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2014 真菌資源及其永續利用研討會

2014 真菌資源及其永續利用研討會專刊

主 編

張雅君、詹富智、汪碧涵

作 者

安寶貞、朱盛祺、何小曼、吳孟玲、吳信郁、吳雅芳、李芷芸、李涵荺、沈偉強、

沈湯龍、林乃君、林宗俊、林俞廷、林國詞、林駿奇、施佑霖、施欣慧、洪挺軒、

袁國芳、張東柱、張芳陌、莊書婷、莊雅惠、郭建志、陳又嘉、陳昭翰、陳玲儀、

陳啟予、陳錦桐、曾敏南、曾顯雄、黃尹則、黃振文、劉俊揚、劉桂郁、劉廣宏、

歐聰億、蔡志濃、蔡依真、鄭安秀、鄭瑋寧、賴明信、謝松源、鍾仁賜、鍾嘉綾、

魏育慧、蘇慶華、鐘珮哲

(依姓氏筆劃排列)

行 政 院 農 業 委 員 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局

中 華 民 國 植 物 病 理 學 會

編印

中 華 民 國 真 菌 學 會

國 立 臺 灣 大 學 植 物 病 理 與 微 生 物 學 系

中華民國一百零三年十月

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

i

臺灣是一個寶島,高山聳立海洋環繞,自然資源豐富且具生物多樣

性,尤其在自然資源的利用,包括從早期菇類的栽培,至近年來牛樟芝的

研究及生物製劑的發展,均有豐碩的研究成果。

提及真菌資源的利用,以農用生物防治製劑為例,如何有效的研發

真菌資源,是目前農政單位所關切,一種有益的真菌除可創造其價值外,

對生產安全蔬果及環境維護亦有相當的助益,如何善加利用,就須靠專家

學者的鑽研。本次研討會特邀 13 位專家,以真菌之永續利用、多樣性發

展及資源應用三個面向議題進行專題報告,包括安全農業所關切的防治作

物疫病蟲害微生物資材、抗癌資材牛樟芝的有效成分利用及蟲草素醫療應

用等,均為農民及社會大眾所關切,另重要真菌分類上的基礎研究,包括

接合菌、麴菌及長殻菌等,則有助於未來真菌長遠的利用及其應用發展。

為瞭解真菌資源及其永續利用的最新研究發展及應用現況,國立臺

灣大學植物病理學與微生物學系、中華民國植物病理學會及中華民國真菌

學會共同主辦「2014 真菌資源及其永續利用研討會」,藉以匯集專家學者

之意見,作為農政單位未來施政之參考,謹此 致謝。

行政院農業委員會動植物防疫檢疫局 謹誌

中華民國 103 年 10 月

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

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國立臺灣大學生物資源暨農學院自 1928 年設立以來,一直積極發展農

業相關領域之學術研究,持續提升我國農業生產科技之發展,並已成為世

界一流的農學研究機構,這些成就主要都來自於院內所有同仁的努力付

出。終身特聘教授曾顯雄博士,更是其中翹楚,學養俱豐、貢獻宏偉,而

備受師生同仁的敬重。曾顯雄特聘教授於 1983 年自中研院研究員轉任本

校後,轉眼之間已三十春秋。在這段期間,曾特聘教授除了教學之外,更

投入極大心力於真菌學領域的基礎研究,包括真菌多樣性、靈芝基因體及

樟芝代謝體學等,也因而獲得國科會傑出研究獎的肯定。曾有幸與曾特聘

教授同時參與國科會 (現為科技部)「生物多樣性行動計畫」,對老師執行

「臺灣不完全菌之生物多樣性及其資源之永續利用計畫」的成就印象深

刻,並對其編撰「臺灣真菌誌」之用心極表欽佩。此外,曾特聘教授亦將

其研究成果,由農委會或食品工業發展研究所出版真菌分類系列專書,實

為後進學者進修之珍貴參考資料。除了基礎研究成果斐然之外,曾特聘教

授亦甚關注農業永續經營之議題,積極研發以真菌進行病蟲害生物防治,

於線蟲捕捉菌、昆蟲寄生菌及真菌超寄生菌等領域均有深入之探討,也因

其對農業發展之巨大貢獻,實至名歸地獲頒農委會農業優秀人員獎。近幾

年來,更常在臺大校園中看到老師診治樹木病害的身影,也知悉其首開先

例,自英國引進銹病菌防治對森林樹木為害甚劇之小花蔓澤蘭。因為曾特

聘教授對環境生態之關注與投入及貢獻成就,更榮獲臺灣大學 2013 年度

教師社會服務獎的表揚。感謝農委會防檢局支持,植物病理學會與真菌學

會相助本院植物病理與微生物學系舉辦此次研討會,讓曾特聘教授的同道

好友,以及學生門徒有機會將其最新研究成果分享;冀望老幹彌堅,新枝

擴揚,讓臺灣的生物資源能得到妥適利用,農業能永續發展。

國立臺灣大學生物資源暨農學院院長

謹誌

中華民國 103 年 10 月

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

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2014 真菌資源及其永續利用研討會議程表

(曾顯雄特聘教授榮退學術研討會)

時間:103 年 10 月 17 日 (星期五)

地點:臺灣大學凝態中心國際會議廳

主辦單位:國立臺灣大學植物病理與微生物學系、中華民國植物病理學會、中華民國真菌學會

補助單位:行政院農業委員會動植物防疫檢疫局

時間 講題 主講人 主持人

08:15-08:45 來賓報到

08:45-09:00 開幕式暨貴賓致詞

09:00-09:50 真菌之多樣性及其永續利用 曾顯雄特聘教授 徐源泰院長

09:50-10:20 團體照、茶敘

第一節 真菌學之永續發展

10:20-10:50 真菌的多樣角色—以生物防治劑之菌源為案例

黃振文特聘教授

詹富智理事長

汪碧涵理事長

10:50-11:20 臺灣疫病之現況與病害防治 安寶貞研究員兼組長

11:20-11:50 由白色念珠菌單倍體發現到牛樟芝抗癌之歷程—抗黴菌藥物之應用

蘇慶華教授

11:50-12:20 臺灣接合菌之生物多樣性資源 何小曼教授

12:20-13:30 午餐

第二節 真菌多樣性

13:30-13:55 臺灣之麴菌屬資源 劉桂郁研究員

袁國芳主任

劉瑞芬教授

13:55-14:20 臺灣之長喙殼菌類真菌 陳啟予副教授

14:20-14:45 隱球菌有性生殖之多樣性 沈偉強教授

14:45-15:10 臺灣水稻徒長病菌族群之遺傳組成、

病原性及抗藥性分析

鍾嘉綾助理教授

15:10-15:30 茶敘

第三節 真菌資源之應用

15:30-15:55 牛樟芝與香杉芝 PCR 鑑別技術建立 吳孟玲研究員兼組長

黃 昌場長

張瑞璋組長

15:55-16:20 蟲草素在轉譯醫學上之應用 劉俊揚副研究員

16:20-16:45 利用木黴菌搭配拮抗細菌防治草苺萎凋病之效果評估

林乃君副教授

16:45-17:10 提升蟲生真菌逆境耐受能力與致病力之研究

曾敏南副研究員兼課長

17:10-17:30 閉幕式 張雅君教授兼系主任

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目 錄

序 / 行政院農業委員會動植物防疫檢疫局 ...................................... i

序 / 國立臺灣大學生物資源暨農學院院長 ..................................... ii

研討會議程表 ............................................................. iii

真菌之多樣性及其永續利用 ................................................... 2

真菌的多樣角色—以生物防治劑之菌源為案例 .................................. 52

臺灣疫病之現況與病害防治 .................................................. 63

由白色念珠菌單倍體發現到牛樟芝抗癌之歷程—抗黴菌藥物之應用 ................ 84

臺灣接合菌之生物多樣性資源 ................................................ 92

臺灣之麴菌屬資源 ......................................................... 103

臺灣水稻徒長病菌族群之遺傳組成、病原性及抗藥性分析 ....................... 141

牛樟芝與香杉芝 PCR 鑑別技術建立 .......................................... 151

蟲草素在轉譯醫學上之應用 ................................................. 158

利用木黴菌搭配拮抗細菌防治草苺萎凋病之效果評估 ........................... 165

提升蟲生真菌逆境耐受能力與致病力之研究 ................................... 181

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曾顯雄

現職

國立臺灣大學植物病理與微生物學系

終身職特聘教授

學經歷

1969-1971 國立臺灣大學植物病理所 碩士

1974-1976 加拿大麥基爾大學植物科學系 博士

1971-1973 臺灣糖業研究所 助理植病技師

1977-1981 中央研究院植物研究所 副研究員

1980-1981 加拿大高富大學環境生物系 研究員

1981-1983 中央研究院植物研究所 研究員

1983-2006 國立臺灣大學植物病理與微生物學系 教授

1986-1987 美國羅格斯大學植物病蟲害學系 客座教授

1987-1987 美國哈佛大學生物系 客座研究員

1992-1992 美國俄亥俄州立大學 生物科技中心 客座學者

1993-1993 美國農部東區研究中心植物與土壤科學系 客座學者

1999-1999 美國密西根州立大學能源與植物科學研究室 客座學者

2001-2002 中華民國真菌學會 理事長

2001-2004 國立臺灣大學植物病理與微生物學系 系主任

2006-2004 日本岡山大學生物學系 客座教授

2010-2012 中華民國植物病理學會 理事長

專 長

植物病理學、真菌學、線蟲學、微生物學

榮 譽

行政院國科會傑出研究獎 (1990-1996)

行政院國科會特約研究人員獎 (1997-2002)

行政院農委會農業優秀人員獎 (2004/09)

國立臺灣大學院級教學優良教師獎 (2007/09)

國立臺灣大學教師校級社會服務優良獎 (2013/09)

國立臺灣大學校級教學優良教師獎 (2014/09)

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真菌之多樣性及其永續利用

曾顯雄

國立臺灣大學植物病理與微生物學系

通訊作者:曾顯雄 [email protected]

摘要

真菌種類繁多,功能多元,於自然界扮演多重之角色,為應用其有益之生理

活性,並減損其負面影響,遂進行諸多方向之真菌之多樣性探勘和其永續利用,

包括:工業、製藥、生物防治可資應用真菌之分離鑑定、專誌撰寫,或重要植物

防檢疫真菌病原之快速診斷鑑定核酸探針晶片之研發、昆蟲寄生真菌之抗逆境及

提昇病原性之轉型、病原真菌之超寄生菌、松材線蟲之新寄生真菌之探討、引進

入侵小花蔓澤蘭之原產地天敵銹病菌,以進行對環境友善之古典生物防治,或探

討藥用靈芝之交配型或出菇相關基因之選殖、特性界定,以供生物學之基礎學理

探討或建立菇類分子育種平台。此外,也探討牛樟芝之木質素分解酶、抗氧化酶,

及具多功能之萜類化合物生合成途徑基因選殖、表現、功能性分析,以建立未來

代謝體工程平台、生合成具生理活性功能之化合物。

關鍵詞:真菌、多様性、生物資源、生物防治、生物晶片、永續利用

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

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緒 言

真菌為重要之微生物資源,於自然界扮演多重重要角色,其友善利於人類之

益處,如與農園藝林木作物共生,增加其活力、耐逆境之能力,用以防治有害之

昆蟲、線蟲、真菌病原或入侵雜草,或於食品、生物資材、酵素、降血脂、抗生

素、免疫抑制劑、工業醱酵、釀酒、或生物質轉換甚至生質能源之應用等;而真

菌亦為植物四大病原之首,至少一萬種以上之真菌可侵染危害植物造成各種病害,

引起質量之莫大經濟損失,造成儲藏運輸穀物、水果、蔬菜腐敗,或產生有毒之

黴菌毒素,更為人畜之直接或伺機性病原引起黴菌病 (mycosis),尤以不良環境或

免疫能力低下時為甚 (Fig. 1) (49,92)。

植微系在消極作為係為防止或降低真菌所造成之許多負面不良影響和後果,

而在積極作為方面,則應化危機為轉機,化腐朽為神奇;應特別關注真菌之友善、

有益於人類福祉,對其優越之生理活性發揮到極致,以創造全民福祉。

職是之故,臺大植微系應用真菌研究室,從事真菌之多樣性探勘,工業、製

藥、生物防治或重要防檢疫病原之診斷鑑定、專誌撰寫,快速精確核酸生物晶片

研發應用,昆蟲寄生菌、超寄生菌、線蟲內寄生菌或捕捉菌之生物防治之應用以

及藥用靈芝、樟芝交配型、出菇基因、抗氧化、生理活性、基因體等之探討。現

就已往三十年來之探索,略作回顧 (Fig. 2)。

澤田兼吉「臺灣真菌調查報告」之中譯、編審及模式真菌標

本數位典藏

臺灣真菌多樣性之研究肇始於日據時代之澤田兼吉 (Kaneyoshi Sawada,

1883-1950) 以及其共事同仁。澤田氏為日本之真菌學者,於 1908 年來台,任職

於臺灣總督府中央農業試驗所,並同時擔任臺北帝國大學之農業生物系講師教職。

澤田氏於 1908 年至 1945 年臺灣光復止,共 37 年間於全臺進行系統性之調查、鑑

定感染農作物或害蟲之寄生性真菌,嗣后發表「臺灣真菌調查目錄(Descriptive

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Catalogae of Formosa Fingi)」共十一冊,其中第十一冊,係澤田氏往生之後,經

三位日本真菌學者代為整理、編輯、並譯為英文,於 1959 年由臺大農學院正式代

為刊印發表。

「臺灣真菌調查目錄」非常詳細描寫記載隸屬於不同分類群之真菌,包括藻

菌 (鞭毛菌門)、子囊菌、擔子菌、不完全菌,共 870 屬、2464 種,而其中涵蓋

14 屬、862 種臺灣特有之屬、種。此外,也進行重要病原菌,如稻熱病菌、稻徒

長病菌等之接種、病原培養、病原性以及發病生態條件之檢測 (50)。

澤田氏及其同仁所採集超過 4000 份之臺灣真菌搮本,典藏於國立臺灣大學植

微系標本館,另備份典藏於日本國立東京科學博物館。適逢行政院科技部 (前國

科會) 推動「數位典藏與數位學習國家型科技計畫」,遂進行澤田兼吉之臺灣模式

真菌標本之數位典藏計畫,建立典藏於臺灣大學植物病理與微生物學系真菌標本

館之模式標本,以及典藏於日本東京國家科學自然博物館之備份之模式標本之精

確數位影像檔案,以減損珍貴標本歷經歲月、害蟲之侵蝕,失去重要形態構造特

徵,而失去典藏價值。

此外,雖然澤田氏之研究成果奠定臺灣研究真菌相之基礎,但其著作 (1-10

冊),皆以日文發表,閱讀瞭解不易,造成後續研究之障礙和困難;而此文書亦會

氧化、褪色、罹受真菌、害蟲侵蝕,亦需數位典藏,故也邀請臺灣大學日文系多

位同學將 10 冊日文版「臺灣真菌調查目錄」中譯,並邀請嘉南藥理大學陳城箖 (陳

金亮) 博士協助以針筆重新描繪該目錄所附已逐漸模糊不清之圖解 (illustration)。

此等工作皆已順利完成,並與國立臺灣大學出版中心簽約,即將於 2014-2015 年

刊印出版 (11)。此中譯本,深信將提升本土專家學者對於此一領域之認知、興趣,

並可為未來深入探討臺灣真菌多様性之學術基礎,以及對於本土各種不同植物病

原之地理分布、發病季節、發病生態、病原特性、形態、構造特徵,分類有更深

入之瞭解。未來,若有研究經費挹注,更應將其譯為英文版之「臺灣真菌調查目

錄」和世界接軌,也讓國際真菌學界認知臺灣此一領域於 20 世紀初期,在真菌多

様性研究工作及其貢獻。

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臺灣真菌多様性之探勘

承先啟後,臺大植微系應用真菌研究室及其合作研究機構、系所,也接續「臺

灣真菌多樣性」之調查、分離、保存、鑑定等研究,並陸續刊印、發行臺灣麴菌、

青黴菌、蟲生真菌以及中文版之臺灣線蟲捕捉菌、進口植物或其產品潛在之病原

真菌、大地精靈-大型真菌百選等鑑定專誌,以及多篇相關學術期刊論文之發表,

以提供學界或相關單位參考 (2, 13, 19, 22-33, 39, 45, 46-48, 57, 59-67, 77-84, 86,

88, 93, 94) (Fig. 3)。

臺灣真菌誌 (Mycobiota Taiwanica) 第三版電子書發行 (英文版)

於第二次世界大戰之後,臺灣光復,1985-1999 年間,臺灣在行政院國科會

之大力支持下,由臺灣大學植物系陳瑞青教授所領導之「臺灣真菌相,Taiwan

Fungal Flora」之群體研究計畫,得以順利執行。其間在多名海外學成歸國或國內

培育之真菌學者之參與研究,於此相關領域,有極佳之進展和成果展現。計至 1999

止,共有 5,396 臺灣真菌物種被記載描述,其中有 2,932 種、407 屬,包括 4 新科、

20 新屬、387 新種,皆係自澤田兼吉之後,由本土之真菌學者所累積之亮麗研究

成果 (34),此也提供素材,奠定編輯「臺灣真菌誌」之基礎。

臺大植微系應用真菌研究室,於國科會所支持之「生態永續群體計畫」下,

執行「臺灣真菌誌」之編輯和出版,邀約國内與真菌多樣性研究相關之專家學者

共 26-31 名,撰寫描述不同分類群之臺灣本土真菌,分別於 2005 年刊印第一版,

英文版「臺灣真菌誌」,2008 年發行第二版之電子版「Fungal Flora of Taiwan」,今

年 2014 年底即將刊印發行第三版電子版之臺灣真菌誌「Mycobiota Taiwanica」。

目前第三版之臺灣真菌誌記載 2051 種廣義之臺灣真菌,包括類真菌之雜色藻

界以及原生動物門之成員,這2051種係曾被描寫過約6,000種臺灣真菌之一部份。

本八冊之臺灣真菌誌內容涵蓋了 160 種真正粘菌、3 種原生網狀粘菌、12 種細胞

網狀粘菌、3 種領鞭毛蟲黏菌、55 種卵菌、45 種壺菌、82 種結合菌、13 種球囊

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菌、1028 種子囊菌以及 647 種擔子菌;所有分類群之描寫皆來自於所採集之標本

或由所採集標本分離之純粹培養菌株;標本之採集時間久遠,且棲地涵蓋本島之

不同生態系,標本之種類包括土壤、底泥、沉積物、枯枝落葉、莖、植被、種子、

昆蟲或蜘蛛蟲體、草食性動物糞物,擔子果、子囊果等大型之產孢構造,或其它

發霉之農林作物基質以及溪流、池塘、紅樹林、海邊之水體,或由水體誘釣、離

心所得之菌體。

本真菌誌有關菌類之鑑定主要依據其微觀或巨觀之形態構造特徵,偶而也應

用生理、生化試驗所獲得之資料,其分類體系之安排主要係依據英國聯邦國際農

業研究所 2008 年第 10 版之真菌學辭典為準,所有描寫物種之學名皆經

Mycobank、Index Fungorum 之真菌網站之資料庫比對修正。本誌之數位電子檔也

將公開陳示於新竹食品工業發展研究所 (http://www.firdi.org.tw/),以及中研院生

物多樣性中心網站 (http://biodiv.sinica.edu.tw/) 以供查詢並與國際相關網站接軌。

稍後將繼續撰寫編輯其餘之臺灣真菌,並提供分類群之檢索表以供鑑定參酌 (79)

(Fig. 4)。

重要防檢疫真菌病原之診斷鑑定及其核酸探針晶片研發

炭疽病菌 (Colletotrichum) 之快速診斷鑑定之寡核苷酸微陣晶片

傳統上炭疽病菌屬 (Colletotrichum) 之鑑定主要依據植物寄主範圍及形態構

造特徵,但常因特徵重疊導致分類混淆和鑑定困難,甚至利用單一基因當為分子

標記,用以診斷鑑定不同種的炭疽病菌,但因序列彼此相似度太高、解序力低而

無法區別並釐清親緣關係。目前多基因座分析為探討炭疽病菌類緣及種間鑑定之

主要方法,但需耗費較多人力、物力與時間。為克服此種障礙,遂進行探討與致

病性相關之黑色素生合成基因,在炭疽病菌診斷鑑定及類緣關係應用之可能性。

研究結果顯示炭疽病菌屬之黑色素生合成基因 Scytalone dehydratase (SCD)

在種間相似度為 70~100%,而 1,3,8-trihydroxynaphthalene reductase (THR) 則為

78~100%,相似度不高,有利於類緣分析及種間鑑定。此外,兩基因皆具有較長

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

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片段的內插子 (intron),也有利於設計寡核苷酸探針。分別應用 SCD (651 bp) 及

THR (1,286 bp) 基因片段,以 RaxML 之最大似然性分析,建構 59 種代表性炭疽

病菌,皆可將其區分為 9 個支序群 (clade),且類緣樹末端種間分支少有多支性,

顯示此二基因皆可用以區辨不同種之炭疽病菌。

利用 SCD 進一步探討感染草苺、紅棗之 51 株炭疽病菌分離株,47 株屬於

gloeosporioides clade,4 株則屬 boninense clade,其病原皆非已往所記載之 C.

gloeosporioides、C. acutatum、C. theobromicola (syn. C. fragariae),其中除 C.

asianum/C. fructicola、C. boninense 外,位在 gloeosporioides clade 中出現頻率 89%

之菌株可能為一新種。另外 ML443、ML463、ML348 對草苺之病原性也經柯霍氏

法則 (Koch's postulates) 證明。此分離株可以感染草苺,並造成草苺冠部褐化、

全株萎凋。

此外,利用黑色素生合成基因 SCD,所完成設計之寡核苷酸生物晶片,可鑑

別 28 種涵蓋國內外嚴重危害具有經濟價值農園藝作物之重要炭疽病菌。也應用

SCD 基因當為炭疽病菌分子標記,試圖解決由食品工業研究所之生物資源保存及

研究中心所保存之 26 株炭疽病菌身分及分類問題,並提出應修訂的菌株及可能為

特有種之名單。未來將進一步蒐集文獻序列,分析更多炭疽病菌菌株,應用黑色

素生合成基因或多基因座分析釐清此 26 株炭疽病菌株之屬性 (4)。

本研究結果顯示黑色素生合成基因可資應用於炭疽病菌屬之類緣分析,而所

完成設計之生物晶片,未來將有助於炭疽病菌之防檢疫、生態學、病害防治管理

及流行病學等研究 (4)。

木層孔菌屬 (Phellinus) 防治策略芻議及其它樹木重要真菌病原之診斷鑑定之寡

核苷酸微陣晶片研發

林木褐根病在臺灣為一古老病害,遠於 1928 年日據時代,隸屬於總督府中

央農業試驗所之真菌學者,澤田兼吉 (Kaneyoshi Sawada) 即已記敘此病於龍眼、

金露花、黃梔花、裂瓣朱槿、繡球花、茄冬、樟樹、變葉木、虱母子草等植物之

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發生、為害,其後至今之調查顯示,此病在臺灣以及離島,多達 120 種以上之植

物寄主被發現,此病隨機分布、多點感染,主要傳播途徑係藉由根系接觸,發病

慢、傳播慢、早期病徵不明顯,難以診斷,而後期防治又難以成功,為其特徵。

林木褐根病經由平面或立體之大眾媒體之鉅量傳播,以及無數褐根病後期診

斷、鑑定講習班之講習、推廣,其實已是家喻戶曉、深入人心之全民教育,褐根

病目前被認為是臺灣或離島,平地海拔 1,000 公尺以下,林木、果樹或觀賞植物

之「世紀黑死病」。

褐根病之防治方法,雖有多種被提及,但目前廣為推行之處理方式為「邁隆

(Dazomet)」在罹病植株移除後之大量施用燻蒸,以及再種植前之「再燻蒸」。爰

美國環境保護署 (Environmental Protection Agency) 在 2008 年 7 月 10 日,於紅

皮書 (Red Fact Sheet) 開宗明義即已指出「邁隆」為廣泛性殺生劑 (biocide),可

用以殺滅真菌、細菌、藻類、線蟲,甚至雜草;而主要殺生機制在其於土壤施用,

加水分解後,產生具高揮發性、殺生性之異硫氰酸甲酯 (methyl isothiocyanate,

MITC),但若吸入或接觸 MITC,皆會刺激眼睛,對呼吸系統造成不良影響,此

外,亦為皮膚之致過敏原,對於無保護之哺乳類、鳥類、水棲生物,暴露於「邁

隆」亦為劇毒。

2011 年 6 月 4 日,以及 7 月 26 日,台北平面媒體,分別以顯著之標題報導

「市府 4 年砸 1 億,卻擋不住褐根病,束手無策?」,以及「褐根病蔓延,大安森

林公園拉警報」;其他各縣市政府,亦應有類似經驗。顯然,廣泛性施用「邁隆」

燻蒸處理,除伐除樹木外,徒勞無功,無法滅絕褐根病菌及防止其蔓延。目前所

推薦之防治方法,長久持續大量施用燻蒸劑,衍生抗藥性之褐根病菌菌系勢所難

免,而且對生態系破壞性高,對於人、畜、野生物、微生物多樣性之滅絕之負面

作用不容忽視,更何況也不符防治成本效益,且不符具深根系、廣根系特性林木

之病害防治原則。此外,也和國家所標榜之無毒島、有機農業、生態永續經營之

理想、願景背道而馳,亦和地球村之綠色環保之趨勢大相逕庭。

林木感染褐根病由侵染至顯現明顯病徵,通常費時數年至數十年,感染末期

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根部組織 60% - 80% 以上皆已被殖據、分解,縱然於根圈土壤施用石灰、尿素,

以及其他殺菌劑,通常回天乏術,無法獲得防治成效;倘若以系統性殺菌劑 [普

克利 (propiconazole)、三泰芬 (triadimefon)、撲克拉 (procanazole)、三賽唑

(tricycloazole)、亞托敏 (azoxystrobin)、減普寧 (mepronil)、滅達樂 (metalaxyl)]

進行根、莖基部點滴灌注,可藉擴散或輸導作用,反而較易達到觸殺病原效果。

職是之故,對於珍貴樹種或老樹先行施以預防性藥劑灌注,或定期以靈敏之分子

標記進行檢測,驗證有病原存在時,立即進行藥劑灌注,應可事半功倍降低成本,

並減少藥劑對於根圈土壤之汙染和對生態系之破壞。

現行林木褐根病防冶標準作業流程,亦推薦水淹沒法,然於自然林地,就罹

病林木或已枯死之林木長期浸水處理,常受水源、地貌、地質所限,通常難以執

行,倘若處理對象為尚未枯死之林木,除榕樹或水生樹木外,長期浸水,就學理

而言,亦不利於其生長,很可能導致根系缺氧、窒息,或遭受其他喜濕性之卵菌

病原侵染,而加速其死亡;但水淹沒法用於清除罹患褐根病殘根後之罹病地根系

土壤,則為合適之措施。

真菌,包括林木褐根病菌 (Phellinus noxius) 及層根腐病菌 (Phellinus werii),

皆係經地球之長期生態選汰、演化後,可適應之棲息物種 (inhabitants),前者盛

行於熱帶、亞熱帶,而後者則盛行於溫帶、寒帶,故不論於感染林木、果樹、觀

賞植物,皆呈分散、點狀分布,或於人工純林之感染中心往外擴散;故生態條件

適合時,造成發病、感染,此純屬必然;就此原則衡量,事實上無法滅絕此褐根

病之病原,只能由樹種、栽培、管理、經營等途徑,降低發病率,經由物種自然

演替,維持生態系多樣性平衡。基於上述,將所獲致之結論和建議陳述於下:

樹木高齡化自然枯死、環境逆境壓力、其他根系病原、或其他根系病原和褐

根病菌複合感染,因而導致樹木之枯萎,皆需加以釐清,以免誤診。

褐根病病原菌殘存於根系,故徹底清除殘留根部組織,植穴中長期 (3-6 個月)

陽光曝曬、乾燥根域,即可減少感染源,並降低其感染潛勢 (自然生態撫育

法),再強化生態復育,即有利於病害蔓延之遏止。

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褐根病病原不殘存於土壤,並且樹木根系通常分布既深且廣,故用「邁隆」

燻蒸根域土壤不具合理性;再植前之再燻蒸,更不利於再植植物之生長、發

育。

「邁隆」為廣泛性殺生劑 (biocide),會滅絕土壤之微生物,破壞生態,永難

恢復。此外,也和國家所標榜之無毒島、有機農業、生態永續經營之理想背

道而馳,亦不符地球村之綠色環保趨勢。故「邁隆燻蒸法」之繼續推廣使用,

有待商榷。

林木罹患褐根病,於感染後期呈現明顯病徵,此時於根圈施用系統性殺菌劑

難以收致防治成效。

就罹病林木或於已枯死林木之林地長期浸水處理,常受水源、地貌、地質所

限,通常難以執行;倘若處理對象為尚未枯死之林木,除榕樹或水生樹木外,

長期浸水,亦不利於其生長,且易誘發其他喜濕性病原侵染,更易導致林木

枯死;但水淹沒法用於清除罹患褐根病殘根後之罹病地根系土壤,則為合宜

之措施。

褐根病感染點隨機分佈,阻絕、減絕感染不易;除根系嫁接傳染外,擔孢子

之長距離分散傳播,機率或許不高,但隨著子實體之出現頻率增加,此可能

性不能排除,此等更影響「邁隆」之區域性燻蒸,難以收到遏止病原擴散之

預期成效。

結合早期快速診斷、鑑定、早期治療,以及生態撫育、種植抗病、耐病樹種、

合理栽培管理、友善之化學藥劑、生物防治、抗病育種、抗病單株選植等技

藝,進行綜合病害管理 (Integrated Disease Management,IDM),應為上策。

此外,為早期快速診斷、鑑定、早期預防、治療已罹病但病徵不明顯,無病

兆,或具歷史、文化、景觀價值之珍貴樹木,或為造林,都市綠美化林苗之

苗木認證,也己完成研發木層孔菌屬 (Phellinus) 及其它樹木重要真菌病原之

診斷鑑定之寡核苷酸微陣晶片 (6,8,12,53,90) (Fig. 5-6),以供學界或林務、防

檢單位參酌應用。

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應用蟲生真菌生物防治農林作物害蟲之應用

蘇鐵白輪盾介殼蟲舆銀葉粉蝨之真菌性天敵調查與其在生物防治潛能之評估

蘇鐵白輪盾介殼蟲 (Aulacaspis yasumatsui Takagi),於 2001 年在臺灣北部被

發現後,逐漸往南部傳播感染至一般庭院、校園之蘇鐵,此外甚至傳播至東部台

東紅葉村之台東蘇鐵 (Cycas tailungensis) 自然保護區內。蘇鐵白輪盾介殼蟲是臺

灣外來種,對於臺灣特有種臺東蘇鐵危害嚴重導致大量枯萎。臺東自然保護區內

地形崎嶇,施用化學藥劑困難、成本高,並且有污染水源之虞,因此尋求生物防

治似為較佳之策略。

另外,銀葉粉蝨 (Bemisia argentifolii) 和白輪盾介殼蟲皆為同翅目,是多年

來為害洋香瓜及其他瓜類之重要害蟲,且是傳播多種植物病毒的媒介昆蟲,故本

實驗也將其視為防治目標之一。蟲生真菌常被開發為真菌性殺蟲劑,施用於田間

對環境影響小也可有效控制害蟲族群數量。

自林間採集受白輪盾介殼蟲嚴重感染之蘇鐵葉片,剪枝後以濕室培養數日後

分離蟲體上可能之蟲生真菌,以形態、分子特徵進行鑑定。除此之外,為蒐集足

夠之生物防治候選菌株,亦針對粉蝨以及臺灣各林地,進行採集以及分離可利用

之蟲生真菌。

自臺灣各地共採集 19 種蟲生真菌,而其中在臺東蘇鐵保護區內發現之

Simplicillium lanosoniveum、Torrubiella luteorostrata、Fusarium coccophilum、

Myriangium duriaei 是首次被發現的白輪盾介殼蟲生物性天敵。對其中 S.

lanosoniveum、T. luteorostara、F. coccophilum 以及 Isaria javanica (Paecilomyces

javanicus) 進行生物防治潛能評估後發現,I. javanica 在寄主範圍、生長速率、產

孢能力表現皆優於其他三者。至於 F. coccophilum,其在各類培養基中生長緩慢,

各菌株表現差異大,且病原性弱,評估後較不建議使用於生物防治。而酵素測定

實驗顯示,S. lanosoniveum 可產生最多的蛋白質分解酵素和脂質分解酵素。

在白輪盾介殼蟲接種試驗當中,相對於對照組在六天後達到 50% 死亡率,

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四種蟲生真菌皆可使 90% 的介殼蟲死亡。而粉蝨族群在接種此四種蟲生真菌後

十一天,和對照組相比,只有 T. luteorostara 表現優於對照組,可以使 50% 的粉

蝨族群死亡。另外,在小規模的產孢試驗中,蟲生真菌在以燕麥做為基質的培養

基中產孢狀況最好,並以 I. javanica 最為明顯。綜觀四種蟲生真菌之評估,I.

javanica 做為白輪盾介殼蟲生物防治劑之潛力最大,未來可以藉由劑型研發以及

最佳化接種方式、施用時機或配合其他防治措施,以提升其致病力和防治效力

(16)。

轉殖昆蟲寄生菌黑色素生合成基因以增加其抗逆境及病原特性

蟲生真菌被應用於生物防治工作已有數十年,然而這些真菌在田間之應用成

效並不穩定,其主要原因為環境逆境所造成,這些逆境包括紫外線幅射、極端溫

度及乾燥。為解決此瓶頸,本研究由磚格孢菌 (Alternaria alternata) 中選殖出

DHN-黑色素的生合成基因 (polyketide synthase、 scytalone dehydratase 及

1,3,8-trihydroxynaphthalene reductase) 並透過農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)

媒介轉殖 (Agrobacterium-mediated transformation),將黑色素生合成基因轉殖進入

不具黑色素生合成能力的昆蟲寄生真菌—黑殭菌 (Metarhizium anisopliae)。黑色

素在黑殭菌轉殖株中的表現,利用分光光度計、液相層析質譜 (LC/MS) 及共軛

焦顯微鏡之觀察加以證明 (Fig. 7)。

與野生株相比較,此轉殖株對於環境逆境具有較佳的抗性,對於寄主昆蟲亦

具有較高的致病力 (virulence)。然而,這些特性的相關機制仍不清楚,因此本研

究透過生理及分生的途徑,探討其可能之機制。雖然轉殖株與野生株皆可侵染相

同的寄主範圍,但在活體内 (in vivo) 及活體外 (in vitro) 的情況下,轉殖株的分

生孢子發芽及產生附著器 (appressorium) 的速率及與產生附著器的數量皆明顯

高於野生株。轉殖株對小菜蛾 (Plutella xylostella) 及黃條葉蚤 (Phyllotreta

striolata) 的半致死時間 (LT50) 亦顯著的短於野生株。此外,轉殖株對活性氧

(reactive oxygen species, ROS) 的耐受能力較野生株來得高。在 in vivo 的情況下轉

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殖株可產生高於野生株 40 倍的 orthosporin,並顯著的大量轉錄 chitinase、protease

及 phospholipase 之編碼基因。但轉殖株與野生株相比較之下,附著器的膨壓

(turgor pressure) 及殺蟲毒素 destruxin A 的產量則有些微下降。轉殖株對黑豆蚜

(Aphis craccivora)、小菜蛾 (Pl. xylostella)、黃條葉蚤 (Ph. striolata)、銀葉粉蝨

(Bemisia argentifolii) 及東方果實蠅 (Bactrocera dorsalis) 具有高致病力,並具有

在兩種植物根部殖據的能力,使轉殖株於田間進行生物防治應用時,應具有較高

之潛力 (7,54,55,56)。

超寄生菌、超病原菌、菌根菌、植物病原菌間之相互作用及

其在生物防治之應用

非常久遠之前,於鏡檢培養於馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基 (PDA) 之線蟲捕捉

菌 Arthrobotrys oligospora 時,偶然發現,此線蟲捕捉菌,被意外入侵污染之一種

真菌誘導,產生線圈狀菌絲卷,而且利用此以前所未曾被描述之構造,來纏繞此

入侵之真菌之菌絲。更進一步探討,發現至少三種真菌:入侵之真菌

(Geotrichum-like) ,立枯絲褐病菌 (Rhizoctonia solani) ,以及一種擔子菌

(Matruchotia varians),當與此三種可以產生黏性捕捉網之線蟲捕捉菌:A.

oligospora、A. robusta、A. superba,對峙培養,遭遇時,即可被誘導,產生線圈

狀菌絲卷,纏繞對方菌絲。進一步穿透式電顯鏡檢,卻發現此等線蟲捕捉菌並未

由此菌絲卷,產生侵入釘或吸器等入侵或吸收養分構造,但被纏繞之立枯絲核菌

卻呈現細胞膜內陷,細胞質壞疽以及自身產生菌絲內菌絲,而最後其細胞質完全

流失,只剩胞壁。顯然此等線蟲捕捉菌亦可分泌某種酵素或毒素使對方受損

(69)。

但此 Geotrichum-like sp.之真菌,現在已被命名為新屬新種之 Geotrichopsis

mycoparasitica,但却進行反擊,産生菌絲或短側枝,不規則纏繞線蟲捕捉菌,並

於不同處產生膨大之附著器,甚至入侵,產生入侵菌絲,而且在互相纏鬥時,略

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佔上風 (73,74)。此等相互作用,隱藏其背後之形態分化,侵染機制,極富生物學

旨趣。

在另一方面,裂褶菌 (Schizophyllum commune) 也會產生小分生孢子

(oidium),外表有些類似此 G. mycoparasitica 之斷生孢子,故也被選為測試對象。

S. commune 雖不會誘導此等線蟲捕捉菌,促其產生線圈狀菌絲,但卻可如同其他

之毀滅性超寄生菌,如木黴菌 (Trichoderma)、黏帚菌 (Gliocladium) 之超寄生模

式寄生線蟲捕捉菌,以及其它對植物具病原性之子囊菌、擔子菌以及不完全菌,

故此種超寄生行為應可用於生物防治應用 (35,69)。

此外,也偶然發現 Pythium 或 Phytophthora 之游走子被自由生活式之線蟲所

吞食,即可感染此吞食之線蟲。國立中興大學植病系陳啟予博士與其所指導之研

究生,也發現多種隸屬於卵菌綱之 Pythium 或 Myzocytium 可寄生線蟲 (72)。

而又在另一領域,於温室以玉米繁殖叢狀枝囊狀體內生菌根菌

(vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi, VAMF) 時,也意外發現可被一種壺菌

(Phytochytrium kniepii) 寄生,而此種壺菌细胞內卻帶有螺旋菌質體 (Spiroplasma)

(Fig. 8)。曾有報告指出 Spiroplasma kunkelii 可經由葉蟬傳播感染玉米,引起矮化

病,故如亦能經由此 VAMF 傳播此等 Spiroplasma 時,則當使用 VAMF 做為微生

物肥料時,需特別謹慎 (68)。

綜合上述,再度印證真菌在自然界所扮演之多重角色,如何善加利用其優點,

降低其害,其前提是對於其多樣性、生物學以及生態學應先多加探討和瞭解

(19,57,58)。

線蟲捕捉菌之類缘學、演化及其捕捉構造形態分化及其侵染

之分生機制探討

線蟲捕捉菌之所以能夠演化成各式之捕捉構造和機制,可能與平行演化而出

現於地球之線蟲有關,但線蟲捕捉菌何時出現,其真正時間點至今仍不清楚,此

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即極富生物學旨趣之研究議題。研究線蟲捕捉菌菌,最大之貢獻應來自 Drechsler,

C.,一位德裔美籍之真菌學者。Drechsler 至少描寫超過 60 種以上之線蟲捕捉菌,

發現並精緻描繪其所產生之不同類型之捕捉構造和記敘捕捉線蟲模式 (18,36,37)。

為探索此等菌類之生物種之概念、演化路徑及其捕捉線蟲構造特徵,是否和傳統

應用於鑑別此群真菌之分生孢子、產孢構造之形態、構造、產孢發生學之特徵受

相互吻合,於 1997 年,應用已研發成熟之 PCR (polymerase chain reaction) 技術,

利用廣泛性簡併式引子對增幅由世界各地所蒐集之 29 株,隸屬於 Arthrobotrys、

Dactylella、Dudduingtonia、Genicularia、Monacrosprium、Nematoctonus 等屬之線

蟲捕捉菌,以及 5 株分生孢子形態、產孢枝、產孢方式類似線蟲捕捉菌,但卻不

具捕捉能力之真菌之 rDNA 核酸 (ITS1-5.8S-ITS2),並將增幅產物定序,之後併

比,以最大簡約法 (maximum parsimony) 進行分析。結果顯示捕捉構造之分群與

rDNA 之分群互相一致,但與傳統之產孢構造、分生孢子形態等分類、分屬、分

種之特徵有所扦格;推演此等捕捉構造之演化路徑,應起始無柄之黏著球 (sessal

adhesive knob),經由黏著柱 (adhesive column)、有柄黏著球 (stalked adhesive knob)、

非收縮環 (non-constricting ring)、收縮環 (constricting ring),最後演化成黏著網

(adhesive net) (43) (Fig. 9-10)。

當然隨時代推演,分子生物學、基因體學、轉錄體學以及次世代定序技術之

神速進展,利用多基因,甚至全基因體具功能之衆多基因,以及應用不同之軟體,

進行進一步分析,所得之結論應較接近於真。此外,應用基因之破壞置換,也驗

證蛋白酶基因與其生長、產孢、侵染及捕捉構造形態分化有關。

松樹缐蟲萎凋病之新天敵真菌及其於生物防治之探討

臺灣之松樹萎凋病於民國七十四年於臺灣北部台北縣金山、石門,以及桃園

縣之虎頭山、忠烈祠、慈湖一帶被發現,其後經二年之調查發現北部十九處皆有

發生,歷經三十年來之傳播蔓延,甚至金門、馬祖亦難以倖免。各處之黑松、琉

球松林被害高達 50-60% 以上,為害相當嚴重,造成萎凋之主要病原為松材線蟲

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(Bursaphelenchus xylophilus),其係經由松斑天牛 (Monochamus alternatus) 傳播,

最近於台中縣之谷關、武陵農場,以及南投縣之奧萬大森林遊樂區一帶之臺灣二

葉松、五葉松也罹受萎凋病,除 B. xylophilus 外,擬松材線蟲 (Bursaphelenchus

mucronatus),亦可能共同為害。二葉松為臺灣之原生樹種,鄰近德基水庫一帶又

為純林,和生態系之平衡和水源之涵養息息相關,故宜加審慎迅速處理被害木,

以防病害擴散蔓延。已往防治松樹萎凋病,大面積造林地,以空中噴撒殺天牛化

學藥劑為主,但易造成二次環境污染公害,故探討其它對環境相對親合及永續性

之方法,如以可寄生松材線蟲或松斑天牛之真菌性天敵,來減少此等病原或病媒

之族群,似亦為可行之方式 (8,9,20,95-97) (Fig. 11-13) (Table 1)。

此外,也首次於本土發現,瞭解具寄生或毒殺松材線蟲隸屬於擔子菌綱之皮

殼 菌 Hyphoderma praetermissum 、 H. mucronatum , 以 及 隸 屬 於 子 囊 菌

(Ophiostomaceae) 之無性世代 Esteya vermicola 之寄生機制,並探討協同白僵菌

(Beauveria bassiana) 於南投奧萬大,防治松材線蟲侵染二葉松、五葉松,以及於

金門國家公園中山林區之侵染黑松、琉球松、濕地松所引起萎凋病可能之應用 (14,

44-46, 80, 87, 89) (Fig. 14-18) (Table 2-3)。

應用古典生物防治入侵之小花蔓澤蘭

小花蔓澤蘭原產於中南美洲加勒比海沿岸國家,在原產地長期共演化的結果,

已受當地的昆蟲或病原微生物制約,並不會造成顯著為害,而能和生態系和諧共

存。在 20 世紀初期,它被南亞、東南亞一些國家引進種植當作綠色植被。由於旺

盛的生命力、生長勢和拓植能力,經過 50 至 100 年,已遍布大洋洲、澳洲、印尼、

巴布尼幾亞、馬來西亞、印度、中國廣東、香港等地。

至於它何時入侵臺灣,雖不可考,但由中研院植物所和臺灣大學植物系在屏

東採集的標本顯示,至少於 1986 年已在南臺灣立足。其後短短二十幾年,向北蔓

延已超過 150 公里以上。據臺灣特有種生物研究中心的調查顯示,全臺 23 縣市,

除臺北縣市、新竹市,以及離島的金門、馬祖、澎湖外,至少已有 18 縣市,共約

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5 萬多公頃的農林棲地已被入侵。

俗稱「綠癌」的小花蔓澤蘭具優異的生長、生殖遺傳特性,又可產生數量驚

人的種子,發育後的藤蔓善於攀沿、纏勒,繁盛的莖葉覆蓋鄰近的灌木甚或喬木,

致使被攀附的植物無法進行光合作用,生長衰微,最後枯死,被認為是最具侵略

性的入侵雜草。

小花蔓澤蘭入侵除造成農林作物的經濟損失外,對於本土生態系生物多樣性

與結構也產生巨大影響。為防止它的猖獗為害,政府所轄的農政單位無不卯足全

力,極力進行防治。目前所採行的防治方法,不外乎化學性的殺草劑或物理性的

剷除,但兩者都是治標,且不符成本效益,常有「雜草鋤不盡,春風吹又生」之

嘆!最後的另類選擇「生物防治」,也許能峰迴路轉,柳暗花明,帶來一線生機。

入侵臺灣小花蔓澤蘭之古典生物防治。臺灣的農林生態系廣受入侵的小花蔓

澤蘭為害,已罄竹難書。如何有效防治這種入侵雜草,真需費神思量。還好溯古

證今,他山之石可以攻錯。似可借鏡前述的古典生物防治雜草的成功典範,引進

這種入侵雜草原產地的天敵,以期可以壓制入侵的小花蔓澤蘭,恢復本土生態系

的永續平衡。

引進天敵及病原專一性測定歷程。臺灣大學植微系應用真菌研究室,在行政

院農委會國際合作處的經費協助下,著手進行為期三年 (2006 至 2008 年) 的古典

生物防治計畫。首先經行政院農委會防檢局的核准同意後,獲得英國聯邦國際農

業總署 Dr. Carol A. Ellison 的合作和協助,引入業經其驗證,原產於厄瓜多爾,可

嚴重侵染小花蔓澤蘭,具同主寄生生活史的短週期銹病菌天敵菌株。在亞洲世界

蔬菜研究中心 Dr. Robert de la Péna 的協助下,於亞蔬基改溫室以小花蔓澤蘭大量

繁殖這種銹病菌天敵,並進行病原性和寄主範圍檢測。結果顯示這種引進的銹病

菌天敵極具寄主專一性,對 45 科 115 種本土重要農林或觀賞作物都具免疫反應,

不受這種銹病菌的感染,也再度證實它的生物安全性。

天敵的釋放。在 2008 年 1 月上旬,經農委會動植物防疫檢疫局召開的專家

諮詢委員會議同意可於野地釋放。2008 年 5 月上旬,獲行政院農委會林務局的協

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助,在林務局屏東林管處所轄的高雄六龜工作站苗圃,以及鄰近的扇平坡崁等小

