El uso de sustancias antioxidantes en la conservación de semillas de trigo (Triticum aestivum L.) en silos.

Isabel Barriuso Ortegamiembro del equipoIsabel Díez Santosmiembro del equipoJavier de Grado Alonsomiembro del equipoBeatriz Benito Ibañezmiembro del equipoLuis V. de Benito Aparicio.Profesor de Biología y Geología.

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I. E. S. FÉLIX RODRÍGUEZ DE LA FUENTE

El siguiente trabajo de investigación fue realizado de izquierda a derecha por Beatriz, Isabel Barriuso, Isabel Diez y Javier. El trabajo no fue nada fácil pues era la primera vez que intentábamos valorar la respiración de las semillas. Tuvimos que montar un aparato donde los gases hacían un recorrido entre un liquido que quitaba el oxígeno y otro que nos servia para valorar la respiración de las semillas. Tardamos más de tres meses en que funcionara. Al final cuando ya obtuvimos valores que podíamos dar por buenos resultaba que quitando todo el oxigeno al circuito las semillas seguían desprendiendo CO2. Nuestra sorpresa fue descubrir que las semillas en un ambiente sin oxigeno son capaces de realizar la fermentación alcohólica. Queríamos demostrar que el uso de sustancias antioxidantes de origen vegetal podrían servir para conservar el grano en los silos. Estas sustancias secuestran el oxigeno y limitan la respiración de las semillas que en teoría producirían menos CO2

pero la fermentación que no la consideramos en la hipótesis de partida altero todos los datos que esperábamos obtener. El trabajo se presento al Concurso de Jovenes Investigadores y el del colegio San Viator. No obtuvimos ningún premio pero en nuestra memoria quedara los buenos ratos pasados en el laboratorio.

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El uso de sustancias antioxidantes en la conservación de semillas de trigo (Triticum aestivum L.) en silos.

MEMORIA

Nuestro instituto está en un barrio residencial de Burgos. Próximo a él se encuentran los

campos de trigo y cebada que caracterizan el paisaje castellano. En estos campos de cereal es fácil

encontrar la mala hierba llamada rompesacos (Aegilops geniculata Roth.). Esta planta tiene una

característica que le hace especial, sus semillas permanecen aletargadas gracias a la presencia de

unas sustancias antioxidantes en su fruto. Estas sustancias atrapan el oxígeno en el entorno del

embrión produciendo así una baja tasa respiratoria, lo que evita la germinación del mismo.

Nuestro proyecto se inicia con la búsqueda de una aplicación práctica de este fenómeno a los

silos. Como sabemos uno de los principales problemas que presenta el almacenamiento de grano, en

grandes cantidades, es que las semillas al respirar liberan calor y agua. Las semillas siempre van

acompañadas de hongos e insectos. La liberación de calor y el incremento de humedad produce un

aumento de la actividad de estos organismos lo que deteriora la calidad del grano.

Nos planteamos la idea extraer la sustancia antioxidante del rompesacos para ver su efecto

en la respiración del trigo y su posible aplicación para evitar el desarrollo de plagas en el interior de

los silos.

La respiración de las semillas fue valorada en dos momentos diferentes: al iniciarse la

hidratación , para lo que empleamos un sensor de oxigeno disuelto y a las cuarenta ocho horas de

la hidratación, mediante una modificación que hicimos del aparato de Pettenkofer que mide la

liberación de CO2. En cada experimento, primero usábamos agua destilada y luego se repetía con el

extracto antioxidante.

Los resultados fueron por cada 100 gramos de semilla, en una hora, de 1,45 mg O2 al

ponerse en contacto con el agua y de 0,68 mg O2 al repetir el experimento con la sustancia

antioxidante.

A las cuarenta y ocho horas de la hidratación, por cada cien gramos de semilla, en

veinticuatro horas, la liberación de CO2 fue de 115,5 mg, al ponerse en contacto con agua destilada

y de 107,8 mg al repetir el experimento con la sustancia antioxidante del rompesacos. Dado que la

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diferencia era muy pequeña volvimos a repetir el experimento pero esta vez con una sustancia

antioxidante de uso industrial, el ácido ascórbico. En este caso el resultado fue de 97,3 mg de CO2.

En conclusión, los resultados experimentales demuestran que el empleo de extractos

antioxidantes de malas hierbas como el rompesacos (Aegilops geniculata Roth) limita la respiración

de las semillas del trigo. En ambos casos disminuye la liberación de calor y humedad por lo que su

uso en silo puede contribuir a la conservación del grano.

