Tese · 2014. 9. 2. · BM Banho- maria oBrix Graus Brix cm Centímetros Co Concentração inicial...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Tese
TERMOINATIVAÇÃO DE POLIFENOLOXIDASES E PEROXIDASES E
DESTRUIÇÃO TÉRMICA DE LEVEDURAS EM PURÊ DE PÊSSEGO DA
CULTIVAR JUBILEU
ANDRÉA MENEZES LOPES
PELOTAS, 2013.
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ANDRÉA MENEZES LOPES
Bacharel em Química de Alimentos
M. Sc. em Engenharia e Ciência de Alimentos
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal de Pelotas,
como requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Comitê de orientação:
Prof. Dr. César Valmor Rombaldi (FAEM/DCTA)
Prof. Dr. Pedro Luis Antunes (in memorian)
Prof. Dr. Ricardo Peraça Toralles
Pelotas, 2013.
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Banca examinadora
_________________________________________________
Prof. Dr. César Valmor Rombadi (DCTA -UFPEL)
__________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Prentice Hernandez (EQA- FURG)
___________________________________________________
Prof. Dra. Leonor Almeida de Souza Soares (EQA-FURG)
__________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Peraça Toralles (IF - Sul)
_________________________________________________
Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi (DCTA - UFPel)
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A minha mãe Marlene Menezes Lopes, que
mesmo ausente fisicamente continua sendo
minha maior incentivadora, dedico!
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida!
A minha famíla: a princesinha Marina, minha filha, uma criança que transborda alegria
e me fez entender o verdadeiro sentido do amor incondicional. Em especial ao meu
amor, meu marido Everton, que sempre esteve ao meu lado, pelo amor, apoio,
conselhos e compreensão em todos os momentos de ausência. Aos meus pais Paulo e
Marlene, meus maiores amigos, meus amores e minha inspiração, por terem feito tudo
que estava ao alcance para me ajudar sempre, por me encaminharem na vida com
tanto carinho e paciência, respeito e valores. Agradeço-os por me ensinarem, corrigirem
e incentivarem. Ao meu irmão Paulo André, pelo carinho, apoio, incentivo e por ter sido
fonte de inspiração. Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena!
Aos meus sogros Alvanir e Neuza e a bisa Norma, por sempre me incentivarem!
Ao Prof. Ricardo Toralles, o meu reconhecimento pela oportunidade de realizar este
trabalho; pela orientação e amizade, meu respeito e admiração pela sua serenidade e
conhecimentos.
Ao Prof. Pedro Antunes (in memorian), pelo estímulo no desenvolvimento deste
trabalho.
Ao Prof. Cesar Rombaldi, pela orientação e pelos ensinamentos transmitidos.
A bolsista Verônica, pela sua dedicação, sem a qual não teria desenvolvido este
trabalho.
As alunas Ísis e Priscila, obrigada pela ajuda!
A minha amiga Lorena pelo incentivo, amizade e disponibilidade em sempre me ajudar.
Aos colegas do Departamento de Quimica do IF-Sul, por porporcionarem a realização
das análises.
Aos colegas da FURG pela compreensão e incentivo.
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1.1 Parâmetros de inativação da PPO e POD de pêssego cv. Jubileu 46
Tabela 2.1 Caracterização físico-química do purê de pêssego cultivar Jubileu 63
Tabela 2.2 Parâmetros A e B da curva padrão do ácido pirúvico usando DNF 65
Tabeal 2.3 Constantes de inativação térmica 74
Tabela 2.4 Valores D para S. cerevisiae comercial 75
Tabela 2.5 Valores D para levedura isolada do purê de pêssego 76
Tabela 2.6 Valores de D e Z para inativação térmica de S. cerevisiae 77
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Pêssego cultivar Jubileu. 7
Figura 2 Estrutura da enzima polifenoloxidase 9
Figura 3 Reação de oxidação catalítica, pela PPO, do monofenol e ortodifenol produzindo o-quinona 11
Figura 4 Estrutura da enzima peroxidase 13
Figura 5 Esquema da reação na qual a enzima peroxidase converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol (composto colorido) 13
Figura 6 Saccharomyces sp observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x 18
Figura 7 Termoinativação da S. cerevisiae em glicose para diferentes tempos de
quecimento 20
Figura 1.1 Termoinativação da polifenoloxidase em catecol. 43
Figura 1.2 Termoinativação da peroxidase em guaiacol. 44
Figura 1.3 Gráfico de Arrhenius da constante de velocidade de termoinativação da PPO e POD. 45
Figura 1.4 Simulação da desnaturação da PPO Jubileu e Granada 47
Figura 2.1 Transformação da glicose em etanol 56
Figura 2.2 Placa com colônias típicas de leveduras 59
Figura 2.3 Esquema da inativação térmica da levedura 61
Figura 2.4 Curva padrão do ácido pirúvico 65
Figura 2.5 Efeito do pH no acúmulo de ácido pirúvico durante a fermentação da glicose por S. cerevisiae a 300C 66
Figura 2.6 Efeito da temperatura no acúmulo de ácido pirúvico durante a fermentação da glicose por S.cervisiae em pH 8,0 67
Figura 2.7 Cromatograma etanol e acetaldeído em pH 5,0 68
Figura 2.8 Efeito do pH na produção de etanol e acetaldeido 69
Figura 2.9 Termoinativação da Sacharomyces cerevisiae comercial 70
file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645304file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645306file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645306file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645307file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645308file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645308file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645309file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645309file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645310file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645311file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645312file:///H:/resumo%20e%20introdução%20tes.docx%23_Toc339645312
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Figura 2.10 Termoinativação da levedrua isolada do purê de pêssego cv. Jubileu 71
Figura 2.11 Placas com colônias típicas de fungos 72
Figura 2.12 Comparação de K entre a S. cerevisie comercial, a levedura isolada do purê de pêssego e as enzimas PPO e POD 73
Figura 2.13 Determinação de Z para levedura comercial 75
Figura 2.14. Determinação de Z para levedura isolada de purê de pêssego 76
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viii
NOMENCLATURA
A Fator pré-exponecial
Ao Atividade inicial da enzima
At Atividade após o tempo de aquecimento
ANOVA Análise de variância
AR Atividade Relativa
BDA Batata, dextrose, ágar
BM Banho- maria
oBrix Graus Brix
cm Centímetros
Co Concentração inicial do microrganismo
Ct Concentração após tempo de aquecimento
cv Cultivar
D Tempo de redução decimal
DFH Dinitrofenilhidrazina
Ea Energia de ativação
oC Graus celsius
g Gramas
GC Cromatografia gasosa
h Horas
ha hectares
HMF hidroximetilfurfural
k Constante de velocidade de inativação de primeira-ordem
K Kelvin
Kg kilograma
Km Constante de Michaelis-Menten
KJ kilojoule
L litro
LD Limite de detecção
LQ Limite de quantificação
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ix
log Logarítmo em base dez
ln Logarítimo neperiano
mL mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
M Molar
min Minutos
N Normalidade
nm nanômetro
PDC Piruvatodescarboxilase
PME Polimetilgalacturonase
PPO Polifenoloxidase
POD Peroxidase
PVP Polivinilpirrolidona
R Constante universal dos gases
s Segundos
S Substrato
SS Sólidos solúveis
SS/AT Sólidos solúveis por acidez titulável
T Temperatura
t1/2 Tempo de meia-vida
TCA Ácido tricloroacético
U Unidades
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
Vmax/Km Coeficiente de especificidade
Z Temperatura para reduzir 10 vezes valor D
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x
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................... iv
ÍNDICE DE TABELAS ...........................................................................................v
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................... vi
NOMENCLATURA ............................................................................................. viii
SUMÁRIO ..............................................................................................................x
Resumo........... ................................................................................................... xiii
Abstract.. ............................................................................................................. xv
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
1.1 Hipótese ...................................................................................................... 3
1.2 Objetivos ..................................................................................................... 3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 5
2.1 Pêssego ...................................................................................................... 5
2.2 Enzimas do escurecimento do pêssego ...................................................... 8
