 37 DC bebrutet. Fur die anderen Stamme wurde der Enterotube 18 Std. bei 37 DC bebrutet. Auf einen geplanten Vergleich zwischen API-20E® und Micro-ID wurde verzichtet, da mittlerweile zahlreiche Unter­suchungen anderer Arbeitsgruppen zu dieser Fragestellung vorliegen (1-3,5).

Das API-20E-System wurde einmal nach 18 Std. Inkubation bei 37 DC abgelesen und aus­gewertet (20 Stamme).

Direktbeimpfung aus Blutkulturen. Aus 15 positiven Blutkulturen wurde nach Feststel­lung gramnegativer Stabchen im mikroskopischen Praparat das Micro-ID-System direkt beimpft. 5-10 ml des moglichst erythrozytenfreien Kulturuberstandes wurden mit einer sterilen Spritze abgezogen und bei 3-4000 UpM in der Laborzentrifuge sedimentiert. Sedi­mente aus hamolytischen Kulturen wurden einmal mit 0,9%iger NaCl gewaschen. Aus dem Sediment wurde mit der Ose so viel Material entnommen und in 3,5 ml einer 0,9%igen

Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID® 327

NaCI-Losung eingerieben, daR ein Trubungsgrad von 1-2 nach McFarland erreicht wurde. Diese Suspension wurde als Inokulum fur Micro-ID sowie zur Anlage einer Kontrollplatte auf Endo-Agar verwendet.

Ergebnisse

Das Micro-ID-System wurde unter drei Gesichtspunkten beurteilt: nach Hand­habung, Zuverlassigkeit der Einzelreaktionen und Dbereinstimmung mit 18-Std.­Systemen in der Identifizierung.

Handhabung. Die Handhabung des Systems ist ausgesprochen einfach. Bei Be­achtung der yom Hersteller gegebenen Instruktionen lieBen sich potentielle Fehler­moglichkeiten in der praktischen Ausfuhrung nicht erkennen: Das Inokulum war fur alle Kammern gleich und vor dem Ablesen mugte nur ein Reagenz (KOH) zur ersten Kammer (Voges-Proskauer-Reaktion) hinzugefugt werden.

Als weniger eindeutig erwies sich das Ablesen der Indikator-Reaktionen. Es ka­men Farbveranderungen vor, die aut dem Beipackzettel nicht angegeben wurden (z.B. Braunfarbung der Zuckeransatze). Einige Reaktionen zeigten nur sehr schwa­che Farbumschlage und waren nicht eindeutig beurteilbar (Phenylalanin, H2S). Auf nicht eindeutig interpretierbare Farbumschlage hatten bereits Aldridge et al. (1) hingewiesen. Nach entsprechenden Erfahrungen wurde folgendes Verfahren ein­gehalten: Bei geringen Farbanderungen wurden die Reaktionen Voges-Proskauer, Nitrat, Phenylalanin, H2S, Urea und ONPG als positiv, schwache Farbumschlage der anderen Ansatze als negativ gewertet.

Mit Ausnahme von Y. enterocolitica hatte sowohl in Vorversuchen aIs auch wahrend der gesamten Prufung die Keimdichte des Inokulums keinen EinfluB auf die Identifizierung (innerhalb 0,5-2 Triibungsgraden nach McFarland). Bei Verdacht auf Y. enterocolitica muBte jedoch ein moglichst dickes Inokulum verwendet wer­den (uber 1); die zu diinne Einsaat hatte durch fehlende positive Reaktionen ver­einzelt zur Diagnose Shigella sp. gefiihrt. Eine weitere Fehlermoglichkeit liegt in der Verwendung von Subkulturen, die alter als 30 Std. sind: Der Ansatz aus einer 48-Stcl.-Kultur von C. freundii war im Micro-ID ONPG-negativ und wurde daher nach clem Handbuch als S. enteritidis identifiziert.

