2 Microscopio Óptico Compuesto
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TEMA 3
MICROSCOPIO PTICO
COMPUESTO (campo claro)
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INSTRUMENTOS BSICOS EN
UN LABORATORIO
MO
LUPA
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CONCEPTOS ASOCIADOS AL MO
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AN = n x sen
Apertura numrica (AN):
Expresa el dimetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo.
n = ndice de refraccin del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo
(aire n aprox = 1; vidrio o aceite n = 1.51
sen = semi ngulo del cono de luz que entra al objetivo
Rayo de luz
Cono luminoso frente
al objetivo sen
muestra
AN
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APERTURA NUMRICA
-
APERTURA NUMRICA
-
Resolucin ( R): es la capacidad de un sistema ptico discriminar como entidades distintas dos puntos muy prximos entre si.
R = / 2 AN
R (resolucin, m)
(longitud de onda de la luz empleada) 2 AN (aperturas numricas del objetivo y del condensador
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(a) (b)
Comparacin entre la informacin obtenida en las imgenes tomadas con
un microscopio ptico y uno electrnico con una magnificacin
comparable
(a) Fotografa del tejido muscular esqueltico que se impregno en plstico, se corto a 1 m y se fotografi con un microscopio ptico con una lente de
objetivo para aceite de inmersin. (b) Corte adyacente al empleado para la parte a que se corto a 0.025 m y se examino al microscopio electrnico con una magnificacin comparable a la imagen en a. (CORTESA DE DOUGLAS E. KELLY Y M.
A. CAHILL.)
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Lmite de resolucin (LR): Menor distancia a la
cul dos puntos A y B pueden ser observados de
manera independiente (separados).
A+B
A B
B A
A+B
LR
LR
Lmite de Resolucin= 0.61 / n x sen
AN
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LR= 0.61 / n x sen
-
Factores que afectan el LR
LR= 0.61 / n x sen
Aumento
Longitud de onda
ndice de refraccin del medio
Apertura numrica
AN
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LR depende de:
Concepto inverso al poder de resolucin = un instrumento con gran poder de resolucin
tiene un valor numrico de LR muy pequeo.
- Longitud de onda
- Apertura numrica
(objetivo-aumento)
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PODER DE RESOLUCIN (PR)
Se define como el inverso de la mnima distancia
que tiene que haber entre dos puntos A y B, para que
ambos se observen como unidades independientes.
PR = 1/LR
LR, PR, R son conceptos relacionados
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LR aprox. 0,1 mm
LR= 0,1- 0,2 m
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Conceptos bsicos
x10
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MAGNIFICACIN VS RESOLUCIN
a b
c
Magnificacin
vaca
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PROFUNDIDAD DE CAMPO (PC)
Profundidad de campo: capacidad de ver enfocados
simultneamente distintos planos de la preparacin
o muestra.
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PUNTO FOCAL Y DISTANCIA FOCAL
Punto focal
Distancia focal
Distancia que separa el punto focal del centro ptico de la lente.
Distancia desde la lente frontal del objetivo a la preparacin
enfocada.
Punto donde
confluyen los
rayos luminosos
refractados
despus de
atravesar la lente
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Microscopio ptico compuesto
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Microscopio ptico compuesto-Tipos
MO binocular de visin mltiple
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Partes del Microscopio ptico compuesto
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Sistema ptico: Constituido por dos
juegos de lentes
Lentes Objetivas
(primer aumento)
Lentes Oculares
(segundo aumento )
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Lente objetiva
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Cdigo de color en los objetivos del MO
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ESTRUCTURA DE LOS
OBJETIVOS
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OBJETIVOS SECOS/OBJETIVOS DE
INMERSIN
Difieren por la naturaleza del medio impuesto entre el cubre objeto de la
muestra y la lente frontal del objetivo.
OBJETIVO SECO: medio (aire, n= 1)
OBJETIVO DE INMERSIN: medio (aceite, n= 1,515, semejante al n del vidrio
del porta y cubre objeto)
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Objetivo seco
Objetivo
de
inmersin
-
Objetivo seco
Objetivo
de
inmersin
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El ndice de refraccin de un medio (n), es una medida
para saber cunto se reduce la velocidad de la luz, dentro
del medio transparente en estudio.
n= c/v n= ndice de refraccin
c= velocidad de la luz en el vaci
v= velocidad de la luz en el medio
material transparente
Aceite de cedro 1,515
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Lente ocular
Aumento adicional de la imagen proporcionada por la lente objetiva.
Valores inscritos (10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x).
Ocular Periplan. Diseo avanzado
Otras anotaciones:
UW: Ultra wide, oculares con campo de visin
amplio.
H: alto punto focal (observado con lentes)
Plan-comp: oculares que corrigen curvatura de
campo y dan campos planos
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Lente ocular
CAMPO DEL MICROSCOPIO: crculo visible que se observa
a travs del ocular (general). Rectangular (hematologa y coprologa)
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Sistema de iluminacin
Luz natural
Bombillas de tungsteno y halgenas
Luz artificial
Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz)
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Sistema de iluminacin
http://ofershop.com/microscopios/index.htm
Diafragma o Iris con mecanismo para variar la apertura.
Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (70).
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CARACTERSTICAS DE LA
IMAGEN-MO CAMPO CLARO
Imagen plana (eje x,y)
Imagen aumentada (hasta 1000 x (2000x)
Imagen invertida
Imagen virtual
http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/
40x
Corte transversal msculo esqueltico
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Imagen plana (eje X,Y)
4 5
Y
X
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Imagen aumentada
Primer aumento
(Objetivos) Segundo aumento
(Oculares)
AUMENTO TOTAL = Aumento del objetivo x Aumento del ocular x cte (1)
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Imagen invertida
Que ocurre en los objetivos del microscopio ?????
