249403737...
68
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------*------- LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012
Transcript of 249403737...
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------*-------
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU HỆ NẤM
CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA,
TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
MỞ ĐẦU
Sự cộng sinh giữa nấm và rễ cây trồng đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào
năm 1885 do A.B.Fank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức. Nhƣng phải
đến năm 80 của thế kỷ 20 mới đƣợc tập trung nghiên cứu và ứng dụng trong
sản xuất.
Nấm rễ cộng sinh là hiện tƣợng rất phổ biến trong tự nhiên, có khoảng
60 – 80% các loài thực vật trên thế giới có mối quan hệ cộng sinh với nấm nội
cộng sinh. Đây là mối quan hệ cộng sinh không thể tách rời: Nấm không có rễ
thì không thể tồn tại, cây không có nấm cây sinh trƣởng yếu vàng và chết
[11]. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh vai trò của nấm cộng sinh
mang lại những lợi ích to lớn, thiết thực đối với quá trình sinh trƣởng và phát
triển của cây trong điều kiện bất lợi của môi trƣờng, bởi vậy chỉ trong điều
kiện đất đai khô hạn, nghèo dinh dƣỡng thì nấm rễ mới phát huy tốt vai trò
cộng sinh của mình. Chính vì vậy, hình thức cộng sinh này đã và đang đƣợc
nghiên cứu (về phân loại, sinh học phân tử, ảnh hƣởng của chúng đối với thực
vật...) và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông – lâm nghiệp ở nhiều nƣớc
trên thế giới.
Ở Viêt Nam, diện tích đất trồng trên cạn là rất lớn (3 317 270 ha), chủ
yếu là các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, trong phát triển sản
xuất thƣờng gặp khó khăn về vấn đề nƣớc tƣới, đất chua và dinh dƣỡng . Vì
vậy, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phát triển nâm cộng sinh Mycorrhiza
cho một số cây trồng chính tại các vùng sinh thái phục vụ sản xuất Nông –
Lâm nghiệp bền vững ở nƣớc ta nhằm nâng cao năng suất cây trồng, duy trì
và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là vấn đề cấp bách cần đƣợc quan
tâm hiện nay. Cho đên nay, một số nhà khoa học của Viện Lâm nghiệp, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Thổ nhƣỡng nông hóa… cũng đã công bố những
nghiên cứu cơ bản về nấm rễ cộng sinh. Kết quả của những nghiên cứu này
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3
mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, lƣu giữ bào tử nấm cộng sinh và nghiên cứu
xƣ ly đât ô nhiêm chi co sƣ dung nâm Mycorrhiza. Tuy nhiên vẫn chƣa có
nghiên cứu về khả năng cộng sinh của nấm cộng sinh trên cây cam nhăm tao
ra chê phâm lam tăng năng suât va chât lƣơng.
Trong các loại cây ăn quả, Cam Vinh là một loại cây ăn quả đặc sản
truyền thống có giá trị dinh dƣỡng cao, đồng thời cũng rất có giá trị về kinh
tế. Tuy nhiên, diện tích trồng cam ở đây đang dần bị thu hẹp và chất lƣợng
của cam đang ngày càng bị mai một. Với mong muốn có thể góp phần nào đó
vào việc cải thiện năng suất, chất lƣợng cam, nhóm nghiên cứu tiến hành
nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR
MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN‟‟. Với mục tiêu
và nội dung nghiên cứu sau:
Mục tiêu nghiên cứu :
Nghiên cứu hệ nấm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) trên
đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Phủ Qùy – Nghệ An. Trên cơ sở đó, góp phần
đề xuất các giải pháp về phân bón, canh tác nhằm làm tăng năng suất, chất
lƣợng chè, ổn định độ phì nhiêu, cải thiện môi trƣờng đất vùng trồng cam.
Nội dung nghiên cứu:
Xác định thành phần loài AMF tại vùng nghiên cứu.
Xác định đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam tại Phủ Qùy –
Nghệ An.
Xác định loài AMF trong đất trồng cam bằng kỹ thuật sinh học phân
tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA
FUNGI (AMF)
Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank – nhà bệnh cây lâm
nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ
cây và nấm ngoại cộng sinh [53]. Sƣ công sinh cua Mycorrhiza vơi rê đƣơc
mô ta nhƣ (hình 1.1). Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm)
và Rhiza (rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng
sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và
Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với
dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và
Orchidaceae. Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa
[33]. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi
của hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng
bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là
“Vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi
(chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A).
Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc
hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19]. Bên cạnh đó, một số bài
báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A
rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23]. Những
nghiên cƣu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhƣng
không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V. Do vậy, loại hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza”. Nói chung,
tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất.
Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại
Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi”
(AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc
công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc
thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza”
vào năm 2008 [28].
Hình 1.1. Sƣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng.
1.2. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA
Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại
của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1.1.
5
Bảng 1.1. Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF
Tên chi Tên loài Hình dạng Mầu sắc
Kích
thước
(µm)
Đặc điểm
Glomus
Aggregatum Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có
mầu vàng nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng, có 2 lớp.
Ambisporum Hình cầu hoặc hình trứng Mầu nâu, nâu đậm 100-150 Thành bào tử mỏng.
Marcaropus Hình cầu hoặc hình trứng Nâu hoặc mầu vàng nhạt 100-125 Thành bào tử mỏng, có quả bào tử.
Acaulospora
Appendicul
a Hình cầu Có mầu vàng nhạt 150-175 Thành bào tử dày, 1-6 µm.
Delicate có quả bào tử, hình cầu Có mầu nâu, nâu đậm 100-175 Thành bào tử dày.
Dilatata Hình cầu, có quả bào tử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,có nhiều lớp.
Myriocarpa, Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần
hình cầu. Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn.
Bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp.
Lacunose.
Hình cầu Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng,1-2 lớp
Entrophora
colombiana
Hình cầu hoặc hình trứng Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng nhạt 120-200
Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2
nhóm
schenckii.
Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng 150-200 Thành dày chia bào tử thành 3 lớp.
Sclerocystis
Coccogena
Bào tử có dạng hình cầu, gần hình
cầu, elip Có mầu nâu nhạt 100-150 Thành bào tử mỏng có 2 lớp.
Coremioides Bào tử có hình cầu, Có mầu nâu, nâu đậm 120-180 Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2
nhóm.
Glomites Rhyniensis Hình cầu hoặc hình elip Có mầu nâu đậm 150-200 Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên
tiếp, gồm nhiều lớp.
Gigaspora
Candida, Bào tử thƣờng có hình cầu và gần
hình cầu, một số có hình elip Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ 120–160
Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2
nhóm
Albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp,
gồm 3 – 5 lớp.
6
Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ
ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.
* Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm
hình thành mạng lƣới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày
đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nâm r ễ
ngoại cộng sinh thƣờng có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận
thấy bằng mắt thƣờng).
* Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trƣng là không có sự
biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và
không có mạng lƣới Hartig. Nấm rê nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rê nội
cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng
ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ
có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular).
* Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trƣng
của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng nhƣ sinh lý.
Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh:
* Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm).
* Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh.
* Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan
(Orchidaceae).
* Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ
Quyên (Ericales).
* Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh.
* Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh
nhƣng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous
của họ Đỗ Quyên (Ericaceae).
* Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ
Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales).
Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ
và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài
cây gỗ có cả ECM và AMF [32].
7
Hình 1.2. Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF
(http://www.ffp.csiro.au/research/mycorrhiza [62])
8
1.3. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF
Thông thƣờng, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1.1). Một trong những cơ sở quan trọng
để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton. Phƣơng pháp ADN và
giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và
Tinker đề xuất 1997 [51].
Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ
thống phân loại của Morton và Benny đƣa ra vào năm 1990 và đƣợc hoàn
chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39].
Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc
hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em
Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ
Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc
điểm chung. Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp
nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.
Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học)
đã đƣa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm
tế bào chất [40]. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã
phát hiện ra rằng Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và
tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone,
Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora,
Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31].
Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học –
Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF:
Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh
(Endogone).
9
Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi
Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker
cũng đề xuất nhƣ trên [60]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của
Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ:
Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới
Glomales [39].
Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular
mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2
chi mới là Glomites và Jimtrappea. Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT
thƣờng đƣợc sử dụng ở các nƣớc châu Á.
Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là:
Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và
Paraglomus [49].
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA
Phương pháp tách bào tử
Muốn tiến hành phân loại thì công việc đầu tiên là tách bào tử từ đất.
Thông thƣờng, bào tử đƣợc tách bằng sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc
sử dụng để lọc tuyến trùng từ đất do Gerdermann đã cải biên cho phù hợp với
nấm nội cộng sinh [32]. Trên cơ sở đó nhóm tác giả Daniel và Skipper (1982)
và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng
ƣớt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose
(dịch 50%) [25, 56].
Quan sát, đếm số lượng bào tử
Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể đƣợc thực hiện trên
kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ. Số lƣợng bào tử đƣợc xác
định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng
Satorrius [24].
10
Xác định dạng xâm nhiễm
Để xác định các dạng xâm nhiễm, ngƣời ta tiến hành nhuộm Tryphan
blue (0,005%) làm biến màu thể cần xác định trong rễ của cây chủ, do Philip
và Hayman đề xuất cụ thể nhƣ sau: Đầu tiên, nấm rễ cộng sinh đƣợc rửa
nhiều lần bằng nƣớc cất nhằm loại bỏ đất và các tạp chất hữu cơ bám trên bề
mặt của rễ sau đó đun nóng bằng dung dịch KOH 10% ở nhiệt độ 90oC trong
vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi
nấm sẽ bắt màu xanh [43]. Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ,
Kormanik và cộng sự đề xuất phƣơng pháp sử dụng fuschin làm mất màu
những mẫu rễ cây cần quan sát [35]. Năm 1996 tác giả Brundrett đã đƣa ra
một phƣơng pháp mới với thuốc nhuộm là Chlorazol black E, nhờ đó có thể
quan sát một cách rõ ràng những giai đoạn của AMF trong rễ cây chủ [24].
Tuy nhiên, tất cả các phƣơng pháp trên đều có chung một nhƣợc điểm là
tốn thời gian và gây phá hủy mẫu. Mặt khác, quá trình và mức độ biến đổi
màu là khác nhau với từng mẫu rễ. Đa số các loài thuộc chi Gigaspora và
Scutellospora biến đổi màu rất mạnh với Tryphan blue mà không phụ thuộc
vào loài cây chủ theo Morton (1988) [38]. Nhƣng có loài chỉ biến màu trung
gian với Tryphan blue nhƣ Acaulospora trapei [18]. Thậm chí, một số loài
của chi Glomus (G.leptoticum, G.maculosum…) hoặc loài Acaulospora
myriocarpa lại không biến màu với Tryphan blue [38].