Vergleich der Einzelreaktionen. Zwei Reaktionen zeigten im Micro-ID deutliche Abweichungen yom Ergebnis der Rohrchentests: PhenylaIanindesaminase (PAD) und Urease. Die bei der Urease beobachteten Abweichungen waren ausschlidslich durch K. pneumoniae verursacht. 1m Handbuch ist der Erwartungswert dieser Re­aktion fur K. pneumoniae mit 31% angegeben und liegt damit weit unter dem Wert konventioneller Tests (uber 95%). Von den 29 getesteten Klebsiella-Stammen waren im Micro-ID nur acht (28%) positiv, im Rohrchentest hingegen aile (Tab. 3). Von 47 Stammen der Gattung Proteus waren nur 25 (53%) PAD-positiv. Innerhalb der Spezies gab es deutliche Schwankungen:

Die Stamme von P. morganii waren in 33%, die von P. mirabilis und P. vulgaris in jeweils 64% und die von P. rettgeri in 84% PAD-positiv. 1m Rohrchentest hatten 45 Stamme (96%) eine positive PAD-Reaktion und im Enterotube waren es 35 Stamme (75%). Alle im Enterotube PAD-negativen Stamme waren P. morganii. Die tur Micro-ID genannten Erwartungswerte der PAD bei Keimen der Gattung Proteus liegen zwischen 84% (P. morganii) und 97-98% und entsprechen denen nach Edwards u. Ewing (7). Hier ist, im Gegensatz zu den Angaben zur Urease bei

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Tabelle 3. Vergleich der Einzelreaktionen von Micro-ID gegeniiber dem Rohrchentest

Reaktionen Dberein- Anzahl der falsch falsch stimmung , Isolate mit positiv negativ (%) Abweichungen

Voges-Proskauer 99 2 2 Nitratreduktase 99,5 1 1 Phenylalanindesaminase 89 20 20 H2S-Bildung 99,5 1 1 Indol-Bildung 96 8 8 Ornithindecarboxylase 97 6 6

Lysindecarboxylase 99 2 2 Malonatverwertung 100 Harnstoffspaltung 88 21 21 Askulinhydrolyse 100 ,B-Galaktosidase 94 11 3 8

Arabinoseverwertung 100 Adonitverwertung 99,5 1 1 Inositverwertung 97 5 5 Sorbitverwertung 99 2 1 1

K. pneumoniae, eine erhebliche Diskrepanz zwischen den nachgewiesenen Reak­tionsausfallen und den yom Hersteller genannten Erwartungswerten feststellbar.

Bei den ubrigen Reaktionen waren nur vereinzelt Abweichungen zu beobachten. Sieben laktosepositive Stamme von E. coli zeigten im Micro-ID keine ONPG-Reak­tion. Falsch positive ONPG-Reaktionen wurden bei einem Stamm von S. mar­cescens und zwei Stammen von E. cloacae beobachtet. Die Indol-Reaktion war im Micro-ID bei acht Stammen talsch negativ: C. freundii (1 Stamm), P. rettgeri (4 Stamme), P. vulgaris (2 Stamm e) und Providencia alcalifaciens (1 Stamm). Die Ornithin-Decarboxylase war bei sechs Stammen falsch negativ: vier Stamme von E. cloacae und je ein Stamm von P. mirabilis und Y. enterocolitica (Bebriitung bei 37 DC). Vier Stamme von Enteritis-Salmonellen (verschiedene Serovars) hatten im Rohrchentest eine positive Inositspaltung und waren im Micro-ID Inosit-negativ.

Vergleich der endgiiltigen Identi(izierung. Die 215 getesteten Stamme zeigten hin­sichtlich der Gattungsdiagnose in allen verwendeten System en Obereinstimmung. Abweichungen waren bei der Speziesdiagnose zu beobachten. Bei Vergleich mit dem Rohrchentest waren es 6% (11 von 188 Stammen), beim Vergleich mit dem erweiter­ten Enterotube 4,3% (9 von 207 Stammen). Wurden die 20 mit API-20E identifizier­ten Stamme und die Salmon ellen einbezogen, so betrug die Abweichung insgesamt 5% (11 von 215 Stammen). In Tab. 4 sind die Stamme mit abweichender Identifizie­rung zusammengestellt.

Die haufigsten Abweichungen waren bei E. cloacae zu beobachten: 5 von 20 Stam­men wurden im Micro-ID als E. agglomerans identifiziert. Die weiteren Ahweichun­gen verteilten sich auf die Gattungen Klebsiella (2 von 29), Proteus (3 von 47) und Serratia (1 von 9).

Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID® 329

Tabelle 4. Stamme mit abweichender bzw. unvollstandiger Differenzierung im Micro-ID­System, verglichen mit Rohrchentest und erweitertem Enterotube

Differenzierung im Rohrchentest

Enterobacter cloacae (5 Stamme) Klebsiella pneumoniae (2 Stamme) Proteus mirabilis (1 Stamm) Proteus vulgaris (1 Stamm) Proteus rettgeri (1 Stamm) Serratia marcescens (1 Stamm)

Differenzierung im Differenzierung im erweiterten Enterotube Micro-ID

Enterobacter cloacae Gattung Klebsiella Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus rettgeri Serratia marcescens

Enterobacter agglomerans Gattung Klebsiella Proteus vulgaris Gattung Proteus Gattung Proteus Gattung Serratia

Bei den beiden Stammen von K. pneumoniae hatten sowohl Micro-ID als auch der erweiterte Enterotube nur zur Gattungsdiagnose gefiihrt. Bei gleichem Ergebnis in Rohrchentest und Enterotube fur je einen Stamm von P. mirabilis, P. vulgaris und P. rettgeri konnte mit dem Micro-ID bei diesen Stammen zweimal nur die Gat­tung ermittelt werden, einmal ergab sich P. vulgaris statt P. rettgeri. Der Stamm von S. marcescens, der im Rohrchentest und Enterotube ubereinstimmend identifiziert wurde, ergab im Micro-ID nur die Gattungsdiagnose. Diese Vergleiche beziehen sich jeweils nur auf die etsten Keimangebote im Identifizierungs-Handbuch. Wurde Micro-ID mit Nicht-Enterobakterien beimpft (je vier Stamme der Gattungen Aci­netobacter und Pseudomonas, ein Stamm Enterokokken), so ergaben die Reaktions­muster der Stabchen siebenmal die Code-Ziffer fiir Shigella sp. (4 Stamme Acineto­hacter, 3 Stamme Pseudomonas), einmal kam die entstandene Ziffer im Handbuch nicht vor. Fiir die Enterokokken konnte je nach Bewertung der nicht eindeutig aus­ge£allenen Reaktionen E. agglomerans identifiziert werden oder es ergab sich keine verwertbare Ziffer.

Beimpfung aus der Blutkultur. Bei Direktbeimpfung aus 15 positiven Blutkulturen war die Speziesdiagnose aus elf und die Gattungsdiagnose aus weiteren drei Kul­turen eindeutig abies bar. 1m Einzelfall konnte die Keimdiagnose innerhalb 24 Std. nach Blutabnahme gestellt werden. Eine Kultur enthielt Acinetobacter anitratus. Nach dem Handbuch ergab sich hier die 1dentifizierung Shigella sp. Die anschlie­Ben de serologische Kontrolle war jedoch negativ. Die 1dentifizierung war deshalb nur iiber die Subkultur moglich.

Diskussion

Die Identifizierung von 239 Enterobakterien-Stammen aus klinischen Unter­suchungsmaterialien (einschliefSlich 14 Stammen aus Blutkulturen) mit dem Micro­ID-System erbrachte im Vergleich mit gebrauchlichen 18-Std.-Systemen (erweiterter Enterotube, "Bunte Reihe", AP1-20E) vollstandige Dbereinstimmung in der Gat­tungs-Diagnose. Die bisher uber Micro-ID veroffentlichte Literatur zeigt vergleich­bare Ergebnisse. Bereits 1978 hatten Aldridge u. Mitarb. (1) erste Erfahrungen mit Micro-1D publiziert. Bei 373 Stammen (darunter 122 aus der Stammsammlung) fan­den sie in 90% Dbereinstimmung mit den Ergebnissen konventioneller Rohrchen-

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tests. Sie konnten nachweis en, daIS die Fehlbestimmungen zu einem grolSen Teil auf Fehler in der ersten Auflage des Identifizierungs-Handbuchs zuruckzufuhren waren. Blazevic u. Mitarb. (3) tanden dann - nach vorausgegangener Korrektur des Hand·· buchs - bei 376 frischen Isolaten und 232 Stammen aus ihrer Stammsammlung in 97,8% der frischen Kulturen und in 93,2% der konservierten Stamme Dbereinstim·· mung der Identifizierung. Als Referenz-System verwendeten die Autoren den API-20 E-Kit, ebenfalls ein industriell vorgefertigtes Identifizierungs-System. Einen Ver­gleich mit den Ergebnissen der "Bunten Reihe", also dem konventionellen Rohr­chentest, haben Blazevic et al. nicht vorgenommen. Diesen Vergleich wiederum er·· brachte Edberg mit seiner Arbeitsgruppe (5), ebenfalls unter Verwendung des uber·· arbeiteten Identifizierungs-Handbuches (Ausgabe September 1978). Sie konnten an 768 frischen Isolaten die Dbereinstimmung zwischen Micro-ID und Rohrchentest in 98,5% feststellen. Zu vergleichbaren Ergebnissen kamen Barry u. Badal (2), die bei 433 Stammen (266 frische Isolate und 167 Labor-Stamme) eine Dbereinstimmung von 97% mit den Ergebnissen aus dem Rohrchentest fanden.

