5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests
Transcript of 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests
My5-FU™ Reagents
© 2017 Saladax Biomedical, Inc. English 1
My5-FU™ is a trademark of Saladax Biomedical, Inc. Printed in USA
PI 5FU-RGT, 18 October 2017, revision 09
5FU-RGT
5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay
This package insert must be read carefully prior to product use. Package insert instructions must be
followed accordingly. Reliability of assay results cannot be guaranteed if there are any deviations
from the instructions in this package insert.
Customer Service:
Telephone: +1 610 419-6731
Fax: +1 610 849-5001
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in vitro Diagnostic Device
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Authorized Representative
in the European Community
Reagent 1
Manufacturer
Reagent 2
EMERGO EUROPE
Prinsessegracht 20
2514 AP The Hague
The Netherlands
Saladax Biomedical, Inc.
116 Research Drive
Bethlehem, PA 18015 USA
www.saladax.com
R1
R2
English 2
Intended Use
The Saladax 5-Fluorouracil (My5-FU) Assay is an in vitro diagnostic medical device intended for the
quantitative determination of 5-FU in human plasma using automated clinical chemistry analyzers as
an aid in the management of 5-FU therapy.
Summary and Explanation of the Test
5-FU (Adrucil, among others) is a chemotherapeutic agent used in the treatment of several solid
tumor cancers, especially in colorectal, stomach, breast, pancreatic and head and neck cancers.1-2
Since its development in 1957, it has been the mainstay of colorectal cancer treatment.3 The metabolic
pathways of 5-FU have been extensively investigated. Several studies have reported high inter-
individual variability of 5-FU metabolism. Blood concentrations of 5-FU can vary by over 10-fold
despite equal dose administration by Body Surface Area (BSA).4-8
5-FU is routinely administered by infusion or orally as a prodrug. In plasma it has a half-life of
approximately ten to fifteen minutes and achieves steady state concentrations in two hours with
continuous infusion. Severe side effects, including gastrointestinal, neurological, hematological and
mucosal toxicity, have been encountered during conventional 5-FU treatment.9 Studies have shown
that over 30% of treated patients exhibit dose-limiting toxicity. Recent studies also reported severe
toxicity (grade 3/4) and death following treatment with 5-FU. Research has suggested that only 40%
to 50% of patients with severe toxicity display partial or profound dihydropyrimidine dehydrogenase
(DPD) enzyme deficiency, demonstrating that there are other factors besides a genetic DPD defect
that can affect 5-FU levels.10-15
Clinical studies have consistently reported that the majority of patients are not in the target
therapeutic range when dosed by BSA and indeed most of those are underdosed.16-23 Clinical data
also demonstrate that pharmacokinetically (PK) guided dose adjustment of blood levels of 5-FU can
result in lowered toxicity, improved overall response, and increased survival.4-8,16,17,19,20,22,24-38
In combination with other clinical information, monitoring 5-FU levels provides physicians with an
effective tool to aid in dose management in order to achieve optimal therapeutic effect while avoiding
sub-therapeutic or toxic drug levels.4-8,16,17,19,20,22,24-38 With reduced toxicity, patients are able to
maintain treatment for longer periods of time. Today, PK assessment of 5-FU in patients can only be
performed by physical analytical methods such as high performance liquid chromatography
(HPLC)39-41 or liquid chromatography-tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS).34,42 These physical
techniques are time-consuming, expensive, involve sample preparation and require full-time
technicians, all of which hinder widespread adoption of a PK-guided dose management approach.
English 3
By contrast, a homogenous immunoassay for determining levels of 5-FU provides rapid quality
results correlated to physical methods utilizing routine clinical analyzers, comparable to other
therapeutic drug monitoring determinations that have been routinely used for more than thirty years.
The My5-FU Assay provides a convenient, cost-effective, and timely tool to aid oncologists in 5-FU
dose management.
Principles of the Procedure
The My5-FU Assay (US Patent No. 7,205,116) is a homogeneous two-reagent nanoparticle
agglutination immunoassay used for detection of 5-FU in human plasma. It is based upon the
principle of measuring changes in scattered light or absorbance which result when nanoparticles
aggregate. This aggregation is measured at wavelengths between 400 and 650 nm using automated
clinical chemistry or immunoassay analyzers. Multivalent drug-conjugates serve as a binding
partner to antibodies selective for 5-FU which are covalently attached to the surface of nanoparticles.
In the absence of free 5-FU, this reaction creates large aggregates, resulting in a solution that scatters
incident light and leads to an increase in the observed absorption of the solution. When a sample
containing 5-FU is introduced, the agglutination reaction is partially inhibited. Antibody bound to
sample drug is no longer available to promote nanoparticle aggregation, resulting in less scattering of
incident light and lower observed absorption of the solution. Thus, a classic inhibition curve with
respect to 5-FU concentration is obtained with the maximum absorption occurring with low levels of
drug and minimum absorption occurring with high levels of drug. Monitoring the changes in
scattered light or absorbance as a function of drug levels results in a concentration-dependent
curve.43-44
Reagents
My5-FU Assay ( 5FU-RGT) includes:
1. Reaction Buffer : Contains agglutination enhancers, protein, and buffer.
2. Nanoparticle Reagent : Contains monoclonal antibody bound to nanoparticles in a
buffered solution.
Additional Materials Required But Not Provided:
5FU-CAL – My5-FU Calibrator Kit
5FU-CON – My5-FU Control Kit
5FU-STB – My5-FU Sample Stabilizer Packs (20 kits) OR 5FU-STB-V– My5-FU Sample
Stabilizer Vial
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Precautions and Warnings
For In Vitro Diagnostic Use Only.
Exercise the normal precautions required for handling all laboratory reagents.
Materials of human origin were tested for HIV1 and HIV2, Hepatitis B and Hepatitis C by FDA-
approved methods and the findings were negative. However, as no test method can rule out the
potential risk of infection with absolute certainty, the material must be handled just as carefully as a
patient sample. In the event of exposure, the directives of the responsible health authorities should
be followed.
