121. 楼主请问一下在做疏水层析的一些问题.1.疏水的blinding buffer中一般要加那些试剂.2.离子对试剂常用的有那些,在做疏水层析时是否应加这些试剂.3.一般根据怎样的规则来选这些试剂和疏水填料还有离子排组色谱的填料有那些呀,他的分离的机制又是怎样呢?

1.疏水通常情况下不需要添加什么物质,就是高浓度的硫酸铵,氯化钠等盐,离子对是适合做反相用,蛋白纯化中不加这些物质.常用的我就知道三氟乙酸别我也不清楚.2.疏水的填料我们选择一般就用苯基的,别的不怎么用,一般用苯基足够了,实在不行再换别的.3好象没有离子排组色谱,应该是凝胶过滤色谱吧,分离原理很简单,那就是因为凝胶是多孔的,所以小分子能进入更小的孔,而大分子进不去,因此小分子流经的路径大于大分子的,选择的填料最常用的也就是葡聚糖凝胶,葡聚糖混合琼脂糖凝胶,还有烯丙基接枝葡聚糖凝胶,代表的产品有sephadex系列,superdex系列,sephacryl系列,具体的填料结构和规格可以参考<生物工程下游技术>

122. 我纯化的蛋白等电点预测为8.04左右,我用ph6.5的１０mM磷酸钠，１mM　ＥＤＴＡ的缓冲液，柱的填料为ＣＭ－钎维素，上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白，不幸的是目的蛋白也

被洗了下来，接下来的梯度洗脱根本就无用．请帮我看看是哪儿除了问提！

把缓冲液pH调低点，到5左右，样品要的盐浓度和pH都不能高于你平衡缓冲液的浓度。123. 请问sephadex G-25和QAE-sephadex A-25使用,再生的方法.我要分离分子量700左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)

都可以用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用50%乙醇洗,然后保存在20%的乙醇中.700左右的物质是什么东西,也许只能用RP-HPLC了.

124. 我的蛋白，从包涵体中纯化，用SKL溶解复性后上Sephadex G－100柱没问题，用PEG20000浓缩后再上DEAE－Sephadex A－50后不论用多大的NaCl浓度都挂在顶上下不来。都是在10度以下过的柱子，温度和缓冲系统都不成问题，是什么原因呢？吐血ing～～～～

也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子上,所以洗不下来.

我的蛋白的确很不稳定，但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外，我是用SKL溶解包涵体后透析除SKL复性，用非变性PAGE检验过的，如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗？我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用SKL处理，丙酮沉淀后SDS－PAGE发现目的蛋白就在里面，真郁闷呢……

所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.

125. 用离子交换分离蛋白质或多糖以往多用弱的离子交换树脂，现在出现了许多强离子交换树脂，如QSepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow，资料上介绍这些埴料性能较好。请问楼主，是否我买了Q Sepharose Fast Flow一般就不用买DEAE Sepharose等弱阴离子填料？谢谢。

我觉得Q可以部分代替DEAE.

1

126. 求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!

这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达

你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试.

至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那

填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的

需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样

类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯

化。这样省事点。

请问什么是分级沉淀包涵体？

参考这个帖子吧:http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=961391&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#961391

127. 我的蛋白是水溶性蛋白，还有整个操作过程所用的缓冲液都一样。根据氨基酸来看等电点大概4，我的缓冲液PH为8。包涵体溶解液大概10ml吧，稀释成100ml透析去除SKL，然后PEG20000浓缩回10ml，取一半上Sephadex G－100，峰形很漂亮，SDS－PAGE检测去除了部分杂蛋白，收集峰再用PEG20000浓缩成5ml，上DEAE－Sephadex A－50，上样后可以看到柱顶部挂着蛋白，但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白，后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M，还是不行。

那你就把缓冲液pH调到6-7,然后再做纯化试试.我还是觉得因为沉淀所以洗不下来.128. 我是搞药剂的，想请教一个问题，我将分子量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm（粒径范

围50-400nm，材料为单硬脂酸甘油酯，分子量358.6，采用药剂学方法聚合成载药纳米粒，聚合后分子量我也不知道，只知道粒径）的纳米粒中，现想将游离药物和载药纳米粒分离，请问应该

选用何种规格型号的Sephadex填料？文献有用Sephadex-G50的，我有Sephadex-G15，不知可否？谢谢！

我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子上面或中间,G50也也这些危险,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适.

129. 蛋白质去盐究竟是过柱好还是透析好？是否与柱子的质量有关系呢？

都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快.

130. 我的目的蛋白PI9.0，用弱阳离子交换层析（CM52）分离，请问平衡缓冲液（PH3.75）与上样液（PH4.0）这样大的PH差距会影响目的蛋白与介质的结合吗？

不会影响,但是为还是一致这样好一些.131. 请问chromatography ：我提纯的包涵体蛋白在经含不同浓度尿素的PBS中透析时析出来了，有什

么办法可以复溶吗？我要用此蛋白去打动物。另外我的蛋白是用8M尿素裂解后用镍柱纯化的，洗

2

涤液用的是含20ｍＭ咪唑，洗脱液用的是含250ｍＭ咪唑，但是纯化后跑SDS－PAGE发现，在洗涤液最后一管中己有我的目的蛋白，没有杂带，但在洗脱的第一管中就开始在紧邻我的目的蛋白

的上方出现一条杂带，并随着我的目的蛋白洗脱浓度的降低而降低，后来我试用的增大洗涤液中

咪唑浓度到40ｍＭ，结果还是一样，不知是什么原因，请问有更好的方法用镍柱纯化包涵体蛋白吗？如果我想纯化后不用透析就去打动物，有何方法呢？请多指教！谢谢！

1.如果要溶解还得用变性剂,这样变性条件下可以免疫动物,不需要除去.2.你可以用你的抗体做WB看看是不是你的样品变成了聚合体.3.镍柱纯化包涵体有专门的总结的帖子,你可以参考一下.4免疫动物的问题你可以发到免疫版或者直接搜索就能找到相关的材料.

132. 请问怎样在不引入其他杂质的情况下从阳离子交换层析（CM）纯化的蛋白中除掉核酸？谢谢！

加到2M硫酸铵,上苯基琼脂糖凝胶,核酸被吸附.蛋白不一定能被挂柱,阳离子柱子通常不吸附核酸的,你蛋白能被阳离子吸附,而核酸不能,这样不就可以了.所以最简单的是使核酸和你的蛋白带相反的电荷,这样用阴柱或者阳柱都可以达到你的目的.

133. 我做的原核表达GST-融合蛋白，用的是Glutathione Sepharose 4B的一次性小柱子，pharmacia公司的，经过反复试验，现在已经纯化出来了，期间曾得到你的指点，再次表示感谢！

现在我要开始大量提纯蛋白了，为了节省时间，我想问一下有没有类似Glutathione Sepharose 4B的用于大量提纯蛋白的进口柱子，就是说不用自己配填料的，直接用的这种柱子？若有何处可买到？

你需要多大的柱子呢,进口的好象只有5ml的预装柱,大的要自己装填,其实自己装是一样的,没有什么差别,我发了一些材料给你了,你可以考虑用国产的.

134. 我最近买了一个Amersham的中空纤维浓缩换液柱，柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig, 不知道psig和MPa之间怎么换算啊？15psig相当于多少MPa呢？ 多谢！！

1磅力/英寸2（psi）=6.895千帕（kPa）,所以15psi=103.425kPa=0.10MPa吧,你可以再问问他们的工程师吧,.

135. 有在柱子上切的，也有纯化后切的，切下的片段可以用原来的亲和填料去除，凝血酶也需要去除的，你可以看下面的一些材料吧：

http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins如果用凝血酶切的话，怎样去除凝血酶比较好？谢谢！

去除一般用肝素琼脂糖凝胶和苯甲脒琼脂糖凝胶.

136. 我们在做多肽的纯化，都是制备用的，不知道该用哪家的填料，现在有很多厂家来推销，Vydac，Kromasil，YMC都有，不知道哪家的反相硅胶比较好呢？

大的厂家都差不多,差别不大.

137. 你说阳离子柱子通常不吸附核酸的，为什么我用PH4.0上样，PH9.0洗脱，洗脱液测紫外吸收值时总在260有很高的的吸收值，难道不是核酸，那会是什么呢？

也许别的物 质也这样把,你可以把样品跑一下琼脂糖凝胶电泳,看看是不是就知道了.核酸酸性如果不强,你怕pH提高到5-6,这样核酸应该就挂不住,你偏酸性太多,那也许有一些会挂住,你试试吧.

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138. 您好chromatography ，我是新手，现在正在做牛血蛋白质的纯化，希望得到纯化的白蛋白和IgG。打算用盐析的方法先粗提白蛋白和球蛋白，然后层析分级，再超滤浓缩除盐。 现在遇到的困难是层析这部分，特向大狭您请教。

白蛋白和IgG分别应选用哪种层析方法？填料选择什么？洗脱液具体选择什么（分段洗脱）？每次上样量最大能到多（制备型）？多长时间能过完一次？柱子的寿命一般为多少？洗脱液流速控制到多少？

现在还没有做样品的电泳，所以还不知样品中杂蛋白和含量，只是在盐析中先用22%硫酸铵将纤维蛋白除去，用33%盐析出IgG样品，用50%除去拟球蛋白，用65%盐析出白蛋白样品。其中能提供以下数据①牛血清白蛋白：分子量：66210；分子形状：椭圆形；分子大小：40Å*140Å；等电点：4.7；血浆中的含量：52.0g/L。②IgG:分子量：15300；分子形状：球状；等电点：5.8—7.3;血浆中含量：2.0g/L。③另外，我从书上看到说：凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等，但对脱盐效果优良；流速较低，对分级

每周期约≥8小时，对脱盐仅30分钟；适用于大规模纯化的最后步骤，在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理，尤其适用于两种缓冲液交替时。

白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于IgG可以用重组蛋白A琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化.

139. 请问：sephadex系列, superdex系列 的gel fitrition column 有什么不同？

前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为pH,盐,压力而体积有很大的变化.

140. 请问上HPLC的样品盐浓度过高是否影响纯化效果？

那倒不会,但是盐浓度高和有机溶剂混合也许会产生沉淀堵柱子,所以还是要很小心,最好别有高盐

141. 柱子一般寿命多久，保养好了能用四五年吗？每次上样量是否不得超过十分之一？用于装填柱子的reservoir在哪里买得到，中文名叫什么，不同规格柱子用的reservoir是否是一个规格？一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少，大概需要洗脱液多少个柱体积，需要多长时间？

除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般3个柱床体积,多的要5个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积.

142. 凝胶过滤怎么脱盐啊,我做凝胶的时候buffer是甲酸铵，本身就是盐啊

buffer毕竟是低浓度的盐，而您过了凝胶柱后，除去了样品溶液中的大部分的盐。过柱子,除盐没有什么难的,很难在这里把整个操作写一遍,甲酸胺是可挥发性的盐,你浓度不高,物质稳定的话,直接冷冻干燥,或者真空干燥都可以去掉了,没有必要过柱子,我猜测你的是多肽,过柱子也去不掉盐.