Nuestros alumnos trabajaron en la parte experimental del proyecto los viernes por la tarde,

desde las tres hasta las seis, en el laboratorio que el I.E.S. Félix Rodríguez de la Fuente tiene en el

Edificio “Florentino Diaz Reig” durante los cursos 2009-2010 y 2010-2011. Este trabajo se terminó

de redactar en el segundo trimestre del curso 2011. De los procedimientos y resultados obtenidos se

pasa a dar explicación detallada en el informe que acompaña a la memoria.

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El uso de sustancias antioxidantes en la conservación de semillas de

trigo (Triticum aestivum L.) en silos.

Índice

1.- Antecedentes.

1.1 El problema del almacenamiento de los granos de trigo en silos.

1.2 Las sustancias antioxidantes del genero Aegilops.

2.- Objetivos de nuestro trabajo.

3.- Metodología

3.1 Trabajo de campo.

3.2 Método empleado para extraer las sustancias antioxidantes de las espigas

de Aegilops geniculata Roth.

3.3 Método empleado para determinar el consumo de oxígeno, en las semillas de

trigo, en el momento de la hidratación.

3.4 Método empleado para valorar la liberación de CO2 , en las semillas de trigo,

a las cuarenta y ocho horas de la hidratación.

4.- Resultados.

4.1 Resultado del método empleado para determinar el consumo de oxígeno, en

las semillas de trigo, en el momento de la hidratación.

4.2 Resultado del método para valorar la liberación de CO2 , en las semillas de

trigo, a las cuarenta y ocho horas de la hidratación.

5.- Conclusiones.

6.- Bibliografía.

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1.- Antecedentes.

1.1 El problema del almacenamiento de los granos de trigo en silos.

Los silos son estructuras diseñadas para almacenar grano. En este trabajo nos referiremos a

dos tipos, el primero es el silo torre que esta fabricado en hormigón o chapa galvanizada y que es

un edificio que suele tener una altura de veinticinco metros. El segundo es el silo bolsa, se trata de

bolsas de plástico generalmente dos a dos metros y medio de diámetro y de un largo que varia en

función de la cantidad del material que se quiera almacenar sellándose en sus extremos (figura 1).

Figura 1. Tipos de silos: la fotografiá de la izquierda muestra el silo torre presente en el barrio donde vivimos, la de la

derecha son silos bolsa.

Los granos almacenados en silos son seres vivos y como tales respiran (figura 2). El

mecanismo de la respiración se puede representar como la degradación del almidón almacenado en

la semilla, el cual al combinarse con el oxígeno produce anhídrido carbónico, vapor de agua y

desprende calor (Cruz & Diop, 1990).

(C6 H12 O6)n (almidón del grano)+ 6O2 (aire)→ 6CO2 + 6H2O (vapor) + calor

Figura 2. Reacción química global de la respiración tomado de Cruz & Diop, 1990.

Este fenómeno degradatorio es además un proceso autoacelerado, cuanto más elevado sea el

calor y el contenido en humedad más intensa sera la respiración del grano.

Esta liberación de calor asociada a la humedad puede producir la destrucción de la semilla

por el desarrollo de hongos, bacterias y acaros almacenados con el grano. Por ejemplo, en la figura

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3 se muestran los diferentes daños que se pueden presentar dependiendo de la temperatura y de la

humedad. Se puede observar que el grano almacenado a 25º C y con el 15% del contenido de

humedad está expuesto a los ataques de insectos, de mohos y a problemas de germinación (punto A)

mientras que con un contenido de humedad del 12,5% solamente se encuentra expuesto a los

ataques de insectos (punto B). A partir del 40% de humedad la actividad respiratoria se dispara

preparando a la semilla para la germinación. Finalmente se puede apreciar que un grano con el 15%

de humedad se puede conservar perfectamente cuando se almacena a una temperatura de 15º C

(punto C).

Figura 3. Diagrama de almacenamiento de grano (Burgess y

Burrel, 1964). En el eje vertical se representa la temperatura

y en el eje horizontal la humedad de grano.