All components of the My5-FU Assay contain less than 0.1% sodium azide. For specific listing, refer
to the reagent section of this package insert. Avoid contact with skin and mucous membranes. Flush
affected areas with copious amounts of water. Seek immediate medical attention if reagents are
ingested or come into contact with eyes. When disposing of such reagents, always flush with large
amounts of water to prevent accumulation of azide.
Handling and Storage Instructions
Store reagents, calibrators and controls refrigerated at 2-8°C (35-46°F). Do not freeze.
Before use, mix the Nanoparticle Reagent (R2) by gently inverting the R2 reagent vial three to five
times, avoiding the formation of bubbles.
Indications of Stability
Reagents are stable until the expiration date when stored and handled as directed.
Sample Collection and Handling
Plasma (EDTA or heparin) specimens may be used with the My5-FU Assay. Draw the sample
towards the end of the infusion, preferably 2 – 4 hours before the end, but ensure that the pump still
contains solution during the sample draw. For 46-hour infusions draw the sample at least 1818 hours
after the start of the infusion. Start time of continuous infusion and actual sampling time should be
recorded.
Collect a minimum of 2 mL of blood into an EDTA or heparin tube. Collect the blood sample by
venipuncture or through a peripheral IV line. This is to avoid contamination by the infusing drug.
DO NOT collect the blood sample from the infusional IV line.
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Sample Stabilizer
Inject collection tube with the My5-FU sample stabilizer immediately after draw and gently invert 3
times. Do not place sample on ice and do not refrigerate when using the stabilizer. Centrifuge
sample within 24 hours of draw. Draw off plasma from the top of the tube, avoiding the cell layer
and transfer to a capped secondary tube. Plasma must be free of cells. Store the plasma sample at 2-
8°C or room temperature for up to one week or freeze (at ≤ -20°C) if storing the sample longer.
Samples may be shipped at ambient temperature. Provide the laboratory with the times of infusion
start and finish. Refer to the My5-FU sample stabilizer package insert for complete instructions for
use of the sample stabilizer.
No Sample Stabilizer
Use of the sample stabilizer is strongly recommended. If the sample stabilizer is not used, samples
should be centrifuged within twenty minutes of collection to isolate the plasma. Alternatively, place
sample on ice immediately upon collection and centrifuge within one hour of collection. Draw off
plasma from the top of the tube, avoiding the cell layer (contamination of plasma with blood cells can
cause 5-FU degradation), and transfer to a capped secondary tube. Store the sample at 2-8°C for up
to one week or freeze (≤ -20° C) if storing for a longer period. If the sample will be shipped to an
outside testing laboratory, freeze (≤ -20°C) plasma sample for a minimum of 16 hours before
shipment to decrease sample degradation. Samples may be then shipped to the laboratory at ambient
temperature.
Assay Procedure
Refer to the instrument specific Application Sheet for instructions and parameters before performing
the assay.
Specimen Dilution Procedure
Samples containing 5-FU in concentrations greater than 1,800 ng/mL can be diluted 1:5 to give an
upper range of 9,000 ng/mL. Refer to the instrument specific operation manual for an automatic
dilution protocol (by cuvette only) of 5-FU samples with water. Alternatively, specimens out of
range can be manually diluted 1:10 or 1:100 with deionized water or 1:5 in the 0 ng/mL Calibrator and
placed in the sample rack for analysis.
Calibration
The My5-FU Assay produces a calibration curve with a 0 to 1,800 ng/mL range using the My5-FU
Calibrator Kit. The minimum detectable concentration of 5-FU in plasma for the My5-FU Assay is 52
ng/mL.
Validate the assay calibration by testing My5-FU Controls.
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Calibration Frequency
Calibration is recommended:
• After a calibrator or reagent (kit) lot change,
• After performance of monthly instrument maintenance,
• As required following quality control procedures.
Quality Control
The My5-FU Control Kit contains three levels of controls at low, medium and high concentrations of
5-FU.
Each laboratory should establish its own control ranges and frequency. Good laboratory practice
suggests that at least two concentrations of quality control be tested each day patient samples are
assayed and each time calibration is performed. Reassess control targets and ranges following a
change of reagent (kit) or control lot.
Results and Expected Values
The instrument software calculates a best fit non-linear curve equation that is used to generate a
calibration curve that ranges from 0 to 1,800 ng/mL of 5-FU concentration. This curve is stored on the
analyzer and concentrations of drug in the unknown samples are calculated from this curve using
absorbance values generated for each sample.
Limitations of the Procedure
As with all analyte determinations, the My5-FU Assay should be used in conjunction with
information available from clinical evaluation and other diagnostic procedures.
Performance characteristics for the My5-FU Assay have not been established for body fluids other
than human plasma containing EDTA or heparin.
No significant interferences were observed from samples with the following conditions:
Level
Rheumatoid Factor 500 IU/mL
Total Protein Matrix Effect 12 g/dL 120 g/L
Icteric Interference 95 mg/dL 1624 µmol/L
Lipemic Interference 1700 mg/dL 19 mmol/L
Hemolysate 1000 mg/dL
5-FU is not stable in whole blood. Hemolysis should be avoided.
English 7
Theophylline, when tested at 10,000 ng/mL, has a 4.6% cross reactivity in the My5-FU Assay.
Elevated 5-FU levels may be seen in samples from patients taking theophylline. Theobromine, when
tested at 20,000 ng/mL has a cross-reactivity of 2.2%. 5-FU levels may be elevated in samples from
patients who have eaten chocolate during or shortly before their infusion.
As with any assay utilizing mouse antibodies, the possibility exists for interference by human anti-
mouse antibodies (HAMA) in the sample. Samples containing such antibodies can potentially
produce erroneous 5-FU results, which are inconsistent with the patient’s clinical profile. If you
suspect this occurrence, please contact Saladax Technical Service for assistance.