143. 我提的蛋白中老是混有大量的血红蛋白，干扰实验的后续工作，非常苦恼。请问有没有那种介质可以吸附组织蛋白提取物中的血红蛋白？

144.我们的苯基琼脂糖凝胶可以吸附血红蛋白,而且很牢固,我们以前做过,你可以用这个办法去除, 在通常不加盐的情况下就可以吸附血红蛋白。

145. DEAE－Sephadex A－50是离子交换加凝胶过滤，想请教chromatography它单纯的凝胶过滤分离范围多大？相当于Sephadex的什么型号呢？谢谢。

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对这个填料不熟悉，没有用过，我觉得凝胶过滤相当于sephadex G-50，范围在1000-30000,但是它可用于纯化的蛋白分子量在30-200KD.

为什么范围和可用于纯化的分子量不一样呢？我的目的蛋白单亚基是18KD，该选哪个型号？

你是想用它做凝胶过滤还是离子交换呢，你为什么不用琼脂糖凝胶系列呢，这个填料在高盐的时候床体积

变化很大，不好用。

离子交换试了四个月不行，最近一次错用成了含PO3－的缓冲液，结果还没有开始往上加NaCl梯度蛋白就下来了，后来查资料才知道PO3－会和DEAE反应，不知道是否因此使这个柱子的离子交换失效，变成单纯的凝胶过滤，所以想知道和它相当的Sephadex的型号。

那何必呢,直接用凝胶过滤好了, sephadex G-50正好适合你的蛋白。146. 可是产品目录上说G－50分离范围是1000－5000，适用于脱盐，我的目的蛋白是18000啊。另外G－25有粗、中、细、超细颗粒之分，请问区别在哪里？

147. 我试做过两次CNBR活化亲合配基偶联，效果不太理想；希望能得到你的指点，听你说环氧活化琼脂糖凝胶有不少优点，请给一些活化及偶联的资料吧。

你偶联的是什么配基呢，环氧活化可以选择合适的亲和手臂，例如我们常用的有3-10个 碳原子的手臂，而对于一些物质的纯化，没有手臂是不行的。此外环氧活化再偶联形成的键非常稳定不容易脱落，所以我们

经常用这样的办法，我已经把我们的材料 发给你了，其实这样活化的方法偶联的效率也很高，它还适合带氨基，羟基，巯基等配基的偶联，应用范围很广，我觉得是不错的方法。

148. 镍柱选择哪个厂家性价比较好呢？

国产的就很好，价格便宜，性能一点也不差于进口的，螯合好了镍离子，载量高。能少花钱的何必多花钱

呢，其实所有这些厂家性能都差不多，没有太大差别。

你就选择北京卓冠科技有限公司的吧，没有必要选择进口的，你pM你的邮件地址给我。我可以把相关的材料发给你。

149. 我们实验室最近纯化了一批带His tag的蛋白，大部分为包涵体形式。用8M尿素超声溶解后，用amersham的镍柱纯化，结果均不是太纯。因为我的目的是想纯化后作为抗原做ELISA检测，为了防止与血清中的抗菌抗体起反应，必需得到很纯的蛋白。所以想请教一下还可以如何优化条件

或结合哪些别的纯化手段？如果几种纯化方法联用的话,怎样的顺序最合理呢？

一般通过一步亲和都可以得到不错的效果,没有必要多做几步,何况包涵体的蛋白用别的纯化方法效果未必好, 洗脱用阶段洗脱的方法,摸细致点, 相信会有好的结果的,你把你的邮件告诉我,我把我们的材料发给你参考吧.

150. 我提取了一些水溶性多糖，但含大量的色素。我想用分子筛或离子交换将色素与多糖分开，不知可行吗？色素会不会粘在填料上将填料污染？

只能说试试,色素种类很多,多糖也是如此,我也没有做过,只能试试.

你试试MCI GEL吧，这个东西分色素非常出色。你找这个公司要资料吧。

010-51528296sales@herbs-extract.com

151. 我想纯化一蛋白，分子量10kd左右，目的蛋白来自血液中，浓度大概为每毫升20纳克左右，其他性质不详。手边暂时没有bio-rad蛋白质纯化用mini-protein电泳仪，无法用tricine-sds-page纯化。反相液相色谱柱c18又太贵，有没有其他比较好而且又经济的方案？谢谢。

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只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧.

152. 你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达到80%以上. 现在的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% .

我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.

153. 我想问一下Ｃ８柱用于分离蛋白质或肽类物质时，怎样选择洗脱的试剂？我对ＨＰＬＣ不懂，但现在需要用！谢谢！

你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.

154. 今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：IPTG0.1mM，26～29度3小时。细菌离心后用PBS重悬，-80度反复冻融3次，蛋白酶抑制剂只加了PMSF，超声（可能有点过，有部分泡沫），加tritonX100后RT摇20min，添加DTT至10mM（操作手册说可以增加跟柱的结合）后10000g离心，上清过柱按说明操作。SDS-PAGE的结果，沉淀仍然有大量目的条带，过柱前的上清的同一位置就只有很淡条带，过柱后相类似，PBS洗出液里蛋白就较稀少，但关键洗脱液中就只见约26kD的条带，怀疑GST，但从何而来？

我曾经按此步骤纯化过分子量比较小的一个蛋白（含GST约55kD），纯化得率还可以，但这次失败的原因是什么呢？

我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧.

谢谢chromatography的教导，现在我已经决定不切除GST，凝血酶也很贵，不成功，则成＃％￥，所以，应该GST对研究影响不大吧。是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢？我添加的DTT是不是也有影响？怎样超声不会太过？我500ml菌液浓缩到15mlPBS，超声几次都还很粘稠，请再给予指点。变性剂是指哪些？

此外，听您讲有国产的层析柱还是怎样，可否给小弟一些资料？

我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍

155. 我的酶蛋白单体分子量约为90KD，其四聚体的分子量约为360。我现在用的凝胶柱是S-200，是不是不大合适？此外，做SDS-PAGE时，有一条杂蛋白，和我的目标蛋白距离很近，一直分不开。不知道该怎么办？

你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧

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156. 我在做一个核内定位的蛋白，预测等电点是10，60KD。做过好久的亲和纯化，有N端his-tag，C端his-tag, 还有N端GST-tag的，纯化时的问题都一样：包涵体表达为主，上清含量很少。用低离子强度的PBS破菌的化，上清中含量会多一些，但是蛋白不挂亲和柱。洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分，用透析，PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀。上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏水柱也不挂，也试过阴、阳离子柱，还是不挂柱。因为蛋白活性未

知，所以我不倾向于做包涵体纯化，但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白，都没能拿到比较纯

的包涵体，而且在包涵体中his－tag耦连的该蛋白也不挂柱，很迷惑，在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧？

既然是包涵体本身应该有一定的纯度，不挂柱，那你用的是哪家的产品呢，此外怎么操作呢，你能说详细

点吗，有的时候也许结合力比较弱，所以要选择镍密度高的填料，延长作用时间，提高pH值，降低流速，一般天然结构不挂的时候有，但是变性不挂很难理解，此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱，原因挺

多的，所以需要你说详细点。

我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA agrose，应该不是镍柱质量问题，用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想，至于是不是有其他物质干扰我也不能确定，但是我试过这么多载体和tag，效果都一样，就觉得是蛋白本身性质的问题了

据说在靠近等电点附近的ph条件下，8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的，不知是不是有这个情况，但是据预测的数据来看，好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的

至于操作呢，亲和纯化我们用的都是agrose，在离心管里agrose与菌体上清4度或者室温结合2hr～过夜不等，结合条件应该是很充分的了，很迷惑

另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话，用哪种型号的分子筛来做HPLC合适呢？

做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我建议你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.

如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.

157. 我用离子层析得到人总IgG，含有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4，然后用亲和层析获得各个亚类，它们的分子量分别为：146，146，170，146，分子量差别很小，用常规的SDS-PAGE+考马斯亮兰很难鉴定它们的纯度，请问用何方法来鉴定它们的各自纯度。

哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.

158. 请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗？或用1M醋酸钠 pH3.0？还有它们的上样浓度一般在什么范围内？有没有什么要求？

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应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在>20mg/ml左右,太高我没有上过.

159. 我现在想用蛋白来亲和纯化我的抗体蛋白SDS-PAGE就有一条带，但western效果很差所以我想进一步纯化一下蛋白，来亲和纯化抗体

现在我想电洗脱来纯化一下蛋白

但对用考染后的蛋白是不是可以用于亲和柱来纯化抗体呢

具体应注意什么问题呢

变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道位置后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.

160. 请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his tag 融合蛋白,杂带忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.

我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非特异吸附.

161. 你好版主！我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析？另外separose4FF分离2万左右分子量的蛋白效果会如何？如果改成 6FF应该怎样换介质？

8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能保证硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性分子,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用.

162. 请问chromatography 师兄, 纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?

低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用离,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.

163. 偶纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白，超声裂菌后40％硫酸铵沉淀，然后DEAE SepharoseFF纯化下来纯度85%左右，有3条杂带，分别为130KD+、～55KD、～45KD，目标蛋白分子量为74KD，偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化，可是偶的这个蛋白比较奇怪2M NaCl才能挂柱，（用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了），可是挂上之后0M NaCl也洗不下来，而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来，是不是偶的疏水做的有问题呀？还有一个问题就

是国产的柱子和仪器哪家的比较好？我现在用的柱子没有接头，对拉梯度会不会有很大影响？

其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,应该和你操作没有关系.国产的机器和柱子上海就有,上海沪西的就不错,柱子一般用锦华的.如果你的柱子没有死体积就没有关系.后面的操作没有问题,一点坑没有关系

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我之所以不先用疏水是因为疏水的分离效果很差，下来后还有好多杂蛋白，不如DEAE效果好，我现在用DEAE纯度可以达到85%，但是下一步不知道选什么介质好了，疏水不是很理想，我刚才用2M NaCl上样，用500mM NaCl到0M NaCl 50%乙二醇的梯度洗脱，结果都洗不下来像样的峰，是一个扁扁的A280最高值才7，偶用的柱子是1X17cm,流速0.9ml/min，洗脱体积>10CV.还有不知道Butyl、OCtyl和phenyl差别大不大，如果换他们两个会不会有不同效果？还有偶的蛋白是个多聚体，凝胶过滤好像没甚么戏。不知道您

还有什么推荐的介质供选择吗？偶的蛋白不怕变性。

是吗,那会不会你的蛋白再盐情况下容易沉淀,所以没有没有得到象样的峰呢,如果是这样你可以降低浓度,调pH看看,我怀疑是沉淀到柱子上,或者你用盐酸胍洗看看,通过调pH可以改变溶解度,此外可以用凝胶过滤做试试,或者尝试燃料亲和或金属螯合试试,也可以用羟基磷灰石做试试

164. chromatography :您好，我想请教一个问题，我要把标记碘的900KB的蛋白与游离碘分开，用凝胶层析法，应该用多长的柱子及多大型号的凝胶呢？

游离的碘是溶解状态的吗，这个我不清楚，如果是小分子的，那可以透析或者sephadex G-25柱子就可以，你试试吧，不知道你处理多少体积，一般上样量是柱子体积的1/5或1/4

游离的碘是溶解状态，我用过sephadex G-200，分离效果很差，昨天刚用过sephadex G-25，效果也不好，第一个峰下降的不快，并且两个峰之间的值仍然很大，远远大于本底值，我用的柱床体积是18立方厘米，每次上样量只有100微升。您看我哪个地方需要改进？谢谢！

你上样可以上到3-4毫升试试,上样太少扩散厉害,如果你做了还不行,那你可以透析试试吧.

