3- Aula IMUNOENSAIO USANDO CONJUGADOS.pdf
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IMUNO ENSAIOS USANDO
CONJUGADOS
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REAES USANDO REAGENTES MARCADOS
Conjugado: molcula constituda por duas substncias ligadas covalentemente e que mantm as propriedades funcionais de ambas
Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com
isotiocianato de fluorescena (FITC)
HRP: enzima peroxidase
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IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO
CONJUGADOS
Antgenos usados nos imuno ensaios: patgeno inteiro, molculas derivadas de patgenos, hormnios
Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais
Ensaios manuais e automatizados
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TCNICAS
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1 TCNICAS QUE USAM FLUORESCNCIA
Fluorescncia: emisso de luz de uma cor aps
irradiao com luz de cor diferente:
FITC: absoro mxima (490-495 nm), emisso
mxima (517 nm)
Tcnicas: imunofluorescncia, citometria de fluxo
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Alguns fluorocromos
FITC: isotiocianato de fluorescena
PE: ficoeritrina
Rodamina
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IMUNOFLUORESCNCIA
Lmina de imunofluorescncia
Antgeno usado: pode-se usar Ag comercial ou
pesquisar Ag (micrbio) num material coletado do
paciente (ex: secreo)
Exemplo: IMUNOCRUZI: Ag de Trypanosoma cruzi
liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT
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CONJUGADO E MONTAGEM DA LMINA
Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina
obtida em espcie heterloga (carneiro, cabra)
purificada e conjugada marcada - com substncia fluorescente (fluorocromo)
Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,
lmina coberta com glicerina de alcalina e lamnula
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KIT COMPLETO PARA
IMUNOFLUORESCNCIA
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REAO DE
IMUNOFLUORESCNCIA
I - Reao de imunofluorescncia direta
(RIFD)
pesquisa do Ag em clulas ou tecidos
elevada sensibilidade e especificidade
Usa um conjugado para cada sistema
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Reao de imunofluorescncia
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II - Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
amplificao do sinal aumento da
sensibilidade em relao RIFD
A - pesquisa de antgeno
mais sensvel, uso de um nico
conjugado para diferentes sistemas
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Reao de imunofluorescncia
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Reao de imunofluorescncia
indireta (RIFI)
B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso
Ag do agente infeccioso (lmina) + soro do paciente Ag-Ac
LAVAR
Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscpio
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RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI
TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE
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RIFI PARA ANTICORPO SRICO ANTI
LEISHMANIA
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DETERMINAO DA CLASSE DO AC
Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:
Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC
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DETERMINAO DO TTULO DE ANTICORPO
Como o resultado liberado:
Toxoplasmose IgG (imunofluorescncia):
Resultado: reagente (ou positivo at) 1:8.192
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INTERFERENTES NA PESQUISA
DE IgM POR RIFI
Presena de fator reumatide (FR) falso-
positivo:
o Competio com IgG falso-negativo
Para eliminar falso positivo e falso negativo:
Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro
com anti IgG humano seguido de centrifugao usar sobrenadante para dosagem de IgM
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KIT PARA IMUNOFLUORESCNCIA PARA AC
ANTI TRYPANOSOMA CRUZI
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Desvantagens da RIFI:
Mais demorada, maior nmero de reagentes
Limitaes da reao de imunofluorescncia
Necessidade de microscpio de fluorescncia,
subjetividade, no automao
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AUTOMAO NA IMUNOFLUORESCNCIA (E
ELISA)
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REAES DE
ENZIMAIMUNOENSAIO
Reao Ag-Ac monitorada por medida da
atividade enzimtica
Alta sensibilidade, reagentes estveis,
leitura visual ou fotomtrica, substratos
coloridos ou luminescentes
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CLASSIFICAO DOS ENZIMA-
IMUNOENSAIOS
Ensaios homogneos: atividade da enzima alterada como parte da atividade imunolgica, no precisa de lavagem entre as etapas
Ensaios heterogneos: atividade da enzima no alterada, precisa de lavagem entre as etapas
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ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGNEO
SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)
A atividade da enzima alterada pela ligao do Ac ao substrato fluorognico
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ENSAIOS HETEROGNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay)
Uso de peptdeos sintticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais
Fase slida: placas de poliestireno
Material da placa tem afinidade por protena
Interao protena-placa no covalente
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PLACAS E TIRAS PARA ELISA
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ETAPAS DO ELISA
sensibilizao (ou cobertura) da fase slida: adio de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)
Bloqueio: adio de protena inerte: soro fetal bovino, leite desnatado
lavagens
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ETAPAS DO ELISA
adio da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *
adio do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)
lavagens
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ETAPAS DO ELISA
o Adio do substrato cromognico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina) ou ABTS (cido 5-amino
saliclico) (cromgenos)
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ETAPAS DO ELISA
Interrupo da reao: adio de SDS ou H2SO4
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Leitura do resultado
Leitor de ELISA: Fotmetro multicanal para tiras ou placas
Filtros: 405, 450, 490, 630 nm
Leitura monocromtica: uso do comprimento de onda no qual o produto da reao tem maior absorbncia
Leitura bicromtica ou diferencial: uso de 2 filtros: o primrio e o diferencial
Elimina imperfeies do plstico
Leitura feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferena das 2 absorbncias
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EXPRESSO DOS RESULTADOS
limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de
um teste sorolgico; pode-se trabalhar com maior
especificidade ou sensibilidade dependendo do
objetivo do teste (ex: seleo de doadores num
banco de sangue)
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Cut-off (limiar de reatividade)
Corrigir: b: mxima sensibilidade e especificidade
g: mxima especificidade
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Leitor de ELISA
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Reao de ELISA
Lavadora de
placas
Pipeta
multicanal
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ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS
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ELISA: ENSAIOS PARA ANTGENOS
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II - Western Blot
Pesquisa de antgenos e anticorpos
Exemplos:
- Caracterizar reatividade srica de paciente suspeito de infeco pelo HIV (teste confirmatrio para infeco pelo HIV)
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II - WESTERN BLOT
Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:
Fracionamento das protenas do HIV: separao de acordo
com peso molecular
Transferncia das protenas para membrana de nitrocelulose
Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais protenas do HIV o soro reconhece
Cromgeno usado deve originar produto insolvel
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Western blot
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Western Blot
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ONDE ESTUDAR
Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. VAZ, TAKEI, BUENO, 1 edio, 2007
OU
Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas
Infecciosas e Auto-Imunes FERREIRA & VILA, 2a edio, 2001.
OU
Imunologia Mdica - PARSLOW, 10a edio, 2004.
OU
Imunologia Clnica na Prtica Mdica VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,
1 edio, 2008.