Expected Values
No precise relationship between 5-FU plasma levels and antineoplastic efficacy has been established.
Recent clinical studies in colorectal cancer have used target 5-FU AUC ranges from 20 to 24 or to 30
mg·h/L.18-21,23 AUC levels greater than 25 mg·h/L have been associated with increased risk of toxicity
in the form of diarrhea, hand-foot syndrome, mucositis, stomatitis, and leucopenia.4,17,24-37
Use of 5-FU plasma area under the curve (AUC) calculations in which AUC is determined from the
concentration of 5-FU at steady state (Css) multiplied by the duration of the 5-FU infusion cycle has
been shown to be useful in determining optimal individual doses of 5-FU. The AUC can be
calculated by multiplying the Css by the time (hours) of infusion:
Css x Time of infusion = AUC
5-FU drug concentrations should not be the only means of therapeutic drug management. The assay
should be used in conjunction with information available from clinical evaluations and other
diagnostic procedures. The patient’s current and past medical condition, the complexity of the
clinical state, individual differences in sensitivity to 5-FU and toxic effects of 5-FU, co-administration
of other drugs, and a number of other factors may result in different optimal blood concentrations of
5-FU for any individual. Each patient should undergo comprehensive clinical assessment prior to
modification of the treatment plan and clinicians should carefully monitor patients during therapy
initiation and dose adjustments. Given the heterogeneity of the patient’s clinical state, clinicians
should establish a desired therapeutic management range based on their own experience as well as
each patient’s clinical requirements. 5-FU concentrations for individual patients should be
determined using a single, consistent method to minimize confounding effects associated with cross-
reactivity and recognition of metabolites.
Specific Performance Characteristics
Typical performance data for the My5-FU Assay obtained on a Beckman (formerly Olympus) AU400
are shown below. Results obtained in individual laboratories may differ from these data.
English 8
Precision
Precision was determined as described in CLSI Guideline EP5-A2.
Low, medium and high 5-FU controls and 4 patient sample pools containing varying 5-FU levels
were assayed in duplicate twice a day for twenty days at two sites using 2 assay lots. The means
were determined and within run, total SD and % CVs were calculated.
The following are representative results from one assay lot at one site.
Sample
Type
Assigned
Value
(ng/mL) N
Mean
(ng/mL)
Within Run Total
SD %CV SD %CV
Controls
225 80 223 5.5 2.5 11.5 5.2
450 80 450 6.5 1.4 9.7 2.1
900 80 910 10.4 1.1 14.7 1.6
Human
Plasma
240 80 238 11.6 4.9 13.2 5.5
470 80 475 8.5 1.8 12.1 2.6 700 80 705 13.2 1.9 15.1 2.1
1300 80 1341 18.6 1.4 27.0 2.0
Lower Limit of Quantitation (LLoQ)
This is defined as the lowest drug concentration that can be measured with acceptable accuracy and
precision. It is considered the measured drug concentration at which the assay coefficient of variation
is not greater than 15%, and the recovery is 90 to 110%. To determine the LLoQ, 3 negative plasma
samples were spiked with a known amount of 5-FU and the amount of drug was quantified by the
assay using two lots of reagents over five runs (n = 5/run). The LLoQ was determined to be 85
ng/mL.
Limit of Detection (LoD)
This is defined as the lowest drug concentration that can be detected with 95% confidence. To
determine the LoD, 3 negative plasma samples were spiked with a known amount of 5-FU and the
amount of drug was quantified by the assay using two lots of reagents over five runs (n = 5/run). The
LoD was determined to be 52 ng/mL.
Specificity
5-FU metabolites and Structurally Related Compounds
Unless otherwise indicated, 10,000 ng/mL of each of the following 5-FU metabolites or structurally
related compounds were added to 5-FU free plasma and were assayed using the My5-FU Assay. The
% cross-reactivity in the assay for each compound is given below.
English 9
Compound % Cross-Reactivity
Dihydro-5-fluorouracil <0.1
Dihydrouracil* 0.4
Eniluracil 0.9
Uracil 11.1
Thymidine <0.1
5-Fluorouridine <0.1
Uridine <0.1
Pseudouridine* <0.01
Tegafur <0.1
Capecitabine* <0.01
5’-deoxy-5-fluorouridine <0.1
5’-deoxy-5-fluorocytidine <0.1
*100,000 ng/mL concentration tested
Common Co-Administered Drugs
Unless otherwise indicated, 100,000 ng/mL of each compound was spiked into 5-FU free plasma or
plasma spiked with 1,000 ng/mL 5-FU. With the exception of theophylline, with 4.6% cross-reactivity
in the assay and theobromine, with 2.2% cross-reactivity, all compounds cross-reacted ≤1% in the
assay.
Acetaminophen Irinotecan* Prednisone
N-Acetylprocainamide Kanamycin A Procainamide
Allopurinol Kanamycin B Prochlorperazine
Amikacin Leucovorin* Quinidine Sulfate
Ampicillin Lidocaine Rifampicin
Azathioprine Methotrexate Salicylic Acid
Caffeine Methylprednisolone Spectinomycin
Carbamazepine Morphine sulfate* Streptomycin Sulfate
Ceftriaxone Oxaliplatin* Theobromine**
Cephalosporin Paraxanthine** Theophylline*
Erythromycin Penicillin G Tobramycin
Gemcitabine Phenobarbital Valproic Acid
Gentamycin Phenytoin Vancomycin
Hydrocortisol Prednisolone Xanthine
*10,000 ng/mL concentration tested
**20,000 ng/mL concentration tested
English 10
Recovery
To assess recovery, 5-FU was spiked into normal 5-FU free plasma samples and into patient samples
containing a known concentration of 5-FU. The percent recovery was determined by dividing the
observed concentration of each sample by the expected concentration of added 5-FU plus original 5-
FU present in the sample. The percent recovery ranged from 96 to 108%.