Die von den verschiedenen Autoren gefundenen Abweichungen in der Identifi­zierung bezogen sich nicht auf einzelne Gattungen oder Spezies, sondern zeigten eine relativ breite Streuung, die sicherlich durch das jeweilige lokale Keimspektrum mitbestimmt wurde. In unserer eigenen Untersuchung waren es uberwiegend Keime der Gattungen Enterobacter, Serratia, Klebsiella und Proteus, bei denen Identifi­zierungsabweichungen beobachtet wurden. Von Aldridge et al. (1) wurden Citro­bacter, Enterobacter, Proteus, Salmonella und Serratia genannt, Blazevic et al. (3) verweisen vor aHem auf C. divers us als Quelle der abweichenden Identifizierung (lysinnegative Stamme von E. coli) und Barry u. Badal (2) bemerkten Abweichungen bei Enterobacter, Serratia und besonders haufig bei Y. enterocolitica. Von Abwei­chungen bei der Identifizierung mit dem Micro-ID bei Providencia-Stammen und Citrobacter diversus hatten Stuver u. Matsen bereits 1978 berichtet (Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., Las Vegas, 1978). Interessant ist die Beobachtung von Buesching u. Mitarb. (4), daiS die haufigsten und typischen Isolate aus klinischen Untersuchungsmaterialien zu 98% korrekt mit dem Micro-ID-System identifiziert werden konnten (145 getestete Stamme), dagegen Keime, die ublicherweise nur sel­ten zu beobachten sind oder die ungewohnliche biochemische Reaktionen aufwiesen, nur zu 76% (161 getestete Stamme). Zu dies en seltenen Isolaten, die sich die Autoren aus der Stammsammlung des Centers tor Disease Control, USA, besorgt hatten, gehorten auch drei Keimspezies, die im Identifizierungs-Handbuch nicht vertreten waren: C. amalonaticus, ein Malonat- und H~S-negativer C. freundii; E. gergovia, ein Sorbit-negativer und Harnstoff-positiver E. aerogenes sowie das Peptobacterium (Erwinia-like). Wurden diese Keimarten aus der Untersuchung herausgenommen, konnten 94,5% der Keime mit ungewohnlichem biochemischen Verhalten ebenfalls korrekt mit dem Micro-ID-System identifiziert werden.

Ein bisher ungelostes Problem fur den Einsatz von Micro-ID im Routine-Labora­torium sind die gramnegativen nicht-fermentierenden Stab chen (Nonfermenter), deren Bedeutung als Isolate aus klinischen Untersuchungsmaterialien deutlich zu­nimmt. Zwar verweist der Hersteller von Micro-ID ausdrucklich auf den alleinigen Gebrauch fur Enterobakterien und die vorausgehende Cytochromoxidase-Testung, aber es bleibt dahingestellt, ob die generelle Oxidase-Vortestung wirklich konse­quent durchgefuhrt wird. Daruberhinaus gibt es eine Reihe nicht-fermentierender Keimspezies, die durch die Oxidase-Reaktion allein nicht von Enterobakterien ab­trennbar sind: Keime der Gattung Acinetobacter, P. maltophilia und einige Stamme