花蔓澤蘭叢生的地方,釋放繁殖的銹病菌接種源。釋放銹病菌天敵後,於 2008

年 6 至 11 月間,每個月進行追蹤調查,觀察野生的小花蔓澤蘭的葉、葉柄、藤蔓

是否已被所釋放的銹病菌侵染,並追蹤評估病勢進展。若鄰近植被呈現疑似銹病

菌感染的病斑時,也鏡檢驗證它的屬性。

天敵族群建立評估。歷經幾個月的調查,證實釋放銹病菌 1 個月後,六龜、

扇平兩處的野生小花蔓澤蘭的葉片、葉柄已被銹病菌天敵所侵染,並產生典型的

病徵。其後,隨著梅雨季的來臨,在適宜的溫、濕度和飛濺雨、氣流的協助傳播

下,罹患釋放的銹病菌天敵而產生的病灶,就逐漸增多而易於發現。

感染的葉片常有畸形、變小、脫落的情形,而藤蔓被感染也膨大呈紅棕色、

生長點死亡。坡崁下方約 10 公尺隔一馬路處的小花葉片下表面,也發現有小型紅

色病斑,切片鏡檢也確認是銹病菌天敵所致。坡崁鄰近的路旁斜坡 40 至 50 公尺

處,也有不少小花蔓澤蘭蔓延生長,因地形過於陡峭,不適攀爬觀察,所以無從

判斷是否也被銹病菌天敵所感染。調查結果顯示,基改溫室所繁殖的銹病菌天敵

可以感染野生的小花蔓澤蘭,產生典型病灶,再生冬孢子堆、冬孢子、擔孢子為

接種源,進行重複感染。2010 年 10 月調查追蹤顯示,所釋放小花蔓澤蘭銹病菌

天敵已傳播感染 22 公里外之甲仙、南化等地之野生小花蔓澤蘭,此外於臺東農改

場斑鳩分場所釋放之同種銹病菌天敵,已傳播感染 2 至 3 公里外之賓朗果園之小

花蔓澤蘭。目前已於中南部 9 縣市建立族群,並散播侵染野生小花蔓澤蘭,其面

積達到 4500 平方公里。將設立永久樣區,以評估其壓制小花蔓澤蘭及恢復本土生

態系之成效和時程 (Fig. 19-20)。

未來,應取得本國植物分類專家學者的協助或合作,設立永久性樣區,共同

長期監測、調查天敵釋放點鄰近植被的多樣性,以及釋放前後小花蔓澤蘭的消長,

包括葉、藤蔓、乾重量、種子數量等資料。有鑑於執行防檢業務相關人員或一般

大眾對古典生物防治的相關資訊並不十分熟悉,應舉辦講習會、研習會以推廣和

加深國人這方面的相關知識或技藝。期冀於執行第二階段的防治後,可以明顯抑

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制入侵的小花蔓澤蘭,降低它的族群密度及恢復本土生態系的永續平衡 (10)。

靈芝之交配、出菇、殖據基因之選殖及其特性界定

靈芝 (Ganoderma lucidum 或 Ganoderma multipileum) 為可引起多種樹木白

腐 (white rot) 之病原真菌,但在另一方面,卻可產生多醣體或萜類或其他代謝產

物,具免疫調節,抗癌或其他生理活性功能,因而廣受觀注。靈芝和其他多種之

模式物種之擔子菌,如墨水菇 (Coprinopsis cinerea)、裂褶菌 (Schizophyllum

commune) 皆為四極異宗交配型 (tetrapolar heterothallism),由兩對基因座 (mating

locus) 調控其交配,以及其下游之出菇調控基因,調控其出菇之行為。

臺大植微系應用真菌實驗室和本系劉瑞芬教授、沈偉強教授、本校食科所呂

廷璋教授,以及臺北榮民總院蕭明熙研究員 (現任職私立長庚大學教授),以及國

立陽明大學基因體研究中心蔡世峰教授、生物醫學資訊中心楊永正教授,及國立

交通大學生科系邱顯泰副教授 (現任職國立成功大學) 共同合作,進行跨機構、

跨校之「靈芝基因體及其生物學之群體計畫」。臺大植微系應用真菌實驗室主要進

行探討靈芝之交配型以及出菇基因之選殖及功能性分析,以及靈芝引起樹木白腐

之相關病原性之酵素 Cazy (catabolic active enzymes) 之探討。

本研究室已建立靈芝之 fosmid library、cDNA library 以及部分 EST (expression

sequence tag) 之解序註解,榮總則進行靈芝代謝產物之生理活性探討,而陽明大

學則利用傳統或次世代之基因定序技術,進行全基因之解序和註解。本研究室目

前已完成靈芝兩個交配型 BCRC37177 (A1B1) 以及 BCRC37180 (A2B2) 之 A 交

配型基因座 (A1:a1a2;A2:b1b2),以及 B 交配型基因座之 21 個費洛蒙受體

(pheromone receptor) 以及 13 個費洛蒙前驅物 (pheromone precursor) 基因之選殖

及功能性分析,並以 yeast two hybrid 及原生質體轉型系統轉型,證明 AB 基因

座之功能,此外也利用扣減式 cDNA Library 之建構,初階段界定 20 個與出菇相

關之基因,未來如有可能將進行其功能性分析。此等研究具學術旨趣,也可為未

來菇類之分子育種,建立一可行之工作平台 (3,5,41)。

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牛樟芝之木質分解酶,抗氧化及萜類次級代謝產物基因之選

殖及其特性界定

牛樟芝 (Antrodia cinnamomea) 為臺灣之特有種,生長於臺灣特有之牛樟

(Cinnamomum kanehirae) 之樹心空洞處之內壁,含有許多生理活性成分,具抗氧

化、抗發炎、免疫調節以及抗癌等功能,為臺灣特有之珍貴藥用真菌。目前研究

顯示,其生理活性功能和萜類、多醣體、酚類及其衍生物有關,其中萜類被研究

最多,最具開發潛能,但在臨床舆生理活性功能之驗證上,常因無法生產提供足

夠驗證劑量,因而成為發展為先導藥之瓶頸。有鑑於此,過往幾年來,進行萜類

生合成路徑或抗氧化物合成之相關基因之選殖、特性界定與功能性分析。最後將

藉由遺傳代謝工程組合此等基因,進行生合成表現,如可產出別具治療功能之生

理活性物質,再行純化、分離、屬性鑑別,以及進行細胞活性檢測。近幾年,共

選殖 7-10 基因,如 Cu-Zn-superoxide dismutase (Cu-Zn SOD)、Cytochrom c

peroxigenase (CCP) 、 Glutathione oxidase(GO), Glutathione reductase(GR),

Glutathione transferase(GT),Squaleue monoxygenase (SM)、Lanosterol synthase (LS)、

gerenyl-trans-trasferase (GTT)、Squalene synthase (SQS) 等基因,而其中 4-5 個基

因已完成功能性分析。未來將組合此等基因,共同表現,期冀達成預設目標

(1,15,17,40)。

结 語

真菌為重要微生物資源,於自然界扮演多重角色,可為敵、為友。瞭解其生

理、生態特性,為敵時可防止其為害,化危機為轉機;為友時可將其益處,優異

特性加以改良提昇,發揮到極致,以造福社稷人群。真菌之基因體大小適中,可

於後基因體世代,當為模式物種,以探討其於醫藥、食材、生質能源、分子農場、

工廠等之應用,以及在基因、分子層次,探討系統生物學或諸多具生命旨趣相關

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議題、原理、機制之素材。

誌 謝

感謝三十年來行政院科技部、農委會國合處、農委會科技處、動植物防疫檢疫

局、林務局、食品工業發展研究所、中研院植微所之有形無形之熱誠協助與支持;

也深深感謝國立臺灣大學所提供優質之教學、研究環境和行政服務,以及植微系

全體師生和同仁,以及眾多未能一一具名之全校同道、同仁之照顧、指教和包容,

使得以諸事順遂,與時成長向前行;最後,但非最少,感謝所有的家人長期無怨

無悔之衷心支持、鼓勵和照顧。

參考文獻

1. 王沿峻. 2014. 牛樟芝之萜類生合成基因角鯊烯單氧合成酶及羊毛甾醇合成

酶之選殖、特性界定、表現及其功能性分析. 國立臺灣大學植物病理與微生

物學系, 碩士論文。

2. 林暐峻、袁如陵、曾昱、周子禾、黃學聰、曾顯雄、陳金亮. 2013. 大地精靈

-雪山坑溪野生動物重要棲息環境-大型真菌百選. 行政院農委會東勢林區管

理處. 初版 1-149.

3. 吳竑毅. 2005.靈芝交配型與出菇相關基因之選殖與分析.國立臺灣大學植物病

理與微生物學系,碩士論文。

4. 胡賢彬. 2013. 應用黑色素生合成基因研發鑑定炭疽病菌之生物晶片及探討

其類緣關係. 國立臺灣大學植物病理與微生物學系,碩士論文。

5. 袁如陵. 2008. 靈芝A交配型基因座之選殖及功能界定. 國立臺灣大學植物病

理與微生物學系, 碩士論文。

6. 曾昱、許博堯、曾顯雄. 2013. 松材線蟲與木層孔菌引起之樹木病害:診斷與

防治. p. 87-100. 102 年森林健康之管理與經營國際研討會. 中華民國自然生

態保育學會編印. 臺北. 211 pp.

7. 曾敏南、曾顯雄. 2014. 可表現黑色素之真菌轉殖株及其方法. 中華民國專利

第 I 437096 號.

Page 29:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

22

8. 曾顯雄. 2011. 分子技術在農業病原微生物鑑定之現況與展望. p. 101-125.

2011 臺灣農作物病蟲害診斷鑑定現況與未來展望研討會、國立臺灣大學植物

醫學研究中心、行政院農委會動植物防檢疫局編印. 臺北. 158 pp。

9. 曾顯雄. 2011. 松材線蟲. p. 63-90. 2010 年樹木病蟲害研討會論文集. 國立屏

東科技大學編印. 屏東. 171 pp。

10. 曾顯雄. 2012. 小花蔓澤蘭之古典生物防治評估. p. 4-16. 農作物有害生物防

疫技術與資材發展研討會. 行政院農委會農藥毒物所, 行政院農委會動植物

防檢局編印. 台中. 94 pp。

11. 曾顯雄 審訂. 2014. 澤田兼吉 ”臺灣菌類調查報告” (中譯版). 十册. 國立臺

灣大學出版. 台北。

12. 曾顯雄、許博堯、曾昱. 2012. 鑑定木層孔菌屬 (Phellinus) 之生物晶片及其

方法. 中華民國 專利第 I 372782 號.

13. 曾顯雄、黃子葳. 2009. 進口植物或其產品潛在真菌病原之鑑定專誌 (II). 行

政院農委會動植物防檢疫局, 國立臺灣大學植物病理與微生物學系刊印. 台

北. 168 pp。

14. 曾顯雄、劉俊揚、石如茵. 2005. 線蟲寄生真菌. 中華民國專利 第 I 186697

號.

15. 陳良坤. 2006. 牛樟芝萜類生合成基因選殖及其特性界定. 國立臺灣大學植物

病理與微生物學系, 碩士論文。

16. 蔡昇宏. 2006. 蘇鐵白輪盾介殼蟲及銀葉粉蝨之真菌性天敵調查與其在生物

防治潛能之評估. 國立臺灣大學植物病理與微生物學系, 碩士論文。

17. 劉宇真. 2007. 牛樟芝抗氧化酶基因選殖及其生理活性分析. 國立臺灣大學植

物病理與微生物學系, 碩士論文。

18. Barron, G. L. 1977. The nematode-destroying fungi. Canadian Biological

Publications Ltd. Ontario, Canada. 140 pp.

19. Barron, G. L., and Tzean, S. S. 1981. A subcuticular endoparasite attacking rotifers

with three-pronged spores. Canadian Journal of Botany 59: 1207-1212.

20. Chang, R. J., Tzean, S. S., Enda, N., Shen, K. H., and Hsiao, C. H. 1998. Appraisal

of morantel tartrate for controlling pine wilt disease. Taiwan Froestry 13:147-153.

(in Chinese with English Summary)

21. Chen, C. C., Ashok Kumar, H. G., Tzean, S. S., and Yeh, K. W. 2007. Molecular

cloning, characterization, and expression analysis of an endochitinase cDNA from

the entomopathogenic fungus, Paecilomyces javanicus. Curr. Microbiol. 55:8-13.

22. Chen, J. L*, Lin, W. S., and Tzean, S. S. 1999. Aphanocladium macrosporum sp.

nov. from Taiwan. Bot. Bull. Acad. Sin. [Taipei], New Ser. 40: 333-336.

23. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 1993. Megacapitula villosa gen. et sp. nov.

(Hyphomycetes) from Taiwan. Mycological Research 97: 347-350.

24. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 1993. Podosporium elongatum a new synnematous

Hyphomycetes from Taiwan. Mycological Research 97: 637-640.

Page 30:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

23

25. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 1995. A new species of Ardhachandra from Taiwan.

Mycological Research 99: 364-366.

26. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 1999. Two synnematous hyphomycetes from Taiwan.

Fungal Science 14(1,2): 31-35.

27. Chen J. L. and Tzean, S. S*. 2000. Conioscypha taiwaniana sp. nov. and several

new records of the genus from Taiwan. Bot. Bull. Academia Sinica 41:315~322

28. Chen J. L. and Tzean, S. S.* 2000. Three species of Spegezzinia (Hyhomycetes)

from Taiwan. Fungal Science 15: 81-87.

29. Chen, J. L. and Tzean S. S.* 2007. Hyphomycetes from Taiwan. Akanthomyces

and allied species. Fungal Science. 22: 63-77.

30. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 2008. Hyphomycetes- Beltrania and allied species

from Taiwan. Taiwania 53(3): 301-307.

31. Chen, J. L. and Tzean, S. S.*. 2009. Hyphomycetes from Taiwan.

Chaetendophragmia and allied species. Taiwania 54 (2): 152-158.

32. Chen, J. L. and Tzean, S. S.* 2010. Hyphomycetes from Taiwan- Endophragmia

and allied species. Taiwania 55(1): 37-42.

33. Chen J. L*., Tzean S. S., and Lin W. S. 2008. Endophragmiella multiramosa a

new dematiaceous anamorphic ascomycete from Taiwan. Sydowia 60

(2):197-204.

34. Chen, Z. C. 1992. Mycological survey in Taiwan: historyaand present status.

Pages 119-130. in Bioresource Survey and Informatics Management. Peng, CI ed.

Institute of Botany, Acad. Sin. Monograph Ser. 11, Taipei.

35. Chiu, S. C. and Tzean, S. S.*. 1995. Glucanolytic enzyme production by

Schizophyllum commune Fr. during mycoparasitism. Physiol. Mol. Plant Pathol. 46:

83-94.

36. Drechsler, C. 1937. Some hyphomycetes that prey on free-living terricolous

nematodes. Mycologia 29:447-552.

37. Drechsler, C. 1941. Some hyphomycetes parasitic on free-living terricolous

nematodes. Phytopathology 31:773-802.

38. Estey, R. H. and Tzean, S. S. 1981. An ultrastructural examination of nematode

penetration by nematode-trapping fungi. Canadian Journal of Plant Science 61:

785-789.

39. Hsieh, L. S., Tzean, S. S.*, and Wu, W. J. 1997. The genus Akanthomyces on

spiders from Taiwan. Mycologia 89: 319-324.

40. Huang, S. T., Tzean S. S.*, Tsai, B. Y.*, and Hsieh, H. J. 2009. Cloning and

heterologous expression of a novel lignolytic peroxydase gen from poroid

brown-rot fungus Antrodia cinnamomea. Microbiology 155, 424-433.

41. Huang, Y. H., Wu, H. Y., Wu, K. M., Liu, T. T., Liou, R. F., Tsai, S. F., Shiao, M.

S., Ho, L. T., Tzean, S. S.*, and Yang, U. C.* 2013. Generation and Analysis of

Page 31:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

24

the Expressed Sequence Tags from the Mycelium of Ganoderma lucidum. PLOS

ONE, Vol. 8. Issue 5/ e61127.

42. Ko, B. S., Lu, Y. J., Yao, W. L., Liu, T. A., Tzean, S. S., Shen, T. L., and Liou, J.

Y*. 2013. Cordycepin Regulates GSK-3B/B-Catenin Signaling in Human

Leukemia Cells. PLOS ONE, Vol. 8. Issue 9/ e76320.

43. Liou, G. Y. and Tzean, S. S.* 1997. Phylogeny of Arthrobotrys and allied

nematode-trapping fungi based on rDNA sequences. Mycologia 89: 876-884.

44. Liou, J. Y. and Tzean, S. S.* 1992. Stephanocyst as nematode-trapping and

infecting propagules. Mycologia 84: 786-790.

45. Liou, J. Y., Liou, G. Y., and Tzean, S. S.* 1995. Dactylella formosana, a new

nematode-trapping fungus from Taiwan. Mycological Research 99:751-755.

46. Liou, J. Y., Shih, J. Y., and Tzean, S. S.* 1999. Esteya, a new genus of

nematophagous fungus from Taiwan, attacking pinewood nematode

Bursaphelenchus xylophilus. Mycological Research: 103: 242-248.

47. Lin, A., Huang, K. C., Hwu, L., and Tzean, S. S.* 1994. Production of ribotoxins

among Aspergillus species and its related fungi. Toxicon 33: 105-110.

48. Luen H., Cho, C. J., Tzean, S. S., Lin, A. M. J. 2001. Nucleotide sequence and the

action of rubotoxin gene (sar gene) of Penicillium isolates from Taiwan. Bot. Bull.

Acad. Sin. 42: 101-107.

49. Moore-Landdecker, E. 1990. Fundamentals of the Fungi. Prentice hall, H. J., USA.

561 pp.

50. Sawada, K. 1908-1944. The Descriptive Catalogue of Formosan (Taiwan) Fungi.

10 Vol. Dept. Agr. Gov. Res. Inst., Taihoku, Formosa.

51. Shen, H. D., Lin, W. L., Tam, M. F., Wang, S. R., Tzean, S. S., Huang, M. H., and

Han, S. H. 1999. Characterization of allergens from Penicillium oxalicum and P.

notatum by immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis. Clinical

and Experimental Allergy 29: 642-651.

52. Shiao, M. S., Lin, L. J., Lien, C. Y., Tzean, S. S., and Lee, K. R. 1989. Natural

products in Cordyceps. Proceedings of the National Science Council, R. O. C., Part

B 13: 382-387.

53. Shu, P. Y., Tzean, Y., and Tzean, S. S.* 2012. Simultaneous rapid and precise

identification of Phellinus and allied tree disease pathogens by microchip: p.

232-252. In Proceedings of the International Conference on Ecology, Etiology and

Integrate Management of Forest and Fruit Tree Disease. Department of Plant

Pathology and Microbiology, National Taiwan University and Taiwan

Phytopathological Society Press., Taipei, Taiwan. 254 pp.

54. Tseng, M. N., Chung, C. L., Tzean, S. S.* 2014. Mechanisms relevant to the

enhanced virulence of a dihydroxynaphthalene-melnin metabolically engineered

entomophatogen. PLOS ONE: Vol.9 Issue 3/e90473.

Page 32:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

25

55. Tseng, M.N., Chung, P.C., and Tzean, S. S.* 2011. Enhancing the stress tolerance

and virulence of an entomopathogen by metabolic engineering of

dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis genes. Applied and Environmental

Microbiology, 77 (13): 4508-4519.

56. Tseng, M. N. and Tzean, S. S.* 2013. Fungi transformation for melanin

production and uses thereof. USA Patent No. US 8,518,393 B2.

57. Tzean, S. S. and Barron, G. L. 1981. A new and unusual fungus inhabiting the gut

of free-living nematodes. Canadian Journal of Botany 59: 1861-1866.

58. Tzean, S. S. and Barron, G. L. 1983. A new predatory hyphomycete capturing

bdelloid rotifers. Canadian Journal of Botany 61: 1345-1348.

59. Tzean, S. S.* and Chen, J. L. 1989. A new species of Trinacrium from Taiwan.

Mycological Research 93: 391-393.

60. Tzean, S. S.* and Chen, J. L. 1989. A new species of Triadelphia from Taiwan.

Mycologia 81: 626-631.

61. Tzean, S. S.* and Chu, C. L. 1984. Ultrastructure and host-endophyte interactions

in Alnus formosana root nodules. Proceedings of the National Science Council, R.

O. C., Part B 8: 210-221.

62. Tzean, S. S.* and Chen, J. L. 1990. Cheiromoniliophora elegans gen. et sp. nov.

(Hyphomycetes). Mycological Research 94: 424-427.

63. Tzean, S. S.* and Chen, J. L. 1991. Two new species of Dactylaria from Taiwan.

Mycological Research 95: 1000-1004.

64. Tzean, S. S.*, Chen, J. L., and Hsu, H. H. 1992. Talaromyces unicus sp. nov. from

Taiwan. Mycologia 84: 739-749.

65. Tzean, S. S.*, Chen, J. L., Liou, G. Y., Chen, C. C., and Hsu, W. H. 1990.

Aspergillus and related teleomorphs from Taiwan. Mycological Monograph of the

Food Industry Research and Development Institute (1): iii+113pp.

66. Tzean, S. S.* and Chu, C. L. 1985. Infectivity and nitrogen fixing activity of a

species of Frankia from nodules of Alnus formosana. Proceedings of the National

Science Council, R. O. C., Part B 9: 305-310.

67. Tzean, S. S.*, Chiu, S. C., Chen, J. L., Hseu, S. H., Lin, G. H., Liou, G. Y., Chen, C.

C., and Hsu, W. H. 1994. Penicillium and related teleomorphs from Taiwan.

Mycological Monograph of the Food Industry Research and Development Institute

(9): v+159 pp.

68. Tzean, S. S.*, Chu, C. L., and Su, H. J. 1983. Spiroplasmalike organism in

vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus and its mycoparasite. Phytopathology 73:

989-991.

69. Tzean, S. S.* and Estey, R. H. 1978. Schizophyllum commune Fr. as a destructive

mycoparasite. Canadian Journal of Microbiology 24: 780-784.

Page 33:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

26

70. Tzean, S. S. and Estey, R. H. 1978. Nematode-trapping fungi as mycopathogens.

Phytopathology 68: 1266-1270.

71. Tzean, S. S. and Estey, R. H. 1979. Transmission electron microscopy of the fungal

nematode-trapping devices. Canadian Journal of Plant Science 59: 785-795.

72. Tzean, S. S. and Estey, R. H. 1981. Species of Phytophthora and Pythium as

nematode-destroying fungi. Journal of Nematology 13: 140-143.

73. Tzean, S. S.* and Estey, R. H. 1991. Geotrichopsis mycoparasitica gen. et sp. nov.

(Hyphomycetes), a new mycoparasite. Mycological Research 95: 1350-1354.

74. Tzean, S. S.* and Estey, R. H. 1992. Geotrichopsis mycoparasitica as a destructive

mycoparasite. Mycological Research 96: 263-269.

75. Tzean, S. S.*, Hsieh, L. S., Chen, J. L., and Wu, W. J. 1992. Nomuraea viridulus, a

new entomogenous fungus from Taiwan. Mycologia 84: 781-786.

76. Tzean, S. S.*, Hsieh, L. S., Chen, J. L., and Wu, W. J. 1993. Nomuraea

cylindrospora comb. nov. Mycologia 85: 514-519.

77. Tzean, S.S., Hsieh, W. H., Chang, T. C., and Wu, S. H. 2005. Fungal Flora of

Taiwan. (1st ed.). Vol. I- V, 2422 pp. National Science Council, Taiwan (R.O.C.)

Press.

78. Tzean, S. S., Hsieh, W. H., Chang, T. C., and Wu, S. H. 2010. Fungal Flora of

Taiwan (Ⅱ).(2nd ed.). Vol. I-Ⅶ, 3450 pp. National Science Council and

Department of Plant Pathology and Microbiology, National Taiwan University,

Taiwan (R.O.C.).

79. Tzean, S. S., Hsieh, W. H., and Chang, T. C., and Wu, S. H. 2014. Mycobiota

Taiwanica 3rd

Ed. Vol. I-Ⅷ, 4405 pp. National Science Council, Executive Yuan;

Department of Plant Pathology and Microbiology, National Taiwan University,

Taipei, Taiwan (R.O.C.).

80. Tzean, S. S.*, Hsieh, L. S., and Wu, W. J. 1997. Atlas of Entomopathogenic Fungi

from Taiwan. Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan, R. O. C. 214 pp .

81. Tzean, S. S.*, Hsieh, L. S., and Wu, W. J. 1997. The genus Gibellula on spiders

from Taiwan. Mycologia 89: 309-318.

82. Tzean, S. S.*, Hsieh, L. S., and Wu, W. J. 1998. Torrubiella dimorpha, a new

species of spider parasite from Taiwan. Mycological Research: 102: 1350-1354.

83. Tzean, S. S. and Huang, T. W. 2009. Altas of potential fungal pathogens

associated with plants and its commodity imported to Taiwan 2nd

. COA Press, 168

pp.

84. Tzean, S. S., Huang, T. W., and Yuan, J. L. 2006. Altas of potential fungal

pathogens associated with plants and its commodity imported to Taiwan. COA

Press, 194 pp.

Page 34:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

27

85. Tzean, S. S.* and Huang, Y. S. 1980. The occurrence and formation of

vesicular-arbuscular mycorrhizae of citrus and maize. Bot. Bull. Acad. Sin.

[Taipei], New Ser. 21: 119-134.

86. Tzean, S. S.,* Leu, L. S., and Chu, H. T. 1974. Fungal flora of roots and

rhizosphere from ratoon cane in Taiwan. Rept. Taiwan Sugar Res. Inst. 63: 69-117.

87. Tzean, S. S.* and Liou, J. Y. 1993. Nematophagous resupinate basidiomycetous

fungi. Phytopathology 83: 1015-1020.

88. Tzean, S. S.*, Liou, J. Y., Liou, G. Y., and Yuan, G. F. 1997. Atlas of

Nematophagous Fungi from Taiwan. Food Ind. Res. Develop. Inst. CCRC.

Mycological Monograph 12, 55 pp. ( in Chinese with English Summary )

89. Tzean, S. S., Liou, J. Y., and Shih, J. Y. 2002-2005. Nematophagous fungi. USA

US 6,168,947 B (2001/1/2), EU EP 1027828 B (2002/5/3), Japan 3737303

(2005/11/04), Korea 0464059 (2005/2/23), P.R.O.C 2L.99100699.2 (2005/4/12).

90. Tzean, S. S., Shiu, P. Y., and Tzean, Y. 2013. Microchip for identifying Phellinus

species and the method thereof. USA. Patent No. US 8,580,514 B2.

91. Tzean, S. S.* and Torrey, J. G. 1989. Germination and life cycle of Frankia in vitro.

Canadian Journal of Microbiology 35: 801-806.

92. Webster, J., and Weber, R. W. S. 2007. Introduction to Fungi. 3rd

ed. Cambridge,

London, UK. 841 pp.

93. Wingfield, M. J., Crous, P. W., and Tzean, S. S. 1994. Leptographium elegans: a

new species from Taiwan. Mycological Research 98: 781-785.

94. Yao, W. L., Ko, B. S., Liu, T. A., Liang, S. M., Liu, C. C., Lu, Y. J., Tzean, S. S.,

Shen, T. L., and Liou, J. Y*. 2014. Cordycepin Supress Integrin/FAK Signaling

and Epithelial-Mesenchymal Transition in Hepatocellular Carcinoma.

Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry 14, 29-34.

95. Yen, J. H. and Tzean, S. S.* 1996. Efficacy of pesticides against pine wilt caused

by Bursaphelenchus xylophilus. Plant Prot. Bull. 38: 225-234. (in Chinese)

96. Yen, J. H. and Tzean, S. S.* 1996. Study on the complex causal agents of Japanese

black pine, Pinus thunbergii, wilt disease. Plant Prot. Bull. 38: 215-224. (in

Chinese)

97. Yen, J. H., Tzean, S. S., and Chang, R. J. 1997. Occurrence of pine wilt disease in

Taiwan red pine, Pinus taiwanensis, in Taiwan. Plant Pathol. Bull. 6: 49-57. (in

Chinese)

Page 35:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

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Fig. 1. The multi-roles played by the kingdom Fungi.

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Fig. 2. The multi-mission of Applied Mycology Lab, Department of Plant Pathology

and Microbiology, National Taiwan University. Research activities include: fungal

bioprospecting, biocontrol of plant parasitic insect, nematode, fungal pathogen,

invasive weed, biochip study for detection and diagnosis of crucial crop fungal

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

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pathogens, biology and sustainable application of medicinal mushrooms Ling-Chih and

Niu-Chang-Chihi.

Fig. 3. Several published monographs on domestic Aspergillus, Penicillium,

entomopathogenic fungi, nematode-trapping fungi, Snow Valley Creek Nature Reserve

Hundred Large Mushrooms, and Atlas of potential fungal pathogens associated with

imported agricultural commodity to Taiwan.

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Fig. 4. The 2nd

edition of Fungal Flora of Taiwan 「臺灣真菌誌」(2009), and the

scheduled publishing of 3rd

edition of Mycobiota Taiwanica 「臺灣真菌誌」(2014).

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Fig. 5. Biochips for detection of Phellinus noxius and allied tree pathogens.

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Fig. 6. Strategy proposed to control tree brown-rot caused by Phellinus noxius.

褐根病防治標準作業流程(SOP) 褐根病防治管理手冊

病害診斷鑑定 病害診斷鑑定

珍貴樹木健

檢、撫育

生產履歷、健康

苗木認證

病徵病灶 菌落顯微鏡檢特徵 分子診斷鑑定

病徵病灶 菌落顯微鏡特徵 分子診斷鑑定

任一診斷成立

早期

(無病徵或病徵

不明顯)

中期

(病徵明顯

少葉化、小

葉化)

晚期

(病徵明顯、樹

勢極衰微或枯

死)

樹木褐根病防治管理手冊與標準作業流程之比較

根基部組織灌注系統性

殺菌劑,根域澆灌系統性

殺菌劑

移除病株、徹底清除

根系組織、整平曝曬

每 1-3月一次

連續三次,視需要得再追

3-6個月後,種植花

草或耐病、抗病樹種

邁隆或邁隆加石灰、尿

素、土壤燻蒸

認定為樹癌,立即砍伐

病株,移除根砧、根系

燻蒸處理約 1-1.5個月

種植前再燻蒸

根基部組織

分離培養,病

原盛行率調

根基部組織

分子檢測分

地上根莖

部菌絲

層、子實體

消除

設立安全警示

標識、誘導氣

根成為側根、

設置安全支架

生態撫育、添加

有機質、烏肥、

拮抗微生物、土

壤物化特性改

挽救失敗之

樹木,則以

晚期之方法

清除處理

樹木妥善撫育管理、認養照顧、疫情通報、即時防治

任一診斷成立

(林試所推薦)

(中華民國植物病理學會推薦)

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Fig. 7. Transformation of entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplae with

DHN-melanin biosynthesis genes to enhance anti-stress capacity and virulence toward

insect pests.

(Courtesy of Mycology Online)

OOnline )Online)

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Fig. 8. Mycoparasitism of vesicular arbuscular mycorrhizal fungus by

Phytochytrichum kniepii which harboring with Spiroplasma-like organisms.

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Fig. 9. Phylogenetic tree of nematode-trapping fungi based on r-DNA sequences

analysis derived from Maxium Parsimony method.

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Fig. 10. The evolution of trapping devices based on ITS1 and ITS2 region analysis of

clampless nematode-trapping fungi.

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Fig. 11. The symptom of wilted pine tree in Yang-Ming Shan Natural Parks and the

associated long-horn beetle larvae, feeding debris and emergency hole.

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Fig. 12. The morphology and structure of male and female pinewood nematode

Bursaphelenchus xylophilus retrieved from Yang-Ming Shan National Park and the

illustrations by Mamiya and Kiyohara (1972).

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Fig. 13. Disease cycle of pinewood wilt nematode.

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Fig. 14. Infection of pinewood nematode by stephanocyst of Hyphoderma

praetermissum and H. puberum.

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Fig. 15. Transmission and scanning electron-microscopy of pinewood nematode

infected by Hyphoderma praetermissum.

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Fig. 16. Infection of pinewood nematode by H. praetermissum (A) and poisoned and

colonized by H. mucronatum (B-D).

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Fig. 17. Illustration of new genus, new species, Esteya vermicola parasitizes on

pinewood nematode.

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Fig. 18. Microphotographs show morphological characteristics of E. vermicola and

infection of pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus.

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Fig. 19. Infection of invasive weed Mikania micrantha by introduced rust Puccinia

spegazzinii.

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Fig. 20. The released rust P. spegazzinii infects the invasive Mikania weed establishing

in nine southern central counties, covering 4500 km2.

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Table 1. Strategy for control of pinewood wilt disease caused by Bursaphenchus

xylophilus.

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Table 2. Mode of parasitism of Hyphoderma species on pinewood nematode B.

xylophilus.

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Table 3. Infectivity of Hyphoderma praetermissum stephanocyst on different

nematodes.

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黃振文

現 職

國立中興大學植物病理學系 特聘教授

學經歷

1978-2000 中興大學植物病理學研究所 碩士

1990-2000 美國喬治亞大學 博士

1998-2000 國立中興大學農推中心 主任

2000-2006 國立中興大學植物病理學系 系主任

2006-2012 國立中興大學農資學院 院長

2006-2007 中華民國植物病理學會 理事長

2006-2008 亞洲農學院校協會 會長

2009-2011 國科會農業環境學門 召集人

2009-2011 中華民國真菌學會 理事長

2010-2014 中華永續農業協會 理事、副理事長

2011-2012 國立中興大學國際農企業學士學程 主任

2012-2013 教育部顧問室 顧問

2014-2016 中華永續協會 理事長

專 長

植物病理學、植病防治學、植物病害診斷、鐮孢菌分類、農業廢棄物再利

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真菌的多樣角色—以生物防治劑之菌源為案例

黃振文 1*、陳錦桐 2、林宗俊 2

1 國立中興大學植病系

2 農委會農試所植病組

* 通訊作者:黃振文 [email protected]

摘 要

在自然界存在的真菌約有 10 萬種以上,遍佈於世界各地的土壤、水、空氣及

動植物活體與死體等處所。真菌體內沒有葉綠素,無法利用二氧化碳營自營生活,

是以寄生、腐生或共生方式攝取營養源。一般常見的真菌分成五大類,即鞭毛菌、

接合菌、子囊菌 、擔子菌及不完全菌等。在生態系中,真菌主要扮演著分解者的

角色外,它尚可為害動植物;此外,真菌也可作為食品、醫藥、環保、生化、造紙

及生物農藥等產業的多元用途。本文主要內容在於介紹: (一) 利用菇類代謝產物

防治作物病害; (二) 以 Alternaria 蛋白激活子防治作物病害。

關鍵詞:真菌、分解者、工業真菌、生物防治劑、激活子、菇類

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Diversity roles of fungi — as a source of biocontrol agents

Huang, J. W. 1, Chen, J. T.

2, and Lin, T. C.

2

Department of plant pathology, National Chung Hsing University, Taichung 40227,

Taiwan1

Division of plant pathology, Taiwan Agricultural Research Insititule, Wufeng 413,

Taiwan2

ABSTRACT

In nature, more than 100,000 kinds of fungi exist in the soil, water, air and living

or dead bodies of animals and plants. Unlike plants, fungi lack the green pigment

chlorophyll. Therefore, they cannot transform carbon dioxide to carry out

photosynthesis for producing chemical energy of sugars. Scientific evidences indicate

that fungi have developed three strategies such as saprophytism, parasitism and

symbiosis to uptake nutrient sources. In general, fungi were classified into five

categories, namely, Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota and

Deuteromycota. In the ecosystem, the majority of fungi do play a role of decomposer,

but a few can be the pathogen of plants and animals. Furthermore, fungi could also be

applied for food, pharmacentical, environmental, biochemical, biopulping, and other

industrial purposes as well as biocontrol agents. The main content of this article to

discuss (1) the application of mushroom secondary metabolites for control of plant

diseases; (2) the development of protein elicitor isolated from Alternaria spp. for

controlling plant diseases.