2.2.1 Polifenoloxidases .................................................................................... 8
2.2.2 Peroxidases ........................................................................................... 11
2.2.3 Atividade enzimática .............................................................................. 13
2.2.4 Inativação enzimática ............................................................................ 13
2.3 Purê e néctar de Pêssego ......................................................................... 14
2.3.1 Padrões de identidade e qualidade ........................................................ 14
2.3.2 Purê de pêssego .................................................................................... 15
2.4 Microflora presente ................................................................................... 16
2.4.1 Fermentação alcóolica ........................................................................... 18
2.4.2 Modelo linear para D e Z ...................................................................... 18
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 21
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xi
CAPíTULO 1 _____________________________________________________
TERMOINATIVAÇÃO DAS ENZIMAS PPO E POD EM PURÊS DE PÊSSEGO
DA CULTIVAR JUBILEU .................................................................... 31
Resumo... ........................................................................................................... 31
Abstract... ........................................................................................................... 32
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 34
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 36
2.1 Frutas ........................................................................................................ 36
2.2 Preparo do pó-de-proteína ........................................................................ 36
2.3 Preparo do extrato enzimático .................................................................. 36
2.4 Estudo da atividade da polifenoloxidase e da peroxidase ......................... 37
2.5 Estabilidade térmica, parâmetros de Arrhenius e tempo de meia-vida. .... 38
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 39
3.1 Inativação térmica da PPO e POD ............................................................ 39
4. CONCLUSÕES .............................................................................................. 45
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 46
CAPíTULO 2 _____________________________________________________
DESTRUIÇÃO TÉRMICA DA Sacharomyces cerevisiae COMERCIAL E DAS
LEVEDURAS ISOLADAS DE PURÊ DE PÊSSEGO CV. JUBILEU.. 50
Resumo . ............................................................................................................ 51
Abstract.... .......................................................................................................... 51
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 52
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 54
2.1 Matéria-prima ............................................................................................ 54
2.2 Isolamento da levedura ............................................................................. 55
2.3 Curva padrão do ácido pirúvico ................................................................. 56
2.4 Efeito do pH e temperatura na produção do ácido pirúvico....................... 56
2.5 Quantiticação dos metabólitos intermediários na fermentação ................. 57
2.6 Estudo da estabilidade térmica ................................................................ 57
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xii
2.6.1 Saccharomyces cerevisiae comercial .................................................... 57
2.6.2 Levedura isolada do purê de pêssego .................................................. 58
2.7 Determinação de D e Z ............................................................................. 59
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 60
3.1 Caracterização do purê ............................................................................. 60
3.2 Curva padrão de ácido pirúvico ................................................................ 60
3.3 Efeito do pH na produção de etanol e acetaldeído ................................... 64
3.4 Inativação térmica da S. cerevisiae comercial e de levedura isolada de
pêssego .......................................................................................................... 66
3.5 Determinação de D e Z ............................................................................. 71
4 CONCLUSÃO .................................................................................................. 75
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 76
Comentários finais .............................................................................................. 79
APÊNDICE A ...................................................................................................... 80
APÊNDICE B ...................................................................................................... 90
APÊNDICE C ..................................................................................................... 93
ANEXO A.... ....................................................................................................... 98
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xiii
RESUMO
LOPES, Andréa Menezes. Inativação térmica da polifenoloxidase, peroxidase e leveduras em purê de pêssego da cultivar Jubileu. 2013. 115f.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustiral. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A polifenoloxidase (PPO) e A peroxidase (POD) são responsáveis pelo
escurecimento enzimático em pêssegos. Por outro lado, a Saccharomyces
cerevisiae, quando não devidamente inativada durante a pasteurização, pode
provocar a fermentação do purê basicamente em duas etapas chaves: a
transformação do açúcar em piruvato e a do piruvato em etanol. O conhecimento
da termoestabilidade dessas enzimas e da S. cerevisiae é muito importante para
branqueamento e pasteurização de polpas, purês e néctares. A cv. Jubileu é
amplamente cultivada no Sul do RS e tem características sensoriais favoráveis
para elaboração de purês e derivados. Entre a PPO, POD e leveduras da cultivar
Jubileu, o objetivo foi definir um indicador de termoinativação determinando-se
os parâmetros: constante de velocidade de inativação (k), energia de ativação
(Ea), tempo de meia-vida (t1/2) e tempo de redução decimal (D). Para esta
finalidade, implantaram-se três experimentos consecutivos. No primeiro
experimento, as enzimas PPO e POD foram extraídas usando o método do pó-
de-proteína, purificação parcial pela precipitação com (NH4)2SO4 seguido de
diálise. A atividade enzimática foi determinada por medida do incremento na
absorbância a 420 nm para PPO e 470 nm para POD, utilizando um
espectrofotômetro Varian. A análise cinética dos resultados sugere que a
desnaturação térmica foi bem descrita por um modelo cinético de primeira
ordem, e a dependência da temperatura foi significativamente representada pela
lei de Arrhenius. As constantes cinéticas para PPO variaram de 6,4. 10-4 até 5,5.
10-2 s-1 na faixa de temperatura de 50-90oC e Ea de 111,1 kJ.mol-1. Para POD de
3,6.10-3 até 1,9.10-2 s-1 entre 50-650C e com Ea de 97,2 kJ.mol-1. No segundo
experimento, foi estudado o efeito do pH e temperatura na produção de ácido
pirúvico, durante a fermentação por S. cerevisiae comercial. O conteúdo de
ácido pirúvico foi determinado por colorimetria usando dinitrofenilhidrazina.
Também estudou-se o efeito do pH na produção de etanol e acetaldeído, os
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xiv
quais foram determinados por cromatografia gasosa. Com base nos resultados
de pH e temperatura ótimas de fermentação para S. cerevisiae comercial
estudou-se a termoinativação de levedura isolada de pêssego cv. Jubileu,
usando a comercial como testemunha. Finalmente, nas condições estudadas a
S. cerevisiae comercial desenvolveu ótima condição de fermentação em pH 5,0
a 300C, decorrente da baixa concentração de ácido pirúvico e alta concentração
de etanol. A S. cerevisiae foi mais termoestável do que a levedura isolada do
purê de pêssego. Os valores D 600C em pH 5,0 foram de 1,53 e 1,87 min para a
S. cerevisiae comercial e a levedura isolada do purê de pêssego,
respectivamente. Ambas as leveduras demonstraram-se menos termoestáveis
que as enzimas PPO e POD da cv. Juibileu. Os resultados demonstram que
cultivares diferentes de pêssego não podem ter os mesmos parâmetros de
tempo e temperatura no branqueamento e na pasteurização.
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xv
ABSTRACT
LOPES, Andréa Menezes. Thermal inactivation of polyphenoloxidase, peroxidase and yeast in peach puree cv. Jubileu. 2013. 115f. Thesis - Graduate Program in Agroindustrial Science and Technology. Federal University of Pelotas, Pelotas.
The polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) are responsible for
enzymatic browning in peaches. Moreover, Saccharomyces cerevisiae, when not
properly inactivated during the pasteurization, can cause fermentation of the
puree basically in two key steps: transformation of sugar into pyruvate and of
pyruvate into ethanol. Knowledge of thermostability of these enzymes and of S.
cerevisiae is very important for the bleaching and pasteurization of pulps, purees
and nectars. The cv. Jubileu is widely cultivated in southern Rio Grande do Sul,
Brazil, and has sensory characteristics favorable for the elaboration of purees
and derivatives. Among PPO, POD and yeast of the cultivar Jubileu, the objective
was to define an indicator of thermoinactivation determining the parameters:
inactivation rate constant (k), activation energy (Ea), half-life time (t1/2) and
decimal reduction time (D). For this purpose, were implanted three consecutive
experiments. In the first experiment, the enzymes PPO and POD were extracted
using the method of acetone powder, partial purification by precipitation with
(NH4)2SO4 followed by dialysis. The enzymatic activity was determined by
measuring the increase in absorbance at 420 nm for PPO and 470 nm for POD,
using a Varian spectrophotometer. Kinetic analysis of the results suggests that
the thermal denaturation was well described by a first order kinetic model, and
the temperature dependence was significantly represented by the Arrhenius law.
The kinetic constants for PPO varied from 6,4. 10-4 to 5,5. 10-2 s-1 in the
temperature range of 50-90oC and Ea of 111,1 kJ.mol-1. For POD from 3,6.10-3 to
1,9.10-2 s-1 between 50-650C and with Ea of 97,2 kJ.mol-1. In the second
experiment, we studied the effect of pH and temperature on ethanol production
and pyruvic acid, during fermentation by commercial S. cervisiae. The pyruvic
acid was determinate by colorimetry using dinitrophenylhydrazine. We also
studied the effect of pH on ethanol production and acetaldehyde by gas
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xvi
chormatograph. Based on the results of pH and temperature optimum
fermentation to s. cerevisiae comercial was studied the thermal resistence yeast
isolated from peach puree cv. Jubileu, using commercial as witness. Finally,
under the conditions studied it commercial Saccharomyces cerevisiae developed
great condition of fermentation at pH 5.0 at 30oC, due to the low concentration of
pyruvic acid and high ethanol concentration. The s. cerevisiae was more
thermostable than the yeast isolated from peach puree. The D60-values in buffer
at pH 5 were 1,53 and 1,87 min for the comercial Sacharomyces cerevisiae and
yeats isolated from spoiled Jubileu peach puree, respectively. Both yeasts were
less than thermostable enzymes PPO and POD of the cv. Jubileu. The results
demonstrate that different peach cultivars may not have the same type of
blanching and pasteurising.
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xvii
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1
1. INTRODUÇÃO
O pêssego é uma fruta climatérica da espécie Prunus persica (L.)
Batsch, originária da Ásia. Sua expressiva produção comercial no mundo,
geralmente, localiza-se em regiões de clima temperado, entre as latidudes
30oN e 45oS (SCORZA, 2005). É a oitava fruta mais produzida no mundo, com
15,4 milhões de toneladas, e é uma das frutas mais consumidas in natura
(FAO, 2010) .
A produção brasileira de pêssego em 2010 foi de 239.149 toneladas
produzidas em uma área cultivada de 21.326 hectares, com produtividade de
11.2Kg.ha-1. Analisando o período de 2000 a 2008, observa-se a média de
produção de 215000 toneladas anuais, com área de 23.098 hectares e
produtividade média de 9.3Kg.ha-1(IBGE, 2010).
Segundo dados do IBGE (2010), o Rio Grande do Sul foi o maior
produtor nacional, respondendo por 65% da safra de pêssego. De acordo com
o Sebrae (2009), a produção da safra 2008/2009 no município de Pelotas (RS)
atingiu 55 mil toneladas, 10% superior a safra 2007/2008.
A maior parte da produção nacional, tradicionalmente, destina-se ao
processamento de pêssegos em calda, geléias e doces em massa, mas, existe
um grande potencial de crescimento de mercado, tanto em termos da fruta in
natura como na forma de purê, néctar e suco de pêssego clarificado
(VENDRUSCOLO e VENDRUSCOLO, 2003).
O valor de comercialização do pêssego é reflexo da demanda e de sua
apreciação pelo consumidor, bem como de sua adaptabilidade para a indústria.
A compreensão de que os frutos de algumas cultivares são mais valorizados e
que esta valoração pode estar relacionada com as características de gosto e
sabor, possibilita o estabelecimento de uma estratégia de comercialização,
visando ao aumento do consumo e da receita do produtor (ALMEIDA ,2006).
Suas peculiaridades de sabor e aroma resultam do equilíbrio de
açúcares, ácidos orgânicos, compostos fenólicos, carotenóides e compostos
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2
voláteis, fazendo do pêssego uma fruta muito apreciada e de grande
importância comercial, incluindo “commodities” derivadas da cadeia produtiva
(CRISOTO et al., 1998; GIL et al., 2002; VERSARI, 2002).
O purê de pêssego é uma “commodity” usualmente comercializado no
mercado internacional, entre 30-32oBrix, e é usado para elaboração néctares,
sucos, sorvetes, geléias, espumantes, vinho e produtos reestruturados (LUH,
1980; MCHUGH, 1996). A concentração de purês visa aumentar a vida-de-
prateleira, reduzir o custo de transporte e facilitar a comercialização (DEUEL e
PLOTTO, 2010).
Além das alterações devidas à ação de microorganismos, o purê de
pêssego também pode ser modificado em função das enzimas presentes. A
polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) são responsáveis pelo
escurecimento enzimático em pêssegos. Por outro lado, Saccharomyces
cerevisiae, quando não devidamente inativada durante a pasteurização, pode
provocar a fermentação do purê basicamente em duas etapas chaves: a
transformação do açúcar em piruvato e a do piruvato em etanol (TORALLES et.
al., 2011; GARZA et.al, 1994). O conhecimento da termoestabilidade da PPO
e POD e da S. cerevisiae é muito importante para definir as condições de
branqueamento e pasteurização de polpas, purês e néctares.
Os tratamentos térmicos comercialmente usados no processamento de
frutas e vegetais são pouco efetivos para uma inativação irreversível
principalmente da peroxidase. O efeito da termoinativação enzimática é função
do tempo e termperatura utilizados. (VALDERRAMA et. al., 2001).
No Brasil, não existe uma legislação específica para produtos novos
como purê, mas foi estabelecida para néctar de pêssego (BRASIL, 2003). Além
disso, empresas envolvidas nessa cadeia produtiva vêm usando, como
matéria-prima para elaboração de néctar de pêssego, purê concentrado de
pêssego importado de vários países, em detrimento do nacional, devido a
questões de qualidade relacionadas com cor, sabor, textura e segurança
alimentar (TEIXEIRA et al., 2003).
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3
Atualmente se tem um bom conhecimento sobre as características
físico-químicas, sensoriais e o potencial de escurecimento de diversas
cultivares brasileiras, mas poucos dados específicos sobre a resistência
térmica das enzimas responsáveis pelo escurecimento e das leveduras
responsáveis pela fermentação. A cv. Jubileu é amplamente cultivada no Sul
do RS e tem características sensoriais de sabor e cor favoráveis para
elaboração de purês e derivados.