Mức độ chặt chẽ của mối quan hệ giữa thực vật và AMF đƣợc thể hiện
thông qua số lƣợng bào tử có trong đất. Tuy nhiên, việc xác định số lƣợng bào
tử đôi khi gặp nhiều khó khăn. Để giải quyết vấn đề đó, ngƣời ta thƣờng dùng
một chỉ số trung gian là “hệ số xâm nhiễm”. Phƣơng pháp đơn giản là cắt hệ
thống rễ thành những mẩu nhỏ và xác định tỷ lệ Mycorrhiza. Tuy nhiên,
phƣơng pháp này không hiệu quả khi tỷ lệ Mycorrhiza lớn. Năm 1975, dựa
trên cơ sở phƣơng pháp đƣờng chéo của nhóm tác giả Newman, Sparling và
Tinker lần đầu tiên áp dụng với AMF, sau đó đƣợc dùng để so sánh với các
phƣơng pháp xác định khác. Hiện nay, phƣơng pháp này rất thông dụng [52].
11
1.5. SỰ PHÁT TÁN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA AMF ĐỐI VỚI THỰC
VẬT CHỦ
Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều
phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật
[29]. Nhƣng theo MacMahon và Warner thì những vùng khô hạn, gió là nhân
tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [36]. Ngƣợc lại, với
những nơi ẩm ƣớt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [29].
Năm 1983, Hayman cho rằng số lƣợng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá mức độ ƣu thế của loài. Trong đất canh tác, số lƣợng
loài và số lƣợng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [34]. Mặt khác theo tác
giả Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để
xác định số lƣợng bào tử [29].
Đồng thời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc
AMF thì ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh trƣởng của cây cũng đƣợc quan
tâm từ rất sớm.
Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng nhƣ
một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh đƣợc rằng cây trồng sẽ phát triển
nhanh khi có mặt AMF [32]. Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã
chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trƣởng của cây táo con từ chồi
[40]. Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và
yến mạch cũng cho kết quả tƣơng tự [30].
Nhƣ vậy, trong nhiều năm qua, những nghiên cứu về AMF chỉ tập
trung vào vấn đề ảnh hƣởng của chúng đối với sinh trƣởng cây trồng mà
không biết rằng giá trị AMF mang lại cho thực vật chủ còn lớn hơn nhiều.
Năm 1968, bào tử nấm nội cộng sinh có thể sống cùng với thực vật trong
chậu và đƣa ra phƣơng pháp nhân nuôi thì những nghiên cứu về AMF và ảnh
hƣởng của chúng đối với thực vật mới đƣợc tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh
12
vực nông lâm nghiệp [30, 41]. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng: AMF
không chỉ làm tăng khả năng sinh trƣởng, phát triển của cây trồng mà còn có
thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (nhƣ phốtpho, đồng, kẽm…) trong đất;
làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt độ
đất cao và nhiều nguyên nhân khác.
Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF,
Schonbeck và Dehne (1989) đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là
đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dƣa chuột, rau
diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thƣờng gặp
trên các loại cây chủ này [48]. Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả
tƣơng tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF
(giảm 30 – 45% các tác nhân gây bệnh) [54].
Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và đtg, đã chứng minh hiệu quả của
AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra. Đối với bệnh ở rễ
gây ra bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn
chế những thiệt hại về sản lƣợng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lƣợng
P2O5 thấp và cây đƣợc nhiễm AMF trƣớc khi bị nhiễm tuyến trùng. Nhƣ vậy,
AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hƣởng của bệnh ở rễ có
nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra. Tuy nhiên, tác dụng của AMF
không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus [20].
Khi nghiên cứu số lƣợng AMF trong đất, Schuybert và đtg đã nhận thấy
rằng: Ở các loại đất khác nhau, số lƣợng bào tử AMF là khác nhau [50].
Năm 1989 tác giả Schonbeck đã phân lập đƣợc 15 loài thuộc 3 chi khác
nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7
loài thuộc chi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo [48]. Trong đất trồng trọt
thƣờng xuyên (đất trồng lúa nƣớc, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác)
luôn có số lƣợng bào tử AMF cao hơn nhƣng thành phần loài của AMF lại thấp
hơn so với trong đất tự nhiên. Năm 1989 Schonbeck và Dehne nghiên cứu về
13
mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF đã
làm tăng đáng kể lƣợng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas) [48].
Khi nhiễm 3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và
Glomus caledonium cho cây dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm
lƣợng phốtpho trong cây, trong đó, Gigaspora margarita có hiệu quả kích
thích mạnh hơn 2 loài còn lại. Năm 1982, Dehne cũng phát hiện tác dụng kích
thích sinh trƣởng của AMF trên cây hành và cây ngô [26]. Đến năm 1989,
nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ
lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme
nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [59]. Ngoài
ra, Sung và đtg còn chứng minh đƣợc rằng: Thông qua hoạt động trao đổi chất
của mình, AMF có ảnh hƣởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này
cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trƣởng và
phát triển của cây chủ [48].
Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA –
Mycorrhiza chủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dƣỡng P. Hàm
lƣợng P trong tế bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA-Mycorrhiza tăng
35% đối với các loài nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus
fasciculatum. Hàm lƣợng P đƣợc tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử
P hữu cơ và acid hoà tan. Hàng ngày P đƣợc di chuyển đến các bộ phận của
cây bắp theo phƣơng pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh
trƣởng của cây [7].
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh
trƣởng và phát triển của các loại cây trồng khác nhau cho thấy chúng đều có
tác dụng tăng sinh khối, tăng quá trình trao đổi chất và thu nhận chất dinh
dƣỡng, tăng hoạt động của các enzyme.
Tóm lại vai trò cộng sinh của Mycorrhiza đối với sự sinh trƣởng, phát
triển của cây trồng đƣợc khái quát nhƣ sau [52]:
14
* Khả năng huy động nƣớc và các chất dinh dƣỡng: Hệ sợi nấm cộng
sinh xung quanh vùng rễ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút
nƣớc và các chất dinh dƣỡng. Đối với các chất dinh dƣỡng kém di động (nhƣ
ion phốtphat, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng
khuếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thƣờng hình thành vùng hẹp
cạn kiệt xung quanh rễ. Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vƣợt qua
vùng cạn kiệt để đến với nơi có đủ phốtpho dễ tiêu. Do có đƣờng kính nhỏ
hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các
lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua đƣợc để hút dinh dƣỡng cung cấp cho cây.
Đối với phốtpho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các
axít hữu cơ qua phản ứng của anion hữu cơ phân tử nhỏ (nhƣ oxalate…) để
sau đó có thể đổi chỗ cho phốtpho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại)
bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung
dịch, do vậy ngăn chặn đƣợc sự kết tủa của phốtphát kim loại. Nấm cộng sinh
Mycorrhiza còn giải phóng phốtpho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ
(thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ). Các hình thức cộng sinh Ericoid
Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng
hoá nitơ. Chỉ cần một lƣợng nhỏ AMF có thể huy động dinh dƣỡng từ khối
lƣợng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lƣợng lignin và tannin cao).
* Dòng chảy cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza: Dòng cacbon có
thể chỉ theo một chiều cƣỡng bức từ cây xuống AMF hoặc cũng có thể theo
chiều thoả thuận do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất. Dòng chảy
cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF
xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp mạnh hơn gấp bội
(trừ trƣờng hợp ánh sáng quá yếu). Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon
xuống nấm và đất có một số vai trò quan trọng sau:
- Sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (nhƣ protease,
phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ
và huy động chất dinh dƣỡng cho cây trồng.
15
- Sợi nấm kéo dài làm tăng liên kết với các hạt đất, cải thiện cấu tƣợng
đất, thông thƣờng có đến 1 – 20 m sợi nấm/gam đất.
- Tạo nên cộng đồng vi sinh vật vùng rễ. Đây là chỉ tiêu quan trọng để
đánh giá độ phì nhiêu của đất.
* Tăng khả năng chống chịu hạn: trong môi trƣờng đất khô nấm rễ giúp
cây hấp thu nƣớc bằng cách tăng cƣờng tốc độ thoát hơi nƣớc so với những
cây không có nấm rễ cộng sinh. Allerm cho rằng tác dụng của nấm trong vùng
khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn của cây và tăng nhanh tốc
độ truyền nƣớc trong cây. Năm 1982, Berea và đtg lại cho rằng tác dụng của
nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lƣợng nƣớc trong đất từ đó làm
tăng khả năng hấp thu nƣớc cho cây [21].
* Giúp cây chống chịu với bệnh hại: nấm cộng sinh ở rễ cây có tác
dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Phytophthora
infestans (một loài tảo tƣơng tự nấm). Do Phytophthora infestans không thể
xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [10].
- Ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi nấm
đan xen trong rễ cây.
- Sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic).
- Cạnh tranh dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức
đề kháng cho cây chủ.
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMF TRÊN THẾ GIỚI BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nấm Mycohriza ở mức độ phân
tử nhƣ RFLP, RAPD khuyếch đại trên nhiều vùng khác nhau của nấm đƣợc
thống kê theo bảng 1.2. Tuy nhiên việc phân loại bào tử bằng sinh học phân
tử vẫn còn nhiều hạn chế do khả năng thu nhận DNA tổng số từ bào còn thấp.
16
Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu AMF bằng sinh học phân tử [45]
Vùng
gen
Kỹ thuật sinh
học phân tử Đoạn mồi Tế bào đích
Tài liệu
tham khảo
SSU
rDNA
Genomic
DNA
PCR PCR–
RADP
VANS1
OPA-02 và OPA-04
OPA-18 và P124
OPA-18 và P124
Glomales
Glomusversiforme
Gl. mosseae . Gl. Caledoniu
Acaulosporalaevis
Gigasporamargarita
Scutellospora gregaria
109
39
SSU
rDNA PCR VANS1 và NS21 G. intraradices 83
Genomic
DNA
Competitive
PCR PO và M3 G. Mosseae 46
ITS PCR–RFLP ITS1 và ITS4 Glomus sp., Scutellospora
sp. 41
SSU
1492¢ PCR NS71 và SSU1492¢ Gigaspora sp. 75
Partial
rDNA PCRpartial
SS38 và VANS1
VANS1
VAGIGA
Rễ và bảo tử của AM,
Scutellospora và Glomus
Gigasporaceae
30
ITS1 and
ITS2 PCR ITS1 và ITS2 G. margarita 32
ITS PCR ITS1 và ITS4 G.mosseae và Gigaspora
margarita 29
SSU
rDNA
PCR-RFLP
PCRnested
LR1 và FLR2
FLR2-5.23 và
FLR2-8.23
LR1-23.46
Dƣới nhóm của Glomales
G. mosseae, G. intraradices
G. roseae
45
28S
rDNA PCR–SSCPs LSU-Primers Glomus sp. 82
SSU
rDNA PCR NS31 và AM1 Glomus sp. 4
17
SSU
rDNA
PCR–SSCP
Nested-PCR
VANS1
ITS, AM1
Dƣới nhóm của Glomales
60
ITS PCR–RFLP ITS1 và ITS4 G. mosseae 74
ITS Nested PCR–
SSCP
Eukaryotic
universal primer
Glomus sp.
