UNIDAD FIJACIÓN

FORMALINA

Profesora Jimena Le Roy B.Técnica Histológica

FIJACIÓNFIJACIÓN

�� Detener los procesos de autólisis. Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y Especialmente la acción de proteasas y nucleasasnucleasas

�� Conservar la citoConservar la cito--histoarquitectura de la histoarquitectura de la �� Conservar la citoConservar la cito--histoarquitectura de la histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.muestra similar a su estado “in vivo”.

�� Preparar al tejido para los procedimientos Preparar al tejido para los procedimientos posterioresposteriores

�� Agente AntiAgente Anti--microbianomicrobiano

�� Convierte citoplasma en Convierte citoplasma en un gel insolubleun gel insoluble

�� Conserva organelosConserva organelos

��FormaldehídoFormaldehído

FijFij. No Coagulantes. No Coagulantes

�� Conserva organelosConserva organelos

�� Penetración + lenta de Penetración + lenta de medios de inclusiónmedios de inclusión

�� GlutaraldehídoGlutaraldehído

�� TetróxidoTetróxido de Osde Os

ACCIÓN EN LOS TEJIDOSACCIÓN EN LOS TEJIDOS

�� Interacción con las proteínas.Interacción con las proteínas.�� Formación de gel insoluble.Formación de gel insoluble.�� Formación de gel insoluble.Formación de gel insoluble.

�� FIJADOR FIJADOR NONO COAGULANTE COAGULANTE ((No precipita No precipita las las proteínas, proteínas, solosolo

�� las insolubiliza)las insolubiliza)

�� Más conocido de los fijadoresMás conocido de los fijadores�� Presentación comercial es en solución acuosa Presentación comercial es en solución acuosa

37% a 40% 37% a 40%

FIJACION CON FORMALDEHIDO

37% a 40% 37% a 40% �� La fijación involucra una interacción con La fijación involucra una interacción con

proteínas, específicamente con aminoácidos proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes básicos, con formación de puentes metilénicosmetilénicos..

FormaldehídoFormaldehído

�� Saturación 37Saturación 37--40%40%�� Forma de gas a Forma de gas a --21º C21º C�� Uso 10% o 4%Uso 10% o 4%�� Paraformaldehído como polímero sólido Paraformaldehído como polímero sólido �� Paraformaldehído como polímero sólido Paraformaldehído como polímero sólido �� metanol estabilizametanol estabiliza�� Sol. Acuosa tamponada pH 7.2Sol. Acuosa tamponada pH 7.2--7.47.4�� Mezclas Susa, BouinMezclas Susa, Bouin

ACCIÓN EN LOS TEJIDOSACCIÓN EN LOS TEJIDOS

�� Alta penetración, lenta fijación.Alta penetración, lenta fijación.�� Escasa acción sobre H de C.Escasa acción sobre H de C.�� Bueno para lípidos en gral.(pero no para Bueno para lípidos en gral.(pero no para

grasas neutras). grasas neutras). grasas neutras). grasas neutras). �� Contraindicaciones para técnicas Contraindicaciones para técnicas

especiales.especiales.�� Efectos sobre la coloración.Efectos sobre la coloración.�� Deterioro de la solución.Deterioro de la solución.

importantes características importantes características FormaldehídoFormaldehído

�� Saturación 37Saturación 37--40%40%�� Uso 10% o 4%Uso 10% o 4%�� Paraformaldehído Paraformaldehído

como polímero sólido como polímero sólido

�� Gas Gas --2121°°CC�� puentes de metileno puentes de metileno

con proteínascon proteínas�� estables o insolublesestables o insolublescomo polímero sólido como polímero sólido

�� metanol estabilizametanol estabiliza�� Sol. Acuosa Sol. Acuosa

tamponada pH 7.2tamponada pH 7.2--7.47.4

�� Mezclas Susa, BouinMezclas Susa, Bouin

�� estables o insolublesestables o insolubles�� Preserva lípidosPreserva lípidos�� Pobre carbohidratosPobre carbohidratos

COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)SOLUCIÓN (FORMALINA)

�� Hidrato de metilenoHidrato de metileno�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%

Ácido fórmicoÁcido fórmico�� Ácido fórmicoÁcido fórmico�� ParaformaldehídoParaformaldehído