Linearity by Sample Dilution
To assess assay linearity, 11 samples with 5-FU concentrations covering the range of the assay were
prepared by using the dilution scheme in CLSI Approved Guideline EP6-A vol. 23 No. 16 and were
tested (n = 10) with 2 assay lots. Linearity at specific dilutions was considered acceptable if the
percent deviation was within ± 10% of expected value for concentrations ≥ 150 ng/mL or ± 15% for
concentrations < 150 ng/mL. The assay was found to be linear over the reportable range of the assay.
Method Comparison
A comparison between the Saladax My5-FU Assay and LC-MS/MS was performed using 57 human
plasma samples obtained from patients receiving 5-FU therapy. The range of 5-FU concentration by
the My5-FU Assay was 122-1,801 ng/mL with a mean of 816 ng/mL. The 5-FU concentration range
for the validated LC-MS/MS reference method was 141-1,810 ng/mL with a mean of 796 ng/mL.
Results of the Deming regression analysis are below.
0
500
1,000
1,500
2,000
0 500 1,000 1,500 2,000
My
5-F
UT
MB
eck
man
AU
400
[ng
/mL
]
LC-MS/MS [ng/mL]
Deming Regression
1:1 LineSlope = 1.017
y-intercept = 6.78
Correlation Coefficient (R) = 0.9925
English 11
Package Insert References:
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My5-FU™-Reagenzien
© 2017 Saladax Biomedical, Inc. Deutsch 1
My5-FU™ ist eine Marken von Saladax Biomedical, Inc. Gedruckt in USA
PI 5FU-RGT, 18.10.2017, Revision 09
5FU-RGT
5-Fluorouracil (My5-FU™)-Assay
Dieser Beipackzettel ist vor dem Gebrauch des Produkts sorgfältig zu lesen. Die Anleitung auf dem
Beipackzettel muss entsprechend befolgt werden. Die Zuverlässigkeit der Testergebnisse kann nicht
gewährleistet werden, wenn die Anleitung auf dem Beipackzettel nicht genau befolgt werden.
Kundendienst:
Telefon: +1 610 419-6731
Fax: +1 610 849-5001
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2514 AP Den Haag
Niederlande
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Bethlehem, PA 18015 USA
www.saladax.com
R1
R2
Deutsch 2
Verwendungszweck
Der Saladax 5-Fluorouracil (My5-FU)-Assay ist ein In-vitro-Diagnosesystem, das zur quantitativen
Bestimmung von 5-FU in Humanplasma vorgesehen ist, wobei automatisierte klinische
Analysegeräte verwendet werden, um die Anwendung einer 5-FU-Therapie zu unterstützen.
Zusammenfassung und Erläuterung des Tests
5-FU (u. a. Adrucil) ist ein Chemotherapeutikum, das zur Behandlung verschiedener solider
Karzinome eingesetzt wird, insbesondere bei Kolorektal-, Magen-, Brust-,Pankreaskrebs und Patienten
mit Kopf-/Hals-Tumoren.1-2 Seit der Entwicklung im Jahr 1957 ist es der Grundpfeiler der Behandlung
von kolorektalen Karzinomen.3 Die Stoffwechselwege von 5-FU wurden umfassend untersucht, und
mehrere Studien haben eine hohe inter-individuelle Variabilität des 5-FU-Metabolismus gezeigt. Die
Blutkonzentrationen von 5-FU können um über das Zehnfache variieren, selbst wenn die gleiche
Dosis nach Körperoberfläche (KOF) verabreicht wird.4-8
5-FU wird häufig als Infusion oder oral als Prodrug verabreicht. Im Plasma weist es eine
Halbwertszeit von ca. zehn bis fünfzehn Minuten auf und erreicht bei kontinuierlicher Infusion
innerhalb von zwei Stunden stationäre Konzentrationen. Bei konventioneller 5-FU-Therapie werden
schwere Nebenwirkungen beobachtet, darunter gastrointestinale, neurologische, hämatologische und
Schleimhaut-Toxizität.9 Studien zeigen, dass über 30% der behandelten Patienten eine
dosislimitierende Toxizität aufweisen. Neuere Studien berichten außerdem von schweren
Toxizitäten (Grad 3/4) und dem Tod von Patienten im Anschluss an eine Behandlung mit 5-FU. Laut
Studienergebnissen weisen nur 40% bis 50% der Patienten mit schwerer Toxizität einen teilweisen
oder schweren DPD- (Dihydropyrimidin-Dehydrogenase)-Enzymmangel auf, was zeigt, dass außer
einem genetischen DPD-Defekt andere Faktoren den 5-FU-Spiegel beeinträchtigen können.10-15
Zahlreiche klinische Studien haben gezeigt, daß die Mehrheit der Patienten, die eine KOF-Dosierung
erhielten, nicht im Zielbereich waren, die meisten der Patienten wurden unterdosiert.16-23 Ebenso
konnten klinische Studien zeigen, dass eine pharmakokinetisch (PK) gesteuerte Dosisanpassung der
5-FU-Konzentration im Blut zu reduzierter Toxizität, verbessertem allgemeinem Ansprechen und
einem Anstieg der Überlebensrate führen kann.4-8, 16, 17, 19, 20, 22-38
In Kombination mit anderen klinischen Informationen bietet die Überwachung der 5-FU-Spiegel
Ärzten eine effektive Möglichkeit zur Anpassung der Dosierung, um eine optimale therapeutische
Wirkung zu erzielen und sub-therapeutische oder toxische Arzneimittelspiegel zu vermeiden.4-8, 16, 17,
19, 20, 22-38 Mit reduzierter Toxizität kann die Behandlung der Patienten länger aufrecht erhalten werden.
