ZbI. Mikrobiol, 139 (1984), 267-280

[Institut fur Phytopathologi e As chers leben del' Akademie del' Landwirt sch aftswissenschaft en del'D eutschen Demokratisch en R epublik]

Untersuchungen zur Erfassung des lat ent en Befallsstadiumsvon Corynebacterium sepedonicum (SPIECK. et KOTTH.) SKAPT. et BURKH.im Kartoffelgewebe

Studies on the Indication of the Latent Phase of Corynebacterium eep edonicum(SPIECK. et KOTTH.) SKAPT. et BURKH. in Potato Tissue

R. ZIELKE und K. NAUMANN

Mit 4 Abbildungen.

Summary

The ca usa l agent of potato ring rot, Corynebacterium sepedonicum (Sl'I ECK. et KOTTH.) SKAl'T.et B UUKH., is well -known for its long incubation period. Often its inoculum concen t ra t ion in thet issue of t he ho st does not rea ch to induce di stinct symptoms. Thus, during some years it ca n bedi stributed in potato materi al without to be detected. To inhibit the impor t and the seeding ofpo tato t u be rs la tently infected, special m ethods of detecting are necessary . In this paper, ase nsitive technique for indicating t he ca usa l agen t is proposed . I t is su itable for a n aly s ing sproutsan d tubers on potato ring ro t. The m a terial under t est must be cr us he d a n d t hereafter inocul a tedin yo ung egg plant (Sol anum melongena L .) for enr ichm ent of t he ca usa l age n t . Sim ult a ne ous ly,the samples homogenized are to a nalyse mi cr oscopically (Gram stain ing) a nd se rologica lly (ag ar­gel-diffusion t est from OUCHTERLONY).

B y suitable v arieties of egg pla n t, for example "Frtihviolette" a n d " B la ck B eauty ", ve ry lowce ll concentra ti on (less than 10 ce lls jrnl) in p lant tissue ca n be indicated.

F ollowing th is test on latent infestation by C. sepedonicum, it is possible to use the tuber s forfurther pl ant breeding s tu d ies .

Zusammenfassung

D el' Erreger del' B ak te r ienringfaule del' Kartoffel, Corynebacterium sepedonicum (Sl'IECK. etKOTTH.) SKAPT. et BURKH., ist fill' se ine lange Inkubationszeit b ek annt. Oft reicht sei ne Konzen.tration im Wirtsgewebe nicht aus, urn ein deu t ige Sy mptome h ervorzurufen. Dadurch kann er sichtiber J ahre hinaus unerkan nt im Kartoffelanbau verbreiten. Urn unter di osen Umstanden eine rmogl ich en Einschlepp ung vorzubeugcn, sin d spezifische Nach weism ethoden notwendig .

E s wird deshalb eine sehr em pfin dlich e und sichere Na chweism eth ode fiir den Erreger vorge­sch lagon , Sie ist sowohl fill' eine Kraut- a ls auch Knollenana lyse a n wen d bar . F ur diesen Zweckwerden di e gezogenen Prob en aufbereitet und tiber Test pfl anzen (S olanum melongena L .) anger ei­ch ert. P arall el hierzu erfolgt eine m ikroskopisch-zytologisch e (Grarn-Farbung) und sero logische(Doppcldiffusions-Test nach Ouchterlon y) Ana lyse.

Mit geeigne ten Eierfruchtsorten (z. B. " F r tihviole t te" , "Black Beauty") la ssen s ich sehr geringeK eimdich ten (unter 10 K eime pro ml) im Pflanzengeweb e nachweisen.

Di e m it Hilfe di eses Testes a uf ih re latente Verseuchung mi t. C. sepedonicum untersuchtenKnollen konnen anschlie13end zii chterisch weiterverwendet worden .

Di e Bakteri enringfiiule der Kartoffel (Erreger: Corynebacterium sepedonicum[SPIECK. et KOTTH.] SKAPT. et BURKH.) ist eine Quarantanekrankheit, die unterbestimmten Bedingungen zu betriichtlichen ErtragseinbuBen .fiihren kann. Mit dern

268 R. ZIELKE und K. NAUMANN

Auftreten diesel' Bakteriose muB auch in del' DDR gerechnet werden. Sie zahlt mitzu den bakteriellen Erkrankungen, die infolge ihrer langen Inkubationszeit erst dannsichtbare Symptome erkennen lassen, wenn bereits eine sehr weitgehende Durch­seuchung del' Vermehrungsstufen eingetreten ist. Aus diesem Grund sind Nachweis­methoden notwendig, die 'Schon in einem sehr friihen Befallsstadium eine sichereDiagnose gestatten. An einen derartigen Nachweis miissen folgende Anforderungengestellt werden:

hohe Aussagesicherheit auch bei geringen Stichprobenumfangen

Unabhangigkeit del' Versuchsdurchfiihrung und Aussagesicherheit vom Unter­suchungszeitpunkt

Erfassung sehr geringer Bakterienkeimzahlen im Pflanzengewebe (SproB- undKnollenmaterial)

Einsatz- und Durchfiihrbarkeit des Nachweises III Laboratorien ohne Spezial­ausriistung

geringe EinbuBen an wertvollem Zuchtmaterial.