Key words:Fungi, decomposer, industry fungi , biocontrol agents, activator,

mushrooms

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利用菇類代謝產物防治作物病害

臺灣地處熱帶與亞熱帶地區,氣候高溫多濕及高密度集約式的耕作方式,農

作物容易滋生病蟲害,農民為提高作物產量與品質,常會施用化學肥料與化學農

藥來補充作物所需養份和防治作物病蟲害。不過,施用過多氮肥常會造成土壤酸

化或劣化;而毫無節制的重複或過量使用化學藥劑,往往造成抗藥性菌系與害蟲

的產生、土壤及水源的污染以及農藥殘留的問題,已經普遍受到社會的關注。近

年來利用用微生物防治植物病害、蟲害及草害成為植物保護工作的熱門研究課題。

生物防治是利用一種或多種拮抗微生物,在自然或人為調控的環境下,降低病原

菌的存活密度、生物活性或感染作物能力,進而達到防治植物病害的目標(4, 5, 6,

8)。鑑於時勢的需求與市場的潛力,近年來學者們致力於篩選利用有益拮抗微生

物,如枯草桿菌 (Bacillus spp.)、放線菌 (Streptomyces spp.)、螢光假單胞菌

(Fluorescent pseudomonads )、 木 黴 菌 (Trichoderma spp.) 及 膠 狀 青 黴 菌

(Gliocladium spp.)等,藉以研製生物性農藥或抑病栽培介質,為植物病害綜合

防治管理的重要策略,有效協助農業永續經營,提升農作物產品的衛生安全。

生物製劑除了上述的微生物外,在真菌中的擔子菌類,有些二次代謝產物具

有抗細菌、抗真菌、抗病毒、細胞毒素或幻覺劑的活性,也可作為植物生長調節

劑(7, 15, 16, 18, 21)。Kupra 氏 1979 年 (22) 與 Benedict & Brady 1972 年 (7) 提

出菇類菌絲細胞外二次代謝產物具有抗細菌作用。許多食藥用菇蕈本身除了具有

食用價值外,也兼具有藥理功能,尤其是二次代謝物質,其功能並非在維持自身

生命所需,然而以生態觀點而言,它們為了適應環境,諸等二次代謝物具有克敵、

誘敵、逃避,毒他等功能,可用來防禦其他生物的侵襲 (2)。菇類尤其是擔子菌

及少數子囊菌所生產的二次代謝產物,含有其他真菌類少見的特徵,其中以多糖

體和三帖類為最明顯,主要的目的在於防衛外來病原菌的侵入;且又具有機能性

成分,以提高自身免疫力為主。防禦性物質主要為 (a) 抗生素:目前所知菇蕈類

所產生的天然抗生素就超過一百種,田蘑菌(Agrocybe spp.)產生 agrocybin 具有

抗格蘭氏陰性與陽性細菌功效 (27),香菇(Lentinus edodes)具有 Lentinamycin A,

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B 可抗真菌、細菌的功效等等;(b) 抗腫瘤:靈芝(Ganoderma lucidum)具有靈

芝多糖可抗腫瘤 (1);(c) 抗病毒物質:香菇含有 FBP 蛋白質可抑制病毒的感染

(20)等等。

菇類與其特殊的成分具有抗微生物活性引起科學界的注意,許多細菌逐漸對

一 般 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 如 金 黃 葡 萄 球 菌 對 甲 氧 苯 氰 黴 素 MSRA

(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)和螢光假單胞菌 Pseudomonas 有抗性,

而由菇類分離萃取新的防治藥劑成為一種可行方式(31)。在 2000 年 Suay 氏 (36)

等學者篩選 204 種擔子菌, 45% 具有有抗微生物活性,其中白蘑科

(Tricholomataceae)58 個菌株中有 26 個具有抗細菌性,21 個具有抗真菌性。1980

年代末期,由 Anke 等人 (3) 由松樹毬果長出的野生菇類 (Strobilurus tenacellus

(Pers. ex Fr.) Singer) 分離出一種殺菌效果優異,具系統移行性的成分 strobilurin A;

這些天然抗菌物質在發現其化學成份,最近經改良後,不僅對光線反應穩定,具

系統性,主要作用機制是藉由阻礙細胞色素 bc1 複體傳遞電子作用,進而抑制真

菌粒線體呼吸作用,具保護及治療效果,且施用後無植物藥害情形,在 1995 年後

於美國陸續發展出來的新型藥劑登記上市。由這個 S. tenacellus 野生菇類萃取出

來的物質,專利的衍生物超過 400 種以上,較著名有亞托敏 (azoxystrobin),克收

欣 (kresoxim methyl) 及三氟敏 (trifloxystrobin) 等。殺菌成分 strobilurin A 源自於

野生菇 S. tenacellus;而 oudemansin A 來自黏小奧德菇 Oudemansiella mucida

Hoehn;這些都是由菇類天然抗菌物質開發成植物保護製劑成功案例。這些藥劑

在臺灣也已經取得農藥許可,如殺菌劑亞托敏 23%水懸劑,農藥許可證為農藥進

字第 1825 號,對動物低毒,對天敵安全,在環境中不會累積,滲透移行性佳,耐

雨性佳。可防治葡萄、胡瓜、結球白菜露菌病、洋香瓜蔓枯病,檬果、蓮霧、木

瓜、番石榴炭疽病,馬鈴薯、番茄晚疫病,香蕉黑星病,蔥紫斑病,梨輪紋病,

柑桔瘡痂病。

食用菇類紫丁香蘑 (Clitocybe nuda) 的子實體被研究發現具有強大的抑制腸

球菌(Enterococcus faecium)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(28, 36) 與

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白色念珠菌(Candida albicans)(13, 36) 的生物活性。而在 2000 年 Sangita & Agate

二位學者 (33) 以 UV 光譜認為紫丁香蘑抑制金黃葡萄球菌的水溶物質為具乙炔

類(polyacetylenic)的化合物。除了菇類子實體外,Kupra 氏 1979 年 (22) 與 Benedict

& Brady 1972 年 (7) 提出菇類菌絲細胞外二次代謝產物具有抗細菌作用。有學者

以臺灣地區的各食用菇類菌株之培養濾液的對於植物病原真菌與細菌進行抗菌活

性分析;結果發現這些菇類菌株的培養濾液具有抑制植物病原菌的效果,且抑菌

功效會隨菇類菌株的不同而有明顯的差異,其中香菇與紫丁香蘑菌株之培養濾液

可完全的抑制白菜炭疽病菌 (Colletotrichum higginsianum) 的孢子發芽;香菇、紫

丁香蘑及靈芝 (Ganoderma lucidum) 菌株之培養濾液對十字花科蔬菜黑斑病菌

(Alternaria brassicicola) 的孢子亦有抑制發芽的效果;香菇、紫丁香蘑、雞腿蘑

(Coprinus comatus) 及金耳 (Tremella aurantialba) 等四個菌株之培養濾液則可完

全抑制番椒疫病菌 (Phytophthora capsici) 的游走孢子發芽。對於植物病原細菌方

面,則發現香菇、柳松菇 (Agrocybe cylindracea)、靈芝及舞菇 (Grifola frondosa) 等

四個菌株培養液可顯著抑制細菌性果斑病菌 (Acidovorax avenae subsp. citrulli)

的細胞增殖;柳松菇之培養濾液尚可抑制海芋軟腐細菌 (Pectobacterium

carotovorum subsp. carotovorum);舞菇、柳松菇與香菇的培養濾液則可抑制蓮霧

青枯病菌 (Ralstonia solanacearum);而香菇、紫丁香蘑及柳松菇的培養濾液尚可

抑制水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 的生長 (9)。

陳與黃 (10) 以紫丁香蘑的培養濾液進行溫室試驗,發現噴佈紫丁香蘑 LA82

菌株的培養濾液,可使番椒疫病罹病率由 100%下降至 11%,具有效抑制番椒疫

病發生的效果;對茄科細菌性斑點病也有降低罹病度的效果。陳等人在 2012 年

(11),進一步發現紫丁香蘑培養液的抗菌物質具有對熱及酸鹼值的穩定性,利用

管柱層析、紅外線光譜、核磁共振及質譜儀圖等相關分析,分離出 3 種天然化合

物,分別為 2-methoxy-5-methyl-6-methylenemethoxy -p-benzoquinone,分子結構式

為 C10H12O4; 6-hydroxy-2H-pyran-3-carbaldehyde,分子結構式為 C12H10O5 及

indole-3-carbaldehyde,分子結構式為C9H6NO;其分子量分別為 196, 126, and 145,

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屬小分子量的物質,其中第一個化合物是全新發現的天然化合物,而化合物 2 與

3 則在紫丁香蘑首次被發表;顯示出這些來自食用菇類天然的化合物的確具研發

成為植物保護製劑的潛力。

以 Alternaria 蛋白激活子防治作物病害

植物遭受病原菌攻擊時,會出現一系列的防禦反應,例如植體會出現過敏反應

(hypersensitive response)、產生激活態氧 (23)、生合成並累積與致病過程相關之蛋

白質(pathogenesis-related protein, PR) (30) 及植物防禦素 (phytoalexin) (29)等。植物

之防禦反應還可擴展至未受侵染的部位,因而對隨後入侵植體的病原菌產生抗性,

此現象稱為系統性誘導抗病 (systemic acquired resistance, SAR) (35)。SAR賦予植株

抵抗病原菌侵染的能力,並伴隨產生一系列PR-protein,這些蛋白質基因的表現在

植株抗病反應中扮演著極重要的角色。雖然這種誘導抗病因子不能遺傳,但由於其

具有廣效性與系統性等特性,已普遍引起學者濃厚的興趣,是目前生物防治的重要

研究方向。

一般微生物之誘導因子可分為細菌、真菌及病毒等三類。細菌可作為誘導因

子 (elicitor) 的種類包括死體、活體的病原細菌和非病原細菌及菌體之脂多醣

(lipopolysaccharide, LPS)、胞外多醣 (exopolysaccharide, EPS) 等;真菌作為誘導

因子的種類包括病原菌、非病原菌、菌絲體、細胞壁片段及培養液;病毒則以低

毒性株系或病毒輔助因子作為誘導因子。

近年來,學者們從植物病原菌中發現具有誘導植物產生廣效抗性和促進植物

生長的多功能蛋白激活子類物質如 Harpin 和 Elicitin。在植物病原細菌中存在著誘

導植物產生多種抗性的信號分子, Harpin 就是其中之一。西元 1992 年 Wei 等

人 (38) 首次探討梨火傷病菌 (Erwinia amylovora) 的一種新蛋白質 HarpinEa 造

成植物的過敏反應 (hypersensitive response, HR) 與其誘導抗病間的關係。由於

Harpin 蛋白可同時決定病原細菌對寄主植物的致病性和非寄主植物的過敏反應,

因此,學者對植物病原細菌 hrp 基因的分佈、結構、功能等曾有深入的研究。西

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元 2000 年美國 EDEN 公司業已將 HarpinEa 研發成生物農藥,其商品名為

Messenger® 。此外,Elicitin 泛指由疫病菌屬 (Phytophthora) 如 Phytophthora

cryptogea、P. cinnamomi 或 P . capsici 分離得到分子量約為 10kDa 的蛋白類激活

子 (17, 32, 39)。Elicitin 是一類外泌小分子耐熱蛋白,在培養液中含量極多,可

誘導煙草、油菜及蘿蔔產生過敏性反應和誘導抗性等防禦反應 (19, 32)。研究證

明 Elicitin 是透過水楊酸之抗病信號途徑,誘導植物對真菌、細菌等病原微生物

產生系統獲得抗性。

誘導植物發生防禦反應的機制大致可分為 (a) 激活子與植物的細胞膜上都存

在有類似受體 (receptor) 的結合蛋白結合,通過構型變化激活胞內有關抗性酵素活

性,再進一步修飾胞內基質,然後產生激活性信號分子。蛋白質磷酸化的作用是使

胞內特定酵素系統活化,形成第二信使,再將信號放大,最後經由特殊基因的調節,

進而激活防禦的反應; (b) 誘導植物結構抗性物質的變化,主要是細胞壁的強化,

包括木質素沉積 (37)、乳突體 (34) 及膠質體的形成 (12)、酚類化合物 (26) 的產

生;(c) 增加植物體內過氧化物酵素、多酚氧化酵素、苯丙氨酸氨裂解酵素 (14) 及

幾丁質酵素 (25) 活性增加。這些防禦酵素能夠有效分解病原菌的細胞壁和抑制病

原菌在植體內生長;(d) 誘導植物產生抗菌物質:此類抗菌物質主要以產生致病過

程相關之蛋白質及植物防禦素 (phytoalexins) 等。

往昔筆者的研究也證實由 Alternaria brassicicola ( ABA)、A. alternata (ALA)

及 A. tenuissima (APR01) 等植物病原真菌之菌絲體所抽取的蛋白質,若施用於白

菜及胡瓜植株上,可有效降低白菜幼苗立枯病與胡瓜炭疽病的發生。進一步筆者

以液相分析管柱分離 APR01 之不同性質蛋白質,評估它們的生物活性後,進而選

出具有功能的蛋白並純化之。將純化的蛋白質進行胺基酸序列解序,並反推核酸

序列以選殖它的調控基因,結果將該基因與國外 Mao et al. (24) 等學者選獲之序

列進行比較,證實 APR01 的蛋白基因多了三個 base,是一種新發現的蛋白激發子

基因。由 ARP01 獲得的蛋白激發子具有促進作物生長,並誘導胡瓜抗炭疽病菌

與白菜抗立枯絲核菌的效果,處理該真菌蛋白後植物之 PAL 及 POD 等酵素的

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活性明顯的增加,具有發展成植物保護治劑的潛力;此外,我們亦成功地將具有

誘導植物抗病能力的 Alternaria 蛋白質基因轉殖至大腸桿菌中,大量表現該蛋白,

並證實重組蛋白的粗萃取液可有效減少胡瓜炭疽病的發生。顯然未來我們可利用

轉殖技術量產此一真菌蛋白質,藉以研製另一新穎的植物保護製劑。

參考文獻

1. 水野卓、川合正允。1996 。菇類的化學生化學。國立編譯館出版。台北。409pp。

2. 陳啟楨。1999。菇類二次代謝物質及其利用。食品工業月刊 31:1-11。

3. Anke, T., F. Oberwinkler., Steglich, W. Schram, G.1977. The strobilurins—new

antifungal antibiotics from the basidiomycete Strobilurus tenacellus. J. Antibiot.

30:806-810.

4. Axelrood, P. E. 1991. Biological control of plant pathogens: principles and

strategies. pages 127-132 in: Proceedings of the First Meeting of IUFRO Working

Party S2.07-09 (Diseases and Insects in Forest Nurseries). J. R. Sutherland and S.

G. Glover. eds., Victoria, B. C.: Forestry Canada, Pacific Forestry Centre, Rept.

BC-X-331.

5. Baker, K. F., 1987. Evolving concepts of biological control of plant pathogens.

Annu. Rev. Phytopathol. 25:67-85.

6. Baker, K. F., Cook, R. J. 1974. Biological Control of Plant Pathogens. W. H.

Freeman &Company, San Francisico. 433pp.

7. Benedict, R. G., Brady, L. R. 1972. Antimicrobial activity of mushroom

metabolites. J. Pharm. Sci. 61: 1820-1822.

8. Campbell, R. 1989. Biological Control of Microbial Plant Pathogens. University

Press. Cambridge, USA. 218pp.

9. Chen, J. T., Huang, J. W. 2010. Antimicrobial Activity of Edible Mushroom

Culture Filtrates on Plant Pathogens. Plant Pathology Bulletin.19: 261-270.

10. Chen, J. T., Huang, J. W. 2009. Control of plant diseases with secondary

metabolites of Clitocybe nuda. New Biotechnol. 26: 193-198.

11. Chen, J. T., Su, H. J., Huang, J. W. 2012. Isolation and Identification of Secondary

Metabolites of Clitocybe nuda Responsible for Inhibition of Zoospore

Germination of Phytophthora capsici. J. Agric. Food Chem. 60: 7341-7344.

12. Conrath, U., Domard, A., Kauss, H. 1989. Chitosan-elicited synthesis of callose

and of coumarin derivatives in parsley cell suspension cultures. Plant Cell Rep. 8:

152-155.

13. Dulger, B., Ergul, C. C., Gucin, F. 2002. Antimicrobial activity of the macrofungus

Lepista nuda. Fitoterapia.73: 695-697.

Page 67:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

60

14. Green, N. E., Hadwiger, L., Graham, S. 1975. Phenylalanine ammonia-lyase,

tyrosine amonia-lyase, and lignin in wheat inoculated with Erysiphe graminis f. sp.

tritici. Phytopathology 65: 1071-1074.

15. Hautzel, R., Anke, T. 1990. Screening of basidiomycetes and ascomycetes for

plant growth regulating substances. Introduction of the gibberellic acid induced

de-novo synthesis of hydrolytic enzymes in embryoless seeds of Triticum aestivum

as test system. Z. Naturforsch 45: 1093-1098.

16. Heim, R. 1963. Les Champignons Toxiques et Hallucinogenes. Boubee Press,

Paris. 327 pp.

17. Huet, J.-C., Nespoulous, C., Pernollet, J.-C. 1992. Structures of elicitin isoforms

secreted by Phytophthora drechsleri. Phytochemistry 31: 1471-1476.

18. Janssens, L., De Pooter, H. L., Schamp, N. M., Vandamme, E. J. 1992. Production

of flavors by microorganisms. Proc. Biochem. 27: 195-215.

19. Kamoun, S., Young, M., Glascock, C. B., Tyler, B. M. 1993. Extracellular protein

elicitors from Phytophthora: host-specificity and induction of resistance to

bacterial and fungal phytopathogens. Mol. Plant Microbe In. 6: 15-15.

20. Kobayashi, N., Hiramatsu, A., Akatsuka, T. 1987. Purification and chemical

properties of an inhibitor of plant virus infection fom fruiting bodies of Lentinus

edodes. Agric. Biol. Chem. 51:883-890.

21. Korzybski, T., Kowszyk, G. Z., Kurylowicz, W. 1967. Antifungal antibiotics

(polyenes).pages 769-820 in: Antibiotics: Origin, Nature and Properties.

Korzybski, T. ed, Polish Scientific Publishers: Oxford.

22. Kupra, J., Anke, T., Oberwinkler, G., Schramn, G., Steglich, W. 1979. Antibiotics

from basidiomycetes VII. Crinipellis stripitaria(Fr.) Pat., Journal of Antibiotics 32:

130-135.

23. Lamb, C., Dixon, R. A. 1997. The oxidative burst in plant disease resistance.

Annu. Rev. Plant Biol. 48: 251-275.

24. Mao, J., Liu, Q., Yang, X., Long, C., Zhao, M., Zeng, H., Liu, H., Yuan, J., Qiu, D.

2010. Purification and expression of a protein elicitor from Alternaria tenuissima

and elicitor-mediated defence responses in tobacco. Ann. Appl. Biol. 156:

411-420.

25. Mauch, F., Hadwiger, L. A., Boller, T. 1984. Ethylene: symptom, not signal for

the induction of chitinase and β-1, 3-glucanase in pea pods by pathogens and

elicitors. Plant Physiol. 76: 607-611.

26. Mayama, S., Shishiyama, J. 1978. Localized accumulation of fluorescent and

uv-absorbing compounds at penetration sites in barley leaves infected with

Erysiphe graminis hordei. Physiol. Plant Pathol. 13: 347-354.

27. Miller, M. W. The Pfizer Handbook of Microbial Metabolites, McGraw-Hill Book

Company, Inc., New York. 1961; pp 107-117.

Page 68:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

61

28. Mustafa, Y., Bilgili, F. 2006. Antimicrobial activities of fruit bodies and/or

mycelial cultures of some mushroom isolates. Pharm. Biol. 44: 660-667.

29. Osbourn, A. E. 1996. Preformed antimicrobial compounds and plant defense

against fungal attack. Plant Cell 8: 1821.

30. Palva, T. K., Holmström, K.-O., Heino, P., Palva, E. T. 1993. Induction of plant

defense response by exoenzymes of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Mol.

Plant Microbe In. 6: 190-196.

31. Paul , S. 2002. Novel antimicrobials from mushrooms. HerbalGram. 54:28-33.

32. Ricci, P. 1997.Induction of the hypersensitive response and systemic acquired

resistance by fungal proteins: the case of elicitins. pages 53-75 In Plant-microbe

interactions. Springer.

33. Sangita, D., Agate, A. D. 2000. Antibacterial activity of some Indian mushrooms.

Int. J. Med. Mushroom. 2: 141-150.

34. Sherwood, R., Vance, C. 1976. Histochemistry of papillae formed in reed

canarygrass leaves in response to noninfecting pathogenic fungi. Phytopathology

66: 503-510.

35. Sticher, L., Mauch-Mani, B., Métraux, J. P. 1997. Systemic acquired resistance.

Annu. Rev. Phytopathol. 35: 235-270.

36. Suay, I., Arenal, F., Asensio, F. J., Basilio, A., Cabello, M. A., Díez, M. T., García,

J. B., Val, A. G., Gorrochategui, J., Hernández, P., Peláez, F., Vicente, M. F. 2000.

Screening of basidiomycetes for antimicrobial activities. Antonie van

Leeuwenhoek. 78: 129-139.

37. Vance, C. P., Sherwood, R. T. 1976.Regulation of lignin formation in reed

canarygrass in relation to disease resistance. Plant Physiol. 57: 915-919.

38. Wei, Z.-M., Laby, R. J., Zumoff, C. H., Bauer, D. W., He, S. Y., Collmer, A., Beer,

S. V. 1992. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant

pathogen Erwinia amylovora. Science 257: 85-88.

39. Yu, L. M. 1995. Elicitins from Phytophthora and basic resistance in tobacco. P.

Natl. Acad. Sci. USA 92: 4088-4094.

.

Page 69:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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安寶貞

現 職

行政院農業委員會農業試驗所植物病理組

研究員兼組長

學經歷

1974-2000 國立臺灣大學植物病蟲害學研究所 碩士

1987-2000 美國夏威夷大學植物病理系 博士

1976-1987 農業試驗所嘉義分所 助理研究員

1988-1997 農業試驗所嘉義分所 副研究員

1997-1998 農業試驗所植病組 副研究員

1998-2008 農業試驗所植病組 研究員

2008-2014 農業試驗所植病組 研究員兼組長

專 長

植物病理、果樹病害、土壤傳播病害、病害生態、病害防治

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臺灣疫病之現況與病害防治

安寶貞*、蔡志濃

行政院農業委員會農業試驗所植物病理組

*通訊作者:安寶貞 [email protected]

摘 要

植物疫病菌 (Phytophthora de Bary) 種類甚多,目前世界上已發現且可被接

受之有效種 (species) 約有百餘種,存在臺灣的約有 30 餘種,包括 P. amaranthi、

P. arecae、P. boehmeriae、P. cactorum、P. capsici、P. cinnamomi、P. citricola、P.

citrophthora、P. cambivora、P. colocasiae、P. cryptogea、P. cyperi、P. drechsleri、

P. heveae、P. humicola、P. infestans、P. insolita、P. katsurae、P. lateralis、P. leersiae 、

P. lepironae、P. macrospora、P. melonis、P. multivesiculata、P. meadii、P. nicotianae

(=P. parasitica)、P. palmivora、P. tropicalis、P. vignae 及 P. cactorum x P. parasitica。

防治作物疫病之理念是預防重於治療,新入侵疫病菌一但侵入後,幾乎無法根除;

而植物一但罹患疫病,幾乎無法治癒,且花費不貲。防治作物疫病應採用綜合管

理作業,依據植物病害中之寄主、疫病菌、環境三者間之三角關係,從加強植物

之抗 (耐) 疫病性、降低疫病菌之致病力與活性、及製造不適合病害發生之環境

等方面著手,來切斷誘發病害之個個環節。由於大部分疫病菌為土棲性,初次感

染源大多來自種苗、栽培介質 (含土壤) 及水源,因此防治之道首重健康種子種

苗、抗病育種、清潔介質及田間衛生,再配合物理、生物、化學及法規防治,以

遏止與降低植物疫病之發生與危害。

關鍵詞:疫病、疫病菌、病害防治。

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緒 言

疫病菌 Phytophthora de Bary 自 1876 年 de Bary 命名以來,為害作物在千屬

以上,是非常重要之植物病原菌之一。目前可被接受之有效種 (species) 已有百

餘種以上,有半數為近 20 年才浮現的新種。依據「臺灣植物病害名彙」(4) 及近

年論文發表之記載,為害臺灣農作物之疫病菌共有 30 種,寄主則在百餘種以上。

疫病菌的菌絲白色透明,表面不規則,無隔膜,分歧處成直角;菌落純白色,

有的種有特殊花紋。無性生殖主要為形成孢囊 (sporangia) 與游走子 (zoospores)。

孢囊著生在孢囊梗 (sporangiophores) 上,有不同的著生方式。孢囊球形、卵形、

檸檬形、橢圓形、洋梨形、偶而不規則。孢囊可直接發芽侵入寄主,亦可在低溫

高濕環境下釋放游走子,成為感染源。有性生殖為形成卵孢子 (oospores),一般

一個藏卵器 (oogonia) 與一個藏精器 (antheridia) 結合,藏精器的著生方式有底

著 (amphigenous) 與側著 (paragenous) 兩種。有些疫病菌單獨培養即可行有性生

殖,稱為同絲型 (homothalism);大部分疫病菌需要不同配對型共同培養才可行有

性生殖,稱為異絲型 (heterothalism)。孢囊與游走子為疫病菌之主要傳播與侵染

器官;而卵孢子則為殘存器官,可以在土壤與殘體中存活數年。

疫病菌在 1980 年代以前被認為是低等真菌 (lower Fungi),其分類地位如

下:

真菌門 (Eumycota)

藻菌綱 (Phycomycetes)

卵球菌亞綱 (Oomycetes)

露菌目 (Peronosporales)

腐霉菌科 (Pythiaceae)

疫病菌屬 (Phytophthora)

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而後因生物科技進步,發現疫病菌在基因等分子層次與一般真菌相差很遠,

包括細孢壁構造與成分 (主要為纖維素 cellulose),儲存物質成分 (主要為葡聚醣

β-1,3 glucans)、體細孢形態 (多核無隔膜 coenocytic)、體細孢核的數目 (雙套

diploid)、粒腺體脊 (mitochondrial cristae) 的形狀 (管狀 tubular) 等,顯示疫病菌

反而與藻類比較接近,其現代分類地位如下:

真核領域 (Eukaryota Domain)

藻菌界 (Chromista 原藻界) (12),Stramenopila 或 Chromalveolata

(21)

不等鞭毛類 (Heterokonta) Heterokontophyta

卵球菌門 (Oomycota)

卵球菌綱 (Oomycetes)

露菌目 (Peronosporales)

腐霉菌科 (Pythiaceae)

疫病菌屬 (Phytophthora)

此外,比對一些基因 DNA 序列,有學者認為疫病菌與露菌比較接近 (13),因

此,有關分科部分,亦有不同意見。

然而,在傳統鑑定中與疫病菌最容易混淆者為腐霉菌。兩者最大的差別為疫

病菌在間接發芽時,遊走子的分化是在孢囊中進行;而腐霉菌則是孢囊的先端先

長出 extrusion tubes 與 viscles,原生質在 viscles 分化。此外,利用選擇性培養

基也可以區分兩屬菌 (23) 茲將兩者的區別列表於下:

表一、疫病菌與腐霉菌之區別

形態與生理特性 Phytophthora Pythium

菌絲形態 分歧直角,菌絲表面不平滑 分歧角度小,菌絲平滑

生長速率 相對較慢 相對較快

孢囊 球形或近似球形 菌絲狀、指狀、球型及其近似

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形狀、或無

游走子分化 孢囊內 孢囊長出之 vesicle 內

卵孢子大小 體積相對較大 體積相對較小

藏精器數目 單一藏精器附著於單一藏卵器 一或多個藏精器附著於單一藏

卵器

寄主與為害部位 幼苗與成株,地上與地下部 幼苗或根系,地下部位

疫病菌的傳統分類

疫病菌之分類以形態特徵為主,生理生化特性與病原性為輔。形態特性包括:

孢囊、有性器官、菌絲膨脹體、厚膜孢子、菌落形態。生理生化特性:生長溫度、

生化反應。病原性:寄主範圍。選擇性培養基:分離疫病菌與其他菌區隔。

疫病菌之重要形態特徵:(1) 孢囊:a.乳頭狀突起 (papilla) 程度或無;b.孢

囊脫落或不脫落;c.孢囊柄長 (pedicel length);d.孢囊再生情形;e.孢囊在孢囊梗

上排列的情形;f.孢囊長寬比 (Length/Broad);g.孢囊的大小-P. botraysa 的孢囊

非常小。(2)有性器官:卵孢子: a.藏精器著生的方式:底著或側著;b.大小;c.藏

卵器表面形態-有顯著之突起,如 P. katsurae。(3)厚膜孢子 (chlamydospores)-有無、

大小、多寡;例如 P. cinnamomi 具有大量的厚膜孢子。(4)菌絲膨脹體 (hyphal

swellings) - 容易判別 species。(5) 菌落形態:白色透明。a.菌落平滑或有特殊花

紋 ; b.氣生菌絲之有無;c.菌絲直徑 (粗細)(顯微鏡下)。主要參考分類書籍

Waterhouse 1963, 1970 (16,28)

; Stamp et al. 1990 (25),如 Waterhouse (1963) 之“Key to

the Species of Phytophthora de Bary”

疫病菌之重要生理特性:生長溫度:存在臺灣的菌株一般為中溫菌,菌絲一

般可在 12-32℃下生長,最適約為 24-28℃;最高生長溫度,有些菌耐 36-37℃高

溫,如:P. nicotianae, P. capsici, P. melonis;有些菌最高生長溫度為 24-25℃,為

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低溫菌,P. infestans US11 可生長至 27-28 ℃。

茲將臺灣目前常見的菌,以二分法分類如下

Dichotomous Key to Taiwan Species of Phytophthora (Ho, modified)(17)

1.Microorganism cannot be culture on agar media …………………… 2

1.Microorganism can be cultured on agar media ………………………. 5

2.Oogonia over 50 μm diam …………………………………………..... 3

2.Oogonia under 50μm diam ………………………………..………….. 4

3.Antheridia paragynous ………………………………..………………. macrospora

3.Antheridia amphigynous ……………………………………………… leersiae

4.Sporangia oblong-ovoid(length/breadth: 1.6-1.7) …………………..... cyperi

4.Sporangia.spherical-ovoid(length/breadth: 1.1-1.2)…………………… lepironae

5.Sex organs produced readily in singly culture………………………… 6

5.Sex organs not or scarcely produced in singly culture………………… 14

6.Antheridia absent ……………………………………………………… insolita

6.Antheridia present……………………………………………………... 7

7.Antheridia predominantly paragynous ……………………………….. 8

7.Antheridia amphigynous ……………………………………………… 9

8.Sporangia non-papillate….. …………………………………………... humicola

8.Sporangia semi-papillate………………………………………………. citricola

8.Sporangia papillate…………………………………………………….. cactorum

9.Sporangia non-papillate ……………………………………………….. 10

9.Sporangia semipapillate or papillate ………………………………….. 11

10.Good growth on agar at 35C ………………………………………… melonis

10.No or slight growth on agar at 35C, but good growth at 30C……….. vignae

10.No or slight growth on agar at 30C………………………………….. multivesiculata

11.pathogenic to amaranthus …………………………………………….

11. non-pathogenic to amaranthus ………………………………………

12. Oogonia spherical…………………………………………………….

Amaranthi

12

boehmeriae

12..Oogonia pyriform with tapered base………………………………… 13

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13.Oogonia wall smooth……………………………………………….... heveae

13 Oogonia wall verrucose….…………………………………………... katsurae

14.Sporangia non-papillate.... …………………………………………... 15

14.Sporangia pa pillate to semi-papillate ……………………………..... 16

15.Oogonia wall verrucose, spherical hyphal swellings in clusters…….. cambivora

15.Hyphae coralloid with large spherical swellings in clusters…………. cinnamomi

15.Hyphae uniform; sporangia reovoid to obpyriform; mostly no or

limited growth at 35C ………………………………………………

cryptogea

15.Hyphae uniform, sporangia ovoid or ellipsoidal, good growth at 35C dreckhsleri

16.Sporangiophore branching compound sympodial …………………… infestans

16.Sporangiophore branching simple sympodial ………………………. 17

17.Sporangia non-deciduous…………………………………………….. 18

17. Sporangia deciduous………………………………………………… 19

18.Good growth at 35C, mycelium tufted ……………………………… nicotianae

(parasitica)

18.No growth at 35C, mycelium finely radiate………………………….. citrophthora

19.Sporangial pedicel over 20μm long……………………..…………… 20

19.Sporangial pedicel 5-20μm long…………………………………….. 21

19.Sporangial pedicel under 5-20μm long……………………………… 22

20.Chlamdospores absent …………………………………………… capsici

20.Chlamdospores present ……………………………………………… tropicalis

21.Sporangia elongate, ellipsoidal to fusiform………………………….. colocasiae

21.Sporangia ellipsoidal to variable, often asymmetrical ……………… Meadii

22.Sporangia broadly ellipsoidal to obturbinate (length/breadth under

1.4) in short irregular sympodia ………………………………………

areace

(palmivora)

22. Sporangia ovoid to ellipsoidal (length/breadth over 1.4) in long

regular sympodia ……………………………………………………..

palmivora

疫病菌出現在臺灣的記錄史 (18)

1. Phytophthroa infestans-Kawakami & Suzuki (1908)

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2. P. cyperi (Ideta) Ito (1908)

3. P. colocasiae Sawada (1911)

4. P. citrophthora (R.E. Smith & E.H.smith) Leonian (1915)

5. P. palmivora (E. Butler) E. Butler (1974) (P. carica 1916)

6. P. leersiae Sawada (1927)

7. P. boehmeriae (1927)

8. P. cactorum (Lebert & Cohn) Schroeder (1927)

9. P. citricola Sawada (1927)

10. P. macrospora (Saccardo) Ito &Tanaka (1927)

11. P. cinnamomi (1965) (P. cinchonae 1936)

12. P. lepironae Sawada (1941)

13. P. nicotianae Breda de Haan (1942) (P. allii 1915; P. melongenae 1915; P. tabaci

1927; P. formosa 1942; P. murrayae 1942; P. ricini 1942; P. parasitica 1944; P.

taihokuensis 1959 )

14. P. capsici Leonian (1977)

15. P. drescheri Thompaon (1977)

16. P. vignae Purss (1977)

17. P. melonis Katsura (1979)

18. P. cryptogea Pethybridge & Lafferty (1978)

19. P. katsurae Ko & Chang (1979)

20. P. insolita Ann & Ko (1980)

21. P. heveae Thompson (1980)

22. P. humicola Ko & Ann (1984)

23. P. meadii McRae (1990)

24. P. arecae (Coleman) Pethybridge (1995)

25. P. tropicalis Aragaki & Uchida (1995)

26. P. cactorum × P. parasitica (1995)

27. P. multivesiculata Ilieva, Man in ’t Veld, Veenbaas-Rijks & Pieters (1996)

28. P. cambivora Maxim. (2004)

29. P. amaranthi (2007)

30. P. lateralis Tucker & Milbrath (2010)

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臺灣疫病菌之寄主範圍(4)

1. Phytophthora nicotianae (1915)

寄主:96 屬(genera),117 種 (species)。1945 年之前:蔥、韭、茄子、番茄、煙

草、月橘、蓖麻 (7 species);1945 年之後:90 屬 110 種 species。包括:

果樹:柑桔 (酸桔、廣東檸檬、柳橙、椪柑、桶柑、海梨、文旦、檸檬、萊母、

茂谷等等)、番石榴、百香果、棗、枇杷、洛神葵、木瓜、鳳梨、桃金孃、

楊桃、草苺、釋迦、奇異果、無花果

蔬菜:洋蔥、芝麻、胡瓜、金針花、芹菜、香菜

特用作物:荖花、老藤、老葉、泡桐

花卉:蘭科 (石斛蘭、文心蘭、蝴蝶蘭、萬代蘭、脫鞋蘭、四季蘭、素心蘭、報

歲蘭)、石竹科 (康乃馨、西洋石竹、日本石竹、滿天星)、菊科 (矢車菊、

銀葉菊、勳章菊、瑪格麗特菊)、木本花木 (變葉木、桂花、九重葛、金露

花、三爪藤、朱槿、聖誕紅、玲瓏扶桑、炮仗花、馬櫻丹、紅蟬、鳥尾花)、

球根花卉 (百合、非洲菫、大岩桐、天堂鳥)、草花 (日日春、螃蟹蘭、雞

冠花、鳳仙花、星辰花(水晶花)、夏蓳、香雪球、藍雪花、美女櫻、翠笛

花、長壽花)、天南星科 (火鶴花、粗肋草、萬年青、白鶴芋、蔓綠絨、黃

金葛)、觀葉植物 (椒草、口紅花、金錢樹、丹藥花、八角金盤、彩葉草、

密葉竹蕉、鑲邊竹蕉、天鵝絨、竹芋、巴西之吻、仙人掌、馬拉巴栗、袋

鼠花、繁星花、伯利恆之星、木芙蓉)

保健與香草植物:香林投、香椿、刺蔥、胡椒木、地黃、薰衣草、鼠尾草

2. Phytophthora palmivora (1916)

寄主:35 屬 (genera),48 種 (species)。1945 年之前:無花果 (1 species);

1945 年之後:34 genera, 47 species。包括:

果樹:柑桔 (酸桔、廣東檸檬、柳橙、椪柑、桶柑、海梨、文旦、檸檬、萊母、

茂谷、溫州柑、金柑等等)、木瓜、酪梨、蓮霧、枇杷、檬果、印度棗

特用作物:泡桐

花卉:蘭科 (嘉德麗蘭、蝴蝶蘭、文心蘭、石斛蘭、拖鞋蘭、萬代蘭、千代蘭、

九華蘭、春蘭、藝蘭、虎頭蘭、台南蘭)、木本花木 (桂花、含笑花、鵝掌

藤、倒掛金鐘、黃蟬、馬拉巴栗)、球根花卉 (百合)、草花 (矮牽牛、薑荷

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花、毬蘭、長壽花、洋桔梗)、觀葉植物 (常春藤、鐵線蕨)

保健與香草植物:香椿、迷迭香、蓖麻

3. Phytophthora capsici (1977)

寄主:15 屬 (genera),25 種 (species)。包括:

果樹:木瓜

蔬菜:甜椒、辣椒、朝天椒、番茄、茄子、西瓜、香瓜、洋香瓜、甜瓜、南瓜、

扁蒲、玩具南瓜、胡瓜、花豆、洋蔥、蘆薈、羅勒;

花卉:康乃馨、西洋石竹、滿天星、大理花、波斯菊、飄香藤;

特用作物:荖花、老葉、老藤

4. Phytophthora infestans (1908)

寄主:3 genera, 4 species,包括:馬鈴薯、番茄、耳鉤草、龍珠

Phytophthora infestans 引起的馬鈴薯與蕃茄晚疫病是世界重要病害,於 1990

年代捲土重來,在全世界各地氾濫成災,甚受國際重視。主要因 A2 與 A1A2

菌系出現,菌系演化速率快,防治困難。因此,我國晚疫病菌菌 A2 系列為檢疫

病原菌。

臺灣地區 1997 年冬季爆發嚴重晚疫病,經數年研究,發現為新入侵菌系 US-11

造成,配對型 A1,抗滅達樂。近 17 年來,一直監測田間晚疫病菌配對型之變異,

均無巨大變化,共檢定 382 罹病田的 1696 支菌株,均為 A1 配對型 ;且該病害

亦在妥善之掌控中。

5. Phytophthora citrophthora (1915)

寄主: 15 genera, 21 species。1945年之前:柑橘 (1 genus);1945年之後:16 genera,

22 species。包括:

果樹:柑桔 (酸桔、廣東檸檬、柳橙、椪柑、桶柑、海梨、文旦、茂谷、金柑

等等)、桃、馬拉巴栗、番荔枝、楊桃、草苺

花卉:火鶴花、黃金葛、日日春、仙克來、七里香、竹芋、毬蘭、文心蘭

保健與香草植物:防蚊草

6. Phytophthora melonis (1979)

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寄主:6 genera, 9 species,主要為瓜類,包括胡瓜、絲瓜、苦瓜、冬瓜、西瓜、

洋香瓜、甜瓜、扁蒲、印度棗

7. Phytophthora cinnamomi (1936)

寄主: 12 genera, 14 species。1945 之前:2 species (小葉雞納樹、大葉雞納樹);

1945 之後:11 genera, 12 species。包括:

酪梨、鳳梨、金絲桃、蘇鐵、美葉蘇鐵、杜鵑、肉桂、蘭嶼肉桂、茶花、 樟

樹、肖楠、柑桔 (酸桔、廣東檸檬、椪柑、桶柑、海梨、文旦)、秋海棠、蓮霧、

琴葉榕

8. Phytophthora colocasiae (1911)

寄主:芋、野芋

9. Phytophthora citricola (1927)

寄主:4 genera, 4 species。1945 之前:柑桔;1945 之後:杜鵑、草苺。

10. Phytophthora cryptogea (1978)

寄主: 11 species。包括:

果樹:蓮霧、香丁

蔬菜:紅鳳菜

花卉:非洲菊、菊花、麒麟菊、瓜葉菊、康乃馨、香雪球、聖誕紅

保健與香草植物:丹參

11. Phytophthora drechsleri (1978)

寄主: 10 species。包括:

蔬菜:紅鳳菜、萵苣、白菜、馬鈴薯

特用作物:向日葵

花卉:聖誕紅、矮牽牛、百合、金毛菊

保健與香草植物:黃耆

12. Phytophthora meadii (1990)(22)

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寄主:虎班粗肋草、海芋、桃

13. Phytophthora tropicalis (1995)

寄主:4 species, 康乃馨、迷迭香、長春藤、杜鵑

14. Phytophthora cactorum (1927)

寄主:9 species。包括:

1945 之前:槭、苧麻、毛百合、蘋果、人參、柑橘

1945 之後:草苺、枇杷、一葉蘭

15. P. boehmeriae (1927)

寄主:苧麻

16. Phytophthora mutivesiculata (1996)

寄主:虎頭蘭

17. Phytophthora arecae (1995)

寄主:檳榔

18. Phytophthora cambivora (2005)

寄主:山櫻花

19. Phytophthora vignae (1977)

寄主:豇豆、豌豆

20. Phytophthora amaranthi (2007)(3)

寄主:莧菜。

21. P. lateralis (2010)

寄主:檜木

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22. P. katsurae (1979) (森林土)

23. P. heveae (1980) (柑桔土、鳳梨土、檳榔、桃及龍眼之土壤)

24. P. insolita (1980)(7)

(柑桔土、楊桃土、水溝水)

25. P. humicola (1984) 弱病原菌;寄主:柑桔、花豆、康乃馨、菊花

26. P. cactorum × P. parasitica (1995)

寄主:枇杷

疫病的防治

作物疫病之防治理念與其他病害相同,為預防絕對重於治療。植物罹患疫病

後,幾乎無法治癒,且花費不貲。防治疫病應注重綜合管理,在進行作物病害防

治之前,先要瞭解疫病菌與疫病,包括病害史、初次感染源、侵染方式、發生生

態及防治方法。在防治策略部分,由於大部分疫病菌為土棲性,初次感染源大多

來自種苗、栽培介質 (含土壤)及灌溉水源,因此首重健康種子種苗、介質管理及

田間衛生。由於罹患疫病之植物種類繁多,各種植物之栽培環境與疫病發生之條

件不盡相同,因而防治策略亦有差異,茲將防治植物疫病之綜合注意事項分述如

下:

1. 檢疫 (法規防治)

疫病菌一但入侵後往往造成重大的經濟損失,幾乎無法根除。在臺灣,近 40

年來入侵許多疫病菌,造成嚴重之經濟損失。包括:P. capsici (為害茄科、瓜類、

花卉);P. melonis (為害瓜類);P. cryptogea (為害菊科、苗木);P. drechsleri (為害

苗木);P. meadii (為害白色海芋、桃果實);P. tropicalis (為害花卉);P. mutivesticulata

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(為害虎頭蘭);P. cambivora (為害山櫻花);P. infestans US11 (為害番茄、馬鈴薯)。

其中前三種疫病菌與 P. infestans US11 對臺灣農業均造成極為嚴重之損失 (18)

目前國際間的重要檢疫疫病菌包括:P. ramorun (引起櫟樹猝死病) (美國)(16);

P. fragariae (草苺紅心病菌) (多國);P. eythroseptica (馬鈴薯緋腐病菌) (中國)極

受注意;P. sojae (大豆疫病菌) (中國)。此外,我國也將馬鈴薯晚疫病菌 P. infestans

A2 配對型 (mating type) 列為產地貨品限制輸入的病菌之一,禁止發病地區之番

茄與馬鈴薯進口臺灣 (1,2,8,19, 20)。

2、健康種子與種苗

疫病菌為土壤傳播性病害,植物一旦罹病便無法根除。因而避免使用罹病或

受污染之種子 (含種薯、種球) 與種苗為防治疫病之第一步。疫病菌的菌絲與孢

囊可以侵入與附在種苗與種子上,而傳至下一代,且迅速蔓延至鄰近地區,造成

病害防治上莫大困擾與嚴重損失。染病種子除了無法培育出健康植物外,而且種

子或種苗帶菌為病害長距離傳播的最主要方式,也是國外有害病原入侵國內的最

主要途徑。例如近年來大發生的馬鈴薯晚疫病即為種植自美國進口之帶菌的馬鈴

薯薯塊之後果 (8,19, 20)。因而培育與使用無病原之健康種子與苗木為病害綜合管理

之首要任務,尤其是柑橘、木瓜、酪梨、蘭花、花木、蔬菜等,栽培前需要確定

種苗的健康性。

3. 抗病品種與根砧

經常使用抗病品種與抗病砧木來對抗病菌入侵,為經濟又安全的方法,因此應

多推廣。抗病品種較常使用的包括蕃茄、鈴馬薯抗晚疫病。抗病砧木多使用於果

樹,包括柑橘耐根腐並根砧:枳殼、酸橙、廣東檸檬、酸桔,及酪梨抗根腐病 (P.

cinnamomi)(14)。此外,有許多作物 (包括:果樹、蔬菜、花卉) 不會罹患疫病,

因此在經常發生疫病地區,可以栽培此類作物。

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4.誘導性抗病

植物噴布中和後的亞磷酸 (neutralized phosphorous acid) 或灌注亞磷酸於根

圈土壤中,可刺激植株啟動防禦系統,產生植物抗禦素 (24),抵抗病菌,稱為誘

導性抗病 (induce resistance),可有效防治晚疫病、疫病、露疫病及白銹病等。然

而亞磷酸具有易氧化與潮解等特性,導致進口產品防病效果不彰;又因價格高昂,

農民使用意願不高。此外,亞磷酸為強酸性,酸鹼值為 pH2-3,直接使用會有藥

害產生,須以鹼性物質中和。近年來,農業試驗所已開發出一種簡便使用亞磷酸

的方法,即中和亞磷酸溶液(6,9,10)。將亞磷酸與氫氧化鉀以 1:1 比率等重量中和後

使用,其防病效果甚佳。配製時,先將亞磷酸先溶於水,再溶解氫氧化鉀;中和

亞磷酸水溶液的酸鹼值約為 pH6.1-6.8,配置好之溶液最好當日使用,農民可以自

行配製。

中和亞磷酸之施用方法與濃度。使用方法有葉面噴布、土壤灌注及樹幹注射。

(1).葉面噴布:稀釋 1000 倍,每 7-10 天一次,連續 2-3 次。其防病效果為使用

一次約 60%,二次 80%,三次 90-95%。(2).土壤灌注:稀釋 200~500 倍,每年

2-4 次。(3).樹幹注射:稀釋 100~200 倍,每年 1-2 次。一般以雨季來臨前使用

2-3 次 (每隔七天使用一次)即可有很好之預防效果。

5.化學防治

在撲滅或降低疫病菌方面,仍以施用化學藥劑之傳統方法為主。其優點為經濟、

速效、易操作;缺點為危險、藥害、殘毒及污染生態環境。依據國外資料,有許多

藥劑可以降低疫病之發病率,與阻礙病害之蔓延 (15)。在臺灣,亦有許多藥劑登記

於植保手冊 (5),對疫病菌有預防或治療效果,包括滅達樂、歐殺斯、依得利、亞拖

敏、達滅芬、曼普胺、安美速、賽座滅、普拔克、大生類、銅劑、波爾多液等。然

而,大部分藥劑均為預防功效,主要在消滅初次感染源,治療已經發病之植物的效

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果甚差,藥劑除了葉面灑布與地際部灌注外,亦可施用於地面或灌溉水中,消滅土

壤中病菌與水中之游走子。

此外,幼苗對疫病極為感病,從瓶中移出之組織培養瓶苗,必須將所有附著之

洋菜 (瓊脂) 清洗乾淨;種子播種之幼苗亦十分感病。幼苗在定植時,必須施用一

次殺菌劑以茲保護。許多高經濟價值之花卉常用人工分株之方式來繁殖,分株或分

割時用之刀剪必須每使用一次,就須消毒一次,因為只要一株花卉帶菌,極可能散

播至往後分株之花卉上,而且連續使用未經消毒之刀剪,甚易傳染病毒病害。刀剪

可用十倍稀釋之漂白水 (0.5%) 或氫氧化鉀 (KOH, 1N) 消毒。分株後之傷口需塗抹

藥劑或浸藥,植株暫時需保持乾燥,等傷口完全癒合後才種植植。次外,台架和地

面均須消毒,可噴布稀釋之硫酸銅。

6. 生物防治

包括拮抗微生物與忌避植物,及土壤添加物。許多拮抗菌被認為在溫室、田間

實驗時有防治作物疫病能力。而土壤添加有機質、鈣化合物有防治酪梨疫病、森林

植物疫病之功效 (11)

7. 栽培防治與田間衛生

乾淨之栽培介質與器材:土壤與栽培介質不可帶菌,使用無菌之土壤與界質播

種。如能選用處女土育苗,或在處女地耕作,種植高級花卉則更佳。扞插苗木之土

壤必須不帶有疫病菌,帶菌苗木不宜移至本田。田間重複栽培相同作物 (連作) 時,

土壤亦須徹底滅菌。作業用工具,包括刀剪、工具、機械與車輛,亦須消毒。

良好栽培制度:(1).田間栽培時,應作高畦、注意排水良好,避免在低窪地、

或土質黏重地上種植作物。(2).台架栽培:苗木、高貴之花卉,避免接觸帶菌之土

壤、人畜、小動物。(3).輪作:疫病菌為多犯性,寄主廣泛,應避免在有共同病原

寄主的疫病田進行連作。如:馬鈴薯晚疫病田廢耕後宜避免種植番茄。一般耕作

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方式以與水稻輪作為佳,疫病菌在水田中的存活率很低。

合理化施肥:勿失用過度的氮肥,以免降低植物抗病性。

田間作業:(1).露天栽培時,不宜在降雨時分株、摘心與採花,因分株、扞插

苗木、甚而採摘花朵、摘心時造成之傷口,均是疫病菌最容易侵入花卉植株之管

道。(2).避免與帶菌之土壤、人畜、動物接觸。疫病菌屬土壤傳播性病害,病原菌

平常就可能生存於土壤中,因而,苗木、高貴之盆花均應放置在台架上,不宜直

接與地面接觸,增加感染疫病菌之機會。又疫病菌可經人畜之攜帶而闖入園區,

須加防範。清潔之環境:注意整枝修剪,日照通風良好,可消滅病菌潛伏場所,

有效降低病菌密度,增強植物抗病性。(3).隔離與銷毀:發現疫病時,必須將病株

隔離、挖除、銷毀,不可棄置成為感染源。

水分與濕度管理:疫病菌之初次感染源可能來自灌溉用水,且疫病菌主要靠水

分攜帶以四散傳播。(1). 因此對經濟價值高之作物,最好使用自來水灌溉,如需使

用地下水時,需經消毒或偵測,確定水中不含疫病菌時,方可使用;而田間使用溝

渠水灌溉時,應確定水源上游處無罹病田園。而田間發病時,宜降低引水灌溉時間,

但以增加灌溉次數來彌補水分之不足,以降低病菌傳播之速率。(2). 栽培苗木與貴

重花卉時,最好有防雨設施,包括:簡易遮雨棚、網室、精密溫室等。因雨水飛濺

不但提供病害發生所需之高濕環境,更可能攜帶與傳播疫病菌,及在植株表皮上製

造傷口,以利病原菌侵入。精密溫室須有濕度控制,以避免通風不良。濕度過高 (一

般超過 90-95%) 是誘發疫病猖獗之唯一氣候條件。如發現病株,首先應搬離罹病

植株,停止使用噴霧法灌溉,改用滴灌或人工灌溉,盡量降低園中濕度與病菌散播

之機會。

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8. 物理防治

第一次使用之栽培介質,如水草、蛇木屑、樹皮、泥碳土、有機肥或磚瓦石

礫,如無註明經過消毒時,需經過滅菌處理。重複使用之栽培介質與盆缽更需經

過殺菌。滅菌方法包括:高溫日曬、煮沸、高壓蒸汽滅菌及藥劑薰蒸 (最後一項

為化學防治)。疫病菌不耐高溫,60-70℃, 30 min, 就可殺死附在器材與介質上之

病菌。設施田重複使用時,土壤亦須徹底滅菌。

結 語

疫病為世界上最重要之植物病害之一。由於臺灣高溫多濕,適合多種疫病菌

之生存與繁殖蔓延,因而病害發生亦十分猖獗。疫病菌之發生生態與其他非卵菌

略有差異,在誘發植物疫病之病害三角關係中,致病因子-病原菌方面中只要有

感染源存在即可,與初次感染源之密度相關性較低;而環境因子中之水分 (降雨)

條件則與病害發生與否與嚴重情形有密切關係,它可完全左右疫病之發生、病勢

進展與病害擴散速率。故當感病之寄主遇到少少的疫病菌,而適逢合適的發病環

境時,病害極可能一發不可收拾,在短時間內造成極嚴重之疫情。在疫病防治方

面:應了解植物疫病生態、流行病學,研擬防治策略,預防重於治療。此外,須

具備疫病鑑定技術,用以決定應採取哪些防禦手段與措施,以達成有效管理病害

之目的;同時要明瞭國際病害情勢,阻遏國外有害微生物入侵,以保護國內作物

之健康生長,避免造成重大疫情與嚴重之經濟損失。

參考文獻

1. 未具名. 2001. 中華民國輸入植物或植物產品檢疫規定. 行政院農業委員會動

植物防疫檢疫局印. 台北. 69 頁.