Glomus-specific ITS primer 110
ITS Nested-PCR ITS 5 và ITS4 Glomeromycota (except
Archaeosporaceae) 44
ITS PCR
SSU-Glom/LSU-
Glom 1
ITS5 và ITS4
Các nhóm chính với
Glomeromycota 44
1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam, Mycorrhiza đƣợc nghiên cứu từ những năm 60 của thế kỷ
XX nhƣng đến nay mới đạt đƣợc một số kết quả nghiên cứu về nấm ngoại
cộng sinh, hầu nhƣ chƣa có thành tựu trên nấm nội cộng sinh, đặc biệt là với
cây cam.
Nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh trong lâm nghiệp là việc sử dụng
lớp đất tầng mặt của rừng thông để gieo ƣơm cây con - đây có thể đƣợc coi
nhƣ một hình thức nhiễm nấm tự nhiên của Lâm Công Định và đã đƣợc sử
dụng nhƣ một biệp pháp lâm sinh trong một thời gian khá dài [2].
Sau đó là các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1976) về sự có
mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông. Nghiên cứu sử dụng nấm cộng
sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vƣợt
trội về chiều cao và đƣờng kính của những cây đƣợc nhiễm nấm so với công
thức đối chứng là 20 – 30% [1]. Bên cạnh đó, Nguyễn Sỹ Giao và Nguyễn
Thị Nhâm (1980) còn nghiên cứu sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh
vàng còi ở thông con và cũng đã đạt đƣợc những kết quả nhất định [3].
Từ năm 1970 – 1980, Viện Nghiên cứu lâm nghiệp (nay là Viện Khoa
học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tiến hành phân lập và nuôi cấy thuần chủng
18
nấm cộng sinh [3]. Một vài thí nghiệm đã đƣợc tiến hành trên đất cằn với cây
chủ là một số loài thông nhập nội. Tuy nhiên, những thí nghiệm này sau đó
phải dừng lại vì nhiều lý do. Những nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh
trong lĩnh vực lâm nghiệp trong giai đoạn tiếp theo bị ngƣng trệ [15,16].
Năm 1998, Phạm Quang Thu và đtg tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng
sinh với thực vật, kết quả là xác định đƣợc 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ)
cộng sinh với 3 loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa
Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea). Công trình này đƣợc coi
nhƣ sự khởi đầu lại cho những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc
biệt trên đối tƣợng cây lâm nghiệp. Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác
định thành phần loài nấm mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất
các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ƣơm cây con ở
keo và bạch đàn. Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm
cộng sinh vì đã chủ động đƣợc nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm
sinh học. Giá trị của nghiên cứu này còn đƣợc thể hiện trong thực tiễn sản
xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng
kể tình hình sinh trƣởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi [14]. Đối với
AMF với cây dƣợc liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đƣợc cũng chỉ dừng
lại ở thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [5].
Một điều đáng mừng cho khoa học Việt Nam về nấm cộng sinh nói
chung và AMF nói riêng tại Hội thảo về nấm cộng sinh đầu tiên của Việt Nam
đã đƣợc tổ chức tại Viện Thổ nhƣỡng nông hoá vào năm 2004 với sự góp mặt
của các nhà nghiên cứu cơ bản thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội và các ngành
nông nghiệp, lâm nghiệp, dƣợc học... Tuy các tham luận tại Hội thảo này còn
mang tính lý luận, ít đề cập đến các kết quả nghiên cứu nhƣng nấm nội cộng
sinh đã đƣợc chú ý nhƣ một nội dung chính của Hội thảo, một số nhà khoa
học còn đề xuất định hƣớng nghiên cứu AMF trong những năm tiếp theo.
19
Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và đtg [12], khi tiến
hành nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và
quần thể vi sinh vật trong đất trồng bƣởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã
phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập đƣợc nhƣng tỷ lệ
xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5 [33], khả năng nảy mầm của các bào tử nấm
rễ bƣởi thấp (chỉ đạt 16%). Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử
dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lƣơng, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân
bào tử rồi đƣa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây ký chủ, mỗi loài cây ký
chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lƣơng không thích hợp dùng làm
cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 –
40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [13].
Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007)
trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu [8, 9]. Cùng năm
2007, Nguyễn Hoàng Yến công bố công trình nghiên cứu đầu tiên về phân bố
của AMF trong cây họ Sao dầu ở Đồng Nai [17].
Tuy có nhiều tài liệu đề cập đến vai trò của nấm cộng sinh AMF nhƣng
chƣa có nghiên cứu về vai trò của nấm cộng sinh đối với cây cam cũng nhƣ
ảnh hƣởng của các biện pháp kỹ thuật canh tác, dinh dƣỡng đất đến nấm cộng
sinh trên cây cam.Các nghiên cứu sâu rộng về AMF ở mức độ sinh học phân
tử, bằng các phƣơng pháp nhƣ RFLP, RAPD chƣa đƣợc tiến hành hoặc chƣa
đƣợc công bố.
Tóm lại, mối quan hệ cộng sinh nấm rễ – thực vật ít đƣợc quan tâm
nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam, đặc biệt chƣa có công trình khoa học
nào nghiên cứu về AMF ở cây cam. Bởi vậy đề tài: “Nghiên cứu hệ nấm cộng
sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An”
đƣợc thực hiện nhằm góp phần thiết thực vào hƣớng nghiên cứu mới: Ứng
dụng AMF để nâng cao năng suất cây cam nói riêng và cây trồng nông – lâm
nghiệp nói chung trên cơ sở bảo vệ môi trƣờng sinh thái theo hƣớng phát triển
bền vững trong thế kỉ XXI.
20
CHƯƠNG II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu
Sử dụng 60 mẫu đất và rễ đƣợc lấy ở các tầng đất khác nhau (0 – 20 cm, 20
– 40 cm, 40 – 60 cm) tại đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Quỳ Hợp – Nghệ An.
Thời gian lấy mẫu vào thán 8 và tháng 10 năm 2011.
Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR
MỒI Trình tự nucleotide
VANS1_5 5' GTC TAG TAT AAT CGTTAT ACA GG 3'
NS21 5’AAT ATA CGC TAT TGG AGC TGG 3
’
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Hóa chất:
Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR (buffer, dNTP, enzyme taq
polymerase…) do hãng Fermentas PureXtreme (Mỹ) cung cấp và bộ Kit tách
chiết DNA, tinh sạch DNA nhập từ hãng QIAGEN (Canada). Ngoài ra, một
số hóa chất khác còn đƣợc chúng tôi sử dụng nhƣ: EtBr, gel agarose, dung
dịch đệm TAE 1X…
Thiết bị chủ yếu:
- Bộ rây với các kích cỡ: 10.000 m; 70.000 m; 5.000 m; 2.500 m;
1.000 m; 750 m; 500 m; 250 m; 90 m và 40 m.
- Kính hiển vi quang học Olympus BH với hệ thống chụp ảnh chống
rung.
- Bộ vi gắp và bộ hút chân không áp suất thấp.
- Phễu hút kèm giấy lọc Whatman số 1 – 4.
21
- Tủ lạnh -200C Vestfrost (Đan Mạch), Máy li tâm BioFuge fresco
(Đức), Lò vi sóng Sharp (Nhật Bản), Cân điện tử Precisa (Thụy Sỹ),
Máy chu trình nhiệt GenAmp PCR System 9700 (Mỹ), Máy chụp gel
BioRad (Đức), Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản), Máy điện di Mupid –
2plus (Nhật Bản), Máy li tâm nhanh Picofuge (Mỹ), Máy giải trình tự
ABI 3100 Bio System (Mỹ), Pipette Gilson (Pháp), Bể ổn nhiệt
Memmert (Hàn Quốc), Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan), Máy đo quang
phổ (Đức).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp tách bào tử
- Lấy mẫu, bảo quản mẫu: Theo phƣơng pháp của Hayman 1983, mẫu
lấy ở ba tầng phẫu diện khác nhau: Tầng 0 - 20 cm, tầng 20 – 40 cm và tầng
40 – 60 cm. Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản ở 4oC cho đến khi phân tích [34].
- Tách bào tử từ đất: Sử dụng kỹ thuật sàng ƣớt (wet siewing) qua rây
kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) theo Daniel&
Skipper (1982) [26], Tommerup (1992) [56].
Bƣớc 1:
+ Cân mẫu đất 50 g
+ Loại bỏ các mảnh rác thô và đá trong mẫu đất
+ Sau đó cho lƣợng đất đã cân vào trong nƣớc để ít nhất 30 phút trƣớc khi
sàng, các khối đất to phải đƣợc đập vỡ.
Bƣớc 2:
+ Đất đƣợc trộn đều trong ca dung tích 1lít nƣớc, sau đó để trong 10 phút
cho các mẫu đất lớn lắng xuống rồi gạn dịch sang một loạt sàng có kích thƣớc
khác nhau.
22
+ Quá trình rửa và gạn lọc đƣợc lặp lại nhiều lần cho tới khi nƣớc trong
rễ và các mẫu rác thô đƣợc giữ lại trên sàng có kích thƣớc lớn nhất, còn bào
tử đƣợc giữ lại trên sàng có kích thƣớc bé nhất.
Bƣớc 3:
+ Thu lại các vật chất bám trên sàng có kích thƣớc bé nhất sau đó chuyển qua
các ống ly tâm, tiến hành ly tâm lần 1 ở 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút.
+ Sau bƣớc này các cặn lơ lửng và rác đƣợc loại bỏ.
Bƣớc 4:
+ Cho 50 µl dung dịch sucrose 50% vào ống ly tâm rồi lắc mạnh các ống
(Hình 2.5)
+ Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 11000 vòng/ phút trong 2 phút để tách bào tử
từ thành phần đất. Sau khi ly tâm, bào tử nằm trong dung dịch huyền phù
sucrose.
Bƣớc 5:
+ Hút dịch huyền phù sucrose đƣợc cho lên giấy lọc và đặt trên phễu
Buchner trƣớc khi lọc hút chân không (dùng giấy lọc Whatman GF/A số 1-4).
