1.Introducere L-acid ascorbic (vitamina C), reprezint un antioxidant de exceptie ce contribuie activ la franarea proceselor degenerative din organism. Facnd parte din grupa vitaminelor hidrosolubile (solubile in apa) acidul ascorbic se elimina n cantitati mari din organism. L-enantiomerul acidului ascorbic se mai numete i vitamina C (numele de "ascorbic" vine de la proprietatea sa de a preveni i vindeca scorbutul). Primatele (incluznd oamenii) i cteva alte specii din regnul animal, notabil fiind porcuorul de guinea, i-au pierdut proprietatea de a sintetiza vitamina C i trebuie s i-o procure din alimente sau din alte surse.[1] Acidul ascorbic i srurile sale de sodiu, potasiu i calciu sunt des folosii ca aditivi alimentari antioxidani. Aceti compui sunt solubili n ap i, deci, nu pot proteja grsimile de oxidare: pentru acestea, esterii liposolubili ai acidului ascobic cu caten lung de acizi grai (ascorbil palmitat sau ascorbil stearate) pot fi folosii drepti antioxidani. Numele aditivilor alimentari europeni relevani sunt: E300 acid ascorbic, E301 ascorbat de sodiu, E302 ascorbat de calciu, E303 ascorbat de potasiu, E304 esteri ai acidului ascorbic cu acizi grai ascorbil palmitat,ascorbil stearat.[1] n 1937 Premiul Nobel pentru chimie a fost acordat la Walter Haworth pentru munca sa n determinarea structurii acidului ascorbic. Acidul ascorbic este oxidat foarte uor i de aceea este folosit ca reductor n soluiile de developare fotografic (printre ali compui) i drept conservant. Expunerea la oxigen, lumin, cldur si metal distrug acidul ascorbic, deci trebuie pstrat la ntuneric i rcoare, ntr-un recipient non-metalic. Forma oxidat a acidului ascorbic se numete acid dehidroascorbic.[1] Acid ascorbic se gsete n fructe i legume, cum ar fi citricele (portocalele, lmile, mandarine, etc), pepeni galbeni, rosii, ardei, broccoli, legumele cu frunze verzi, cum ar fi spanac, cartofi i napi. Are un rol deosebit de important n producia de vin, bere, lapte, buturi rcoritoare i sucuri de fructe. n industria vinului, acid L-ascorbic poate fi adugat pentru a preveni oxidarea vinului.[2] 2. Utilizarea acidului ascorbic Antioxidanii reprezint un grup de aditivi care se utilizeaz pentru pstrarea calitii grsimilor, mpiedicnd procesul de degradare a grsimilor prin autooxidare (rncezire aldehidic). n cazul alimentelor, degradarea grsimilor, pe lng faptul c face alimentele improprii consumului (modificnd gustul i mirosul), reduce i valoarea lor nutritiv. Grsimile degradate oxidativ au efect duntor asupra organismului prin aciune distructiv asupra vitaminelor A, E, C, B2 , B6 din alimente (avitaminoze secundare), prin lezarea mucoasei gastrice i intestinale, n care