Page 87:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

80

2. 安寶貞、張東柱. 2000. 近年來 (1997 冬季以來) 馬鈴薯與番茄晚疫病大發生

之病因探討. 植物疫情與策略研討會. 第 115-126 頁. 台中 1999,12,18

3. 安寶貞、王姻婷、黃晉興、蔡志濃、王三太. 2008. 莧菜疫病. 植病會刊 17:69-70.

(摘要,論文宣讀)

4. 徐世典等. 2002. 植物病害名彙 (四版). 植病學會刊印. 台中. 386 頁。

5. 費雯綺、王玉美編. 2010. 植物保護手冊. 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗

所出版,台中霧峰. 791 頁

6. 蔡志濃、安寶貞、王姻婷、王馨媛、胡瓊月. 2009. 利用中和後之亞磷酸溶液

防治馬鈴薯與番茄晚疫病. 臺灣農業研究 58:155-165.

7. Ann, P. J., and Ko, W. H. 1980. Phytophthora insolita, a new species from Taiwan.

Mycologia 72:1180-1185..

8. Ann, P. J., Tsai, J. N., Wang, T. C., Chen, C. H., Lin, M. J. and Ko, W. H. 2010.

Reevaluation of the report of A2 mating type of Phytophthora infestans on tomato

in Taiwan. Botanical studies 51: 203-207.

9. Ann, P. J., Tsai, J. N., Wong, I. T., Hsieh,T. F., and Lin, C. Y. 2009. A simple

technique, concentration and application schedule for using neutralized

phosphorous acid to control Phytophthora diseases. Plant Pathol. Bull. 18: 185-195.

10. Ann, P. J., Wang, I. T. and Tsai, J. N. 2011. Control of Phytophthora disease of fruit

tree seedlings by neutralized phosphorous acid. J. Taiwan. Agric. Res. 60:149-156.

11. Broadbent, P., and Baker, K. F. 1974. Behaviour of Phytophthora cinnamomi in

soils suppressive and conducive to root rot. Aust. J. Agric. Res. 25:121-137.

12. Cavalier-Smith, T. 1986. The kingdom Chromista: origin and systematics. Progress

in phycological research 4: 309-347.

13. Cooke, D. E. L., Drenth, A., Duncan, J. M., Wagels, G., and Brasier, C. M. 2000. A

Molecular Phylogeny of Phytophthora and Related Oomycetes. Fungal Gen. Biol.

30: 17-32.

14. Dolen, T. E., and Coffey, M. D. 1986. Laboratory screening technique for assessing

resistance of four avocado root-stock to Phytophthora cinnamomi. Plant Dis.

70:115-118.

15. Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K. 1996. Phytophthora Diseases Worldwide. APS

press, St. Paul. Minnesota, 562 pp.

Page 88:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

81

16. Goheen, E. M., Hansen, E. M., Kanaskie, A., McWilliams, M. G., Osterbauer, N.,

and Sutton, W. 2002. Sudden oak death caused by Phytophthora ramorum in

Oregon. Plant Dis. 86:441.

17. Ho, H. H. 1992. Key to the species of Phytophthora in Taiwan. Plant. Patholol.

Bull. 1:104-109.

18. Ho, H. H., Ann, P. J., and Chang, H. S. 1995. The Genus Phytophthora in Taiwan.

Acad. Sin. Mo. Ser. 15. 86 pp.

19. Jyan, M. H., Ann, P. J., and Liou, R. F. 2002. Genotype analysis of Phytophthora

infestans revealed appearance of the US-11 lineage in Taiwan. Plant Pathol. Bull.

11:234-235.

20. Jyan, M. H., Ann, P. J., Tsai, J. N., Hsih, S. D., Chang,T. T. and Liou, R. F. 2004.

Recent occurrence of Phytophthora infestans US-11 as the cause of severe late

blight on potato and tomato in Taiwan. Can. J. Plant. Pathol. 26:188-192

21. Keeling PJ. 2009. Chromalveolates and the evolution of plastids by secondary

endosymbiosis. J. Eukaryot. Microbiol., 56 (1): 1–8.

22. Liou, R. F., Lee, J. T., and Ann, P. J. 1999. First report of Phytophthora blight of

white arum lily caused by Phytophthora meadii. Plant Pathol. Bull. 8:37-39.

23. Massago, H., Yoshikawa, M., and Fukada, M. 1977. Selective inhibition of

Pythium spp. on a medium for direct isolation of Phytophthora spp. from soils and

plants. Phytopathology 67:425-428.

24. Saindrenan, P. and Guest, D. V. 1995. Involvement of phytoalexins in the response

of phosphonate-treated plants to infection by Phytophthora species. Pages 375-390

in Handbook of Phytoalexin Metabolism and Action. M. Daniel, and R. P.

Purkayastha. eds. Marcel Dekker, INC. New York.

25. Stamp, D.J., Waterhouse, G.M., Newhook, F.J., and Hall, G. S. 1990. Revised

Tabular Key to the Species of Phytophthora. Mycol. Pap. 162:1-28.

26. Van Der Plaats-Niterink, A. J. 1981. Monograph of the Genus Pythium.

Centraalbureau Voor Schimmelcultures Baarn, Netherlands. 242 pp.

27. Waterhouse, G. M. 1963. Key to the species of Phytophthora de Bary. Mycol. Pap.

92. Comm. Mycol. Ins. Kew, Surrey, England.

Page 89:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

82

28. Waterhouse, G. M. 1970. The genus Phytophthora - Diagnoses (or Descriptions)

and Figures from the Original Papers. Mycol. Pap. 122. Comm. Mycol. Ins. Kew,

Surrey, England.

Page 90:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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蘇慶華

現 職

台北醫學大學醫學系微生物暨免疫學科 講座教授

學經歷

1973-2000 國立臺灣大學農學院園藝研究所 碩士

1985-2000 國立臺灣大學農學院農業化學研究所 博士

1985-1999 台北醫學大學醫學系 副教授

1999-2013 台北醫學大學醫學系 教授

2000-2006 台北醫學大學生物醫學材料研究所 所長

2009-2012 台北醫學大學 副校長

2011-2012 台北醫學大學 代理校長

2013-2000 台北醫學大學醫學系 講座教授

專 長

微生物學、真菌學、生物醫學材料

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由白色念珠菌單倍體發現到牛樟芝抗癌之歷程—抗黴菌藥物

之應用

蘇慶華*、歐聰億、張芳陌、陳玲儀、鄭瑋寧

台北醫學大學 微生物暨免疫學科

*通訊作者:蘇慶華 [email protected]

摘 要

白色念珠菌(Candida albicans)被視為以絕對二被體(obligate diploid)方式存活,

單倍體因為基因具有高度異質性而無法單獨存在。作者觀察到以 fluconazole 等麥

角固醇合成抑制抗黴菌藥物會對白色念珠菌造成形態激烈變化,有類似

white-opaque transition 之現象。經性別基因鑑定發現有單性化,即僅具有 MATa

或 性別基因菌珠發生頻率高於自然機率之趨勢。進一步檢查基因體組發現

經 fluconazole 短期間暴露後所篩選之菌株有染色體短少或增加之現象。這些菌株

再以流式細胞儀檢視篩選核酸含量最低之菌株,得到不同性別之兩株可能為單倍

體之菌株分別為 17-LS 及 LN208B。以下世代全基因體定序 (next generation

sequencing ,NGS)分析確認此二白色念珠菌菌株為單倍體,並可由設計之軟體工具

証明其單倍體基因型 (comparative halpotyping)。此外,牛樟芝(Taiwanofungus

camphoratus, syn. Antrodia cinammomea)為臺灣獨有的藥用真菌,近年來針對抗癌

之主題已有不少具有成果之研究。本報告則針對故態栽培牛樟芝之酒精粗萃物進

行間接抗癌之測試發現與 Amphotericin B 有前後加乘抑制癌症細胞作用。此一測

試再細胞、動物模式均有極明顯之作用,本文亦提出此作用之假說。

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緒 言

念珠菌為人體正常菌相,念珠菌症(Candidiasis)為真菌疾病中最常發生之伺機

感染疾病之一,但如因免疫力下降可能導致念珠菌菌血症 (Candidemia) 致死率高

達 50%。其中在菌血症病人中最常分離出的菌株為色念珠菌(Candida albicans)。

白色念珠菌經常以二倍體(Diploid)狀態型出芽無性生殖,在遺傳研究上缺乏有性

生殖所具備的優勢,也就是無法得到基因重組的後代以及單倍體。也造成對此一

病原菌的研究上較為遲緩。因此尋找白色念珠菌的有性世代及單倍體成為 21 世紀

科學家所追尋的目標(1)。

作者觀察白色念珠菌在一種常用於治療念珠菌菌血症的抗黴菌藥 fluconazole

實驗中,意外的發現抑制圈內外所產生的菌落形態並不相同。因此開始探討此一

形態上的改變世原於一傳上的改變還是僅只對應環境的形態轉換。也從此展開從

最簡單的 PCR 分析以之的性別基因一直到全基因體序列分析,結果証明類似

fluconazole 這些抑制麥角固醇合成藥物包括 imidazole, triazole 以及 terbinafine 都

會造成此一現象。此現象在於干擾 cytochrome P450 相關酵素施與氧化壓力後會

對白色念珠菌在行有絲分裂(mitosis)過程中造成不均等的染色體分配。在短時間

內(12-18 小時),迅速將處理藥物的後代分離可以得到不整倍體(aneuploids)。而且

在較小的機率中可以得到單倍體(2)。

另一種抗真菌藥物則是古老的 Amphotericin B 具有高度結合麥角固醇能利而

使真菌細胞模造成孔洞而加以消滅,利用此一特性應用於腫瘤治療上則配合牛樟

芝酒精萃取物含有大量三萜及固醇之特點,先進行固醇置換,使腫瘤細胞膜之固

醇由膽固醇取代為真菌固醇厚再以 Amphotericin B 殺死腫瘤細胞。此一前題再於

腫瘤細胞膜中之磷脂質有別於正常細胞,富含花生四稀酸 (Arachidonic acid)。推

測較多的雙鍵較易於由較多雙鍵的固醇所取代。本文也提出此一假說來解釋此一

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合併牛樟芝及 Amphotericin B 腫瘤治療之可能性(3,4)。

內 容

1. 含 Phloxine B 染劑抑制圈測試

如圖 1-1,濾紙片為含有 fluconazole 抗黴菌藥物,處理時間為 48 小時。培養

基為 PDA 加上 5 ppm 的 Phloxine B 染劑,此一染劑會對 opaque 細胞染成紅色。

Opaque 指在第五對染色體喪失其中一條,而失去其中一種性別基因 (a 或 α),由

原來的兩性細胞(white)成為單性細胞(opaque)。因此在抑制圈的邊緣產生這麼多的

轉換,有可能是檢數分裂或其他原因造成的。在最初暴露在 fluconazole 的階段

(12-16 小時),細胞開始變成豆莢形,豆莢內部有 4 個區隔(圖 1-2)

2. 菌種分離

利用顯微操作器(micromanipulator)將存活豆莢移至不含抗黴菌藥新的培養基

中,待新的細胞從豆莢之不同分隔中出芽,再以顯微操作器分離 (圖 1-3),經過

培養的結果如圖 1-4。此一結果顯示白色念珠菌經過 fluconazol 處理後呈現變形,

其後代也隨著變。也顯示極可能發生一傳上的改變。

3. PCR 及流式細胞儀分析

選擇以上分離之菌種約 300 株進行性別基因及 cytox 染色流式細胞儀分析

顯示性別確實成為單性;DNA 含量也發生改變。而大多數形態發生改變之菌株細

胞 DNA 含量減少 (圖 2-1) 。由 DNA 含量之強度也可以推算 8 對染色體中那一

條喪失或者增加之可能。

4. RFLP/PCR 測定 SNP

進一步利用 8 條染色體兩臂中的 SNP 位點確認異核性喪失 (loss of

heterozygosity) (圖 2-2) 。

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5. NGS 全基因體定序

結果如圖 3. 顯示所選出之菌株中確有單倍體形成,單倍體與不整倍體之

haplotyping 也正確顯示。

6. 牛樟芝合併 Amphotericin B 治療腫瘤之結果

如圖 4。

7. 牛樟芝合併 Amphotericin B 治療腫瘤之假說

如圖 5。

結 語

利用抗黴菌藥物 floconazole 造成氧化壓力之特性,可以成功的篩選白色念珠

菌不整倍體及單倍體。單倍體之篩選將有助於白色念珠菌遺傳上之研究。尤其對

於造成形態改變的基因群會有很大幫助。此一現象只會發生在白色念珠菌,而對

其他造成菌血症的其他種 例如:C. grabrata, C. tropicalis, 及 C. parapsilosis 則沒

有這種反應。另一方面,利用 Amphotericin B 對麥角固醇高親合性之特性,則可

應用於腫瘤治療,先認識腫瘤細胞模之脂肪酸具有較高比率之 arachidonic acid 脂

性質,如能以例如牛樟芝來改變腫瘤之固醇使之成為接近真菌的成分,則可做為

一種標靶治療之模式殺死腫瘤細胞而對正常細胞沒有危害。

參考文獻

1. Hickman MA, Zeng G, Forche A, Hirakawa MP, Abbey D, Harrison D, Wang YM,

Su CH, Bennet R, Wang Y and Berman J. 2013

The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature,

494:53-59.

2. Chang FM, Ou TY, Cheng WN , Chou ML, Lee KC, Chin YP, Lin CP, Chang KD ,

Lin CT, Su CH, 2014

Page 95:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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88

Short-term exposure to fluconazole induces chromosome loss in Candida albicans:

An approach to produce haploid cells Fungal Genetics and Biology, 70:68–76

3. Chen LI, Sheu MT, Liu DZ, Liao CK, Ho HO, Kao WY, Ho YS, Lee WS, Su CH.

2011

Pretreatment with an Ethanolic Extract of Taiwanofungus camphoratus (Antrodia

camphorata) Enhances the Cytotoxic Effects of Amphotericin B Journal of

Agricultural and Food Chemistry.59:11255-11263.

4. Chen LY, Sheu MT, Liao CK, Tsai FC, Kao WY, Su CH. 2012

Taiwanofungus camphorauts (syn. Antrodia camphorata) extract and amphotericin

B exert adjuvant effect via mitochondrial apoptotic pathway. Integrative Cancer

Therapies.12(2):153-164.

Page 96:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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圖 1 圖 2

圖 3

圖 4

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圖 5

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何小曼

現 職

國立台北教育大學自然科學教育學系 兼任教授

學經歷

1973-2000 國立臺灣大學理學院 理學碩士

1992-2000 國立臺灣大學理學院植物學 博士

1974-1978 省立台東女子高中 教師

1980-1982 省立台北師專 助教

1982-1988 省立台北師專 講師

1988-1996 國立台北師範學院數理教育系 副教授

1996- 2014 國立台北教育大學自然科學教育學系 教授

1998-2001 國立台北教育大學自然科學教育學系 系主任

2006-2008 中華民國真菌學會 秘書長

2008-2013 國立台北教育大學理學院 院長

2011-2013 中華民國真菌學會 理事長

專 長

植物學、菌類學、接合菌分類、環境教育研究

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臺灣接合菌之生物多樣性資源

何小曼

國立台北教育大學自然科學教育學系

通訊作者:何小曼 [email protected]

摘 要

接合菌是一個種類、數目頗多的真菌群。其特徵為菌絲無隔板,無性生殖以

孢子囊孢子繁殖,有性生殖係形成接合孢子。其與人生相關性廣泛,包括可用於

食品製造,生物科技應用,部分種類能造成儲藏果實腐爛,為動、植物病原菌等。

本土相關接合菌研究成果分佈於各分類群,分離菌株及基因序列資料已有相當數

量存於國內菌種中心、科學博物館及國際基因庫。

關鍵詞:接合菌,生物多樣性,臺灣

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接合菌之分類,傳統上屬於接合菌門 ( Zygomycota ),下分兩綱,接合菌綱

( Zygomycetes )及毛菌綱 ( Trichomycetes ),此菌群的特徵為菌絲無隔板

(coenocytic),無性生殖產生不動的孢子囊孢子 ( sporangiospore ),有性生殖藉由

配子囊接合產生厚壁的接合孢子 ( zygospore ),細胞壁成分為 chitosan 或 chitin。

但近年學者研究發現接合菌門為多系群,目前接合菌門 ( Zygomycota ) 已不再使

用,而分為一門四個亞門 Entomophthoromycota (蟲黴菌門),Kickxellomycotina

( 梳黴亞門),Mortierellomycotina (被孢毛黴亞們),Mucoromycotina ( 毛黴亞門 )

及 Zoopagomycotina ( 捕蟲黴亞門 ) (7,14,15),其中種類數目最多的是毛黴亞門。

其生活方式主要為腐生,但也有些為共生,會與植物形成菌根或與節肢動物 ( 包

括昆蟲與其幼蟲 )共生於其腸道上,也有寄生於動物、植物或其他真菌上的種類。

常見於土壤、糞物或有機質上。

在經濟上,接合菌某些種類為植物組織之弱寄生 (weak parasite),例如

Gilbertella persicaria、Mucor piriformis、Rhizopus oryza、R. stolonifer 可以造成蘋

果、馬鈴薯、火龍果、櫻桃、梨果實之腐爛,笄黴科之 Blakeslea trispora 及

Choanephora cucurbitarum 為植物病原菌,後者常可造成瓜類花果腐爛,而造成果

農損失 (5, 19, 20, 22, 27, 28, 30)。有些可生長於 37oC 以上之種類,可能會對動物

有致病性,如Basidiobolus、Conidobolus、Lichtheimia、Apophysomyces、Cokeromyces、

Cunninghamella、Mucor、Rhizomucor、Rhizopus 及 Saksenaea 可對包括人類、馬、

牛造成疾病,常在癌症、糖尿病、白血病及愛滋病患者之腦部、肺部或其他器官

產生病灶,如 R. stolonifer 及 Lichtheimia 均有報導於人體上發現,也會造成其他

動物的疾病 (6, 21)。有些種類可用於食品製造,例如 Rhizopsus 用於霉大豆

(Temph),Actinomucor 用於豆腐乳 (Fermented Soybean Curd) 醱酵,或做為澱粉

類原料製酒之糖化菌。也有報導對於儲藏於冷凍房之肉類接種Thamnidium elegans,

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可產生特殊香味(4)。工業上,Mortierella alpina 可利用廢甘油為碳源,生產花生

油烯酸 (Arachidonic acid) (16),Cunninghamella echinulata 可用於生產生質柴油

(26); C. echinulata、數種 Rhizopus、Umbelopsis 及 Zygorhynchus 可用於生產 lipid,

做為產生生質柴油的前驅物 (18)。

臺灣接合菌之研究始自日人臺灣大學教授 Sawada (澤田兼吉),在他的系列文

獻(1919-1959)(23, 24, 25)中報導了 3 屬 8 種接合菌。之後本土之真菌學家包括楊

寶瑜、簡秋源、劉錦惠、陳桂玉、劉桂郁、吳美麗、汪碧涵,何小曼等也都對接

合菌之研究作出貢獻。根據行政院農委會出版之臺灣真菌名錄 (1),臺灣在 1999

年前之接合菌紀錄包括 I. Entomophthoromycota (蟲黴菌門) 3 屬 6 種如下,

Basidiobolus (4 種 ) 、 Conidiobolus (1 種 ) 、 Entomophthora (1 種 ) 。 II.

Zoopagomycotina (捕蟲黴亞門) 2 屬 4 種如下為 Syncephalis (3 種)、Thamnocephalis

(1 種)。III. Kickxellomycotina (梳黴亞門)有 2 屬 2 種,包括 Coemansia (1 種)、

Linderina (1種)。IV. Mortierellomycotina (被孢毛黴亞門)有1 屬Mortierella 14種。

V. Mucoromycotina (毛黴亞門)最多,包含 20 屬 85 種如下,Absidia (5 種)、

Actinomucor (1 種)、Blakeslea (2 種)、Choanephora (3 種)、Circinella (5 種)、

Cunninghamella (4 種)、Gongronel1a (1 種)、Mucor (37 種)、Peridiosporam (2 種)、

Phycomyces (l 種)、Pilobolus (3 種)、Rhizomucor (2 種)、Rhizopus (11 種)、Saksenaea

(1 種)、Sporodiniella (1 種)、Syncephalastrum (1 種)、Thamnidium (1 種)、

Thamnostylum (1 種)、Utharomyces (1 種)及 Zygorhynchus (2 種)。其中臺灣師範大

學簡秋源教授指導多位研究生,對臺灣接合菌研究時間最長,貢獻最多。但是上

訴所列種 類數目 與 Kirk et al. (17) 所列全世 界接合菌 種類相較,

Entomophthoromycota 臺灣發現種類只佔 0.02,Mucoromycotina 佔 0.26,

Kickxellalomycotina 佔 0.01,而 Zoopagomycotina 佔 0.02,實仍有相當大的研究

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空間。

之後臺灣接合菌研究,主要見於國立台北教育大學真菌實驗室,新竹食品工

業發展研究所及東吳大學生命科學系,其中多於國立台北教育大學真菌實驗室進

行,其研究題材與”臺灣接合菌生物多樣性”相關者簡介如下。實驗步驟如下: (一).

樣本採集: 菌株分離來源主要包括土壤及動物糞物,土壤為由全省各地校園、植

物園、野外、森林、果園、菜園採取,糞物則以草食性或囓齒類動物為主,由校

園、植物園、野外、森林、養殖場、牧場、傳統市場或居家環境取得梅花鹿、山

羌、牛、兔或鼠類動物等的糞物,放在塑膠袋內帶回實驗室。(二).分離: 1.土壤:

取少許顆粒撒在玉米培養基(CMA)上。2.糞物:取數顆以濕室培養或置於 CMA 培

養基上。(三).純化:以單孢子囊分離置於 CMA 培養基培養,之後再進行單孢子

分離。(四).培養溫度:24℃。(五).菌種保存: 1.菌種純化後,以合成毛黴培養基(SMA)

斜面試管將菌株置於冰箱 4℃保存。2.使用培養液添加甘油(10%)放置菌種保存管

於-80℃冰箱中。3.寄存食品工業發展研究所生物資源保存研究中心 (BCRC)。(六).

核糖體 rDNA (LSU、SSU、ITS)序列定序: 1.DNA extraction、2.PCR amplification 3.

DNA sequencing。

所分離菌種資源為永續保存,並能廣泛利用,儘可能存於新竹食品工業發展

研究所生物資源保存中心,新種模式標本存於台中自然科學博物館,相關菌種

DNA 序列資料除上傳 NCBI GenBank,近期也提交食發所。到目前所累積接合菌

生物多樣性紀錄如下列:

I.捕蟲黴亞門 (Zoopagomycotina)為寄生性真菌,寄生於真菌、線蟲、阿米巴或其

他陸生動物,菌絲有隔板,無性生殖形成具 1-2 孢子之管狀孢子囊。其下捕蟲黴

目(Zoopagales)中分離到四科五屬真菌: 1.捕蟲黴科 (Zoopagaceae) 為利用菌絲捕

捉寄主而寄生的捕捉性種類,分離到三個屬,有輪蟲黴屬 (Zoophagus)、泡囊蟲

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黴屬 (Cystopage)、黏球孢菌屬 (Acaulopage)。2.旋體黴科(Cochlonemataceae)為利

用分生孢子附著寄主而寄生的寄生性種類,分離到旋體黴屬(Cochlonema)一屬。

由土壤分離出 Zoophagus pectosporus 及 Cystopage cladospora 兩個種類,其寄主

皆為線蟲。從苔蘚類分離出三個種類,其中 Cystopage ovispora 及 C.

irregularispora 為兩個新種,其寄主均為線蟲;以及 Acaulopage tetraceros 寄主為

阿米巴蟲。從水池落葉及水池苔蘚類分別分離出 Cochlonema agamum 和 Co.

megaspirema 各一個種類,其寄主皆為阿米巴蟲。除了 Zph. pectosporus 之外,

其它種類包含 2 個新種及 4 個臺灣新紀錄種。3.折孢黴科(Sigmoideomycetaceae)、

頭枝黴屬(Thamnocephalis)分離一種,即 T. sphaerospora,為有吸胞之真菌寄生菌,

本菌寄生於蛙糞菌 Basidiobolus 上。4.頭珠黴科(Piptocephalidaceae)是一群行絕對

寄生的真菌寄生菌,寄主大部分是毛黴目真菌。分離到兩屬 : (1) 頭珠黴屬

(Piptocephalis)由土壤及糞物共分離出十二個種,為 Piptocephalis curvata、P.

fimbriata、P. freseniana、P. indica、P. lepidula、P. tieghemiana、P. xenophila、P. sp.

nov. 1、P. sp. nov. 2 與 P. sp. nov. 4,另 P. formosana 及 P. graefenhanii 為已發表之

新種,寄主主要為 Mucor 及 Cunninghamella。另外核糖體 DNA 分析結果也發現

頭珠黴科下的葛葉屬 (Kuzuhaea),應歸類在頭珠黴屬下,為一新組合種 (8, 13)。

(2 )集珠黴屬(Syncephalis):由土壤及糞物共分離 18個種,分別為 Syncephalis cornu、

S. depressa、S . nodosa、S. obconica、S. parvula、S. sphaerica、S. tenuis、S. vivipara、

S. cf. ventricosa、S. sp. nov. 1、S. sp. nov. 2、S. sp. nov. 3、S. sp. nov. 4、S. sp. nov. 5、

S. sp. nov. 6,另 S. formosana、S.clavata 及 S. obliqua 為新種。rDNA 之 LSU-D1/D2

序列及 ITS 區域序列,每個種在親緣關係分析樹內皆能自成一分支群 (clade) (9,

10, 11, 12)。

II.毛黴亞門(Mucoromycotina)、毛黴目(Mucorales)分離到七科,主要為腐生性,少

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數為兼性寄生於動植物包括人類,無性生殖藉由多數至一個孢子之孢子囊孢子繁

殖。1. 利克密黴科(Lichtheimiaceae )、利克密黴屬(Lichtheimia),基本上為腐生菌,

但有一些種類為致病性真菌,可發現於免疫力低下之病人。本屬由弓黴屬分出,

在 37℃以上生長良好,且初級孢子囊及次級孢子囊發達。由土壤、堆肥及糞物分

離到四種: Lichtheimia corymbifera、L. hyalospora、L. ornata 及 L. ramosa。每個種

在親緣關係樹皆能自成一分支群(29)。2. 弓黴科(Absidiaceae)、弓黴屬(Absidia),

生長適溫低於 37℃且孢子囊多為初級孢子囊,孢子囊柄在由假根 (rhizoids)長出

之匍匐莖(stolons)上輪生。分離到六種如下: Absidia cylindrospora、A. glauca、A.

heterospora、A. pseudocylinmdrospora、A. repens 和 A. spinosa。每個種在親緣關係

樹皆能自成一分支群。3. 水玉黴科(Pilobolaceae)係屬糞生真菌,孢子囊以強力噴

射出。由動物糞物分離到兩屬 (1).水玉黴屬 (Pilobolus),分離到八種如下 :

Pilobolus crystallinus、P. hyalosporus、P. kleinii、P. oedipus、P. roridus、P.

sphaerosporus、P. umbonatus 及 P. sp. nov. (2).星玉黴屬 (Utharomyces) 分離到一

種 Utharomyces epallocaulus。每個種在親緣關係樹皆能自成一分支群,包括 SSU

序列與 LSU-D1/D2 序 SSU 及 ITS 區域序列。4. 毛黴科 (Mucoraceae )(1).卷黴屬

(Circinella),為腐生性微小真菌。從土壤及糞物樣本中分離卷黴屬中 5 個種,分

別為 Circinella minor、C. mucoroides、C. muscae、C. simplex 和 C. umbellata。C.

simplex 因與其他卷黴屬真菌在親緣關係樹上不在同一群內,且其為唯一由土壤分

出者,建議可將之移出卷黴屬。(2).布雷絲枝黴屬 ( Cheaetoclaium ),為真菌寄生

菌,分離一種 Cheaetoclaium brefeldii。5. 共頭黴科 ( Syncephalastraceae ) 枝柄黴

屬 ( Thamnostylum )一種,T. piriforme。6. 深黃傘形黴科 ( Umbelopsidaceae )、深

黃傘形黴屬( Umbelopsis )本科由原 Moetierella 屬分出,為腐生性,目前已分離出

五種: Umbelopsis angularis、U. dimorpha、U. isabellina、U. ramanniana 及 U. vinacea。

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7. 笄黴科(Choanephoraceae),本科真菌是一群植物落花及落果上常見之弱寄生菌,

常寄生於瓜科植物花果,造成花果腐軟及潰爛,導致經濟上的損失。因生長溫度

較高,春、夏、秋季較易分離到。目前分離到三屬五種 (1)布拉黴屬(Blakeslea )

兩種: Blakeslea trispora 及 B. monospora。(2).Poitrasia 一種,Poitrasia circinans。

(3) 笄黴屬(Choanephora)兩種,Choanephora cucurbitarum 及 C. infundibulifera。

III.梳黴亞門(Kickxellomycotina),大部分為腐生菌也有真菌寄生菌,菌絲常有隔

板,分離到兩目:

(I).梳黴目(Kickxellales) 梳黴科(Kickxellaceae ),為腐生菌,分離三屬: (1).下梳黴

屬 (Coemansia),從土壤、糞物分離十一個種,分別為 Coemansia aciculifera、C.

furcata、C. interrupta、C. linderi、C. pectinata、C. sp.1、C. sp.2、C. sp.3、C. sp.4、

C. sp.5 與 C. sp. 6. (2)。(2).球梳黴屬(Linderina) 兩種 Linderina pennispora 及 L.

macrospora。(3).燭台黴屬(Ramicandelaber),共三種除 Ramicandelaber brevisporus

外有兩新種 R. fabisporus 及 R. taiwanensis (3)。

(II)雙珠黴目(Dimargaritales)雙珠黴科(Dimargaritaceae),為真菌寄生菌,寄生於其

他真菌,特別是毛黴。分離到一屬兩種 Dispira simplex 及 D. cornuta,生長於由動

物糞物長出之毛黴上。

IV.被孢毛黴亞門(Mortierellomycotina) 由土壤及糞物分離到九種如下: Mortierella

alpina、M. biramosa、M. capitata、M. elongata、M. exigua、M. gamsii、M. globulifera、

M. parvispora 及 M. zychae。

以上所分離菌種儘可能存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存中心,目

前 各 分 類 群 Kickxellmycotina , Zoopagomycotina , Mortierellomycotina 及

Mucoromycotina 均有菌種存於此處,可供各界利用。

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99

參考文獻

1. 王也珍、吳聲華、周文能、張東柱、陳桂玉、陳淑芬、陳城箖、曾顯雄、劉

錦惠、謝文瑞、謝煥儒、鍾兆玄、簡秋源等編輯. 1999. 臺灣真菌名錄。行政

院農業委員會出版。

2. Chuang SC, Ho HM. 2011. The Merosporangiferous Fungi from Taiwan

(VIII):Two New Records of Coemansia (Kickxellales, Kickxellomycotina).

Taiwania, 56(4):295-300.

3. Chuang SC, Benny GL, Lee CF and Ho HM. 2013. Two new Ramicandelaber

species from Taiwan. Mycologia 105(2): 320-334.

4. Benny GL. 2012. Current systematics of the zygomycotan fungi with a brief

discussion of their biology. In:Misra JK, Tewari JP, Deshmukh SK (eds)

Systematics and evolution of fungi. Progress in Mycological Research. Science

Publishers, Enfield, New Hampshire, pp. 55-105.

5. Guo LW, Wu YX, Mao ZC. 2011. Storage rot of dragon fruit caused by Gilbertella

persicaria. Plant Disease 96:1826.

6. Gomes MZ, Lewis RE, Kontoyiannis DP. 2011. Mucormycosis caused by unusual

Mucormycetes, non-Rhizopus, -Mucor and –Lichtheimia species. Clin Microbiol

Rev 24:411-445.

7. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE,

Huhndort S, James T, Kirk PM, Lücking R, Lumbsch HT, Lutzoni F, Matheny PB,

McLaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA,

Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA,

Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth

DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Kõljalg U,

Kurtzman CP, Larsso KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miądlikowsk J, Miller A,

Moncalvo JM, Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers

JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell

L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K,

Yao YJ, Zhang N. 2007. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi.

Mycol Res 111:509–547.

8. Ho HM. 2006. A new species of Piptocephalis from Taiwan. Botanical studies 47:

453-456.

9. Ho HM, Benny GL. 2007. Two new species of Syncephalis from Taiwan, with a

key to the species of Syncephalis found in Taiwan. Botanical Studies 48: 319-324.

Page 107:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

100

10. Ho HM, Benny GL. 2008. A new species of Syncephalis from Taiwan. Botanical

Studies 49: 25-48.

11. Ho HM, Chen YT. 2013. The merosporangiferous fungi from Taiwan (IX): Two

zoopagalean species, Syncephalis nodosa and S. vivipara new to Taiwan Fung. Sci.

28(1): 39–44.

12. Ho HM, Chiang HJ. 2014. Notes on Zygomycetes of Taiwan (XI): One

zoopagalean species Thamnocephalis sphaerospora new to Taiwan. Fungal

Science (in press).

13. Ho HM, Kirk PM. 2009. Piptocephalis formosana, a new species from Taiwan.

Botanical Studies 50:69-72.

14. Hoffmann K., Voigt K, Kirk P M. 2011. Mortierellomycotina subphyl. Nov. Based

on multi-gene genealogies. Mycotaxon (155:353-363).

15. Humber RA. 2012. Entomophthoromycota: a new phylum and reclassification for

entomophthoroid fungi. Mycotaxon 120:477-492

16. Khanna S, Goyal A, Moholkar VS. 2011. Microbial conversion of glycerol:

present status and future prospects. Crit Rev Biotech 2011:1-28

17. Kirk PM, Cannon PF., Minter DW and Stalpers JA. 2008. Dictionary of the fungi.

10th ed. CABI, Wallingford, UK. 771 pp..

18. Kosa M, Ragauskas AJ. 2011. Lipids from heterotrophic microbes: advances in

metabolism research.Trends Biotechnol 29:53-61.

19. Michailides TJ. 1991. Characterization and comparative studies of Mucor isolates

from stone fruits fromCalifornia and Chile. Plant Disease 75:373-380.

20. Ogawa JM, Sonada RM, English H. 1992. Postharvest diseases of tree fruit. In:

Kumar J, Chambe, Singh US, Mukhopadhyay AN (eds) Plant diseases of

international importance. III. Diseases of fruit crops. Prentice Hall, Englewood

Cliff, New Jersey, pp 405-422.

21. Ribes JA, Vanover-Sams CL, Baker DL. 2000. Zygomycetes in human disease.

Clin Microbiol Rev 13:236-301.

22. Saksena HK, Narain U. 1983. Blight of vegetabile seedlings. Indian J Hort

40:129-131.

23. Sawada K. 1919. Descriptive Catalogue of Taiwan Fungi Part I. Published by

agricultral Experiment Station, Formosa.

24. Sawada K. 1942. Descriptive Catalogue of Taiwan Fungi Part VII. Published by

Agricultral Experiment Station, Formosa.

25. Sawada K. 1959. Descriptive Catalogue of Taiwan Fungi Part XI. Published by the

Page 108:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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101

college of Agriculture, National Taiwan University.

26. Sergeeva YE, Galanina LA, Lunin VV, Feofilova EP. 2011. A biotechnology for

the production of new biodiesel fuel. Catalysts Indust 3:53-56.

27. Sinha S. 1940. On the characters of Choanephora cucurbitarum Thaxter on chillies

(Capsicum spp.). Proc Indian Acad Sci, Sect B 11:162-166.

28. Shtienberg D. 1997. Rhizopus Head rot of confectionery sunflower: effects on

yield quantity and quality and implications for disease management.

Phytopathology 87:1226-1232.

29. Yang, LW, Ho HM, Chien CY. 2012. Notes on Zygomycetes of Taiwan (X): The

genus Lichtheimia in Taiwan. Fun. Sci. 27: 109-120.

30. Wolf FA. 1917. A squash disease caused by Choanephora cucurbitarum. J Agricult

Res 8:319-327.