(polímero sólido del formaldehído)(polímero sólido del formaldehído)

COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)EN SOLUCIÓN (FORMALINA)

�� Hidrato de metileno Compuesto activoHidrato de metileno Compuesto activo

�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%�� Ácido fórmicoÁcido fórmico CompuestosCompuestos�� ParaformaldehídoParaformaldehído no deseadosno deseados(polímero sólido del (polímero sólido del formaldehídoformaldehído))

ADHESIÓN A PROTEÍNASADHESIÓN A PROTEÍNAS

�� Adhesión de hidratos de metilo a grupos Adhesión de hidratos de metilo a grupos funcionales de los aa.funcionales de los aa.

�� ReversiblesReversibles�� Fijación inicial: 12Fijación inicial: 12--24 hrs24 hrs�� Fijación inicial: 12Fijación inicial: 12--24 hrs24 hrs�� N terminal de la lisina.N terminal de la lisina.

NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA

CH2OH

+ H2OHPROTEÍNA

H 2 C O + HOCH3 H2C

OH

FORMALINA modo de acción

O CH3formalina metanol

hemiacetal

Hidrato de metileno

FORMALDEHÍDOFORMALDEHÍDO

C OH

HEn solución acuosa:En solución acuosa:

C

H

H

O + O

H H

H

H

C O + O

HH

CH

H

O H

O H

FORMOL AGUA HIDRATO DE METILENO

PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS�� Formación de puentes cruzados entre Formación de puentes cruzados entre

componentes de una proteína o entre componentes de una proteína o entre moléculas de 2 proteínas.moléculas de 2 proteínas.

�� Unión química estable.Unión química estable.�� Unión química estable.Unión química estable.�� Fijación completa: 1Fijación completa: 1--2 semanas2 semanas

PenetraciónPenetraciónHidrato deHidrato de Reacción Reacción MetilenoMetileno con gruposcon grupos

NHNH

FIJACION CON FORMALINA

NHNH22

Formación deFormación dePuentesPuentes ReacciónReacciónmetilénicosmetilénicos entre NHentre NH22

metiladosmetilados

PROTEÍNACH2OH + H

PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS

PROTEÍNA

PROTEÍNAPROTEÍNA CH2 + H2O

Formación de puentes de metileno entre el grupo hidroximetilo y grupos funcionales de

moléculas de otras proteínas.

FORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINA

Equilibrio de la soluciónEquilibrio de la solución

Tiempo/ pHTiempo/ pH

CompuestoCompuesto Compuestos Compuestos activo no deseados activo no deseados

PUENTES METILÉNICOS

Proteína + formalina + H proteína proteína proteína + H OCProteína + formalina + H proteína proteína proteína + H2OC

H2

PUENTES METILÉNICOS

Proteína + formalina + H proteína proteína proteína + H OCProteína + formalina + H proteína proteína proteína + H2OC

H2

La fijación involucra una interacción con proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.

grupos afectados en la fijación de grupos afectados en la fijación de proteínas:proteínas:

AminoAminoIminoIminoPéptidoPéptidoPéptidoPéptidoGuanidiloGuanidiloHidroxiloHidroxiloCarboxiloCarboxiloSHSHAnillos aromáticosAnillos aromáticos

PUENTES METILÉNICOS

•SON MUY ESTABLES

•RESPONSABLES DE LA FIJACIÓN DE LAS PROTEÍNAS•(cross linking)•(cross linking)

•Son reacciones lentas

•Se acepta que llegan a un medio aceptable a las 12 a 24 horas

•Excepto para tejido nervioso

Formación de puentes de metileno entre moléculas

de la misma proteína

PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS

metileno entre moléculas de la misma proteína

Los puentes de metileno pueden formarse Los puentes de metileno pueden formarse entre dos grupos similares:entre dos grupos similares:

NH2 NH2 NH2NH2

o o grupos distintos:grupos distintos:

NH2 (CONH) péptidoNH2 (CONH) péptido

La molécula de Metilen glicol se una a LISINA

PROTEÍNA NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA N + H2O

H

PROTEÍNA NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA N + H2O

CH2OH

ARGININA. CISTEINA, SERINA, etc (ver pág 21 J.A. KIERNAN

Aunque los aldehídos puros nopueden tomar parte en puentes de hidrógeno entre sí,tienen pares de electrones no compartidos y pueden formar puentes de hidrógenos con otros compuestos que tengan enlaces compuestos que tengan enlaces

O – H y N – H.