caz se ajunge la scderea coeficientului de utilizare digestiv a alimentelor i prin aciunea peroxizilor i radicalilor din grsimile autooxidate asupra membranelor celulare, asupra unor vitamine din organismul uman . Antioxidanii pot fi clasificai n antioxidani propriu-zii i antioxidani secundari. Substanele care ntresc aciunea antioxidanilor se numesc sinergetice. Dup originea lor antioxidanii pot fi naturali i de sintez.[3] Acid ascorbic se compor ca un antioxidant prin disponibilitatea sa de a se oxida n condiii energetice favoranile. Oxidanii (numii tiinific specii de oxigen reactiv) precum redicalul hidroxil (format din peroxid de hidrogen), conin un orbital monoelectronic i de aceea sunt foarte reactivi i duntori oamenilor i plantelor la nivel molecular. Acest lucru are loc datorit interaciei lor cu acizii nucleici, proteinele i lipidele. Speciile de oxigen reactiv pot 'extrage' un atom hidrogen din ascorbat, care devine astfel monodehidroascorbat, dar imediat ctig un alt electron pentru a redeveni dehidroascorbat. Speciile de oxigen reactiv sunt reduse in prezenta apei, n timp ce formele de ascorbat oxidat sunt relativ stabile i nereactive, necauznd nici un ru celulei.[1] n plante, L-ascorbic acid este esenial pentru activitatea n timpul fotosintetice de detoxifiere a superoxid i peroxid de hidrogen n cloroplastele, n lipsa catalazei. Asa este, de asemenea, implicat n regenerarea -tocoferol. Vitamina C joac un rol major n procesul de fabricare i de aprare a esutului conjunctiv. Reprezinta un ingredient principal al colagenului, o substan lipicica, care leag celulele mpreun pentru a forma esuturi [4]. Acid ascorbic ajut sistemul imunitar pentru a lupta mpotriva cotropitorilor strini i celulele tumorale. Acid ascorbic susine, de asemenea, sistemul cardiovascular, prin facilitarea metabolismul grsimilor i a esuturilor de protectie daune radicalilor liberi, i asist sistemului nervos prin transformarea amino-acizi n anumite neurotransmitori.[5] Pielea, dini i oase de asemenea beneficiaza de acid ascorbic. Aceasta antioxidant contribuie la meninerea oaselor sanatoase, prevenirea bolilor parodontale si vindecarea ranilor. Servete chiar ca o aspirina naturala, prin controlul inflamaie i durere.[6] Acidul ascorbic contribuie la o varietate de funcii biochimice, biosinteza aminoacizi i aminelor ce reglementa sistemul nervos. El ajut, de asemenea, corpul s absoarb fier i in reactia histaminei, componenta inflamatorie a reaciilor alergice. Condiia referitoare la deficitul de vitamina C este scorbutul, care este caracterizate de boala a gingiilor, durere la nivelul muchilor i articulaiilor, leziuni ale pielii, oboseal, i sngerri. Un adult are nevoie de 10 miligrame de vitamina C pe zi pentru a preveni scorbutul. Unele studii au artat c o doz zilnic de 100 mg sau mai mult este necesara pentru a menine in organism vitamina C. [7] Persoanele n vrst sunt cunoscute pentru lipsa de vitamina C, n primul rnd pentru c dieta lor este sracita. ntr-un sondaj din 1978, persoanele n vrst au avut doar jumtate din nivelul de acid ascorbic n snge, la fel ca i subiecii mai tineri. Conform studiilor de cercetare, brbai i femeile peste 65 de ani nevoie de doze zilnice de 150 mg i 75 - 80 mg, respectiv, pentru a menine un nivel plasmatic de 1,0 mg / dl. Ca un antioxidant, acidul ascorbic, rolul principal este de a neutraliza radicalii liberi. Deoarece acidul ascorbic este solubil n ap, se poate lucra att n interiorul ct i n afara celulelor pentru a controla daune radicalilor liberi.