+ Đặt giấy lọc chứa bào tử vào đĩa petri rồi đem quan sát bào tử dƣới kính
hiển vi điển tử.
Bƣớc 6:
Bào tử sau khi đƣợc phát hiện dƣới kính hiển vi đƣợc chụp ảnh. Số
lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có
chia ô của hãng Satorri.
- Xác định hình dạng và kích thƣớc của bào tử: Bảng so sánh của
Morton [38].
- Xác định các dạng xâm nhiễm AMF: Nhuộm Tryphan blue có cải tiến
của Brundrett Mark và cộng sự [25].
- Xác định tên chi và loài: Theo Schenck và cộng sự [47].
23
- Giữ giống các bào tử AMF: Lây nhiễm chủ động vào chậu chứa đất cát
khử trùng trƣớc khi trồng cây ký chủ ngô [18].
- Màu sắc của bào tử: Xác định bằng bảng màu chuẩn 4 nhân tố.
24
Hình 2.1. Bảng mầu so sánh để phân loại nấm Mycorrhiza
25
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
Quá trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu rễ đƣợc cải tiến theo phƣơng
pháp tách DNA tổng số của White và cộng sự (1990) [61].
Phƣơng pháp này bao gồm những bƣớc chính sau:
Bƣớc 1: Rễ đƣợc cắt nhỏ cho vào ống effendorf 1,5 ml.
Bƣớc 2: Dùng pipette hút 300 µl dung dịch đệm, cho vào ống
effendorf có chứa mẫu.
Bƣớc 3: Dung dịch đƣợc chạy qua 3 chu kỳ nóng lạnh:
Làm nóng ở 65 °C/ 15 phút
Làm đông lạnh ở bể đá/ 15 phút
(Hai chu kỳ này xen kẽ nhau và đƣợc lặp lại 3 lần)
Bƣớc 4: Sau đó dùng chày giã nhỏ và đem đi ủ ở nhiệt độ 65 oC/30
phút.
Bƣớc 5: Bổ sung 400 µl Clorofom vào dung dịch sau đó vortex.
Bƣớc 6: Dung dịch đƣợc ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 30 phút.
Bƣớc 7: Sau khi ly tâm dịch chia làm 2 pha, thu pha trên chuyển
sang ống effendorf mới và tủa bằng dung dịch Isopropanol lạnh.
Bƣớc 8: Ly tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 30 phút.
Bƣớc 9: Loại bỏ dich, thu cặn và rửa cặn bằng ethanol 70% lạnh.
Bƣớc 10: Sau khi rửa sạch, làm khô và bổ sung 20 µl đệm TE, rồi
bảo quản ở tủ lạnh -20 oC.
Sau đó, sản phẩm DNA tổng số đƣợc tiến hành điện di kiểm tra sản
phẩm trên gel agarose 0,8%.
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
Điện di là kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích, kích thƣớc và hình
dạng của chúng trên gel. Trong phƣơng pháp điện di trên gel, các phân tử
26
DNA có điện tích âm, đƣợc kéo qua một lớp gel bán lỏng nhờ một dòng điện
về phía cực dƣơng trong buồng điện di.
Thông thƣờng, gel có chứa một phần đƣờng của thạch tinh khiết gọi là
agarose, chất này ngoài việc làm gel đồng nhất hơn so với thạch mà nó còn
hoạt động nhƣ một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích thƣớc
của chúng khi trong điện trƣờng.
Các đoạn DNA càng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng xa so
với các đoạn lớn. Để xác định kích thƣớc của một đoạn DNA, ngƣời ta so
sánh khoảng cách nó so với khoảng cách mà các đoạn DNA tiêu chuẩn (là
một tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết rõ kích thƣớc - marker) đi qua.
Nồng độ agarose đƣợc sử dụng khác nhau tùy thuộc vào thí nghiệm
cần nghiên cứu, thƣờng nằm trong vùng từ khoảng 0,8 - 1,5%.
Để hiện hình các băng DNA trên bản gel, ngƣời ta thƣờng sử dụng
thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr). Chất này liên kết với DNA bằng cách
xen vào giữa và kề sát với các cặp bazơ (liên kết nhuộm). Khi chiếu ánh sáng
(tia UV) vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát huỳnh quang, kết
quả có thể nhận biết đƣợc bằng mắt thƣờng và chụp ảnh đƣợc.
Quy trình:
* Chuẩn bị gel agarose: cân 0,8 g agarose cho vào 100 ml dung dịch đệm
TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống
khoảng 50 oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lƣợc. Sau
khoảng 30 phút, gỡ lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X
vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.
* Tra mẫu DNA: Lấy mẫu khoảng 5 – 10 µl mẫu DNA trộn với 3 µl đệm
loading dye (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng
giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trƣớc khi chạy điện di) và tra vào
các giếng nhỏ trong gel. Sử dụng marker 1kb để làm chỉ thị phân tử.
27
* Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút. DNA di chuyển từ
cực âm đến cực dƣơng. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để
biết khi nào dừng điện di.
* Nhuộm bằng EtBr: bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào
dung dịch EtBr nồng độ 2 µl/ml trong thời gian khoảng 10 phút. Sau đó lấy
bản gel ra tráng qua nƣớc rồi quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng tia tử ngoại
của máy soi chụp gel (Bio – Rad).
2.2.4. Kỹ thuật PCR
PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction, đƣợc dịch là phản
ứng chuỗi trùng hợp hay “phản ứng khuếch đại gen. Máy chu trình nhiệt (máy
PCR), các chuỗi DNA mong muốn đƣợc nhân lên hàng triệu lần trong thời
gian ngắn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide tƣơng tự hai đầu 3’ ở hai của
đoạn DNA đích với sự tham gia của Taq DNA polymerase.
Quá trình PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì
gồm 3 bƣớc (biến tính, gắn mồi, kéo dài) lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ
làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. PCR là một kỹ thuật phổ biến
trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) DNA mà
không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E. coli hay nấm men. PCR cũng là
một phƣơng pháp thông dụng hiện nay để phát hiện các bệnh di truyền.
Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thƣờng chỉ đƣợc
nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện đƣợc quá trình
này, đòi hỏi phải có mặt một enzyme DNA polymerase, cũng nhƣ sự tham gia
của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn với sợi DNA khuôn có đầu 3’OH tự
do và các dNTP làm nguồn cung cấp các nucleotide. Trong quá trình phân
bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép đƣợc mở xoắn và tách thành DNA sợi
đơn. Dƣới tác dụng của DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA đƣợc xảy
ra theo cách gắn lần lƣợt các nucleotide vào đoạn mồi tại vị trí 3’OH để kéo
dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.
28
Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng
hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trƣờng dƣ
thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới hình thành lại đƣợc
sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Nhƣ vậy số lƣợng
bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số
lƣợng bản sao là 2n.
Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau:
+ DNA khuôn mẫu.
+ Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide.
+ Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP).
+ Taq DNA polymerase chịu nhiệt.
Nhân đoạn gen SSU bằng PCR
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR
- Thành phẩn phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc đã khử ion vô trùng 11,75
Buffer 1 X 2,5
dNTP 10 mM 0,5
Mồi xuôi 10 pmol 1
Mồi ngƣợc 10 pmol 1
Taq DNA polymerase 1 U 0,25
DNA khuôn 8
Tổng 25
29
Chu trình nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa: Cho phản ứng PCR
Hình 2.2. Chu trình nhiệt PCR
Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện trên máy GenAmp
PCR System 9700 thông qua 3 giai đoạn (Hình 2.9):
Giai đoạn 1: Giai đoạn tiền biến tính, tháo xoắn DNA ở 950C trong 3
phút.
Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại đoạn DNA thông qua 3 bƣớc. Một là
bƣớc biến tính DNA ở 950C trong 1 phút, hai là bƣớc gắn mồi ở 50
0C trong 1
phút và ba là bƣớc kéo dài chuỗi ở 720C trong 2 phút 30 giây. Quá trình này
lặp lại trong 30 chu kì.
Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp nên chuỗi DNA mới ở 720C trong 10
phút, sau đó mẫu đƣợc bảo quản ở 40C.
2.2.5. Tinh sach san phâm PCR
Sau khi tiến hành điện di các mẫu PCR lƣợng lớn, phần gel chứa đoạn
gen mong muốn đƣợc thu lại vào ống effendorf 1,5 ml. Quá trình tinh sạch
bao gồm những bƣớc sau:
Bƣớc 1: Cân ống effendorf chứa gel đã thu.
30
Bƣớc 2: Bổ sung Binding buffer II vào ống, chú ý cứ 100ng gel cần bổ
sung thêm 400 µl buffer (Ví dụ: 125ng gel thì cần thêm 500 µl buffer), sau đó
đem ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 65oC đến khi gel tan hoàn toàn.
Bƣớc 3: Cho toàn bộ dịch trong ống effendorf vào cột li tâm lồng trong
ống EZ 10 (loại ống chuyên dùng cho li tâm) và để im trong 2 phút ở nhiệt độ
phòng. Sau 2 phút, đem ống đi li tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút. Kết thúc
li tâm, loại bỏ hết phần dịch ở đáy ống, thu cột.
Bƣớc 4: Chuyển cột sau li tâm trƣớc đó vào ống EZ 10 mới, bổ sung
Wash Solution với lƣợng tối đa 800 µl và đem đi li tâm lạnh 12000 vòng/phút
trong 2 phút. Cũng giống nhƣ bƣớc 3, bỏ phần dịch ở đáy ống, thu cột.
Bƣớc 5: Bổ sung 500 µl Binding buffer nếu nhƣ mẫu muốn tiến hành đọc
trình tự luôn.
Bƣớc 6: Bổ sung 700 µl wash buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1
phút.
Bƣớc 7: ly tâm lại một lần nữa để loại bỏ hết dịch.
Bƣớc 8: chuyển cột từ bƣớc 7 sang ống 1,5 ml đã khử trùng. Bổ sung 50
µl Elution Buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1 phút.
Bƣớc 9: DNA sau khi đƣợc tinh sạch cần phải đƣợc bảo quản ở -20 oC,
dùng 3 - 5 µl mẫu đi điện di kiểm tra, chạy điện di bằng gel agarose 0,8%
trong 30 phút, sau đó nhuộm bằng EtBr trƣớc khi chụp ảnh dƣới tia UV trên
máy Bio Ra.
