UNIVERSIDADDEL CAUCAFACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACINDEPARTAMENTO DE BIOLOGAREA DE MICROBIOLOGIA

Prcticas de Laboratorio de Microbiologa

MTODOS DE ASEPSIA Y UBICUIDAD MICROBIANA Gua No. 3

1. INTRODUCCIN

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo fsico y qumico.

Por lo tanto, para limitar su presencia o eliminarlos, y de esta manera poder desempear correctamente las tareas en un laboratorio de microbiologa, es indispensable contar con conocimientos tericos acerca de los diferentes mtodos de control del crecimiento microbiano (mtodos de esterilizacin, desinfeccin, asepsia, etc.); y con un buen manejo prctico de los equipos destinados a tal fin, as como tambin del flameado de cajas de Petri, tubos y esterilizacin de asas a la llama del mechero.

2. OBJETIVOS Observar la importancia de la asepsia en el control de la contaminacin microbiana en el laboratorio Demostrar la ubicuidad de los microorganismos a partir de diversas fuentes utilizando tcnicas de cultivo en medio slido.

3. CONSULTAS PRELIMINARES

Se recomienda leer un texto de microbiologa general sobre la distribucin de los microorganismos en diferentes ambientes y conceptos de tcnicas de asepsia.

4. MATERIALES

Los materiales requeridos por grupo son:

MATERIALCANTIDAD

Cajas de Petri 6

Copos de algodn6

Asa bacteriolgica 1

Mechero1

Tubos taparosca (2 agua, 1 sln salina)3

5. REACTIVOS

SUSTANCIAS*CANTIDAD

Agar nutritivo90 ml (15 x c/c)

Solucin salina fisiolgica10 mL

Hipoclorito de Na (5,25%, 2,5%, 0,5%)

Agua destilada estril20mL

Cultivo bacteriano en caldo1

No hay restriccin de seguridad por el uso de este medio de cultivo. Remitirse al protocolo de preparacin recomendado por el proveedor en el frasco del medio de cultivo.

6. EQUIPOS

EQUIPOS*CANTIDAD

Incubadora1 para todos los grupos

La incubadora estar previamente calibrada a la temperatura requerida, lo cual ser realizado por el auxiliar de laboratorio. Favor no manipular el equipo y mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el cultivo a incubar.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. TCNICAS ASPTICAS

a) Con un asa sin esterilizar tomar una gota de agua destilada estril y rayar suavemente la superficie del agar nutritivo, como lo muestra la grfica, teniendo la precaucin de no romper la superficie del medio de cultivo

b) Limpiar la superficie de la mesa con alcohol al 70%, encender el mechero y quemar el asa bacteriolgica hasta que se torne roja y dejarla enfriar. Al lado del mechero, destapar cuidadosamente otro tubo de agua destilada estril y con el asa tomar una gota, rayar suavemente la superficie del medio de cultivo

c) Una vez realice la siembra, vuelva a quemar el asa para desinfectarla. Flamee la boca del tubo de ensayo para evitar contaminacin. Repita el procedimiento anterior, pero coloque la gota a partir del tubo que contiene un cultivo bacteriano. En todos los casos, evite la manipulacin libre del asa bacteriolgica y flamela hasta lograr la esterilizacin.

Rotule cada una de las cajas y sllelas con papel parafilm o similar. Colquelas en forma invertida en la incubadora a 35 +/- 2 C por un periodo de 24 horas.

7.2. DISTRIBUCION DE MICROORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES

7.2.1. MICROORGANISMOS DEL AIRE

Destapar una caja de petri con agar nutritivo en. 1. Sobre la incubadora, 2. En pasillo, 3. En el bao, 4. Dentro de la cmara de flujo laminar apagada, 5. Dentro de la cmara de flujo laminar encendida (realizar el procedimiento de desinfeccin previo al uso de la cmara) y 6. Al lado del mechero encendido Dejarla expuesta por 15 minutos, despus tapar adecuadamente y rotular Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 horas, colocando las cajas invertidas.

Los muestreos descritos en los siguientes tems deben realizarse teniendo en cuenta las tcnicas de asepsia

7.2.2. MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES

Tomar una torunda o copo de algodn humedecido en solucin salina Frotar sobre las siguientes superficies: 1. mesn del laboratorio sin desinfectar, 2. mesn desinfectado con etanol al 70%, 3. mesn desinfectado con hipoclorito al 5,25%, 4. mesn desinfectado con hipoclorito al 2,5%, 5. mesn desinfectado con hipoclorito al 0,5%, 6. Pared interna de la incubadora. Aplicar la torunda sobre un extremo del medio de cultivo en la caja de Petri Hacer estras en toda la superficie sin romper el medio de cultivo Tapar adecuadamente y rotular Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 horas, colocando las cajas invertidas.