Crnurile srate (cu adaos de NaN02 i NaCl) la depozitare n stare congelat se oxideaz mai uor, sarea avnd rol prooxidant, efect ce poate fi contracarat prin adaos de acid ascorbic. Efectul clorurii de sodiu este mai evident n prezena aerului i n absena antioxidanilor; de aceea, produsele de carne srate se congeleaz i se depoziteaz dup ambalare sub vid, n care caz durata de pstrare este aproximativ aceeai la -12oC, -18oC i la -24C. Substanele cu aciune oxidant sunt recomandate la prelucrarea finurilor de calitate slab, n scopul creterii elasticitii i rezistenei glutenului, respectiv pentru mbuntirea nsuirilor reoogice ale aluatului. Aciunea lor se bazeaz pe oxidarea gruprilor -SH din aluat. Dintre oxidani cel mai folosit este acidul ascorbic care, dei este un reductor, n aluat n prezena oxigenului acioneaz ca un oxidant, deoarece este oxidat enzimatic n prezena enzimei ascorbat oxidaz la acid dehidroascorbic care, de fapt, are aciune oxidant. Se folosete n doze de 10-100 pri pe milion i se introduce n maia sau n aluat.[3] Tratarea berii cu substane antioxidante, care are drept scop legarea oxigenului dizolvat n bere i protejarea altor compui susceptibili la oxidare prezeni n bere. Se utilizeaz acidul ascorbic n cantitate de 2-8 g/hl, care poate compensa aciunea oxigenului dintr-o bere care conine 0,5-1,0 mg 02 bere. Acidul ascorbic se adaug n berea filtrat nainte de tragere.[3] Din totalul de peste 80.000 tone produse anual, circa o treime se utilizeaz n industria farmceutic (multivitamine, tablete, siropuri, comprimate efervescente etc.), restul utilizndu-se n special n calitate de conservant n industria alimentar sau n industria cosmetic [8]. 3. Metode de extractie Acidul ascorbic se obine prin extracie din diferite materii prime vegetale, prin sintez chimic, prin biosintez sau prin procedee combinate de sintez chimic i biosintez. Indiferent de metoda de obinere, separarea i purificarea necesit numeroase etape, care implic consumuri ridicate de materiale i energie. Soluia final din care trebuie extras acidul ascorbic conine numeroase produse secundare, cel mai important dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. n ciuda faptului c fiecare etap a procesului decurge cu randamente de 90%, conversia global a glucozei n acid ascorbic nu depete 60% [8]. Datorit caracterului labil al acidului ascorbic, procedurile de extracie sunt proiectate pentru a o stabiliza. Cooke i Moxon [11] a revizuit literatura de specialitate pn la 1981 i a constatat c 20 sau mai mult soluiile de extract au fost folosite de ctre cercettori cu un numr mare de matrici biologice. Soluiile de extract ar trebui s menin un mediu acid, s inactiveze oxidaz acidului ascorbic, s limiteaze oxigenul i s precipite amidonul i proteinele. Alegerea depinde de soluia de extract si de prob matrice determinand procedur. Acidul metafosforic inhib oxidaza acidului L-ascorbic, inhib cataliza din metal, i precipita protein. Amidonul este problematic n sensul ca interfereaz cu titrarea colorimetrica i teste fluorometrice. Adaosul de etanol sau aceton pentru a extrage precipitate metafosforic solubilizeaza amidonul. Acest pas este necesar pentru a analiza prin metode spectroscopice multe legume, inclusiv cartofi, legume, porumb. Aceton este de asemenea util pentru a elimina

metabisulfit i dioxid de sulf din fructele deshidratate si din sucuri de fructe. Aceti ageni de reducere interfereaza cu 2,6-dichloroindophenol (DCIP) in titrare. EDTA este ca un chelator activ n extractia acidului ascorbic. [11] Toate procedurile de extracie trebuie s fie completat de lipsa lumini pentu a limita reactile oxidative. Metodelor de reducere a dimensiunii particulelor ar trebui s evite acumularea cldurii. Ori de cte ori este posibil, eantionul trebuie adugat azot peste eantionul iniial. Liofilizare nu este recomandata pentru concentraia probei sau conservarea, deoarece stabilitatea vitaminei C scade n umiditate matricei poroase. Stabilitatea acidului ascorbic total (acid L-ascorbic + acid L-dehidroascorbic) n ser poate fi extins pentru perioade lungi de timp, n condiii corespunztoare. Adaosul de acid metafosforic (50 g L-1) stabilizeaz n mod eficient acidul ascorbic in gel atunci cnd este inut la congelat -70C. Institutul Naional de Standarde i Tehnologie (NIST) Standardul de referinta Material (SRM) 970, acid ascorbic in ser, este stabilizat cu acid metafosforic 50 g L-1. Margolis Park [12] a artat c degradarea poate aprea la plasarea de soluii de acid L-ascorbic n flacoane nainte de analiz. Ei au artat c n interiorul suprafeei de sticl poate conine materiale, cum ar fi urme de metale care poate degrada rapid de acid L-ascorbic. Ei au evaluat nou feluri de flacoane de la cinci furnizori i au constatat variaii mari n stabilitatea acidului Lascorbic stocate n flacoane diferite. Eliminarea efectiv a degradrii implica nmuierea flacoanelor n 0,5 mol L-1 NaOH timp de 30 minute; cltirea cu ap distilat, ap deionizat; nmuiere n 1 mol L-1 HCl i din nou, cltire cu ap distilat, deionizat. Rizzolo [13] a artat c manipularea i depozitarea fructelor proaspete a fost esenial pentru stabilitatea acidului L-ascorbic nainte de analiz. Solutia fiind congelare n azot lichid i depozitarea probelor nainte de extracie la -80C. Acid ascorbic se extrage din celule prin ruperea esutului ntr-un mediu potrivite pentru extracie. Varza, la fel ca multe esuturi de plante superioare, poate fi uor omogenizate prin mcinarea ntr-un mojar i cu un pic de nisip curat (pentru a face procesul mai uor). Pentru o msurare exact a coninutului de acid ascorbic, extracia de acid ascorbic trebuie s fie complet, acid ascorbic poate fi pierdut prin degradare. Multe plante conin oxidaza acid ascorbic, care catalizeaz oxidarea acidului ascorbic la acid dehidroascorbic (Figura 1). Atunci cnd celulele sunt pregtite pentru extractie, componentele din celule, care sunt de obicei separate prin membrane, se amestec mpreun. n aceste cazuri, oxidaza acidului ascorbic poate catalizeaza oxidarea acid ascorbic iniial prezente n esut. [9]