165. chromatography,你好。我现在遇到一个非常头痛的事情，最近用分子筛SephadexG100来分离虾的总蛋白的时候可以把大分子和小分子蛋白分开，可是条件不变，换了蟹的材料就不行了，而且

提高盐的浓度或PH值都没有使分离效果得到改善。请帮忙分析一下。分离条件如下：柱体积为80ml，流速为0.1ml/min，上样方式手工上样，缓冲液：0.05M磷酸缓冲液，PH=6.4。分离图谱和SDS电泳结果见附件。请问如果换一种孔径的分子筛是否能够使蟹总蛋白分离效果改善？如果是应该换大的还是小孔径的？您还有其他好的建议吗？谢谢了！

要把大蛋白和小蛋白分开,那你干脆选择范围更小点的填料,例如G-50也许更好点,此外对凝胶过滤改变pH和盐对分离效果没有什么影响.你的流速也太慢了,可以提高到0.5ml/min左右.抱歉忽略了,以为已经回复过了呢.

166. 还有一个问题想问一下。纯化的酶最终要冻干成制剂，静脉注射。可是内毒素很难合格，好不容易成功过几次，现在又不行了。而且我用的TRITON X－114萃取分离不适合放大。该酶理论等电点8.4。ph稳定范围7－11。肯定不能用阳离子柱了。内毒素合格标准每mg小于25EU。请问可以用什么方法，或者什么填料？哪可以提供少量填料小试一下（我们公司只有看到可行才会买大量

柱料）？

据我所知，内毒素的控制可以采取一下措施：

1 首先所用的容器必须经过干烤，180摄氏度4小时以上，使粘附在容器上的内毒素分解。2 配制缓冲液的盐类必须保持不被内毒素污染。所用蒸馏水应该新鲜配制，所用试剂也最好新鲜配制，因为缓冲液在常温下很容易孳生细菌，而是溶液产生大量的内毒素。

3 配制好的液体用0.22微米的滤器虑过。这样处理的话，有师兄将内毒素控制在了0.5EU/mg蛋白，符合FDA 的规定。不妨一试。

你的酶是不是有同工酶,这酶有什么特点,需要辅酶吗,不知道有没有试过疏水,此外也可以用染料亲和的方法,不知道有没有可能用亲和的办法.

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萃取的方法回收率要低,而且如果临床那也得对你的的TRITON残留也是个问题,不好去干净.我们有专门去除内毒素的填料,可以给你点小样,你可以PM你的邮件给我,我把我们的材料发给你.我们是用亲和的方法,特异去除内毒素,收率高.你可以试试.

167. 我在纯化一个天然蛋白，纯化出来后没有抗原活性，请教原因。流程是这样：提取－－－－conA柱－－－－－DEAE柱（梯度洗脱）－－－－ －总蛋白 －－－未结合部分 －－－一个蛋白

－与抗体 －－反应 －－－－反应－－－－－－－ 不反应很是苦恼，最近才发现这个宝地，请不吝赐教。

会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.

首先谢谢你的答复。第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白，然后在上的交换柱，文献上基本上都这样，而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白。不过我将试试直接上离子柱的效果。

电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外，几乎没有什么蛋白出来。离子交换柱不就是这种性质吗？我一直

这样认为，蛋白挂在柱上，经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白，没用的蛋白就洗不下来。不知对不对。

conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢.

168. 在层析过程中，我只是少量蛋白纯化，并且基本上是在4度 层析柜中进行的，没有脱气，结果装柱装了几次，还是有一些气泡（开始在室温中装的，装好后放到层析柜中），由于样品已经处理

好，最后一次有一些气泡我也没 办法，我只能上样，结果在再平衡过程中出现很多峰，花了几个小时，还是没平衡，时不时又出现一个峰，真的很郁闷，这时我再看柱中的气泡时，几乎气泡都

消失 了，原来气泡一般都在柱壁上，是不是气泡跑到柱中间填料里去了？出现这么多峰，其它的问题都不存在，是不是气泡的缘故？如果装柱过程中有气泡，层析过程中 会出现哪些情况？谢谢！

造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差, 这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡, 你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你 说的问题说明的确是有气泡，气泡不是进入填料中间，而是出去了，或者变更小了，一直出到检测池中，所以一直有小峰上去又很快下来，装柱子装好后再放到层析 柜中也不会有气泡的，主要还是有温差造成的，如果柱子中有气泡有两种情况，一是气泡一直不断，有气泡也赶不走，二是可以把气泡赶走，但是

越多越难赶，因此 最好是没有气泡，否则柱子分离效果也不好。

你说的情况似乎跟我的不一样，我装柱的时候，液体都放在层析柜里，并且恒流泵也放在层析柜中，柱中

都是刚从层析柜中拿出来的,还有，我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来，慢慢上去，下得也很慢，持续的时间相当长，不知为什么？很急，做得很烦，是不是填料有问题？

气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.

169. 我这几天作DEAE sephadex 50离子交换，上样前检测有蛋白，但是洗脱梯度0.1mol/L到1mol/L。但是检测没有任何蛋白（280nm），实用的缓冲液tirs－Hcl 8.0

样品是碱性蛋白酶。不知道什么原因？谢谢！！

那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来.

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170. 我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的，洗脱条件都已经摸索好，最近我觉得我们CM填料有问题，我们还有SP填料，我想请问一下，如果我用SP填料的话，用CM填料的洗脱条件是否适用？能否得到相同的结果？

还有一个小问题：

使用分子筛时，每一种填料都有一个分级范围，我想请问一下，洗脱体积跟洗下来的蛋白的分子量之间的

具体关系是怎样的？就是说，比如Sephadex G-25 的分级范围在1000～5000，多少柱床体积，分子量1000的蛋白分子就出来了？一般洗几个柱床体积就可以了？谢谢！1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.

171. 我原核表达了一种Ｈis蛋白，买了博采公司的非变性条件下提取His Tag蛋白质的Ni＋填料，按照它的说明书在层析是用的Buffer含有Tris,Nacl,甘油和不同浓度的咪唑，洗脱液就含有甘油。我对洗脱液进行了冷冻干燥，可是甘油除不了，不知该怎么办？请指点！

直接透析就可以，你把你的邮件pM给我，我可以把我们的材料发给你做参考，其实不需要用甘油就可以，此外金属螯合最好别选择Tris缓冲液。我不知道博采公司是哪里的，好用吗，什么价格呢。

172. 我最近纯化一个蛋白，发现CM填料装的柱用7～8个柱床的平衡缓冲液都无法平衡，并且用7～8个柱床的的氢氧化钠也也洗不出一条直线来，总是有峰出来，不知是怎么回事？请高手指点，希望

能指出造成这种现象尽可能多的原因。谢谢！

是不是太脏了，多洗几个柱床体积，或者看有没有气泡，峰型是直上直下的吗，如果是这样那就是气泡。

这次绝对没有气泡，峰型也不是直上直下的，慢慢升起来后又慢慢降下去，也不知道是不是紫外检测仪不

稳定？

也许是不稳定或者检测池脏了。你直接不过柱子走有没有这样的问题

173. 我用amersham的Ni亲和柱变性条件下纯化E Coli表达的蛋白。菌体破碎后，用8M Urea溶解。样品10000g，10min，0.22v过滤，但进样过程中，柱子压力升高仍很快。很快就达到了压力上限，不得不停止进样。

我想降低一点尿素的浓度，使得压力降一些，但是提取时8M Urea比6M提取的更好。考虑，样品中用8M Urea，Binding &elution buffer中使用4M Urea, 会不会有一些蛋白（或杂蛋白）由此在柱中沉淀呢？用1N NaOH CIP理论上应该可以把蛋白降解，柱子是否能通过CIP完全恢复原状呢？另外，进样过程中压力升高，除了有蛋白，还有什么物质容易堵在柱子里呢？如何在进柱前除去呢？谢谢

另外，我用Superdex200 10/300预装柱分析Ni柱收集的目的蛋白（样品中含500mM IMI,8M Urea, 500mMNaCl,10% Glycerol,pH8.0），分子筛的buffer也用同样的buffer，可是，最后在19ml开始，出现好几个大峰，跑SDS-PAGE也没有蛋白band。不知道为什么我的buffer和样品buffer一样还会出现可能是溶剂峰？Another question:蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？

30% ACN是不是能让蛋白复性呢？

1, 在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同,至少相当,你的问题就在于平衡用的4M, 而样品用的是8M, 这样混合, 蛋白就会沉淀, 所以柱压高,没有办法纯化,解决这个问题的方法是AKTA可以倒洗,你用6M盐酸胍或者8M脲含有400mM咪唑反方向冲柱子,这样就可以使沉淀溶解, 同时咪唑可以把挂的蛋白洗下来,这样柱子就好了, 用1N NaOH 变性蛋白也不能溶解, 根本没有用.你洗后再用水洗,再做CIP这样还可以好些.否则不用变性剂使蛋白溶解, CIP根本没用,还是堵柱子.此外还有注意的是你的样品很粘加上有甘油,黏度很大,所以相应压力也高,所以不用甘油也可以.

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2,你的意思是说你的缓冲液中也有500mMIMI吗,我怀疑那几个峰不是蛋白,会不会是咪唑呢.此外也许有你的目标蛋白,但是浓度低,你得透析浓缩才能电泳看到,或者你用银染的方法看看.我怀疑你前面纯化也许没有你的目标蛋白,所以做这一步没有蛋白或者很少.Another question:蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？

30% ACN是不是能让蛋白复性呢？

一般是不能,除非这个蛋白是亲脂性的,而且稳定性很好.而我看的文献30% ACN只会使蛋白变性,不会复性的,除非你的蛋白是亲脂性,水中不溶解,而溶解在有机溶剂中,这就不是复性的问题,,是溶解性的问题.

