DECREASED NUMBER AND IMPAIRED FUNCTIONALITY OFENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS INSUBJECTS WITH METABOLIC SYNDROME: IMPLICATIONS FORINCREASED CARDIOVASCULAR RISK.

Apresentado por:

Jemima Fuentes

DATA: 24/05/10

DECREASED NUMBER AND IMPAIRED FUNCTIONALITY OFENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS INSUBJECTS WITH METABOLIC SYNDROME: IMPLICATIONSFOR INCREASED CARDIOVASCULAR RISK.

I. Jialal, S. Devaraj, U. Singh, B.A. Huet

Atherosclerosis (2010)

The Laboratory for Atherosclerosis and Metabolic Research, Department of Medical Pathology and Laboratory Medicine, UC Davis Medical Center, Sacramento, CA, and VA Medical Center, Mather, CA, United State.

HipertensãoDislipidemia

(↓HDL, LDL,

triglicerídeos)

Glicemia basal

Lakka HM et al. JAMA 2002;288:2706-16.Grundy et al. Circulation 2005; 112 (17): 2735 – 2752. Carvalho MHC et al. Arq Bras Endocrinol Metab 2006;50 (2):304-312.

SÍNDROME METABÓLICA

Obesidade Central

_______________________________________________INTRODUÇÃO

RESISTÊNCIA À INSULINA

DISFUNÇÃO ENDOTELIAL

RISCO DE DOENÇA CARDIOVASCULAR

Insulina ação vasodilatadora,

NO.

EROs

_______________________________________________INTRODUÇÃO

Alberti KGMM et al. Circulation. 2009;120:1640-1645.

_______________________________________________INTRODUÇÃO

Alberti KGMM et al. Circulation. 2009;120:1640-1645.

_______________________________________________INTRODUÇÃO

Células progenitoras endoteliais (EPCs) - Origem

Roura S & Baynes-Genis A. Nat Rev. Cardiol. 2009; 6(9):590.

_______________________________________________INTRODUÇÃO

Células progenitoras endoteliais – Características morfofuncionais

Rafii S & Lyden D. Nature Medicine. 2003; 9: 702 – 712.

Tube formation

_______________________________________________INTRODUÇÃO

↓ EPCs ↑ EPCs

Diabetes

Obesidade

Doença renal crônica

Artrite reumatóide

↑ idade

Risco para doença arterial coronariana

Fatores que influenciam o número de células progenitoras endoteliais

Estatinas

Bloqueadores dos receptores de angiotensina

Agonistas do PPAR gama

O número de células progenitoras endoteliais circulantes é um marcador cardiovascular podendo representar uma

disfunção endotelial ou integridade vascular.

Tousoulis D, et al. Atherosclerosis 2008;201:236–47.Fadini GP, et al. Curr Diabetes Rev 2005;1:41–58.

As células progenitoras endoteliais podem estarnumericamente diminuídas e funcionalmente alteradasem homens e mulheres com Síndrome Metabólica semdiabetes ou doença arterial coronária associada e livresdo uso de medicamentos.

_______________________________________________HIPÓTESE

Avaliar o número e a atividade funcional de célulasprogenitoras endoteliais obtidas de indivíduos comSíndrome Metabólica, livres do uso de medicamentostais como: estatinas, bloqueadores do receptor deangiotensina ou agonista do PPAR gama, bem como,de diabetes e doença arterial coronária associada ecompará-los ao grupo controle.

_______________________________________________OBJETIVOS

_____________________________________________METODOLOGIA

Panfletos e anúncios nos Jornais da cidade de Sacramento

SÍNDROME METABÓLICA*

n= 46

CONTROLEn= 31

• Obesidade central• Hipertensão• Dislipidemia (baixo HDL, alto triglicerídeos)• Hipertensão com uso de anti-hipertensivos.

• ≤ 2 aspectos de SM• s/med. para pressão arterial• Glicose (<100mg/dl) • Triglicerídeos (< 200mg/dl).

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

21-70 ANOS

* Definida utilizando no mínimo 3 dos 5 critérios da NCEP/ ATP III.

Grundy et al. Circulation 2005; 112 (17): 2735 – 2752.