Fig 1 Acidul ascorbic i oxidare sa in ascorbat i acid dehidroascorbic

Pentru a evita pierderea de acid ascorbic, se recomand s se piseze esutul de proba n 5% acid metafosforic, care va inactiva oxidaza. Atomi de hidrogen dintre cele dou grupe de enol de acid ascorbic poate fi uor oxidat (Figura1), ceea ce face acid ascorbic un agent puternic de reducere. Avnd n vedere utilizarea pe scar larg de acid ascorbic n conservea fructelor, legumelor, alimente de origine animal i medicamente, pentru a permite determinarea acidului ascorbic multe tehnici analitice sunt disponibile, cum ar fi titrimetrice, spectrophotometrie, derivat spectrophotometric; colorimetrie, cinetica-spectrophotometrice, debitul de injecie spectrofotometric, lichid de nalt performan chromatographic (HPLC). Determinarea acidului ascorbic din usturoi, piper verde si castan a fost interpretat de derivate spectrofotometrie fr a folosi nici o pre-separare sau tehnici de corectare de fond. Metoda se bazeaz pe msurarea distanelor dintre dou valori extreme (amplitudinea vrf la vrf) n scopul de al doilea i al treilea spectrele derivate din extracte.[10] 1.Titrarea cu 2,6-Dichloroindophenol Titrare cu DCIP a fost introdusa de Tillmans n 1930[14]. DCIP este redus de acid L-ascorbic la o soluie incolor de la culoarea albastr. Acid L-ascorbic este oxidat la dehidroascorbic acid i colorant n exces roz rmne n soluie de acid, formnd final vizual a titrrii. Absorbana la 518 nm, pot fi utilizate alternativ, la determinarea vizual punctul final. Exist o serie de deficiene importante cu acesta metoda. Cel mai important, este de titrare acid dehidroascorbic nu va fi msurat cu excepia cazului n care este redus la acid ascorbic. Titrarea nu va face diferena ntre acid L-ascorbic i isoascorbic acid. Metoda nu poate fi folosit pentru analiza de vitamina C. DCIP titrare poate fi folosit pentru sucuri proaspete si multivitamine care nu conin cantiti excesive de cupru sau iron. Extracte foarte colorate din fructe i legume pot masca schimbarea culoari la titrare lui. Reducerea DCIP nu se limiteaz la acid L-ascorbic, precum i orice substan prezent reducerea n eantion poate reduce colorantul. Astfel de interferene pot duce la msurtori n mod eronat de mare, n cazul n care nu sunt recunoscute. Substane care pot interfera includ ioni de cupu, de fier, i ioni de staniu, sulfite, tiosulfat, taninuri, betanin, cisteina, glutation.. Metoda include urmtoarele etape: 1. Extracia: acid L-ascorbic este extras din materiale uscate cu metafosforicacid care conin acid acetic glacial. Soluia este stabilizat timp de 7 pn la 10 zile in frigider. Extractul, este utilizat pentru a dilua sucuri sau alte probe de lichid. Pentru analiza, extractantul este pregtit prin nlocuirea apei n extractant cu 0,3 N H2SO4. Dup filtrare sau centrifugare, reziduurilor ar fi extras cel puin o dat suplimentare prin amestecul n extractant. Extracie corespunztoare, inclusiv protecia de lumina, viteza, duce la recuperri mai mare de 95%, cu formarea minim de acid dehidroascorbic. 2. Titrarea: extractele limpezite se titreaz cu vopsea standard pregtit de ctre dizolvarea 50 mg DCIP Na sare (Eastman Kodak Nr 3463) n 50 ml de ap care conin 42 mg de NaHCO3, cu diluare la 200 ml cu ap. Soluia colorant este filtrat i stocate la frigider ntr-un recipient din sticl de chihlimbar. Concentraia DCIP este exprimat n mg echivalent acid L-