Derzeit kann die PK-Bewertung von 5-FU in Patienten nur mit Hilfe von physikalisch-analytischen
Methoden wie HPLC (High Performance Liquid Chromatography)39-41 oder LC-MS/MS (Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy) durchgeführt werden.34,42 Diese physikalischen
Methoden sind zeitaufwändig, kostspielig und erfordern die Vorbereitung von Proben und den
Deutsch 3
Einsatz von Vollzeitkräften; alle diese Faktoren schränken die allgemeine Anwendbarkeit eines PK-
geleiteten Dosierungsansatzes ein.
Im Gegensatz dazu liefert ein homogener Immunoassay zur Bestimmung der 5-FU-Konzentration,
unter Verwendung klinischer Analysegeräte, schnelle Ergebnisse in Korrelation mit physikalischen
Methoden, die mit anderen Methoden zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung, die seit über
dreißig Jahren routinemäßig eingesetzt werden, vergleichbar sind. Der My5-FU-Assay bietet
Onkologen eine praktische, kostengünstige und effiziente Methode zur Anpassung der 5-FU-
Dosierung.
Verfahrensgrundsätze
Der My5-FU-Assay (US-Patent-Nr. 7,205,116) ist ein homogener, aus zwei Reagenzien bestehender
Nanopartikel-Agglutination-Immunoassay zur Bestimmung von 5-FU in Humanplasma. Er basiert
auf dem Prinzip der Messungsänderungen durch Streulicht oder Absorption, die bei der Aggregation
von Nanopartikeln auftreten. Diese Agglutination wird im Wellenlängenbereich zwischen 400 und
650 nm mit automatisierten klinischen Chemie- oder Immunoassay-Analysegeräten gemessen.
Multivalente Arzneimittelkonjugate dienen als Bindungspartner für 5-FU-selektive Antikörper, die
kovalent mit der Oberfläche von Nanopartikeln verbunden sind. Bei Abwesenheit von freiem 5-FU
erzeugt diese Reaktion große Aggregate die Auflicht streuen und zu einer Zunahme der
beobachteten Absorption führen. Wenn eine 5-FU-haltige Probe hinzugegeben wird, wird die
Agglutinationsreaktion teilweise inhibiert. Antikörper, die an das 5-FU der Probe gebunden sind,
stehen nicht zur Verfügung , um die Aggregation der Nanopartikel zu fördern, was die Streuung des
Auflichts und die beobachtete Absorption der Lösung mindert. Somit wird eine klassische
Inhibitionskurve im Hinblick auf die 5-FU-Konzentration erzeugt, wobei maximale Absorption bei
niedrigen Arzneimittelkonzentrationen und minimale Absorption bei hohen
Arzneimittelkonzentrationen auftritt. Die Änderungen von Streulicht oder Absorption als Funktion
der Arzneimittelkonzentration ergibt eine konzentrationsabhängige Kurve.43-44
Reagenzien
Der My5-FU -Assay ( 5FU-RGT) enthält:
1. Reaktionspuffer : Enthält Agglutinationsverstärker, Protein und Pufferlösung.
2. Nanopartikelreagenz : Enthält an Nanopartikel gebundene, monoklonale Antikörper in
einer Pufferlösung.
Weitere erforderliche Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind:
5FU-CAL – My5-FU-Kalibrator-Kit
5FU-CON – My5-FU-Kontroll-Kit
R1
11 R2
Deutsch 4
5FU-STB – My5-FU Probenstabilisator-Paket (20 Kits) ODER 5FU-STB-V– Flasche mit
My5-FU Probenstabilisator
Vorsichts- und Warnhinweise
Nur zur Verwendung in der In-Vitro-Diagnostik.
Bei der Arbeit mit Laborchemikalien sind die üblichen Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.
Materialien menschlichen Ursprungs wurden mit von der FDA zugelassenen Methoden auf HIV1
und HIV2, Hepatitis B und Hepatitis C getestet, alle Ergebnisse waren negativ. Da jedoch keine
Testmethode das potentielle Risiko einer Infektion völlig ausschließen kann, muss das Material
ebenso vorsichtig wie Patientenproben gehandhabt werden. Sollte ein Kontakt stattgefunden haben,
sind die Richtlinien der zuständigen Gesundheitsbehörde zu befolgen.
Alle Komponenten des My5-FU-Assays enthalten weniger als 0,1% Natriumazid. Für eine genaue
Übersicht lesen Sie bitte den Reagenzabschnitt in dieser Packungsbeilage. Kontakt mit Haut und
Schleimhäuten vermeiden. Betroffene Bereiche mit reichlich Wasser spülen. Bei Verschlucken der
Reagenzien oder Kontakt mit den Augen ist sofort ein Arzt aufzusuchen. Beim Entsorgen dieser
Reagenzien immer mit viel Wasser nachspülen, um eine Azidansammlung zu vermeiden.
Anweisung zur Handhabung und Lagerung
Die Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollen gekühlt bei 2 - 8°C aufbewahren. Nicht einfrieren.
Das Nanopartikel-Reagenz (R2) vor der Verwendung durch vorsichtiges Umdrehen (3 bis 5 Mal) der
R2-Reagenzflasche mischen; dabei Blasenbildung vermeiden.
Indikationen für Stabilität
Bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung sind die Reagenzien bis zum Verfallsdatum
stabil.
Entnahme und Handhabung der Proben
Mit dem My5-FU-Assay können Plasmaproben (EDTA oder Heparin) verwendet werden. Die Probe
gegen Ende der Infusion, am besten 2 – 4 Stunden vor Infusionsende, entnehmen; dabei sicherstellen,
dass die Pumpe während der Probenahme noch Lösung enthält. Bei Infusionen über 46 Stunden,
entnehmen Sie die Probe frühestens 18 Stunden nach Infusionsstart. Die Anfangszeit der
kontinuierlichen Infusion und die tatsächliche Entnahmezeit sollten aufgezeichnet werden.