1,我现在做的镍柱样品和buffer是一样的，都是8M Urea，降低尿素浓度只是一个想法，还没开始实施。2，我的SEC中的peak1, peak2浓缩跑过电泳，都是我的目的蛋白。我的蛋白疏水性强，较容易聚集，所以才加的甘油。前面纯化应该纯化出来了。

3，SEC最后的peak4, 5用银染做过，没有蛋白条带，浓缩用BCA测过蛋白浓度基本没有。所以应该不是蛋白。这样就很怪了，我的SEC buffer中也有500mM Imidazole阿，基线走平了才进的样，为什么最后还会出峰呢？

4，乙腈的问题是由于有做蛋白结构的文献说我的目的蛋白在三氟乙醇或30% ACN中用CD测，三维结构是对的；也没有聚集体。当然，他们的蛋白是固相合成的。我在做蛋白复性，希望找到一个条件使得我的蛋

白不聚集，且有三维结构，所以想试一下。

5，你说的CIP方法很有启发，多谢了。我用Urea,Gua-HCl,NaOH洗镍柱，柱的颜色都不如水洗时白，是不是变性剂和碱会使胶的状态发生变化呢？

1.抱歉，因为问题太多，所以没有看清楚。2，即使是这样，那样品黏度大，而且有甘油，你得把流速降低，蛋白的浓度也不能高。3。如果是有你的蛋白，那后面的也许是一些色素或别的有吸收的物质，不是蛋白也没有关系。4。如果是这样，那你可以试试用这样的液体看能不能复性。5，碱不能长时间洗镍柱子，那样镍也许会被还原的，何况单独在碱性条件下并不能溶解变性沉淀的蛋白。

174. 我在最近不断的条件摸索下纯化到了我的目的蛋白，其中洗脱液是改用含0.1%SDS的系统，这样才能洗出蛋白（还原型谷胱苷肽就不行），但这样得到的蛋白还需要怎么样处理呢？

如果是这样，那我很长见识：），不知道你随后要做什么，所以很难知道要怎么处理。

其实还有一个问题随后出现，就是我之前用的是直接与sepharose 4B混合的纯化方法，就用0.1SDS洗脱可以，但是用预装柱就变成是是elution buffer（含还原型谷胱苷肽)才能洗脱，前者琼脂糖有一些过期而已，其他步骤基本一致，样品也是一样处理的，用SKL溶解包涵体，用TX100增加Binding，不知道为什么结果有差。

我之后的目的是功能检测，检测蛋白对癌细胞的促凋亡作用。

还有一点想问一下，上海生化所的低分子量Marker的每条蛋白带大约是多少蛋白量呀（20ul*20的），因为我不想做蛋白定量先，想先估计一下。

那也许你填料和样品混合时间较长, 所以吸附比较牢固, 因此用elution buffer洗不下来,而要用0.1SDS洗脱,而过柱子相对吸附较弱, 所以elution buffer可以, 或者是你的这两种填料不一样造成的, 至于Marker我就不清楚了,你最好问卖东西的人,他们也许知道.

175. 我一般洗镍柱都是用EDTA把镍脱去再洗，洗完再加镍，很麻烦。用Gua-HCl,EtOH洗柱可以不脱镍么？

别客气。用Gua-HCl, EtOH洗柱可以不脱镍,放心吧

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176. 这里还要麻烦Chromatography兄一次，我作草鱼胰蛋白酶的提纯，用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱提纯。

现在我碰到亲和柱洗脱液的问题。草鱼胰蛋白酶性质和哺乳动物的不同，哺乳动物的是碱性蛋白酶，而草

鱼胰蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性区域不稳定，国外资料和我作的预实验都证明了这一点。经典的哺乳动

物胰蛋白酶的提纯方法用pH2.5的酸性洗脱液洗脱，而这种方法对我的草鱼胰蛋白酶的提纯不适用。国外资料有苯甲脒琼脂糖凝胶提纯鱼胰蛋白酶的，用120mM苯甲脒在中性区域洗脱。我的卵类粘蛋白合成的SEPHAROSE-4B亲和柱能用120mM苯甲脒洗脱吗？

苯甲脒琼脂糖凝胶可以用苯甲脒洗脱，但是我不知道能不能用在你的柱子上，因为按道理蛋白和这两个填

料的作用位点和方式也许不一样，因此我觉得不一定能用，除非它们作用方式是一样的，最实际的就是试

试就知道。

此外我觉得既然文献用的是苯甲脒琼脂糖凝胶，那你也可以用这个填料，其实我们公司就有这个填料。此

外你也可以换个配基例如胰蛋白酶抑制剂做配基，不过一般都是用降低pH的洗脱，所以实在没有办法你还是得用苯甲脒琼脂糖凝胶。

177. 我用的介质是CM52（羧甲基纤维素的），柱子的直径是7CM，介质在上样过程中经常出现裂纹，请问这是为什么？这个问题怎么解决？

我怀疑是填料压得太紧,样品和平衡缓冲液是一样的吗,温度是一样的吗,我怀疑样品上柱子有气泡才会有裂纹,否则是不该有的.你要保证样品和平衡缓冲液温度一样,别直接从冰箱里拿出来就上样.

178. 我想问一下DEAE FF柱缓冲液能不能用硼砂-硼酸缓冲液阴离子柱一般都用TRIS-HCL，或者有用磷酸缓冲液 但是前者对我的酶活有影响，后者PH值不够高，所以决定换BAFFER，不知道选择BAFFER的时候有什么依据

应该没有问题，其实缓冲液不过是调pH的，低浓度对离子交换影响没有象一些书上说的那样说不能用某个缓冲体系。所以我觉得大多都比较随意，常用的都是可以的。

179. 真佩服搂主的豪言壮语，你果真能“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“吗？我不太相信，国内好多前辈和专家都不敢这么夸口，我做了6年的蛋白纯化和填料合成工作，我觉得这个领域要做好，做精并不是一件轻松的事情.

“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“是我对填料合成的理解,那就是填料合成和做汤差不多，就是熬，而纯化就象把杂蛋白象灰尘一样吹去才得到目标蛋白，我不觉得做填料和做纯化很容易。专家和前辈现在亲自

做实验的不多，而做产业的更少，我也做了11年的纯化和填料，包括小分子的HPLC和生物大分子的中低压色谱，既然你是同行，有问题以后向你请教，精是要静下心来做的。我觉得做产品最难。

180. 我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？

我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达请问，5KD 左右得蛋白，不用tricine－sdspage用普通得sds－page跑胶行吗？

181. chromatography兄: 请教一个问题目的蛋白分子量大概在9万左右，想除去分子量8万以下的杂质，而且希望除的尽可能干净，但是我看了millipore的资料，如果选择3万截留分子量的膜，还有不少3－8万的杂质，不知道选择8万截留分子量的膜能不能最大可能的去除8万以下的杂质？最适当的膜应该是哪种？

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选择5万截留分子量的膜是否能保证5万以下的分子都能除干净（95％以上吧）？其实目的蛋白只要损失不超过三分之一我都可以接受，但是一定要去除3万到5万之间的那些小分子，不然会影响我的检测。请专家赐教！谢谢！

我超滤用得不多，好象没有这么能截留80KD以上的膜，如果你的样品不多，直接过凝胶过滤柱子就可以，你选择排阻范围上限为80KD的填料，例如sephadex G-75范围在3000-80000，这样在外水体积出来的正适合你需要大于80000的样品，快，简单，而且不需要复杂设备。如果用superdex 75 范围在3000-70000,效果也许更好，

182. 1,现在除了各种离心管样的超滤装置,有没有更快更大量的超滤设备? g_kdu@stu.edu.cn2,如果样品体积相对于上样量太大您比较常用的浓缩方法是什么?我有透析袋,PEG ,大容量冷冻干燥设备和50ml的脱盐柱,很小的超滤管可供选择.3,我依次用离子柱,疏水柱,亲和柱纯化我的蛋白.过了离子柱之后,我发现不挂柱的部分和梯度洗脱下来的某一部分都能检测到活性(我提纯天然酶),这可不可以说明他们是不同蛋白? 我把在离子柱上梯度洗脱下来的那一部分再经过疏水柱之后上亲和柱(染料,red),用2M的盐洗,发现在小于1M和接近2M的地方有两个活性峰,这能不能说明这又是不同的蛋白?最终SDS-PAGE发现这"两个"条带分子量相差一点点,但是按照文献上应该只有一个活性很强的蛋白,我却得到这样活性很弱的"两个"蛋白,真是越做越糊涂了.

超滤设备当然有大的，你可以和密理博或者颇尔公司联系，他们会给你详细回答的，我做纯化大多用疏水

和亲和多，所以不怎么浓缩，小量可以用透析袋，大量的可以用超滤，如果要做成粉末长期保存那就冷冻

干燥。

不挂的部分不一定是另一种酶，因为柱子不可能是100%挂 住，何况超载时穿透也会有活性，还是用电泳检测看是不是在同一个位置都有。洗脱做电泳差一点很难说，因为电泳的带不一定对得很齐，你把两个样

品混在一起 跑，这样看是不是一条带，如果是很可能还是一个东西，活性的强弱得看你操作本身有没有降低活性的可能，如果是这样，那说明在纯化过程中有活性损失，染料亲 和有洗脱需要特异洗脱，例如用辅酶洗脱的，你看你的操作和文献是不是一样，此外提取有没有问题，还有是不是浓度太低所以活性低。

183. 请问新买的NI填料是不是已经螯和好镍的？NI填料的再生过程具体怎么样呢？我要做的His融合蛋白是细胞表达后提取出来的，上样体系是否要和柱子平衡体系一样呢？因为没有检测器，请问大概要用多大浓度的咪唑来洗脱？

我们公司的镍琼脂糖凝胶是已经螯合好镍了，不知道你用的是哪家公司的，一般如果是蓝绿色的，那是螯

合好镍了，如果是白色的，那就没有，再生很难在这里说清楚，你PM你的邮件地址给我，我把我们的材料发给你，很详细，包括操作也是，样品最好是pH和盐浓度同平衡缓冲液一样，一般你买的填料都有说明书，就有怎么操作的，我可以把我们的操作发一份给你做参考。不同蛋白洗脱都不一样，你看我们的说明

书就比较清楚了。

184. 准备纯化一多肽串联体，分子量17000左右，，准备先用G-25除盐，在分别过sp-sephroseFF,DEAE-sephrose FF,串联体裂解成单体后，由于单体分子量4000左右，PI和原来差不多，所以想重复串联体一样在进行纯化。

我没做过纯化，以上想法是否行得通，请兄台指教，

若学长有更好的想法请尽管不吝赐教。G-25除盐速度快吗？操作条件：平衡，洗脱液，柱的大小，都望指教

如果你的样品等电点是4.3，那用DEAE-sephrose FF比较合适，而sp-sephrose FF很难挂住，当然如果pH在2左右也许能挂柱，但是不知道在这样条件下你的蛋白稳定性如何。得到串联体后用什么方法裂解，这个说清楚才能说选择怎么样的柱子，简单重复不一定能得到好的效果，除盐很快，一般上样的多少取决

你柱子的大小，也就是说你处理的样品体积，一般除盐可以上样到填料体积的25%左右，洗脱就用你不含盐的缓冲液，也就是平衡DEAE-sephrose FF最好。除盐柱子一般离子交换平衡缓冲液洗冲柱子3个柱床体积就可以，柱子不需要装很高，短粗柱子就可以除盐了，你没有告诉你要做多少样品，抱歉没有办法给你说

要多大的柱子。

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多谢指点，sp sephrose-ff 我是打算用来出去带+电蛋白的，所以这步我是否可以、只收集过柱液，而不要去洗脱了，我用溴化氰裂解的，你的意思是否我可以只用DEAE SEPHROSE-FF就可除盐了，不用再用G-15之类的，我是用来进行50L罐后的纯化的，小肽分子量如上，很小，选柱要以此为依据，但我对柱的参数不懂，请指教

别客气,其实我觉得sp sephrose-ff 也可以，看你怎么配合了，DEAE SEPHROSE-FF不能除盐，但是如果你选择挥发性的盐，那也许不需要过凝胶柱子就可以，此外如果是4000的多肽，只能选择sephadex G-10除盐，不知道效果好不好，G-25不行，因此如果量很大的话，还是用挥发性的盐吧。仅用离子交换不好的话，你可以考虑反相，但是量大成本比较高，因此你也可以试试疏水

185. 主要是纯化小肽，能教我选选柱子吗，thank you抱歉，不知道你要纯化多肽分子量在什么范围，做多大的规模，这些不清楚很难说选择什么填料和柱子。

纯化小肽最好用反相色谱，它的分辨率是色谱方法中最高的，C18或C8柱都可以，如果你的小肽中芳香氨基酸的含量较高，也可以考虑苯基的反相柱，小肽经过反相后通常结构能够得到恢复，如胰岛素。仅供参

考。

186. 前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？？

另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。

chromatography wrote:

你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀

或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。

chromatography,您好.为什么"丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了"呢?谢谢!