En las últimas décadas, para combatir a los organismos que acompañan a las semillas se han

utilizado plaguicidas químicos, que no han dado el resultado esperado debido a los problemas de las

resistencias. En la actualidad, se emplean las siguientes técnicas:

(1) Limitar la humedad del trigo almacenado que no debe superar el 14%. Si la humedad es mayor,

el grano cedería vapor de agua al ambiente intergranario, elevando la humedad relativa del mismo

por encima del 67%, valor crítico a partir del cual se desarrollan diferentes tipos de plagas. Para

eliminar el exceso de humedad del grano se emplean máquinas secadoras.

(2) Una vez disminuida la humedad del grano, la técnica de conservación varía según el tipo de

silo:

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Los silos torre presentan sistemas de aireación que permiten reducir la temperatura por

debajo del óptimo para el desarrollo de plagas (15º- 40º C). El problema surge al hacer circular el

aire exterior a través del grano almacenado. Si el aire es demasiado seco y el grano tiene la

humedad correcta, disminuirá su peso por pérdida de humedad, con la consiguiente pérdida

económica. (Thielemann, 2000).

Los silos saco al estar cerrados herméticamente no tienen pérdidas de humedad, pero es

imposible el control de la temperatura con aireadores. La ventaja que presentan este tipo de silos es

que su atmósfera interna se modifica por la respiración de las semillas. Dado que los insectos y los

mohos son organismos que necesitan oxígeno para su crecimiento, si se crea una atmósfera muy

pobre en oxígeno alrededor de los granos los insectos no podrán sobrevivir y los mohos detendrán

su desarrollo. El inconveniente que presentan es que el contenido de oxígeno disminuye

gradualmente. Por tanto, al inicio , se dan las condiciones idóneas para el desarrollo de hongos y la

formación de micotoxinas como demuestra el trabajo de Venturino y Alverez, 2007.

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1.2 Las sustancias antioxidantes en el genero Aegilops.

La domesticación es el proceso por el cuál los humanos llevan el control reproductivo de

plantas y animales, modificándolos para sus propios propósitos. Las presiones selectivas aplicadas

han producido una significativa modificación de los cereales, pero también han generado efectos no

deseados. En el área mediterránea, el trigo de invierno es cosechado en verano para ser sembrado

otra vez hacia mediados del otoño. Para sobrevivir al invierno, el trigo debe germinar y establecerse

rápidamente, de ahí que se ha producido una selección contraria al periodo de letargo de las

semillas. La pérdida del periodo de letargo ocasiona un gradual deterioro fisiológico de la semilla

almacenada que termina por no germinar (figura 6).

Figura 4. Duración de almacenamiento en relación con la

temperatura y el contenido de humedad del grano (la

norma de referencia que se ha utilizado para establecer el

diagrama de almacenamiento de seguridad ha sido la

capacidad de germinación). Tomado de Cruz & Diop

1990.

Todo esto ha conducido a estudiar los factores que inducen el letargo en la semilla trigo.

Ahora bien lo que en la actualidad llamamos trigo (Triticum aestivum L.) se trata de una planta

obtenida a partir de la hibridación de las especies de dos generos, Aegilops y Triticum. Este

proceso de selección, que ha durado miles de años, ha producido la perdida en el trigo actual de las

características genéticas que inducen la latencia. Los investigadores tienden a buscar estos rasgos en

las plantas que le dieron origen.

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Datta & al (1970), en sus experimentos de germinación de las espigas completas de A.

geniculata observaron que si las semillas permanecian en el interior de la espiga, no germinaban.

Cuando las semillas eran extraídas , germinaban normalmente. De estos experimentos se puede

extraer la conclusión de que las glumas y glumillas, hojas modificadas que envuelven a la semilla,

contienen una sustancia inhibidora de las semillas (figura 7).

Figura 5. Fotografiá de la espiga de Aegilops geniculata Roth. (autores). Esquema de la inflorescencia mostrando las

partes de la espiga y los tipos de semillas. (modificado de Marañon, 1987)

Los trabajos para determinar la naturaleza química de las sustancias inhibidoras así como su

efectos en las semillas son muy variados tanto en Aegilops (Wurzburger et al. 1976, Dyer 2004,

Quinn et al 2006) como en Triticum (Mosheov 1938, Miyamoto et al. 1961, Gatford 2004). De

estos trabajos podemos concluir diciendo existen dos tipos de sustancias de naturaleza fenólica que

actúan en este tipo de plantas: en las brácteas (glumas y glumillas) hay fenóles simples (tipo

tanino) como el ácido vainíllico (Gatford 2004) o el ácido cumárico (Datta et al 1970) mientras en

el pericarpio del fruto hay fenoles complejos (tipo flavonoides) como las catequinas (Miyamoto et

al. 1961) que además de dar color a la semilla actúan en ella produciendo el letargo (figura 6).