Amostra

CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO:

Diabetes Aterosclerose clínica (CAD, PAD, CVD) Fumantes Hipo ou Hipertireoidismo Má – absorçãoTerapia com anticoagulantes Terapia com esteróidesDrogas anti-inflamatóriasEstatinas e outras drogas hipolipidêmicasAgentes hipoglicemiantesBloqueador do receptor de angiotensinaTriglicerídeos ≥ 400 mg/dl (SM)Contraceptivos oraisUso de suplem anti-oxidantes (últimos 6 meses)GravidezContagem de células sanguíneas anormalConsumo de álcool > 1 dose/diaConsumo de N-3-PUFA

_____________________________________________METODOLOGIA

Pós-menopausa ou em terapia hormonalFeridasRetinopatiaCirurgia recenteDoença inflamatória ou com malignidadeCRP > 10mg/lExercício físico de alta intensidade (> 100min/semana)

_____________________________________________METODOLOGIA

Contagem sanguínea Perfil lipídico e lipoproteico Uréia Creatinina Aspartato aminotransferase Alanina aminotransferase Glicose TSH Dosagem de insulina - ELISA HOMA – IR (glicose/insulina)

Exame físico

Exame Bioquímico

História pregressa

O estudo foi aprovado pelo ConselhoInstitucional da Universidade daCalifórnia.Todos participantes assinaram o TCLE. Os indivíduos selecionados voltarampara a coleta de sangue.

Protocolo

_____________________________________________METODOLOGIA

Quantificação de EPCs por Citometria de Fluxo

1ml

100 µl

Agente bloqueador

Fc

TAMPÃO DE LISE

KDR/PE

CD34/PECy5

CD34+

KDRCONT

FIXAÇÃO EM 1% DE PARAFORMALDEÍDO

AQUISIÇÃO FACScan (FACS array flow)

• Em duplicata• Coeficiente de variação de 11%• C, n=30 e SM, n=46

Sangue heparinizado

Isolamento e Cultura de Células

_____________________________________________METODOLOGIA

4x106

células

20ml

•Revestidas com Fibronectina•Meio 199 +20%SFC+ 100ng/ml VEGF+100U/ml penicilina+100µg/ml streptomicina•48h

Cultura de Células

_____________________________________________METODOLOGIA

•Revestidas com Fibronectina•Meio 199 +20%SFC+ 100ng/ml VEGF+100U/ml penicilina+100µg/ml streptomicina• 7 dias• Triplicata•Troca de meio – 3 dias• Análise citoquímica com Ulex/FITC, Dil – LDL, KDR e CD 31

Células não aderentes

106céls/poço

replaqueadascentrifugadas ressuspensas

Ensaio de unidade formadora de

colônia –Capacidade clonogênica

Ensaio de migração –Capacidade migratória/

angiogênese

Ensaio de formação de tubo –

Capacidade formação de novos

vasos

_____________________________________________METODOLOGIA

Análise Clonogênica – Ensaio unidade formadora de colônia

7 dia106céls/poço

3 poços por indivíduo

Cont, n = 25, SM, n=43

Hamed et al. Cardiovascular Diabetology. 2009;8:56

Ensaio formação de tubo

• Cont, n = 15, SM, n=15

•Placa de 48 poços revestida com matrigel – 30 min a 37 C

• EPCs coradas com Dil-LDL e misturadas a HAEC

• Incubação à 37 C overnight c/ meio de cultura

• Resultado: número de células incorporadas.

Placa 24 poços

Membrana com poro de 8 µm

100 ng/ml de VEGF humano

EPCs (4 x106 céls) marcadas com CFDA (10 uM)

Ensaio de migração – Técnica da câmara de Boyden modificada

_____________________________________________METODOLOGIA

Incubação por 12 hLavagem com PBSLado inferior TRIS – TRITON para lise das células migratórias

Câmara

Cont, n = 16, Mets, n=36

Resultados expressos em MFI

_____________________________________________METODOLOGIA

Análise Estatística

•Dados: média ± SD, mediana e diferença interquatílica (não paramétricos)

• A transformação de LOG foi aplicada antes das análises paramétricas.

• O coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar aassociação entre fatores de risco metabólico, o número de EPC e suafuncionalidade.

• Modelo de regressão múltipla foi utilizado para análise dos preditores davariável dependente EPC. As variáveis independentes analisadas foram:idade, IMC, cintura abdominal, pressão sanguínea, glicose plasmática,triglicerídeos, HOMA-IR, LDL-C, HDL-C e PCR.

• Versão 9.1.3 do SAS (SAS Institute, Cary, NC, E.U.A.).

_____________________________________________RESULTADOS

FL-2-CD34+

CD34+KDR+

FL-2-CD34+

FL-1

-KD

R+

CD34+KDR+

1

Control MetS

Supplement Fig 1: Scatterplots for CD34+KDR+ EPCs from Control and Met S Subjects

CD34-

KDR-CD34+KDR-

CD34-

KDR+

CD34-

KDR-CD34+KDR-

CD34-

KDR+CD34+KDR+

CD34+KDR+

FL-2

-KD

R+

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

Supplement Figure 2a: Staining for Ulex Lectin and DiI-LDL Uptake in EPCs

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

_____________________________________________RESULTADOS

Hipertensão1

Hiperglicemia1

Obesidade1

Dislipidemia1

Síndrome metabólica2

Aterosclerose1

Inflamação2

Tabagismo1

Disfunção EndotelialDisfunção Endotelial ↓ Número de EPCs↓ Número de EPCs

[1] Vasa M, et al. Circ Res 2001;89:E1–7.[2] Fadini GP, et al. Metab Syndr Relat Disord 2009;7:5–10. [3] Pompilio G et al. Int. J. Cardiol. (2009) 131: 156–167[4] Lipsic E, et al. J Am Coll Cardiol 2006;48:2161–7.[5] Sandri M, et al. Circulation 2005;111:3391–9.[6] Schnatz PF. Obstet Gynecol Surv Oct 2006;61:673–81.