O melhor aproveitamento das cultivares brasileiras de frutas com o
desenvolvimento de processamento térmico eficiente é de grande importância,
pois gera benefícios para todos envolvidos nessa cadeia produtiva, incluindo
consumidores que contarão com melhor qualidade e menor custo.
A elaboração de purê de pêssego combinando adição de ácido
ascórbico seguido de tratamento térmico a 750C por 4 min. pode não ser
suficiente para inativar a PPO de cultivares diferentes do que a Granada, que
foi utilizada como indicador de termoinativação por TORALLES E
VENDRUSCOLO (2007). Além disso, neste tipo de produto, as leveduras
podem sobreviver ao tratamento térmico.
Definir um indicador de termoinativação, entre PPO, POD e leveduras,
para purês de pêssego produzidos a partir da cv. Jubileu, determinando-se os
parâmetros de constante de velocidade de inativação (k), energia de ativação
(Ea), tempo de meia-vida (t1/2), tempo de redução decimal (D) e valor Z).
Para tal finalidade implantaram-se três experimentos consecutivos,
divididos em dois capítulos:
1.1 Hipótese
1.2 Objetivos
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4
1. Termoinativação das enzimas PPO e POD de purês de pêssego
da cv. Jubileu: estudou-se a termoestabilidade das enzimas de escurecimento
em purês de pêssego produzidos a partir da cv. Jubileu, que é amplamente
cultivada no Sul do Rio Grande do Sul, Brasil. Desse experimento resultou o
conhecimento da enzima mais termoestável entre PPO e POD.
2. Cinética da destruição térmica da S. cerevisiae comercial:
obteve-se as condições ótimas de fermentação, através do estudo do efeito do
pH e da temperatura na atividade da enzima PDC de S. cervisiae comercial.
Desse experimento resultou o conhecimento da desnaturação térmica do
microrganismo, que foi bem descrito por um modelo cinético de primeira ordem
e a dependência da temperatura foi significativamente representada pela lei de
Arrhenius.
3. Cinética de destruição térmica da S.cerevisiae em purês de
pêssego da cv. Jubileu: estudou-se a cinética de inativação da levedura
extraída de pêssego da cultivar Jubileu, determinando os seguintes
parâmetros: constante de inativação(k), energia de Ativação (Ea), tempo de
meia-vida (t1/2), tempo de redução decimal (D) e valor Z. Desse experimento
resultou o conhecimento das constantes cinéticas de inativação do
microrganismo.
Este trabalho objetiva complementar estudos para elaboração de purê
de pêssego, visando a obtenção de um produto estável utilizando uma cultivar
brasileira e servirá de base para a indústria processadora deste tipo de
produto.
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5
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O pêssego e a nectarina são frutas muito apreciadas pelo sabor,
aparência e pelo seu valor econômico no âmbito da cadeia produtiva. No Brasil,
é possível produzir estas frutas, apenas nos estados do Sul e Sudeste, onde
predomina o clima temperado.
A produção mundial de pêssegos e nectarinas está em torno de 12
milhões de toneladas, crescendo ao redor de 20% a cada 10 anos. A China é o
maior produtor mundial, com cerca de 27% de participação na oferta global,
seguida da Itália e dos Estados Unidos, que produziram em 1998, 1,4 milhão e
1,3 milhão de toneladas, respectivamente.
No Brasil, o pêssego e a nectarina são produzidos nos Estados do Sul e
Sudeste, onde as condições naturais, sobretudo o clima temperado, favorecem
a exploração comercial. O Rio Grande do Sul é o principal produtor, com cerca
de 65% da produção nacional, ocupando uma área superior a 10 mil hectares.
Conforme dados da ASCAR/EMATER-RS(2010), o Rio Grande do Sul
produziu na safra 2008/2009, 129.515 toneladas de pêssego. A produtividade
média do RS é de 9.9 kg.ha-1 e a média de área por produtor é de 2,68 ha.
Para o processamento industrial, a produção foi de 71.095 toneladas, colhidos
em uma áera de 8.220 hectares.
Toda a produção nacional de pêssego e nectarina se destina ao
mercado interno. O Brasil não exporta esta fruta, sendo considerado um grande
mercado para os principais produtores mundiais, principalmente para o Chile,
país vizinho, e tradicional exportador da América Latina.
2.1 Pêssego
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6
Pêssegos são ricos em potássio, fósforo e cálcio. Ferro e sódio são
encontrados em pequenas quantidades. A vitamina encontrada em maior
quantidade no pêssego é a vitamina C, sendo 10 vezes superior ao conteúdo
encontrado na laranja, seguida da niacina e da vitamina A (MAHAN e
ESCOTT- STUMP, 1999).
Os carotenóides são responsáveis por grande parte da cor amarela,
alaranjada e vermelha das frutas (KADER e BARRET, 2005). O caroteno,
critoxantina, luteína, violaxantina e zeaxantina são os principais carotenóides
encontrados no pêssego (LUH, 1980).
Pêssegos contêm diferentes tipos de compostos fenólicos que
desempenham um papel relevante na qualidade de frutos frescos e
processados, estando envolvidos com a cor do exocarpo, escurecimento
enzimático, a adstringência do mesocarpo e com escurecimento não
enzimático que ocorre em certos cultivares de pêssego quando processadas
termicamente (SAINZ, 2006).
A cultivar Jubileu (Figura 1) foi disponibilizada pelo Melhoramento
Genético da Embrapa Clima Temperado em 1998. A planta é produtiva,
apresenta boa sanidade e é indicada para áreas de 250 a 350 horas de
acúmulo de frio hibernal (temperatura menor ou igual a 7,2ºC). Produz frutos
redondos, sem ponta de película amarela, podendo apresentar até 20% de
vermelho. A polpa é firme, de sabor doce-ácido, de cor amarela-escura e o
caroço é aderente. Os frutos têm tamanho grande com diâmetro em geral,
superior a 6 cm. O conteúdo de sólidos solúveis tem variado de 12°Brix a 16,6
ºBrix (EMBRAPA, 2011).
Figura 1 1 Planta cultivar Jubileu. Fonte: Embrapa, 2011.
-
7
Em estudos sensoriais realizados por TORALLES et al. (2006), o
equilíbrio entre o doce e o ácido foi o principal atributo de preferência, e o
residual amargo como o principal atributo de rejeição dos purês de pêssego. A
relação SS/AT (sólidos solúveis/acidez titulável) foi um bom parâmetro para
indicar a qualidade e os purês elaborados a partir das cultivares Jubileu e
Eldorado foram os preferidos dos consumidores. Quanto à cor, as cultivares
Granada, Jade, Esmeralda e Jubileu, com menor potencial de escurecimento
enzimático, originaram purês de coloração amarela característica, desejável
nesse tipo de produto.
Figura 1. Pêssego cultivar Jubileu. Fonte: Embrapa, 2011.
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2.2 Enzimas do escurecimento do pêssego
Desde a sua descoberta no século passado, as enzimas PPO e POD têm sido
objeto de extensas pesquisas científicas. Com isso, considerável importância tem sido
acumulada sobre suas propriedades moleculares e catalíticas.
As polifenoloxidases (PPO) e peroxidases (POD) fazem parte de um grande
número de enzimas conhecidas como oxiredutases, podendo promover uma variedade
de reações, principalmente a peroxidase. A polifenoloxidase (PPO; EC 1.10.3.1) e a
peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) estão presentes em um grande grupo de frutas e
vegetais.
