KROMATOGRAFI KOLOM

Pemakaian

Memisahkan zat warna (pigmen) tumbuhan

Pemisahan metabolit sekunder

Pemisahan enzim

Berdasarkan perbedaan adsorpsi, fasa diam:

Fasa normal, bersifat PolarContoh: silikagel, aluminaFasa terbalik, bersifat Non polar

Contoh: RP4, RP8, RP18

Bila komponen yang dipisahkan bersifat amfifilik (lipid, minyak/ lemak), dapat digunakan fasa normal maupun fasa terbalik

Langkah operasionalEluen berupa campuran beberapa pelarut, didasarkan uji KLT

Perbandingannya diperkecilHanya satu komponen Rf> 0,4 Dengan Eluen tunggalAbsorben : sampel = 50 : 1Silikagel : alumina = 2 : 1

Langkah operasional lanjutan

Proses pembuatan bubur fasa diam, Rf harus terkecil

Diamkan bubur di kolom, tanpa gelembung, kran atas bawah tertutup

Permukaan pelarut 1-2 cm dari permukaan absorben

Eluen aseton max 30%

Faktor-faktor Kromatografi kolom

1. AbsorbenSellulosa, starch, gula,

magnesium silikat, kalsium sulfat, silikagel, florosil, magnesium oksida, alumina, karbon aktif

Tdk bersifat universal, tapi spesifik

Faktor-faktor Kromatografi kolom

lanjutan

2. Pelarut N- heksana, petroleum eter, sikloheksana, karbon tetra klorida, benzena, kloroform, dietil eter, etil asetat, aseton, etanol, metanol, air.Step gradien polarity: peningkatan kepolaran secara bertingkat

Faktor-faktor Kromatografi kolom

lanjutan

3. Ukuran kolom dan jumlah absorben

Jumlah absorben : sampel = 50 : 1Tinggi absorben : diameter kolom = 8 : 1

Sampel(g)

Absorben(g)

Diameter kolom (mm)

Tinggi kolom (mm)

0,010,101,00

10,00

0,55,0

50,0500,0

3,57,5

16,035,0

3060

130280

Faktor-faktor Kromatografi kolom

lanjutan

4. Kecepatan alirKonstan, tidak terlalu cepat, tidak terlalu lambat.

Pada saat aliran terjadi kesetimbangan distribusi antara fasa diam dan fasa gerak