_____________________________________________DISCUSSÃO

Estatinas1

Hipoglicemiantes orais2

Agonistas PPAR2

ARBs2

Exercício5

Inibidores da ECA3

Eritropoitina4

Estrogênio6

Função Endotelial/

↑ Mobilização M.Óssea

Função Endotelial/

↑ Mobilização M.Óssea ↑ Número de EPCs↑ Número de EPCs

Número de EPCs circulantes é um indicador independente da saúde cardiovascular.

EPCs X Risco Cardiovascular

•Poucos autores tem analisado o número reduzido de CP e EPCs em indivíduoscom SM. Fadini et al. 2005 em diabéticos e Westerweel et al. 2008 em machosobesos.

•Os indivíduos com síndrome metabólica apresentaram descréscimo do númerode EPCs, não eram usuários de estatinas, ARBs nem agonitas do PPAR gama.Não apresentavam diabetes, doença arterial coronariana nem hipercolesterolemiae eram em sua maioria mulheres (77%).

Satoh et al. 2008 encontrou aumento de EPCs em indivíduos com SM (apósevento coronário agudo). EPCs tinham decréscimo do comprimento do telômeroe aumento do dano oxidativo no DNA, sugerindo uma EPC disfuncional.

[1] Fadini GP, et al. J Am Coll Cardiol 2005;45(9):1449–57.[2] Westerweel PE, et al. Eur Heart J 2008;29:2808–17.[3] Satoh M, et al. Atherosclerosis 2008;198:347–53.

_____________________________________________DISCUSSÃO

Porque escolher as células progenitoras CD34+KDR+ ?

Dois estudos de seguimento:

Werner et al. 2005 - 519 pacientes com DAC (12 meses).

Schmidt-Lucke et al. 2005 – Indivíduos saudáveis e pacientes com eventocardiovascular.

O número de células CD34+KDR+ apresenta correlação negativa com a funçãoendotelial sendo considerado um preditor independente para eventoscardiovasculares, progressão da aterosclerose e morte por complicaçõescardiovasculares.

Glicose plasmática, triglicerídeos e a PCR são variáveis preditoras de reduçãodo número de EPCs (CD34+KDR+).

[1] Werner N, et al. N Engl J Med 2005;353:999–1007[2] Schmidt-Lucke C, et al. Circulation 2005;111:2981–7.

_____________________________________________DISCUSSÃO

Caracterização Funcional da EPCs

Pioneiro na avaliação funcional (ensaios de UFC, migração, tubulogênese) das EPCs em indivíduos com SM x Controles.

↓ número de UFC (SM X Controle)Análise de multivariância: IMC, HDL-C, PCR são preditores independentes para a redução do número de colônias.

George et al., 2004 – Correlação negativa PCR X UFC de EPCs em pacientes com angina instável.

↓ incorporação de EPCs à células endoteliais (tubulogênese) em SM x Controles. ↓ reparo endotelial e da angiogênese em indivíduos com SM.

Análise multivariância: PCR preditor independente para a redução da tubulogênese.

[1] George J, et al. Eur Heart J 2004;25:1003–8.

_____________________________________________DISCUSSÃO

_____________________________________________DISCUSSÃO

PCR

(Biomarcador inflamatório)

Desregulação das EPCs (↓ número e ↓ tubulogênese)

Disfunção endotelial/ altera a atividade eNOS1

↓ Reparo endotelial e regeneração

Contribui para Aterosclerose

Biomediador do processo da doença.

↑ PCR → Disfunção da EPC?

(↓ sobrevida, ↓ função e ↓ diferenciação das EPCs - ↑ EROs) 1

[1] Verma S, et al. Circulation 2004;109:2058–67.

_____________________________________________CONCLUSÃO

O estudo demonstrou pela primeira vez que, indivíduos de ambos ossexos, não tabagistas, usuários somente de medicação anti-hipertensiva, com SM porém sem diabetes, hipercolesterolemia oudoença arterial coronária associada, apresentam diminuição do númeroe alteração da função das células endoteliais progenitoras (EPCs)quando comparado ao grupo controle. Este estudo preenche umalacuna científica sobre a atividade funcional das EPCs em indivíduoscom SM e explica em parte o risco cardiovascular aumentado emindivíduos com SM.