A investigação desse grupo de enzima tem sido de grande importância para a
tecnologia de alimentos, uma vez que a continuidade da atividade enzimática pode
ocasionar mudança na cor, variações de aroma, alterações no teor de vitaminas e até
modificações na textura. A manutenção da cor natural é um dos fatores de qualidade
mais importantes no processamento de purês, polpas, néctares e sucos (LEONARD et
al., 1981; ASHURST, 1995; GUERRERO-BELTRAN et al., 2004; GARCIA e BARRET,
2005). A cor amarela típica está associada ao purê de pêssego de alta qualidade, porém
modificações na coloração dos pêssegos durante colheita, pós-colheita, processamento e
armazenamento causam declínio drástico na qualidade, quando não controlados
(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981; TOURJEE et al., 1998; CHENG & CRISOTO, 1995; GARZA et
al., 1999; GIRNER et al., 2002).
2.2.1 Polifenoloxidases
Polifenoloxidase (Figura 2), monofenol oxidase (tirosinase, EC1.14.18.1),
catecol oxidase ou o-difenol oxigênio redutase, são algumas das diferentes
nomenclaturas que as enzimas responsáveis pela oxidação de fenóis podem receber
(MAYER, 2006; FARIA et al., 2007). As distintas designações são atribuídas devido ao
tipo de substrato catalisado e/ou devido à atividade da enzima (cresolase, catecolase,
difenolase e fenolase) (RICHARD-FORGET e GAUILLARD, 1997). A enzima PPO é
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9
encontrada praticamente em todos os tecidos vegetais, em concentrações especialmente
altas em cogumelo, batata, pêssego, maçã, banana, manga, folhas de chá, abacate e
café (BOUCHILLOUX, 1963).
Muito das características sobre a função biológica das PPO ainda é desconhecida
(MAYER, 2006). As PPO são classificadas em catecol oxidases e lacases; ambas
oxidam substratos fenólicos (OSUGA et al., 1994). As catecol oxidases podem catalisar a
oxidação dos o-difenóis em o-quinonas usando a atividade catecolase (MAYER e
HAREL, 1979). As lacases, por sua vez, catalisam reações de oxidação, dimetilação e
polimerização de compostos fenólicos (MAYER, 1987).
Inúmeros trabalhos têm sido citados com diversos substratos catalisados pela
PPO (CHEYNIER e MOUTONET, 1992). No entanto, esta enzima pode demonstrar
preferência por um determinado substrato. O pH ótimo de atuação da PPO pode variar
com a fonte de origem do substrato. Entretanto, na maioria dos casos, o pH ótimo de
atuação encontra-se entre 6 e 7, sendo a enzima inativada em pH 4 ou abaixo.
Figura 2 Estrutura da enzima polifenoloxidase. Fonte: Protein Date Bank/ PDB,
2012.
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Na Figura 3 observa-se a formação de quinonas pela oxidação das
hidroxilas fenólicas do catecol. A formação da quinona é dependente do oxigênio
e da enzima. Uma vez formadas, as reações subseqüentes ocorrem
espontaneamente, não dependendo mais da enzima nem do oxigênio (ARAÚJO,
2004; GOMES et al., 2001).
As cultivares de pêssego podem ser divididas em dois grupos: aquelas com forte
tendência ao escurecimento e as com baixa tendência, sendo que a forte tendência ao
escurecimento enzimático tem sido relacionada à alta atividade da PPO, baixa valor de
Km e ao alto conteúdo de compostos fenólicos, principalmente, o do ácido clorogênico
(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
TORALLES et al. (2004), em estudo comparativo entre concentração total de
fenóis e a constante de Michaelis-Menten (Km) usando catecol como substrato, para
quatro cultivares de pêssego brasileiras, obtiveram a seguinte ordem crescente para o
potencial de escurecimento enzimático: Granada, Jade, Esmeralda e Maciel. Essa ordem
foi coincidente com a obtida através da relação do coeficiente de especificidade (Vmax/Km).
Segundo esses autores, uma isoenzima com 0,35 de mobilidade relativa pode ser
responsável pelo maior escurecimento enzimático observado pela PPO-Maciel e PPO-
Esmeralda em catecol.
Figura 3. Reação de oxidação catalítica, pela PPO, do monofenol e
ortodifenol produzindo o-quinona. Fonte: FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 2002.
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2.2.2 Peroxidases
A peroxidase é uma enzima resistente a elevadas temperaturas e sua inativação
tem sido freqüentemente usada como índice da efetividade do branqueamento, que
consiste no tratamento térmico usual aplicado em alimentos para inibir a ação das
enzimas.
A perda da sua atividade enzimática no produto branqueado indica uma perda
correspondente da atividade para outras enzimas de deterioração. Por ser a enzima mais
termoestável em sistemas vegetais, uma vez que pode recuperar sua atividade após
tratamento térmico, a peroxidase é utilizada como parâmetro de eficiência do
branqueamento (GONÇALVES et al., 2007; AGÜERO et al., 2008).
No organismo humano a peroxidase possui função antioxidante, impedindo que o
peróxido de hidrogênio gere radicais livres como o íon hidroxila (-OH) e o ácido
hipocloroso (HOCl). Níveis baixos de peroxidase e de outras enzimas antioxidantes estão
relacionados ao desenvolvimento de câncer, doenças relacionadas ao sistema nervoso e
distúrbios cardiovasculares (ANESINI et al., 2006). Nos alimentos a peroxidase é
responsável por mudanças indesejáveis no aroma, na cor (escurecimento) e na textura
(FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002; GONÇALVES et al., 2007).
A enzima peroxidase (Figura 4) possui um grupo prostético ferriprotoporfirina
(Fe+++) pertencente à classe das hemeproteínas, o qual influencia as reações químicas
catalisadas por esta enzima. A função da peroxidase é proteger os tecidos animal e
vegetal contra os efeitos tóxicos do H2O2 formado durante o metabolismo celular. A POD
oxida compostos fenólicos somente na presença do H2O2 . Sua detecção, medida por
espectrofotometria, é baseada no desenvolvimento da cor na presença do substrato
guaiacol e água oxigenada como substrato secundário. O complexo peroxidase-peróxido
formado oxida o guaiacol (incolor), transformando-o em um produto final colorido (o
tetraguaiacol), conforme reação ilustrada na Figura 5 (ARAÚJO, 2004).
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A PPO e POD de pêssegos são enzimas com comportamento michaeliano
(LUH & PHITHAKPOL, 1972). A constante de Michaelis-Menten (Km), uma constante
empírica igual à concentração em substrato para o qual há uma velocidade inicial igual à
Figura 4. Estrutura da enzima peroxidase. Fonte: Protein Date Bank/ PDB, 2012.
Figura 5 Esquema da reação na qual a enzima peroxidase converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol (composto colorido). Fonte: FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 2002.
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Vmax/2 em condições experimentais definidas, vem sendo determinada para caracterizar o
escurecimento enzimático in vitro.
2.2.3 Atividade enzimática
A atividade enzimática de uma enzima é medida através de sua velocidade de
reação, em condições de ensaio estabelecidas. A atividade enzimática deve ser
quantificada considerando-se a velocidade da reação durante a fase linear (LIMA et al.,
2001).