El objeto (muestra) est colocado un poco ms all del foco.
La imagen ser real e invertida y cada vez ms grande
cuanto ms cerca este el objeto del foco
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http://ofershop.com/microscopios/index.htm
Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????
Lente ocular: Emplea la imagen formada
por el objetivo (imagen intermedia) para
formar una imagen virtual y aumentada
del objeto (muestra).
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Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????
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Formacin de la imagen virtual
Son imgenes subjetivas que no podrn ser recogidas o proyectadas sobre una
pantalla o pelcula fotogrfica.
Son percibidas gracias a la posibilidad que tiene el globo ocular de seguir por detrs del objeto observado, la proyeccin de rayos divergentes y los hace
confluir en la retina para constituir la imagen virtual.
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TERCER SISTEMA DE LENTES
La crnea se comporta como una lente tipo menisco y el cristalino como
una lente biconvexa.
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CALIBRACIN DEL MICROSCOPIO
SE REQUIERE
Micrmetro o
retculo ocular
Micrmetro objetivo
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Micrmetro ocular
Placa de vidrio
Escala de referencia
Micrmetro objetivo
Portaobjeto
5 10
10 div. pequeas
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CALIBRACIN DEL MO http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo2.pdf
Obj. 4x = X m
Obj. 10x = X m
Obj. 40 x = X m
Obj. 100 x = X m
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Clculo de aumentos (MO y fotografa)
ESCALA
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Clculo de aumentos
3 m
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Microscopi invertit
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MICROSCOPIO INVERTIDO
Estructura invertida en comparacin con el MO convencional.
Fuente de luz ubicada por encima de la platina.
Principio de funcionamiento y formacin de la imagen, igual que el MO convencional.
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Usado en la observacin de
cultivos celulares
(clulas vivas) sin
preparacin previa.
APLICACIONES- microscopio ptico invertido
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Alkaline phosphatase activity in a coculture of two intestinal cell lines. Localization
of alkaline phosphatase activity (in red) was identified by cytochemistry in a coculture
of the human intestinal cell lineages Caco-2 and HT29-5M21.
Estudios fisiolgicos 21
22
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Usado en estudios FIV (manipulacin
de vulos).
APLICACIONES- microscopio ptico invertido
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FIV: Microinyeccin espermtica
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FIV: Microinyeccin espermtica Consiste en la introduccin mecnica de un espermatozoide dentro del ovocito
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Ejemplo de microscopio invertido: Microscopio confocal
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ANALISIS DE IMAGEN
+ Cmara de vdeo
+
Imagen ptica u electrnica
directa de los microscopios (imagen analgica= imagen convencional)
Imagen digitalizada
(imagen de pxel)
Sistema electrnico
Se trabaja sobre la imagen
con programas informticos
Microscopio Ordenadores
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ANALISIS DE IMAGEN
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Microscopa virtual: amplio uso en
el diagnstico patolgico
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Microscopa virtual-Aplicaciones
Uso a distancia de recursos interactivos para el diagnstico
y la investigacin
Docencia (acceso a bases de datos remotas de imgenes
microscpicas)
Reconstruccin 3D a partir de mltiples microgrficas.
Permitir compartir bases de datos de las diversas
instituciones
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Microscopa virtual-Ejemplo
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MATERIAL COMPLEMENTARIO
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Partes del MO. Funcionamiento
Relacin de vdeos
http://www.youtube.com/watch?v=AC_X87DexiY&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=0Tunrrm3OlM&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=KzNsuiqW1LQ&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=L6d3zD2LtSI
http://www.youtube.com/watch?v=-A9tVEsTi9w&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=XbLD2zJDEzs&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=dqdKGjG_nR8&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=KfqQErL64cY&feature=related
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TEMA 4
TCNICAS DE PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MO.
APLICACIONES ESPECFICAS DE LA MICROSCOPA PTICA EN
BIOMEDICINA
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USO DEL MO COMPUESTO
Observacin de preparaciones temporales -Directamente de la muestra
clnica
-A partir de cultivos
microbianos
Observacin de preparaciones permanentes
- Citoqumica
- Histoqumica
Observacin directa de clulas vivas Cultivos celulares
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Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas
Espermiograma
6 7
Micosis oportunista
Candidiasis (Candida albicans)
-
8
Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas. Se
realiza un fresco con KOH
Malassezia furfur
Pitiriasis versicolor
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Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas (Hongos dermatofitos de los gneros: Microsporum, Trichophyton, Epydermophytom)
9
Trichophyton mentagrophytes
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Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Tincin Gram (Citoqumica)
Bacillus brevis Bacillus anthracis
12 11
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Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Tincin Hematoxilina-eosina en sangre humana (Citoqumica)
Eje. Tincin de verde malaquita para endosporas bacterianas (Citoqumica)
Endospora
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Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Prueba de Papanicolau (Citoqumica)
15
14
16
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Observacin de preparaciones permanentes Eje. Observacin de tejidos (Histoqumica)
Smooth muscle, muscularis externa of colon, H&E, x132 Ovary, medulla containing multiple blood vessels, H&E, x33
Heart, H&E, x130 Epidermis, H&E, x100
18
19 20
17
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MICROSCOPIOS PTICOS ESPECIALES
Modifican la manera en
que incide la luz sobre el
espcimen: emplea
condensadores o filtros
1
Modifican la fuente emisora
de luz: cambia la luz
blanca por la luz ultravioleta
o rayos lser (tambin emplean filtros)
2
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de polarizacin.
- Microscopio de contraste de fases.
- Microscopio interferencial
o de ptica Kormaski.
- Microscopio de fluorescencia o de
luz ultravioleta.
- Microscopio confocal