3.Virus Dxviral

7/23/2019 3.Virus Dxviral

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Cultivo de virusDetección de células infectadas por virusDiagnostico viral en el laboratorio



Métodos de cultivo viral (aislamiento)

Virus

CÉLULAS

Animales delaboratorio

Huevosembrionados

Líneas celulares

Cultivos primariosCultivos secundariosCultivos continuos o líneas celulares



Huevos embrionados

! Embrión de pollo

! Edad: 5-14 días después de su fertilización.! Vías de inoculación:

! membrana corioalantoidea.!

cavidad amniótica!

saco vitelino! cavidad alantoidea



Crecimiento viral en embrión de pollo

virus Vías de inoculación signos

Herpes simplex Saco vitelino muerte

Herpes simplex

poxvirus

Membrana

corioalantoidea

pústulas

InfluenzaNewcastleAviadenovirus

Cavidad alantoidea HemaglutinaciónMuerteMuerte

Influenza Cavidad amniótica Hemaglutinación



Animales de laboratorio

" Técnica poco empleada; solo los que no puedan replicarse enembriones de pollo o cultivos celulares

" TIPOS DE ANIMALES: monos, cobayos, ratones lactantes y conejos.

" ACTUALMENTE SE UTILIZAN EN:

* Estudios de mecanismos de patogenicidad , investigacionesepidemiológicas y respuesta inmune

* Producción de Ac en grandes cantidades: vacunas(especialmente conejos)

* Para probar agentes antivirales



Cultivos celularesSon poblaciones celulares homogéneas, que pueden ser incluso

mantenidas y multiplicadas in vitro.

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganostomados directamente del organismo.

Cultivos secundarios: se obtienen a partir de subcultivos, solo crecenunos cuantos pases. Se les llaman células diploides (estas crecen hasta50 pases)



Cultivos continuos o Líneas celulares

•

Son de origen tumoral o derivados de células diploides x Tx consustancias carcinogénicas

• Duran un tiempo prolongado o indefinido

• Algunas líneas celulares:

– Células HeLa

Células humanas, obtenida de Henrietta Lacks,(falleció de cáncer de útero) a partir del cual seobtuvieron estas células: células HeLa



Líneas celulares de Primates (riñón mono verde africano): líneas Vero

Líneas celulares de tumor de rata: GH3 y PC12

Líneas celulares de ratón: MC3T3

Líneas celulares de plantas: Nicotiana tabaccum BY-2

Líneas celulares de otras especies: células de pez cebra ZF4 y AB9

– ST: células de testículos de cerdo

–

RK 13: células de riñón de conejo – PK-15: células de riñón de cerdo

El tipo de línea celular depende del virus que se quiera aislar

Líneas celulares



EFECTO CITOPÁTICO (ECP)

Son los cambios morfológicos, bioquímicosmoleculares, y de viabilidad celular, visibles

a microscopia óptica, causados durante elciclo de replicación viral.

LINEAS CELULARES

Detección de células infectadas por virus en



Sin InfecciónMonocapa de Células C6/36

Infectadas con Dengue 2(RIO)

(Destrucción de monocapa)

Líneas celulares Vero

no inoculada ECP característico de adenovirus



Cambios observados en las monocapas

•

Monocapa normal

•

Monocapas infectadas–

Lisis

– Corpúsculos de inclusión

–

Presencia de antígeno



El cultivo masivo de líneas celulares animales esfundamental para:

"

La manufactura de vacunas virales

"

Productos biotecnológicosAc monoclonales, interleucinas, linfocinas,agentes anticancerígenos.(mediante tecnología del ADN recombinante)



Cultivo de virus

Cultivo de virus que infectan humanos y/o animales:

Animales de experimentación

Embriones de pollo

Líneas celulares

Cultivo de bacteriófagos: “cultivos puros" en medios líq. o semisólidos

Cultivo de algas y hongos

Cultivo de virus vegetales: planta o protoplasto

Cultivo en insectos



Cultivo de bacteriófagos

-Se mezcla, la célula huésped, con elbacteriófago en agar nutritivo.

- Después de varios ciclos de

multiplicación lítica, los virus destruyenlas bacterias.