O método espectrofotométrico é o mais usado para acompanhar
quantitativamente as atividades da PPO e POD, normalmente definidas em termos de
incremento da absorbância por minuto por miligrama de proteína solúvel a 420 nm para
PPO e 470 nm para POD (FLURKEY & JEN, 1978; SILVA & NOGUEIRA, 1984;
TIJSKENS et. al., 1997; TORALLES 2003).
Segundo a IUB (International Union of Biochemistry) uma unidade internacional
(UI) de atividade enzimática representa a quantidade de enzima que catalisa a
transformação de um micromol de substrato por minuto nas condições de ensaio
definidas. A atividade enzimática específica é utilizada em várias situações sendo
expressa em unidades (UI) por massa de proteína. A atividade enzimática residual é
definida como a atividade enzimática após tratamento térmico sobre a atividade
enzimática inicial (REED, 1975; LIMA et al., 2001; SHALINI et al., 2008).
2.2.4 Inativação enzimática
Na indústria alimentícia, a inativação enzimática visa eliminar ou retardar
reações enzimáticas que resultam na degradação dos alimentos. A inativação enzimática
é considerada um processo químico. LUMRY E EYRING (1954) propuseram um
esquema geral para inativação térmica enzimática onde ocorre primeiramente um
desdobramento parcial reversível seguido de uma etapa irreversível onde a enzima
encontra-se inativada.
A cinética de inativação enzimática é o acompanhamento do progresso da
inativação em relação ao tempo. Modelos matemáticos são utilizados para descrever o
comportamento da curva de inativação e, a taxa de inativação é determinada pelos
parâmetros cinéticos desses modelos (LOEY et al., 2003).
A estabilidade cinética depende da energia de ativação (Ea, energia de barreira
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14
necessária para desdobrar a proteína). Também o tempo de meia-vida (t1/2) e a constante
de velocidade de inativação de primeira-ordem (k) são parâmetros amplamente utilizados
para estudar a estabilidade cinética (VIEILLE & ZEIKUS, 2001; BOCK et al., 1999). Em
geral, uma energia de ativação alta implica que uma menor variação de temperatura é
necessária para inativar a enzima (YEMENICIOGLU et al., 1997).
TIJSKENS et al. (1997), trabalhando com termoinativação da POD de pêssegos da
cultivar Andross, relataram que a Ea foi de 150 kJ.mol-1 e k = 8,44.10-3 s-1 a 60oC.
Posteriormente, NEVES (2002) determinou uma energia de aproximadamente 171
kJ.mol-1 para POD da cv. Rei da Conserva. Já WONG et al. (1971) estudaram a
termoestabilidade de quatro isoenzimas de PPO da cv. Cortez, sendo que os tempos de
meias-vidas foram de 5,5 até 50 minutos a 50oC e, acima de 76oC, todas as izoenzimas
foram rapidamente inativadas.
TORALLES (2005) verificou que a PPO e POD de pêssego Granada apresentaram
ótima atividade, respectivamente, em pH 6,2 e em pH 5 a 30oC. O tratamento térmico
reduziu significativamente a atividade enzimática da PPO e POD, sendo que foi efetiva a
termodesnaturação acima de 70oC. A estabilidade térmica da PPO foi superior a da POD
e, assim, a polifenoloxidase poderia ser um bom indicador de termoinativação para
controle do escurecimento enzimático em pêssegos, no entanto a POD apresentou maior
atividade do que a PPO.
Em contraste com a energia de ativação em pêssegos, ANTHON et al. (2002),
trabalhando com a termoinativação das enzimas do tomate, chegaram a resultados mais
elevados para POD com uma Ea de 557 kJ.mol-1 e k = 32,4.10-3 s-1 a 70
oC.
YEMENICIOGLU et al. (1997), comparando diferentes cultivares de maçãs, concluíaram
que a cultivar Amasya (Ea=255,6 kJ.mol-1) apresentou menor termoestabilidade que a
cultivar Starking Delicious (Ea= 240,6 kJ.mol-1). Na temperatura de 68oC os tempos de
meias-vidas foram respectivamente 32,1 e 48,5 minutos.
2.3 Purê e néctar de Pêssego
2.3.1 Padrões de identidade e qualidade
Não há, na legislação brasileira, padrões para produtos novos como purê de
pêssego. A Instrução Normativa N.o 1, de 7 de janeiro de 2000, trata do regulamento
técnico geral para fixação dos padrões de identidade e qualidade para polpas de várias
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frutas destinados somente ao consumo como bebida, mas nada trata especificamente
sobre polpa ou purê de pêssego simples ou concentrado. De acordo com a norma geral,
polpa de fruta é definida como produto não fermentado, não concentrado, não diluído,
obtido de frutos polposos, através de processo tecnológico adequado, com um teor
mínimo de sólidos totais, proveniente da parte comestível do fruto. A norma também
define linhas gerais para as características físicas, químicas e sensoriais para polpa de
fruta, mas sem citar limites. Os padrões microbiologicos para polpas segundo essa norma
são: (a) Salmonella ssp: ausência em 25 g; (b) Coliformes fecais (máximo): 1 g-1; (c)
bolores e leveduras (máximo): 5.103 g-1 para polpa in natura e 2.103 g-1 para polpa
conservada quimicamente (BRASIL, 2000).
Para néctar de pêssego, a Instrução Normativa N.o 12, de 4 de setembro de 2003,
estabelece padrões de identidade e qualidade. De acordo com essa norma, o néctar de
pêssego é a bebida não fermentada, obtida da dissolução, em água potável, da parte
comestível do pêssego (Prunus persica L.) e açúcares, destinado ao consumo direto,
podendo ser adicionado de ácidos. O néctar deve apresentar cor amarelada, sabor
característico e aroma próprio da fruta.
2.3.2 Purê de pêssego
O processo para produção de purê de pêssego não concentrado foi descrito por
HEALTON et al. (1966) citados por LUH (1980). Recentemente, TORALLES e
VENDRÚSCULO (2007), propuseram um processo para elaboração de purê de pêssego
concentrado (Anexo A - Figura 1A). Neste processo, as frutas devem ser processadas
frescas, completamente maduras e preferencialmente no mesmo dia da colheita para
preservar características de sabor e aroma da fruta. As frutas são selecionadas, lavadas,
descaroçadas, descascadas e lavadas. Recomenda-se a pelagem com solução de NaOH
a 5%, na temperatura de 2100F pelo tempo entre 1 e 2 minutos. Posteriormente, as
metades são lavadas com jatos de água em lavadores rotativos. Após a pelagem, a polpa
é branqueada em um termoinativador enzimático tubular contínuo a 750C por 4 minutos.
A polpa é refinada em despolpadeira e o purê integral é acondicionado em tanques para
adição de 0,08 % em peso de ácido ascórbico, sob agitação. Após, é pasteurizado a 910C
por 7 segundos e rapidamente resfriado em torno de 20C. Os purês de pêssegos
normalmente são comercializados entre 30-32oBrix no mercado internacional e são
usados para elaboração de néctares, sucos, sorvetes, geléias, espumantes, vinhos e
produtos reestruturados (LUH, 1980; MCHUGH, 1996). Embalagens flexíveis têm sido
utilizadas para purês (CARVALHO-FILHO e MASSEGUER, 1997).
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2.4 Microflora presente
As leveduras são fungos que se apresentam, usual e predominantemente, sob
forma unicelular. Sua reprodução vegetativa se faz principalmente por gemulação.