Fur derartige Analysen stehen nul' wenige Methoden zur Verfiigung. Da bei einerlatenten Verseuchung mit sehr geringen Erregerkonzentrationen gerechnet werdenmuB, kommen nul' Verfahren in Betracht, die entweder so empfindlich sind, daB sieauch auf geringste Konzentrationen von O. sepedonicum. ansprechen oder eine Anrei­cherung dieses Erregers bewirken. Dies kann auf mechanischem Wege, d. h. durchZentrifugation, oder durch Inokulation in Anreicherungsmedien versucht werden.

Wegen del' extrem niedrigen Vermehrungsrate des Erregers in kiinstlichen Sub­straten scheidet eine Vermehrung auf selektiv wirksamen Nahrlosungen praktischaus. Jedoch haben die Untersuchungen von LELLIOTT und SELLAR (1976), OLSSON(1976) und SLETTEN (1980) gezeigt, daB durch Injektion von O. sepedonicum. in Eier­fruchtpflanzen (Solanum melongena L.) eine derartige Anreicherung stattfindet, sodaB ein Nachweis des Erregers an Hand del' von ihm erzeugten Symptome moglichwird, Eine solche Anreicherung ist offenbar auch mit anderen Wirtspflanzen, wie z. B.Tomaten, moglich (GOLENIA 1978).

In del' vorliegenden Arbeit sollte gepriift werden,

inwieweit die genannten Moglichkeiten unter normalen Laborbedingungen prakti­ziert werden konnen,

an welche Voraussetzungen diese Verfahren gekniipft sind und

ob eine routinemalsige Anwendung in del' Ziichtung moglich erscheint,

Material und Methoden

1. Kartoffelknollen und -sprosse

Von der zu untersuchenden Sorte, der Herkunft oder dem Klon wird eine reprascntabivc Stich.probe ausgewahlt, Bei Vorliegen eines umfangreichen Knollenmaterials werden 100 Kartoffelnausgewablt und in vier Proben von je 25 KnoIlen aufgeteilt; stehen nur einige wenige KnoIlen zurVerfiigung, mufs jede Knolle als Einzelprobe gewertet und untersucht werden, Zu testende Kar­toffelsprosse werden nach der Bliite iiber dem Erdboden abgeschnitten, getrocknet oder in frioschem Zustand aufgearbeitet.

AIle Proben werden gewaschen, auJ3erlich sterilisiert und mit sterilem Wasser nachgespiilt.

E rfa ssung des latenten Befall sst a d iu ms von G. sepe doni cum 269

2. NahrbodenIn vo rausgegange ne n U n tersuc h ungen (ZIELKE und NAU)IANN 1984 a) ha tten sich insb esonder e

de l' H efeex trakt-Dextrose-Ca COa·Agar u nd das 4-ML-Medium nach SNIESZKO und BONDE (1943)fur di e E rregerisolierung und -k ultiv ierung b esonder s bewahrt, Diese besitzen folgende Zusamm en­setzung :

H efeex trak t-Dextrose-Ca COa-Agar (YDCaA)Gluko se 20,0 gCaCO a 20,0 gH efeextrakt 10,0 gAgar 25,0 gAq ua dest. I 000 m lpH (Endwert) 7,0Sterilisation: 30 min bei 120 °C

4-ML-Medium nach SNIESZKO und B OND EPankreat.isches P epton 5,0 gCas am ino ae ids 3,0 gBakt o-Hefeextrakt 3,0 gMaltose 2,0 gLaktose 1,0 gAgar 18,0 gAqua dest. 1 000 mlp H (E ndwert) 7,0Sterilisation: 30 min bei 120 °C

3. Ei erfruchtpflanzen und ihre InokulationFiir einen biolog ische n Na chwei s von G. sepedonicum miissen Testpflanzen verwende t werde n,

di e selbs t bei sehr ni edrigen K eimdieh ten in de l' Pruflosung n och einde utige Symptome erke nne nla ssen . U nsere U nters uc h ungen wurden iibe rwiege n d mit Eierfruchtpflanzen (S. m elongena L.)del' Sorten "Bla ck Beaut y ", " Dons ko j 14", "Friihviolette", "Harbin 319" und "Tsinan Chang TaChie h" durchgefuhrt-) . Au f.Jerdem priiften wir zu Vergleich szw ecken z. T. Tomatenpflanzen(Sorte " R evermun" ).