我觉得因为是水溶性的色素，在乙醇和高盐中能溶解，而蛋白沉淀，这样可以去掉一些色素，其实色素是

小分子，也可以超滤透析过凝胶过滤都可以去掉一部分，结合起来也许能去得更干净点。

187. 作完外源基因表达后想纯化上清中6kd糖蛋白，看了一点文献也不确定如何选择柱子，正着急。你看先过分子筛再过疏水或离子柱行吗？ 关键是想您给一些关于各类柱子型号、特点以及装柱操作的链接或书（希望能全点），帮我扫一下盲。可以吗？

另外上清中的色素用分子筛可以和目的蛋白分开吗？

糖蛋白有专门的亲和柱子,例如凝集素的柱子,你的蛋白上是什么类的糖就可以用专门的凝集素亲和柱子去做,当然也可以用硼酸琼脂糖凝胶去纯化糖蛋白,我们公司就有这样的填料,当然你也可以选择离子交换和疏水试试,具体的方案得看你现在手头有什么条件,我觉得如果是离子交换和凝胶最好先过离子住,再过凝胶柱子,如果是疏水,那可以用硫酸铵沉淀配合疏水,不知道你的上清目标蛋白浓度大不大,太具体的那就很难三言两语说得清楚,何况你没有提供蛋白的等电点,所以很难说选择这么离子柱,也没有上清电泳图,所以不知道选择什么凝胶的填料,不知道什么糖,很难知道用什么凝集素的柱子,硼酸琼脂糖凝胶倒适合各种糖蛋白,而且成本也低,也许值得考虑.色素一般比蛋白分子量小很多,凝胶柱子应该能分开.

188. 我想用反相Source分离蛋白，说明书上说可以耐受6M Gua-HCl，我的蛋白溶于8M Urea中，不知道Urea会不会对source填料造成影响？Urea会不会影响蛋白的binding呢？色谱园上有一个实例用SOURCE分离包含体蛋白，不过进样时样品是在盐酸胍中的，没见到用尿素的阿。

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还有，反相的A液为TFA in water，在这种条件下，是不是应该先做一下我的蛋白的溶解性试验呢？随着洗脱时ACN的增加，蛋白会不会沉淀出来呢？这样，柱子很容易会被堵掉的。我试过不加TFA的ACN溶解我的蛋白，30%以下的ACN无法溶解，我的蛋白疏水性较强，非变性buffer中溶解性很小，那么加入TFA就可以保证蛋白百分之百溶解么？

能用6M Gua-HCl那耐受8M Urea完全没有问题，这个填料很稳定，脲也不会影响binding的，我觉得还是用Gua-HCl好一些，，因为它溶解包涵体的能力更强。一般的蛋白在TFA in water这样条件下都能溶解，但是我不知道包涵体蛋白可以不可以，你参考文献做吧。通常HPLC做蛋白和多肽在洗脱时ACN增加不会使蛋白沉淀，如果不加TFA不溶解是很正常的，因为没有它一般的蛋白都难溶解在ACN水溶液中，加入的话应该可以增加你蛋白的溶解度。100%的溶解那也得看你蛋白浓度和本身的特性。

189. 我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？

190. 我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？

我怀疑你的蛋白也许在苯基柱子上没有洗下来，你可以用20%乙二醇水洗看看有没有东西，和柱子大小关系不大，你纯化什么酶呢

我纯化的是真菌发酵液里的葡聚糖酶，量很小，即使硫酸铵浓缩后酶活也没有显著提高，电泳凝胶用考染

只有几条很淡的条带，所以一直在用银染．过阴离子柱时我用的是ＰＨ７.０的Ｔris－ＨＣl平衡柱子和１Ｍ的ＮaＣl洗脱，在１０－１５％时目标蛋白就被洗了下来．您认为我有没有必要改变ＰＨ再过阴离子柱．疏水层析对蛋白的稀释大吗？有没有可能我的蛋白本身就太少所以被稀释的找不见了．用20%乙二醇水洗是上样后直接用20%乙二醇洗脱还是低盐洗脱后再用20%乙二醇洗，20%乙二醇会影响酶活吗？是乙醇还是乙二醇？

离子交换如果挂住，洗脱下来比较快，那你可以改变pH试试，提高pH到8-9看看，这样是不是结合更牢，此外如果你的蛋白是葡聚糖酶，那你直接用sephadex G-25这样的柱子也许能做亲和填料，挂住你的蛋白，可以试试，因为它的底物是葡聚糖，而sephadex是交联的葡聚糖，测定上柱前的酶活，上样完后看总的酶活有没有降低，如果是，那可能被吸附，然后改变pH或者盐看有没有东西下来。疏水不会稀释你的蛋白，如果被挂住它和亲和一样有富集的作用，用20%乙二醇水洗只在洗脱的时候用，别的缓冲液都没有，此外疏水和时候配合硫酸铵沉淀，如果你沉淀没有，那也许浓度太低，沉淀不下来。

191. 1、颗粒性（蛋白聚合体）能利用柱层析吗？2、能比较一下柱层析与离心在纯化过程中对目标蛋白生物活性的影响吗？3、柱层析能进行活病毒的纯化吗？

聚合体如果小于病毒颗粒那完全没有问题，你可以用琼脂糖凝胶6BFF或者脂糖凝胶4BFF，一般的层析都不会使蛋白失活离心也不会，离心很难做得很纯，如果差别很大也许好些，如果要得到纯的样品，不过柱子

很难做到。

层析做病毒完全没有问题，我用我们公司的离子交换和琼脂糖凝胶6BFF做过病毒的纯化，很好用，而且纯度很高，很清晰的三条带，滴度也很高。

192. 目前我们需要大量提纯小鼠血清中IgG，我做过了预实验：辛酸－硫酸铵粗提后，再以阴离子交换树脂（DEAE sephadex A-50)进行层析，看帖子说此法提纯IgG效果较理想，但我做后，跑SDS-PAGE电泳，仍有不少带，且得到的量非常少。现将大致过程写出，请您指点其中不足之处，帮我分析一下原因，由于初接触蛋白方面，知之甚少，望不吝赐教，谢谢！

1 5ml血清先以辛酸（33ul/ml)PH4.5 沉淀出杂蛋白，取上清2 PH7.4下加0.277g/ml的硫酸铵，使终浓度达45％，静止1h以上，取沉淀，沉淀溶于2ml PH8.0 PB缓冲液中（不含NaCL）对同液透析过夜。

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3 透析液2ml直接上PH8.0 PB缓冲液平衡好的 2.6×15cm 的DEAE sephadex A-50柱，并以同缓冲液洗脱（据说IgG不挂在柱上，直接流出，而其它杂蛋白挂到柱上），以紫外分光光度计测A280吸收值，测值结果发现，几乎没有高值出现，约收集了120ml洗脱液，选了几管有值的跑电泳，带子相当微弱，不知蛋白跑哪里去了？

后来不采用过柱方法，直接将2ml透析样品与1ml sephadex A-50胶直接混合，4度过夜，离心取上清，但电泳后仍有许多带。

另外，有说以亲和层析方法提纯鼠IgG，纯度较高。我们头儿让我找溴化氰活化琼脂糖凝胶后偶联的方法提IgG，我没在网上找到相关内容，这里看到您又提到用环氧丙烷活化琼脂糖凝胶，此法更好，如果您方便能发一些溴化氰和环氧丙烷活化琼脂糖凝胶的具体方法以及接下来的偶联和纯化相关资料到我邮箱

吗？hailanliu37@126.com 非常感谢您！

抗体这样纯化的方法我没有做过,你可以参考下面的帖子,我也有相关的材料,其实硫酸铵沉淀后直接过苯基柱子就效果很好,直接过亲和也可以,你这个方法文献虽然说,但看来不一定好用,我怀疑还是操作的条件.http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1160718&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1160718

你需要偶联什么东西来纯化抗体呢,是你的抗原吗,我把材料发给你吧,其实纯化抗体方法不少,看你的需要了.

193. 硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，应该用多大浓度的硫酸铵平衡柱子啊看你蛋白情况了,一般也就2M左右吧.挂不住就提高浓度,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要根据实验决定.我一般就用苯基琼脂糖凝胶,一般纯化IgG用0.7M硫酸铵就可以挂住.

你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同至少相当。我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，那我是不是要先确定复溶后样品的盐浓度再确定平衡缓

冲液的盐浓度啊，如果是我怎么检测样品的盐浓度啊

其实差不多就可以,也不一定特别严格,例如疏水盐浓度你的样品的盐高于平衡的也可以,但是别相差太多,尤其不能样品的盐浓度小于平衡缓冲液,这样也许挂不住,或者会产生沉淀.而缓冲液和盐浓度不同混合也许会产生沉淀,所以要小心,而一样的缓冲液体系和盐浓度可以避免这样的问题.硫酸铵沉淀后的样品,如果是上清按盐浓度稀释到你缓冲液盐浓度就可以,如果是沉淀,直接用缓冲液去溶解,沉淀里的盐可以忽略.最好的办法你可以用电导的方法去检测,只要样品的电导和你的平衡缓冲液一样就可以了.

194. 我在用镍柱亲和纯化后，蛋白已经比较纯了，仅在银染时能看见微弱的杂带（目的蛋白约25KD，杂蛋白约40KD)。但我还想试试能不能完全去除杂带。此前试过分子筛没效果，所以想试试离子交换。想请教一下，在变性条件下可以做离子交换吗？和复性后再做比起来哪个效果好呢？非常感

谢！！

浓度太低一些杂带是很难出现的,所以这样的纯度很难说,我觉得得浓度高到25mg/ml左右,这样做电泳才能看得清楚些到底纯不纯.如果你是变性条件下做凝胶过滤没有意义,因为这时候蛋白是链状分子或者是不蜷曲的,不是球型,所以在这样的柱子中没有办法使他们分离,你最好的方法是优化你的亲和纯化条件,也可以在纯化前做好预处理,如果是包涵体,可以用分级沉淀的方法来初纯,亲和柱子的缓冲液中加点土温或者用pH洗脱和咪唑洗脱的方法配合,同时用阶段洗脱的方法,一般都能做得很好,用试剂盒的方法或者线性洗脱的方法有时候很难得到好的效果,你也许可以参考我们的方法,你留下邮箱我给你发一份做参考吧.我觉得离子交换也不一定好,在脲这样的变性剂下可以做离子交换,但是效果也不一定好,我觉得还是优化亲和条件更有意义.此外浓度太低很难纯化.

195. 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗？如几十毫升。

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如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清IgG，先要偶联其相应配基如抗体或蛋白A是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？

几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法.