ascorbic pe 1.0 ml soluie colorant. Factorul de echivalen este determinat prin adugarea a 2 ml de acid L-ascorbic standard (1,0 mg mL-1) la 5 ml de extractant, rapid i titrare cu o soluie de vopsea la o culoare roz persist timp de 5 s. Acest lucru ar trebui necesita aproximativ 15 ml de soluie DCIP. Un martor determinarea este condus prin titrarea 7 ml de ap de extracie care conine egal cu media volumul de vopsea necesare pentru a se titreaz standard de acid ascorbic. Blanks trebuie s se apropie 0,1 ml soluie DCIP, care prevede un control imediat asupra reactiv de calitate

2. Metoda cu 2,6-diclorofenol-indofenol Se bazeaz pe proprietile de reducere a acidului ascorbic asupra 2,6-diclorofenolindofenol ntr-un mediu acid, atunci cnd acidul ascorbic este transformat n acid dehidroascorbic i substana oxidat, care este de culoare , se transform n forma sa redus, care este de alta culoare. PH-ul acid al mediului de reacie este asigurat de acid oxalic. Aciditatea mediului de reacie este o necesitate din cauza mai multe motive, dup cum urmeaz: - Pierderea de acid ascorbic din extracte din cauza oxidari cu aer este mpiedicat; - Viteza de reacie ntre agentul colorant i acid ascorbic este crescuta; - Aciunea reductiv de substane strine, gsite n produsul analizat, este redus foarte mult, fcnd astfel posibila schimbarea culoari. Ca reactiv i indicator sare de sodiu a 2,6-diclorofenolindofenol are o culoare albastru, in mediul acid trece de la albastru la culoarea roz. Coninutul n acid ascorbic este variabil de la un extract de la altul, datorit compoziiei chimice pe de o parte anatomice cercetate de plante i, de asemenea, ca urmare a solventul folosit. Acest lucru este, de asemenea, confirmate de alte studii n conformitate cu care -tocoferol au un efect protector fa de acid ascorbic. Procentul de protecie este variabil, n conformitate cu raportul amestecului dintre aceste antioxidanti, cercetrile arat c acidul -tocoferol i ascorbic, i amestecuri de acid ascorbic avea un efect semnificativ mai bune dect alte combinaii. Pentru a verifica declaraiile de mai sus HPLC (cromatografie lichid de nalt performan), a fost folosit pentru a determina coninutul celor trei analizate extracte vegetale. Colorani 2,6 diclorofenol-indofenol (DCIP) este albastru n mediu alcalin, roz n mediu acid, i poate fi redus de acid ascorbic la o culoare incolor form "leuco" (Figura 2).

Figura 2. Reducerea DCIP la DCIPH2. 3. Detectarea acidului ascorbic prin metoda electochimica Se bazeaz pe oxidarea acidului ascorbic(fig. 3). Amperometric i coulometric sunt msurtorile la un potenial electrod constant. Principala diferen ntre aceste dou msurtori este cantitatea de analit oxidat n detector: n amperometric oxidare este limitata; n coulometric, analitul este complet oxidat. Structura unui detector de amperometric este de obicei un ''flux de celule'', ntruct, n coulometric o poros ''celule'' fluxul prin aceasta este utilizat. n coulometrie, o cantitate mai mare a analitului este permis n contact cu suprafaa electrodului i sensibilitatea crete. Lucrul cu detector electrochimic, componente ale faz mobil trebuie s permit separarea distinct de acid ascorbic i s fie conductoare s efectueze responsabil de analit. Cu toate acestea, faza mobil nu trebuie s produc prea mare fond de semnal.