Page 109:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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劉桂郁

現 職

財團法人食品工業發展研究所 研究員

學經歷

1987-2000 國立臺灣師範大學理學院生物研究所 碩士

1996-2000 國立臺灣大學農學院植物病理研究所 博士

1983-1985 台北市北安國中 生物教師

1987-1996 財團法人食品工業發展研究所 副研究員

1996-2000 財團法人食品工業發展研究所 研究員

專 長

絲狀真菌收集保存與品質管制、毛黴目真菌、類酵母真菌、產油真菌

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臺灣之麴菌屬資源

魏育慧 1、謝松源 1、袁國芳 1、曾顯雄 2、劉桂郁 1*

1 財團法人 食品工業發展研究所 生物資源保存及研究中心

2 國立臺灣大學 植物病理與微生物學系

* 通訊作者:劉桂郁 [email protected]

摘 要

麴菌屬廣泛應用於食品、生技、農業、環境及醫藥等領域,而部份種類對於

人類健康或經濟造成直接的威脅,因此與人類的生活習習相關。食品工業發展研

究所生物資源保存及研究中心收存之麴菌屬及其有性世代菌種資源計有 750 株以

上,菌株數量最多的種分別為黃麴菌、米麴菌、黑麴菌與土麴菌,皆為產業應用

之重要菌種;其中,本土麴菌有 51 種 238 株以上,多歸屬於黃麴菌群及黑麴菌群。

為妥善維護及加值生物資源,以 rDNA ITS 片段及鈣調蛋白基因部份序列建置本

土黃麴菌群與黑麴菌群之 DNA 條碼資料,並進行歸群分析,結果顯示本土黃麴

菌群菌株多分離自製造傳統醱酵食品之種麴,63 株本土菌株區分為 4 種,而本土

黑麴菌群 20 株本土菌株可區分為 12 種。臺灣豐富多樣之麴菌屬資源有待進一步

之探勘開發,生物資源之永續利用是未來發展生物經濟之重要課題。

關鍵詞:麴菌屬、生物資源

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緒 言

麴菌屬(Aspergillus)及其有性世代為自然界廣泛分佈的真菌之一,存在於土壤、

食物、土壤、種子、儲存穀物、布料、皮革、空氣等各式不同的基質,菌種可生

產醱酵食品、有機酸、酵素與藥物等產品,廣泛應用於食品、生技、農業、環境

及醫藥等領域。另一方面,少數種類造成人類過敏或麴菌病(aspergillosis),或是

造成植物病害,此外部份麴菌可於低水活性的環境下生長,於儲藏穀物生長導致

腐敗造成莫大的經濟損失,甚至產生黴菌毒素危害人類的健康,與人類生活息息

相關,是真菌最重要的屬之一。

經濟學者預估至 2020 年經濟的主導型式將轉變為「生物經濟」,基因工程與

生物科技將成為人類經濟的主流(1),生物資源為生命科學與生物技術的基礎(9),

支撐未來生物經濟的發展。由傳統醱酵食品到現今之生技產品,人類應用麴菌屬

歷史久遠,而新的應用領域仍持續被開發,是未來發展生物經濟之重要資材。

本文將說明目前食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 (簡稱生資

中心 ) 麴菌屬資源之收存現況,並著重於對人類深具影響力的黃麴菌群

(Aspergillus section Flavi) 與黑麴菌群 (Aspergillus section Nigri)說明其產業應用

潛力,此外由菌種應用的角度來看,確立菌種的分類地位與菌名是產業研發的先

決條件,因此以 rDNA ITS 片段及鈣調蛋白基因部份序列建置本土黃麴菌群與黑

麴菌群之 DNA 條碼資料並進行歸群分析,期能提供各界對於麴菌資源研究與開

發應用的基礎。

麴菌屬之鑑定

麴菌屬分類上隸屬於麴菌科(Aspergillaceae)、散囊菌目(Eurotiales)、散囊菌綱

(Eurotiomycetes)、子囊菌門(Ascomycota),傳統麴菌之分類依據形態特徵,產孢構

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造為其關鍵,分類鑑定依據分生孢子頭 (conidial heads) 之大小與排列、分生孢子

(conidia)顏色、指定培養基之生長速率、生理試驗(溫度,水活性)等重要特徵。Raper

與 Fennell (13)將麴菌屬區分為 18 群 132 種 18 個變種,多基因類緣分析(multigene

phylogeny)結果顯示 Raper 與 Fennell (13)以表現型特徵歸群結果與現今之分類大

致符合,目前麴菌屬可區分為 4 個亞屬 19 群 180 種以上(6,14);實務上現行麴菌

鑑定依據多相分類(polyphasic taxonomy)技術,整合運用表現型與基因型特徵,提

升菌種鑑定之正確性。

在產業應用的範疇,正確快速的鑑定菌株極為迫切,生命條碼的概念在於以一

個短的標準 DNA 序列,來進行物種之鑑別。建立生命條碼的目的在於:加速物

種的鑑別與發現、保留物種的多樣性、生態系統的監測、避免外來種的侵入、品

質規範、市場管理與發明驗證等。ITS 被認為是目前真菌能使用的最理想的標誌,

再配合其他序列,或可作為快速判斷真菌物種的方法(15,16),麴菌屬 DNA 條碼

除了 rDNA ITS序列,需配合 β微管蛋白(beta-tubulin), 鈣調蛋白(calmodulin), RNA

聚合酶 II (RNA polymerase II) 等持家基因(house keeping genes)部份序列(10,11),

方能有效鑑別至種的階層。

臺灣麴菌屬資源

生資中心收存的麴菌屬及其有性世代菌種資源有 750 株以上,分別隸屬於

150 種,其中有 66 株為模式菌株,分離株數量最多的種是黃麴菌群之黃麴菌

(Aspergillus flavus) 98 株、米麴菌 (Aspergillus oryzae) 95 株,其次為黑麴菌群之黑

麴菌(Aspergillus niger) 36 株,土麴菌群(Aspergillus section Terrei) 之土麴菌

(Aspergillus terreus) 26 株,皆為產業應用之重要菌種。

本土麴菌屬菌種資源由國內研究機構、學者專家以及產業界寄存之本土菌種

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有 51 種 372 株以上,包括《臺灣產麴菌屬及其有性世代圖譜》(17) 描述之 37 種

8 個變種 45 株代表性菌種;主要分離自種麴、食物、土壤、種子、儲存穀物、植

物組織等多樣化基質。

臺灣黃麴菌群資源

黃麴菌群之分生孢子柄(conidiophores)頂端囊泡(vesicles)一般主要為雙層構

造(biseriate),分生孢子(conidia)為黃綠到棕色,是一種常見的黴菌。黃麴菌群部

分菌種一直被應用於東方醱酵食品和酒精性飲料,例如:醬油、清酒、味噌及醋的

生產。黃麴菌群能產生許多不同種類的二次代謝物,所以也是許多酵素的重要生

產菌種,葡萄糖澱粉酶 (glucoamylase)、 α 澱粉酶 (alpha-amylases)和蛋白酶

(proteases),在澱粉加工製程、烘焙工業及釀造業都有廣泛的應用(3,18)。黃麴菌

群可生產麴酸(kojic acid),麴酸具有美白及強效抗氧化的功能,在化妝品工業已

有良好的應用;可抑制多酚氧化酵素(polyphenol oxidase),防止蘋果、蝦子受到氧

化酵素作用造成的褐變,並可催熟未成熟的草苺,讓它們呈現漂亮的紅色,所以

亦可用於食品加工,作為食品添加劑;而麴酸也具有抗菌活性,對於細菌、結核

菌與真菌都有抑制作用(2)。

在美國大約有三分之二的麵包生產使用黃麴菌群的米麴菌(Aspergillus oryzae)

所生產的蛋白酶釋放氨基酸和胜肽幫助麵包酵母生長和產氣;米麴菌所生產的 α

澱粉酶及蛋白酶也早已被使用於醫藥及洗滌劑;米麴菌及其副產物也被添加於益

生菌及做為家畜飼料的補充劑(3)。

麴菌屬黃麴菌群及其相關菌種在食品、生化、工業與醫藥生產等領域上都極

具應用潛力,其分類與應用可說是非常重要。但部分黃麴菌種會污染農產品,造

成農產品儲存及食品加工業的問題,甚至產生黴菌毒素,且有某些黃麴菌種,是

人類與動物的伺機性病原菌,對於人類及動物會造成危害;所以在工業上使用黃

麴菌進行醱酵時,安全考量非常之重要(3)。

黃麴菌群已描述的種目前有 30 種以上,生資中心收存的本土菌種有 63 株,

依據形態學特徵鑑定為 4 種,分別為 Aspergillus flavus、Aspergillus flavofurcatus、

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Aspergillus oryzae 及 Aspergillus tamarii,以 rDNA ITS 片段序列類緣分析結果顯示

可區分為 2 群,依據 calmodulin 基因部份序列類緣分析結果顯示可區分為 6 群,其

中有 1 群之分類地位需進一步探討;由於本土黃麴菌群菌株有 46 株菌分離自製造

傳統醱酵食品之種麴,因此總計有 55 株歸屬於 Aspergillus flavus / Aspergillus oryzae

(表一);近年研究顯示 Aspergillus oryzae 應用於醱酵食品,為 Aspergillus flavus

之馴化種(6),需配合 DNA 條碼資料與表現型特徵予以識別。

ITS 雖被選定為真菌 DNA 條碼(15),但麴菌屬或因與人類生活息息相關且應

用廣泛,其分類系統較一般真菌複雜且區分細膩,ITS 無法區分多數黃麴菌內不同

的種,目前常用的鑑別性序列為 calmodulin 及 β-tubulin 基因部份序列(8)。

臺灣黑麴菌群資源

黑麴菌群是麴菌屬中產生褐色至黑褐色分生孢子的類群,由於生長快速且分

布廣泛,除了可應用於傳統泡盛酒 (awamori) 的釀造,因其能產生許多不同種類

的之有機酸和各種酵素製劑等,廣泛應用於食品工業與生技產業。可用於商業量

產檸檬酸(citric acid),亦是多種工業酵素的重要菌種來源之一,其醱酵生產的

酵素包括纖維素酶(cellulase)、半纖維素酶(hemicellulase)、澱粉葡萄糖酶

(amyloglucosidase)、果膠分解酶 (pectinase)及葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase)

等,美國食品暨藥物管理局將 Aspergillus niger 生產之檸檬酸及多種酵素列為公認

安全物質(GRAS)。由於黑麴菌在食品工業上的使用歷史悠久,並具有下列特性:

(1)高度的蛋白質合成及分泌能力;(2)蛋白質合成修飾作用;(3)基因工程技術操作

較動植物簡單快速;(4)能正確形成雙硫鍵穩定蛋白質結構;(5)是安全的基因寄主,

故常被用於生產外來蛋白的寄主(5,7,12)。

黑麴菌群已描述的種目前有 25 種以上,生資中心收存的本土菌種有 20 株,

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依據形態學特徵可鑑定為 7種,分別為Aspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、

Aspergillus carbonarius、Aspergillus japonicus、Aspergillus niger、Aspergillus

phoenicis 及 Aspergillus usamii,以 rDNA ITS 片段序列類緣分析結果顯示可區分

為 7 群,calmodulin 基因部份序列類緣分析結果顯示可區分為 12 群,其中有三群

之分類地位需要進一步探討(表二),calmodulin 基因部份序列對於黑麴菌已描

述的種有較為理想之區分性,本土黑麴菌群呈現豐富的多樣性。

結 語

麴菌屬可說是對人類最重要的真菌,已有14個種之基因體資訊可公開取得,

在真菌之中是全基因體定序最多的屬(4),進入後基因體時代將可大幅拓展麴菌之

應用與價值;臺灣具有豐富的麴菌屬資源,食品所生資中心以 ISO 品質管理系統

妥善維護此重要的生物資源,並透過分讓服務平台提供各界優質的研發素材,期

能實現麴菌資源之產業價值。

誌 謝

食品所生資中心麴菌屬資源之收存承行政院農業委員會與經濟部技術處的

支持,特此致謝。

參考文獻

1. 李宜映、楊玉婷. 2010. 生物經濟的情境模擬. 臺灣經濟研究月刊 33: 60-

66。

2. Burdock, G. A., Soni, M. G., and Carabin, I. G. 2001. Evaluation of Health

Aspects of Kojic Acid in Food. Regulatory Toxicology and Pharmacology 33:

80–101.

Page 116:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

109

3. Chang, , P.-K., and Ehrlich, K. C. 2010. What does genetic diversity of Aspergillus

flavus tell us about Aspergillus oryzae? International Journal of Food

Microbiology 138: 189–199.

4. Gibbons, J. G., and Rokas, A. 2013. The function and evolution of the Aspergillus

genome. Trends in Microbiology 21: 14–22.

5. Hong, S. -B., Lee, M., Kim, D.–H., Varga, J. Frisvad, J. C., Perrone, G., Gomi, K.,

Yamada, O., Machida, M., Houbraken, J. and Samson, R. A. Aspergillus

luchuensis, an Industrially Important Black Aspergillus in East Asia. PLoS One 8:

e63769.

6. Houbraken, J., de Vries R. P., and Samson, R. A. 2014. Modern taxonomy of

Biotechnologically important Aspergillus and Penicillium species. Advances in

Applied Microbiology 86: 199-249.

7. Hubka, V., and Kolarik, M. 2012. β-tubulin paralogue tubC is frequently

misidentified as the benA gene in Aspergillus section Nigri taxonomy: primer

specificity testing and taxonomic consequences. Persoonia 29: 1–10.

8. Midorikawa, G. E., de Sousa Mde, L., Freitas Silva, O., Dias Jdo, S., Kanzaki, L.

I., Hanada, R. E., Mesquita, R. M., Gonçalves, R. C., Alvares, V. S., Bittencourt, D.

M., and Miller, R. N. 2014. Characterization of Aspergillus species on Brazil nut

from the Brazilian Amazonian region and development of a PCR assay for

identification at the genus level. BMC Microbiology 14:138–146.

9. OECD Organisation for Economic Co-operation and Development. 2001.

Biological Resource Centres-underpinning the future of life sciences and

Biotechnology. OECD, 68 pp.

10. Peterson, S. W. 2012. Aspergillus and Penicillium identification using DNA

sequences: barcode or MLST? Applied Microbiology and Biotechnology 95:

339344.

11. Peterson, S. W. 2008. Phylogenetic analysis of Aspergillus species using DNA

sequences from four loci. Mycologia 100: 205–226.

12. Perrone G., Stea, G., Epifani, F., Varga, J., Frisvad, J. C., and Samson, R. A. 2011.

Aspergillus niger contains the cryptic phylogenetic species A. awamori. Fungal

Biology 115:1138-50.

13. Raper, K. B., and Fennell, D. I. 1965. The Genus Aspergillus. Williams and

Wilkins, Baltimore, 875 pp.

14. Samson, R. A., Houbraken, J., Thrane, U., Frisvad, J. C., and Andersen. 2010.

Food and Indoor Fungi. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Center, Utrecht, 390 pp.

Page 117:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

110

15. Schocha, C. L., K. A. Seifertb, S. Huhndorf, V. Robert, J. L. Spouge, C. A.

Levesque, W. Chen, and Fungal Barcoding Consortium. 2012. Nuclear ribosomal

internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for

Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 109: 6241–6246.

16. Seifert, K. A., Samson, R. A., De Waard, J. R., Houbraken, J., Levesque, C. A.,

Moncalvo, J., Louis-Seize, G., and Hebert, P. D. N. 2007. Prospects for fungus

identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as test case.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

104: 3901–3906.

17. Tzean, S. S., Chen, J. L., Liou, G. Y, Chen, C. C., and Hsu, W. H. 1990.

Aspergillus and Related Teleomorphs from Taiwan. Food Industry Research and

Development Institute, Taiwan, 119 pp.

18. Varga, J., Frisvad, J.C. and Samson, R.A. 2011. Two new aflatoxin producing

species, and an overview of Aspergillus section Flavi. Studies in Mycology 69:

57–80.

表一、生資中心本土黃麴菌群之歸群分析

Table 2. Phylogenetic grouping of native Aspergillus section Flavi collected at BCRC

ITS clade1 Scientific name CaM clade

2, 3

I

Aspergillus flavus Link / Aspergillus oryzae

(Ahlb.) Cohn

IA (18)

IB (3)

IC (34)

Aspergillus effuses Tirab. II (1)

Aspergillus section Flavi unidentified group III (3)

II Aspergillus terricola var. indicus (B.S. Mehrotra

& Agnihotri) Raper & Fennell

IV (4)

1: clades identified based on rDNA ITS region sequences.

2: clades identified based on calmodulin gene partial sequences.

3: The number of strains in the clade is given in parentheses.

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表二、生資中心本土黑麴菌群之歸群分析

Table 2. Phylogenetic grouping of native Aspergillus section Nigri collected at BCRC

ITS clade1 Scientific name CaM clade

2, 3

I Aspergillus brasiliensis Varga, Frisvad & Samson I (1)

II Aspergillus carbonarius (Bainier) Thom II (2)

III Aspergillus brunneoviolaceus Bat. & H. Maia III (3)

Aspergillus section Nigri unidentified group 1 IV (1)

IV Aspergillus luchuensis Inui V (1)

Aspergillus neoniger Varga, Frisvad & Samson VI (1)

Aspergillus tubingensis Mosseray VII (1)

Aspergillus section Nigri unidentified group 2 VIII (1)

V Aspergillus niger Tiegh. IX (4)

Aspergillus welwitschiae (Bres.) Henn. X (3)

Aspergillus section Nigri unidentified group 3 XI (1)

VI Aspergillus violaceofuscus Gasperini XII (1)

1: clades identified based on rDNA ITS region sequences.

2: clades identified based on calmodulin gene partial sequences.

3: The number of strains in the clade is given in parentheses.

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陳啟予

現 職

國立中興大學植物病理學系 副教授

學經歷

1992-2000 國立中興大學植物病理學系 碩士

1994-1997 國立中興大學植物病理學系 助理

1997-1999 英國倫敦大學暨 CABI 博士肄業

1999-2001 中央研究院植物研究所 助理

2004-2000 國立中興大學植物病理學系 博士

2005-2000 國立中興大學植物病理學系 助理教授

2014-2000 國立中興大學植物病理學系 副教授

專 長

真菌學、真菌分類學

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臺灣之長喙殼菌類真菌

黃尹則 1、李涵荺 2、施欣慧 1,3、林俞廷 1、陳啟予 1*

1 國立中興大學植物病理學系

2 財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心

3 行政院農業委員會林業試驗所六龜研究中心

* 通訊作者:陳啟予 [email protected]

摘 要

長喙殼菌類真菌(ophiostomatoid fungi)主要包含有性態之屬 Ophiostoma、

Ceratocystiopsis、Grosmannia (屬於 Ophiostomatales 目)及 Ceratocystis (屬於

Microascales 目);以及其無性態之屬,包括 Pesotum、Sporothrix、Hyalorhinocladiella、

Leptographium、Raffaelea (屬於 Ophiostomatales 目)及 Thielaviopsis、Graphium、

Ambrosiella (屬於 Microascales 目)。此類群之真菌在森林生態中極為重要,普遍

屬於木材基質上演替初期之菌種,一般為弱病原性,部分種類會造成嚴重之樹木

病害,多數之種類會引起樹木邊材之藍染,在森林中主要藉由昆蟲、尤其是小蠹

蟲所傳播,而 Raffaelea 及 Ambrosiella 兩屬為蟲道真菌(ambrosia fungi),與菌蠹蟲

有緊密之共生關係。其中有些 Ceratocystis 的種類並不是危害樹木,而是危害農作

物。Microascales 目中之無性態 Scedosporium 屬,由於具有類似 Graphium 之無性

態,也常被歸納為長喙殼菌類真菌,此屬常為人體之伺機性病原菌。對於以上長

喙殼菌類之真菌,臺灣從早期僅有農作物危害之 Ceratocystis 的種類報導,近年逐

漸擴展至廣泛之屬種紀錄,隨著資料之累積,將揭開臺灣另一蘊藏豐富生物多樣

性之領域範疇。

關鍵詞:長喙殼菌類真菌、Ophiostoma、Ceratocystis

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114

長喙殼類真菌簡介

長喙殼菌類真菌 (ophiostomatoid fungi),指的並非是單一分類群,為具有共

有形態、及相似之生態棲境的菌類,有性態(teleomorph)子囊殼具有長喙,無性態

(anamorph)具有長的分生孢子梗或分生孢子束,而子囊孢子及分生孢子為了便於

昆蟲傳播,會聚集成黏液狀。顯然此類似特徵是為了要適應環境而演化,而早期

卻誤將其視為同一分類群,初期主要僅有 Ophiostoma 及 Ceratocystis 屬,此時期

即是以長喙殼菌類真菌為稱呼之開端,當時視此二屬為相近親緣之菌。然而隨著

分類工具之日新月異,且有更多的技術能深入探討菌種間之親緣關係,發現

Ophiostoma 及 Ceratocystis 屬之相似特徵為趨同演化之結果,親緣關係實際上非

常遙遠,Ophiostoma 屬於長喙殼菌目(Ophiostomatales),Ceratocystis 屬於小囊菌

目(Microascales),所以縱使已知道其並非單系群(monophyletic group),現今這類

真菌仍稱之為長喙殼菌類真菌。而隨著更多物種的發現,為了能適切反映類緣關

係,分類上逐步的產生了更多之屬名,以至於長喙殼菌類真菌包含了歸於長喙殼

菌目之 Ophiostoma、Ceratocystiopsis 及 Grosmannia 屬,及其無性態(Pesotum、

Sporothrix、Hyalorhinocladiella、 Leptographium 等屬 );及歸於小囊菌目之

Ceratocystis 屬及其無性態(Thielaviopsis 屬)(40,42),而其他幾個更細分之小屬,

則不在此探討,可參考 de Beer et al. (10)之文章。總而論之,所謂長喙殼菌類之真

菌,包含了所有長喙殼菌目之種類,但僅包括部分小囊菌目之種類。前述菌屬不

論是有性態或無性態皆可稱呼其為長喙殼菌類真菌。在小囊菌目中,無性態之

Graphium、Scedosporium 屬及有性態之 Petriella、Pseudallescheria 屬,雖然與

Ceratocystis (傳統之長喙殼菌類)關係疏遠,但具有分生孢子束、及黏液狀分生孢

子團,所以仍視為長喙殼菌類真菌;其廣泛存在於多樣之生物基質上,並有許多

人體伺機性病原之種類。另外,蟲道真菌(ambrosia fungi)─Raffaelea 及 Ambrosiella

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兩屬與菌蠹蟲(ambrosia beetle)共生,此菌為菌蠹蟲之食物來源,雖然此二無性態

屬在形態上沒有其他長喙殼菌類真菌之特色,但前者親緣和 Ophiostoma 屬相近,

而後者親緣和 Ceratocystis 相近,且生態上和前述種類相似,都主要存在於衰弱、

新近倒伏之木材上,仍同樣被視為長喙殼菌類真菌。

長期以來真菌命名上所使用之雙名系統,也就是允許真菌具有性態、及無性

態平行的兩套命名方式,以至於會有“同一類真菌會擁有有性及無性態兩個學名”

之可能,然自 2013 年起“one fungus one name”的新命名法之實施(33),將造成學

名使用上之重大更迭,尤其是具有許多有性態、及無性態屬之長喙殼菌類真菌,

在此類菌之學名使用尚未定案前,本文仍依循慣用之學名來記述,關於此類菌之

建議用法,以符合新命名法之規定,可參考 de Beer et al. (8)之文章。

長喙殼菌真菌造成之危害

長喙殼菌類真菌對植物而言大部分的種類為弱寄生性,而某些種類則具有強

病原性(13,19,24),部分為人體病原菌,以下分述其所造成之危害。

(1)維管束萎凋:最著名的例子為荷蘭榆樹病,由 Ophiostoma ulmi 以及 O.

novo-ulmi 引起;以及由 Ceratocystis fagacearum 所引起之櫟樹萎凋病。其孢子會

造成維管束阻塞,或是誘發寄主抗病反應而產生樹脂與侵填體(tylose),阻塞了植

物之輸導組織而造成萎凋病徵(35)。

(2)藍染(blue stain):許多長喙殼菌類真菌生長於樹木之邊材,深色的菌絲會

造成邊材藍染色現象。長喙殼菌類真菌中,除了蟲道真菌(ambrosia fungi)及一些

不是以木本植物為基質之菌種外,普遍具有藍染之能力。由於其不具有木質素分

解酵素、及纖維素分解酵素,所以不會影響木材整體之強度(14)。藍染真菌大多

僅為弱寄生菌,如 Ophiotoma quercus 在中歐地區與橡樹林之衰弱有關(11);少數

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致病力強的種類,如 Ceratocystis polonica、C. virescens、Thielaviopsis australis (24)

會引起嚴重的植物病害,致病力強是因為破壞寄主的形成層以及內層樹皮,導致

壞疽(13),進而影響植物水分及養分的運送,此其雖造成萎凋之表徵,但與維管

束阻塞而致之萎凋是不同的。

(3)其他植物危害:包括木本植物之根部病害,如 Leptographium wageneri 引

起針葉樹的黑根病(43);及草本植物、農業經濟作物的危害,如 Ceratocystis

fimbriata 引起之甘藷黑斑病;C. paradoxa 引起之甘蔗鳳梨病、椰子蒂腐病、鳳梨

黑腐病、荸薺黑腐病等;Thielaviopsis basicola 存在於土壤,引起許多草本作物之

根部危害。而 C. paradoxa、T. basicola、T. thielaviopsis 亦造成儲藏性病害(34,36)。

(4)蟲道真菌(ambrosia fungi)之新興病害:現今 Raffaelea lauricola 及 Raffaelea

quercivora 為世界關注之焦點,此菌理當與菌蠹蟲緊密共生,卻轉化為致命之植物病

害。Raffaelea lauricola,造成樟科植物維管束阻塞而致萎凋之病害,特別是酪梨類

(Persea borbonia 及 P. americana)最為嚴重,已在美國造成嚴重威脅,媒介之菌蠹蟲

為 Xyleborus glabratus。Raffaelea quercivora,嚴重造成日本幾種殼斗科橡樹屬(Quercus)

植物莖部之壞疽,而致萎凋,媒介之菌蠹蟲為 Platypus quercivorus。

(5)人體病害:Sporothrix schenckii 普遍存在於木材基質中,並可造成人體皮

膚皮下組織及其淋巴管之肉芽腫,此為極少數長喙殼菌目中會引起人類疾病之種

類。小囊菌目中之 Scedosporium 屬,其多數種類會造成人體疾病(16),尤其是 S.

prolificans 及 S. apiospermum 兩種,危害從皮膚、肺部、至擴散全身,為普遍存

在於環境中之伺機性病原。

主要長喙殼類真菌之形態

(1)有性態屬

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Ophiostoma:(圖一)子囊殼具長喙,具有孔口菌絲(ostiolar hyphae);子囊球形或寬

棍棒狀,於成熟時溶解,子囊孢子於孔口集結成水滴狀;子囊孢子無色,單細胞,

型式多變,偶有膠質外層包覆(10)。對應之無性態為 Pesotum、Sporothrix 及

hyalorhinocladiella-like (O. ips)。

Ceratocystiopsis:子囊殼外圍偶包覆領狀的構造,具喙,但較短;子囊紡錘狀至

橢圓形,於成熟時溶解,子囊孢子於孔口集結成水滴狀;子囊孢子無色,單細胞,

具有膠質外層,鐮刀型(10)。對應之無性態為 Hyalorhinocladiella。

Grosmannia:子囊殼大多具喙(少數種類缺乏),多不具有孔口菌絲;子囊於成熟

時溶解,子囊孢子於孔口集結成水滴狀;子囊孢無色,單細胞,形狀多變,常包

覆有膠質外層(44)。對應之無性態為 Leptographium。

Ceratocystis:(圖二)子囊殼具喙,經常具有孔口菌絲;子囊球形至半球形,於成

熟時溶解,子囊孢子於孔口集結成水滴狀;子囊孢子無色,單細胞,形態多變(腎

形、新月形、帽型)。對應之無性態為 Thielaviopsis。

Petriella:子囊殼短喙;子囊半球形至棍棒狀或倒卵形,成熟時溶解;子囊孢子黃

色至紅棕色,單細胞,不對稱形、長形至卵形,兩端有發芽孔,常於發芽孔處有

突出(hilar protuberances)。對應之無性態為 Scedosporium 及 Graphium。

Pseudallescheria:子囊殼為閉囊殼形式,外壁由拼圖狀(jig-saw-shaped)的細胞組

成;子囊於成熟時溶解;子囊孢子亮棕色,單細孢,橢圓形至檸檬形(16)。對應

之無性態為 Scedosporium 及 Graphium。

(2)無性態屬

Pesotum:(圖三)形成分生孢子束(synnemata),分生孢子梗呈掃帚狀分支,產孢點

呈合軸排列(sympodial),分生孢子於頂端聚集成水滴狀。

Sporothrix:(圖四)產孢點呈合軸排列(sympodial)、並留有截痕(denticle),每個截

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痕處只產生一個孢子(6),每個分生孢子尚能以出芽型式再產生另一個孢子。

Hyalorhinocladiella:(圖五)其產孢梗與營養菌絲形態接近,產孢方式似不明顯之

合軸排列(sympodial),產孢點無截痕,有時具環痕(annellidic)(6)。

Leptographium:(圖六)具深色單生的長分生孢子梗,掃帚狀分支,產孢細胞為環

痕式(annellidic)的產孢方式,分生孢子單細胞,無色,以水滴狀聚集(44)。

Thielaviopsis : (圖七)為瓶狀(phialidic)且內壁芽生式(enteroblastic)的產孢方式,分

生孢子乾性,不會聚集成水滴狀。依不同棲息環境,某些種類同時具有異形孢子

(aleuriospore)。

Graphium:(圖八)具分生孢子束,分生孢子梗呈掃帚狀分支,分生孢子於頂端呈

水滴狀,並會隨時間顏色漸深;產孢方式為環痕式;分生孢子單細胞,無色,稍

彎曲;少數種類具有 scedosporium-like (產孢梗單生或叢生、分生孢子卵型且厚壁)

的伴生無性態(synanamorph)(9)。

Scedosporium:(圖九)產孢梗與營養菌絲形態接近,無色,產孢細胞為環痕式的產

孢方式,孢子於頂端形成透明或淺棕色的水滴狀;分生孢子單細胞,倒卵型,淺

棕色(16)。

Raffaelea:(圖十)分生孢子梗無色,常聚集成分生孢子褥(sporodochia),產孢方式

為環痕式、或為合軸排列且全芽式(holoblastic);分生孢子無色,橢圓形(18)。

Ambrosiella:(圖十一)分生孢子梗無色,常聚集成分生孢子褥(sporodochia),分生

孢子由瓶狀產孢細胞或斷生方式產生,單一或成鏈狀(18)。

臺灣長喙殼菌類真菌之研究歷程

雖然長喙殼菌類真菌主要為林木上之真菌,但臺灣對此類菌之研究卻起始於危

害農作物之種類,即 Ceratocystis 屬之探討,以下將針對臺灣長喙殼菌類真菌各

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屬研究情況逐一做說明。

Ceratocystis:最早為 1912 年 Miyake 的 C. paradoxa (無性態為 Thielaviopsis

paradoxa)引起甘蔗鳳梨病之報告(38),隨後有此病原菌造成香蕉軸腐病(1928)、荸

薺黑腐病(1955)、及鳳梨黑腐病(1959)之報導(6),而 2009 年造成椰子蒂腐(黑腐)

病之紀錄(1)。Ceratocystis adiposa 最早為 Matsumoto (31)報導造成輕微之甘蔗根

部黑腐病,及 1955 年於荸薺上之報導(6),此後不曾有記載,全世界也少有此菌

之報導,而被認為是極稀少之真菌,然而黃(4)之研究顯示,此菌廣泛而普遍存在

於臺灣之土壤中,其確切之致病性仍有待確認。Ceratocystis fimbriata 最早於 1944

年報導造成甘薯黑斑病(6),而此病害至今仍常發生於甘藷田中,而李等(2)發現此

病原亦造成太陽麻之黑腐病。Li & Hsieh(28)於木麻黃枯樹皮上發現 Ceratocystis

stenoceras。Lee et al. (25)自青剛櫟屬植物之傷口上分離得到 Ceratocystis

bhutanensis。

Ophiostoma:Lin et al. (29)證實造成臺灣中部山區重要危害之廣葉杉萎凋病可能

與 O. quercus 有關,此為首次臺灣對於此屬之報導。Li et al. (26)自進口木材中分

離得到 O. floccosum 及 O. pluriannulatum 兩種,但此二種尚未在臺灣發現。Huang

& Chen (22)發表新紀錄種 Ophiostoma denticiliatum。

Ceratocystiopsis、Grosmannia、Petriella、Pseudallescheria:此幾屬之報導闕如。

Sporothrix: Tzean et al. (39)在檬果葉蟬上發現 Sporothrix isarioides 之紀錄;而

Sporothrix schenckii 在臺灣也屢發現有人體臨床危害,亦普遍可在森林林木中分離

得到此菌。

Leptographium:Wingfield et al. (41)在建立了臺灣發現的新種 L. elegans。Li et al.

(27)發表了新紀錄種 L. bistatum 及 L. sinoprocerum。Huang & Chen (23)發表了一

新種 Leptographium globosum。而李(3)、黃(4)有新種尚未正式發表。

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Thielaviopsis:Huang & Chen (21)調查臺灣市場上之紅蘿蔔普遍存在造成儲藏性病

害之 T. basicola,亦有在部分胡蘿蔔樣品中分離得到 T. thielaviopsis。

Graphium: Sawada (38)發表了新種 G. gordoniae,造成大頭茶之葉斑病,然而發表

當時沒有拉丁文描述,以至於此學名為無效(nom. inval.)發表;再從其原始描述判

斷,其並不像長喙殼菌類之真菌。之後有 Matsushima (32)發表臺灣發現之 G.

penicillioides 紀錄,及黃(4) Graphium carbonarium 之紀錄。

Scedosporium:臺灣臨床醫學上有S. apiospermum及S. prolificans之紀錄,而經調查,

此二種真菌普遍存在於都市土壤中(黃尹則,未發表)。

Pesotum、Hyalorhinocladiella:此二屬之報導闕如。

Raffaelea:由於 Raffaelea lauricola 在美國造成樟科植物、尤其是酪梨嚴重之病害,

而其媒介菌蠹蟲 Xyleborus glabratus 被視為原生於亞洲,Harrington et al.(20)於臺灣捕

捉到此菌蠹蟲,並分離到此病原,而特別的是,此病原尚未對臺灣的樟科有危害之報

導,可能與臺灣為此病原之原生地有關,其同時也在此菌蠹蟲身上分離到 R. fusca 及

R. subfusca 兩種菌。另外針對在日本造成橡樹重要危害之 Raffaelea quercivora,其媒

介昆蟲 Platypus quercivorus 亦存在於臺灣(7),且已有分離得到此菌(Masuya,未發表),

但同樣的,此菌並未有造成臺灣樹木危害之現象。

Ambrosiella:與 Raffaelea 同屬於蟲道真菌(ambrosia fungi),臺灣尚未有任何的紀錄。

Esteya:在此提及此特殊及罕見之屬,此為 Liou et al. (30)年建立於臺灣捕捉線蟲

之新屬新種 E. vermicola,此屬與 Leptographium 相近,但其特殊的生存策略與分

生孢子的形態皆與 Leptographium 不同,從親緣分析來看(8),確實 Esteya 屬於長

喙殼菌目,且和其他 Leptographium 種類相近,所以在未來修正 Leptographium 屬

時此屬需一併納入。

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結 語

長喙殼菌類之真菌廣泛地存在於世界各地,且對於森林、經濟作物都可能造成

危害(特別是森林病害),目前對於此類真菌研究主要集中在美國及南非兩地,因

此過去此許多種類的報導集中於歐美地區,但這並非代表亞洲地區沒有這些真菌

的危害的情形,亞洲地區僅日本對於長喙殼菌有較深入的了解,其他國家仍正在

起步 — 包含臺灣。而臺灣多樣的生態相,勢必仍有更多不同的長喙殼菌類真菌

待發掘,期盼能有更多的研究此類物種的資訊,以作為探討生物多樣性與病害管

理之用。

參考文獻

1. 曾勝志、孫岩章. 2009. Ceratocystis paradoxa 引起之可可椰子果實基腐病. 植

物病理學會刊 18:67–74.

2. 李俊義、郭克忠. 1997. 由 Ceratocystis fimbriata 引起之太陽麻黑腐病. 植物病

理學會刊 6:191–194.

3. 李涵荺. 2009. 進口木材及本土林木中長喙殼菌類真菌之鑑定. 國立中興大學

植物病理學碩士論文 85 pp.

4. 黃尹則. 2011. 臺灣長喙殼菌及相關類群真菌之鑑定. 國立中興大學植物病理

學碩士論文 117 pp.

5. Aghayeva, D. N., Wingfield, M. J., de Beer, Z. W., and Kirisits, T. 2004. Two new

Ophiostoma species with Sporothrix anamorphs from Austria and Azerbaijan.

Mycologia 96:866–878.

6. Anonymous. 2002. List of plant diseases in Taiwan. The Plant Protection Society,

R. O. C. 404 pp.

7. Beaver, R. A., Shih, H.-T. 2003. Checklist of Platypodidae (Coleoptera:

Curculionoidea) from Taiwan. Plant Protection Bulletin 45:75–90.

8. De Beer, Z. W., Seifert, K., and Wingfield, M. 2013. The ophiostomatoid fungi:

their dual position in the Sordiomycetes. In Seifert KA, ZW De Beer and MJ

Wingfield (eds) The Ophiostomatoid Fungi: Expanding Frontiers, CBS

Biodiversity Series Vol. 12, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht,

The Netherlands:1–19.

Page 129:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

122

9. De Beer, Z. W., Seifert, K., and Wingfield, M. 2013. A nomenclator for

ophiostomatoid genera and species in the Ophiostomatales and Microascales. In

Seifert KA, ZW De Beer and MJ Wingfield (eds) The Ophiostomatoid Fungi:

Expanding Frontiers, CBS Biodiversity Series Vol. 12, CBS-KNAW Fungal

Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherlands:245–322.

10. De Beer, Z. W., Seifert, K., and Wingfield, M. 2013. Emerging lineages in the

Ophiostomatales. In Seifert KA, ZW De Beer and MJ Wingfield (eds) The

Ophiostomatoid Fungi: Expanding Frontiers, CBS Biodiversity Series Vol. 12,

CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherlands:21–46.

11. Cech, T., Donaubauer, E., Tomiczek, C., Leontovyc, R., Yde-Anderson, A.,

Delatour, C., Wulf, A., Toth, J., Vajna, L., Vammini, A., Luisi, N., Oosterbaan, A.,

Kowalski, T., Gibbs, J., and Jurc, D. 1990. Oak decline and the status of

Ophiostoma spp. on oak in Europe. EPPO Bull 20:405–422.

12. Cortez, K. J., Roilides, E., Quiroz-Telles, F., Meletiadis, J., Antachopoulos, C.,

Knudsen, T., Buchanan, W., Milanovich, J., Sutton, D. A., Fothergill, A., Rinaldi,

M. G., Shea, Y. R., Zaoutis, T., Kottilil, S., and Walsh, T. J. 2008. Infections

Caused by Scedosporium spp. Clin. Microbiol. Rev. 21:157–197.

13. Dimond, A. 1970. Biophysics and biochemistry of the vascular wilt syndrome.

Annu. Rev. Phytopathol. 8:301–322.

14. Gibbs, J. 1993. The biology of Ophiostomatoid fungi causing sapstain in trees and

freshly cut logs. In Wingfield, M. J. Seifert, K. A., and Webber, J. F. (eds.)

Ceratocystis and Ophiostoma: Taxonomy, Ecology, and Pathogenicity., American

Phytopathological Society Press, St. Paul, MN: 153–160.

15. Greif, M. D., Gibas, C. F. C., and Currah, R. S. 2006. Leptographium piriforme sp.

nov., from a taxonomically diverse collection of arthropods collected in an

aspen-dominated forest in western Canada. Mycologia 98:771–780.

16. Guarro, J., Kantarcioglu, A. S., Horré, R., Luis Rodriguez-Tudela, J., Cuenca

Estrella, M., Berenguer, J., and Sybren De Hoog, G. 2006. Scedosporium

apiospermum: changing clinical spectrum of a therapy-refractory opportunist. Med.

Mycol. 44:295–327.

17. Harrington, T. C. 2005. Ecology and evolution of mycophagous bark beetles and

their fungal partners. In Vega F.E. and Blackwell, M. (eds) Insect-fungal

associations: ecology and evolution, Oxford University Press: 257–291.

18. Harrington, T. C., Aghayeva, D. N., and Fraedrich, S. W. 2010. New combinations

in Raffaelea, Ambrosiella, and Hyalorhinocladiella, and four new species from the

Page 130:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

123

redbay ambrosia beetle, Xyleborus glabratus. Mycotaxon 111:337–361.

19. Harrington, T. C., McNew, D., Steimel, J., Hofstra, D., and Farrell, R. 2001.

Phylogeny and taxonomy of the Ophiostoma piceae complex and the Dutch elm

disease fungi. Mycologia 111–136.

20. Harrington, T. C., Yun, H. Y., Lu, S.-S., Goto, H., Aghayeva, D. N., and Fraedrich,

S. W. 2011. Isolations from the redbay ambrosia beetle, Xyleborus glabratus,

confirm that the laurel wilt pathogen, Raffaelea lauricola, originated in Asia.

Mycologia 103:1028–1036.

21. Huang, Y. T., and Chen, C. Y. 2010. Two Thielaviopsis Species on Carrots in

Taiwan. Fung. Sci. 25:69–74.

22. Huang, Y. T., and Chen, C. Y. 2013. Ophiostoma denticiliatum, a new record in

Taiwan. Fung. Sci. 28:31–38.

23. Huang, Y.-T., and Chen, C.-Y. 2014. Leptographium globosum sp. nov., a new

species with globose conidia. Mycol Progress 1–8.

24. Kirisits, T., Wingfield, M., and Chhetri, D. 2002. Studies on the association of

blue-stain fungi associated with the Eastern Himalayan spruce bark beetle (Ips

schmutzenhoferi) and with other bark beetles in Bhutan. Renewable Natural

Resources Research Center, Yusipang, Bhutan. Yusipang Report.

25. Lee, H.Y., Hsieh, S.Y., and Chen, C.Y. 2009. Newly Recorded Species of

Thielaviopsis and Chalara in Taiwan. Fung. Sci. 53–59.

26. Li, H.Y., Kao, H.W., and Chen, C.Y. 2009. Two New Records of Leptographium

from Taiwan. Fung. Sci. 15–21.

27. Li, H. Y., Kao, H. W., and Chen, C. Y. Ophiostomatoid fungi from imported wood

in Taiwan. Taiwania 54:343–352.

28. Li, L.T., and Hsieh, W.H. 1991. Two new species and 13 new records of

ascomycetes from Taiwan. Transactions of the Mycological Society of Republic

of China 6:57–71.

29. Lin, T. C., Huang, J. W., and Hsieh, W. H. 2003. Identification of ophiostomatoid

fungi associated with Chinese fir wilt in Taiwan. Plant Pathol. Bull. 12:33–42.

30. Liou, J. Y., Shih, J. Y., and Tzean, S. S. 1999. Esteya, a new nematophagous

genus from Taiwan, attacking the pinewood nematode (Bursaphelenchus

xylophilus). Mycol. Res. 103:242–248.

31. Matsumoto, T. 1952. Monograph of sugarcanes diseases in Taiwan.

32. Matsushima, T. 1980. Matsushima mycological memoirs. Matsushima Fungus

Collection.

Page 131:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

124

33. McNeill, J., Barrie, F., Buck, W., Demoulin, V., Greuter, W., Hawksworth, D.,

Herendeen, P., Knapp, S., Marhold, K., Prado, J., Prud’homme van Reine, W.,

Smith, G., Wiersema, J., and Turland, N. 2012. International Code of

Nomenclature for algae, fungi and plants (Melbourne Code). [Regnum vegetabile

no. 154.] Königstein: Koeltz Scientific Books.

34. Punja, Z. K., and Gaye, M. M. 1993. Influence of postharvest handling practices

and dip treatments on development of black root rot on fresh market carrots. Plant

Dis. 77:989–995.

35. Raffa, K. F., and Berryman, A. A. 1983. Physiological aspects of lodgepole pine

wound responses to a fungal symbiont of the mountain pine beetle, Dendroctonus

ponderosae (Coleoptera: Scolytidae). Can. Entomol. 115:723–734.

36. Rohrbach, K. G., and Phillips, D. J. 1990. Postharvest diseases of pineapple. In

Paull R. E. (eds) Symposium on Tropical Fruit in International Trade,

International Society for Horticultural Science: 503–508.

37. Sawada, K. 1922. Descriptive catalogue of the Formosan fungi II. Dept. Agri.

Govern. Res. Inst. Taiwan Rept. 2:139–164.

38. Sawada, K. 1959. Descriptive catalogue of Taiwan (Formosan) fungi XI. Spec.

Publ Coll. Agric. Taiwan Univ. 8:211–277.

39. Tzean, S. S., Hsieh, L. S., and Wu, W. J. 1997. Atlas of Enomopathogenic Fungi

from Taiwan. Council of Agriculture, Taiwan, R.O.C. 214 pp.

40. Upadhyay, H. P. 1981. A monograph of Ceratocystis and Ceratocystiopsis. Univ.

Georgia Press. Athens. 176 pp.

41. Wingfield, M. J., Crous, P. W., and Tzean, S. S. 1994. Leptographium elegans: a

new species from Taiwan. Mycol. Res. 98:781–785.

42. Wingfield, M. J., Seifert, K. A., Webber, J. F., and Society, A. P. 1993.

Ceratocystis and Ophiostoma: taxonomy, ecology, and pathogenicity. American

Phytopathological Society Press, St. Paul, MN.

43. Witcosky, J. J. 1981. Insects associated with black-stain root disease of

Douglas-fir in western Oregon. M. Sc. thesis. Oregon state Univ., U.S.A. 51 pp.

44. Zipfel, R. D., de Beer, Z. W., Jacobs, K., Wingfield, B. D., and Wingfield, M. J.

2006. Multi-gene phylogenies define Ceratocystiopsis and Grosmannia distinct

from Ophiostoma. Stud. Mycol. 55:75–97.

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圖一、Ophiostoma 之 (A)長喙子囊殼 (B)孔口菌絲。

Fig. 1 Ophiostoma (A) Perithecium with a long neck. (B) ostiolar hyphae

圖二、Ceratocystis 之 (A)長喙子囊殼 (B)孔口菌絲。

Fig. 2 Ceratocystis (A) Perithecium with a long neck. (B) ostiolar hyphae.

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圖三、Pesotum 之分生孢子束,頂端呈掃帚狀分支。

Fig. 3 Pesotum, showing a synnema with penicillate branches.

圖四、Sporothrix 之合軸排列的產孢梗上之齒狀痕跡。

Fig. 4 Sporothrix, showing sympodial conidiophores with denticles.

圖五、Hyalorhinocladiella 之環痕式產孢方式。

Fig. 5 Hyalorhinocladiella, showing annellidic conidiogenous cells.

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圖六、Leptographium 之單生產孢梗,頂端呈掃帚狀分支。

Fig. 6 Leptographium, showing a simple conidiophore with penicillate branches.

圖七、Thielaviopsis 之瓶狀產孢方式。

Fig. 7 Thielaviopsis, showing phialidic conidiohenous cells.

圖八、Graphium 之 (A)分生孢子束及 (B)環痕式產孢方式。

Fig. 8 Graphium, showing a synnema with annellidic conidiogenous cells.

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圖九、Scedosporium 之單生產孢梗及分生孢子。

Fig. 9 Scedosporium, showing a simple conidiophores and conidia

圖十、Raffaelea 之分生孢子梗及孢子。

Fig. 10 Raffaelea, showing conidiophores and conidia.

圖十一、Ambrosiella 之分生孢子梗及孢子。

Fig. 11 Ambrosiella, showing conidiophores and conidia.