31
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LOẠI AMF TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Hình thái và cấu tạo bào tử AMF trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp - Nghệ An
Trong tổng số 60 mẫu đƣợc khảo sát tại đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An năm 2011 có tổng số 16 kiểu hình
bào tử AMF thuộc 6 chi đƣợc tìm thấy nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả phân loại bào tử AMF
Tên chi Tên chủng Kích
thƣớc µm
Đặc điểm Hình dạng
Acaulospora
Appendicula 150-175
Bào tử hình cầu hoặc gần hình cầu. Đa
số bào tử màu trắng, một số ít bào tử
màu nâu hoặc nâu nhạt, đôi khi xuất
hiện các bào tử màu nâu đỏ (mã màu
20/60/30/10).
Delicate 100-175
Bào tử hình cầu hoặc elip, màu nâu
nhạt hoặc nâu vàng (mã màu từ
40/80/70/10). không bắt màu khi
nhuộm Melzer
32
Dilatata 125-200
Phần lớn bào tử có dạng hình cầu hoặc
gần hình cầu, đôi khi có dạng tròn.
Bào tử có màu đỏ đậm, (mã màu từ
60/80/20/00 đến 40/60/100/00),
Lacunose.
120-175
Bào tử có dạng hình cầu hoặc gần hình
cầu, đôi khi có dạng elip, màu đỏ vàng
(mã màu từ 20/60/60/00 đến
20/60/100/10). Thành bào tử có cấu
trúc 5 lớp, chia thành 3 nhóm.
Myriocarpa 150-200
Bào tử có dạng hình trứng hoặc hình
tròn, bề mặt có vết lõm,màu nâu hoặc
có màu nâu nhạt (40/80/60/00). Thành
bào tử có 1 – 3 lớp, bắt màu vàng khi
nhuộm Melzer.
scrobiculata 120-175
Bào tử có dạng hình cầu hoặc elip, đặc
biệt trên thành tế bào có quả bào tử.
Mã màu bào tử từ 40/60/40/00 đến
40/60/80/00. Thành bào tử có 2 lớp, có
phản ứng khi nhuộm Melzer.
33
Glomus
Aggregatum 120-175
Bào tử có hình cầu hoặc elip, đặc biệt
bào tử có cuống bào tử. Bào tử thƣờng
có màu nâu đậm, có thể xuất hiện
vàng. Cấu trúc thành rõ rệt, gồm 4 lớp,
chia thành 3 nhóm.
Ambisporum 100-150
Bào tử hình cầu, gần hình cầu hoặc
hình trứng, đa số màu nâu hoặc có màu
nâu đỏ, (mã màu từ 20/60/40/00),
thành bào tử rất dày, có khoảng 5 – 6
lớp.
Marcaropus 100-125
Bào tử có hình cầu hoặc gần hình cầu,
hình elip. Đa số bào tử có màu vàng
hoặc vàng nhạt, (mã màu từ
20/40/100/10). Thành bào tử dày,
nhiều lớp, bắt màu vàng nhạt trong
phản ứng nhuộm Melzer.
34
Sclerocystis
.
Coccogena
120-150
Bào tử có dạng hình cầu, gần hình cầu,
có màu nâu hoặc nâu nhạt
(40/80/30/10). Thành bào tử gồm 2 - 3
lớp.
Coremioides 100-150
Bào tử có hình tròn, màu nâu, đôi khi
có màu đỏ, (mã màu từ 40/60/80/00 ).
Thành bào tử có 2 lớp, lớp ngoài dày
và có màu nâu nhạt đến nâu đậm.
Glomites Rhyniensis 150-200
Bào tử hình cầu hoặc hình elip, đặc
biệt trên thành bào tử có cuống bào tử
có mầu nâu đậm. Bào tử có màu nâu
đậm. Thành bào tử có cấu trúc kiểu
liên tiếp, gồm nhiều lớp.
35
Entrophospora
colombiana 150-200
Bào tử hình cầu, gần cầu, bề mặt có
các lƣới đa giác, đa số có màu nâu đỏ,
số ít có màu nâu thành bào tử dầy, có
nhiều quả bào tử.
schenckii 150 -200
Bào tử hình cầu, gần hình cầu hoặc
hình thận, bề mặt có các gai nhỏ. Bào
tử có màu xám xỉn hoặc nâu tối
(60/80/70/10). Thành bào tử gồm 2 lớp
Gigaspora
Candida, 120–160
Bào tử thƣờng có hình cầu và gần hình
cầu, một số có hình elip. Bào tử có
màu nâu hoặc đỏ (mã màu từ
20/60/20/00). Thành bào tử có cấu trúc
nối tiếp, gồm 3 – 5 lớp
Albida 120-150
Bào tử hình cầu hoặc gần hình cầu, đa
số có màu trắng, vàng hoặc vàng kem,
(mã màu 60/80/60/00). Thành bào tử
có 3 lớp.
36
3.1.2 Thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở quỳ hợp thuộc xã
Minh Tân - huyện Quỳ Hợp - Tỉnh Nghệ An.
16 kiểu hình AMF xác định đƣợc trong đất trồng cam phủ quỳ xã Minh
Tân – huyện Quỳ Hợp - tỉnh Nghệ An thuộc 6 chi, 3 họ và 2 bộ phụ.
Các chi AMF xuất hiện trong đất trồng cam Phủ Quỳ xã Minh Tân-
huyện Quỳ Hợp – tỉnh Nghệ An là: Acaulospora, Entrophospora, Glomus,
Sclerocystis, Glomites và Gigaspora.
Các họ đƣợc tìm thấy ở đây là: Acaulosporaceae, Glomaceae và
Gigasporaceae.
Các bộ phụ tìm thấy là: Glomineae và Gigasporinae
Thành phần loài chi tiết của 6 chi AMF trong đất trồng cam.
* Chi Acaulospora: Có 6 loài, bao gồm các loài Acaulospora
appendiculata, Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora
myriocarpa, Acaulospora bireticulata, Acaulospora lacunose.
* Chi Entrophospora: Có 2 loài, bao gồm các loài Entrophospora
colombiana, Entrophospora schenckii.
* Chi Glomus: Có 3 loài là Glomus aggretum, Glomus ambisporum,
Glomus marcaropus.
* Chi Sclerocystis: Có 2 loài là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* Chi Glomites: Có 1 loài duy nhất Glomites rhyniensis.
* Chi Gigaspora: Có 2 loài Gigaspora candida, Gigaspora albida.
3.1.3. Đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam Quỳ Hợp – Nghệ An
Cam có thể sinh trƣởng và cho thu hoạch bình thƣờng ở đất xốp. Nhƣng
chỉ ở đất tốt, cây cam mới cho năng suất cao, chất lƣợng. Ở Việt Nam, cây
cam đƣợc trồng trên 6 loại đất chính trong đó đất đỏ bazan chiếm từ 50 – 60%
diện tích đất trồng cam.
37
3.2. PHÂN BỐ CỦA AMF THEO GIỐNG CAM
Các kết quả điều tra chỉ rõ rằng ở Phủ Quỳ, Nghệ An có rất nhiều giống cam
khác nhau nhƣng phổ biến nhất là: cam Xã Đoài, Vân Du, và V2. Sƣ phân bô
của nấm Mycorrihza giƣa cac giông cam co sƣ khac nhau (Hình 3.9).
Giống cam Xã Đoài
Ở giống cam Xã Đoài đã phát hiện đƣợc 16 loài AMF trong đó có:
* 6 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora appendiculata,
Acaulospora dilatata, Acaulospora bireticulata, Acaulospora lacunose,
Acaulospora scrobiculata, Acaulospora elegans, Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora schenckii,
Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum, Glomus ambisporum,
Glomus australe,
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida, Gigaspora albida.
Giống Vân Du
Trong đất trồng cam Vân Du có tổng số 9 loài AMF xuất hiện, gồm:
* 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora
dilatata, Acaulospora myriocarpa, Acaulospora bireticulata, Acaulospora
lacunose.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora schenckii,
Entrophospora infrequens.
* 1 loài thuộc chi Glomus là:Glomus ambisporum, Glomus aggretum.
* 1 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida.
38
Giống cam V2
Ở giống cam V2 đã phát hiện đƣợc 12 loài AMF trong đó có:
* 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora
dilatata, Acaulospora lacunose, Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana,
Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum, Glomus ambisporum,
Glomus marcaropus, Glomus australe.
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
Hình 3.1. Tổng số loài AMF trong các giống cam
39
Hình 3.2. Phân bố loài AMF trong chi theo giống cam
Từ kết quả trên cho thấy số lƣợng loài AMF trong đất trồng cam giống
cam Xã Đoài là cao nhất (16 loài) sau đó đến giống cam V2 (12 loài) và thấp
nhất là giống cam Vân Du (9 loài) (Hình 3.9).
Trong 6 chi AMF xuất hiện ở đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An,
giống cam Xã Đoài có mặt cả 6 chi, Vân Du và V2 chỉ xuất hiện 4 chi xuất
hiện là Acaulospora, Entrophospora, Glomus và Gigaspora. Hai chi nấm
AMF là Sclerocystis và Glomites không xuất hiện ở đất trồng cam Vân Du,
chi Gigaspora không xuất hiện ở đất trồng cam V2 (Hình 3.10). Theo
Boddington và đtg thì nguyên nhân của sự sai khác này có thể bắt nguồn từ
tính chất của giống cam [22]. Đến năm 2002 một lần nữa Roy và đtg cũng
khẳng định nguyên nhân sai khác ở các loài là do giống cây [44].
Giống cam Xã Đoài hay còn gọi là giống cam Vinh là giống địa
phƣơng hỗn hợp, nhiều biến dị, mọc khỏe, bộ rễ lớn, tán xòe rộng mọc tốt
trên cả đất xấu. Đây có thể đƣợc coi là giống thực vật bản địa.
40
Giống cam V2 là giống nhập nội, nguồn gốc từ Nhật Bản, hình thái cây to
trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thƣa đƣờng kính thân cây to, phân cành dày,
bộ khung tán khỏe, cây sinh trƣởng khá, khi trồng cây có tỷ lệ sống cao.
3.3. PHÂN BỐ CỦA AMF THEO TẦNG ĐẤT
Kết quả nghiên cứu về sự phân bố của thành phần loài AMF trong đất
trồng cam ở Phủ Quỳ - Nghệ An theo 3 tầng phẫu diện ở (hình 3.11) nhƣ sau:
Tầng 0 – 20 cm
Trong tầng đất này có tổng số 16 loài AMF xuất hiện bao gồm:
* 6 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora appendiculata,
Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora bireticulata,
Acaulospora scrobiculata, Acaulospora elegans và Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana,
Entrophospora schenckii và Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus ambisporum, Glomus marcaropus
và Glomus mosseae.