Identifizierung von Enterobakterien mit MICRO-ID® 331

von P. cepacia. Bei nicht durchgefiihrter Oxidase-Priifung besteht andererseits die Gefahr der Fehleinordnung von Aeromonas und Vibrio-Stammen. In Dbereinstim­mung mit den Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen fan den auch wir bei den getesteten Nicht-Enterobakterien gehauft den Hinweis auf Shigella sp. als Keim angabe im Identifizierungs-Handbuch: Shahidi u. Flejzor (Abst. C 139, Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., Los Angeles 1979) berichteten, daiS 18 von 29 nicht-fermentie­renden Stammen im Micro-ID zu dieser Diagnose gefiihrt hatten, die 14 anderen Reaktionsmuster ergaben Ziffern, die im Identifizierungs-Handbuch nicht vertreten waren. Die getesteten Spezies sind als "strains of oxidase-positive or nonfermenta­tive bacilli" bezeichnet und nicht naher identifiziert worden. Blazevic et al. (3) hatten unter 230 frischen Isolaten sieben oxidase-negative nicht-fermentierende Stamme (Gattung Acinetobacter und P. maltophilia), deren Reaktionsmuster im Identifizie­rungs-Handbuch nicht vertreten waren. Von sechs oxidase-negativen Nicht-Entero­bakterien-Stammen waren in der Untersuchung von Barry u. Badal (2) vier ohne sinngebende Code-Ziffer, zwei Stamme von P. maltophilia hatten ebenfalls zur Diagnose Shigella sp. gefiihrt. Zu gleichen Ergebnissen kamen Edberg et al. (5) bei Testung von acht Stammen der Gattungen Acinetobacter und Pseudomonas.

Diese iibereinstimmenden Befunde mit dem gehauften Hinweis auf die patho­genetisch und epidemiologisch so wichtige Keimgruppe Shigella bei Beimpfung von Micro-ID mit Nicht-Enterobakterien kann bei groiSziigiger Handhabung durch nicht ausreichend ausgebildete Untersucher zu Verwirrung und gegebenenfalls zu weitreichenden Folgen fiihren, obwohl im Identifizierungs-Handbuch stets auf die erforderliche serologische Absicherung dieser Diagnose hingewiesen wird.

Der Vorteil der extrem kurzen Bebriitungszeit bei insgesamt recht zuverlassiger Identifizierung kann nur dann sinnvoll genutzt werden, wenn die Gefahren einer maglichen Fehlbestimmung durch Nicht-Enterobakterien und die Probleme der Reinheits- und der Qualitatskontrolle beriicksichtigt werden. Zur Abgrenzung ge­geniiber Nicht-Enterobakterien sollten bei den infrage kommenden Code-Ziffern entsprechende Hinweise mit Vorschlagen zur genaueren Identifizierung gegeben werden. Die unverzichtbare Reinheitskontrolle kann friihestens mit einer etwa 10-stiindigen Verzogerung abgelesen werden und muiS gegebenenfalls die Befundkor­rektur einschlieiSen. Zur Frage der Qualitatskontrolle gibt es den Vorschlag von Barry u. Badal (2), die periodische Beimpfung des Systems mit bekannten Kontroll­stammen vorzunehmen, wobei sie zwei Inokulum-Dichten empfehlen (0,5 und 2,0 Triibungsgrade nach McFarland). Bei 36 Kontrollstammen (540 Einzelreaktionen) hatten sie festgestellt, daiS bei Verwendung des diinneren Inokulums 3 Einzelreak­tionen nicht der Erwartung entsprachen, bei dichter Einsaat waren es 18. Dieses insgesamt gute Ergebnis kannte, standardisiert nach Keimart und Einsaat, ein wich­tiges Qualitatskriterium werden.

Allerdings kann der Vergleich der Einzelreaktionen irrefiihrend sein, wie das Bei­spiel Harnstoffspaltung durch K. pneumoniae zeigt. Die industriell vorgefertigten Identifizierungs-Systeme sind heute ausnahmslos mit entsprechenden Auswertungs­Handbiichern versehen, die nicht auf Bewertung der Einzelreaktion, sondern auf die Reaktions-Muster der Keime im entsprechenden System ausgerichtet sind. Die Beurteilung der Einzelreaktion muiS dabei hinter die Qualitat des Gesamtsystems zuriicktreten. So ist es nicht verwunderlich, wenn auch fiir Micro-ID die Erwar­tungswerte fiir bestimmte wichtige Einzelreaktionen deutlich von denen nach Edwards u. Ewing (7) abweichen, ohne daiS sich die Identifizierungs-Ergebnisse gleichermaRen verandern. 1m Gegensatz zur iiblichen mehr hierarchischen Gewich-