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沈偉強

現 職

國立臺灣大學植物病理與微生物學系 教授

學經歷

1992-2000 國立臺灣大學 植物病理學研究所 碩士

1999-2000 美國德州農工大學 植物病理與微生物學研究所 博士

1990-2000 ( Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M

1990-2000 University, College Station, TX, USA )

1999-2000 美國杜克大學 遺傳系 博士後研究

2000-2005 國立臺灣大學 植物病理與微生物學系 助理教授

2005-2011 國立臺灣大學 植物病理與微生物學系 副教授

2011-2000 國立臺灣大學 植物病理與微生物學系 教授

2008-2000 國立臺灣大學 生物資源暨農學院

國際農業教育與學術交流中心 組長

專 長

分子真菌學、真菌光反應、真菌生殖生理、植物病理學

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隱球菌有性生殖之多樣性

沈偉強*、劉廣宏、施佑霖

國立臺灣大學 植物病理與微生物學系

*通訊作者:沈偉強 [email protected]

摘 要

隱球菌(Cryptococcus neoformans)為一人體伺機性病原真菌,屬於異宗交配

型之擔子菌,具有 MATa 與 MAT 兩種不同交配型,可進行雙性有性生殖

(bisexual mating/reproduction)。除了雙性有性生殖外,隱球菌還具有真菌界中少

見的單性有性生殖(unisexual mating/reproduction),此現象絕大部分存在於 MAT

菌株。單性有性生殖的發生形態,與雙性有性生殖類似,唯單性有性生殖產生單

核菌絲,菌絲末端亦會膨大產生擔子柄,並經由減數分裂產生有性子代擔孢子。

隱球菌的雙性與單性有性生殖的發生,都透過相同的環境因子來誘導,並藉由類

似訊息傳遞路徑網絡進行調控,但單性有性生殖有其特殊的誘導及調控機制。藍

光為影響真菌生理功能的重要環境因子,隱球菌的有性生殖過程中,藍光透過Cwc

複合體抑制生殖菌絲的生長。本實驗室的研究,透過基因體層次的篩選與分析,

找出相關參與雙性及單有性生殖的基因,包括 CRK1、SSN3、SSN8 與 MUB1 等,

這些基因除了調控隱球菌雙性有性生殖外,亦與單性有性生殖密切關聯。

關鍵詞:隱球菌、雙性有性生殖、單性有性生殖、藍光、Cwc、Crk1、Ssn3

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緒 言

真菌種類繁多,具有豐富的多樣性,為研究真核生物生理及演化的重要材料。

真核生物為能因應及生存於不同環境中,發展出有性生殖的機制,藉由產生不同

遺傳組成及基因多樣性的後代,增加環境適應性。真菌有性生殖的方式,包括同

宗交配(Homothallism)及異宗交配(Heterothallism)兩種型式。異宗交配型真

菌,通常具有兩種或或多種交配型(mating type)菌株,兩種不同交配型菌株細

胞,藉由分泌費洛蒙互相吸引,進行細胞融合,之後透過減數分裂,產生基因重

組的子代。然而,同宗交配型真菌,通常無交配型之區別,單一細胞可經誘導進

行有性生殖,同樣以減數分裂產生基因重組之後代。單一種類之真菌,多只存在

單一有性生殖方式,鮮少二者並存。隱球菌(Cryptococcus neoformans),屬於異

宗交配型之擔子菌,除了有 MATa 與 MAT 細胞間的雙性有性生殖 (bisexual

mating)外,亦發現 MAT 細胞可行單性有性生殖 (unisexual mating)。本文將介紹

隱球菌之有性生殖,並著重於單性有性生殖之發生與意義。

隱球菌有性生殖

隱球菌(Cryptococcus neoformans)為一人體伺機性病原真菌,屬於二極異宗

交配型之擔子菌,包括 MATa 與 MAT 兩種不同的交配型,並具有兩種細胞形態

-酵母菌與菌絲(10)。隱球菌有性生殖之發生及形態分化,已完整報導描述,

MATa 與 MAT 兩種不同交配型酵母細胞,在氮素源缺乏的環境中,經由費洛蒙

誘導進行細胞融合,產生雙核生殖菌絲,雙核菌絲具有融合扣子體(fused clamp

connection)之構造,藉以維持雙核特徵。而隨著菌絲發育生長,最後在菌絲末端

膨大形成擔子柄,二細胞核在此進行核融合,並經由減數分裂後產生 4 個單倍體

細胞核,再藉由反覆有絲分裂及擔孢子分化過程,產生四串擔孢子,完成有性生

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殖(10, 12)。

在自然界或臨床環境中,絕大部分隱球菌的分離株為 MAT交配型。隱球菌

MAT 交配型菌株,可進行類似其有性生殖形態特徵之分化過程,此過程最初被

認為是一無性產孢過程,原稱為單核產孢(monokaryotic fruiting)or 單倍體產孢

(haploid fruiting),此過程推測與環境中高比例 MAT 隱球菌菌株有關(23)。

2005 年 Lin 等人進一步地深入研究發現,此過程為發生於單一交配型(主要為

MAT 交配型細胞,或極少數 MATa 交配型細胞)菌株的有性生殖,不需要另一

種交配型的細胞進行誘導或融合,即可單獨完成。在環境缺乏氮素源時,MATα 交

配型之隱球菌,可能經由細胞融合或細胞內染色體二倍體化(endoduplication)後,

發育形成單核雙倍體之菌絲,其菌絲扣子體不具融合現象,但菌絲可生長延長,

末端會特化形成擔子柄(basidium),並在其中進行減數分裂,產生四串 MATα 交

配型單核單倍體之擔孢子(basidiospores)。此分化過程經學者研究,所產生之後

代乃經減數分裂而來,具有基因重組與染色體物質交換之特徵,此現象確認為隱

球菌另一有性生殖型式,稱為單性有性生殖(unisexual reproduction;15)。單性

有性生殖,類似真菌已知之同宗交配型式,唯隱球菌為異宗交配型之真菌,具有

兩種不同交配型細胞參與的傳統雙性有性生殖,又存在有單一交配型細胞完成之

有性生殖,在真菌中為首次之報導,目前在真菌中亦極為罕見。

隱球菌單性有性生殖之現象,在近代隱球菌引起之人畜隱球菌症,扮演重要

的角色。二十世紀末於北美西岸加拿大溫哥華一帶,爆發隱球菌造成之人類及野

生動物罹病與死亡案例,所引起之病原菌為隱球菌近緣種-格特隱球菌

(Cryptococcus gattii;1, 6)。 菌株譜系學研究顯示,造成隱球菌症爆發的 MAT

格特隱球菌親本之一,可能源自於二十世紀初,尤加利樹由澳洲引進北美西岸時

所帶入,可能經由兩次-單性有性生殖之過程,於當地產生具有強病原性、高

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產孢力的有性生殖後代,造成群聚感染(5)。

隱球菌有性生殖之調控

隱球菌有性生活史的描述,及 MAT 交配型菌株於環境中的懸殊比例,促使

進一步地發現及分析隱球菌交配型位點(mating type locus;14)。隱球菌交配型

位點大小超過 100 kb,遠大於已知或常見的真菌交配型位點,研究推測其位點可

能經由四極異宗交配型位點之前身,經由三極交配型位點過渡體,演化成為現今

的二極異宗交配型位點結構(4)。隱球菌交配型位點,其中包含有性生殖相關基因,

如費洛蒙基因(pheromone;MF1/2/3;MFa1/2/3)、費洛蒙接受蛋白質基因

(pheromone receptor)(STE3;STE3a)、費洛蒙訊息傳導路徑蛋白質,與轉錄調

控因子等,以及其他目前已知與有性生殖沒有明顯關聯之基因等。

費洛蒙活化的 Cpk1 mitogen activated protein(MAP) kinase 訊息傳導路徑,

是隱球菌雙性有性生殖(bisexual reproduction)的主要調控途徑(2)。MAT/MATa

隱球菌酵母細胞,分別藉由細胞膜上的費洛蒙接受蛋白質 Ste3/Ste3a,感受外泌

的費洛蒙分子 Mfa/Mf,透過 G 蛋白質複合體(heterotrimeric G protein complex)

之活化,並經由 Ste20/Ste20a 及 Ste11/Ste11a-Ste7-Cpk1 MAP kinase cascade

蛋白激酶之訊息傳遞作用,活化下游轉錄調控因子。Mat2,為 Cpk1 MAP kinase

訊息途徑下游主要轉錄因子,透過活化費洛蒙及費洛蒙接受蛋白質等相關基因,

進一步活化 Cpk1 MAP kinase 訊息傳導迴圈,促使 MATa 與 MAT 酵母形態細

胞進行細胞融合,及後續有性生殖之分化。Znf2 轉錄調控因子,位於 Mat2 的下

游,為控制雙核生殖菌絲生長的關鍵轉錄因子(16)。雙核生殖菌絲形成,生長一

段時間後,最後會在菌絲末端膨大形成擔子柄,藉由核融合調控基因 KAR7,誘

導調控細胞核之融合(13);而其他因子如 Dmc1、Spo11 與 Ubc5,則是參與控

制減數分裂的發生及擔孢子的形成,最後產生含等比例交配型的雙性有性生殖基

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因重組子代(3)。

隱球菌雙性及單性有性生殖,具有共同的調控因子或路徑,但研究顯示二者

亦存在不同的誘導及調控機制(21)。費洛蒙活化的 Cpk1 MAP kinas 訊息傳導路

徑,在隱球菌單性有性生殖亦扮演重要角色。當 MF1/2/3 、 GPB1 、

STE11/STE7/CPK1、MAT2,以及 ZNF2 這些基因功能之喪失,亦會造成隱球菌

單性有性生殖的缺失(2, 16);而 DMC1、SPO11,以及 UBC5 這些基因的突變,

也會使單性有性生殖無法完成減數分裂及產生基因重組之子代(3)。

另一方面,研究顯示單性有性生殖,可透過非細胞間費洛蒙感受機制,以及

非費洛蒙訊息傳遞路徑,進行誘導。過度表達 MF1 基因,抑或 G protein 次

單元基因 GPA3 的突變,皆造成單性有性生殖之增加(8, 19); 若 G protein β 次

單元 GPB1 基因發生突變,則 MF1 基因之過度表達或 gpa3 突變株性狀,皆受

到阻斷。而費洛蒙胞外傳輸基因 STE6 的突變,無法進行雙性有性生殖,但單性

有性生殖則不受影響,此結果顯示單性有性生殖可透過細胞內費洛蒙之作用,進

行調控(7)。此外,G protein 次單元基因 gpa2gpa3 雙重突變株,呈現不同的

雙性及單性有性生殖突變性狀,其於雙性有性生殖呈現缺失,但單性有性生殖卻

明顯增加,此結果顯示,二者機制有別,單性有性生殖菌絲的形成,與細胞融合

無關(8)。轉錄因子 Ste12可能位於非 Cpk1 MAP kinase 費洛蒙訊息傳遞路徑,

進行誘導。STE12的突變些微影響雙性有性生殖,但造成單性有性生殖明顯缺失,

過度表達 STE12基因,誘導單性有性生殖之發生(26)。此外,過度表達類似費

洛蒙接受蛋白質基因 CPR2,亦會造成單性有性生殖之增加,而若位於此基因下

游的 GPB1 基因發生突變,則過度表達之性狀,受到阻斷。CPR2 基因之平時表

現量低,於細胞融合後表現增高,而費洛蒙接受蛋白質基因 STE3,受到費洛蒙

誘導,融合前表現量即已增加,二者之表現明顯有別;而於 ste3突變株中過度表

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達 CPR2 基因,單性有性生殖亦顯著增加(9)。因此,了解 CPR2 基因之活化機

制或因子,將有助於單性有性生殖機制之探討。最後,單性有性生殖的過程中,

具有細胞內染色體二倍體化(endoduplication)之現象,該現象可發生於生殖過程

中的不同階段,但其發生及調控所知有限,有待進一步探討。

藍光調控隱球菌有性生殖之菌絲生長

除了氮素源外,許多環境或營養因子,會影響隱球菌雙性及單性有性生殖的

進行,例如溫度、濕度、光線、銅離子、環境中的費洛蒙,以及植物成分等(10,

11, 20, 24)。本實驗室以隱球菌為材料,探討真菌光反應及生殖生理之分子機制,

過去的研究發現,可見光譜中之藍光抑制隱球菌有性生殖菌絲之形成,並且透過

真菌保守性藍光感受蛋白質 Cwc1,與 Cwc2 形成複合體,接受外界光線刺激,並

經由後轉譯修飾作用,調控下游光反應及有性生殖菌絲生長(18)。經由基因體逢

機突變之實驗設計,篩選與分析突變株,找出相關參與雙性及單性有性生殖基因,

包括 SSN8、SSN3、CRK1 與 MUB1 等,這些基因除了調控隱球菌雙性有性生殖外,

亦與單性有性生殖有所關聯(25)。隱球菌 SSN8 基因逢機突變株,除回復雙核菌

絲生長外,亦呈現明顯的單性有性生殖菌絲生長。Ssn8 為 RNA polymerase II

mediator 組成蛋白質,又稱為 C-type 周期素(C-type cyclin),而分析 SSN8 基因

功能,發現 SSN8 在隱球菌雙性與單性有性生殖過程中,皆扮演負向調控之角色,

並且參與其他如黑色素形成、莢膜合成,及入侵菌絲生長等生理之調控(22)。啤

酒酵母菌的研究顯示,Ssn8 周期素蛋白質,會與 Ssn3 周期素依賴性蛋白質激酶

一起作用,調控相關基因的表現。目前本實驗室針對隱球菌 SSN3 基因進行突變,

性狀分析顯示其與 ssn8 突變株相似,因此推測隱球菌 Ssn8 與 Ssn3 蛋白質,一

起共同調控有性生殖相關基因之表現。

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另一逢機突變株分析發現,突變基因為CRK1,Crk1 為Ser/Thr protein kinase,

在雙性有性生殖過程中,同樣扮演負向調控之角色。crk1 突變株之 MF1 費洛蒙

基因,及費洛蒙訊息反應路徑下游轉錄因子如 MAT2 與 ZNF2 的表現量,皆有明

顯的提升。除此之外,crk1 突變株雙核生殖菌絲之長度不如野生株般長,但其形

成擔子柄與擔孢子的時間,卻較野生株提早許多;相對地,在 CRK1 基因過度表

現的菌株中,相關基因表現量則是被抑制。而有趣的是,CRK1 基因在雙性有性

生殖及單性有性生殖中的角色,有所不同,在 crk1 突變株或過度表現 CRK1 之

菌株,單性有性生殖皆無法進行(17)。由此可知,在雙性與單性有性生殖的過程

中,二者之訊息傳遞路徑,有所差異存在。

結語

有性生殖,乃真核生物經由減數分裂過程產生基因重組子代,提供物種遺傳

多樣性,以適應自然界各種不同環境之主要方式。隱球菌,為一異宗交配型之人

體病原真菌,廣泛分佈於世界各地,並且在自然或臨床環境中,主要為 MAT 交

配型的菌株。過去研究的瞭解,異宗交配型之真菌,通常採取雙性有性生殖之策

略,但隱球菌除可進行雙性有性生殖,更發展出單性有性生殖之方式,使得相同

或不同 MAT菌株,能進行有性生殖,經減數分裂產生遺傳重組之子代,並實際

引發流行感染。此一現象,顯示真菌多樣的演化機制,目前除了 C. neoformans

外,在白色念珠菌 Candida albicans 亦有報導,因此除了對單性有性生殖之誘發

與調控機制,需進一步深入探討,是否此現象廣泛存在於其他真菌,亦值得進一

步的了解。

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

137

參考文獻

1. Byrnes, E.J. III, Bildfell, R.J., Frank, S.A., Mitchell, T.G., Marr, K.A. and Heitman,

J., 2009. Molecular evidence that the range of the Vancouver Island outbreak of

Cryptococcus gattii infection has expanded into the Pacific Northwest in the United

States. J. Infect. Dis. 199:1081-1086.

2. Davidson, R.C., Nichols, C.B., Cox, G.M., Perfect, J.R. and Heitman, J. 2003. A

MAP kinase cascade composed of cell type specific and non-specific elements

controls mating and differentiation of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans.

Mol. Microbiol. 49:469-485.

3. Feretzaki, M. and Heitman, J. 2013. Genetic circuits that govern bisexual and

unisexual reproduction in Cryptococcus neoformans. PLoS Genet. 9:e1003688.

4. Fraser, J.A., Diezmann, S., Subaran, R.L., Allen, A., Lengeler, K.B., Dietrich, F.S.,

and Heitman, J. 2004. Convergent evolution of chromosomal sex-determining

regions in the animal and fungal kingdoms. PLoS Biol. 2:1-13.

5. Fraser, J.A., Giles, S.S., Wenink, E.C., Geunes-Boyer, S.G., Wright, J.R., Diezmann,

S., Allen, A., Stajich, J.E., Dietrich, F.S., Perfect, J.R. and Heitman, J. 2005.

Same-sex mating and the origin of the Vancouver Island Cryptococcus gattii

outbreak. Nature 437:1360-1364.

6. Hoang, L.M.N., Maguire, J.A., Doyle, P., Fyfe, M., and Roscoe, D.L. 2004.

Cryptococcus neoformans infections at Vancouver Hospital and Health Sciences

Centre (1997-2002): epidemiology, microbiology and histopathology. J. Med.

Microbiol. 53:935-940.

7. Hsueh, Y.P. and Shen, W.C. 2005. A homolog of Ste6, the a-factor transporter in

Saccharomyces cerevisiae, is required for mating but not for monokaryotic fruiting

in Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 4:147-155.

8. Hsueh, Y.P, Xue, C., and Heitman, J. 2007. G protein signaling governing cell fate

decisions involves opposing Galpha subunits in Cryptococcus neoformans. Mol.

Biol. Cell 18:3237-3249.

9. Hsueh, Y.P, Xue, C., and Heitman, J. 2009. A constitutively active GPCR governs

morphogenic transitions in Cryptococcus neoformans. EMBO J. 28:1220-1233.

10. Hull, C.M. and Heitman, J. 2002. Genetics of Cryptococcus neoformans. Annu. Rev.

Genet. 36:557-615.

11. Kent, C.R., Ortiz-Bermudez, P., Giles, S.S., Hull, C.M. 2008. Formulation of a

defined V8 medium for induction of sexual development of Cryptococcus

Page 145:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

138

neoformans. Appl. Environ. Microbiol. 74:6248-6253.

12. Kwon-Chung, K.J. 1976. Morphogenesis of Filobasidiella neoformans, the sexual

state of Cryptococcus neoformans. Mycologia 68:821–833.

13. Lee, S. C. and Heitman, J. 2012. Function of Cryptococcus neoformans KAR7

(SEC66) in karyogamy during unisexual and opposite-sex mating. Eukaryot. Cell 11:

783-94.

14. Lengeler, K.B., Fox, D.S., Fraser, J.A., Allen, A., Forrester, K., Dietrich, F.S., and

Heitman, J. 2002. Mating-type locus of Cryptococcus neoformans: a step in the

evolution of sex chromosomes. Eukaryot. Cell 1:704-718.

15. Lin, X., Hull, C.M. and Heitman, J. 2005. Sexual reproduction between partners of

the same mating type in Cryptococcus neoformans. Nature 434:1017-1021.

16. Lin, X., Jackson, J. C., Feretzaki, M., Xue, C. and Heitman, J. 2010. Transcription

factors Mat2 and Znf2 operate cellular circuits orchestrating opposite- and same-sex

mating in Cryptococcus neoformans. PLoS Genet. 6:e1000953.

17. Liu, K.H. and Shen, W.C. 2011. Mating differentiation in Cryptococcus neoformans

is negatively regulated by the Crk1 protein kinase. Fungal Genet. Biol. 48:225-240.

18. Lu, Y.K., Sun, K.H. and Shen, W.C. 2005. Blue light negatively regulates the sexual

filamentation via the Cwc1 and Cwc2 proteins in Cryptococcus neoformans. Mol.

Microbiol. 56:480-491.

19. Shen, W.C., Davidson, R.C., Cox, G.M., and Heitman, J. 2002. Pheromones

stimulate mating and differentiation via paracrine and autocrine signaling in

Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 1:366-377.

20. Wang, L., Zhai, B. and Lin, X. 2012. The link between morphotype transition and

virulence in Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 8:e1002765.

21. Wang, L. and Lin, X. 2011. Mechanisms of unisexual mating in Cryptococcus

neoformans. Fungal Genet. Biol. 48:651-660.

22. Wang, L.I., Lin, Y.S., Liu, K.H., Jong, A.Y. and Shen, W. C. 2011. Cryptococcus

neoformans mediator protein Ssn8 negatively regulates diverse physiological

processes and is required for virulence. PLoS One 6:e19162.

23. Wickes, B. L., Mayorga, M.E., Edman, U., and Edman, J. C. 1996. Dimorphism and

haploid fruiting of Cryptococcus neoformans. Proc. USA 91: 12008–12012. Natl.

Acad. Sci. USA 93: 7327–7331.

24. Xue, C., Tada, Y., Dong, X., Heitman, J. 2007. The human fungal pathogen

Cryptococcus can complete its sexual cycle during a pathogenic association with

plants. Cell Host Microbe 1:263-273.

Page 146:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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139

25. Yeh, Y.L., Lin, Y.S., Su, B.J. and Shen, W.C. 2009. A screening for suppressor

mutants reveals components involved in the blue light-inhibited sexual filamentation

in Cryptococcus neoformans. Fungal Genet. Biol. 46:42-54.

26. Yue, C., Cavallo, L.M., Alspaugh, J.A., Wang, P., Cox, G.M., Perfect, J.R., and

Heitman, J. 1999. The STE12alpha homolog is required for haploid filamentation

but largely dispensible for mating and virulence in Cryptococcus neoformans.

Genetics 153:1601-1615.

Page 147:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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鍾嘉綾

現 職

國立臺灣大學植物病理與微生物學系 助理教授

學經歷

1996-2000 國立臺灣大學植物病蟲害學系 學士

1998-2000 國立臺灣大學植物病蟲害學研究所植物病理組 碩士

1998-1999 中央研究院生物醫學研究所 助理

1999-2003 行政院農業委員會動植物防疫檢疫局植物防疫組 技士

2003-2000 行政院農業委員會動植物防疫檢疫局植物防疫組 技正

2009-2000 美國康乃爾大學植物病理與植物微生物生物學系 博士

2010-2000 美國康乃爾大學植物病理與植物微生物生物學系 博士後研究

2010-2000 農委會高雄區農業改良場作物環境課 博士後研究

2011-2000 國立臺灣大學植物病理與微生物學系 助理教授

專 長

真菌病害、分子抗病育種

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臺灣水稻徒長病菌族群之遺傳組成、病原性及抗藥性分析

陳又嘉 1、賴明信 3、林宗俊 3、鍾嘉綾 1,2*、鄭安秀 7、吳信郁 4§、朱盛祺 5§、郭

建志 6§、吳雅芳 7§、林國詞 7§、曾敏南 8§、蔡依真 9§、林駿奇 10§

1國立臺灣大學植物醫學碩士學位學程、2國立臺灣大學植物病理與微生物學系

3農委會農業試驗所、4農委會桃園區農業改良場、5農委會苗栗區農業改良場、6

農委會臺中區農業改良場、7農委會臺南區農業改良場、8農委會高雄區農業改良

場、9農委會花蓮區農業改良場、10農委會臺東區農業改良場

*通訊作者:鍾嘉綾 [email protected] ﹔§同等貢獻

摘 要

水稻徒長病 (Bakanae disease) 是臺灣水稻古老病害之一,近年來似有逐漸流

行的趨勢,其原因可能與田間病原菌族群變異,產生高致病力或具藥劑耐受性的

菌株有關。本研究與農業試驗所及各區農業改良場合作,分析由全臺各地稻種、

稻苗、田間植株上分離所得之水稻徒長病菌菌株。首先以針對 TEF (translation

elongation factor-1 alpha gene) 新設計之專一性引子對 FfTef-F 及 FfTef-R 輔助形

態鑑定,再設計並建立高通量簡單重複性序列 (simple sequence repeats, SSRs) 分

子標誌平臺,結果顯示臺灣水稻徒長病菌族群主要分為 A1、A2、B1 及 B2 四群。

為瞭解其病原性,依據分子分群結果選出代表性菌株,對 8 個水稻品種進行接種,

結果顯示 B2 族群屬於弱病原性菌株,而早期 (1998 及 2000 年) 及近期 (2012

年) 之代表性菌株其病原性並無顯著變化。利用交配型引子對 GFmat1a/1b 與

GFmat2c/2d 進行分析,發現臺灣水稻徒長病菌普遍存在兩種交配型,顯示 F.

fujikuroi 可能以有性生殖增加其族群內遺傳變異性。本研究利用一般常用於稻種

消毒之撲克拉 (prochloraz) 與得克利 (tebuconazole) 對 1998、2000 及 2012 年

共 60 株代表性菌株進行試驗,發現 2012 年整體菌株對撲克拉之耐受性有提升

之現象,顯示病原菌已演化出抗藥性,另外亦檢測出 1 株高度耐撲克拉之菌株及

3 株耐得克利之菌株。本研究之成果,有助於瞭解臺灣田間水稻徒長病菌族群之

演變,相關資訊亦可供未來抗病育種及防治措施擬定之參考。

關鍵詞:Fusarium fujikuroi、分子鑑定、簡單重複序列、族群遺傳、交配型、藥

劑耐受性

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緒 言

稻米為臺灣的主要糧食作物,2011年臺灣農耕地總面積為 808,293 公頃 (3),

其中水稻栽培面積為 254,292 公頃,約占總耕地面積之 31.46 %,水稻每公頃平

均產量為 5,301 公斤 (4),居所有作物之冠。水稻生產過程中易受病蟲為害而減

產,其中由 Fusarium fujikuroi (有性世代為 Gibberella fujikuroi) 所引起的水稻徒長

病 (Bakanae disease),一般農民稱為「稻公」或「馬鹿苗病」,其傳播媒介主要為

種子帶菌成為初次感染源,而土壤殘存則為次要感染源,可感染插秧後的健康種

苗。帶菌之種子,在水稻育苗期間發病常比健康苗高 1/3 以上,病苗纖細瘦弱且

葉片與葉鞘著生角加大,通常於插秧移植後陸續死亡,移植後未死亡之病株,其

病徵會消失,待分蘗期又會產生病徵,植株纖細瘦弱,葉片著生角加大,在其莖

基部產生維管束褐變的現象,嚴重者會腐爛,隨後全株乾枯而死。稻株染病通常

在開花前即死亡,若抽穗後感染,則會造成空穀或穀粒不飽滿的現象 (5)。

水稻徒長病在臺灣已被記載有超過 100 年的歷史 (27),近年來似有逐漸流

行的趨勢,2009 年本病在臺灣各地區水稻田普遍發生,其中又以東部田區發生最

為嚴重 (9)。本病之崛起,除了部分農友之稻種消毒操作問題外,亦可能與田間

病原菌族群變異,產生高致病力或具抗藥性的菌株有關,這也成為臺灣水稻生產

的潛在威脅。欲釐清原因,可透過分子標誌的開發及運用,分析臺灣水稻徒長病

菌之族群組成和遺傳多樣性,再配合代表性菌株之病原性及藥劑耐受性測試,全

面瞭解病原菌之遺傳變異趨勢及風險,並可進一步提供培育抗性或耐性水稻品種

的育種資訊。此外,以分子標誌進行水稻徒長病菌基因型之鑑別,可作為追蹤不

同來源菌株、探討病害感染源的有利工具,期望有助於水稻徒長病之發病生態及

流行病學研究,提供病害管理之重要參考。

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水稻徒長病菌之蒐集、保存及鑑別引子對開發

為瞭解全臺水稻徒長病之發生情形,農委會各區農業改良場於 2012-2013 年共同

執行「水稻病害防疫技術開發與疫情整合管理計畫」,針對各地稻種帶菌率、育苗

場秧苗及田間植株之罹病率進行調查,同時由採集的樣本中分離徒長病菌菌株,

各場並將部分菌株提供本研究使用;本研究亦取得農業試驗所植物病理組所提供,

1996-2002 年及 2011 年在霧峰、潭子及名間等地所採樣之菌株。各菌株進行菌

落形態鑑定後,按照採集地區、水稻品種、採集部位加以分類編號,並以濾紙保

存法 (32) 低溫保存。為能與田間經常分離到的其他 Fusarium 屬菌株如 F.

proliferatum、F. verticillioides、F. oxysporum、F. graminearum 及 F. incarnatum 等

正確區隔 (6, 11, 25),利用美國國家生物技術信息中心 (National center for

biotechnology information) 資料庫,取得上述菌株的轉譯延長因子 (translation

elongation factor 1- ɑ) 序列,進行比對後,成功開發出具鑑別力的專一性引子對

FfTef-F 及 FfTef-R。

水稻徒長病菌之族群遺傳與交配型分析

為分析收集所得之大量菌株,須建立高通量分子標誌系統。2013 年 Jeong 等

人已對 Fusairum fujikuroi B14 菌株進行全基因體解序,本研究利用該菌株之公開

序列資料,共設計 48 對簡單重複性序列 (simple sequence repeat, SSR) 分子標誌,

以來自桃園、苗栗、臺中、臺南、宜蘭以及臺東六縣市之代表性菌株,進行 SSR

多型性 (polymorphism) 測試 及增幅產物定序,據此篩選出 16 對分子標誌,再運

用於全臺各地菌株之族群遺傳分析,結果顯示臺灣之水稻徒長病菌主要分為 A1、

A2、B1、B2 等四群。

F. fujikuroi 為異宗交配型 (heterothallic) (30, 33)。子囊菌之不同交配型

(mating type) 主要由對偶基因 MAT1-1 及 MAT1-2 所支配,MAT1-1 具有高保守

性的 ɑ-domain,而 MAT1-2 則具有高保守性的 HMG (high-mobility-group)

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domain。本研究利用前人開發之交配型分析引子對 GFmat1a/GFmat1b 及

GFmat2c/GFmat2d,分別測試所收集之臺灣水稻徒長病菌,發現兩交配型普遍出

現於各地區及各族群中,顯示在適合之環境條件下,F. fujikuroi 有機會行有性生

殖。

代表菌株之病原性及抗藥性分析

參考所有菌株之 SSR 基因型分群結果及地理分布位置,選擇具代表性之徒

長病菌菌株,對已知抗病、感病及一般商業品種進行病原性測試。接種方法修改

自中興大學植物病理學系陳啟予博士以及臺中農試所賴明信博士之試驗 (8),接

種流程如下:將8個品種之水稻種子先以 60 ℃溫湯消毒10分鐘,經過 3 天催芽,

取已發芽之稻種於代表性菌株之孢子懸浮液 (105 spores/mL) 中浸泡 1 小時後,

栽種於赤玉土中,於 28 oC、RH 90%,12 小時光暗交替的環境下進行生長,待生

長 3 週後觀察記錄罹病程度,最後計算整體罹病指數。罹病程度分為四級:0 級

無病徵;1 級植株高度正常,纖細瘦弱,葉身寬幅較窄;2 級植株徒長,纖細瘦

弱,葉鞘不正常抽長,葉身寬幅較窄;3 級植株基部有菌絲體纏據 (8)。接種結

果顯示,2012 年之代表菌株中,A1、A2 及 B1 族群致病程度較高,而 B2 族

群則相對較低;各菌株對水稻皆有病原性,不同菌株之病原性雖有強弱差異,但

對不同水稻品種之病原性趨勢一致,並未觀察到任何菌株對供測水稻品種有明顯

之生理小種區別。此外,利用臺中地區 1998、2000 及 2012 年之菌株對過去及

現在之水稻主流品種進行病原性試驗,發現早期 (1998 年、2000 年) 與現今 (2012

年) 之菌株對於臺南 11 號、臺南 67 號及臺農 71 號之致病力並無顯著區別。

本實驗利用田間常用於稻種消毒之兩支藥劑-撲克拉 (prochloraz 億度讚,

25% 水基乳劑) 與得克利 (tebuconazole 好秧甲,25.9% 水基乳劑),有效成分別

為 N-propyl-N-[2(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide 及

(RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol,配置

含不同濃度藥劑之 1/2 PDA,測試代表性徒長病菌菌株在不同濃度下之菌落生長

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抑制率,據此計算半有效濃度 (50% effective dose,ED50)。結果顯示,B2 族群對

撲克拉藥劑之耐受性顯著低於 A2 及 B1 族群之耐受性,但其對得克利藥劑之耐

受性則顯著高於 A1、A2 及 B1 族群。比較早期 (1998 & 2000 年) 與近期 (2012

年) 之菌株,可發現其對得克利之耐受性並無顯著差異,然而在撲克拉方面,2012

年之菌株對 1998 & 2000 年之菌株具有顯著較高之耐受性。

結 語

水稻徒長病為全球各水稻產區普遍發生的病害 (28),然而對其病原菌 F.

fujikuroi 之研究,長期以來主要集中於分類地位、病原性確認及二次代謝物如

gibberellin、moniliformin、fumonisin 等之探討 (12, 17, 19-21, 26, 31, 34),近年來

則陸續有學者針對本病之接種方法、病徵等進行深入研究 (7, 10, 22, 23),但至目

前為止,對於水稻徒長病菌之傳播、入侵感染及致病過程仍有許多未知之處,而

有關徒長病菌田間族群的研究則更為有限。過去利用分子標誌探討徒長病菌族群

遺傳多樣性之工作,僅 Carter 等人 (15) 及 Cumagun 等人 (18) 曾分別以 AFLP

及 UP-PCR 技術對美國加州與菲律賓兩個省分之菌株進行研究,但尚未有適用於

F. fujikuroi 族群分析之共顯性遺傳標誌 (codominant markers) 曾被開發及應用,

更未曾有任何研究,進一步探討病原菌族群過去及現在之病原性變化,或是族群

內個別菌株之病原性差異。本研究與農業試驗所及各區農業改良場合作,新開發

專一性鑑定引子對及高通量 SSR 基因型分析平台,對全臺各地菌株進行深入分

析。本研究發現,臺灣徒長病菌族群之遺傳變異及演化可能與有性生殖有關,比

較早期與近期菌株之病原性,則並未發現有高致病性之菌株產生。

對同一病菌長期使用單一藥劑進行防治,容易因高強度之選汰壓力,使族群

中因自然突變而對藥劑較具耐受的菌株被保留下來,且數量越來越多,最後造成

普遍之抗藥性問題。國內稻種消毒最常使用的殺菌劑為咪唑類 (imidazoles) 之撲

克拉與三唑類 (triazoles) 之得克利,兩者都屬於固醇脫甲基抑制劑 (sterol

demethylation inhibitors, DMIs),主要影響子囊菌及擔子菌細胞膜上麥角固醇

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(ergosterol) 生合成途徑中之脫甲基作用 (C-14α-demethylation of

24-methylenedihydrolanosterol) (14)。國內外已有研究報告指出,長期或不當使用

DMIs 類藥劑可導致F. fujikuroi及其他真菌之抗藥性菌株產生 (2, 13, 16, 24, 29)。

本研究使用撲克拉與得克利藥劑對代表性菌株進行試驗,分別對撲克拉與得克利

發現 1 株與 3 株具有較高藥劑濃度耐受性之菌株,而這些菌株皆來自 2012 年

度,再加上 2012 年之菌株整體而言對撲克拉藥劑之耐受度有提升現象,顯示臺

灣的徒長病菌已演化出抗藥性。撲克拉用於稻種消毒已連續使用二、三十年 (2),

菌株對藥劑之耐受性有上升現象,而得克利近年來才開始被普遍推薦使用,故目

前仍十分有效,但已出現耐受性菌株,故在徒長病害之稻種消毒防治上,建議可

選用不同作用機制之藥劑進行篩選試驗,如作用位置為有絲分裂微管蛋白聚合之

免賴得與腐絕,或是具有多重作用之多得淨等(1, 2, 14),增加推薦藥劑之選擇性,

並指導農友避免長期連續使用同類藥劑,以預防特定之抗藥性菌株大量繁殖而造

成防疫問題。

參考文獻

1. 王喻其、王泰權、陳富翔、蔡永勝、李宏萍、費雯綺。2012. 植物保護手冊。

行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所。

2. 朱盛祺、蔣夢心、陳致延。2010。臺東地區水稻徒長病之發病率調查與防治

技術改進。臺東區農業改良場研究彙報(20):57-69。

3. 行政院農業委員會農糧署統計室。2012。臺灣地區耕地面積。行政院農業委

員會農糧署公務統計。

4. 行政院農業委員會農糧署統計室 2012。臺灣地區稻作種植、收穫面積及產量。

行政院農業委員會農糧署公務統計。

5. 張義璋。1975。水稻徒長病。植物保護圖鑑系列 8-水稻保護:256-257。

6. 許晴情。2013。水稻徒長病菌:開發建別性培養基、建立病害評估平台及探

討土壤接種源之角色。國立中興大學植病研究所第四十四屆畢業碩士論文。

7. 許晴情、黃振文、陳啟予。2013。探討在臺灣造成水稻徒長病之病原菌。植

病會刊 22:279-289。

8. 許晴情、賴明信、林宗俊、黃振文、陳啟予。2013。建立水稻對徒長病菌之

抗感性篩檢流程 植病會刊 22:291-299。

9. 黃德昌、朱盛祺。2009。臺灣水稻徒長病之發生與防治。臺灣水稻保護成果

Page 154:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

147

及新展望研討會專刊:15。

10. Amatulli, M., Spadaro, D., Gullino, M., and Garibaldi, A. 2010. Molecular

identification of Fusarium spp. associated with bakanae disease of rice in Italy and

assessment of their pathogenicity. Plant Pathology 59(5):839-844.

11. Amatulli, M., Spadaro, D., Gullino, M., and Garibaldi, A. 2012. Conventional and

real-time PCR for the identification of Fusarium fujikuroi and Fusarium

proliferatum from diseased rice tissues and seeds. European Journal of Plant

Pathology 134(2):401-408.

12. Avalos, J., Cerdá-Olmedo, E., Reyes, F., and Barrero, A. 2007. Gibberellins and

other metabolites of Fusarium fujikuroi and related fungi. Current Organic

Chemistry 11(8):721-737.

13. Becher, R., Hettwer, U., Karlovsky, P., Deising, H. B., and Wirsel, S. G. 2010.

Adaptation of Fusarium graminearum to tebuconazole yielded descendants

diverging for levels of fitness, fungicide resistance, virulence, and mycotoxin

production. Phytopathology 100(5):444-453.

14. Brent, K. and Derek, W. H. 1995. Fungicide resistance in crop pathogens: how can

it be managed?Fungicide Resistence Action Committee Monograph(1).

15. Carter, L., Leslie, J., and Webster, R. 2008. Population structure of Fusarium

fujikuroi from California rice and water grass. Phytopathology 98(9):992-998.

16. Chen, F., Fan, J., Zhou, T., Liu, X., Liu, J., and Schnabel, G. 2012. Baseline

sensitivity of Monilinia fructicola from China to the DMI fungicide SYP-Z048

and analysis of DMI-resistant mutants. Plant Disease 96(3):416-422.

17. Cruz, A., Marín, P., González‐Jaén, M. T., Aguilar, K. G. I., and Cumagun, C. J. R.

2013. Phylogenetic analysis, fumonisin production and pathogenicity of Fusarium

fujikuroi strains isolated from rice in the Philippines. Journal of the Science of

Food and Agriculture 93(12):3032-3039.

18. Cumagun, C. J. R., Arcillas, E., and Gergon, E. 2011. UP-PCR analysis of the seed

borne pathogen Fusarium fujikuroi causing bakanae disease in rice. International

Journal of Agriculture & Biology 13:1029-1032.

19. Desjardins, A., Manandhar, H., Plattner, R., Manandhar, G., Poling, S., and

Maragos, C. 2000. Fusarium species from Nepalese rice and production of

mycotoxins and gibberellic acid by selected species. Applied and Environmental

Microbiology 66(3):1020-1025.

20. Desjardins, A. E., Plattner, R. D., and Nelson, P. E. 1997. Production of Fumonisin

B (inf1) and Moniliformin by Gibberella fujikuroi from Rice from Various

Geographic Areas. Applied and Environmental Microbiology 63(5):1838-1842.

21. Harvey, R. B., Edrington, T. S., Kubena, L. F., Rottinghaus, G. E., Turk, J. R.,

Genovese, K. J., and Nisbet, D. J. 2001. Toxicity of moniliformin from Fusarium

fujikuroi culture material to growing barrows. Journal of Food Protection

Page 155:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

148

64(11):1780-1784.

22. Hsuan, H. M., Salleh, B., and Zakaria, L. 2011. Molecular identification of

Fusarium species in Gibberella fujikuroi species complex from rice, sugarcane and

maize from Peninsular Malaysia. International journal of molecular sciences

12(10):6722-6732.

23. Hwang, I. S., Kang, W.-R., Hwang, D.-J., Bae, S.-C., Yun, S.-H., and Ahn, I.-P.

2013. Evaluation of bakanae disease progression caused by Fusarium fujikuroi in

Oryza sativa L. Journal of Microbiology 51(6):858-865.

24. Kim, S. H., Park, M. R., Kim, Y. C., Lee, S. W., Choi, B. R., Lee, S. W., and Kim,

I. S. 2010. Degradation of prochloraz by rice bakanae disease pathogen Fusarium

fujikuroi with differing sensitivity: a Possible explanation for resistance

mechanism. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry

53(4):433-439.

25. Leslie, J. F., and Summerell, B. A. 2006. The Fusarium laboratory manual.

Blackwell publishing.

26. Matić, S., Spadaro, D., Prelle, A., Gullino, M. L., and Garibaldi, A. 2013. Light

affects fumonisin production in strains of Fusarium fujikuroi, Fusarium

proliferatum, and Fusarium verticillioides isolated from rice. International Journal

of Food Microbiology 166(3):515-523.

27. Ou, S. H. 1984. Rice diseases. 2nd ed. Common wealth Mycological Istitute, Kew,

Surrey England:11.

28. Ou, S. H. 1985. Rice diseases. International Rice Research Institute.

29. Spolti, P., Jorge, B. C. d., and Del Ponte, E. M. 2012. Sensitivity of Fusarium

graminearum causing head blight of wheat in Brazil to tebuconazole and

metconazole fungicides. Tropical Plant Pathology 37(6):419-423.

30. Steenkamp, E. T., Wingfield, B. D., Coutinho, T. A., Zeller, K. A., Wingfield, M. J.,

Marasas, W. F., and Leslie, J. F. 2000. PCR-Based Identification of MAT-1

andMAT-2 in the Gibberella fujikuroi Species Complex. Applied and

Environmental Microbiology 66(10):4378-4382.

31. Suga, H., Kitajima, M., Nagumo, R., Tsukiboshi, T., Uegaki, R., Nakajima, T.,

Kushiro, M., Nakagawa, H., Shimizu, M., and Kageyama, K. 2014. A single

nucleotide polymorphism in the translation elongation factor 1α gene correlates

with the ability to produce fumonisin in Japanese Fusarium fujikuroi. Fungal

Biology 118(4):402-412.

32. Thangavelu, R., Kumar, K. M., Devi, P. G., and Mustaffa, M. M. 2012. Genetic

diversity of Fusarium oxysporum f.sp. cubense isolates (Foc) of India by inter

simple sequence repeats (ISSR) analysis. Molecular Biotechnology 51(3):203-11

33. Watanabe, T., and Umehara, Y. 1977. The perfect state of the causal fungus of

Bakanae disease of rice plants re-collected at Toyama [Japan]. Transactions of the

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

149

Mycological Society of Japan.

34. Wiemann, P., Brown, D. W., Kleigrewe, K., Bok, J. W., Keller, N. P., Humpf, H.

U., and Tudzynski, B. 2010. FfVel1 and FfLae1, components of a velvet‐like

complex in Fusarium fujikuroi, affect differentiation, secondary metabolism and

virulence. Molecular Microbiology 77(4):972-994.

Page 157:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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吳孟玲

現 職

林業試驗所森林保護組 研究員兼組長

學經歷

1994-2000 國立臺灣大學 植物病蟲害學研究所 博士

1994-1999 國立臺灣大學 植物病蟲害學研究所 博士後研究

1999-2000 行政院農業委員會 農業藥物毒物試驗所農藥殘毒組 助理

1999-2009 行政院農業委員會 林業試驗所 森林保護組

-2000-2000助理、助理研究員、副研究員、副研究員兼組長

2009-2000 行政院農業委員會 林業試驗所 森林保護組 研究員兼組長

2010-2000 行政院農業委員會林業試驗所森林保護組「林木疫情鑑定與資

1990-2000 訊中心」暨「樹木醫學中心」管理人

2012-2000 第36屆全國十大傑出農業專家

2013-2000 國際樹藝協會 ( International Society of Arboriculture ) 國際樹

1990-2000 藝師證照 (認證碼ML-0371A)

專 長

植物病蟲害診斷與綜合防治管理、樹病診斷試劑研發、樹醫技術研究、

園藝植物栽培管理、生物技術

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牛樟芝與香杉芝 PCR 鑑別技術建立

Establishment of PCR rapid detection technique for Antrodia

cinnamomea and Antrodia salmonea

Meng-Ling Wu1, Ting-Hsuan Hung

2*, Tang-Long Shen

1, Tun-Tschu Chang

2,

Chao-Han Chen1, Chih-Yun Lee

1

1 Forest Protection Division, Taiwan Forestry Research Institute. 53 Nanhai Rd., Taipei

100, Taiwan. 2

Department of Plant Pathology and Microbiology, National Taiwan University, 1 Sec. 4

Rosfu Rd, Taipei 105, Taiwan.

* Corresponding author: Ting-Hsuan Hung; [email protected]

Abstract

Both Antrodia cinnamomea and A. salmonea belong to the Polyporaceae fungus.

A. cinnamomea, only grown on the inner side of the trunk of Cinnamomum kanehirai

Hayata (Lauraceae), is a precious and medicinal fungus; A. salmonea, causes brown

heart rot disease of Cunninghamia konishii Hayata (Cunninghamieae) in Taiwan. It

was previously difficult to distinguish A. cinnamomea and A. salmonea because of

their morphologically similarity. A. salmonea was commonly used as a counterfeit

substitute for A. cinnamomea and sold by dishonest merchants. In 2004, these two

fungi were first distinguished by pore surface color of basidiomata, host preferences

and mating types. However, accurate identification relies on professional training and

experience. More convenient and persuasive methods are necessary for precise

identification of A. cinnamomea. In this study, we applied six fungal primer pairs in the

PCR assays, and analyzed the sequences of amplified DNA fragments between A.

cinnamomea and A. salmonea. Results showed that one of these primer pairs could

amplify a particular DNA fragment from A. salmonea, approximately 1.4 kb, longer

than that from A. cinnamomea. Based on this 1.4 kb difference sequence, another

primer pair named Acl-F / Acl-R was then designed for specific detection of A.

salmonea. A specific fragment, 219 bp, was yielded only from A. salmonea whereas no

fragment was yielded from A. cinnamomea in the PCR assay. In this study, we

establish a rapid and accurate identification technique for A. cinnamomea and A.

salmonea, which would be helpful in rapid identification for A. salmonea from A.

cinnamomea. Additionally it also saves significant time as the entire procedure only

takes about 5 hours with high sensitivity. This identification method can provide

objective evidence for industry and public institutions.