Zu d iese m Zwe ck zogen wir d ie entspreehe n de n Pflanzen in K eimsch al en an und pikierten sie .Na ch Erscheinen des ers te n La ubbla t tes wu rden di e Sarnlinge in 9.cm.Topfe umgetopft. D ieInokula t ion erfolgte durch Ansteche n des Sprosses von del' Spit ze zur Basis im 2- bi s 3-Bl a tt.stadiu m; zu di esem Zeitpunkt b et rag t del' Stengeldurchmesse r ca . 1,5 b is 2,5 rnm.

4. Probenaufarbeitung (Abb. I )Knoll e

Mit Hilfe eines Stechbohrer s (ca . 15 mm Durchmesser) wurden aus dem Nabelteil del' KnolleB ohrker ne von 10 mm Lange entnomme n. Dadurch kormen d ie ge priiften K nollen anschlieJ3 endals Pflanzgut weiterverwendet worden. Die Bohrkerne zerrieb en wir unter Zugabe von 0,5 mlp ro Bohrkern Aqua dest.; del' so entstandene Gewebebrei wurde durch Verbandsmull filtriertund danach bei 150 g fiir 10 min zentrifugiert. Den dabei erhaltenen Uberstand behandeltenwir anschlieJ3end noehmals bei 8 500 g fur wiederum 10 min.

S te nge l

ZUl' Untersuchung von Sprossen sehn it ten wir ca. 10 em lange Stiic ke, a us denen mit Hilfeeine r Quetschzange Pflanzensaft gc wonne n wurde.Bei ge t roc kne tem :M:a te r ia l ma cht es sich notwendig, di e zu unter suchenden StengelabschnitteVOl' dem Pressen mehrer e Stunden vo rzuquelle n. Bei kleinen Prob en ist es giinstiger , den Pf'lan­zenstengel unter Zugabe von etwas Quarzsand zu zermorsern. Die wei tere Aufarbe it ung erfolg teanal og del' del' Bohrkerne.

1) H errn Dr. C. LEHMANN, Zentralinstitut fur Gen etik und Kulturpflanzenforschung del'Ad W del' DDR Gatersleben, m iichten wir an di eser St elle fiir d ie B er eit stellung del' Samenprobe nrecht herzlich danken,

270 R . Z IELKE u nd K . N AU AfANN

Ablau(schema zum Lalenznachweis von &'8.

VAH/ANTEl

~ 1.Aussage

/iewebeenlnahme

~ 2.Aussage

Lalenznachweis

HZ - Tes! == Hilff'08lfopisch - zy/ologischeT' Tes!

IJIJ - Test == IJoppe/diffusions/est

Abb . 1. Ablaufsche ma zum Latenzn achweis vo n Cory nebacterium sepedonicum im K art offel­ge webe.

5. Testdurchfiihrung

D er Nachweis eines la t en t en E rreger befall s in K ar t offelknollen und -sprossen wurde von unsa uf zwei getren nten W egen gefiihrt (Abb. I ).

I ) I sol ierung tiber Nahr rned ien und a nschlie fiende E rregerd iagnose (serolog isch er, zytologischerNachweis, B iotest)Von dem u nter 4. anger cicherten Zentrifugat wurde eine Verdiinnungsr eih c (1: 10) h er gestelltund auf das 4-ML-Mediuffi ausgestrich en. Nach einer Inkubationszeit von 14 bis 21 T agen(22 DC) impften wir d ie zu d iese m Zei tp unk t festst ellbaren, steckna delkopfgro13en, verda cht igenK olon ien (cremefa rben, opak, glattran dig) ab. Die so gewonne ne n I sola t e wurden 5-7 Tagedana eh in parallel durch gcfiihrt en Arbeitsschritten gramgefarbt, se ro logisch (D oppeldiffu sions ­Test) u nd biologiseh (B iotest a n jungen Eierfruc htpOanzon ) gepriift.B eim b iologische n Test zeig en sich - sofern es sieh urn pathogene I sola te handelt - n a eh 15bi s 40 Tag en an ein zeln en B lattern typische Kran kheitserscheinungen (U m klappon der Bl att ­rander }, B lattde formationen ode r W elkesymptome) (Ab b . 2).

II) Anreicher ung iiber d ie Testpflanze

Nach der zweiten Zen trifu gation (Absch n . 4.) wurde das Sedi ment in ot wa gleicher MengeWasser aufge nom men und serologisch und zytologisch (Gram-Farbung) untersucht so wiein junge Ei erfruchtpflanzcn injizier t .

Erfassung des lut onton B efallsstadiums von C. sepedotvicum 271

Abb. 2. CorynebacteriuTli sepedonic um- Sym pto me a n Bl iittern vo n So lanum melonqena a ls T est ­pflanze (Sorte : " F riihv iolette" ; rechts Bl a t t ei ne r K on t rollpflanze).