Aunque todavía se desconoce el mecanismo de actuación por el cual las sustancias fenólicas

inducen a la semilla a la latencia o dormición según Natella et al. 1999 una posible explicación

seria su carácter antioxidante. Estas sustancias secuestrarían el oxigeno en el entorno del embrión

impidiendo su desarrollo.

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Figura 6. En este dibujo se muestra la sección longitudinal de una semilla de cereal, con las capas que la forman. En las

capas más externas glumillas encontramos compuestos fenólicos simples como el ácido cumárico (recuadro rojo)

mientras que en las capas más internas, pericarpio y testa, vemos los compuestos fenólicos complejos como las

catequinas (recuadro azul).

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2.- Objetivos de nuestro trabajo.

Hoy día es frecuente el uso de las sustancias antioxidantes tanto en la nutrición, para

conservar las propiedades organolépticas de los alimentos envasados (Cubero et al. 2002), como en

la medicina, para combatir el envejecimiento celular (Ramos et al 2008). Estas ideas inspiraron el

tema de nuestro trabajo, en el sentido de poder emplear sustancias antioxidantes en otra faceta de la

industria humana como es la conservación del grano almacenado.

El objetivo que nos planteamos fue extraer sustancias antioxidantes de las brácteas del

rompesacos ( Aegilops geniculta Roth) y emplear los extractos para ver su efecto en la respiración

de las semillas de trigo.

Si el principio activo contenido en el extracto del rompesacos disminuye la respiración del

trigo, porque secuestra el oxígeno, ésto tendría su aplicación para la conservación de las semillas

en:

(1) Silos torre, porque al disminuir la respiración, el calentamiento del grano sería menor.

No sería necesario el uso de ventiladores y por tanto desaparecería el riesgo de las pérdidas de peso

como consecuencia de las pérdidas de humedad del grano.

(2) Silos bolsa, su empleo también tendría un efecto positivo ya que el consumo de oxígeno

por las sustancias antioxidantes acortaría el tiempo en el que la atmósfera se vuelve rica en CO2

evitando el desarrollo de hongos que producen micotoxinas.

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3.- Metodología.

3.1 trabajo de campo.

En el verano del 2010, utilizando de referencia la obra de Alejandre et al. 2009 iniciamos la

búsqueda de especies del genero Aegilops. Según esta obra, existen en Burgos ciudad cuatro

especies: Aegilops geniculata Roth.; Aegilops neglecta Req & Bertol ; Aegilops triuncialis L. y

Aegilops ventricosa Tausch.

El 29 de junio de 2010 encontramos Aegilops geniculata Roth (Aizpuru 1999) en un cerro,

llamado el Páramo próximo al polígono industrial de Villalonquejar, al lado de unos campos de

trigo y cebada. Recolectamos unos 100 gramos de esta planta (figura 7 y 8).

Figura 7. mapa con ortofotografía donde se muestra con el número 1 el lugar donde se localizó el rompesacos (Aegilops

geniculata Roth.) georeferencia 30TVM3890 y con el número 2 la posición de nuestro instituto. Modificado de

http://sigpac.mapa.es/fega/visor .

Figura 8. fotografiá que muestra los páramos con los

cultivos de trigo y cebada donde se recolecto Aegilops

geniculata Roth.

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3.2 Método empleado para extraer las sustancias antioxidantes de las espigas de

Aegilops geniculata Roth.

Para extraer la sustancia antioxidante seguimos el procedimiento de Gatford (2004). Dado

que las sustancias antioxidantes que queríamos extraer son hidrosolubles empleamos por cada

gramo de inflorescencia de rompesacos (Aegilops geniculata Roth.) 16 ml de agua destilada. La

mezcla se mantuvo en reposo en la oscuridad y a 20º C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo

se filtró (figura 9). El extracto crudo obtenido se empleó directamente en los experimentos.

Figura 9. Procedimiento de extracción de la sustancia a antioxidante. La fotografiá de la izquierda muestra los 30

gramos que se empleaban de inflorescencias, mezclados con 480 ml de agua destilada. La fotografía de la derecha

muestra el proceso de filtración por el cual se separaban la espigas del extracto crudo.