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài chi Gigaspora là Gigaspora albida , Gigaspora candida.
Tầng 20 – 40 cm
Không nhiều nhƣ ở tầng 0 - 20cm, trong tầng 20 - 40cm, chỉ có 12 loài
AMF xuất hiện, bao gồm:
* 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora
dilatata, Acaulospora scrobiculata và Acaulospora elegans.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana,
Entrophospora infrequens.
* 2 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum, Glomus australe.
41
* 1 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài chi Gigaspora là Gigaspora candida, Gigaspora albid
Tầng 40 – 60 cm
Có 9 loài AMF xuất hiện trong tầng đất này là:
* 3 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora dilatata, Acaulospora
lacunose và Acaulospora elegans.
* 2 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum và Glomus australe.
* 1 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida và Gigaspora
decipiniens.
Hình 3.3. Tổng số loài AMF theo tầng phẫu diện
42
Hình 3.4. Phân bố loài AMF trong chi theo tầng phẫu diện
Nhƣ vậy, thành phần loài AMF tập trung chủ yếu ở tầng mặt (16 loài), giảm
dần xuống tầng 20 – 40 (12 loài), thấp nhất ở tầng 40 – 60cm (9 loài). Nói
một cách khác số lƣợng loài nấm AMF giảm dần theo chiều sâu phẫu diện ở
đất trồng cam. Kết quả phân bố này tƣơng tự nhƣ phân bố của vi sinh vật nói
chung trong đất của Tortora (2002) [57].
Một số nghiên cứu cho biết cam có 2 loại rễ là rễ hút và rễ dẫn. Rễ cam
có đƣờng kính <1mm, màu vàng ngà đƣợc gọi là rễ hút. Rễ dẫn có đƣờng
kính >1mm, màu nâu hoặc nâu đỏ. Ở tầng đất mặt lƣợng rễ hút tập trung đến
60%. Có thể chính vì nguyên nhân này khiến cho số lƣợng loài AMF tập
trung chủ yếu ở tầng 0 – 20 cm theo Newman [42]. Nhìn lại các kết quả của
các tác giả khác trên thế giới ta cũng thấy chiều hƣớng tƣơng tự. Kết quả
nghiên cứu của Redhead (1980) cho thấy AMF giảm đáng kể khi độ sâu tầng
43
đất đạt dƣới 15 cm. Tuy nhiên có nghiên cứu cũng cho thấy AMF có thể xuất
hiện dƣới các tầng phẫu diện sâu hơn [46]. Năm 1983, Ted và Chiristopher đã
phát hiện thấy rằng tỷ lệ phần trăm rễ bị AMF xâm nhiễm cũng nhƣ trạng thái
xâm nhiễm rễ giảm mạnh khi tăng về độ sâu của phẫu diện ở các loại cỏ [55].
3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CỘNG SINH AMF TRÊN CÂY CAM
Để xác định khả năng cộng sinh của AMF trên cây cam. Sau khi phân
lập bào tử từ đất trồng cam, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm trên cây cam
con nẩy mầm từ hạt.
Sau khi hạt cam nẩy mầm, lần 1 bổ sung 10-15 bào tử AMF vào bầu
chứa cây ký chủ. Sau khi bổ sung AMF từ 15 -20 ngày chúng tôi tiến hành đó
chiều dài, số lƣợng rễ cam trên hai lô thí nghiệm và cho kết quả ở (bảng 3.1).
Kết quả cho thấy lô thí nghiệm bổ sung Mycorrhiza có khả năng sinh trƣởng
và phát triển tốt hơn trên lô đối chứng không bổ sung Mycorrhiza (Hình 3.5).
Hình 3.5. Bổ sung AMF lần 1 (ảnh trái), thí nghiệm đối chứng
(ảnh phải)
44
Lần 2 tiến hành thí nghiệm lặp lại giống nhƣ lần 1 và cho kết quả khả
quan ở (bảng 3.2).
Hình 3.6. Kết quả nhiểm AMF trên cây cam con.
Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy vai trò của AMF đối với
cây cam con là rất lớn nhƣ: làm tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng,
muối khoáng và nƣớc cho cây cam trên môi trƣờng đất cát (môi trƣờng nghèo
dinh dƣỡng) qua thời gian 3 tháng cây vẫn phát triển bình thƣờng. Qua bảng
thống kê thì chúng tôi nhận thấy những cây cam con khi đƣợc bổ sung AMF
có khả năng sinh trƣởng và phát triển hơn nhiều so với cây đối chứng: Về
chiều dài của cây, cũng nhƣ chiều dài và số lƣợng rễ trên cây, đƣợc thể hiện
qua (hình 3.5; 3.6; 3.7).
45
Hình 3.7. Kết quả sinh trƣởng của cam sau 3 tháng bổ sung AMF
Số liệu thu đƣợc sau các lần đo đƣợc tính toán và xử lý qua phần mềm
Ecxel, độ sai lệch đƣợc tích theo công thức:
Trong đó n số cây (n = 20)
Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm trên cây cam con
Số lần đo Bổ sung AMF Thí nghiệm ĐC
Chiều dài rễ
(cm)
Số lƣợng
rễ (cái)
Chiều dài rễ
(cm)
Số lƣợng rễ
(cái)
Lần 1 3,2 ± 0,17 3,0 ± 0,1 2,1 ± 0,03 2,0 ± 0,01
Lần 2 6,7 ± 0,17 5,0 ± 0,1 3,8 ± 0,01 3,0 ± 0,05
Lần 3 13,0 ± 0,02 6,0 ± 0,05 4,8 ± 0,13 4,0 ± 0,02
Sau thời gian 3 tháng chúng tôi tiến hành thu mẫu rễ có bổ sung AMF
để xác định khả năng cộng sinh của AMF trên rễ cam bằng phƣơng pháp
nhuộm trypan blue (0,005%) có cải tiến của Brundrett Mark và đtg, (1996)
46
[24]. Sau khi xác định khả năng cộng sinh trên rễ cam, chúng tôi tiến hành thu
mẫu rễ với số lƣợng lớn cho quá trình tách DNA tổng số.
Hình 3.8. Kết quả nhuộm Tryphan blue AMF ở rễ cam:
1- Bào tử AMF
2- sợi nấm AMF
3- thành tế bào thực vật.
3.5. NHÂN ĐOẠN GEN 18S rRNA
3.5.1. Tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số là bƣớc khởi đầu để tiến hành thí nghiệm sinh
học phân tử. Thông thƣờng, để xác định độ tinh sạch DNA tổng số đƣợc
chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ ở
tại hai bƣớc sóng 260nm và 280 nm. Tuy nhiên quá trình tách chiết DNA tổng
số từ 2 nguồn bào tử trực tiếp và rễ cây nhiễm bào tử thu đƣợc rất thấp nên
chúng tôi không tiến hành chạy điện di cũng nhƣ đo quang phổ. Theo các
nghiên cứu trƣớc đó thì quá trình nhân đoạn gen 18S rRNA cũng tiến hành
nhân trực tiếp từ sản phẩm tách DNA tổng số [36].
3.5.2. Nhân đoạn gen 18S rRNA
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi sử dụng dịch tách chiết làm
khuôn dùng trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc sử dụng 2 mồi
47
VANS1_5 và NS21 với nồng độ mồi thích hợp là 10 nmol.
Đối với phản ứng PCR, việc xây dựng một chu trình nhiệt phù hợp là
yếu tố quan trọng nhất, bởi vì yếu tố nhiệt độ đảm bảo cho sự giãn xoắn của
phân tử DNA, cũng nhƣ việc gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt tối ƣu
cho phản ứng PCR trình bày ở trên.
Ngoài ra một yếu tố khác cũng không kém phần quan trọng là nhiệt độ
gắn mồi. Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể đƣợc tính toán
dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm = 20C x (A + T) + 4
0C x (G +C) + 3,3
0C
A, T, G, C: các bazơ nitơ
Sau khi tính đƣợc nhiệt độ Tm theo lý thuyết, phản ứng PCR đƣợc
tiến hành chạy tại các nhiệt độ gắn mồi khác nhau và đã chọn đƣợc nhiệt độ
gắn tối ƣu là 500C trong thời gian 1 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc tiến hành kiểm tra trên gel agarose
0,8% (Hình 3.26). Kết quả chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen SSU có
kích thƣớc khoảng 0,5 kb đúng theo tính toán lý thuyết. Kết quả này hoàn
toàn phù hợp với nghiên cứu trƣớc đó [36].
48
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR
M: Marker – thang DNA chuẩn 1 kb.
1: DNA nhân bởi cặp mồi SSU có kích thƣớc 0.5 kb.
3.5.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Nhƣ đã nói ở trên, sản phẩm PCR sau phản ứng vẫn còn lẫn mồi dƣ lại
do đó để có đủ lƣợng DNA cho việc giải trình tự gen, sản phẩm PCR đƣợc
chúng tôi tiến hành điện di lƣợng lớn với tổng thể tích mỗi giếng là 50 µl, sau
đó cắt những băng DNA đặc hiệu dƣới tia UV trƣớc khi thực hiện tinh sạch
thu DNA tinh khiết nhất. Kết quả điện di thôi gel ở (hình 3.9.A).
A B
Hình 3.10. Kết quả sản phẩm PCR.
M: Marker DNA chuẩn 1 kb.
1: DNA nhân bởi cặp mồi SSU có kích thước 0,5kb
(Hình A thôi gel sản phẩm PCR, Hình B tinh sạch sản phẩm PCR).
49
Trong quá trình tiến hành, để thuận tiện cho việc điện di sản phẩm
PCR thể tích lớn, ba giếng điện di đƣợc ghép vào làm một (Hình 3.10. A).
Trên hình ảnh kết quả, các băng DNA đều rất đặc hiệu, rõ nét, không có dấu
hiệu bị đứt gãy và kích thƣớc các băng phù hợp với kích thƣớc đã thiết kế mồi
nằm trong khoảng 0,5 kb trong khi mồi dƣ hoàn toàn nằm phía dƣới. Do đó,
đoạn gel chứa các băng DNA đƣợc cắt dƣới tia UV sau đó tiến hành tinh
sạch, tạo nguyên liệu cho quá trình giải tự gen. Kết quả điện di DNA sau khi
tinh sạch thể hiện ở (hình 3.10. B). Trên hình ảnh điện di, các băng DNA hiện
rõ nét, không có dấu hiệu đứt gãy, kích thƣớc phù hợp và đặc biệt là đã không
còn dƣ lại mồi ở phía dƣới. Điều đó chứng tỏ DNA lúc này đã hoàn toàn tinh
khiết, đủ điều kiện để tiến hành giải trình tự gen.