Bei Vor hande ns e in von Erregerzellen in del' Probe worden a n den Laubbla t tern Krankheits­erscheinungen sich t bar (Abb. 2) .Traten bi s zum 40. T ag p . i. a n den T estpflanzen keine Ver iinderungen im Vergleich zu r K on­trolle auf, so wurde del' T est abgebrochen und die Probe a ls befallsfrei eingesch abzb. Zeigtensich jedoch Veranderungen a n einzelnen infizierten Pflanzen (im Extremfall kann bei einersehr geringen Erregerkonz entration nul' eine Testpflanze erkr a nk en ), so en t na hm en wi r vondem geschiidigten Pflanzenmaterial aus del' Ubergangszone erneut Ge web e. Dieses wur de ,wie oben besehrieben, a ufbere ite t und er ne ut in di e T estpfla nze inokulier t ; parallel dazu unter­sueh te n wir den Gewebebrei mikroskop isch-zytol ogi sch und serologise h.

6. Bonitur und Befallsermittlung

D el' K rankheitsbefall a n den T estpflanzen wurde la ufend reg is t r iert. Di e E rmittlung des durch­sc hn ittl iehe n Krankheitsbefalls erfolg te analog den Anga ben vo n ZIELK E und NAUMANN (19 84 a) .

Ergebnisse

1. Em pfindlichkei tspriifungen an Eierfruc h t pflanzen

Urn zunachst einmal exakte Aussagen tiber die Empfindlichkeit und Eignung derEierfruchtpflanze (S . melonqena L.) als Testobjek t zu erha lten, Iiihrten wir mehrereInokulations-Versuche mit gestaffelten Erregerkonzentrationen und verschiedenenC.-sepedonicum-I solate n in Klimazellen durch. Diese Ergebnisse sind in den Abb. 3und 4 sowie der Tabelle 1 zusammengefaBt.

Die Dar stellung 3 zeigt einen GroBen vergleich der mit verschiedenen Keimdichteninokulierten Testpflanze " E ierfruc ht". Es wird hierbei eine Wu chsbeeinflussung durchdie Erregerkonzentration sehr deutlich. Danach rufen inokuliert.e C.-sepedonicum­Keimdichten > 1 X 104 Zellen /rnl Suspension neben der st arkeren Symptomausbildungeine groBe Wuchshemmung an der Testpflanze hervor.

272 R. ZIELKE und K. NAUMANN

Abb.3. Wuchshemmung bei Solanum melonqena nach Inokulation unterschiedlicher Corynebac­erium-sepedonicum-Zellkonzentrationen.

IJie AbhiingigJreit der Be[ollssfii"Jre von de" Errege" - lfonzenfration

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CorynBbocIB"iumsepedonicum - ]so/off:

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Abb. 4. Die Abhangigkeit der Befallsatarke an jungen Solanum-melongena-Pflanzen von derErregerkonzentration.

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274 R. ZIELKE und K. NAUMANN

In Abb. 4 sind fur die unterschiedlichen Inokulum-Konzentrationen die Pflanzen­Hinge und der mittlere Krankheitsindex ausgewiesen. AuBerdem werden in diesemDiagramm Ergebnisse aus parallel durchgefuhrten Inokulationen an Tomaten mitden Stammen C. s. 1 und A 5 dargestellt. Es wird zunachst deutlich, daB die Wuchs­hemmung mit steigender Inokulumdichte einhergeht. Die durchschnittliche Pflanzen­lange verringerte sich (im Mittel von 4 Versuchen) von 15,5 ern auf 9,1 em. Weiterhinwird in dieser Darstellung die unterschiedliche Pathogenitat der Erreger deutlich:So rief das Isolat C. s. 1 erst bei einer Konzentration von 1 X 107 Keimen/ml sichtbareKrankheitssymptome an der Eierfruchtpflanze hervor, das Isolat A 10 hingegenloste bereits ab 1 X 101 Keimejrnl typische Krankheitserscheinungen aus,

Inokulierte Tomatenpflanzen zeigten erst bei einer Keimdichte von 1 X 105 Zellenjml Blattsymptome (A 5-Isolat). Damit liegt ihre Empfindlichkeit im Vergleich zu Eier­fruchtpflanzen um eine bis drei Zehnerpotenzen niedriger, bei hoheren Inokulum­Konzentrationen werden aber bei Verwendung von Tomaten etwa gleiche Befalls­werte erreicht, wie dies fur S. melongena der Fall ist,

In Tabelle 1 wird die unterschiedliche Anfalligkeit (Befallshaufigkeit und -starke)von Iiinf ausgewahlten Eierfruchtsorten ausgewiesen und der Tomatensorte "Rever­mun" gegentibergestellt. Danach sind alle fiinf gepriiften Sorten fiir einen biologischenTest geeignet; geringe Keimdichten lassen sich allerdings mit der Eierfruchtsorte"Donskoj 14" nicht nachweisen. Sie reagiert erst bei 104 bis 105 Zellenjrnl Inokulum­dichte mit einer groBeren Befallshaufigkeit.