Possuem parede celular e são facilmente diferenciadas das bactérias em virtude de suas
maiores dimensões e propriedades morfológicas. Cada espécie tem uma forma
característica, mas, mesmo em culturas puras, há consideráveis variações de tamanho e
de forma das células individuais, dependendo da idade e do ambiente (GOMES, 2004).
O gênero Saccharomyces é um dos grupos de microrganismos mais estudados
pela comunidade científica. Esse interesse é função da ampla aplicação desses
microrganismos na indústria de biotecnologia. Essa levedura tem sido relatada como
agente de transformação desde 1800 (ANDRIETTA et. al, 2006)
Saccharomyces cerevisiae (Figura 6) é uma espécie de levedura utilizada há
milhares de anos em produtos de panificação e na fermentação de bebidas alcoólicas,
sendo a levedura fermentativa por excelência, tendo sido utilizada ultimamente na
produção de bioetanol. É também muito importante como organismo modelo
(OSTERGAARD et al., 2000) em estudos fisiológicos (efeitos de diversos tipos de
stresse - osmótico, oxidativo,formação de etanol e ácidos fracos), sendo o
microrganismo eucariótico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser
sequenciado (WILLIAMS, 1996).
As colônias apresentam uma coloração que varia entre o branco
(predominantemente) e o creme (ocasionalmente), apresentando forma convexa e lisa.
Este microrganismo pode formar pseudohifas, que consistem em cadeias simples de
células esféricas, elipsoidais ou cilíndricas. Reproduzem-se na maioria das vezes por
gemulação multilateral, onde a nova gémula é formada na porção lateral da célula-mãe.
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A temperatura é um dos parâmetros mais importantes para o desempenho das
leveduras durante o processo fermentativo (FLEET e HEARD, 1993).
PARISH e HIGGINS (1989) pesquisaram uma variedade de produtos cítricos,
incluindo casca seca de laranja utilizada como forragem de gado, suco de laranja
pasteurizado e não pasteurizado, e suco de laranja refrigerado com relação à microbiota
fúngica. As seguintes leveduras foram isoladas: Candida maltosa, C.sake, Hanseniaspora
guilliermondii, Hanseniaspora spp.; Pichia membranaefaciens, Saccharomyces cerevisiae
(suco de laranja não pasteurizado - comercial); Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora
delbrueckii (suco de laranja não pasteurizado - experimental) e Rhodotorula spp (casca
de laranja seca).
PUT et al. (1976) estudaram a alta resistência de 120 espécies de leveduras,
representativas da biota fúngica de refrigerantes e produtos alimentícios ácidos. Foram
testadas 35 espécies de leveduras esporogênicas (Brettanomyces, Candida, Kloeckera,
Rhodotorula e Torulopsis) e 85 espécies de ascomicetos (Debaryomyces, Hansenula,
Kluyveromyces, Lodderomyces, Pichia, Saccharomyces e Saccharomycopsis). As
temperaturas testadas foram 55, 60, 62,5 e 65°C nos tempos de 10 e 20 minutos. Os
resultados obtidos evidenciaram que, das espécies testadas, a Saccharomyces
cerevisiae e a Saccharomyces chevalieri mostraram-se mais resistentes.
Figura 6. Saccharomyces sp observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x. Fonte: Fugelsang e Edwards, 2007.
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18
Segundo SPLITTSTOESSER (1975); DEVÈZE e RIBÉREAU-GAYON (1977);
WALLS e CHUYATE (1998); JACKSON (2008), cada microrganismo tem determinado
nível de resistência ao calor. Modelos matemáticos de destruição térmica tem sido
propostos para avaliar a inativação de S. cerevisiae em alimentos. Podem ser citados
estudos de BELTRÁN e CÁNOVAS (2006) para néctar de manga, GUERRERO et. al
(2004) para suco de maçã, GARZA et. al (1994) para purê de pêssego e REVERON
(2012) para cerveja Pilsen.
2.4.1 Fermentação alcóolica
As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por
via fermentativa. A fermentação alcoólica é, portanto, um processo biológico conduzido
pela levedura, normalmente Saccharomyces cerevisiae (LIMA, BASSO e AMORIM,
2001).
A fermentação alcoólica é a ação das leveduras sobre açúcares fermentescívieis
contidos em uma solução. É um processo biológico no qual a energia fornecida por
reações de oxidação parcial pode ser utilizada para o crescimento de leveduras e
oxidação parcial anaeróbia da hexose na produção de álcool e CO2 (LIMA e
MARCONDEES, 2002).
A transformação da sacarose em etanol e CO2 envolve reações em sequência
ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica (LIMA, BASSO e AMORIM,
2001).
A principal rota metabólica envolvida na fermentação etanólica é a glicólise, na qual
uma molécula de glicose é metabolizada e duas moléculas de piruvato são produzidas.
Dois ATPs produzidos na glicólise são usados na condução da biossíntese das
leveduras, que envolve diversas biorreações que requerem energia. Portanto, a produção
do etanol está fortemente relacionada com o crescimento das leveduras, o que significa
que leveduras podem ser produzidas como subproduto (BAI, ANDERSON e MOO-
YOUNG, 2008). As enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase convertem o
piruvato em etanol e em dióxido de carbono e re-oxidam 2 moléculas de NADH que são
produzidas na glicólise (BARNETT, 2003).
2.4.2 Modelo linear para D e Z
A inativação de muitos microrganismos a uma temperatura constante segue uma
cinética de 1ª ordem, que é representado por um gráfico log C/Co versus tempo (Figura
7).
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19
Figura 7. Termoinativação da S. cerevisiae em glicose para diferentes tempos de
aquecimento. Fonte: Toralles et. al., 2011.
De acordo com este modelo, todas as células da população tem igual
probabilidade de morte (BUZRUL et al, 2005; BUZRUL e ALPAS, 2007). A partir de um
gráfico deste tipo, pode-se determinar o valor D, que é o tempo de redução decimal
necessário para reduzir em 90% a população microbiana a uma temperatura constante.
Quando se representa a população microbiana em coordenadas semilogarítmicas, o valor
de D é o tempo necessário para a redução de uma ordem logarítmica no número de
microrganismos. O valor de D não depende da população microbiana inicial já que
depende, unicamente, da inclinação da linha reta. A exposição da população microbiana
a temperaturas mais altas produz uma diminuição no valor de D (SINGH e HELDMAN,
1995).
Outro parâmetro cinético importante é o valor Z, denominado constante de
resistência térmica. Este é um fator que descreve a resistência térmica dos esporos
microbianos e é definido como o aumento de temperatura necessário para causar uma
diminuição de 90% no tempo de redução decimal (D). Representando-se os valores de D,
obtidos a diferentes temperaturas, em coordenadas semi-logarítmicas, o valor de Z
representa o aumento de temperatura necessário para modificar uma ordem logarítmica
no valor de D (SINGH e HELDMAN, 1995).
Os valores de D e Z são função de diversos fatores, como por exemplo,
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20
microrganismo, meio em que se encontra, ph do meio. Entre outros fatores que têm
influência sobre os valores D e Z está a metodologia empregada nessa determinação
(SILVA, 2011).
A representação gráfica do logaritmo decimal de sobreviventes, em relação ao
tempo de exposição à temperatura constante resulta em curva linearizada decrescente. A
variação do número de sobreviventes, com o tempo de exposição, é função do número
de microrganismos inicialmente presentes.