196. 谢谢色谱兄，能告诉我分级沉淀的具体操作步骤和缓冲液中添加吐温的浓度吗？

分级沉淀包涵体其实很简单,用6M盐酸胍溶解包涵体,然后用缓冲液稀释到5M,然后混匀离心,上清继续稀释到4M,如此类推,一直到1M,这样把每次的沉淀和上清跑电泳,就可以知道在哪个浓度下包涵体中目标蛋白是最纯,而且收率是最高的,这样得到的包涵体蛋白比普通的洗涕方法要干净而且纯净,再纯化就好多了.加吐温很简单只要在平衡和洗脱的缓冲液中加0.5%吐温可以降低非特异吸附,使洗脱的蛋白更纯,其他的操作和一般没有什么差别,材料我已经发了,请查收.

197. 兄，请教一下如何测柱效呀！谢谢先

一般柱效是常用1%的柱床体积的丙酮过柱子,柱效=柱高/理论塔板数,而每米理论塔板数=5.54/(Ve/W1/2)2,其中Ve是保留体积,W1/2=半峰宽,一般很少测定这个值.

我的是1毫升的预装柱，因为上样环最小100微升，所以就上了100微升的丙酮，然后用蒸馏水冲洗，没有峰出来，后来我用2毫升的NACL冲洗了5个柱体积，还是 没有 峰出来，然后我想里面可能没有物质了，就用蒸馏水想冲平，结果出现了3个峰都搞不懂是些什么物质。

丙酮测柱效的时候 洗脱液不是用蒸馏水1的吗？

1ml的预装柱根本不需要测定柱效的，如果不是凝胶过滤也许需要，如果是亲和和疏水等没有这个必要，你不出峰我觉得是检测波长不对，因为丙酮在280估计吸收非常弱，你得换个波长，洗脱水就可以。后面出的应该是杂质。

198. chromatography兄：您好！因为我对色谱一窍不通，所以有一些基本的问题想请教于您。我现在正准备用HPLC分离提纯一种细菌的外毒素，它是一种碱性丝氨酸蛋白，分子量大约是33KDa，按照文献的方法，是先用硫酸铵分级沉淀后再上疏水柱（HIC, phenyl sepharose high performance,Pharmacia)，然后再用凝胶过滤柱（(with Superose 6 HR10/30, Pharmacia)，我查了一下，这两种柱子好像都是预装柱。我想问你的是，什么情况需要发放大？是多大的量？我只是想分离出来

做单抗和测序以及做免疫保护性，那么需不需要放大？

另外：这样的两根预装柱加起来差不多要花4000美元，代价太昂贵了，那么有没有便宜的柱子且纯化效果也不错的？

最后一个问题：如果我想让公司代为纯化，您觉得可行吗？如果可行，请问你知不知道哪里有这样的公

司？

你好，其实你这个纯化不一定需要专门的预装柱，当然你要用也可以，我们公司就有苯基琼脂糖凝胶柱子

和填料，你要做多大都可以，至于凝胶过滤Superose 6是比较贵的，何况是预装柱，你可以用sephadexG-50应该也可以，这样组合会比较便宜，公司做纯化一般是比较贵的，你做多少量呢，一般钱给少了公司觉得不合适，多了，你觉得贵，纯化这样的蛋白估计也上万元，而且看你难度不同收费也不一样，我觉得

你还得自己做。你做的量估计不需要多大，100mg足够用了吧。这样不需要多大的柱子就可以。

199. 蛋白在合成中形成了醋酸盐，请问如何分离纯化和检测？谢谢！

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不很明白,电泳不能检测吗,也可以用HPLC的凝胶柱子去检测,纯化和成盐关系不大,只要调pH应该就成游离的蛋白了.不知道你的杂质都有哪些,很难说用什么方法.

200. 我的蛋白等电点预测是6.5，应该选阴离子柱，但是目的蛋白和一些杂蛋白都穿过。但用阳离子CM柱后却能挂柱，经洗脱后纯度很好。请问这该如何解释？

这个很正常,你的这个蛋白用阴柱或者阳柱都可以,因为它的等电点在中性,所以都可以用,至于穿过也许pH不够高,或者吸附力弱,再不就是预测有偏差.

201. 在做HPLC之前要求将样品过滤，但是我的样品过滤以后就没有活性了，有可能样品与超滤膜结合了（但活性丢失的真正原因我不能确定）。现在想问色谱兄，怎样进行该蛋白质的进一步纯化！

样品过滤不该用超滤的膜,用普通的0.22um的膜就可以了,没有活性那蛋白也没有了吧,我怀疑是超滤膜把蛋白截留了,这样样品当然没有活性了

202. 色谱兄你好！我买了WHATMAN的纤维素DE52阴离子层析柱，我想问一下，上样洗脱后，层析柱最后应洗脱到什么程度，是不是要基线 跑平了才行？这样后下次使用，用不用再生？怎样再生，用碱还是用酸？多大浓度？DE52规定使用的pH范围是2－9.5。怎样贮存好？

应该洗到基线.用完最好用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用水洗,保存可以保存在20%的乙醇中也可以,其实你应该按照说明书的去做,我好久没有用过这个填料了.其实用DEAE琼脂糖凝胶不是更好吗,这个填料有点老.

203. 我准备用Gravity－flow柱纯化蛋白，但没有独立的UV检测仪和收集器。能否在FPLC系统上直接运行，而不用启动泵？如可以要如何设置？或者有没有其他方法？

不知道你用的是AKTA prime还是AKTA explorer, 有不少型号的，我觉得不好接，因为这些系统的管道很难靠重力可以流动液体，如果是AKTA prime也许好改点，你可以问他们的工程师吧

204. 谢谢chromatography，因为醋酸分子量很小，用电泳或凝胶柱效果可能不好，现在主要是如何检测纯化后样品中的醋酸残留，因为没有对照品，测蛋白含量就不行了。能不能用醋酸对照，用离

子色谱测醋酸含量呢？没做过离子色谱，不知道用什么检测器合适，请chromatography朋友指点。

你说的是检测醋酸呀,我以为你是要把醋酸和蛋白分开呢,如果是检测,如果是这样,你可以把你的样品加点盐酸,这样变成酸性环境那你的醋酸应该可以游离出来,毕竟蛋白会和盐酸成盐,或者用硫酸也可以,然后你用气相色谱的氢焰检测器就可以检测,而且很灵敏,这样应该就好了

谢谢，醋酸盐可以用GC测定，但若形成的是其它盐如硫酸盐或磷酸盐该如何测呢？如果是这些酸我可不知道怎么检测了, 这得看无机化学怎么分析这些酸了. 其实你的蛋白在碱性条件下就不会成盐了,没有这么复杂吧.

205. 请教chromatography：最近我想做关于蛋白纯化方面的实验，因为是新手，所以想请教几个问题，谢谢！

我的蛋白是70～80KD左右的，HIS标签，怎样确定是以可溶形式还是包涵体形式表达呢？若是包涵体是先让其溶解、复性再进行纯化，还是先纯化再进行溶解复性呢？我想用Ni+琼脂糖凝胶进行亲和纯化，应选用什么型号的填料呢？实验过程应注意些什么呢？

破碎你的菌后, 有上清也有沉淀, 分别跑电泳, 如果上清有目标蛋白, 沉淀没有那说明是可溶的, 如果沉淀也有, 说明两个都有, 但是看哪个更浓, 如果沉淀更多, 那应该是包涵体.

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据说蛋白越纯越好复性, 所以我觉得应该先纯化再复性, 至于填料我们一直用我们公司的产品, 和进口没有什么差别, 我把我们的材料发给你一份, 里面很全面, 希望有所帮助.

206. 我今天本打算试试你所说的分级沉淀法初纯包涵体，但仔细想想还是有点疑问，需要再请教你一下。

1、具体的操作步骤是不是应该用含8M尿素的buffer来超声破碎菌液沉淀，然后把上清用不含尿素的buffer来稀释呢？2、稀释时是将上清分为几份分别稀释后离心，还是要先稀释到7M,离心，再把上清稀释为6M,依此类推呢？3、比如说我稀释到3M时沉淀里的目的蛋白最纯，那我下面是应该选择含3M尿素的buffer洗涤包涵体，再用含8M尿素的buffer溶解沉淀；还是应该直接用含3M尿素的buffer溶解包涵体，离心后取上清用于下一步的纯化呢？

总之，我不太理解这样做的原理，还望不吝赐教，多谢！！！

1,一般都是破碎后再用变性剂溶解包涵体, 不是先加的. 溶解后的上清再分级沉淀.2.是后面的那么操作,不是分几份.3.应该是得到的沉淀用8M溶解后再纯化,3M不溶解怎么纯化呢.

不好意思，再问一下，那我是不是应该先用一小部分包涵体试一下，如果发现3M最纯就直接稀释到3M. 还是摸好条件后还要分级沉淀至3M呢？另外，上清稀释后就可以直接离心吗？还是需要静置一段时间再离心呢？

先试试,摸好了就直接稀释到那个浓度就可以了,一般最好静置一两个小时

每一步都要静置吗？那岂不是要很长时间？

207. Hitrap的脱盐柱如何使用？我的样品是否需要浓缩后到1.5ml的体积再上脱盐柱，然后接样品即为脱盐后的样品。

我不知道你的除盐柱是多大的柱子,一般除盐可以做到20-30%的柱床体积,你根据你的柱子可以算出你能除盐的体积,你的预装柱都有说明书教怎么用,很简单,用平衡缓冲液冲柱子3个床体积,然后上样,再用缓冲液冲,收集蛋白峰得到的就是不含盐的样品.

208. 1.我用酵母表达系统做肠三叶因子表达，如果用融合蛋白（c－myc）有利于纯化，但不知如何去除融合蛋白？2.如果不用融合蛋白，又不知如何纯化？

据说这样的融合蛋白不需要酶切,改变温度或pH就可以自动切去,除去还用原来的亲和柱就可以,你也许可以带his标签,这样不大影响你的蛋白的结构和活性,如果不是融合蛋白,那得看你蛋白特性,用疏水,离子交换等常规方法去纯化.

209. 请问chromatography老师，蛋白质糖基化修饰后其纯化时的条件与修饰前会有什么样的改变？我用毕赤酵母表达的蛋白可能被糖基化了，而组织中该蛋白是非糖基化的，用组织中的提取条件怎

么也不能将我表达的蛋白提纯，应怎么考虑，怎么办？

210. 纯化糖蛋白可以用凝集素亲和或者硼酸亲和柱子去纯化,一般的蛋白不会被挂住.

211. 我纯化的原核蛋白以可溶形式存在，但活性没有（含三对二硫键）。我看到一篇文章，发现蛋白经还原和烷基化处理后，活性出现。不知那位高手告知原因为何以及还原和烷基化的方法？

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我怀疑是二硫键错配,所以没有活性,当还原后再烷基化,这样不会再形成二硫键,也许这样导致蛋白有活性,还原的方法很简单, 加巯基乙醇或者DTT, 搅拌, 就可以还原, 烷基化,应该是巯基的修饰剂,常用的有DTNB,PDS,PMB(参考<酶工程>中的酶修饰章节)

212. 关于蛋白质分离提纯方面,蛋白质的测定除了凯式定氮外,还有那些比较新而且权威的方法,（BCA法过时了吗）?分离纯化时疏水层析,凝胶过滤,离子交换等方法梯度洗脱时,洗脱液浓度是怎样变化的?