Dado el escaso material recogido, 100 gramos, y las pérdidas que hubo a lo largo de la

experimentación, por fallos en la manipulación o en los aparatos, nos vimos obligados a

complementar los resultados utilizando un antioxidante industrial, el ácido ascórbico. El ácido

ascórbico o vitamina C, es capaz de reaccionar con el oxigeno oxidándose y formando ácido de

dehidroxiascórbico (figura 10). Esta reacción ocurre de forma casi instantánea estimándose que

unos 100 mg de ácido ascórbico consumen aproximadamente unos 10 mg de oxígeno en disolución

(Hidalgo 2002).

Figura 10. Reacción de oxidación del ác.

ascórbico. Tomado de Cubero et al 2002.

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3.3 Método empleado para determinar el consumo de oxígeno, en las semillas de trigo,

en el momento de la hidratación.

Como podemos ver en el gráfico que se muestra a continuación (figura 11) cuando una

semilla se pone en contacto con el agua, su periodo de hidratación se eleva a unas ocho horas.

Durante este tiempo se produce un aumento de su actividad metabólica (Öpik 1983).

Figura 11. El gráfico muestra la respiración

en cotiledones de judía (Phaseolus vulgaris)

en relación al contenido hídrico de la semilla.

Tomado de Öpik 1983.

El propósito de experimento fue valorar el consumo de oxigeno de las semillas de trigo al

inicio de la hidratación, cuando esta se producía en agua destilada y en el extracto antioxidante.

Para este experimento usamos un sensor de oxígeno disuelto PASCO-2108 ( figura 12 y 13).

El sensor de oxígeno se pone en contacto con el ordenador a través de un interfaz. A continuación se

calibra, para ello introducimos en un matraz aforado 400 cc de agua destilada a una temperatura de

20º C y una presión de 760 mm Hg (que se pone por defecto) de acuerdo a unas tablas contenidas

en el manual del aparato. En estas condiciones el contenido de oxígeno del agua es de 9,1 mg de O2

por litro de agua destilada. A continuación iniciábamos la lectura a la vez que introducíamos 100

gramos de semilla de trigo en el matraz. El experimento finaliza cuando las semillas acababa de

consumir todo el oxigeno disuelto. A continuación se volvía a repetir el experimento sustituyendo

los 400 cc de agua destilada por el extracto de Aegilops geniculata Roth.

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Figura 12. Diseño experimental para determinar el consumo de oxigeno de las semillas de trigo cuando se ponen en

contacto con agua destilada: 1, matraz aforado que contiene las semillas en agua; 2, aparato para baño maría a 20º C ; 3,

sensor de oxigeno disuelto, la boca del matraz se cerraba con film plástico; 4, interfaz ; 5, ordenador ; 6, monitor donde

se mostraban los datos en forma numérica y gráfica.

Figura 13. Fotografía del sensor y esquema donde se reproduce las reacciones que tienen lugar en él. T .El fundamento

de este aparato se basa en que cuando el oxigeno disuelto atraviesa una membrana de silicona y se pone en contacto con

una disolución electrolítica en las proximidades de un cátodo de platino (con exceso de electrones), el cátodo induce la

reducción del oxigeno disuelto formando ion hidroxilo (OH-):

O2 + 2H2O + 4e- 4 OH- (potencial de reducción = 0,4 V)

El ion negativo hidroxilo se difunde hacia el anodo de plata reaccionando con él y formando un oxido de plata, a la vez

que libera a los electrones que producen una corriente en el electrodo. Esta corriente es amplificada informándonos, en

un monitor, del oxigeno disuelto en miligramos por litro en función de la corriente eléctrica que circula.

4 Ag + 4 OH- 2 Ag2O + 2H2O + 4e- (potencial de reducción = 0,343 V)

Tomado del manual del aparato. .

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3.4 Método empleado para valorar la liberación de CO2 , en las semillas de trigo, a las

cuarenta y ocho horas de la hidratación.

El experimento se iniciaba poniendo las semillas de la experiencia anterior veinticuatro

horas en agua destilada. Para que no les faltara oxígeno, durante este tiempo se conectaba el matraz

que las contenía a una bomba de aire (figura 14).

Figura 14. Bomba de aire conectada al erlenmeyer

que contiene 500 cc de agua destilada con 100 g de

semilla de trigo a temperatura ambiente.

Transcurridas las 24 horas, filtrábamos el agua y poníamos las semillas dentro de un matraz

aforado. Este matraz formaba parte del aparato de Pettenkofer (figura 15).