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Trong 60 mẫu đƣợc khảo sát tại đất trồng cam tại xã Minh Tân huyện Quỳ
Hợp, Tỉnh Nghệ An , năm 2011 có tổng số 16 kiểu hình bào tử AMF đƣợc
tìm thấy thuộc 6 chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis,
Glomites và Gigaspora; 3 họ: Acaulosporaceae, Glomaceae và
Gigasporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae và Gigasporinae.
Số lƣợng và thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở Quỳ
Hợp Nghệ An thay đổi theo giống cam, tầng đất.
Thay đổi theo giống cam: Số lƣợng, thành phần loài AMF cao nhất
với giống cam Xã Đoài ( 16 AMF), Vân Du (9 AMF), V2( 12
AMF).
Thay đổi theo độ sâu tầng đất: Phẫu diện 0 – 20 cm có số lƣợng
loài và thành phần đa dạng nhất (16 loài), kế đó là tầng 20 – 40 cm
(12 loài) và thấp nhất là tầng 40 – 60 cm (chỉ có 9 loài).
2. Cây cam con có khả năng sinh trƣởng và phát triển về chiều dài thân ,rễ và
số lƣợng rễ khi nhiễm nấm Mycorrhiza so với cây đối chứng.
3. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã tách chiết DNA từ bào tử Mycorrhiza trong đất
và rễ cam. Đã nhân đƣợc đoạn gen 18S rRNA có kích thƣớc khoảng 0,5 kb từ
dịch chiết bào từ nấm và rễ cây nhiễm Mycorrhiza.
Kiến nghị
* Tiếp tục nghiên cứu phân tích giải trình tự đoạn gen 18S rRNA để định
danh chính xác tên loài AMF.
* Tiếp tục nghiên cứu hƣớng thu sinh khối bào tử Mycorrhiza để tạo phân bón
cho cây cam.
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Sỹ Giao (1976). Ảnh hưởng của rễ nấm đối với sinh trưởng và
phát triển của cây non thông nhựa. T/s Lâm nghiệp 25, số 12/1976, tr
21 - 36.
2. Nguyễn Sỹ Giao, Nguyễn Thị Nhâm (1977). Bước đầu nghiên cứu ứng
dụng một số loại nấm cộng sinh thuần chủng đ ể tạo rễ nấm ở cây con
thông nhựa (Pinus Merkussi). Kỉ yếu khoa học, 1976 - 1977, Viện
Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, tr 98 – 103.
3. Nguyễn Sỹ Giao, Nguyễn Thị Nhâm (1980). Nghiên cứu bệnh vàng còi
cây Thông nhựa, dựa vào qui luật cộng sinh với nấm. Kỉ yếu Khoa học
1970 -1980. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, tr 216 – 224.
4. Nguyễn Sỹ Giao và cộng sự (1998). Viện Thổ nhƣỡng Nông hoá, Viện
Lâm Nghiệp, Viện Công Nghệ Sinh, hội thảo về nấm rễ Mycorrhiza.
5. Nguyễn Hồng Hà, Trịnh Thị Thu Hà, Nguyến Thị Hồng Hải, Nguyễn
Ngọc Cƣờng, Trần Ngọc Ninh (2003). Thu thập bào tử nấm cộng sinh
trong vùng rễ quyển cây dược liệu. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn
quốc, Hà Nội 2003, tr 238 - 240.
6. Nguyễn Viết Hiệp (2008) , phân bố nấm rễ cộng sinh Arbuscular
mycorhiza fungi trong đất trồng chè ở Thái Nguyên. T/c Khoa học đất,
số 29, tr 17 – 23.
7. Trần Văn Mão – sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích tập 2. Nxb
Nông Nghiệp, Hà Nội 2004 tr 247-251.
8. Nguyễn Thị Minh (2005). Phân lập và tuyển chọn nấm rễ Arbuscular
mycorhizae để xử lý cho cây trồng. T/c Khoa học đất, số 23/2005, tr 46
-51.
52
9. Nguyễn Thị Minh (2007). Ảnh hưởng của một số loại phân hữu cơ đến
sự thiết lập mối quan hệ cộng sinh của nấm rễ Arbuscular mycorhizae,
Gigaspora margirita và sự sinh trưởng của cây chủ. T/c Khoa học đất,
số 28, tr 27 - 31.
10. Nguyễn Đình Quyến – vai trò của Mycorrhiza trong nền Nông – Lâm
nghiệp hiện đại, hội thảo về nấm rễ Mycorrhiza. Viện Thổ Những
Nông Hóa, 11/2004.
11. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp (2004), nghiên
cứu, áp dụng kỹ thuật phát triển cộng sinh Mycorrhiza cho một số cây
trồng chính tại một số vùng sinh thái phục vụ cho sản xuất nông nghiệp
bền vững, báo cáo kết quả nghiên cứu 2004. Viện Thổ Nhƣỡng Nông
Hóa, Hà Nội 12/2004.
12. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp, Nguyễn Thị
Nga (2005). Nấm rễ nội cộng sinh (VAM) và quần thể vi sinh vật trong
đất trồng bưởi đặc sản Đoan Hùng – Phú Thọ. T/c Khoa học đất, số
23, tr 42-46.
13. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp (2006). Khả
năng nhân bào tử nhờ các cây ký chủ của 3 chủng nấm rễ nội cộng
sinh (Vesicular Arbuscular mycorhiza) SHM 4-DH16, SHM 04-DH47
và SHM 04-TC 139 phân lập từ đất Việt Nam. T/c Khoa học đất, số 24,
tr 33 - 37.
14. Phạm Quang Thu và Nguyễn Đức Thắng (1998). Bước đầu nghiên cứu
thành phần loài nấm ngoại cộng sinh với một số loài Thông ở Việt
Nam, Thông tin khoa học Lâm nghiệp 1.
15. Phạm Quang Thu (1999). Ứng dụng vi sinh vật cộng sinh trong việc
sản xuất cây con ở vườn ươm. Tạp chí Khoa học, Công nghệ và Quản lí
Kinh tế, Nông nghiệp và Công nghiệp Thực phẩm.
53
16. Phạm Quang Thu (2002) - Sử dụng nấm cộng sinh và vi sinh vật phân
giải phốt phát để sản xuất cây con Thông nhựa chất lượng cao ở vườn
ươm. Bản tin trồng mới 5 triệu ha rừng.
17. Nguyễn Hoàng Yến (2007). Phân bố nấm nội cộng sinh với loài Sao
đen (Hoperata Odorata Roxb) tại tỉnh Đồng Nai. Luận văn Thạc sỹ
Khoa học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
Tiếng nƣớc ngoài
18. Abbott L. K, Robson A. D. (1982). Infectivity of vesicular Arbuscular
Mycorrhiza Fungi in agricultural soils. Aust J. Agric Res. 33, pp. 1049
– 1059.
19. Bagyaraj D. J. (1984). Biological interactions with VA mycorrhizal
fungi. In: VA mycorrhizae. Bailey C. L. and Mansfield J. W. CRC
Press, Boca Raton, Florida, USA, pp.131 - 154.
20. Bali V, Mammta J, and Mukerji T. (2002). Effect of VAM fungi on
Fusarium wilt of cotton and jute. ACOM 1, University of Madras, p. 2.
21. Barea J. (1982). Production of plant growth – regulating substances by
VAM fungus Glomus mosseae. Applied and Environmental
Microbiology. Vol 43, No 3, pp. 810 - 813.
22. Boddington C. L, Dodd, J. C. (2000). The effect of agricultural
practices on the development of indigenous Arbuscular Mycorrhiza
Fungi I; Field studies in an Indonesian ultisol. Plant and Soil. 218,
137-144.
23. Brundrett M. (2004). Diversity and classification of mycorrizal
associations. Biol. Rev. 79, pp. 473 – 495.
24. Brundrett M. (1996). Working with Mycorrhiza in Forestry and
Agriculture. Canberra, Australia, pp 141 - 252.
54
25. Daniels B. A, Skipper H. D. (1982). Methods for recovery and
quantitative estimation of propagules from soil. In: Schenck NC (ed)
Methods and principles of mycological research. The American
Phytological Society, St. Paul, MN, pp 29 – 35.
26. Dehne J. (1982). Interaction between vesicular-Arbuscular Mycorrhiza
Fungi and plant pathogens. Phytopathology, 72: 1115 – 1118.
27. Dirk R. (2003). Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza Fungi, pp.21 – 28.
28. Fa Y. W, Zhao Y. S. (2008). Biodiversity of Arbuscular Mycorrhiza
Fungi in China: a Review. Advances in Environmental Biology, 2(1):
pp. 31 - 39.
29. Friese C. F, Koske R. E. (1991). The spatial dispersion of spores of
vesicular-Arbuscular Mycorrhiza Fungi in a sand dune: Microscale
patterns associated with the root architecture of American beachgrass.
Mycological Research. Vol. 95, No. 8, pp. 952 - 957.
30. Gerdemann J. W. (1968). Vesicular-arbuscular mycorrhizae and plant
growth. Annual Review of Phytopathology 6, pp. 397 - 418.
31. Gerdemann J. W. (1975). Vesicular-arbuscular mycorrhizae. In: The
development and function of roots. (Eds. JG Torrey and DT Clarkson).
Academic Press, New York, USA, pp 575 - 591.
32. Gerdemann J. W, Nicolson T. H. (1963). Spores of mycorrhizal
Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting.
Transaction of the British Mycological Society 46, pp. 235 - 244.
33. Harley J. L. (1959). The biology of mycorrhiza. Leonard Hill, London,
UK
34. Hayman D. S. (1983). The physiology of vesicular arbuscular
endomycorrhizal symbiosis. Canadian Journal of Botany 61, pp. 944 –
963.
55
35. Kormanik P.P, McGraw A. C. (1982). Quantification of vesicualar
arbuscualar mycorhizae in plant root. In: Scheck N. c. 9ed): method
and principles of mycorrhizal reseach. The American Phytopathological
Society, St Paul, pp. 37 – 45.
36. MacMahon, Warner (1984). Dispersal of mycorrhizal fungi: Processes
and agents. In: S.E. Williams and M.F. Allen, Editors.
37. Maxam A. M, Gilbert W. (1977). A new method for sequencing DNA,
Proc Natl Acad Sci U S A 74, 560-564.
38. Morton J. B. (1988). Taxonomy of mycorrhizal fungi: Classification
nonmenclature and identification. Mycotaxon 32, pp. 276 – 324.