Key words:Antrodia cinnamomea, Antrodia salmonea, polymerase chain reaction

(PCR)

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Introduction

Cunninghamia konishii Hayata (Cunninghamieae) is a coniferous tree and

endemic to Taiwan, growing in broad-leaved and coniferous forests at altitudes

between 1,300 and 2,800 m in the central and northern parts of the island (1). A brown

heart rot associated with resupinate, salmon-pink basidiomata in the empty rotten trunk

of Cu. konishii has vernacularly been called A. salmonea. This fungus is similar to

Antrodia cinnamomea T. T. Chang & W. N. Chou (2), which bears the vernacular name

A. cinnamomea and has only been collected from the endemic aromatic tree

Cinnamomum kanehirai Hayata (Lauraceae) in Taiwan, but it has a different color on

the pore surface of its basidiomata. The basidiomata of A. cinnamomea have

medicinally been used for treatments of food and drug intoxications, diarrhea,

abdominal pain, hypertension, skin itching, and cancer. Both species have a strong

bitter taste, believed to indicate the presence of effective medicinal ingredients.

Therefore, it is said that A. salmonea can substitute for A. cinnamomea.

In this study, we tested six pairs of primers and found sequence differences

between these two fungi. A rapid and convenient PCR reaction system is established

for examination.

PCR Examination

A. cinnamomea and A. salmonea are morphologically similar and can only be

separated by pore surface color of basidiomata, host preferences and mating systems.

We try to distinguish A. cinnamomea and A. salmonea by PCR test. For the first step, 6

pairs of common primers are used , the PCR results for 5 pairs of primers show no

difference in product sizes between A. cinnamomea and A. salmonea, although the

sequences contain certain variances. Only ML3 and ML4 primers give quite different

results; a 900bp fragment is amplified from A. cinnamomea whereas 2.3kb from A.

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salmonea (Fig. 1). Primer pair Acl-F/ Acl-R test on A. cinnamomea and A. salmonea. A.

salmonea yielded a 219 bp fragment; and no fragment found in A. cinnamomea (Fig.

2).

Sequence Alignment and Phylogenetic Analysis

The 900bp and 2,300bp fragments yielded by ML3/ ML4 of A. cinnamomea and

A. salmonea respectively were also sequenced and analyzed for genetic affiliation.

Sequences of the two fragments were quite similar; the 900bp fragment amplified from

A. cinnamomea matches to the fore and rear ends of the 2,300bp fragment of A.

salmonea (Fig. 3).

Discussion

A. cinnamomea and A. salmonea were first thought to be the same species but different

varieties growing on different hosts that exhibit distinct basidiomata. However distinct

colonies, host preferences and mating systems showed that they are quite different from

each other, thus A. salmonea was distinguished from A. cinnamomea in 2004 (3).

Though both A. cinnamomea and A. salmonea contain some medicinal properties,

economic values differ enormously. And their high similarity in morphology makes it is

hard to distinguish these two fungi by only visual observation so that there are many

products on the market purported to contain A. cinnamomea which are actually made

with A. salmonea. This phenomenon makes accurate identification between A. salmonea

and A. cinnamomea important and necessary. Prior to this study, accurate identification

could only be executed by pore surface color of basidiomata, host preferences and

mating types. However, accurate identification relies on professional training and

experience. To establish a less time-consuming molecular method for accurate

identification, we tested 3 nuclear primer pairs and 3 mitochondrial primer pairs for

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PCR examination. Out of these 6 primer pairs only ML3/ ML4, mitochondrial primers,

yielded distinct PCR fragments. For more precise identification and sequencing, ML3/

ML4 yielded fragments from A. cinnamomea (0.9 kb) and A. salmonea (2.3 kb) were

executed and analyzed showing there is little difference between these two but an extra

insert in A. salmonea. Thus a more specific primer pair, Acl-F/ Acl-R, of A. salmonea

was then designed in this study (4). PCR examination showed only A. salmonea could

yield a 219bp-specific fragment. Though ML3/ ML4 could distinguish these two similar

fungi, Acl-F/ Acl-R primer pair yields a shorter fragment, so that it takes only 1 hour for

identification and there is no need for professional morphology experts to execute which

is an improvement to current techniques for A. cinnamomea and A. salmonea

identification.

References

1. 張東柱. 1997. 牛樟之病害. 牛樟生物學及育林技術研討會論文集. 林業叢刊

第 72 號. 12(3):127-131.

2. Chang, T. T., and Chou, W. N. 1995. Antrodia cinnemomea sp. nov. on

Cinnamomum kanehirai in Taiwan. Mycol Res 99:756-758.

3. Chang, T. T., and Chou, W. N. 2004. Antrodia cinnamomea reconsidered and A.

salmonea sp. nov. on Cunninghamia konishii in Taiwan. Bot Bull Acad Sin 45:

347-352.

4. Hung, T. H., Wu, M. L., and Su, H. J. 1999. Development of a rapid method for

the diagnosis of citrus greening disease using the polymerase chain reaction. J.

Phytopathol. 147: 599-604.

Page 162:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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Figures

Fig. 1 Mitochondrial primer pair ML3/ ML4 PCR test showed significant difference

between A. cinnamomea and A. salmonea. A. cinnamomea yielded a 900 bp fragment;

A. salmonea yielded a fragment with 2,300bp in length. M: 100-ladder marker.

Fig. 2 Specific primer pair Acl-F/ Acl-R PCR test on A. cinnamomea and A. salmonea.

A. salmonea yielded a 219 bp fragment; and no fragment found in A. cinnamomea. M:

100-ladder marker.

M

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Fig. 3 PCR product of Antrodia cinnamomea and A. salmonea amplified by ML3 and

ML4 primers. The 900bp fragment matchs to the fore and rear ends of the 2,300bp

fragment respectively.

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157

劉俊揚

現職

國家衛生研究院細胞及系統醫學研究所 副研究員

學經歷

1987-1991 國立臺灣大學植病系 學士

1992-1996 國立臺灣大學植病所 博士

1998-1999 中央研究院生物醫學研究所 博士後研究員

1999-2000 美國德州大學休士頓分校醫學院內科 博士後研究員

2000-2002 中央研究院生物醫學研究所 博士後研究員

2002-2004 美國德州大學休士頓分校醫學院內科 資深研究員

2004-2005 美國德州大學休士頓分校醫學院內科 講師

2005-2007 美國德州大學休士頓分校醫學院內科 助理教授

2007-2008 國家衛生研究院 心血管及血液醫學研究中心 助研究員

2008-2010 國家衛生研究院 細胞及系統醫學研究所 助研究員

2010-2000 國家衛生研究院 細胞及系統醫學研究所 副研究員

2012-2000 中國醫藥大學基礎醫學研究所 合聘副教授

2012-2000 國立中興大學生物科技發展中心 合聘副教授

2014-2000 國家衛生研究院 學務辦公室 主任

專 長

細胞分子生物學、癌細胞生物學、幹細胞生物學、心血管生物學、訊息傳

遞、基因調控、基因治療

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蟲草素在轉譯醫學上之應用

劉俊揚

國家衛生研究院 細胞及系統醫學研究所

通訊作者:劉俊揚 [email protected]

摘 要

冬蟲夏草為一珍貴之中藥材,其組成為蟲草屬之冬蟲夏草菌寄生於蝠蛾幼蟲

之複合體,長期以來被認為具有調節免疫力、抗老化及抗癌等功能。在冬蟲夏草

的主要成分中,蟲草素被發現具有抑制癌細胞生長的功能,然而其詳細的抗癌機

轉則仍未明瞭。我們的研究團隊利用肝細胞癌及白血病兩種細胞做為模式,探討

蟲草素在轉譯醫學上應用的可能性及其作用的分子機轉。我們的研究結果顯示,

蟲草素可透過調控肝癌細胞中 E-cadherin 及 integrins 的表現,進而降低 focal

adhesion kinase 之磷酸化,並減少肝癌細胞之上皮間葉轉移與遷移能力,而對肝

癌腫瘤特性之深入影響則有待進一步的研究。此外我們亦發現蟲草素除了可抑制

多數的癌細胞生長外,對白血病細胞之生長亦有顯著的效果。我們進一步探討蟲

草素影響白血病細胞生長之訊息傳遞途徑,結果發現蟲草素具選擇性地影響白血

病細胞中之 GSK-3β/β-catenin 訊息途徑,進而抑制白血病細胞之生長,並可能影

響白血病幹細胞或前驅細胞之幹細胞特性與更新能力,因此結合蟲草素與其他治

療藥物或方式具有根除或減緩白血病復發之應用潛力。

關鍵詞:冬蟲夏草、蟲草素、白血病、肝細胞癌、細胞生長、上皮間葉轉移、細

胞遷移、β-catenin、integrin、focal adhesion kinase

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

159

緒 言

蟲草素(cordycepin, 3-deoxyadenosine) 是冬蟲夏草萃取物中的主要成份之一,

其為腺甘酸(adenosine)結構相似之衍生物。蟲草素被報導可誘導多種癌細胞之細

胞凋亡或抑制癌細胞之生長能力(1-13),因此被認為是具有一種具應用潛力之天然

抑癌物質。雖然已知蟲草素具有抗癌細胞生長之活性,然而其深入的分子機轉及

在臨床或轉譯醫學上的應用仍未被詳細的報導。我們近期的研究證實蟲草素可透

過影響 E-cadherin、integrins 的表現及 focal adhesion kinase (FAK)之磷酸化,進而

抑 制 肝 細 胞 癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 細 胞 的 上 皮 間 葉 轉 移

(epithelial-mesenchymal transition)及細胞遷移(migration)能力(14)。此外我們另一個

研究結果顯示蟲草素亦可藉由調控 GSK-3β 活性來增加 β-catenin 的蛋白水解,進

一步抑制白血病(leukemia) 細胞的生長,並可能影響白血病幹細胞或前驅細胞之

活性與更新(15)。因此利用蟲草素搭配以其他現有的治療方式或藥物,具有改善

肝癌治療方式及減緩白血病復發之應用潛力。

結果與討論

一、蟲草素抑制肝癌細胞生長、上皮間葉轉移及遷移能力

臺灣為肝癌盛行的區域之一,因此探討肝癌的生成、預防與治療具有相當之

重要性。肝細胞癌(HCC)為肝癌中之最主要種類,本實驗室近年來致力於研究肝

細胞癌生成與進程的分子訊息途徑,我們的研究證實 14-3-3 及 FAK 等分子為影

響肝細胞癌腫瘤進程的重要因子(16-23)。我們近一步研究蟲草素是否對肝癌等不

同種類癌細胞具有抑制效果,並探討其可能的機制,期能將所獲得之訊息做為在

臨床及轉譯醫學上應用之基礎。首先我們利用不同濃度之蟲草素處理肝細胞癌細

胞,並檢測其細胞生長與遷移能力,結果發現蟲草素可隨濃度增加而抑制癌細胞

之生長與遷移能力(14)。進一步利用蛋白質電泳分析蟲草素對癌細胞可能影響之

分子機轉,結果發現蟲草素可有效的增加 E-cadherin 的表現,此結果顯示蟲草素

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

160

具有減緩癌細胞上皮間葉轉移之能力(14)。另以蟲草素處理肝細胞癌細胞會減少

細胞中 integrins 的表現及 FAK 在 Tyr-397 位置的磷酸化,顯示蟲草素可能透過減

少 integrins的生成來抑制FAK之活性與功能,進而抑制了癌細胞的遷移能力(14)。

我們的研究結果顯示蟲草素可能透過減緩細胞上皮間葉轉移、遷移及抑制肝癌細

胞生長,因此推論蟲草素可能具有減緩肝癌腫瘤生長及轉移的能力,然而其實際

效果則仍有待進一步的研究予以證實。

二、蟲草素對白血病細胞之影響

白血病亦稱血癌,其成因為造血細胞發生不正常之增生性病變,導致產生大量不

成熟且不具功能之血液細胞,進而影響正常血液細胞的數量與功能。大部份的白

血病可區分為骨髓型與淋巴型兩大類,依其發生的急迫性又可分為急性與慢性兩

大類。其中慢性骨髓型白血病好發於成人,主要是因為染色體融合造成之變異所

造成,雖然目前藥物可有效的控制病情,然而當前主要的問題是容易產生抗藥復

發性之慢性骨髓型白血病(chronic myeloid leukemia, CML)。急性骨髓型白血病

(acute myeloid leukemia, AML)成因則較多元,目前雖有多種方法可治療,但控制

情況尚不如慢性骨髓型白血病有效。β-catenin 為細胞內一個重要的轉錄調控因子,

主要可影響細胞生長,分化(differentiation),更新(renewal),存活(survival)與遷移

等功能。β-catenin 除了被證實在多種癌細胞的表現量會顯著增加之外,近年在白

血病中亦被廣泛認為是骨髓型白血病幹細胞(leukemic stem cells, LSCs)與前驅細

胞(progenitor cells)中維持幹細胞特性(stemness)與更新的重要因子(24-28),且

β-catenin 之過量表現被證實與白血病之預後(prognosis)有顯著關聯(29),因此近年

來認為發展有效之β-catenin抑制物治療策略搭配既有治療方式具有減緩白血病復

發之應用潛力。我們先前的研究目標主要針對蟲草素是否會影響癌細胞中

β-catenin 的表現,結果發現雖然蟲草素可抑制所有癌細胞(肺癌、肝癌、乳癌、急

性與慢性骨髓型白血病)之生長,但蟲草素具選擇性的抑制白血病細胞中 β-catenin

之表現,對其他癌細胞之 β-catenin 表現則沒有顯著地影響(15)。且蟲草素對白血

病之 β-catenin 抑制效果是透過調控 GSK-3β 之訊息途徑,進而減少 β-catenin 之

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

161

蛋白質穩定性、增加 β-catenin 之蛋白質水解,進而減少 β-catenin 在細胞中之表

現量、細胞質核間轉移及其活性。我們亦證實蟲草素調控 GSK-3β/β-catenin 之訊

息途徑是透過抑制 PI3K/Akt 所造成,且蟲草素會減緩白血病細胞中 wnt 訊息途徑

所活化之細胞功能,並減緩其誘導 β-catenin 表現之能力(15)。除此之外,蟲草素

亦可有效的減少白血病之細胞群落生成(15),在白血病小鼠動物實驗中亦初步證

實可有效的增加白血病小鼠之存活率。因此應用蟲草素來抑制 β-catenin 及相關之

癌化因子相信對白血病的輔助治療具有價值性的助益。

結 語

利用微生物、植物及中藥材之次級代謝產物做為新穎藥物之來源,已成為近來開

發新型藥物的趨勢之一,其中的優點包括在生物毒性上具有較高的安全性。冬蟲

夏草萃取物除了被認為具有成為藥物之潛力之外,亦可廣泛的應用在健康食品上。

近年來由於市場需求而過度採集冬蟲夏草,使得自然採得的蟲草數目銳減,亦間

接導致冬蟲夏草的價格大幅提高,因此考量利用其它替代方式生產冬蟲夏草之有

效成份已成為當前研究的一大課題。蟲草素除了可從冬蟲夏草中萃取之外,在北

蟲草及其它幾種蟲草中含量亦豐富,另也能以菌種醱酵或化學合成等方式生產。

然而目前蟲草素的應用瓶頸之一是蟲草素在動物體內容易被分解,進而進入尿酸

的代謝途徑,因此在蟲草素的應用上,除了探討其在臨床上的實用性外,如何增

加蟲草素的穩定性與效果可能為目前一個值得研究的方向。此外蟲草素可活化腺

甘酸受體,進而影響心律等各種生理功能,因此不適當或過量使用蟲草素可能引

起其它副作用,在實際應用前需再深入評估其運用方式。然而若能深入瞭解蟲草

素之作用機轉後,搭配以穩定且適量之蟲草素與其他治療藥物或方式結合,將可

作為改善治療肝癌或白血病等疾病的一大利器。

參考文獻

1. Wu WC, Hsiao JR, Lian YY, Lin CY, Huang BM. 2007. The apoptotic effect of

Page 169:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

162

cordycepin on human OEC-M1 oral cancer cell line. Cancer Chemother

Pharmacol 60:103-111.

2. Lee EJ, Kim WJ, Moon SK. 2010. Cordycepin suppresses TNF-alpha-induced

invasion, migration and matrix metalloproteinase-9 expression in human bladder

cancer cells. Phytother Res 24:1755-1761.

3. Chen Y, Chen YC, Lin YT, Huang SH, Wang SM. 2010. Cordycepin induces

apoptosis of CGTH W-2 thyroid carcinoma cells through the

calcium-calpain-caspase 7-PARP pathway. J Agric Food Chem 58:11645-11652.

4. Lee HJ, Burger P, Vogel M, Friese K, Brüning A. 2012. The nucleoside

antagonist cordycepin causes DNA double strand breaks in breast cancer cells.

Invest New Drugs 30:1917-1925.

5. Chen LS, Stellrecht CM, Gandhi V. 2008. RNA-directed agent, cordycepin,

induces cell death in multiple myeloma cells. Br J Haematol 140:682-391.

6. Matsuda H, Akaki J, Nakamura S, Okazaki Y, Kojima H, et al. 2009.

Apoptosis-inducing effects of sterols from the dried powder of cultured mycelium

of Cordyceps sinensis. Chem Pharm Bull (Tokyo) 57:411-414.

7. Jeong JW, Jin CY, Park C, Hong SH, Kim GY, et al. 2011. Induction of apoptosis

by cordycepin via reactive oxygen species generation in human leukemia cells.

Toxicol In Vitro 25:817-824.

8. Kodama EN, McCaffrey RP, Yusa K, Mitsuya H. 2000. Antileukemic activity and

mechanism of action of cordycepin against terminal deoxynucleotidyl

transferase-positive (TdT+) leukemic cells. Biochem Pharmacol 59:273-281.

9. Thomadaki H, Tsiapalis CM, Scorilas A. 2008. The effect of the polyadenylation

inhibitor cordycepin on human Molt-4 and Daudi leukaemia and lymphoma cell

lines. Cancer Chemother Pharmacol 61:703-711.

10. Jen CY, Lin CY, Huang BM, Leu SF. 2011. Cordycepin Induced MA-10 Mouse

Leydig Tumor Cell Apoptosis through Caspase-9 Pathway. Evid Based

Complement Alternat Med 2011:984537.

11. Yoshikawa N, Kunitomo M, Kagota S, Shinozuka K, Nakamura K. 2009.

Inhibitory effect of cordycepin on hematogenic metastasis of B16-F1 mouse

melanoma cells accelerated by adenosine-5'-diphosphate. Anticancer Res

29:3857-3860.

12. Yoshikawa N, Yamada S, Takeuchi C, Kagota S, Shinozuka K, et al. 2008.

Cordycepin (3'-deoxyadenosine) inhibits the growth of B16-BL6 mouse

melanoma cells through the stimulation of adenosine A3 receptor followed by

glycogen synthase kinase-3beta activation and cyclin D1 suppression. Naunyn

Schmiedebergs Arch Pharmacol 377:591-595.

13. Nakamura K, Yoshikawa N, Yamaguchi Y, Kagota S, Shinozuka K, et al. 2006.

Antitumor effect of cordycepin (3'-deoxyadenosine) on mouse melanoma and

Page 170:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

163

lung carcinoma cells involves adenosine A3 receptor stimulation. Anticancer Res

26:43-47.

14. Yao WL, Ko BS, Liu TA, Liang SM, Liu CC, et al. 2014. Cordycepin suppresses

integrin/FAK signaling and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular

carcinoma. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 14:29-34.

15. Ko BS, Lu YJ, Yao WL, Liu TA, Tzean SS, et al. 2013. Cordycepin regulates

GSK-3β/β-catenin signaling in human leukemia cells. PLoS ONE. 8:e76320.

16. Jan YJ, Ko BS, Hsu C, Chen SC, Chang TC, et al. 2009. Overexpressed focal

adhesion kinase predicts a higher incidence of extrahepatic metastasis and worse

survival in hepatocellular carcinoma. Human Pathology. 40:1384-1390.

17. Ko BS, Lai IR, Chang TC, Liu TA, Chen SC, et al. 2011. Involvement of 14-3-3γ

overexpression in extrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma. Human

Pathology. 42:129-135.

18. Ko BS, Chang TC, Hsu C, Chen YC, Shen TL, et al. 2011. Overexpression of

14-3-3ε predicts tumor metastasis and poor survival in hepatocellular carcinoma.

Histopathology. 58:705-711.

19. Liu TA, Jan YJ, Ko BS, Chen SC, Liang SM, et al. 2011. Increased expression of

14-3-3β promotes tumor progression and predicts extrahepatic metastasis and

worse survival in hepatocellular carcinoma. American Journal of Pathology.

179:2698-2708.

20. Jan YJ, Ko BS, Liu TA, Wu YM, Liang SM, et al. 2013. Expression of Par-3 for

predicting extrahepatic metastasis and survival with hepatocellular carcinoma.

International Journal of Molecular Sciences. 14:1684-1697.

21. Liu TA, Jan YJ, Ko BS, Liang SM, Chen SC, et al. 2013. 14-3-3ε overexpression

contributes to epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma.

PLoS ONE. 8:e57968.

22. Ko BS, Jan YJ, Chang TC, Liang SM, Chen SC, et al. 2013. Upregulation of focal

adhesion kinase by 14-3-3ε via NFκB activation in hepatocellular carcinoma.

Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 13:555-562.

23. Liu CC, Jan YJ, Ko BS, Wu YM, Liang SM, et al. 2014. 14-3-3σ induces heat

shock protein 70 expression in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 14:425.

24. Wang Y, Krivtsov AV, Sinha AU, North TE, Goessling W, et al. 2010. The

Wnt/beta-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells

in AML. Science 327:1650-1653.

25. Eaves CJ, Humphries RK. 2010. Acute myeloid leukemia and the Wnt pathway.

N Engl J Med 362:2326-2327.

26. Hu Y, Chen Y, Douglas L, Li S. 2009. beta-Catenin is essential for survival of

leukemic stem cells insensitive to kinase inhibition in mice with

Page 171:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

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林乃君

現 職

國立臺灣大學農業化學系 副教授

學經歷

2004-2000 美國康乃爾大學植物病理與植物微生物生物學系博士

2005-2013 國立臺灣大學農業化學系 助理教授

2013-2000 國立臺灣大學農業化學系 副教授

專 長

植物與微生物交互作用、微生物生理學、分子生物學

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利用木黴菌搭配拮抗細菌防治草苺萎凋病之效果評估

莊雅惠 1、鐘珮哲 2、鍾仁賜 3、林乃君 1, 3*

1 國立臺灣大學植物醫學碩士學位學程

2 行政院農業委員會苗栗農業改良場

3 國立臺灣大學農業化學系

* 通訊作者:林乃君 [email protected]

摘 要

草苺 (Fragaria x ananassa Duch.) 在臺灣屬於高經濟價值果樹之一,然而於

民國 99 年開始陸續在苗栗縣草苺栽培區發現由草苺尖鐮孢菌 (Fusarium

oxysporum f. sp. fragariae) 所引起的草苺萎凋病,造成草苺苗產量嚴重損失。本研

究之目的為發展草苺尖鐮孢菌的防治方法,遂利用苗栗農業改良場先前所分離、

對數種草苺病害具防治效果之木黴菌,搭配自金門及桃園農業改良場有機栽培土

壤中篩選出具有拮抗病原菌能力、可能可促進植物生長特性且不具常用藥劑感受

性之土壤分離菌株,應用於草苺萎凋病之管理上,並評估其維護植株健康狀態之

能力。結果顯示,自桃園農業改良場有機栽培土壤中篩選出之 Bacillus spp. 595,

於盆栽試驗中能夠有效控制病害發生率,且在短期內可促進植株生長;然而在田

間試驗時不論是每週或隔週澆灌,木黴菌搭配拮抗細菌的混合處理組,均較單獨

處理時有較好的病害控制和促進植株生長之效果。由於本研究直接於草苺產業的

重要產區進行田間試驗,其試驗結果具有產業應用價值;然而試驗期短,未來仍

需繼續進行長年施用後的效果評估試驗,以提供草苺栽種農民更有用之資訊。

關鍵詞:草苺、草苺尖鐮胞菌、木黴菌、土壤分離菌株、病害防治

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緒 言

草苺 (Fragaria x ananassa Duch.) 為薔薇科草苺屬之多年生草本植物,在臺

灣屬於高經濟價值水果之一。根據農業統計年報顯示,民國 102 年臺灣之草苺年

產量達 8,732 公噸,種植總面積達 535 公頃,而主要產區包括新竹縣、苗栗縣以

及南投縣,其中以苗栗縣為草苺重要產區,該區產量約佔年產量的 94%。由於草

苺屬於非後熟型 (non-climacteric fruit) 水果,加上其病蟲草害種類相當多,使得

儲架壽命短、農藥噴施時期長且施用量高,成為草苺栽培時的主要問題。近年為

了維護消費者食用安全以及農業生產者能夠維護並永續經營農業生產環境,生產

上逐漸以「減少農藥與化學肥料施用量」為目標,因此,草苺其實相當適合作為

有害生物整合管理 (integrated pest management) 的模式作物。

草苺栽培期會遭遇到之常見病蟲害包括斜紋夜蛾、薊馬、二點葉蟎、葉芽線

蟲、青枯病、炭疽病、白粉病、果腐病及灰黴病等,其中,長達半年之育苗期階

段以造成植株萎凋之病原菌為主。根據文獻記載,造成草苺植株萎凋之病原菌有

炭疽病菌 (Collectotrichum spp.)、疫病菌 (Phytophthora spp.)、腐黴菌 (Pythium

helicoides) 以及鐮孢菌 (Fusarium solani, F. oxysporum) (3)。其中,由草苺尖鐮孢

菌 (Fusarium oxysporum f. sp. fragariae) 所造成的萎凋病 (Fusarium wilt) 於民國

99 年,才開始在苗栗縣草苺栽培地區陸續出現,近年來已成為草苺育苗期的隱憂

之一。草苺尖鐮孢菌為土媒性病原菌,可直接入侵植株根部或由帶病原之母株透

過走蔓傳播至子株,病原菌沿維管束向上蔓衍,造成自下位葉開始往上顯現葉脈

透化、葉片黃化與壞疽病徵。初期可見半側萎凋 (維管束堵塞),造成葉片呈現大

小葉現象,後期則全株枯死,罹病株之根、莖部維管束褐化或壞死,為判斷本病

害之主要病徵 (3)。

針對草苺尖鐮孢菌由根部入侵後,其小孢子會隨著走蔓進行系統性傳播 (6),

其田間防治之策略可分為三個方向進行:一、透過具病原拮抗能力以及促進植株

生長能力之微生物製劑開發、試驗和配方施用,以降低尖鐮孢菌和草苺根部接觸、

入侵的機會,達到保護育苗期植株健康的目標;二、降低病原菌定殖 (colonization)

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成功的機率:Fang 等人 (2012) 指出,草苺尖鐮孢菌入侵植株後在不同草苺品種

之組織中定殖情況不一,因此,可以針對臺灣既有草苺品種對於草苺尖鐮孢菌定

殖情形進行評估,篩選出較為抗病的品種;三、降低病害進展程度:由於目前對

於草苺尖鐮孢菌經由走蔓傳播的速度及傳播條件之相關研究不多,因此若有更進

一步的瞭解,便可藉由建議農民切斷走蔓及留株時機,減少病株在田間殘留的機

會,便可降低病害進展速度。目前除了傳統上採取淹水或是與水稻輪作等耕作防

治策略之外 (3),國外研究亦指出可藉由篩選抗病品種 (9) 或是使用拮抗微生物

等來抑制草苺萎凋病的發生與嚴重度 (1,8)。

微生物在土壤中所扮演的角色和功能相當多元,不僅是生產者,也是分解者,

能夠讓自然界的元素循環生生不息;微生物在土壤中的活性常能顯著影響土壤特

性,如改變土壤酸鹼值、分泌代謝物質促進植物生長或是做為植物病害之生物防

治手段 (2)。土壤微生物的運用歷史悠久,應用層面也相當廣泛,以土壤分離菌

株之功能性可分為:固氮菌、溶磷菌、溶鉀菌及分解矽酸鹽類礦物之細菌、促進

植物生長之根棲細菌、菌根真菌以及各種植物病原菌等。依照其應用層面又可分

為:生物性肥料、土壤改良菌劑、生物防治菌、環境汙染指標菌種、環境汙染分

解菌種以及在工業或醫藥等方面的應用菌種 (2)。其中,在農業環境的應用,最

直接相關的為生物性肥料以及生物防治菌。隨著農業生產方式的改變,如何避免

過度施用肥料或農藥以降低農業生產環境的負荷、農業生產者的耕作成本以及提

高生產者與消費者的食用安全,已變成相當重要的課題,而生物性肥料以及生物

防治菌的應用在這樣的需求下便應運而生。

生物性肥料 (biofertilizer) 或稱為微生物肥料,行政院農業委員會將之定義

為「含具有活性微生物或休眠孢子,如細菌 (含放線菌類 )、真菌及藻類等

及其代謝產物的特定製劑,應用於作物生產具供應植物養分的效果,包括

增進植物養分和元素之供應量與總量,或刺激植物生長,或促進植物對營

養和元素之吸收」。生物防治菌或稱微生物農藥,在近期發展中相當活躍,

被認為是綠色農業有害生物管理上,不可或缺的組成分,最為有名的應用實例

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為殺蟲劑蘇力菌 (Bacillus thuringiensis)。在應用層面上,大多研究都以單

一菌株的測試為主,鮮少有混用不同菌株的試驗設計,而篩選出兼具生物

性肥料與生物防治菌的相關研究也不多 (7)。已有許多研究結果指出,使用拮

抗微生物應可有效抑制土媒病害的發生與嚴重度 (1,5,7,10)。近年來更有研究指出,

若能藉由妥善的土壤管理方式來提高土壤品質及健康,便能有效控制土壤傳播病

原菌的族群數量。其中,土壤生物為影響土壤品質及產量的主要因子之一,健康

土壤的指標即為其中微生物的數量及種類多寡,且有更多有益微生物的存在及較

少的病原菌 (4)。如何提升根圈環境的健康狀態,應是未來在發展有害生物整合

管理策略以防治土壤傳播病原菌時考慮的重點課題。本研究以發展出更能符合長

遠及永續經營農業的理念之防治策略為終極目標,希望能從改善土壤品質的角度

來進行草苺萎凋病的防治。因此我們首先評估混用多種具生物肥料或生物防治菌

潛力的菌株,是否比單一施用拮抗菌時有更好的效果。本研究即利用之前篩選出

具拮抗多種草苺病原菌之木黴菌搭配能拮抗草苺尖鐮孢菌之土壤微生物,希冀能

提高土壤中有益微生物的存在,而在草苺萎凋病的防治上達到事半功倍之成效。

材料與方法

一、草苺植株與微生物菌株

試驗中所使用之草苺品種為苗栗地區最大宗栽培品種「桃園一號」 (或稱「豐

香」)。以健康草苺植株為母株,將其無性繁衍出之走莖 (stolon),固定於滅完菌

之介質中,培養三星期後進行試驗。試驗地點為苗栗農業改良場網室內之離土床

架。使用之拮抗微生物包括由苗栗地區所分離到之木黴菌 (Trichoderma spp.) ML1

和 ML56,以及本研究中所分離到之拮抗菌 Bacillus spp. 376 和 595。草苺尖鐮

孢菌則是使用民國101年在草苺苗病株冠部組織上分離到的Fusarium oxysporum f.

sp. fragariae ML369。

二、促進植物生長根棲細菌之分離及其特性分析

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本研究自桃園區農業改良場、臺灣大學農場、苗栗及金門等地農田土壤中分

離出土壤微生物,然後進行特性分析,分析的項目包括:一、是否對草苺尖鐮孢

菌 (F. o. f. sp. fragariae ML369) 和炭疽病菌 (Colletotrichum acutatum 和

Colletotrichum gloeosporioides) 具有拮抗能力;二、是否對具有生物防治潛力的

Trichoderma asperellum ML1 及 Trichoderma sp. ML56 有拮抗作用;三、是否對於

草苺田間常用藥劑—待克利 (difenoconazole) 具感受性;四、是否具有可能可促

進植物生長的特性,如產生吲哚乙酸 (indole-3-acetic acid, IAA) 的能力及溶磷或

溶鉀的能力等。

三、苗栗農業改良場網室盆栽試驗設計

為了瞭解篩選出來的菌種對於草苺萎凋病是否有降低其危害的效果,首先於

苗栗區農業改良場網室進行盆栽試驗。試驗環境為網室內的離土床架,此盆栽試

驗共分為十四組,如表一 (Table 1) 所示,每一組四盆,每週澆灌待測試之土壤

分離菌株一次,共施用三次。

四、苗栗縣大湖鄉觀光草苺園田間試驗設計

本試驗進行五種處理,分別進行每週及隔週澆灌處理,合計十組,如表二

(Table 2) 所示。試驗設計採用隨機完全區集設計 (randomized complete block

design, RCBD),每一處理組共三個植床 (長 150 公分、寬 20 公分、深 25 公分),

作為三重複,每一重複中栽種植株約 10 株,每週同樣記錄草苺萎凋病發病率、

第三成熟葉之葉綠素含量 (SPAD index) 以及補植率 (replanting rate, %)。

五、草苺萎凋病病害評估

於網室盆栽試驗及田間試驗中,均分別記錄發病率 (incidence, %) 和萎凋比

例 (wilting ratio, %)。根據觀察到的病徵形態,即新生幼葉為大小葉且葉色較不均

勻的症狀做為判斷依據。將各處理組內植株區分為病株及健康株兩類,計算方式

為病株數除以該處理組植株總數,再乘以 100%,以計得各組內發病率。此外,

記錄各處理組內出現萎凋狀況的植株數量,將萎凋數量除以各處理組內植株總數,

再乘以 100%即為該組之萎凋比例。

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六、草苺植株生長指標之分析

本研究以第三成熟葉之葉寬和葉綠素含量 SPAD 讀值,作為草苺植株生長指

標依據。各處理組中,以尺量測每一株第三成熟葉中間小葉的葉寬,即得第三成

熟葉之葉寬 (width,或稱為葉幅 )。同時以 SPAD-502 Chlorophyll meter

(Spectrum Technologies, Inc., Aurora, IL) 進行該葉片之葉綠素含量測定,每一處理

組內隨機選定三株,量測第三成熟葉片 SPAD 值,每葉片共測三次,以其平均值

表示。

結果與討論

一、土壤分離菌株之特性分析及鑑定

將所有土壤分離菌株先經過吲哚乙酸合成能力測試、溶磷能力測試、溶鉀能

力測試之後,挑選出只具有吲哚乙酸合成能力的 595、376 和 iii6F,同時具有吲

哚乙酸合成能力和溶磷能力的菌株 i4A、i5C、i5D 和 i6E,以及兼具吲哚乙酸合

成能力、溶磷能力和溶鉀能力的 ii6B,接著進行草苺尖鐮孢菌以及炭疽病菌之拮

抗測試,具有病原拮抗能力的有 595、376、i4A 和 i5D,篩出此四株進行小白菜

促進植物生長試驗,其中 i5D 表現並不理想,因此,挑選土壤分離菌株 595、376、

i4A 和 ii6B 進行後續實驗。由於田間試驗中,菌株必須面臨常用藥劑的考驗,

因此,進行稀釋 3,000 倍待克利之敏感性測試,其結果顯示,土壤分離菌株 376

可在稀釋 3,000 倍待克利培養基上存活;此外,由於後續會以混用菌株的方式進

行病害防治效果評估,因此,也將土壤分離菌株 Bacillus sp. 595 和 376 與苗栗

農業改良場開發之木黴菌進行對峙培養,結果顯示此二菌皆不拮抗木黴菌

Trichoderma asperellum ML1,而對於 Trichoderma sp. ML56 僅在菌落邊緣產生些

微抑制環,因此,最終挑定土壤分離菌株 595 和 376 進行後續試驗 (表三)。

二、網室盆栽試驗中,土壤分離菌株處理對草苺植株病害控制之影響

不同土壤分離菌株及其組合,對被澆灌接種草苺尖鐮孢菌之健康幼苗試驗進

行之結果顯示,每週澆灌 Bacillus sp. 376,四週後仍能最有效達到保護幼苗和抑

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制病害發生的效果;反之,單獨處理 Trichoderma sp. ML56 及處理 Trichoderma sp.

ML1 搭配 Bacillus sp. 376 及 595 這兩組的發病率卻在第四週有增加的情形出現。

雖有出現大小葉的病徵,但植株萎凋率在處理後第一週皆為 0%;四周後,

Trichoderma sp. ML1 無論是搭配 Bacillus sp. 376 或是 Bacillus sp. 595,其植株萎

凋率皆較單獨處理組有下降的情形 (表四)。

三、田間試驗中,土壤分離菌株處理對草苺植株病害控制之影響

1. 每週澆灌對發病率之影響

試驗期間混合木黴菌及枯草桿菌的組別幾乎都有出現降低發病率的效果,但

在混合菌株 Bacillus spp. 376+ 595 + Trichoderma sp. ML56 處理下,於試驗期間均

能將發病率控制在對照組之下。表中標有星號 (*) 的日期表示當天有進行土壤分

離菌株澆灌處理,因此,可以發現,停止施用土壤分離菌株後三周,各組的發病

率也都還能控制在低於控制組;其中,同樣是以 Bacillus spp. 376+ 595 +

Trichoderma sp. ML56 組的病害控制效果以及持續性較好 (表五)。

2. 隔週澆灌對發病率之影響

隔週澆灌土壤分離菌株對於發病率的評估結果如表六所示。整體而言,隔週

澆灌處理仍具有控制草苺萎凋病發病的效果。且與每週澆灌相似,均是在同時處

理木黴菌及枯草桿菌時有最佳的效果,且此效果在停指澆灌後,仍能持續一段時

間。不過此試驗的觀察時間較短,故未能得知停止澆灌後,土壤分離菌株的控制

病害效果能持續多長的時間。

綜合比較每週澆灌與隔週澆灌土壤分離菌株病害控制效果,雖然隔週澆灌時,

各處理組在試驗階段內的發病率變化幅度比較大,但兩種澆灌頻率均能有效控制

病害。

四、網室盆栽試驗中,土壤分離菌株處理對促進草苺植株的生長效果之影響

由處理組間各植株的葉綠素含量來看,第二週便可以觀察到處理組與控制組

之間出現差異,其中僅澆灌 Bacillus sp. 376 或 Trichoderma sp. ML56 的組別,及

Bacillus sp. 376 加上 Trichoderma sp. ML56 的組別,雖然跟未接種病原菌的 RM

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及 CK 組無差異,但與接種病原菌的 PI 組則有顯著差異。在連續澆灌三週的條

件下,僅澆灌 Bacillus sp. 376 或是 Bacillus sp. 376+595 再加上 Trichoderma

asperellum ML1 的混合菌處理組,其植株的葉綠素含量均較控制組高,顯示土壤

分離菌株對於草苺植株的生長狀況確實有所助益 (表七)。此外,進行土壤分離菌

株澆灌處理以及定量病原接種後,於第三及第四周後各組別之第三成熟葉葉寬於

統計上均與控制組無差異。

五、田間試驗中,土壤分離菌株處理對促進草苺植株的生長效果之影響

田間試驗中,土壤分離菌株處理對促進草苺植株的生長效果之結果如表八所

示。每週澆灌土壤分離菌,對於各組間植株第三成熟葉之葉綠素含量並無任何影

響。在隔週澆灌的試驗當中,除了在第二次土壤澆灌後隔週,出現了處理 Bacillus

sp. 595 後葉綠素含量有變少的情形,但在隔一週之後又與各組間無差異。

結 論

本研究建立一有效流程,成功篩選出兼具對草苺尖鐮孢菌具拮抗能力與促進

植物生長特性之菌株。當以此篩選出之枯草桿菌菌株搭配對草苺其他病害具控制

效果的木黴菌進行盆栽試驗後發現,單獨使用或搭配使用此二類菌株對控制草苺

萎凋病及促進植株生長 (葉綠素含量) 均有不錯的效益。於田間試驗中,仍能看

出搭配木黴菌及枯草桿菌對於控制草苺萎凋病的效果,但促進生長效應的評估結

果卻有些許疑問,這可能是因為田間試驗中,採取不干預草苺園既有之管理方式,

所以農民將出現病徵的植株拔除並栽種新苗的栽培管理方法對於我們田間試驗的

結果有相當大的影響,造成評估上的困難。但綜合所有數據發現,每週澆灌

Bacillus sp. 595、Bacillus sp. 376、Trichoderma asperellum ML1 或 ML56 之混合

配方較單獨施用各菌更能有效控制草苺萎凋病之發病率,而且其效果可持續六週

以上。本研究之成果為防治草苺萎凋病提供另一替代方案的可能性,也初步提出

搭配數種具潛力的生物防治或生物肥料菌株,確實可提高防治土媒病害之可能性,

但是否是因為改善土壤品質而造成此種效果,仍需進一步的探討。此外,本研究

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2014 真菌資源及其永續利用研討會

173

所篩出之土壤分離菌株,於草苺重要產區進行試驗獲得初步成效,未來若有更多

相關研究,對於臺灣草苺產業層面亟具應用價值。

參考文獻

1. 王占武、劉彥利。1999。拮抗菌防治草苺枯萎病。中國生物防治學報 15:187

2. 楊秋忠、趙維良、廖啟成、黃山內、曾顯雄和許文輝。2003。臺灣土壤微生物

之收集應用。臺北市,中正農業科技社會公益基金會。

3. 鐘珮哲、彭淑貞、張廣淼、楊秀珠、余思葳。2012。草苺病蟲害之發生與管理。

行政院農業委員會動植物防疫檢疫局和農業藥物毒物試驗所編印。

4. Abawi, G. S., and Widmer, T. L. 2000. Impact of soil health management practices

on soilborne pathogens, nematodes and root diseases of vegetable crops. Appl. Soil

Ecol. 15: 37-47.

5. Chalfoun, N. R., Castagnaro, A. P. and Díaz Ricci, J.C. 2011. Induced resistance

activated by a culture filtrate derived from an avirulent pathogen as a mechanism

of biological control of anthracnose in strawberry. Bio Control 58: 319–329.

6. Fang, X., Kuo, J., You, M. P., Finnegan, P. M. and Barbetti, M. J. 2012.

Comparative root colonisation of strawberry cultivars Camarosa and Festival by

Fusarium oxysporum f. sp. fragariae. Plant Soil 358: 75-89.

7. Jetiyanon, K., Fowler, W. D., and Kloepper, J. W. 2003. Broad-spectrum protection

against several pathogens by PGPR mixtures under field conditions in Thailand.

Plant Dis. 87: 1390–1394.

8. Nam, M. H., Park, M. S., Kim, H. G., and Yoo, S. J. 2009. Biological control of

strawberry Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. fragariae using

Bacillus velezensis BS87 and RK1 formulation. J. Microbiol. Biotechnol. 19:

520-524.

9. Toyoda, H., Horikoshi, K., Yamano, Y., and Ouchi, S. 1991. Selection for

Fusarium wilt disease resistance from regenerants derived from leaf callus of

strawberry. Plant Cell Rep. 10: 167-170.

10. Wu, H., Yang, X., Fan, J., Miao, W., Ling, N., Xu, Y., Huang, Q. and Shen, Q.

2009. Suppression of Fusarium wilt of watermelon by a bio-organic fertilizer

containing combinations of antagonistic microorganisms. Bio. Control 54:287–300.

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表一、苗栗農業改良場網室盆栽試驗之病害控制及促進植物生長效果試驗設計

Table 1. Experimental design for disease-control and plant growth-promoting effects of

Bacillus spp. and Trichoderma spp. on strawberry in a pot assay in the net house at

MDARES, Miaoli, Taiwan

Bacillus spp. Trichoderma spp. ML369

4Registered

fungicides Fertilizer

Code 595 376 ML1 ML56

1RM - - - - - + +

2CK - - - - - + + 3PI - - - - + + +

595 + - - - + + +

376 - + - - + + +

ML1 - - + - + + +

ML56 - - - + + + +

35 + + - - + + +

5m1 + - + - + + +

5m56 + - - + + + +

3m1 - + + - + + +

3m56 - + - + + + +

35m1 + + + - + + +

35m56 + + - + + + +

1 Regular management indicates regular applications of chemical control agents and

fertilizers. 2 Negative control serves as a blank treatment without adding Bacillus spp. or

Trichoderma spp. or any combination, but pesticide were applied to control

anthracnose regularly. 3 Each pot was drench inoculated with 50 mL of F. oxysporum f. sp. fragariae ML369

at a concentration of 1×106 spores/mL.