Figura 3 Analiz cromatografic cu detecie coulometric de probe acid ascorbic. Coloana a fost C18, 75 3.9 mm diametru, dimensiunea particulelor 4 I m, echipat cu un precolumn C18.Faza mobil a constat, de 0,1 M fosfat disodic pe baz de hidrogen, 2,5 mmdisodiu EDTA, i 2,0 mm n-dodecyltrimethylammonium clorur, pH-ul 3.0. Semnalul detectorului

este exprimat n mA. (O prob) apoas care conine 35 I M de acid ascorbic (echivaleaz cu o trie injecie de 17,5 p.mol de acid ascorbic). (B) Proba apoas se reduce cu DTT. (C) Tipic plasm eantion. (D) Plasma proba redus de DTT. (E) proba cu plasm, dup incubare cu 5 I M CuBr2 (5 min, 25A C). (F), proba cu plasm, dup incubare cu oxidaz acid ascorbic (5 min, 25A C). [10]4. Extracia acidului ascorbic cu Amberlite LA-2,

Studiile efectuate arat c n acetat de butil separarea decurge prin intermediul unei reacii interfaciale de ordinul I ntre acid i extractant: Procesul este controlat de concentraia extractantului n faza organic i de valoarea pH-ului fazei apoase. Un grad de extracie de 90% se obine la o concentraie iniial a extractantului de 160 g/L i un pH = 1 n faza apoas iniial. Gradul de extracie poate fi mbuntit cu 6 23% prin adugarea unui modificator de faz (2octanol), care mrete polaritatea solventului. Modelarea matematic a procesului de extracie arat c eficiena extraciei este influenat n proporie de 91,1% de ctre concentraia iniial a extractantului n faza organic i de ctre pH-ul fazei apoase (fig 4), ceilali factori (intensitatea amestecrii, temperatura, raportul volumic al fazelor etc.) influennd procesul ntr-o mai mic msur [3].

Figura 4. Influena pH-ului fazei apoase i a concentraiei extractantului la extracia reactiv a acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 n acetat de butil

Bibliografie

[1] http://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_ascorbic

[2] Izumi, K. 1992. Reaction of nitrite with ascorbic acid or ascorbic acid-2-derivatives. J. Food. Sci.57:1066. [3] Constantin Banu- Manualul inginerului din industra alimentara. Ed. Tehnica Bucuresti 1998 [4] Gaby S.K , Singh V.N., 1991 - "Vitamin C," Vitamin Intake and Health: A Scientific Review, S.K. Gaby, A. Bendich, V. Singh and L. Machlin (eds.) Marcel Dekker, N.Y. p. 103-1043 [5] Schectman G., Byrd J.C., Hoffmann R., 1991 - Ascorbic Acid Requirements for Smokers: Analysis of a Population Survey, American Journal of Clinical Nutrition, 53:1; 1466- 70 [6] Valnet J., 2002 Phytotherapy Treatment by plants. Gramond, Bucharest [7] Kronhausen E., Kronhausen P., Demopoulos M.D., 1989 - Formula for Life, William Morrow and Co., New York, p. 95 [8] Gavrila Lucian., Curs tehnici de separare i concentrate n biotehnologi. [9] Carol Reiss. Measuring the Amount of Ascorbic Acidin Cabbage [10] Ball, G. F. M., Chemical and biological nature of the water-soluble vitamins, In Water Soluble Vitamin Assays in Human Nutrition, Chapman and Hall, New York, 1994, chap. 2. [11] Cooke, J. R. and Moxon, R. E. D., The detection and measurement of vitamin C, In Vitamin C, Counsell, J. N. and Horning, D. H., eds., Applied Science Publishers, London, 1985, p. 303. [12] Margolis, S. A., Paule, R. C., and Ziegler, R. G., Ascorbic and dehydroascorbic acids measured in plasma preserved with dithiothreitol or metaphosphoric acid, Clin. Chem., 36, 1750, 1990. [13] Rizzolo, A., Brambilla, A., Valsecchi, S., and Eccher-Zerbini, P., Evaluation of sampling andextraction procedures for the analysis of ascorbic acid from pear fruit tissue, Food Chem., 77, 257,2002. [14] Tillmans, J., The antiscorbutic vitamin, Z. Lebensm. Unters.-Forsch, 60, 34, 1930.