Entnehmen Sie ≥ 2 ml Blut in einem EDTA- oder Heparinröhrchen. Die Blutprobe durch
Venenpunktion oder eine periphere Infusionsleitung entnehmen. Hierdurch soll jegliche
Deutsch 5
Kontamination durch das Infusionsmedikament vermieden werden. Die Blutprobe darf NICHT von
der Infusionsleitung entnommen werden.
Probenstabilisator
Den My5-FU-Probenstabilisator sofort nach der Entnahme in das Entnahmegefäß injizieren und 3
Mal vorsichtig schwenken. Bei Verwendung des Stabilisators die Probe nicht auf Eis oder im
Kühlschrank lagern. Die Probe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme zentrifugieren. Plasma
unter Vermeidung der Zellschicht oben vom Röhrchen abnehmen und das Plasma in ein
verschließbares Sekundär-Röhrchen übertragen. Das Plasma muss frei von Zellen sein. Für eine
Messung innerhalb von einer Woche, Probe bei 2-8°C oder Raumtemperatur lagern; für längeres
Aufbewaren, Probe bei ≤ -20°C einfrieren. Die Proben können ungekühlt verschickt werden. Das
Labor über die Zeiten von Infusionsstart und -ende informieren. Eine vollständige
Gebrauchsanweisung für den Probenstabilisator ist der Packungsbeilage für den My5-FU-
Probenstabilisator zu entnehmen.
Kein Probenstabilisator
Die Verwendung des Probenstabilisators wird dringend empfohlen. Wenn der Probenstabilisator
nicht verwendet wird, müssen die Proben innerhalb von 20 Minuten nach der Entnahme zentrifugiert
werden, um das Plasma abzutrennen. Alternativ dazu kann die Probe sofort nach Entnahme auf Eis
gelagert und innerhalb einer Stunde nach Entnahme zentrifugiert werden. Plasma unter
Vermeidung der Zellschicht oben vom Röhrchen abnehmen (Kontaminierung des Plasmas mit
Blutzellen kann 5-FU-Degradierung verursachen), und das Plasma in ein zweites Röhrchen mit
Stopfen übertragen. Die Probe zur Messung innerhalb von einer Woche bei 2-8oC lagern; für
längeres Lagern einfrieren (≤ -20°C). Wenn die Probe an ein externes Testlabor versendet wird, muss
die Plasmaprobe vor dem Versand für mindestens 16 Stunden eingefroren werden (≤ -20°C), um eine
Degradierung der Probe zu vermeiden. Die Proben können dann bei Umgebungstemperatur ins
Labor geschickt werden.
Testverfahren
Eine gerätespezifische Anleitung und die Testparameter sind vor Verwendung des Tests dem
Anwendungsblatt für das jeweilige Instrument zu entnehmen.
Probenverdünnungsverfahren
Proben mit 5-FU Konzentrationen höher als 1.800 ng/ml können 1:5 verdünnt werden, um die obere
Messbereichsgrenze auf 9.000 ng/ml zu erhöhen. Ein automatisches Verdünnungsprotokoll (nur
durch Küvette) von 5-FU-Proben mit Wasser ist der Gebrauchsanleitung für das jeweilige Instrument
zu entnehmen. Alternativ dazu können Proben, die außerhalb des Meßbereichs liegen, manuell mit
deionisiertem Wasser im Verhältnis von 1:10 oder 1:100 oder mit dem Nullkalibrator im Verhältnis
von 1:5 verdünnt und zur Analyse in den Probenhalter gestellt werden.
Deutsch 6
Kalibrierung
Der My5-FU-Assay erzeugt unter Verwendung des My5-FU-Kalibrator-Kits eine Kalibrationskurve
für den Bereich von 0 bis 1.800 ng/ml. Die untere Nachweisgrenze von 5-FU in Plasma für den My5-
FU-Assay beträgt 52 ng/ml.
Die Assay-Kalibrierung durch Messen der My5-FU-Kontrollen validieren.
Häufigkeit der Kalibrierung
Folgender Kalibrierungsplan wird empfohlen:
• Nach dem Wechsel einer Kalibrator- oder Reagenz- (Kit)-Charge,
• Nach der Durchführung der monatlichen Instrumentenwartung,
• Entsprechend den Anforderungen der Qualitätskontrollverfahren.
Qualitätskontrolle
Das My5-FU-Kontroll-Kit enthält drei Level an Kontrollen mit niedriger, mittlerer und hoher 5-FU-
Konzentration.
Jedes Labor sollte seine eigenen Kontrollbereiche und -frequenz festlegen. Gemäß guter Laborpraxis
sollten an jedem Tag, an dem Patientenproben getestet werden, und bei jeder Kalibrierung,
mindestens zwei Konzentrationen der Qualitätskontrolle getestet werden. Nach dem Wechsel von
Reagenzien (Kit) oder Kontrollchargen sollten die Kontrollzielwerte und -bereiche neu festgelegt
werden.
Ergebnisse und Erwartungswerte
Die Geräte-Software berechnet eine nicht lineare Best-Fit-Kurvengleichung, die verwendet wird, um
eine Kalibrierungskurve im 5-FU-Konzentrationsbereich von 0 bis 1.800 ng/ml zu erzeugen. Diese
Kurve wird auf dem Analysegerät gespeichert und benutzt, um Arzneimittelkonzentrationen in
unbekannten Proben unter Verwendung deren Absorptionswerten zu berechnen.
Begrenzungen des Verfahrens
Wie bei allen Analytbestimmungen muss der My5-FU-Assay zusammen mit Informationen aus
klinischen Untersuchungen und anderen diagnostischen Verfahren verwendet werden.
Leistungsmerkmale für den My5-FU-Assay für andere Körperflüssigkeiten als Humanplasma mit
EDTA oder Heparin wurden nicht etabliert.