Irn Gegensatz hierzu waren schon 10 bis 100 Erregerzellen ausreichend, um beiden anderen Sorten an ca. 50-60 %aller Testpflanzen Krankheitssymptome hervor­zurufen. Die ausgewahlte Tomatensorte "Revermun" war in unseren Versuchen imVergleich zu "Donskoj 14" - insbesondere gegeniiber geringen Inokulumdichten- noch weniger anfallig ; erst 1 X 107 Zellen/ml riefen an allen Pflanzen Symptomehervor.

Die Befallsstarke (errechneter Krankheits-Index) verlauft mit der Befallshaufig­keit annahernd parallel. Danach waren mit geringen Keimdichten bei der Sorte"Donskoj 14" nur sehr niedrige Werte zu erreichen. Irn Gegensatz hierzu zeigte z, B.die Sorte "Frtihviolette" schon bei der niedrigsten Keimdichte einen Krankheits­Index, der deutlich tiber dem aller Vergleichssorten lag. Diese Testsorte ist demzufolgegerade fur einen Latenznachweis am besten geeignet. Die Tomatensorte "Revermun"bleibt auch nach diesem Bewertungskriterium weit hinter den Eierfruchtsorten zu­riick.2. Erzeugung von Knollenmaterial mit Corynebacterium sepedonicum-Befall

Da uns kein naturlich verseuchtes Kartoffelmaterial zur VerfUgung stand, wurdenfiir alle unsere Untersuchungen Knollen inokuliert (ZIELKE 1982), im Gewachshausund Versuchsfeld angebaut und geerntet. Tabelle 2 weist den auf diese Weise bei dengeernteten Kartoffeln erreichten Grad der akuten und latenten Verseuchung aus,

Den Ergebnissen zufolge andert sich der latente Erregerbefall von der Einlagerungim Herbst bis zur Fruhjahrsuntersuchung kaum. Jedoch ist eine Bonitur auf akuteVerseuchung im Friihjahr gunstiger als im Herbst, da es im Verlauf der Lagerung zueiner deutlichen Verschiebung in der Befallsquote kommt.3. Nachweis des Bakterienring£aule-Erregers in latent verseuchtenKartoffelknollen

Wie bereits oben erwahnt (s, Material und Methoden), suchten wir den latentenC.-sepedonicum-Befall im Knollengewebe auf zwei getrennten Wegen (Abb. 1) zuerfassen:

Isolierung tiber Nahrmedien und anschlieBende Erregerdiagnose und- Anreicherung tiber die Testpflanze.

Erfassung des latenten Befallsstadiums von C. sepedonicum 275

Tabelle 2. Untersuchungen zum Bakterienringfaulebefall der Knollen nach kunstlicher Pflanzgut­infektion uber die Augenkeime- Anteil befallener Knollen in Prozent -

Sorte

AstillaFringillaSalutXenia

Anzahl Herbstuntersuchung Fruhjahrsuntersuchuguntersuchter

davon befallen (%J davon befallen (%JKnollen

akut latent akut latent

300 2,0 54,0 24,5 56,0210 0 50,5 16,0 50,5350 1,0 58,0 20,5 58,0290 0 49,5 12,0 44,0

Die Ergebnisse der Isolierungsversuche sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Eswurden insgesamt 193 Isolate nach Gram-Farbung mikroskopisch untersucht bzw.serologisch und im Biotest geprtift. Danach erwiesen sich ca. 50 % aller Isolate alspathogen. Nur 45,2 % reagierten auch in den beiden anderen Tests positiv. Ein Viertelder als verdacht.ig angesehenen Isolate (21,3 %) war in allen drei Prufungen negativ.

Tabelle 3. Anzahl isolierter und gepriifter Bakterienisolate aus latent mit Corynebacterium sepe­donicum-verseuchten Kartoffelknollen

Nachweisverfahren Anzahl

absolut relativ

Anzahl untersuchter Isolate 193 100,0davon pathogen, d. h.

im Biotest + 101 52,3

im MZT, DD-T und Biotest + 87 45,2im MZT und im Biotest + 14 7,1

nur im MZT und/oder im DD-T + 51 26,4irn MZT, DD-T und Biotest 41 21,3

193 100,0

Erklarung: MZT = mikroskopisch-zytologischer Test,DD-T = Doppeldiffusions-Test.

In Tabelle 4 sind die Ergebnisse des Anreicherungsverfahrens tiber die Testpflanzenwiedergegeben. Es zeigt sich, daB bei dieser Methode ein hoherer Anteil von Probengefunden werden konnte, die im Biotest positiv reagierten (69,5 %). Von 128 unter­suchten Knollen waren ca. 60 %gleichzeitig in allen drei Testverfahren positiv. Dem­gegentiber lag der Anteil negativer Proben bei 14,1 %.