我可不是什么前辈,我们一般用BCA比较多, 没有觉得过时, 好象很多人都用这个方法.洗脱离子交换盐浓度由低到高,可以用梯度混合仪或者机器自己带的混合系统实现,当然也可以用阶段洗脱的方法,这样不需要专门设备,重现性好,很容易放大.疏水和离子交换刚好相反,开始是高盐,洗脱是逐渐降低盐浓度,洗脱方式也可以用线性或者阶段洗脱.

213. 我发酵液中的目的蛋白含量少，所以想在等电点进行硫酸铵沉淀，请教仁兄：是不是用酸碱把我的发酵液ＰＨ调到目的蛋白等电点，再进行硫酸铵沉淀就可以了？能用强酸强碱吗，有什么注意

事项吗？

如果你的目标蛋白含量太低不大适合用硫酸铵沉淀,当然你要调到等电点附近去沉淀也许能行,得试试才知道,不知道这样蛋白是不是有活性,你只有试试才知道,你电泳要不浓缩看不见目标蛋白的话,用这样的方法怕很难有好的结果.你也可以把pH调到等电点用冷的丙酮沉淀试试.最好用弱酸,醋酸等非用强酸也要用浓度低的溶液.注意事项应该在搅拌情况下缓慢滴加,避免局部浓度过高,此外沉淀对蛋白浓度是有要求的,太低不适合.

表达的蛋白如果有亲和标签的话,不需要浓缩可以直接上柱,柱子本身就可以浓缩富集你的目标蛋白,如果没有标签,用离子交换或者疏水都可以浓缩你的样品而且可以初步纯化.

214. 我想请教一下，我现在提取植物中的一种酶，含量可能很低（GUS酶），我直接用提取液来提取，然后经过80％硫酸铵纯化，结果感觉特别粘稠。

是否多糖未除干净，有何简便的高招啊？

另外，跑聚丙烯酰胺凝胶电泳时发现跑的极其难看，很歪，而且是一开始浓缩胶的时候就跑的歪歪扭扭

的。（看溴酚蓝指示）

最后染色是可以将所提取酶染成蓝色的一种染色剂，结果发现没有条带！真晕啊！

我是第一次做蛋白相关的东西，请指教！

（GUS酶）是这个β-葡糖醛酸苷酶吗, 我怀疑没有提取好或者浓度太低所以电泳没有跑出来, 至于电泳开始就歪, 怀疑是你的样品溶解不好, 有沉淀或者盐干扰, 电泳最好先除盐, 此外浓度太低不能用硫酸铵沉淀, 我怀疑也许浓度低, 你要的也许还在沉淀上清里.多糖按理过离子交换柱子, 植物中的样品做得不多, 你多看看文献吧.

215. 你好,我现在用的QAE A-25出现死吸附,不能再生,看看有什么好的方法,我用过的再生方法是2N的NaOH，0.3N的酸、碱，还洗不下来就又用了0.5N的丙酮溶液(50%),还是不行,请教一下您还有什么高招吗?

那就用盐酸胍或者脲洗看看,也许变性沉淀了, 用通常的方法也许洗不下来. 也可以加点蛋白酶试试.

216. 分子量700的化合物应该选择G-10 或G-15 ,如果是离子型的或用离子型交换剂可以除去杂质的话就用QAE 或DEAE, 不过工业生产建议用G,因为QAE或DEAE体积受酸碱及离子强度变化太大.

小分子物质最好别用凝胶过滤去分离,估计没有什么效果,除非是和很大分子的分离还可以,带电荷那就选离子交换,也可以选择反相

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217. 您好，我有一个非常头疼的问题请教：现在在装一根XK1.6cmx100cm长的superdex prep grad75柱，系统使用的是AKTApurify100，用装柱器一次性装入胶体，柱效测得8850N/m，低于10000N/m的要求，但是由于流速1ml/min时压力逐渐升高我将在线滤器卸下，压力降低后再测柱效为何变成了5500N/m？还想问问您装柱头时是否不能压得过紧？技术支持说这样会导致峰前倾，我在最大流速3ml/min冲了1小时后将柱头压下6mm，测得的对称因子是1.75，低于0.3-1.3的要求，请问是否是因为我压胶过紧？

还想问问您装这种极细长的凝胶柱除了将胶一次性倒入外到底还有哪些因素影响柱效？问了技术支持说没

别的就得一遍遍装，逮到哪次算哪次，真是这样吗？柱子太大流速太慢，从装好到测完柱效要2、3天，所以急盼您的指点，非常感谢！

我觉得测定柱效是其中的一个方面,最重要的是跑个样品试试看,我觉得你装柱子的一个问题是在一次倒入填料后应该用最大流速去过柱子,等压力平稳后,你把柱子的转换头接上压紧,这样再用低于你最大流速的来操作,压力不会升高,柱床也不会变化,其实对于压紧的柱子也不一定需要重装, 你可以反冲, 这样压力一般就会平稳, 别太迷信柱效测定, 因为还是有误差的,如果装完的柱子柱子前后效率差这么多,那这个填料就不好用,但是填料本身应该没有问题,所以说不应该太相信这个东西, 我一般装完柱子根本不测柱效, 一样用,此外我觉得纯化也别过分依赖凝胶过滤, 装柱子时间长, 而费时间也长, 上样量也少, 其实成本很高,效率却不一定高. 能用别的方法就别用这个方法.如果峰型不对称,那你要柱子中填料的面一定要平,这样才能保证你的峰型好.

218. 我的蛋白酶分子量可能在300KD以上，可以用可以用Sephadex G-25 Fine去除其中的盐份吗？

应该没有问题,蛋白不会沉淀或者过不了柱子的,它可以从填料的缝隙中过去,别担心,一样能用,如果不放心,那也可以用G50,你先试试就知道了.

219. 我正在做蛋白活性的分析，需用空载体PET28B-HIS 蛋白 作为空对照，但是它太小了怎样才能得到呢?

抱歉,我不是做上游的,我觉得你可以随便找一个带his标签蛋白,它肯定没有你目标蛋白的活性,这样做对照就可以了.

220. 现有一个困扰我多时的问题向您请教。我们的蛋白以包涵体形式在E.coli中表达，利用SP-sepharose FF纯化时，在梯度10%-100%都有目的蛋白被洗脱。请问您是否遇到过这种情况，据您考虑这是什么原因。非常感谢。

这个我没有做过，我觉得变性条件下蛋白特性和普通不一样也许造成这样的结果，你可以参考包涵体清

洗，那样就可以得到比较纯的蛋白，我觉得在变性条件下，非亲和的方法很难做好纯化．

221. 神经细胞膜N－甲基－D－天冬氨酸受体蛋白纯化的技术路线及关键点的指导，有功能活性，量少就可以，105KD的复合蛋白，用抗体结合柱子是否需要抗体量很大？

洗耳恭听！

抗体肯定需要很多的，一般每ml偶联抗体应该在１０－２０mg，那需要２０－３０mg抗体，抗体也不便宜，你这样不如直接把N－甲基－D－天冬氨酸或者天冬氨酸偶联到填料上做成亲和填料，然后用这两物质竞争洗脱也许更好一点．你可以试试，如果天冬氨酸可以那就更简单，我们公司可以帮你合成，或者提供

活化好的介质自己偶联．

222. 我现在用glutathione sepharose 4B纯化原核表达的GST融合蛋白(可溶性的），目的蛋白大小47KD,pI=9.9, 但是纯化后在融合蛋白（73KD）下面60KD左右 处有一条含量较多的带，并且在50KD左右,40KD左右,26KD处都有很清晰的带，我裂解细菌时加了PMSF，纯化过程是照说明做

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的，PBS洗的次数超过说明书的用量，还有一次加了1%的Tritonx-100,用还原型谷胱甘肽洗脱的pH=8.0 ,总共做了三次，但每次结果都一样，目的蛋白只占1/8左右，我的要求也不是很高，最起码也要60%就可了，但为什么那么多杂带呢？很郁闷，请搂主帮帮我，谢谢！

怀疑是降解或者表达后自己降解或者破碎时候条件剧烈而断裂，所以有好几条带，你可以用GST抗体做WB试试，你也而已用不同浓度原型谷胱甘肽洗脱看能不能得到更好的结果．您说的降解的问题我也考虑过，但是我超声的时候加了PMSF,是不是还需要加别的东西，表达后降解如何避免呢？我用GST 以及目的蛋白做了WB,但我的这两个抗体都是多抗，做出来都有带，特异性不是很好。 您说的不同浓度原型谷胱甘肽洗脱，我可以试试。您还有什么建议，请不吝赐教，非常感谢。

别客气,超声如果时间过长或者强度比较大,那也可以使蛋白断裂,杂带增加,所以你可以试试缩短点时间,这种断裂加PMF也没有用.此外由于GST纯化用的填料本身也是有离子交换作用的,因此在缓冲液中适当加0.5MNaCl可以降低非特异吸附,使杂带减少.

我还有一点不明白，您说的（缓冲液中适当加0.5M NaCl），其中缓冲也是指用来平衡柱子的缓冲液吗？还是指超声时的缓冲液？还是洗脱时的缓冲液，对不起，我没有很好的理解您的意思。再次让您费心了。谢

谢！

抱歉是我没有说清楚.是平衡缓冲液,洗脱可以不加

我已经照您以上的意见作了，但结果还是一样，请问我该怎么办啊？求求您帮帮我！

那也许本身你表达出来已经降解或者象他们说的非完全表达,那这样是上游的问题,所以最好是能确定问题出在哪里.实在不行没有办法从上游解决,亲和一步也解决不了.你只好用离子交换,凝胶过滤或者疏水做进一步纯化.

223. 我的物质也是个小分子,分子量800左右的一个修饰过的肽.用凝胶过滤除不去带色杂质,用QAE或DEAE就去除的很好,可是带色的杂质在柱子上就洗不下来了.

那可以用低浓度酸碱去洗，应该可以洗下来，如果还洗不下来用５０－７０％的乙醇试试．

224. 请问亲和层析样品上柱之后目的蛋白洗脱不下来怎么办？我按照文献上面的方法，用pH4.0，1MNaCL的醋酸缓冲液洗脱，杂蛋白可以洗下来，但是目的酶跑电泳检测和酶活检测都没有，并且平衡缓冲液冲出的杂蛋白也没有目的酶。所以我怀疑是吸附在柱子上没洗掉，又用含10％DMSO的洗脱液洗，还是没有。请帮忙指点一下该怎么办？

用更高浓度的盐,更低pH试试,此外也可以用一点变性剂如1-2M脲试试,加DMSO要小心变性蛋白沉淀

225. 我是一个新手,刚开始做RP-HPLC纯化蛋白.我想请教一下1.进样峰大是什么原因呢?尽管进样前已用约10-15倍柱体积的5%bufferA(0.1%TFA)去平衡柱子了.2.用vydac c4的柱子纯化lysozyme标准品(SIGMA),上样量为100ug时总有多个峰,改为30ug时就只剩下一个峰;但将浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰.这是为什么呢?谢谢!