Figura 15. Esquema del aparato de Pettenkofer

(Fernández 1986). Este método consta de tres

botellas conectadas entre si por tubos de silicona a

través de las cuales circula una corriente de aire .

La primera botella contiene hidróxido sódico al

25% , la función que tiene es retener el CO2 que

hay el aire que entra en el circuito. La segunda

botella almacena 100 gramos de semillas que en la

respiración liberan CO2. Este anhídrido carbónico

liberado por las semillas pasa a una tercera botella

que contiene hidróxido de bario 0,1 M, el cual

reacciona con el CO2 de las semillas, resultando

carbonato de bario (BaCO3).

Ba(OH)2 + CO2 BaCO3 + H2O

Después de un tiempo determinado se recoge de la tercera botella una alicuota de 62 ml de solución y se titula

con ácido clorhídrico 0,1 N hasta la neutralidad.

Ba(OH)2 + 2 HCl BaCl2 + 2 H2O

El volumen de ácido clorhídrico gastado esta relacionado con la intensidad con la que el CO 2 ha sido fijado por

la disolución de Ba(OH)2 . Este volumen es usado para calcular la actividad respiratoria de las semillas y fijar el CO2 del

proceso respiratorio, usando la siguiente ecuación.

Actividad respiratoria = N x D x 22 = miligramos de CO2 . 100 g-1 semillas. hora-1 (Müller, 1964)

N es la normalidad del ácido usado (HCl 0,1 N); D es la diferencia entre el volumen gastado de HCl para titular hasta la

neutralidad la disolución de Ba(OH)2 control, sin las semillas y el volumen de HCl usado para titular hasta la

neutralidad la misma disolución de Ba(OH)2 pero que se ha usado para medir la actividad respiratoria de las semillas;

22 es la normalidad del CO2. El resultado es expresado en miligramos de CO2 .100 g-1 semillas. hora-1.

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El aparato de Pettenkofer usado por nosotros fue modificado con el propósito de limitar el

volumen de aire que circulaba por él (figura 16).

Figura 16. Aparato de Pettenkofer modificado.

Las lineas rojas indican los tubos por donde sale

el aire de la bomba señalada con el número (1) .

Las llaves de paso (2) permiten hacer circular el

aire durante 10 minutos por el matraz que

contiene NaOH (4) dejando el circuito limpio de

CO2. A continuación se inicia el experimento

haciendo circular el aire por el matraz que

contiene Ba(OH)2 (3). El hidróxido de bario es

tóxico para las semillas por lo que es necesario

que el aire que sale de este matraz pase por un

filtro de agua destilada (5). El aire finalmente

pasa por el matraz que contiene las semillas (6).

Para mantener la temperatura constante a 20º C

se empleo un aparato de baño maría (7). La

linea azul indica el camino de regreso del aire al

compartimento de la bomba (1). El aire pasa por

un matraz que contiene agua destilada (8) que

en un experimento posterior sería sustituida por

el extracto con sustancia antioxidante. Al llegar

a la bomba se volvía a repetir el circuito. De esta

manera durante 24 horas.

En esta experiencia el ambiente intergranario es gaseoso. Por tanto el oxígeno contenido en

el circuito sirve tanto para la respiración de las semillas como para oxidar la sustancia antioxidante.

Para ello calculamos cuanto oxígeno contenía el aparato que habíamos diseñado aplicado la

siguiente formula:

p (densidad de gas); P es la presión en atmósferas (0,21 atm); PM es el peso molecular del gas (32

g/mol); R constante universal de los gases ideales (0,0821 atm.lts/mol.ºK) y T es la temperatura en

grados kelvin (293 ºK). Esto nos da un resultado de 0,28 g/l. Dado que nuestro circuito tenía un

volumen de dos litros y medio, la cantidad de oxígeno era de 700 mg.

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Es evidente que, en las 24 horas que dura el experimento, la cantidad de oxígeno que hay

dentro del circuito va disminuyendo. Según Taylor (1942), cuando las semillas se someten a

concentraciones inferiores de oxígeno, al presente en el aire (21%), se inicia un proceso de

fermentación etílica que libera CO2 (figura 17).

Figura 17. Efecto de la concentración decreciente de

oxígeno sobre la respiración de las semilla de trigo. El

punto de extinción (E.P.) a 16-18% de O2 representa la

concentración de oxigeno por debajo de la cual comienza

la fermentación. Tomado y modificado de Taylor, 1942.