Wegen der deutlich besseren Isolierungsergebnisse wurde deshalb in den weiterenPrtifungen fiir den Nachweis eines C.-sepedonicum-Befalls stets dem Anreicherungs­verfahren der Vorrang gegeben.

4. Nachweis des Bakterienringfiiule-Erregersin latent verseuchten Kartoffelsprossen

Fur die Untersuchungen wahlten wir solche Kartoffelsprosse, die im Gewachshausaus inokuliertem Pflanzgut aufgewachsen waren und keine Symptome zeigten. EinTeil dieses Materials wurde luftgetrocknet vom Herbst bis Januar gelagert, einenanderen Teil arbeiteten wir unmittelbar nach der Ernte auf. Die Ergebnisse dieserSproBuntersuchungen sind in den Tabellen 5 und 6 zusammengestellt.

276 R. ZIELKE und K. NAUMANN

Tabelle 4. Zusammenstellung der auf latenten Befall mit Oorynebacterium sepedonicurn untersuchtenKartoffelknollen

Nachweisverfahren

Anzahl untersuchter Knollendavon Proben

im Biotest

im MZT, DD-T und Biotestim MZT und im Biotest

nur im MZT und/oder DD·Tim MZT, DD-T und Biotest

Anzahl

absolut

128

+ 89

+ 76

+ 13

+ 2118

relativ

100,0

69,5

59,410,116,414,1

128

Erklarung: MZT = mikroskopisch-zytologischer Test,DD-T = Doppeldiffusions-Test.

100,0

Tabelle 5. Zusammenstellung der auf latenten Befall mit Oorynebacterium sepedonicum untersuchtenKartoffelsprosse (frisches Material)

N achweisverfahren Anzahl

absolut relativ

Anzahl untersuehter Sprosse 120 100,0davon Proben

im Biotest + 95 79,2

im MZT, DD-T und Biotest + 71 59,2im MZT und im Biotest + 24 20,0

nur im MZT undjoder DD-T + 15 12,5irn MZT, DD-T und Biotest 10 8,3

120 100,0

Erklarung: MZT = mikroskopisch-zytologischer Test,DD-T = Doppeldiffusions-Test.

Tabelle 6. Zusammenstellung der auf latenten Befall mit Oorynebacterium sepedonicum untersuchtenKartoffelsprosse (getrocknetes Material)

Nachweisverfahren Anzahl

absolut relativ

Anzahl untersuchter Sprosse 75 100,0davon Proben

im Biotest + 59 78,7

im MZT, DD·T und Biotest + 49 65,4im MZT und im Biotest + 10 13,3

nur im MZT undjoder DD·T + 12 16,0irn MZT, DD-T und Biotest 4 5,3

75 100,0

Erklarung: MZT = mikroskopisch-zytologischer Test,DD·T = Doppeldiffusions-Test.

Erfa ssung des Iatenten Befallsstadiums von C. sepedonicurn 277

Den Ergebnissen in Tabelle 5 zufolge reagierten hei frischem Sproflmaterial voninsgesamt 120 gepriiften Trieben 71 (= 59,2 %) in a llen drei genannten Verfahrenpositiv. In nul' et wa 8 % del' Proben konnte kein Erregerbefall na chgewiesen werd en.I rn biologischen Tes t all ein zeigten ca . 80 %all er Triebe Befall ssymptorne; sie miissendah er als infiziert gelten .

Die Ergebnisse au s den Untersuchungen mit get rocknete n Kartoffelsprossen(Ta belle 6) weichen ni cht wesentlich von denen fri scher Tri ebe aboRiel' konnten zwarnul' insgesamt 75 Proben analysiert werden, dennoch entspricht del' prozentualeBefall sgrad - nach dem biologi schen Verfahren ermittelt - mit 78,7 % dem desfrischen Materials (79,2 % ). In etwa gleicher Hohe liegen a uch die mit all en drei Ver­fahren ermit telte n Ergebnisse (59,2 % frische, 65,4 % getrocknete Sprosse).

Diskussion

Fiir den Nachweis eines akuten Befalls mit Coryn ebacterium sepedonicum. (SPIECK.et K OTTH.) SKAPT. et BURKH. ste hen zahlreiche Methaden zur Verfiigung, die voneiner einfachen Schnittanalyse bis zur ELISA-Technik rcichen (NAUMANN U. a.1984, ZIELKE U. NAUMANN 1984a). Nicht aIle Diagnaseverfahren haben bisher breiteAnwendung in del' Praxis gefunden.

Weitaus schwieriger ist es, den Erreger diesel' Quarantdnekrankheit bereits ineine m latenten Befallsstadium zu erfassen (KATZNELSON u. SUTTON 1956, STROBEL U.