4 include Pyraclostrobin (3000X dilution), Difenoconazole (3000X dilution) and

Prochloraz (6000X dilution)

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表二、苗栗縣大湖鄉觀光草苺園之病害控制及促進植物生長效果試驗設計

Table 2. Experimental design for disease-control and plant growth-promoting effects of

Bacillus spp. and Trichoderma spp. on strawberry at a strawberry farm in Dahu, Miaoli,

Taiwan

595 376 ML1 ML56 ML369 Registered

pesticide Fertilizer

aCK - - - - - + +

B5 + - - - - + +

B35 + + - - - + +

B351 + + + - - + +

B3556 + + - + - + +

a Regular management indicates regular applications of chemical control agents and

fertilizers.

*Strawberry plants in the Tian-mei Strawberry Farm were grown using a high-bench

cultivation method.

**Application of Bacillus spp. and Trichoderma spp. were conducted both weekly and

fortnightly.

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表三、本試驗中使用之土壤分離菌株及其特性

Table 3. List of tested microbes and their characteristics

Code Source1

Functions2

Identification3

A B C D E F G

595 TYDARES, Taoyuan,

Taiwan (soil) ○ ○ ○ × ○ × ×

Bacillus

amyloliquefaciens

376 Kinmen, Taiwan (soil) ○ ○ ○ ○ ○ × × Bacillus subtilis

i4A

NTU, Taipei, Taiwan

(soil)

○ ○ - - ○ ○ × Burkholderia gladioli

i5C × × - - ○ ○ ×

i5D ○ ○ - - ○ ○ × -

i6E × × - - ○ ○ × -

ii6B TYDARES, Taoyuan,

Taiwan (soil) × × - - ○ ○ ○ Pseudomonas monteilii

iii6F NTU, Taipei, Taiwan

(strawberry leaf) × × - - ○ × × -

ML1 Miaoli, Taiwan

(strawberry crown) ○ ○ - - - - -

Trichoderma

asperellum

ML56 Miaoli, Taiwan

(strawberry crown) ○ ○ - - - - - Trichoderma sp.

ML369 MDARES, Taiwan

(strawberry crown) - - × - - - - Fusarium oxysporum

1 TYDARES: Taoyuan District Agricultural Research and Extension Statioin;

MDARES: Miaoli District Agricultural Research and Extension Statioin. 2

A: Antagonistic against F. oxysporum f. sp. fragariae (ML369); B: Antagonistic

against Collectotrichum gloeosporioides and Collectotrichum acutatum; C: Not

antagonistic against Trichoderma asperellum (ML1); D: Able to grow on potato

dextrose agar supplemented with 3000x Difenoconazole; E: Able to produce

indole-3-acetic acid (IAA); F: Phosphate solubilization activity; G: Potassium

solubilization activity. “○”, positive; “×”, negative; “-“, not tested. 3

Names of the bacterial strains were assigned based on the 16S rRNA gene sequences

(appox. 1270bp) with 96% to 98% identities using the Basic Local Alignment Search

Tool (BLAST). “-“, not identified yet.

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表四、苗栗區農業改良場網室育苗期盆栽試驗之病害控制效果試驗結果

Table 4. Disease-control effect of Bacillus spp. and Trichoderma spp. on strawberry in

a pot assay in the net house at MDARES, Miaoli, Taiwan

Week

RM

CK

PI

595

376

ML

1

ML

56

35

5m

1

5m

56

3m

1

3m

56

35m

1

35m

56

Incidence (%)1

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 50 0 50 50 0 0 50 0 0 0 0 0 0

3 50 75 25 25 0 25 0 0 0 0 25 0 0 0

4 50 25 0 25 0 25 75 25 75 50 50 25 25 25

Wilting ratio (%)2

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 50 0 50 50 0 0 50 0 0 0 0 0 0

3 0 0 25 25 50 25 0 0 0 25 0 25 0 0

4 0 0 25 25 50 62.5 0 0 0 25 0 25 0 0 1

Incidence was estimated weekly on-site by identifying the asymmetrical new leaves

of each pot, and calculated by the occurring numbers by the total pots per treatment. 2 Wilting ratio equals to the occurrence of wilting plants by the total pots per treatment.

表五、每週進行土壤澆灌處理對於苗栗縣大湖鄉觀光草苺園之病害控制效果

Table 5. Effect of Bacillus spp. and Trichoderma spp. on disease incidence (%) of

strawberry at a strawberry farm in Dahu, Miaoli, Taiwan

CK B5 B35 B351 B3556

Incidence (%)1: weekly application

2012.12.13* 7.1 3.4 4.0 0.0 0.0

2012.12.20* 0.0 7.1 7.7 0.0 0.0

2012.12.27* 7.1 3.4 17.9 16.0 3.4

2013.01.03 17.2 10.3 7.1 10.7 6.9

2013.01.10 6.9 6.9 10.7 20.0 0.0

2013.01.16 20.7 17.2 21.4 4.0 6.9

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表六、隔週進行土壤澆灌處理對於苗栗縣大湖鄉觀光草苺園之病害控制效果

Table 6. Effect of Bacillus spp. and Trichoderma spp. on disease incidence (%) of

strawberry at a strawberry farm in Dahu, Miaoli, Taiwan

CK B5 B35 B351 B3556

Incidence (%)1: fortnightly application

2013.01.10* 25.7 25.0 5.4 9.4 8.1

2013.01.14 20.0 24.2 21.6 6.3 5.4

2013.01.21* 31.4 14.3 15.4 9.4 5.4

2013.01.30 11.1 5.9 2.7 3.1 5.6

2013.02.04 21.6 9.4 5.3 3.2 5.7 1

Incidence was estimated weekly on-site by identifying the asymmetrical new leaves

within each treatment, and calculated by the occurring numbers by the total plants per

treatment.

*Dates with stars indicate the application of tested microbes.

表七、苗栗農業改良場網室盆栽試驗之促進植物生長效果 (葉綠素含量)

Table 7. Plant growth-promoting effects of Bacillus spp. and Trichoderma spp. on

strawberry in a pot assay in a net house at MDARES, Miaoli, Taiwan

Week 1 Week 2 Week 3 Week 4

Chlorophyll contents (SPAD index)1

RM 47.2 ± 3.1 a 48.3 ± 3.0 a 46.3 ± 4.1 a 35.3 ± 1.0 d

CK 44.6 ± 7.0 a 45.3 ± 3.4 ab 47.3 ± 2.4 a 41.7 ± 4.0 c

PI 39.8 ± 4.0 a 40.3 ± 1.3 b 42.3 ± 6.6 a 42.1 ± 1.3 c

595 40.2 ± 6.0 a 45.9 ± 1.4 ab 47.5 ± 1.0 a 48.4 ± 2.0 a

376 44.3 ± 1.0 a 47.1 ± 1.0 a 41.3 ± 1.2 a 46.3 ± 1.9 abc

ML1 44.8 ± 1.5 a 46.2 ± 1.8 ab 47.3 ± 3.0 a 46.6 ± 1.9 abc

ML56 43.8 ± 2.9 a 47.6 ± 3.2 a 46.1 ± 4.5 a 47.3 ± 2.0 ab

35 44.9 ± 2.9 a 46.9 ± 1.5 ab 46.5 ± 4.1 a 46.0 ± 2.0 abc

5m1 43.2 ± 0.8 a 45.8 ± 1.5 ab 46.6 ± 4.1 a 43.3 ± 2.5 bc

5m56 46.7 ± 5.4 a 46.3 ± 3.2 ab 46.5 ± 1.3 a 45.1 ± 0.8 abc

3m1 40.8 ± 3.8 a 45.5 ± 3.2 ab 46.3 ± 1.9 a 47.5 ± 1.8 ab

3m56 43.1 ± 2.7 a 49.1 ± 4.1 a 44.6 ± 0.4 a 46.6 ± 2.5 abc

35m1 45.2 ± 3.6 a 45.3 ± 1.3 ab 43.8 ± 3.9 a 48.5 ± 0.8 a

35m56 41.5 ± 8.2 a 45.5 ± 3.9 ab 44.3 ± 4.5 a 46.0 ± 1.0 abc

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表八、苗栗縣大湖鄉觀光草苺園之促進植物生長效果 (葉綠素含量)

Table 8. Plant growth-promoting effect of Bacillus spp. and Trichoderma spp. on

strawberry at a strawberry farm in Dahu, Miaoli, Taiwan

CK B5 B35 B351 B3556

Chlorophyll contents(SPAD index): weekly application

2013.01.10 47.4 ± 3.6 a 47.1 ± 3.3 a 47.4 ± 2.8 a 46.7 ± 2.1 a 44.4 ± 3.1 a

2013.01.14* 48.6 ± 4.0 a 47.5 ± 2.5 a 47.3 ± 4.3 a 48.1 ± 2.5 a 47.4 ± 3.0 a

2013.01.21* 46.0 ± 4.2 a 45.4 ± 2.4 a 47.5 ± 4.0 a 46.5 ± 2.3 a 46.7 ± 2.8 a

2013.01.30* 49.4 ± 1.4 a 50.0 ± 2.1 a 50.7 ± 2.3 a 50.7 ± 2.1 a 49.8 ± 1.6 a

2013.02.04 52.0 ± 2.4 a 52.4 ± 1.5 a 51.7 ± 2.6 a 52.2 ± 2.5 a 50.5 ± 1.9 a

Chlorophyll contents(SPAD index): fortnightly application

2013.01.10* 45.2 ± 2.4 a 45.3 ± 1.9 a 43.6 ± 3.2 a 44.4 ± 3.9 a 46.5 ± 2.5 a

2013.01.14 47.0 ± 3.6 a 48.9 ± 2.9 a 47.5 ± 2.1 a 46.5 ± 3.2 a 46.9 ± 1.3 a

2013.01.21* 46.7 ± 3.6 a 48.4 ± 2.9 a 47.1 ± 2.4 a 46.7 ± 2.8 a 46.6 ± 1.9 a

2013.01.30 49.1 ± 1.2 ab 47.6 ± 2.7 b 50.4 ± 2.2 ab 51.6 ± 1.1 a 50.9 ± 1.7 a

2013.02.04 50.6 ± 1.3 a 51.6 ± 2.1 a 51.9 ± 1.8 a 52.0 ± 1.6 a 51.1 ± 1.3 a

1 Chlorophyll contents was measured using SPAD-502 chlorophyll meter.

*Dates with stars indicate the application of tested microbes.

**Each value represents means ± SD (n=6). Means within each row with different

letters indicate significant difference at P < 0.05 using Tukey’s Multiple Comparison

Test.

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曾敏南

現職

行政院農業委員會高雄區農業改良場 副研究員

學經歷

2001-2000 國立臺灣大學植物病理學系 碩士

2014-2000 國立臺灣大學植物病理與微生物學系 博士

2000-2001 農委會高雄區農業改良場 助理

2002-2010 農委會高雄區農業改良場 助理研究員

2011-2014 農委會高雄區農業改良場 助理研究員兼主持人

2014-2000 農委會高雄區農業改良場 副研究員兼作物環境課課長

專 長

植物病理學、微生物學、植物病蟲害整合性管理

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提升蟲生真菌逆境耐受能力與致病力之研究

曾敏南 1*、鐘珮哲 2、曾顯雄 3、莊書婷 1、鍾嘉綾 3

1 行政院農業委員會高雄區農業改良場作物環境課植物保護研究室

2 行政院農業委員會苗栗區農業改良場作物環境課植物保護研究室

3 國立臺灣大學植物病理與微生物學系

*通訊作者:曾敏南 [email protected]

摘 要

蟲生真菌被應用於害蟲防治工作,具有良好的殺蟲能力並兼具環境友善的特

性。然而,這些真菌在田間應用成效並不穩定,其主要影響因子包含紫外線幅射、

不合適的溫度及乾燥。為解決此瓶頸,本研究由磚格孢菌 (Alternaria alternata) 中

選殖出 DHN-黑色素的生合成基因 (polyketide synthase、scytalone dehydratase 及

1,3,8-trihydroxynaphthalene reductase) 並透過農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)

媒介轉殖(Agrobacterium-mediated transformation),將黑色素生合成基因轉殖進入

不具黑色素生合成能力的昆蟲寄生真菌 - 黑殭菌 (Metarhizium anisopliae)。黑色

素在黑殭菌轉殖株中的表現,利用分光光度計的方法、液相層析質譜 (LC/MS) 及

共軛焦顯微鏡的觀察加以證明。與野生株相比較,此轉殖株對於環境逆境具有較

佳的抗性,對於寄主昆蟲亦具有較高的致病力 (virulence)。然而,這些特性的相

關機制仍不清楚,因此本研究透過生理及分子生物技術的途徑,探討其可能之機

制。雖然轉殖株與野生株皆可侵染相同寄主範圍的昆蟲,但在活體内 (in vivo) 及

活體外 (in vitro) 的情況下,轉殖株的分生孢子發芽及產生附著器 (appressorium)

的速率及與產生附著器的數量皆明顯高於野生株。轉殖株對小菜蛾 (Plutella

xylostella) 及黃條葉蚤 (Phyllotreta striolata) 的半致死時間 (LT50) 亦顯著的短於

野生株。此外,轉殖株對活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的耐受能力較野

生株來得高。在 in vivo 的情況下轉殖株可產生高於野生株 40 倍的 orthosporin,

並顯著地大量轉錄 chitinase、protease 及 phospholipase 之編碼基因。但轉殖株與

野生株相比較之下,附著器的膨壓 (turgor pressure) 及殺蟲毒素 destruxin A 的產

量則有些微下降。轉殖株對黑豆蚜 (Aphis craccivora)、小菜蛾 (Pl. xylostella)、黃

條葉蚤 (Ph. striolata) 、銀葉粉蝨 (Bemisia argentifolii) 及東方果實蠅

(Bactrocera dorsalis) 具有高致病力,使轉殖株於田間進行生物防治應用時,應具

有較高之潛力。

關鍵詞:黑殭菌、黑色素、逆境、紫外線、致病力、小菜蛾、發芽率、活性氧

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緒 言

黑 殭 菌 (Metarhizium anisopliae) 為 非 專 一 性 昆 蟲 寄 生 性 真 菌

(entomopahogenic fungi),長久以來,於田間防治工作上已有為數眾多的研究,並

證實黑殭菌對害蟲具有良好防治效果 (13)。然而,黑殭菌於田間應用時,常受環

境逆境的影響 (3, 14),導致防治成效不穩定,這種情況在其它微生物防治媒介上

亦普遍存在。這些環境逆境包含紫外線、不合適的溫度及乾燥等,其中又以紫外

線影響最大。為了改善微生物製劑受紫外線及環境逆境影響,許多方法曾被研究

與應用,例如使用油劑劑型、藉由醱酵條件提高微生物體內甘露糖 (mannose) 含

量及微膠囊劑型。然而,這些方法各有其缺點與瓶頸,不易被應用。為了改善蟲

生真菌不耐逆境的缺點,本研究利用廣泛分佈於生物界的黑色素嘗試提高其抗逆

境能力。黑色素廣泛存在自然界的各種生物體中,並具有多種可協助生物體抵禦

逆境的功能,包括抵抗紫外線傷害、減少自由基傷害及提高致病力 (virulence) 等。

此外,黑色素亦在許多動植物的病原微生物中被報導扮演著與致病力有關的因子。

有鑑於黑色素具有前述的生物功能,本研究透過 1,8-dihydroxynaphthalene 黑色素

(DHN-melanin) 生合成基因群的選殖,再藉由農桿菌媒介而將黑色素生合成基因

轉殖到黑殭菌中,使黑殭菌產生黑色素。藉以了解並探討黑色素在協助蟲生真菌

抗逆境能力以及致病力,並期待未來得以協助蟲生真菌之應用與推廣。

黑色素生合成基因選殖與轉殖

DHN melanin生合成途徑中參與之酵素包含:polyketide synthase、scytalone

dehydratase、1,3,8-trihydroxynaphthalene reductase。於NCBI資料庫中搜集前述酵素

之編碼基因(encoding gene),經分析獲得保守序列後,據以設計簡併式引子對

(degenerate primers)。接著以磚格孢菌Alternaria alternata BCRC30501的DNA為

模板進行PCR,得到的序列經NCBI的資料庫比對確認為黑色素生合成基因後再將

此三個PCR產物分別選殖,做為後續南方氏雜合使用之探針 (probe) 的模板。

使用前述探針於 A. alternata BCRC30501 的 Fosmid library 進行南方氏雜合,

篩選出帶有黑色素生合成基因的 Fosmid clone,再經由 shotgun library 解序後,獲

得基因的 genomic DNA (gDNA)序列。根據 gDNA 的基因序列,再進一步透過

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cDNA 末端快速擴增法 (rapid amplification of cDNA ends, RACE) 獲得 scytalone

dehydratase 的編碼基因 SCD 的 cDNA 全長,以及 1,3,8-trihydroxynaphthalene

redustase 的編碼基因 THR 的 cDNA 全長。Polyketide synthase 的編碼基因 PKS 則

選殖其 gDNA。

PKS、SCD 及 THR 基因個別建構於農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)的穿

梭載體 pCAMBIA 1300 當中,進行 binary vector 轉殖載體之構築。於個別帶有 PKS

基因或 SCD 基因之轉殖載體中,以 GFP 基因作為報導基因(reporter gene)。於帶

有 THR 基因的轉殖載體中,則建構 HygromycinR gene 作為選擇標誌(selection

marker)。最後透過農桿菌將黑色素生合成基因媒介轉殖 (Agrobacterium-mediated

transformation)到黑殭菌野生株 M. anisopliae BCRC35505 之中,並篩選出同時帶

有 PKS、SCD 及 THR 基因的黑殭菌轉殖株 (M. anisopliae MA05-169) 供後續試驗

(34)。

黑殭菌轉殖株表現黑色素能力之驗證

(一)、黑色素生合成途徑的中間產物驗證

本試驗利用黑色素生合成阻斷劑加普胺 (carpropamid) 確認黑色素生合成途

徑是否已建立於轉殖株M. anisopliae MA05-169當中。將M. anisopliae BCRC35505、

M. anisopliae MA05-169及Colletotrichum lagenarium 104-T培養於含有100 ppm 加

普胺的馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基 (Potato Dextrose Agar, PDA) 或未添加加普胺的

PDA,再觀察其菌落顏色變化。M. anisopliae MA05-169及C. lagernarium 104-T在含

有100 ppm 加普胺的PDA中培養後,菌落顏色由黑褐色轉變為淡棕色或灰色 (34)。

由於加普胺可作用在scytalone dehydrtase而阻斷黑色素生合成的路徑,因此可確認

轉殖株具有黑色素生合成之途徑。此外,本試驗亦透過薄層色層分析法 (thin layer

chromagraphy, TLC) 確認DHN melanin生合成途徑的中間產物scytalone存在於添加

加普胺的轉殖株培基質當中,也透過液相質譜分析(LC/MASS) 確認了MA05-169

的萃取物中含有與scytalone、vermelone、1,3,6,8-THN、1,3,8-THN、2-HJ及Flaviolin

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6種DHN melanin生合成途徑的中間產物。這些中間產物無法於野生株中被偵測得

到 (34)。

(二)、黑色素之光譜分析

黑殭菌轉殖株M. anisopliae MA05-169及Alternaria alternata BCRC30501的菌

絲,經由強酸強鹼萃取黑色素。以DOPA-melanin (Sigma, USA) 以及A. alternata

BCRC30501的黑色素做為標準品,進行紫外線-可見光的波長範圍 (200 nm – 500

nm) (UV-Vis) 的光譜掃描、電子自旋共振儀 (Electron paramagnetic resonance, EPR)

分析,及傅里葉轉換紅外光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析。

UV-Vis光譜掃描結果,DOPA-melanin,以及萃取自A. alternata BCRC30501及

M. anisopliae MA05-169的黑色素,吸光值高峰皆位於230 nm 左右。由230 nm開始,

吸光以接近線性的狀態逐漸下降,直到500 nm 達到最低之吸光值。將吸光值轉換

自然對數 (log) 後,再進行線性迴歸,並計算迴歸線的斜率。DOPA-melanin迴歸

線斜率為-0.00209,MA05-169的斜率為-0.00199及-0.00229 (11, 32, 34)。

黑色素帶有不成對電子,自由電子 (free-electron) 的g-value為2.0023 (25)。而

M. anisopliae MA05-169及A. alternata BCRC30501之黑色素藉由EPR光譜分析所得

的g-value皆約為2.0037,接近一個自由電子(free-electron)的g-value2.0023 (25, 34)。

據我們所知,至目前為止黑色素的結構並未被完全的了解,只有部分的單體

(monomer) 結構被提出(24)。這些報導指出黑色素的組成物的結構中可能包含有

羰基 [carbonyl group (C=O)]、OH 鍵及羧基 [carboxyl group (COOH)]。黑殭菌轉

殖株 M. anisopliae MA05-169 之黑色素及 DOPA-melanin 經由 FTIR 分析,兩個樣

品所呈現的 IR 光譜是相近的。兩個樣品的 IR 光譜約 3.2μm 處皆有一吸收峰,此

吸收峰可能為 NH 或 OH 鍵所產生,約 5.8μm 處亦有一吸收峰,此吸收峰可能為

羰基或雙碳鍵 (C=C) 所產生 (6, 24)。另外,M. anisopliae MA05-169 的黑色素,

在大約 3.3μm 處有一個吸收峰為 DOPA melanin 的 IR 光譜中所沒有的,此吸收峰

推測可能為 CH3或 CH2所產生(34)。

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黑殭菌轉殖株耐受逆境能力評估

自然界日照的全光譜中,UV-B 對生物之傷害性最大 (UV-C 在自然界中已被

大氣層所濾除)。沒有 UV-B 照射的條件下,轉殖株 M. anisopliae MA05-169 孢子

發芽速率及菌落生長速率皆明顯高於野生株。分生孢子接種於 PDA 培養基 10 小

時後 ,轉殖株的發芽率已將近 80%,而野生株則只有約 20%的孢子發芽。培養

至 48 小時,兩個菌株的發芽率則無明顯差異,皆接近 100%。當給予 23.4 mJ cm-2

UV-B 的照射劑量時,兩菌株的發芽時間皆延遲 10 小時,於接種後第 23 小時,

轉殖株只有約 7%孢子發芽,野生株之發芽率約為 2% 。培養至第 48 小時,43%

的轉殖株發芽,而野生株只有 21%。至 72 小時,轉殖株發芽率為 79%,野生株

則為 55%。如果給予 UV-B 劑量為 46.8 mJ cm-2 ,則培養 48 小時後轉殖株及野生

株的發芽率分別為 58%及 12% (34)。

經菌絲塊接種於 PDA 再於不同溫度下培養試驗得知,黑殭菌野生株 M.

anisopliae MA35505 及轉殖株 M. anisopliae MA05-169 的最適生長溫度為 25oC,

30 oC 及 20

oC 次之。在 10

oC 及 15

oC 的情況下,雖然轉殖株在接種後 7-9 天,其

菌落生長明顯優於野生株,但兩個菌株的生長皆緩慢。另外,兩菌株在 35 oC 環

境下皆無法生長(34)。

在孢子的發芽率上,於 10 oC -30

oC 之間培養 48 小時,兩菌株的發芽率並無

顯著差異。在 35oC 中,培養第 6 及 15 小時的發芽率,兩菌株之間差異顯著。在

34 oC 環境中,野生株孢子發芽後無法形成可見的菌落,然而轉殖株發芽後,可形

成許多肉眼可見的菌落。在 34oC–35

oC 中,野生株孢子發芽後,菌絲腫脹破裂,

然而轉殖株則可形成正常的菌絲,雖然菌絲生長速度緩慢(34)。

黑殭菌轉殖株對小菜蛾的致病力顯著提升

黑殭菌轉型株M. anisopliae MA05-169或野生株BCRC35505分生孢子接種於

小菜蛾幼蟲後,於 24, 40, 48, 65 及 72 小時計算其死亡率,轉殖株對小菜蛾造成之

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半致死時間 LT50為 43.46 小時,野生株則為 56.05 小時。轉殖株或野生株孢子懸

浮液接種小菜蛾後,分別造成 86.7%及 78.4%的死亡率,兩者間並無顯著差異。

然而,給予分生孢子懸浮液 23.4 mJ cm-2或 46.8 mJ cm

-2的 UV-B 劑量,則兩菌株

造成小菜蛾之死亡率具有顯著差異。轉殖株或野生株接受 23.4 mJ cm-2的 UV-B

後,對小菜蛾分別造成 84.4%及 13.7%的死亡率。接受 46.8 mJ cm-2 的 UV-B 後,

對小菜蛾分別造成 84.7%及 12.9%的死亡率(34)。

轉殖株之致病力提升的相關機制

(一)、黑殭菌侵染構造之分化與致病力之關系

蟲生真菌侵染寄主昆蟲前需先藉由分生孢子之忌水性以及靜電力,然後非專

一性的附著在昆蟲體表(7)。接著孢子發芽並產生附著器 (appressorium) 或直接以

菌絲侵入寄主體壁。而蟲生真菌孢子之發芽速率以及孢子附著於昆蟲體壁上的能

力與其致病力呈正相關(2, 26),Shah 等人 (2005) 報導,在不同營養源之中所生

產的 M. anisopliae 分生孢子之發芽速率與其對大蠟蛾 (Galleria mellonella) 及黃

粉蟲(Tenebrio molitor)的致病力之間具正相關性。另外,Altre 及 Vandenberg (2001)

報導 Paecilomyces fumosoroseus 在 Lepidopteran 體表的發芽速度也與 P.

fumosoroseus 的致病力呈正相關。

黑殭菌分生孢子於寄主體表開始發芽後可產生黏性蛋白,使孢子與寄主昆蟲

之間更具專一性及更緊密的附著力(35)。孢子發芽後所形成的附著器分泌黏著物

質更是緊密粘附於寄主體壁 (8, 16)。附著器並可進一步外泌具有水解活性

(hydrolytic activity) 及解脂活性 (lipolytic activity) 的酵素,例如 protease、chitinase、

lipase 及 esterase,加以弱化寄主表皮結構 (31)。同時,附著器藉由水份的進入而

產生巨大的膨壓以提供侵染時所需之機械力量,並經由附著器產生的侵入釘

(infection peg) 侵入已被弱化的體壁。

分析黑殭菌轉殖株 MA05-169 及野生株 BCRC35505 對於斜紋夜蛾

(Spodoptera litura)、紋白蝶 (Pieris rapae)、獨角仙 (Allomyrina dithotomus),黃條

葉蚤 (Phyllotreta striolata)、黑豆蚜 (Aphis craccivora)、東方果實蠅 (Bactrocera

dorsalis),以及銀葉粉蝨 (Bemisia argentifolii) 之半致死時間,以及孢子在前述各

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種昆蟲體表 in vivo 之發芽時間及附著器形成速率。黑殭菌在昆蟲體表發芽速度與

附著器形成率越快,則造成之半致死時間越短。另外,將黑殭菌轉殖株及野生株

分生孢子接種於蟋蟀 (Gryllus bimaculatus) 成蟲後翅,誘導產生附著器後,再參

照 Wang 及 St. Leger (2007) 的方法量測附著器之膨壓,結果兩個菌株間並無顯著

差異(33)。

(二)、黑色素與抗氧化能力之關系

黑殭菌侵入寄主昆蟲體壁只是感染過程的開端,侵入後立即面臨寄主昆蟲的

免疫系統攻擊。需成功躲過或抵抗免疫細胞攻擊後才有可能在寄主體內殖據

(colonization) 並致病(10, 18)。病原真菌進入動物體內後,首先要面對動物體中大

量的免疫細胞攻擊,例如人體中的 monocyte 及 macrophage,或無脊椎動物的

hemocytes。外來微生物被免疫細胞吞噬後,免疫細胞中產生大量的過氧化物或超

氧化物 (superoxide) ˙O2

-、一氧化氮 (nitric oxide, NO)、過氧亞硝酸鹽(Peroxynitrite,

ONOO-) 及過氧化氫 (H2O2) (18),這個關鍵的早期反應建立了免疫能力。

在動物體內,病原微生物需抵抗或耐受動物體內免疫系統的自由基所造成之

傷害才得以存活並繼續侵染進程,某些動物病原真菌的黑色素就提供了清除自由

基的功能 (28),例如 C. neoformans, Aspergillus spp., Sporothrix schenckii 及

Fonsecaea pedrosoi 形成的黑色素提高了細胞對 H2O2的耐受能力,亦可耐受經由

nitrogen- 或 oxygen- 所產生的自由基之傷害(9, 17, 26)。相同的,黑色素在 M.

anisopliae MA05-169 當中亦扮演著清除自由基的角色。黑殭菌分生孢子經 H2O2

或 Sodium nitroprusside (SNP, NO 的供應體)處理後,轉殖株分生孢子的存活顯著

高於野生株。隨著 H2O2 濃度的提高以及處理時間的增加,轉殖株的存活率皆明

顯高於野生株。例如,處理 10 mM H2O2

20 分鐘後,轉殖株近 100%存活,例野

生株則不到 85%。在 20 mM 中,轉殖株約 80%存活,而野生株存活率為 0。此結

果除了顯示出轉殖株較能耐受 H2O2 的影響,推測黑色素在抗氧化功能上應當在

轉殖株中扮演著提高其致病力的角色。

(三)、提高水解酵素生合成基因的表現量

已往的研究已確認 chitinase、protease 及 lipase 等酵素在蟲生真菌侵染寄主昆

蟲的過程中扮演重要的角色(4, 5, 30)。藉由絕對定量 PCR (absolute quantitative

PCR, AQ-PCR) 的分析,在 in vitro 的情況下,轉殖株中 chitinase chit 1、protease 1D

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及 phospholipase C 的表現量顯著高於野生株。在 in vivo 的情況下,黑殭菌接種於

小菜蛾幼蟲上 16、24、48 及 96 小時再藉由 AQ-PCR 分析,在轉殖株上,前述 3

個水解酵素的表現速度及表現量皆顯著高於野生株。接種 16 小時,此三基因在轉

殖株或野生株的表現量並無顯著差異。然而,24 小時後 chitinase chit 1、protease 1D

及 phospholipase C 在轉殖株上的表現皆顯著增加,分別為野生株的 7、14 及 61

倍。在黑殭落感染 48 小時後,則達到 67.7、100 及 312.5 倍。這些致病基因在侵

染初期的大量表現,勢必協助黑殭菌轉殖株得以提早且快速侵染寄主昆蟲。

(四)黑殭菌殺蟲毒素之生合成

黑殭菌代謝物經由乙酸乙脂 (ethyl acetate) 及甲醇 (methanol) 的萃取及分

析,黑殭菌素 destruxin A 在轉殖株與野生株中皆可偵測得到。野生株之 destruxin

A 的產量 0.174 mg ml-1,是轉殖株的 3.2 倍 (0.054 mg ml

-1)。在本研究中,第一次

報導黑殭菌中可生合成 orthosporin (13, 15, 21, 37),該物質在黑轉殖株中產量為野

生株的 43.7 倍。而 orthosporin 在已往的研究中曾初指出具有抗菌、殺蟲及抗癌之

功能 (19, 20, 27),此物質是否與轉殖株提高致病力有關,則有待進一步探討。

結 語

選殖自 A. alternata 的黑色素生合成基因,經農桿菌媒介轉殖至黑殭菌 M.

anisopliae BCRC35505 之後,這些外源的黑色素生合成基因可在黑殭菌中正常表

達並生合成 DHN-melanin,且可產生黑色素生合成途徑中的諸多中間產物。而經

由黑色素基因工程所獲得的轉殖株也一如預期的比野生株更耐受紫外線幅射、高

溫及乾燥。這些抗逆坑能力的提升將有助於黑殭菌轉殖株在田間的存活能力,進

而協助黑殭菌在充滿逆境之田間環境提升對害蟲的防治成效。

可生合成 DHN-melanin 的黑殭菌轉殖株 M. anisopliae 05-169 具有侵染多種重

要害蟲的能力,這些害蟲分佈於鱗翅目、鞘翅目、半翅目及雙翅目,包括小菜蛾、

黃條葉蚤、銀葉粉蝨、黑豆蚜及東方果實蠅。轉殖株對東方果實蠅及黃條葉蚤之

半致死時間更是顯著地比野生株所造成的半致死時間短,而這個結果則與分生孢

子在 in vivo 及 in vitro 的情況下發芽及分化附著器的能力有關。其致病力之提升,

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也可能與轉殖株在生合成黑色素過程產生的大量二次代謝物及 orthosporin 有直接

關係,且這些代謝物的產生可能與分生孢子發芽率及附著器分化率顯著提升有關。

此外,致病力之提升亦與黑殭菌轉殖株在侵染及殖據過程中大量產生重要之水解

酵素 (包括 chitinase、protease 及 phospholipase) 有直接關係。

轉殖株 M. anisopliae 05-169 生合成的黑色素將使得菌絲及分生孢子大幅提升

其忌水性,並提高其吸水能力,而此特性不僅有助於提高黑殭菌轉殖株分生孢子

吸附於忌水性的昆蟲體表,更有助於孢子的發芽以及對乾燥的耐受能力的提升。

此外,黑色素在自然界中扮演著許多的角色。其中一項重要特性為可以有效清除

自由基,例如經由 H2O2 或亞硝醯鐵氰化鈉 (sodium nitroprusside) 所產生的活性

氧 (reactive oxygen species, ROS)。此一特性將有助於黑色素化的轉殖株抵抗寄主

昆蟲體內之免疫系統的氧化傷害,因而提高對寄主昆蟲的致病力。雖然轉殖株分

生孢子發芽率及附著器分化率之提升、二次代謝物 orthosporin 的大量產生,及與

侵染有關的水解酵素之生合成基因的大量表現之相關機制尚不明確,但這些優點

再加上黑色素化轉殖株耐受環境逆境能力的提升,以及生長快速等能力,將使得

轉殖株更有效率的侵染寄主昆蟲。綜觀經由黑色素生合成基因工程所獲得之轉殖

株的種種特性,其應用於田間防治有害昆蟲應具有相當大的潛力,透過此技術將

可改善黑殭菌或其它有益微生物耐逆境能力,而穩定田間應用之再現性,成為具

有應用潛力的生物防治媒介。

參考文獻

1. Altre, J. A., and Vandenberg, J. D. 2001. Penetration of cuticle and proliferation in

hemolymph by Paecilomyces tumosoroseus isolates that differ in virulence

against Lepidopteran larvae. J. Invertebr. Pathol. 78: 81-86.

2. Altre, J. A., Vandenberg, J. D., and Cantone, F. A. 1999. Pathogenicity of

Paecilomyces fumosoroseus isolates to diamondback moth, Plutella xylostella:

correlation with spore size, germination speed, and attachment to cuticle. J.

Invertebr. Pathol. 73:332-338.

3. Alves, R. T., Bateman, R. P., Prior, C., and Leather, S. R. 1998. Effects of

simulated solar radiation on conidial germination of Metarhizium anisopliae in

different formulations. Crop Prot. 17: 675-679.

4. Bagga, S., Hu, G., Screen, S. E., St. Leger, R. J. 2004. Reconstructing the

diversification of subtilisins in the pathogenic fungus Metarhizium anisopliae.

Gene 324: 159-169.

5. Bogo, M. R., Rota, C. A., Jr. Pinto, H., Ocampos, M., Correa, T., Vainstein, M. H.,

an Schrank, A. 1998. A chitinase encoding gene (chit1 gene) from the

entomopathogen Metarhizium ansiopliae: Isolation and characterization of

Page 197:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

190

genomic and full-length cDNA. Curr. Microbiol. 37: 221-225.

6. Bonner, T. G., and Duncan, A. 1962. Infra-red spectra of some melanins. Nature

194: 1078-1079.

7. Boucias, D. G., Pendland, J. C., and Latge, J. P. 1988. Nonspecific factors

involved in attachment of entomopathogenic deuteromycetes to host insect cuticle.

Appl. Environ. Microbiol. 54: 1795-1805.

8. Campos, R. A., Arruda, W., Boldo, J. T., da Silva, M. V., de Barros, N. M., de

Azevedo, J. L., Schrank, A., and Vainstein, M. H. 2005. Boophilus microplus

infection by Beauveria amorpha and Beauveria bassiana: SEM analysis and

regulation of subtilisin-like proteases and chitinases. Cur. Microbiol. 50: 257-261.

9. Cunha, M. M., Franzen, A. J., Seabra, S. H., Herbst, M. H., Vugman, N. V., Borba,

L. P., de Souza, W., and Rozental, S. 2010. Melanin in Fonsecaea pedrosoi: a trap

for oxidative radicals. BMC Micrbiology 10: 80-88.

10. Czarna, M., and Jarmuszkiewicz, W. 2005. Activation of alternative oxidase and

uncoupling protein lowers hydrogen peroxide formation in amoeba

Acanthamoeba castellanii mitochondria. FEBS Letters 579: 3136-3140.

11. Ellis, D. H., and Griffiths, D. A. (1974) The location and analysis of melanins in

the cell walls of some soil fungi. Can. J. Microbiol. 20: 1379–1386.

12. Genthner, F. J., Chancy, C. A, Couch, J. A., Foss, S. S., Middaugh, D. P., George,

S. E., Warren, M. A., and Bantle, J. A. 1998. Toxicity and pathogenicity testing of

the insect pest control fungus Metarhizium anisopliae. Arch. Environ. Contam.

Toxicol. 35: 317-324.

13. Harris, J. P., and Mantle, P. G. 2001. Biosynthesis of diaporthin and orthosporin

by Aspergillus ochraceus. Phytochemistry 57: 165-169.

14. Hedgecock, S., Moor, D., Higgins, P. M., and Prior, C. 1995. Influence of

moisture content on temperature tolerance and storage of Metarhizium flavoviride

conidia in an oil formulation. Biocontrol Sci. and Technol. 5: 371-377.

15. Hollock, Y. F., Clardy, J., Kenfield, D. S., and Strobel, G. 1988.

De-O-methyldiaporthin, a phytotoxin from Dreschslera siccans. Phytochemistry

27: 3123-3125.

16. Inyang, E. N., Butt, T. M., Beckett, A., and Archer, S. 1999. The effect of crucifer

epicuticular waxes and leaf extracts on the germination and virulence of

Metarhizium anisopliae conidia. Mycol. Res. 103: 419-426.

17. Jacobson, E. S., and Ikeda, R. 2005. Effect of melanization upon porosity of the

cryptococcal cell wall. Med. Mycol. 43: 327-333.

18. Kavanagh, K., and Reeves, E. P. 2004. Exploiting the potential of insects for in

vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28:

101-112.

19. Kerrigan, J. E., Oleksyszyn, J., Kam, C.-M., Selzler, J., and Powers, C. 1995.

Mechanism-based isocoumarin inhibitors for human leukocyte elastase. Effect of

the 7-amino substituent and 3-alkoxy group in

3-alkoxy-7-amino-4-chloroisocoumarins on inhibitory potency. J. Med. Chem. 38:

544-552.

20. Khan, G. S., and Rama, N. H. 2007. Electron ionization mass spectrometric

studies of 3-(4’-chlorophenylethyl) isocoumarin and its 3,4-dihydroisocoumarin.

Jour. Chem. Soc. Pak. 29: 140-142.

21. Lee, I.-K., Seok, S.-J., Kim, W.-G., and Yun, B.-S. 2006. Diaporthin and

orthosporin from the fruiting body of Daldinia concentrica. Mycobiology 34:

38-40.

22. Liu, Y.-T., Sui, M.-J., Ji, D.-D., Wu, I.-H., Chou, C.-C., and Chen, C.-C. 1993.

Protection from ultraviolet irradiation by melanin of mosquitocidal activity of

Page 198:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

191

Bacillus thurigiensis var. israelensis. J. Invertebr. Pathol. 62:131-136.

23. Ment, D., Gindin, G., Rot, A., Soroker, V., Glazer, I., Barel, S., and Samish, M.

2010. Novel technique for quantifying adhesion of Metarhizium anisopliae

conidia to the tick cuticle. Appl. Environ. Microbiol. 76: 3521-3528.

24. Moses, D. N., Harreld, J. H., Stucky, G. D., and Waite J. H. 2006. Melanin and

Glycera jaws. J. Biol. Chem. 281: 34826-34832.

25. Motoji I. 1993. New applications of electron sping resonace: dating, dosimetry

and microscopy. World scientific, Singapore, p. 500.

26. Nosanchuk, J. D., and Casadevall, A. 2003. The contribution of melanin to

microbial pathogenesis. Cell Microbiol. 5:203-223.

27. Pochet, L., Frédérick R, and Masereel B. 2004. Coumarin and isocoumarin as

serine protease inhibitors. Curr. Pharm. Des. 10: 3781-96.

28. Różanowska, M., Sarna, T., Land, E. J., and Truscott, T. G., 1999. Free radical

scavenging properties of melanin: Interaction of eu- and pheo-melanin models

with reducing and oxidising radicals. Free Radic. Biol. Med. 26: 518-525.

29. Shah, F. A., Wang, C. S., and Butt, T. M. 2005. Nutrition influences growth and

virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Micro.

Biol.Lett. 251: 259-266.

30. St Leger, R. J. and Screen, S. E. 2000. In vitro utilization of mucin, lung polymers,

plant cell walls and insect cuticle by Aspergillus fumigatus, Metarhizium

anisopliae and Haematonectria haematococca. Myco. Res. 104: 463-471.

31. St. Leger, R. J., Cooper, R. M., and Charnley, A. E. 1987. Production of

cuticle-degrading enzymes by the entomopathogen Metarhizium anisopliae

during infection of cuticles from Calliphora vomitoria and Manduca sexta. J. Gen.

Microbiol. 133:1371-1382.

32. Suryanarayanan, T. S., Ravishankar, J. P., Venkatesan, G., and Murali, T. S. 2004.

Characterization of the melanin pigment of a cosmopolitan fungal endophyte.

Mycol. Res. 108: 974-978.

33. Tseng M. N., Chung, C. L., Tzean S. S. 2014. Mechanisms relevant to the

enhanced virulence of a dihydroxynaphthalene-melanin metabolically engineered

entomopathogen. PLoS One (DOI: 10.1371/journal.pone.0090473).

34. Tseng, M. N., Chung, P. C., Tzean, S. S. 2011. Enhancing the stress tolerance and

virulence of an entomopathogen by metabolic engineering of

dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis genes. Appl. Environ. Microbiol. 77:

4508-4519.

35. Wang, C., and St. Leger, R. J. 2007. The MAD1 adhesin of Metarhizium

anisopliae links adhesion with blastospore production and virulence to insects,

and the MAD2 adhesin enables attachment to plants. Eukaryot. Cell 6: 808-816.

36. Wang, C., and St. Leger, R. J. 2007. The Metarhizium anisopliae perilipin

homolog MPL1 regulates lipid metabolism, appressorial turgor pressure, and

virulence. J. Biol. Chem. 282: 21110-21115.

37. Wang, Q.-X., Bao, L., Yang, X.-L., Guo, H., Yang, R.-N., Ren, B., Zhan, L.-X.,

Dai, H.-Q., Guo, L.-D., and Liu, H.-W. 2012. Polyketides with antimicrobial

activity from the solid culture of an endolichenic fungus Ulocladium sp.

Fitoterapia 83: 209-214.

Page 199:  · 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝 2014 真菌資閼及其永鷪利用研討閝釀刊 主 饂 釜锐君、詹鎓智、汪鞧涵 作 者 安寶貞、朱盛祺、何小醆

2014 真菌資源及其永續利用研討會

國家圖書館出版品預行編目(CIP)資料

真菌資源及其永續利用研討會專刊. 2014 / 安寶貞等作.

-- 臺北市 : 臺大植微系等, 民 103.10

面 ; 公分

ISBN 978-986-04-2530-7 (平裝)

1.真菌 2.文集

379.107 103020567

=2014 真菌資源及其永續利用研討會專刊=

發行:國立臺灣大學植物病理與微生物學系

出版:行政院農業委員會動植物防疫檢疫局

國立臺灣大學植物病理與微生物學系

中華民國植物病理學會

中華民國真菌學會

策劃:鍾嘉綾、邱順慶、賴巧娟

主編:張雅君、詹富智、汪碧涵

作者:安寶貞、朱盛祺、何小曼、吳孟玲、吳信郁、吳雅芳、李芷芸、李涵荺、

沈偉強、沈湯龍、林乃君、林宗俊、林俞廷、林國詞、林駿奇、施佑霖、

施欣慧、洪挺軒、袁國芳、張東柱、張芳陌、莊書婷、莊雅惠、郭建志、

陳又嘉、陳昭翰、陳玲儀、陳啟予、陳錦桐、曾敏南、曾顯雄、黃尹則、

黃振文、劉俊揚、劉桂郁、劉廣宏、歐聰億、蔡志濃、蔡依真、鄭安秀、

鄭瑋寧、賴明信、謝松源、鍾仁賜、鍾嘉綾、魏育慧、蘇慶華、鐘珮哲

電話:(02) 3366-4604

設計印刷:煜量企業有限公司

地址:台北市萬華區萬大路 414 號 3 樓

電話:(02) 2309-2041

日期:103 年 10 月

定價:新台幣 300 元 (非賣品)

GPN:1010301964

ISBN:978-986-04-2530-7

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