Por tanto, el aparato de Pettenkofer modificado, registraba no sólo el CO2 liberado en la

respiración de las semillas, sino también el que se forma en el proceso de fermentación.

Por último, después del experimento, las semillas del matraz eran puestas a germinar en una

bandeja de poliuretano sobre una base de papel con agua destilada. Para evitar la pérdida de

humedad , la bandeja se envolvía con film plástico . Al cabo de una semana se contabilizaban

cuantas habían germinado y cuantas no (figura 17). La finalidad de esta experiencia era comprobar

que los diferentes lotes empleados, sin sustancia antioxidante, tenían la misma la capacidad de

germinación. En las replicas con sustancia antioxidante, se trataba de ver como afectaba a la

germinación. Según Taylor (1942) el porcentaje de germinación se ve alterado por la caída en la

concentración de oxígeno. Cuando la concentración de oxigeno es inferior al 5% , el porcentaje de

germinación se sitúa entorno al 90% pero si la concentración de oxigeno es inferior al 1%, el

porcentaje de germinación disminuye un 50% .

Figura 17. La fotografía de la izquierda muestra la bandeja con semillas germinadas, la de la derecha cuando se les

quitaba el film plástico y se iban a contabilizar.

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4.- Resultados.

4.1 Resultado del método empleado para determinar el consumo de oxígeno, en las

semillas de trigo, en el momento de la hidratación.

El programa DataStudio funciona a través de un interfaz con la sonda de oxígeno disuelto.

Este programa registra los datos en forma de gráfico y en tabla. Además permite hacer diferentes

tipos de ajustes estadísticos sobre los valores tomados. (figura 18).

Figura 18. Gráficos del

experimento de absorción

de oxígeno disuelto por

semillas de trigo. En el eje

de ordenadas aparece la

concentración de oxígeno

en mg/litro. En el eje de

abscisas aparece el tiempo

en segundos. La línea roja

representa el consumo de

oxígeno. Las coordenadas

del punto que aparece

entre paréntesis es el

tiempo para el cual la

concentración de oxígeno

vale cero. Las tabla que

acompaña a la gráfica

contiene valores

estadísticos. El gráfico

superior corresponde a un

experimento sin sustancia

antioxidante. El gráfico

inferior a un experimento

con sustancia antioxidante

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Al comparar las gráficas de la figura 18, observamos la concentración inicial de oxigeno en

el experimento con agua destilada es más alto (9,1 mg O2/l) que en la gráfica del experimento con

sustancia antioxidante (5 mg O2/l). El tiempo que transcurre hasta que se consume todo el oxígeno

pasa de 8634 segundos, en agua destilada, a 15905 segundos en la sustancia antioxidante. Esto

quiere decir, que el consumo de oxigeno por las semillas de trigo se ralentiza considerablemente al

estar en presencia del extracto de Aegilops geniculata Roth. La tabla que se presenta a continuación

muestra los resultados de las diferentes replicas (figura 19).

réplica con gráficaOxígeno inicial en mg/400 ml

Tiempo transcurrido hasta alcanzar un valor de 0 mg O2

Velocidad de consumo de mg O2/100g de semillas/hora

1ºagua destilada

3,64 mg O2 2 horas y 23 minutos 1,52 mg O2/100g de semillas/hora

2ºagua destilada

3,64 mg O2 2 hora y 4 minutos 1,76 mg O2/100g de semillas/hora

3ºagua destilada

3,64mg O2 3 horas y 20 minutos 1,09 mg O2/100g de semillas/hora

1º sustanciaantioxidante Aegilops

2,8 mg O2 3 horas y 58 minutos 0,91 mg O2/100g de semillas/hora

2º sustanciaantioxidante Aegilops

2,4 mg O2 4 horas y 25 minutos 0,45 mg O2/100g de semillas/hora

Figura 19. Tabla con los resultado de el método empleado para determinar el consumo de oxígeno en las semillas de

trigo en el momento de iniciarse la hidratación con y sin sustancia antioxidante.

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4.2 Resultado del método para valorar la liberación de CO2 , en las semillas de trigo, a

las cuarenta y ocho horas de la hidratación.

Al emplear el método Pettenkofer mostramos en la siguiente tabla (figura 20) los valores

de ácido clorhídrico que necesitamos para titular hasta la neutralidad: la muestra blanco de Ba(OH)2

y la muestra de Ba(OH)2 que había sido expuesta a la respiración de las semillas, así como la

producción de CO2 y la tasa de germinación .