RAJ ]968, BARIBEAU u. MARCOTT), 1968, DEBoER u. COPEMAN 1974). Zu diesem Zweckhaben inzwischen LELLIOTT U . SELLAR (1976) sowie OLSSON (1976,1978) ein Verfahrenvorgesehlagen, das auf einer Anreicherung von C. sepedonicum. in E ierfruchtpflanzen(Solanum melonqena. L.) beruht.

Sehr geringe Erregerdichten in latent befallenen Kartoffelknollen wies au chSLE'1'TEN (1980) durch Ta uchino1ml at ion von Stengel-Stecklingen nacho

Entsprechend den Untersuchungen von OLSSON (1976) kommt es bei ein er Ino­kulum-Dichte von 100 Zellen jml nac h 20 Tagen zur Ausbildung deutlicher Symptomean del' Testpflanze. LELLIOTT U. SELLAR (1976) geben als EDso (Zahl del' Bakterien ,di e cine Reaktion an 50 % del' Pflanzen hervorruft) eine n 'Ver t von 4,2 bzw. 7,0Zellen an. J edo ch hangt nach ihren Erfahrungen die Empfindlichkeit ents cheidendvon del' Testpflanzengr613e ab ; ste igt del' Stengeldurchm esser von 2 mm auf iiber3 mm an, so ist fill' denselben Befall swert bereit s eine K eimdichte von 650 K eimeerforde rlich.

Die vorliegenden Untersuchungen beschaftigen sich insbesondere mit del' Frage,welche technischen und sonsti gen Voraussetzungen erfiillt sein miissen, urn ein ensicheren Nachweis eines latenten Befalls an dem in del' DDB. angebauten Kartoffel­material zu erreichen. Hierbei wurden insbesondere die Bedingungen fur den Einsatzvon E ierfruchtpflanzen als Nachweisverfahren geprUft.

In den von uns durchgefUhrten Injektionsversuchen mit steigenden Keimdichten(101_1011 Zellenjml Bakteriensuspension) zeigte sich dariiber hinaus, daB die EDsoent scheidend abhangig ist von

- del' Pathogenitat des Erregers (Abb. 4) und- del' verwendeten Ei erfruchtsorte.

In del' Gegenuberstellung von zwei ausgewahlten Ei erfruchtsorten "Black Beauty"(von LELLIOTT u. SELLAR [1976] empfohlen ) und "Friihviolette" zeigte sich, daB beisehr geringer Keimdichte (101-102 Zellen jrnl) die Sorte ,,:Friihviolet t e" sowohl imRinblick auf die Befallehsufigkeit als au ch hinsichtlich del' Befull sstarke (errechnet erKrankheits-Index) empfindlicher reagiert als "Black Beauty". Erst bei hoherenInjek tions-Konzentrationen kehrt sich das Verhaltnis um .

278 R. ZIELKE und K. NAUMANN

Weiterhin bestatigen unsere Ergebnisse die von OLSSON (1976) gemachten Erfah­rungen, daB Tomatenpflanzen in ihrer Empfindlichkeit der Eierfrucht weit unterlegensind. KaHN (1980) berichtete, daB in mehrfach wiederholten Priifungen bei Verwen,dung von Eierfruchtpflanzen mit jeweils den gleichen Erregerisolaten unterschied­liche Ergebnisse erzielt wurden. Eine derartige mangelnde Reproduzierbarkeit derErgebnisse konnte in den von uns durchgefuhrten Versuchen nicht bestatigt werden.Es ist abel' durchaus moglieh, daB einzelne Erregerisolate durch eine mehrmonatigeKultivierung auf kiinstlichen Nahrmedien in ihrer Pathogenitat sehr stark abfallenkonnen. Auch konnten wir bei der Anzucht von Testpflanzen beobachten, daB eineverlangerte Anzucht (infolge niedriger Temperaturen) stets zu einer verrnindertenAnfa.lligkeit fiihrt. In Extremfallen kam es sogar zu einem volligen Ausbleiben einerSymptomausbildung, obwohl die Pflanzengrofie nichtwesentlich iiber dem Optimumgelegen hatte.

Der von uns zunachst gewahlte Latenznachweis iiber eine Ausstrichplatte mit an­schlie13ender Kolonie-Isolierung ergab weniger giinstige Ergebnisse. Neben einemhoheren Arbeits- und Materialaufwand fiir die DurchfUhrung des Plattenverfahrensist insbesondere die Tatsache von Wichtigkeit, daB G. sepedonicum auf kiinstlichenNahrboden ein sehr langsames Wachstum zeigt. Dadurch werden diese Zellen - selbstbei sehr hohen Verdiinnungsstufen - durch andere, saprophytisch lebende Keimeiiberwachsen, wodurch sie unauffindbar werden. Zu gleichem Ergebnis kamen auchSAMSON u. POUTIER (1979) bei ihren Vergleichspriifungen (Gram-Farbung, Immun­fluoreszenz, Erregerbestimmung nach deren Isolierung).