39. Morton J. B, Benny G. L. (1990). Revised classification of Arbuscular
Mycorrhiza Fungi (Zygomycetes): A new order Glomales, two new
suborders, Glominae and Gigasporinae, and two new families,
Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an emendation of
Glomacease. Mycotaxon 37, pp. 471 – 491.
40. Moss E. B. (1959). Observation on the extramatrical mycelium of
vesicular-arbuscular endophyte. Transactions of the British
Mycological Society 42, pp. 439 – 418.
41. Mosse. B, Hepper. C. M. (1975). Vesicular-arbuscular infections in
root organ cultures. Physiological Plant Pathology 5, 215-223.
42. Newman E. I. (1988). Mycorrhizal links between plants: their
functioning and ecological significance. Advances in Ecological
Researc, 18: 243-270.
43. Phillips J. M, Hayman D. S. (1970). Improved procedure for clearing
roots and staining parasitic and vesicular Arbuscular Mycorrhiza
Fungi for rapid assessment of infections. Trans Br Mycol Soc 55:158–
161.
56
44. Roy A. K, Kumari R, Chakraborty B. N, Chakraborty U. (2002). VA
mycorrhizae in relation to growth of different tea varieties. Mycorrhiza
News 14, 9-11
45. Ram Reddy S, Pavan K.Pindi and Reddy S. M, 2005. Molecular
methods for research on Arbuscular Mycorrhizal fungi in India:
problems and prospects. Current Science, Vol.89, No.10, 2005, pp
1699-1706.
46. Redhead J. F. (1980). Mycorrhiza in Natural Tropical Forest. In:
Tropical Mycorrhiza research. (ed.). P. Mikola. Clarendon Press,
Oxford.pp.127-142.
47. Schenck N. C, Perez Y. (1990). Manual for the identification of VA
mycorrhizal fungi. 3rd edn. Synergistic Publications, Gainesville, FL.
48. Schonbeck F, Dehne H. (1989). VA – Mycorrhiza and plant health. in
“Interrelationships between microorganisms and plants in soil”.
Czechoslovak Academy of Sciences, Praha 1989, pp. 83-93.
49. Shipra Singh, Anita Pandey, Bhaskar Chaurasia and Lok Man S. Palni
(2008). Diversity of Arbuscular Mycorrhiza Fungi associated with the
rhizosphere of tea growing in „natural‟ and „cultivated‟ ecosites.
Canadian Journal of Microbiology, 1993, 39(6): pp 567-575.
50. Schuybert A, Hayman D. S. (1978). Plant growth responses to
vesicular –asbuscular mycorrhizae: XVI. Effectiveness of different
endophytes at different levels of soil phosphate. New Phytologist
103/1978, pp. 79-80.
51. Smith S.E, D.J. Read (1997). Mycorrhizal Symbiosis. 2nd
edition.
Academic Press, New York.
52. Sparling G. P, Tinker P. B. (1975). Endomycorrhizas. Academic,
London, pp. 545 – 560.
57
53. Taylor T. N, Remy W, Hass A, and Kerp H. (1995). Fossil arbuscular
mycorrhizae from the Early Devonian. Mycologia 87, pp. 560 – 573.
54. Ted S. J. (2000). – The instant expert guide to Mycorrhiza: The
conection for functional enocosystems.
55. Ted S. J, Chiristopher Uhl (1983). Mycorrhizae in the rain forest at San
Carlos De Rio Negro, Venezuaela. Acta Cient Venezolana 34/1983, pp.
233-237.
56. Tommerup I. C. (1992). Method for study of the population biology of
vescular Arbuscular Mycorrhiza Fungi. In Method in Microbiology.
Vol. 24 Techniques for the study of mycorrhiza. Acedemic press,
London, pp. 23-51.
57. Tortora J, Gerard (2002). Microbiology: An Introduction 1992.
Benjamin /Cummings Publishing Company, 810pages with
illustrations.
58. Trappe J. M, Schenck N. C. (1982). Taxonomy of the fungi forming
endomycorrhizae. In: Methods and Principles of Micorrhizal Research
(N. C. Schenck, ed.), The American Phytopathological Society, St.
Paul, p. 1-9.
59. Vancura V, Kunc F. (1989). Interrelationships between
microorganisms and plants in soil. Publishing House of the
Czechoslovak academy of sciences, Praha, 1989.
60. Walker C. (1987). Current concepts in the taxonomy of the
Endogonaceae. In Sylvia, D.M., Hung, L.L. & Graham, J.H. (eds.)
Mycorrhizae in the next decade. IFAS, Gainesville, Florida. Pp. 300 –
302.
58
61. White T. J, (1990). Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA gens for phylogentics. In: Innis MA, Gelfand DH,
Sninsky JJ, White TJ(eds) PCR Protocols:a Guide to Methods and
Applications, pp.315-322 Academic Press, New York.
62. http://www.ffp.csiro.au/research/mycorrhiza/
63. http://www.invam.caf.wvu.edu/
64. http://www.mycorrhiza.ag.utk.edu/
59
PHỤ LỤC
Hình 2.3. Thu mẫu đất và rễ cam tại Quỳ Hợp - Nghệ An
Hình 2.4. Sàng và lọc đất qua rây
Hình 2.5. Ly tâm dịch AMF(ảnh trái) và lọc hút chân không mẫu (ảnh phải)
60
Hình 2.6. Soi mẫu, phát hiện bào tử AMF nhờ kính hiển vi
Hình 2.7. Chụp ảnh bào tử AMF qua kính hiển vi
Hình 2.8. Đếm bào tử qua ô (ảnh trái) và giữ giống bào tử (ảnh phải)
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng –
Trƣởng Phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình hƣớng
dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi
trong quá trình làm việc và hoàn thành luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến Ths. Nguyễn Viết Hiệp, Phó Trƣởng
bộ môn vi sinh vật – Viện Thổ nhƣỡng nông hóa. Đã giúp đỡ tôi trong quá
trình làm thí nghiệm tại phòng thí nghiệm. Qua đây tôi cũng xin bầy tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến các cô, các chị và các em trong Phòng Vi sinh vật đất đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô tham gia giảng dạy tại Khoa
sinh, Trƣờng Đại học khoa học, Đại Học Thái Nguyên.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, ngƣời thân và bạn bè đã chia
sẽ những khó khăn trong cuộc sống và công việc để tôi hoàn thành tốt luận
văn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Thái nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Học viên
Lê Thị Thủy
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số
liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào khác.
Thái nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Học Viên
Lê Thị Thuỷ
iii
MỤC LỤC
Lời cám ơn ................................................................................................................... i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................ v
Danh mục bảng trong luận văn .................................................................................. vi
Danh mục hình trong luận văn ................................................................................ viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA
FUNGI (AMF) .................................................................................................. 3
1.2. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA .................................................................... 4
1.3. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF ..................................................................... 8
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
MYCORRHIZA .................................................................................................. 9
1.5. SỰ PHÁT TÁN BÀO TỬ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA AMF ĐỐI VỚI
THỰC VẬT CHỦ ........................................................................................... 11
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMF TRÊN THẾ GIỚI BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ..................................................................... 15
1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM ........................................... 17
CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 20
2.1. NGUYÊN LIỆU ....................................................................................... 20
2.1.1. Mẫu ....................................................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................ 20
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 21
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 21
2.2.1. Phƣơng pháp tách bào tử AMF……………………………………….21
iv
2.2.2. Tách DNA tổng số……………………………………………………25
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose………………………………………..25
2.2.4. Kỹ thuật PCR…………………………………………………………27
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR……………………………………………..29
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………….31
3.1. PHÂN LOẠI AMF TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU…………….31
3.1.1. Hình thái và cấu tạo bào tử AMF trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp -
Nghệ An……………………………………………………………………..31
3.1.2. Thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở Phủ Quỳ thuộc xã Minh
Tân- huyện Quỳ Hợp - tỉnh Nghệ An ............................................................. 36
3.1.3. Đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam Quỳ Hợp – Nghệ An..... 36
3.2. PHÂN BỐ CỦA AMF THEO GIỐNG CAM ......................................... 37
3.3. PHÂN BỐ CỦA AMF THEO TẦNG ĐẤT ............................................. 40
3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CỘNG SINH AMF TRÊN CÂY CAM ......... 43
3.5. NHÂN ĐOẠN GEN 18S rRNA .............................................................. 46
3.5.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 46
3.5.2. Nhân đoạn gen 18S rRNA .................................................................... 47
3.5.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 50
Kết luận ........................................................................................................... 50
Kiến nghị ......................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51
PHỤ LỤC …………………………………………………………………...59
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A : Arbuscular
AMF : Arbuscular Mycorrhiza Fungi
DNA : Axit Deoxyribonucleic
dNTP : deoxynucleoside triphosphate
ECM : Ectomcorrhizas
Kb : Kilobase
PCR : Polymerase Chain Reaction
RADP : Radom Amplified Polymorphism DNA (Phân tích
ADN đa hình đƣợc nhân bản ngẫu nhiên)
RFLP : Restriciton Fragment Length Polymorphis (Phân
tích chiều dài các đoạn DNA cắt hạn chế)
V : Vesicules
VAM : Vesiculer – Arbuscular Mycorrhiza
vi
DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN
Hình 1.1: Sƣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng. ....................................... 4
Hình 1.2: Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF ............................................ 7
Hình 2.1: Bảng mầu so sánh để phân loại nấm Mycorrhiza ........................... 24
Hình 2.2: Chu trình nhiệt PCR ........................................................................ 29
Hình 3.1: Tổng số loài AMF trong các giống cam ......................................... 38
Hình 3.2: Phân bố loài AMF trong chi theo giống cam .................................. 39
Hình 3.3: Tổng số loài AMF theo tầng phẫu diện........................................... 41
Hình 3.4: Phân bố loài AMF trong chi theo tầng phẫu diện ........................... 42
Hình 3.5: Bổ sung AMF lần 1 (ảnh trái), thí nghiệm đối chứng (ảnh phải) ... 43
Hình 3.6: Kết quả nhiểm AMF . ...................................................................... 44
Hình 3.7: Kết quả sinh trƣởng của cam sau 3 tháng bổ sung AMF ................ 45
Hình 3.8: Kết quả nhuộm Tryphan blue AMF ............................................... 46
Hình 3.9: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR . .................................................... 48
Hình 3.10: Điện di thôi gel sản phẩm PCR. . .................................................. 48
vii
DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1.1: Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF ........................... 5
Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu AMF bằng sinh học phân tử [45] ................... 16
Bảng 2.1: Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR .................................................. 20
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 28
Bảng 3.1 kết quả phân loại bào tửvAMF……………………………………..31
Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm trên cây cam con ............................................. 45