Réplica con Muestra blanco

Muestra usada en el experimento

Actividad respiratoria = N x D x 22 = miligramos de

CO2 . 100 g-1 semillas. 24 hora-1

% de semillas germinadas.

1ºagua destilada

54,6 ml 0,2 ml 119,6 miligramos de CO2 90,5

2º agua destilada

48,5 ml 1,5 ml 103,4 miligramos de CO2 89,9

3º agua destilada

57 ml 0,8 ml 123,6 miligramos de CO2 92,1

1º sustancia antioxidante Aegilops

50 ml 1 ml 107,8 miligramos de CO2 92,6

1º sustancia antioxidante Ác. Ascórbico

45 ml 1ml 96,8 miligramos de CO2 10,3

2º sustancia antioxidante Ác. Ascórbico

45 ml 1ml 97,9 miligramos de CO2 86,3

Figura 20. Tabla con los resultado de el método Pettenkofer empleado para determinar el consumo de oxígeno en las

semillas de trigo a las 48 horas de la hidratación.

Las replicas con ácido ascórbico se hicieron a una concentración de 7 g de ácido ascórbico

en 400 ml de agua destilada. Como cada 100 mg de ác. ascórbico consumen 10 mg de oxígeno y el

circuito almacenaba 700 mg, queríamos dejar el circuito sin oxígeno.

22

5.- Conclusiones.

Las conclusiones que hemos podido obtener al final del trabajo son:

1.- Las sustancias antioxidantes extraídas de la inflorescencia del rompesacos (Aegilops

geniculata Roth.) actúan disminuyendo la cantidad de oxígeno disuelto en agua un 34% , pasando

de 3,64 mg O2/ 400 ml en agua destilada a 2,6 mg O2 en el extracto crudo del rompesacos.

2.- El descenso en la concentración de oxígeno en disolución hace que este gas sea

consumido más lentamente por las semillas. Así en el momento inicial de la hidratación, se pasa de

1,45 mg O2/100g de semillas/hora, en agua destilada, a 0,68 mg O2 en el extracto crudo del

rompesacos. Este hecho confirma la idea de Natella et al. 1999 por la cual la latencia o dormición

de las semillas se consigue porque las sustancias antioxidantes secuestran el oxígeno en el entorno

del embrión impidiendo su desarrollo.

3.- La sustancias antioxidante reducen la cantidad de CO2 liberado, en los procesos de

respiración y fermentación, que tienen lugar en el aparato de Pettenkofer modificado. Los

resultados con agua destilada produjeron una liberación de 115,5 miligramos de CO2 . 100 g-1

semillas. 24 hora-1 . Con sustancia antioxidante procedente de Aegilops geniculata Roth. de 107,8

miligramos de CO2 y con ácido ascórbico de 97,3 miligramos de CO2 .

4.- El método Pettenkofer, en un circuito cerrado de gases, no confirma la idea de Taylor

(1942) de relacionar la tasa de germinación con la fermentación. Se supone que las sustancias

antioxidantes deberían favorecer los procesos fermentativos, al consumir oxígeno, de tal forma que

las tasa de germinación tendrían que ser más baja. Los resultados que hemos obtenido son muy

variables, habiendo resultados de liberación de CO2 similares asociados a tasas de germinación muy

diferentes.

Queda mucho por investigar, desde la purificación de la sustancia antioxidante, hasta la

valoración de su eficacia en el consumo de oxígeno. También habrá que investigar las dosis en las

que se tienen que emplear, para no crear ambientes favorables a una fermentación extrema, que

afecte a la germinabilidad de las semillas. De todas maneras, creemos que el rompesacos y otras

plantas tildadas de “malas hierbas” pueden suponer una fuente barata de sustancias antioxidantes,

que están todavía por explotar, lo que es un argumento más a favor de conservar la biodiversidad en

nuestros campos.

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- http://sigpac.mapa.es/fega/visor .

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CONJUNTO DE VIDEOS REALIZADOS DURANTE EL TRABAJO

Filtración del extracto antioxidante.mpeg

Aparato Pettenkofer con extracto de Aegilops.mpeg

Titulación muestra blanco Ba(OH)2. mpeg

Titulación muestra Ba(OH)2 expuesta a semillas. mpeg

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