Die Latenzpriifung von Knollen- und SproBmaterial iiber den Weg einer Anrei­cherung in der 'I'estpflanze Eierfrucht erwies sich somit gegeniiber der Isolierung vonKolonien als giinstiger. Infolge der hohen Empfindlichkeit geeigneter Eierfruchtsortenist es moglich - vorausgesetzt eine gro13ere Pflanzenzahl wird inokuliert - auch sehrgeringe Erregerkonzentrationen im Wirtsgewebe zu erfassen. Dabei ist es wenigerentscheidend, ob die Probe aus der Knolle oder aus dem SproB entnommen wird.

In dem von uns vorgeschlagenen Verfahren wird empfohlen, die Knollenprobeaus dem Nabelbereich zu entnehmen. Dadurch ist gewahrleistet, daf gerade bei wert­vollem Zuchtmaterial die gepriiften Knollen - auch die Untersuchung einer einzelnenKnolle ist gut moglieh - der Ziichtung nicht verlorengehen.

Unter sowjetischen Bedingungen hat sich eine generelle Untersuchung des Stengel­materials bei wertvollen Linien und einzelnen Stauden als sehr zweckmalsig erwiesen.Die Weiterverwendung des geernteten Knollenmaterials wird von dem Ergebnis derSproBuntersuchung abhangig gemacht (SNEJDER u. MURZAKOVA 1964, CURAKOVA1973, VOLOVIK u. CURAKOVA 1975). Dabei ist jedoch zu beriicksichtigen, daB derErreger der Bakterienringfaule sich nur sehr langsam im SproB ausbreitet (ZIELKE u.NAUMANN 1984 b) und es deshalb notwendig wird, die Probe aus dem untersten Sten­gelbereich auszuwahlen. Diese Stengelabschnitte sind auch in luftgetrocknetem Zu­stand fiir einen eindeutigen Erregernachweis verwendbar (Tabelle 6). Dieses Verfahrenfindet insbesondere in der sowjetischen Kartoffelziichtung breite Anwendung (TIPO­GRAF 1941, SNEJDER u. MURZAKOVA 1964, DUNIN u. MURZAKOVA 1965, CURAKOVA1973, VOLOVIK u. a. 1975).

Das vorgelegte Ablaufschema zum latenten Erregernachweis schlieBt insofern eineFehlinterpretation aus, als fur eine endgiiltige Aussage zwei getrennte Bioteste vor­gesehen sind. Es hat sich jedoch in der praktischen Handhabung gezeigt, daB bereitsim Ergebnis der ersten Inokulation in Eierfruchtpflanzen eine eindeutige Aussage inVerbindung mit Gram-Farbung und serologischer Priifung in der Regel moglich ist.Damit entfa.llt dann die Wiederholungs-Injektion als Bestatigung. Lief sich hin­gegen bei der ersten Aussage in keinem del' drei Testverfahren (entsprechend Abb. 1,

Erfassung des latenten Befallsstadiums von C. sepedonicum 279

Variante II) ein positiver Nachweis erbringen, wurde von uns in der Regel eine weitereAnalyse vorgenommen. Wir haben allerdings in keiner unserer Priifungen festgestellt,daB nach dem negativen Ausgang der ersten Priifung bei einer zweiten Analyse einpositive! Befall registriert wurde.

Es muf jedoch abschlieGend hervorgehoben werden, daB es bei einer sehr geringenErregerzahl in der Probe - trotz einer grofieren Zahl inokulierter Eierfruchtp£lanzen- mitunter nur bei wenigen (in seltenen Fallen ein bis zwei) Pflanzen zur Ausbildungvon Symptomen kommt. Aus diesem Grund ist in Zweifelsfallen ein zweiter Biotestangebracht.

Fur die Notwendigkeit, die Inokulation von Eierfruchtpflanzen bei einem negativenersten Test zu wiederholen, spricht auch die Tatsache, daB insbesondere dann, wennnur ein bis zwei Kartoffelknollen fiir eine Priifung zur Verfiigung stehen, der gewon­nene PreBsaft nur fiir wenige Eierfruchtp£lanzen ausreicht. Fiir eine sichere negativeAussage miissen nach unserer Auffassung mindestens 30 Pflanzen getestet werden.

Literatur

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Eingegangen am 30. 12. 1982

Anschrift der Autoren:

Dr. R. ZIELKE und Dr. so, K. NAUMANN, Institut fur Phytopathologie Aschersleben der Akademieder Landwirtschaftswissenschaften der Deutschen Demokratischen Republik, DDR· 4320Aschersleben, Theodor-Roemer-Weg.