我没有做过几次HPLC分析蛋白,进样峰大也许还是样品本身的问题,你可以直接用缓冲液或者水试试,看看是不是也这样.后面的问题我不明白浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰是什么意思,是洗脱梯度吧,我想如果是这样,那也许是上样浓度过高,而你的洗脱有机溶剂浓度高溶解不好吧,仅供参考

226. 请教chromatography大哥, 我欲纯化精浆蛋白(前列腺特异抗原),前面的同仁最初试过从精液中提取纯化,但据说跑出来的带分子量不对,请问这是怎麽回事?谢谢!

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我不知道在哪里看过这个蛋白的纯化,好象是用亲和的方法,分子量不对差多少,仅靠分子量是不行的,最好有活性测定的方法.

227. 请教chromatography兄，我欲纯化一个分子量16K的蛋白，pI5.5-6.0,为什么很多文献中提到的纯化方法是用阳离子柱，缓冲液pH7.0,那样的话，蛋白不就带负电荷了吗？还有，我用酵母表达该蛋白，试用Q柱纯化时，色素大部分结合到柱上，不知道该怎么办？

用阳柱是不是主要去杂质的，色素不和你蛋白下来没有关系，最后可以用00.5MNaOH+2MNaCl洗看能不能洗掉。

228. 还有个问题就是我做的工作是将鼠抗体人源化,肯定要用到大量抗原来筛库,前面人纯化的精浆蛋白是不够的,有人告诉我将剩下的精浆蛋白在原核中表达,会比从前列腺组织块中提取快,而且量也多,但有人说这样复杂,时间也长,我不知究竟该如何?请赐教!

我觉得如果在前列腺组织块含量高就不需要表达，如果不高那就表达，但是我觉得最简单的方法还是提

取，毕竟表达也天然的蛋白有时候是不一样的，何况也不是所有的表达都好做，所以我觉得能提取还是提

取的好。

229. 请教chromatography兄，我是一个新手，欲纯化一个嗜盐性的酶，该酶至少需1M的Nacl才能有活性，请问我该如何设计纯化方案？

那只好用疏水了，我记得当初中科院微生物所的我的校友用的就是我们的苯基琼脂糖凝胶，硫酸铵沉淀，

过疏水．

230. 我的（101kd）在上清中我已把它纯化，但有条杂带（30kd），请问我如何去掉杂带？如果用DEAE-52层析柱，我容蛋白的buffer(50mMNaH2po4 100mMNacl 250mMimidalole)，Nacl浓度是不是太高了，如何处理？

我要做分子筛，针对线粒体蛋白，能给我一些建议吗？贵公司能否提供？ 谢谢。

最好优化你的纯化条件，没有必要再去做别的纯化，实在没有办法再做，否则浪费时间不说就怕效果也不

一定好，何况凝胶过滤处理量很小，不知道你用的什么方法纯化的，线粒体蛋白分子量有多大，杂质有多

大．线粒体蛋白有什么特性．

231. 我有一个GST融合蛋白，分子量大概60KD，经亲和层析纯化后，SDS电泳检测，有3条 主要的蛋白带（也有其他的杂蛋白带），最浓的是我得目的蛋白，但是另外两条带的浓度也很大，这两条

带的大小加起来差不多是目的蛋白的大小。试了两次都这 样。我想请问这到底怎么回事？是目的蛋白降解的还是其他的杂蛋白？如果是降解的，如何确定？为什么亲和纯化效果会这么差那？

我是蛋白领域的生手，正在为这个问题困扰不安，正好发现了chromatography 的帖子，请多指教！我已经在这个问题上折腾了很长时间了，所以很着急，能不能帮我想想办法？谢谢！

怀疑是降解，你查查以前的帖子，你用GST抗体WB做看看有几条，如果还是三条那是降解，如果不是，那就没有，在纯化的平衡缓冲液中加0.5M盐，看能不能去掉杂带，此外可以用不同浓度的GSH洗脱试试，破碎的时候超声别太强，时间别太长。也可以加点酶抑制剂试试

232. 我使用的蛋白纯化系统使AKTApurify100，刚刚在用superloop进样时不小心把进样方式设成了system pump进样，结果成了A2泵进样，而由于这台机器长期没有人使用了，A2吸头所在的溶液中长菌，管路中有气泡，进样后导致系统压力增加一倍，请问是否是菌体堵塞柱头所至，另外

如柱子里有气泡的话有什么可见的表现形式？是否压力上下跳动不稳？我用的是自己填装

的SUPERDEX75，柱子使XK1.6x100cm，压力现在在0.13-0.15兆帕间不停跳动（原来是0.6兆

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帕），这正常否？另外，我现在的流动相是PBS，是否可以直接换成20%乙醇将柱子反过来冲？盼指点，谢谢

我觉得如果你的A2输液管由于堵塞，才会造成你说的这样压力不稳定，如果真的是进空气或者堵了，那你的柱子后面应该没有液体流出来，所以关键是先把A2输液管的头清洗，然后用20%乙醇作为溶液，再用排气用的注射器抽掉空气，然后再清洗泵，这样就可以，柱子里面应该没有空气，所以和柱子无关。我推断

你A2管道中有空气，根本进不了液体，所以应该没有关系，按我说的去处理，应该就可以。

谢谢你的回复，但我只是进样方式设置成了A2泵进样，进样完成后还是A1泵恒流速泵入流动相，而A1泵的吸头和整个管路都是干净的，这时压力仍然是0.15MPa，而且今天早上已经上升到了0.17MPa（装完柱子测柱效时是0.06MPa），这是否意味着柱头有堵塞但未完全堵死？

最好清洗一下A泵，这样也许好点，此外你最好用A2输液管清洗，压力其实是有波动的，没有关系。当然为避免有东西进柱子，你也可以倒冲一下柱子，压力也随液体的黏度不同而变化，所以有时候压力不高也不

一定说明堵，例如水的黏度要大于20%的乙醇，你装柱用的是20%乙醇，自然压力小，而用缓冲液压力要比装柱高也是正常的，只要不是一直往上升高就没有问题。

装柱后一直是用水平衡的，压力在0.08MPa，准备进样时换用PBS，因有少量盐导致压力降低到0.06MPa，可自从A2进样后压力就是0.14MPa左右的样子了，我已经将柱子反冲。

那就好，只要压力恒定，一般没有什么问题。

233. 1.我买了25mg RNase A，要求在4摄氏度下贮存，我想取出10mg，当拿出冰箱时，会有水汽马上附着于瓶上及药品上，药品都被吸潮了。有同学建议我等放置到室温下再取用。我该怎样取用？

我怎样称量？药品在小瓶里看起来太少了，怎样取出来，那瓶是带盖的小瓶吗？

2.我用RNase A 偶联Sepherose 6B，要求在4摄氏度下搅拌20小时，很难实现，有没有好办法？在冰箱里放不进去搅拌器。我想用冰块冷却，然后放在水平的那种摇床行吗？

3.提取过程也要求在4摄氏度下进行，用冰一直冷却缓冲液行吗？

4.资料上要求用Sepherose 4B，老板说以前买了Sepherose 6B，不让买Sepherose 4B，我要纯化的蛋白大约是50k，这可行吗？有什么影响，偶联的条件需要调整吗？

5.给我详细介绍一下偶联的注意事项好吗？

6.我用WHATMAN的DE52做预纯化，每次用完以后用含 2M NaCl 的tris缓冲液冲平后在进行下次使用可以吗？我的意思是每次使用后用不用NaOH和HCl再生？是不是上次用完后冲平就可以下次使用，当使用不同的缓冲液时才可以？我每次都用的都是相同的缓冲液。

1. 放到室温是不错的做法，但是10mg太少了，很难做1ml的填料吧。取的话用一个硬纸条对折，用这样代替药勺应该可以，要不就找掏耳朵用的小勺：）。

2. 实在不行室温也可以，但是要pH别太高。是溴化氰活化吗。3. 提取那可以在冰浴可以。4. 6B也没有问题，差不多。5. 偶联只要注意你偶联物质的稳定性，保证偶联的物质有活性就可以。6. 用完最好用NaOH再生完，再水冲，保存在你的保存液体中，这样可以保证下次性能相同，如果不洗怕有吸附蛋白影响填料的载量

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234. 我是一位新成员，也是搞蛋白分离纯化与复性的。我干了一年多，感觉很难，没想到您做起来是这么的轻松，很是佩服。我是在读硕士，想要考博士，还想继续这方面的研究，您能给我推荐一

些这方面的导师和学校吗？还有，这个专业的前景如何，还想要请您指点一下。

其实复性是比较难,我做得不多,纯化也许我的运气要好点,而且关键是我们的填料很多,要什么都有,所以好办,此外我们也可以自己合成,所以不存在填料的限制.柱子也各种都有,导师我觉得你可以考虑中科院过程所生物工程国家重点实验室苏志国教授,我在那里工作过,觉得环境还不错,别的地方我也不熟悉,我觉得纯化还是有前途的.只能提供这些消息.

235. 我用携基因的真核载体转染293T细胞，然后收集上清夜，收集蛋白，我的蛋白是糖蛋白，请问一下，怎么浓缩提纯我要得蛋白，前提是保持蛋白的活性，我看了好多书，怎么也不懂，向您请教

一下。麻烦您详细回答一下。

浓缩可以直接过离子交换或者亲和,这样不需要浓缩样品,如果你的糖蛋白是葡萄糖残基,那也可以用刀豆球蛋白A琼脂糖亲和柱子去纯化.

236. chromatography兄根据您的经验疏水层析时，样品的盐浓度一般应为多少，25％饱和度的硫铵够不够，我也知道和纯化的目的蛋白有关，一般情况下是多大的浓度？谢谢啦！

25%也许低一些,通常为保险起见差不多要50%,不同蛋白是不一样的,你先高浓度挂上再说.

237. 我做的是从霉菌的发酵液中提取分子量小于是10KD的蛋白质.最好是能在1~2KD之间,我想请教楼主怎样做合适.我的邮件地址是zhouxianjiou@163.com.谢谢!

这样小的多肽最好是用反相色谱去制备,这是最快的方法,如果没有条件,那就先超滤,然后再进一步纯化,方法可以用离子交换,反相,疏水.

238. 本人也做过多年纯化，但是很惭愧，经验还是少得很。我目前正在作产品研究，正像你说的那样，确实也是难度很大，我目前最大的问题也是一个酸性蛋白的去热源问题，对你的除热源柱非

常感兴趣，请把这方面的资料包括价格给我一份吧。还有，我希望能有34um的敖和介质，不知你们能不能做，PHARMACIA的是太贵了。还有GLUTATHIONE 亲和介质。当然，我使用的介质很多，其他你们有的介质资料也发给我吧。

你别客气,我其实也是和大家交流,共同提高而已, 酸性蛋白去热源和核酸去热源是一样的,都是酸性的物质,所以想用阴离子交换的方法去是很难的, 我们用我们去内毒素的填料解决了我们核酸去内毒素的问题, 现在有几家药厂用我们的填料, 也解决了困惑他们的热源问题. 至于34um的敖和介质效果和90um的没有什么差别, 没有必要, 我用过200um的都一样用, 亲和的填料对颗粒要求不高, 如果不是用线性洗脱而改用阶段洗脱效果一样很好,这样根本不用考虑可颗粒大小,我把我们的材料发给你一份,希望有所帮助.

239. 请问怎么进行SP Sephadex C-25装柱前的预处理，谢谢！

不需要特别处理,其实只要是新的填料直接平衡就可以用.说明书上应该都有.

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