Bei Proben mit den folgenden Zusätzen wurden keine signifikanten Störungen beobachtet:
Deutsch 7
Konzentration
Rheumafaktor 500 IU/ml
Gesamtprotein-Matrixeinfluß 12 g/dl 120 g/l
Ikterische Störungen 95 mg/dl 1624 µmol/l
Lipämische Störungen 1700 mg/dl 19 mmol/l
Hämolysat 1.000 mg/dL
5-FU ist in Vollblut nicht stabil. Hämolyse muss vermieden werden.
Theophyllin weist bei einer Konzentration von 10.000 ng/ml im My5-FU-Assay eine Kreuzreaktivität
von 4,6% auf. Bei Patienten, die Theophyllin einnehmen, kann eine erhöhte 5-FU-Konzentration
gefunden werden. Theobromin, getestet in einer Konzentration von 20.000 ng/ml, zeigt eine
Kreuzreaktivität von 2,2%. Bei Patienten, die vor oder während der Infusion Schokolade verzehrt
haben, können erhöhte 5-FU Konzentrationen gefunden werden.
Wie bei allen Assays, die Mausantikörper verwenden, besteht die Möglichkeit von Störungen durch
humane Anti-Mausantikörper (HAMA) in der Probe. Proben mit solchen Antikörpern können
inkorrekte 5-FU-Ergebnisse erzeugen, die mit dem klinischen Profil des Patienten nicht vereinbar
sind. Falls Sie einen solchen Fall vermuten, kontaktieren Sie den technischen Kundendienst von
Saladax.
Erwartungswerte
Es wurde bisher keine genau definierte Beziehung zwischen 5-FU-Plasmaspiegeln und
antineoplastischer Wirksamkeit etabliert. Kürzlich veröffentliche Studien mit Kolorektalkarzinom-
Patienten verwendeten einen AUC Zielbereich von 20 bis 24 oder bis 30 mg·h/L.18-21,23 AUC-Levels
oberhalb 25 mg·h/l wurden mit erhöhtem Toxizitätsrisiko in Form von Durchfall, Hand-Fuß-
Syndrom, Schleimhautentzündung, Mundhöhlenentzündung und Leukopenie in Zusammenhang
gebracht.4,17,24-37
Die Verwendung von 5-FU-AUC-Berechnungen, bei denen die AUC anhand der stationären 5-FU-
Konzentration (Css), multipliziert mit der Dauer des 5-FU-Infusionszyklus, bestimmt wird, ist bei der
Festlegung optimaler 5-FU-Einzeldosen nachweislich von Nutzen. Der AUC-Wert kann durch
Multiplizieren der stationären Konzentration (Css) mit der Dauer der Infusion (in Stunden) berechnet
werden:
Css x Infusionsdauer = AUC
5-FU-Arzneimittelkonzentrationen dürfen nicht das einzige Mittel im therapeutischen Arzneimittel-
Management sein. Der My5-FU-Assay muss zusammen mit Informationen aus klinischen
Untersuchungen und anderen diagnostischen Verfahren verwendet werden. Die Patientenhistorie
und der derzeitige Gesundheitszustand des Patienten, die Komplexität des klinischen Bildes, die
individuellen Unterschiede bei der Empfindlichkeit gegenüber 5-FU und der toxischen Wirkungen
von 5-FU, die gleichzeitige Verabreichung anderer Arzneimittel und eine Reihe anderer Faktoren
Deutsch 8
können bewirken, dass die optimalen Blutkonzentrationen von 5-FU für jede Person anders ist. Jeder
Patient muss vor Änderungen des Behandlungsplans einer umfassenden klinischen Untersuchung
unterzogen werden. Außerdem müssen Ärtze ihre Patienten beim Start der Therapie und bei
Dosisanpassungen aufmerksam überwachen. Angesichts der Heterogenität des klinischen Zustandes
eines Patienten muss der Arzt den gewünschten Bereich des therapeutischen Managements
basierend auf den eigenen Erfahrungen und den Bedürfnissen des Patienten festlegen. 5-FU-
Konzentrationen für einzelne Patienten müssen anhand einer einzigen, konsistenten Methode
bestimmt werden, um unklare Effekte zu minimieren, die durch Unterschiede in Kreuzreaktivität
und der Erkennung von Metaboliten verursacht werden können.
Spezifische Leistungsmerkmale
Nachfolgend sind typische, mit dem Beckman (vormals Olympus) AU400 erzielte Leistungsdaten für
den My5-FU-Assay aufgelistet. Individuelle Ergebnisse eines Labors können von diesen Daten
abweichen.
Präzision
Die Präzision wurde gemäß der Beschreibung in CLSI Richtlinie EP5-A2 bestimmt.
Niedrige, mittlere und hohe 5-FU-Kontrollen und 4 Patientenprobenpools mit unterschiedlichen 5-
FU-Spiegeln wurden 20 Tage lang an zwei Testzentren zweimal täglich mit 2 Assay-Chargen
zweifach getestet. Die Mittelwerte wurden bestimmt, und die SA und der VK (%) innerhalb eines
Laufs berechnet.
Die nachfolgenden Ergebnisse sind typische Ergebnisse von einer Reagenzcharge an einem
Testzentrum.
Probentyp Zugewiesener
Wert (ng/ml) N
Mittelwert
(ng/ml)
Innerhalb
eines Laufs Gesamt
SA %VK SA %VK
Kontrollen
225 80 223 5,5 2,5 11,5 5,2
450 80 450 6,5 1,4 9,7 2,1
900 80 910 10,4 1,1 14,7 1,6
Humanplasma
240 80 238 11,6 4,9 13,2 5,5 470 80 475 8,5 1,8 12,1 2,6
700 80 705 13,2 1,9 15,1 2,1
1300 80 1341 18,6 1,4 27,0 2,0
Unteres Quantifizierungslimit (LLoQ)
Dies wird als die geringste Konzentration des Medikaments definiert, die mit akzeptabler
Genauigkeit und Präzision gemessen werden kann. Dieser Wert gilt als die gemessene
Arzneimittelkonzentration, bei der der Assay-Variationskoeffizient nicht größer als 15% ist und die
Deutsch 9
Wiederfindung 90 bis 110% beträgt. Um das LLoQ zu bestimmen, wurden 3 negative Plasmaproben
mit einer bekannten Menge an 5-FU gespikt, und die Arzneimittelmenge wurde mit zwei
Reagenzlosen über fünf Durchläufe vom Test quantifiziert (n = 5/Durchlauf). Als untere
Bestimmungsgrenze wurden 85 ng/ml festgelegt.