El área de lisis es llaman “calvas”

-Se reportan unidades formadoras deplacas (UFP)



" Ensayo en placa.

Placa mostrando las calvasproducidas por unbacteriofago (1-2mm).

Cultivo de bacteriófagos



"

Métodos directosdetectan

1. Al virus como agente infeccioso: cultivo celular

2. La presencia de antígenos virales (pruebasinmunológicas)

3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR)

4. El virus como partícula viral (microscopio electrónico)



Técnica que utiliza Ac unidos a una sustancia fluorescente parademostrar la presencia de una determinada molécula (partícula viral).

Compuesto fluorescente:

Isotiocianato de fluoresceína

Se expone la muestra así tratada a una fuente deluz de onda corta ( UV o azul). Esta luz genera unfenómeno de fluorescencia en la moléculamarcadora que a su vez emite luz a una longitud

de onda mas larga (verde, amarillo o naranja).

Esta luz emitida puede ser cuantificadaEn preparados histológicos, se puede observar conmicroscopio de fluorescencia.



Es una técnica de inmunoensayo, en la cual un antígeno inmovilizado sedetecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generarun producto detectable como cambio de color.



O inmunoblot, se usa para detectar proteínas específicas en una muestradeterminada (una mezcla compleja )

Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterioque se desee: peso molecular, estructura, punto isoeléctrico, carga eléctrica, etc.Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosao de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicoscontra ella.

Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática,fluorescencia entre otros métodos.De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto yanalizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.



# Se coloca el suero del paciente sobre la membrana denitrocelulosa.

# Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulinahumana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y,por último, se agrega el substrato enzimático para lavisualización de las bandas reactivas con un producto finalcoloreado.

# La técnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero más

específica que esta.



TEST DE AGLUTINACIÓN

Método simple, para la detección de antígenos virales en muestras clínicas.

Técnica rápida y barataSe usa partículas de látex

Antígeno de Rotavirus en heces (el más importante) mostrando una buenasensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. También

Adenovirus.

Test inmunocromatográfico

para rotavirus y adenovirus



PCR, PCR tiempo real, sondas de ácidos nucleicos



Virus H5N1

rotavirus



La envoltura viral contiene dos glicoproteínas: ej: virus de la gripe

1)

la hemaglutinina (HA) y2) la neuraminidasa (NA).

La proteína HA es la proteína de unión al receptor celular, favorece la fusiónde la envoltura del virus con la membrana celular, importante para lapenetración del virus a la célula blanco.

hematoaglutinina : debido a la capacidad de estas proteínas de provocaraglutinación de los hematíes.

"

Métodos indirectos



HemoaglutinaciónEs uno de los métodos indirectos más comunes para cuantificarpartículas virales y/o antígenos virales hemoaglutinantes ensuspensión.

Vacuna del Virus de Newcastle Eritrocitos de pollo

Observe hemaglutinación cuando los eritrocitos en los pozos control hanformado botones compactos.

Una unidad de hemaglutinación (UHA) es la más alta dilución de lasuspensión viral que aún de una aglutinación completa.



Familia Género o especie Eritrocitos

Adenoviridae Poxviridae Parvoviridae

Togaviridae Flaviviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae

Coronaviridae Bunyaviridae Rhabdoviridae Reoviridae

La mayoría de las especies Ortopoxvirus La mayoría de las especies

Alfavirus Flavivirus Influenza A

Parainfluenza Enfermedad de Newcastle Varias especies Varias especies Rabia Reovirus Rotavirus

Mono y/o rata, 37°C Pollo, 37°C Cobayo, hámster, cerdo, humano,mono, 4°C. Ganso, pa loma, po l l i t o ; pH ytemperaturas críticos. Pollito, humano, cobayo, 4°C.

Pollito, humano, cobayo, 4°C.

Rata, ratón, pollito. Ganso; pH crítico. Ganso, 4°C. Humano

Virus hemaglutinates



CUADRO CLÍNICO



Cuadro clínico

Cultivos celulares

Técnicas inmunológicas

Aglutinación en latexInmunoflurescencia

ELISA, RIA

Western Blot

Métodos moleculares

PCR, PCR tiempo real

Microscopio electrónico

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