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tung der Einzelreaktionen der "Bunten Reihe" durch den Mikrobiologen wertet sie der Computer gleichberechtigt. Deshalb wird es auch bei langerer bakteriologischer Erfahrung notig sein, das Identifizierungs-Handbuch zu verwenden, da das Gesamt­bild aller 15 Reaktionen wichtiger ist als bestimmte Schlusselreaktionen. Wie unsere Ergebnisse deutlich machen, fuhrten die zu beobachtenden Abweichungen von Einzelreaktionen insgesamt nur zu zahlenmafSig geringen Fehldiagnosen. Damit kann aber auch die Qualitatskontrolle nicht nur an det Einzelreaktion durchgefuhrt werden.

Micro-ID ermoglicht in Einzelfallen die Identifizierung von Enterobakterien aus klinischem Untersuchungsmaterial in weniger als 24 Std. Zu den sehr brauchbaren Hinweisen auf Zusatzreaktionen bei nicht eindeutigem Ergebnis fehlen bisher noch zeitgleiche Reaktionsansatze, damit der wert volle Zeitgewinn nicht wieder veri oren­geht. Die Direktbeimpfung aus der Blutkultur bringt erheblichen Zeitgewinn. Wie die Untersuchungen von Edberg et al. (6) und auch die eigenen Ergebnisse zeigen, muiS dieser Zeitvorteilnicht zu Lasten der Identifizierungsgenauigkeit gehen, wenn Reinheits- und Qualitatskontrol!e korrekt durchgefuhrt werden.

Bei bestimmten klinischen Indikationen oder in Verbindung mit Methoden zur Friihablesung des Agar-Diffusionstests zur Resistenzbestimmung (Eppenstein, D.; E.Isele u. K.Pelz: Hemmhofentwicklung und Fruhablesung beim Agardiffusions­test. Abstr. P II 9,37. Tagung DGHM, Berlin 1979) bzw. mit durch Automaten er­stell ten 5-Std.-Resistenzen bietet Micro-ID eine Moglichkeit, ohne grofSen appara­tiven Aufwand eine mikrobiologische Schnelldiagnose zu erstellen. Das System sollte dabei weniger als Alternative zu den herkommlichen 18-Std.-Systemen gesehen wer­den, sondern als Erganzung der bisherigen diagnostischen Moglichkeiten.

Mit dem Micro-ID-System stehr damit ein schnelles und ausreichend zuverlassiges Identifizierungs-System fur Enterobakterien zur Verfugung, das in entsprechenden Fallen zum Einsatz kommen sollte.

Literatur

1. Aldridge,K.E., B.B.Gardner, S.].Clark, and ].M.Matsen: Comparison of Micro-ID, API-20E, and conventional media systems in identification of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 7 (1978) 507-513

2. Barry, E. L. and R. E. Badal: Rapid Identification of Enterobacteriaceae with the Micro­ID System Versus API-20E and Conventional Media. J. Clin. Microbiol. 10 (1979) 293 -298

3. Blazevic, D.]., D.L.Mackay, and N.M. Warwood: Comparison of Micro-ID and API-20E systems for identification of Enterobacteriaceae. J. Clin.Microbiol. 9 (1979) 605-608

4. Buesching, W.]., D.L.Rhoden, A. O.Esaias, P.B.Smith, and ].A.Washington II: Evalu­ation of the Modified Micro-ID System for Identification of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbio!. 10 (1979) 454-458

5. Edberg, S. C., B.Atkinson, C. Chambers, M.H. Moore, L.Palumbo, C.F.Zorzon, and ].M.Singer: Clinical Evaluation of the Micro-ID, API-20E, and conventional media systems for identification of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 10 (1979) 161-167

6. Edberg, S.C., D. Clare, M.H.Moore, and ].M.Singer: Rapid Identification of Entero­bacteriaceae from Blood Cultures with the Micro-ID Systems. J. Clin. Microbio!. 10 (1979) 693-702

7. Edwards, P. R. and W. H. Ewing (ed.): Identification of Enterobacteriaceae, 3rd ed. Burgess Pub!. Co., Minneapolis (1972)

Dr. Wolfgang Peuckert, Dr. Klaus Peiz, Institut fur Allgemeine Hygiene und Bakterio­logie, Zentrum fur Hygiene, Universitat, Hermann-Herder-Str, 11, D-7800 Freiburg LBr.