Nachweisgrenze (LoD)
Wird als die niedrigste Arzneimittelkonzentration definiert, die mit einer Sicherheit von 95% erkannt
werden kann. Um das LoD zu bestimmen, wurden 3 negative Plasmaproben mit einer bekannten
Menge an 5-FU gespikt, und die Arzneimittelmenge wurde mit zwei Reagenzlosen über fünf
Durchläufe vom Test quantifiziert (n = 5/Durchlauf). Die LoD wurde auf 52 ng/ml festgelegt.
Spezifität
5-FU-Metabolite und strukturell verwandte Verbindungen
Soweit nicht anderweitig angegeben, wurden 10.000 ng/ml jeder der nachfolgenden 5-FU-Metabolite
oder strukturell verwandter Verbindungen zu 5-FU-freiem Plasma hinzugegeben und mit dem My5-
FU-Assay gemessen. Die Kreuzreaktivität (%) des Assay für jede Verbindung ist unten angegeben.
Substanz Kreuzreaktivität (%)
Dihydro-5-Fluorouracil <0,1
Dihydrouracil* 0,4
Eniluracil 0,9
Uracil 11,1
Thymidin <0,1
5-Fluorouridin <0,1
Uridin <0,1
Pseudouridin* <0,01
Tegafur <0,1
Capecitabin* <0,01
5’-Deoxy-5-Fluorouridin <0,1
5’-Deoxy-5-Fluorocytidin <0,1
*100.000 ng/ml getestete Konzentration
Deutsch 10
Häufig mitverabreichte Arzneimittel
Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden 100.000 ng/ml jeder Zusammensetzung in 5-FU-freies
Plasma oder in mit 1.000 ng/ml 5-FU gespiktem Plasma gespikt. Mit Ausnahme von Theophyllin mit
einer Kreuzreaktivität von 4,6% im Assay und Theobromin mit einer Kreuzreaktivität von 2,2%
wiesen alle Zusammensetzungen im Assay eine Kreuzreaktion von ≤ 1% auf.
Acetaminophen Irinotecan* Prednison
N-Acetylprocainamid Kanamycin A Procainamid
Allopurinol Kanamycin B Prochlorperazin
Amikacin Leucovorin* Quinidinsulfat
Ampicillin Lidocain Rifampicin
Azathioprin Methotrexat Salicylsäure
Koffein Methylprednisolon Spectinomycin
Carbamazepin Morphinsulfat* Streptomycinsulfat
Ceftriaxon Oxaliplatin* Theobromin**
Cephalosporin Paraxanthin** Theophyllin*
Erythromycin Penicillin G Tobramycin
Gemcitabin Phenobarbital Valproinsäure
Gentamycin Phenytoin Vancomycin
Hydrocortisol Prednisolon Xanthin
*10,000 ng/ml getestete Konzentration
**20,000 ng/ml getestete Konzentration
Wiederfindung
Zur Beurteilung der Wiederfindung wurde 5-FU in normale 5-FU-freie Plasmaproben und in
Patientenproben mit einer bekannten 5-FU-Konzentration gegeben. Die prozentuale
Wiederfindungsrate wurde durch Dividieren der beobachteten Konzentration jeder Probe durch die
erwartete Konzentration des hinzugefügten 5-FU plus dem ursprünglich in der Probe vorhandenen
5-FU bestimmt. Die prozentualen Wiederfindungsraten betrugen 96 - 108%.
Linearität nach Probenverdünnung
Zur Beurteilung der Assay-Linearität wurden 11 Proben mit 5-FU-Konzentrationen, die den Assay-
Bereich abdecken, vorbereitet; hierzu wurde das Verdünnungsschema in CLSI Richtlinie EP6-A Vol.
23 Nr. 16 verwendet und mit 2 Assay-Chargen (n = 10) getestet. Die Linearität bei bestimmten
Verdünnungen wurde als akzeptabel erachtet, wenn die prozentuale Abweichung innerhalb ± 10%
des Erwartungswerts für Konzentrationen von ≥ 150 ng/ml oder innerhalb von ± 15% für
Konzentrationen von < 150 ng/ml lag. Das Assay wurde über den Messbereich des Assay als linear
befunden.
Deutsch 11
Methodenvergleich
Ein Vergleich zwischen dem Saladax My5-FU-Assay und LC-MS/MS wurde mit 57
Humanplasmaproben von Patienten, die 5-FU-Therapie erhalten, durchgeführt. Der Bereich der 5-
FU-Konzentration gemessen mit dem My5-FU-Assay betrug 122 - 1.801 ng/ml mit einem Mittelwert
von 816 ng/ml. Der Bereich der gemessenen 5-FU-Konzentration für die validierte LC-MS/MS-
Referenzmethode betrug 141-1.810 ng/ml mit einem Mittelwert von 796 ng/ml. Die Ergebnisse der
Deming-Regressionsanalyse sind unten gezeigt.
0
500
1,000
1,500
2,000
0 500 1,000 1,500 2,000
My
5-F
UT
MB
eck
man
AU
400
[ng
/mL
]
LC-MS/MS [ng/mL]
Deming Regression
1:1 LineSteigung = 1,017
y-Schnittpunkt = 6,78
Korrelationskoeffizient (R) = 0,9925
Deutsch 12
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