7.2.3. MICROBIOTA DEL CUERPO HUMANO

7.2.3.1. MANOS

El siguiente procedimiento lo debe realizar una sola persona

a) Sin lavarse las manos, frotar cada uno de los dedos de la mano izquierda haciendo crculos sobre el agar nutritivo. b) Aplicar sobre la mano izquierda un gel antibacterial, dejar secar y realizar el procedimiento anterior en otro medio de cultivo.c) Lavar con jabn la mano derecha (segn las instrucciones del docente) y enjuagar con agua de grifo, secar con toalla de papel.d) Realizar el procedimiento como en el tem a.e) tapar adecuadamente y rotularf) Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 horas, colocando las cajas invertidas.

7.2.3.2. MUCOSAS

El siguiente procedimiento lo deben realizar dos personas

Frotar con una torunda de algodn humedecida en solucin salina estril las siguientes mucosas por persona: fosas nasales, lengua, parpado inferior. (utilizar una torunda por mucosa muestreada) Aplicar la torunda sobre un extremo del medio de cultivo en la caja de petri y hacer estras en toda la superficie sin romper el medio de cultivo tapar adecuadamente y rotular Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 horas, colocando las cajas invertidas.

8. OBSERVACIONES, CLCULOS Y RESULTADOS

Lleve un registro de todos los cambios observados sobre el medio de cultivo, describiendo el crecimiento de las colonias, sus colores, formas y texturas, con base en los grficos anexos. Diferencie los resultados para cada uno de los orgenes de muestras. Para efectos de descripcin del crecimiento de las colonias, utilice el material anexo.

9. REPORTE DE RESULTADOS

1. Datos del experimento de muestreo de airea. Ambiente muestreado:_______________________________________b. Tiempo de contacto entre ambiente y medio de cultivo:______________c. Medio de cultivo usado:______________________________________d. Horas de incubacin:________________________________________e. Temperatura de incubacin:___________________________________

2. Datos del experimento de lavado de manosa. Tipo de jabn usado: _______________________________________b. Tiempo de lavado: __________________________________________c. Medio de cultivo usado:______________________________________d. Horas de incubacin:________________________________________e. Temperatura de incubacin:___________________________________

3. Datos del experimento de muestreo de superficiesa. Ambiente muestreado:_______________________________________b. Qumico Usado para desinfectar:_______________________________c. Concentracin del qumico:___________________________________d. Tiempo de contacto entre ambiente y qumico:____________________e. Medio de cultivo usado:______________________________________f. Horas de incubacin:________________________________________g. Temperatura de incubacin:___________________________________

4. Datos del experimento de muestreo de mucosasa. Mucosa muestreada:________________________________________b. Medio de cultivo usado:______________________________________c. Horas de incubacin:________________________________________d. Temperatura de incubacin:___________________________________

AmbienteMicroorganismoForma de la coloniaBordeColorNmero de colonias

10. PREGUNTAS

1. Segn los resultados de la prctica de laboratorio, existen diferencias en la abundancia y diversidad de los microorganismos dependiendo del ambiente muestreado? Por qu?2. Son similares o diferentes lo microorganismos que se encuentran en cada uno de los ambientes muestreados? Por qu? 3. Consultar y hacer una lista con nombres cientficos de 10 microorganismos comunes en cada uno de los ambientes de donde se obtuvo la muestra4. Con base en la lista que usted realice, seleccionar un microorganismo de cada ambiente y consultar sobre su clasificacin taxonmica, su metabolismo y su importancia ecolgica.

11. RECUPERACIN, DESACTIVACIN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS

Los residuos resultantes corresponden a cultivos bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en autoclave. Una vez terminado el proceso de esterilizacin, los residuos se disponen en bolsas termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificacin y se almacenan temporalmente bajo congelacin, La disposicin final se hace mediante el servicio de recoleccin de residuos biolgicos contratado por la Universidad con la Administracin Municipal.

12. BIBLIOGRAFA

ALCARAZ MUNGUA, MONICA. 2005. Manual de prcticas de microbiologa. Universidad de Colima, Mxico, D.F.

ALZATE, Rubn. Microbiologa: Prcticas de laboratorio. Universidad Nacional de Colombia. Sede Palmira. 1996.

BENSON, HAROLD. 1981. Microbiological applications. A laboratory manual in general microbiology. Wm. C. Brown Company Publishers. Iowa.

CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO

CRECIMIENTO EN AGAR INCLINADO

CRECIMIENTO EN GELATINA