Inúmeros estudos vem sendo realizados com a levedura S. cerevisiae,
determinando-se os parâmetros (D) e (Z), com o objetivo de verificar a resistência
térmica do microrganismo em alimentos.
Para S. cerevisiae de purês de pêssego, GARZA et. al. (1994) encontraram
D60°C de 0,5 minutos. TAJCHAKAVIT et al. (1999), estudando a levedura em sucos de
maçã encontraram D 600C de 3,8 minutos. REVERON et. al. (2012) encontraram D50°C
de 0,68 minutos para Saccharomyces cerevisiae em cerveja.
Estudos realizados por SILVA (2011), apontam valores de D e Z para a
Saccharomyces cerevisiae utilizando o aquecimento convencional e o aquecimento
dielétrico. Para o aquecimento convencional encontraram valores de D57°C de 2,15
minutos e Z de 4,27°C, enquanto que com o aquecimento por microondas obtiveram
D57°C de 0,73 minutos e Z de 3,10°C.
-
21
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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inactivation of peroxidase during blanching of butternut squash. Food Science and
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Paranapanema-SP, safra 2005, e sua valorização no mercado atacadista de São
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Universidade Estadual Paulista, 2006.
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31
RESUMO
Estudou-se a inativação térmica da PPO e POD em extrato enzimático de
pêssego da cv. Jubileu, que é amplamente cultivada no Sul do Rio Grande do
Sul, Brasil. A polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) foram extraídas
usando o método do pó-de-proteína, submetido a purificação parcial pela
CAPÍTULO 1
TERMOINATIVAÇÃO DAS ENZIMAS PPO E POD EM
PURÊS DE PÊSSEGO DA CULTIVAR JUBILEU
-
32
precipitação com (NH4)2SO4 seguido de diálise. A atividade enzimática foi
determinada por medida do incremento na absorbância a 420 nm para PPO e
470 nm para POD, utilizando um espectrofotômetro Varian. A análise cinética
dos resultados sugere que a desnaturação térmica foi bem descrita por um
modelo cinético de primeira ordem, e a dependência da temperatura foi
significativamente representada pela lei de Arrhenius. As constantes cinéticas
para PPO variaram de 6,4. 10-4 até 5,5. 10-2 s-1 na faixa de temperatura de 50-
90oC e Ea de 111,1 kJ.mol-1. Para POD de 3,6.10-3 até 1,9.10-2 s-1 entre 50-
650C e com Ea de 97,2 kJ.mol-1, demonstrando maior resistência da PPO.
Palavras-chave: Pêssego Jubileu, desnaturação, energia de ativação,
Arrhenius.
ABSTRACT
It was studied the thermal inactivation in peach of the cv. Jubileu, which is
widely cultivated in southern of Rio Grande do Sul, Brazil. The
polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) were extracted using the
method of protein powder, and submited partial purification by precipitation with
-
33
(NH4)2SO4 followed by dialysis. The enzymatic activity was determined by
measuring the increase in absorbance at 420 nm for PPO and 470 nm for POD,
using a Varian spectrophotometer. Kinetic analysis of the results suggests that
the thermal denaturation was well described by a first order kinetic model and
the temperature dependence was significantly represented by the Arrhenius
law. The kinetic constants for PPO varied from 6,4. 10-4 to 5,5. 10-2 s-1 in the
temperature range of 50-90oC and Ea of 111,1 kJ.mol-1. For POD from 3,6.10-3
to 1,9.10-2 s-1 between 50-650C and with Ea of 97,2 kJ.mol-1, demonstrating
increased resistance of PPO.
Keywords: Jubileu peach, denaturation, activation energy, Arrhenius.
-
34
1. INTRODUÇÃO
A cor e sabor naturais das frutas são atributos importantes para escolha
do consumidor (TORALLES et al., 2006). Preservá-los é um grande desafio em
frutas minimamente processadas, purês, néctares e sucos (GUERRERO-
BELTRAN et al., 2004; MCLELLAN e PADILLA-ZAKDUR, 2005; QUEVEDO et
al. 2011).
A polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD) são enzimas associadas
com reações de deterioração oxidativa que podem causar o escurecimento
destes produtos quando não devidamente controladas (BRITO et al., 2005,
TORALLES et al., 2010). Além da alteração da cor, o escurecimento enzimático
pode induzir severas mudanças de sabor, textura e perdas nutricionais
(VALDERRAMA e CLEMENTE, 2004; GARCIA e BARRET, 2005, PROHENS
et al. 2007; BI et. al., 2013).
As polifenoloxidases catalisam a oxidação de substratos fenólicos
usando o oxigênio como aceptor de hidrogênio em dois tipos de reações. A
PPO (EC 1.14.18.1, monofenol, L-dopa: oxigênio oxidoredutase) está envolvida
na hidroxilação de monofenóis para originar o-difenóis e a PPO (E.C. 1.10.3.1,
1,2-benzenodiol:oxigênio oxidoredutase) que catalisa a remoção de hidrogênio
de o-difenóis para produzir uma o-quinonona (RAMIREZ e WHITAKER, 2003).
A peroxidase catalisa quatro tipos de reações: peroxidação, oxidação,
catalática e hidroxilação. Para substratos fenólicos, somente a reação de
peroxidação é importante. Neste caso, a POD (E.C. 1.11.1.7., doador H2O2,
oxidoredutase) catalisa a reação do peróxido de hidrogênio ou outro peróxido
orgânico, que é reduzido, enquanto que um doador de elétrons (AH2) é
oxidado. O doador de elétrons pode ser ascorbato, fenóis, aminas ou outros
compostos orgânicos (BRITO et al., 2005). Em muitos casos o produto da
oxidação é colorido e serve como base para a determinação colorimétrica da
atividade da peroxidase. Por outro lado, a reação oxidativa pode ocorrer na
ausência do peróxido de hidrogênio, no entanto, necessita da presença de
oxigênio e cofatores (manganês e fenol). A hidroquinona, o ácido
dihidroxifumárico e o ácido ascórbico, são os substratos possíveis de serem
-
35
tratados neste tipo de reação (PINTO, 2008) . Além disso, a ação da enzima
objetiva principalmente controlar o nível de peróxidos gerados em quase todos
compartimentos celulares e, na ausência de um doador de hidrogênio, a
peroxidase converte peróxido de hidrogênio em H2O e O2. Esta reação
catalática é pelo menos mil vezes mais lenta que a de peroxidação (RANIERI
et al., 2001; PINTO, 2008).
Em pêssegos, a atividade da PPO e a POD e seu controle são
conhecidas de longa data e continuam a ser estudadas (REYES & LUH, 1960;
FLURKEY & JEN, 1978; ALBA et al., 1996; GIRNER et. al., 2002). Para
cultivares nacionais, apesar de serem conhecidas as cinéticas de
escurecimento e de desnaturação da PPO e da POD Granada (TORALLES et
al., 2005), e até mesmo o potencial de escurecimento de algumas cultivares de
pêssegos brasileiras (TORALLES et al., 2004), a literatura pertinente tem
poucos relatos sobre a inativação térmica de cultivares brasileiras. Tal
conhecimento cinético de desnaturação é muito importante porque,
tradicionalmente, o controle do escurecimento enzimático em sucos e purês de
frutas resulta da combinação do tratamento térmico e de inibidores químicos
(MCEVILY et al., 1992; FUNAMOTO et al., 2003, TORALLES et al., 2010).
Neste trabalho, estudou-se a termoinativação das enzimas PPO e POD
em pêssego da cv.