Gracias a tales puentes de hidrógeno, los aldehídos son buenos solventesde sustancias polares, como por ejemplo de los alcoholes,también son muy solubles en agua.

LaLa únicaúnica reacciónreacción irreversibleirreversible alal fijarfijar conconformalinaformalina eses lala queque tienetiene lugarlugar concon elelhidrógenohidrógeno aromáticoaromático enen elel triptofanotriptofano,,fenilalaninafenilalanina,, tirosinatirosina ee histidinahistidina..

EstaEsta reacciónreacción ocurreocurre muymuy lentamentelentamente yy sesesiguesigue aa menudomenudo porpor condensacióncondensación concon otrootrogrupogrupo reactivoreactivo parapara formarformar puentepuente dedemetilenometileno..

ALMACENAMIENTOALMACENAMIENTO

Cuando la formalina se guarda ocurren Cuando la formalina se guarda ocurren ciertas reacciones o procesos que ciertas reacciones o procesos que provocarán el deterioro de esta solución :provocarán el deterioro de esta solución :

a) a) PrecipitaciónPrecipitaciónb) b) AcidificaciónAcidificación

El formol y el paraformol coexisten en las soluciones límpidas,bajo la influencia del frío o por otras causas, se polimerizany dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco.

ACIDIFICACIÓNACIDIFICACIÓNLa reacción de moléculas de un aldehído con un La reacción de moléculas de un aldehído con un

equivalente de una base fuerte puede dar equivalente de una base fuerte puede dar como resultado un mol de alcohol y otro de la como resultado un mol de alcohol y otro de la

sal del ácido carboxílico.sal del ácido carboxílico.

2 R-CHO + NAOH R-COO- NA+ + R-CH2OH

La acidificación de la formalina afecta en La acidificación de la formalina afecta en gran medida la fijación y los procesos gran medida la fijación y los procesos ulteriores como la coloración.ulteriores como la coloración.

ACIDIFICACIÓNACIDIFICACIÓN

ulteriores como la coloración.ulteriores como la coloración.-- Pigmentos por oxidación de Pigmentos por oxidación de hemoglobinahemoglobina

-- Disminución de la tinción Disminución de la tinción basófilabasófila de los núcleosde los núcleos

Para inhibir este proceso la solución comercial Para inhibir este proceso la solución comercial viene con Metanol al 10% v/vviene con Metanol al 10% v/v

CH

HO + CH

H

H

OH CH

HO + H

H

H

C OH

H H

FORMOL

HIDRATO DE METILENO

CH

H

OH

C OH

H

H

METILAL

PRECIPITACIÓNPRECIPITACIÓN

La unión de hidratos de metileno formarán La unión de hidratos de metileno formarán polímeros solubles denominados polímeros solubles denominados paraformaldehídoparaformaldehído (2 (2 –– 8 monómeros8 monómeros).).

HO CH2 O H + H O CH2 O H HO

CH2

O

CH2

O H

+ H O H

HIDRATO DE METILENO

HIDRATO DE METILENO

PARAFORMALDEHÍDO AGUA

PRECIPITADOS DE FORMALINA:

Son gránulos de color negruzco

Producidos por la hemateína

Por degradación de la hemoglobina

¿QUÉ ORGANOS O TEJIDOS?

FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO

Solución de fijaciónSolución de fijación::

�� Se debe utilizar en sus condiciones mas Se debe utilizar en sus condiciones mas �� Se debe utilizar en sus condiciones mas Se debe utilizar en sus condiciones mas establesestables�� Neutralizada con carbonato de calcioNeutralizada con carbonato de calcio�� Tamponada en bufferTamponada en buffer�� Suero fisiológicoSuero fisiológico

FORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINA

Equilibrio de la soluciónEquilibrio de la solución

Tiempo/ pHTiempo/ pH

CompuestoCompuesto Compuestos Compuestos activo no deseadosactivo no deseados

FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO

�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs

�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::

�� 10 x 10 x 5 mm10 x 10 x 5 mm

FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO

�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::

�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs

44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs

FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO

�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs

�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::�� 10 x 10 x 5 mm10 x 10 x 5 mm

�� Volumen de fijadorVolumen de fijador::�� 20 20 –– 30 veces el volumen de la muestra30 veces el volumen de la muestra

Fijadores a base de formol

Formol neutro

Formol buffer

Histología en general

Estudios histológicos

Sistema nerviosoFormol buffer

Formol alcalino

Formol Ca etc

Impregnaciones argénticas

Tejido óseo

Identificación de fosfolípidos

proteínas

�� Es una formalina que sigue el mismo principio Es una formalina que sigue el mismo principio de la F. Neutrade la F. Neutra

�� El compuesto que mantiene el pH será un El compuesto que mantiene el pH será un Buffer: Fosfato disódico, Fosfato monobásico Buffer: Fosfato disódico, Fosfato monobásico Acetato de Calcio, etc..Acetato de Calcio, etc..El Amortiguador al tamponar genera una El Amortiguador al tamponar genera una

FORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADA

Acetato de Calcio, etc..Acetato de Calcio, etc..�� El Amortiguador al tamponar genera una El Amortiguador al tamponar genera una

solución tendiente al equilibrio de la solución solución tendiente al equilibrio de la solución pudiendo esta última ser variadapudiendo esta última ser variada

�� Este dependerá de las necesidades del tejido v/s Este dependerá de las necesidades del tejido v/s los recursos del laboratoriolos recursos del laboratorio

FORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRA

�� Formalina + una sal :Formalina + una sal :�� Carbonato de calcioCarbonato de calcio�� Mantiene un pH cercano a el de los tejidos entre Mantiene un pH cercano a el de los tejidos entre

6,3 a 76,3 a 76,3 a 76,3 a 7�� Evita la acidificación por almacenamientoEvita la acidificación por almacenamiento�� Genera una solución invariable y lista para fijarGenera una solución invariable y lista para fijar�� Bajo CostoBajo Costo

FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )

Formaldehido al 37%………………………100 cc.Agua destilada …………………………… 900 cc.Agua destilada …………………………… 900 cc.Fosfato monobásico ( Na2PO4 x H2O ).. 4 grs.Fosfato disódico ( Na2HPO4 )……….…. 6,5 grs.

Formol sucrosa tamponado

Histología en general

Excelente conservador de estructuras finasExcelente conservador de estructuras finas

Para comparaciones con microscopio electrónica

Sin contra indicaciones

Formol alcohólico Formol acetato de calcio

Histología de mucopolisacáridosHistología de mucopolisacáridos

Histología de fosfolípidos

contrindicaciones Identificación de calcio

Teóricamente el formaldehído es un no-electrolito,incapaz de formar sales, pero sí de formar compuestos de adición.

El formol solo, puro o diluido es un mal fijador,

MEZCLAS FIJADORAS

BOUIN

El formol solo, puro o diluido es un mal fijador,produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las célulaso bien les da un aspecto de sobrefijadosdisminuye los contrastes entre citoplasma y núcleo.

La adición de ácido acético, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la coloreabilidad del núcleo.

Derivados de la Formalina o Derivados de la Formalina o pertenecientes a la misma Familia:pertenecientes a la misma Familia:

�� ParaformaldehídoParaformaldehído�� ParaformaldehídoParaformaldehído

�� GlutaraldehídoGlutaraldehído

polímero sólido de formaldehído, produce una fijación suave y paulatina alteran muy poco las estructuras celularesuso al 4 % en PBS Se disuelve muy mal en soluciones acuosas

calentarlo a 60º durante media hora en agitación

PARAFORMALDEHIDO

en agitaciónmuy inestablesolo dura un mes a 4º

Las soluciones stock deben almacenarse a -20 durant e máximo de un año, se descongelan inmediatamente antes de usar.

Efectos a bajas concentracionesde Formaldehído

Dermatitis, tos Disminución de la capacidad pulmonarromadizo, dolor de garganta, dificultad para dormir,romadizo, dolor de garganta, dificultad para dormir,

• dolor de cabeza, • fatiga, dificultades respiratorias, • sinusitis, dolor de cuello, náuseas frecuentes • bronquitis.

LAGO RUPANCO - PUNTIAGUDO