2 EXERCICOS PROTEINAS.pdf

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Bioquímica 2013/2014

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Proteínas

Aminoácidos e proteínas - propriedades ácido-base

Níveis de organização

Conformação e estabilidade

1. Considere a estrutura geral de um aminoácido:

a. Organize os seguintes aminoácidos em “famílias” considerando:I. a natureza do grupo R (polaridade)II. os grupos funcionais do grupo R

H2N CH C

H

OH

O

H2N CH C

CH3

OH

O

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

H2N CH C

CH2

OH

O

C

NH2

O

H2N CH C

CH

OH

O

OH

CH3

HN

C

OH

O

Glicina Alanina

Serina

ProlinaTreonina

Asparagina


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3

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH3

H2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

S

CH3

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH2

CH3

H2N CH C

CH2

OH

O

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

NH2

O

H2N CH C

CH2

OH

O

HN

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

Fenilalanina

TirosinaTriptofano

Valina Leucina

Metionina Isoleucina

Glutamina


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4

H2N CH C

CH2

OH

O

N

NH

H2N CH C

CH2

OH

O

SH

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

CH2

NH2

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH

Lisina Arginina

Histidina Cisteína


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2. Considere os seguintes valores de pKa:

aminoácido pKa1 pKa2 pKa3

Asp 1,9 9,6 3,6

His 1,8 9,2 6,0Cis 2,2 10,5 9,0Thr 2,6 10,4 ---

Identifique os aminoácidos A, B, C e D a partir das curvas de titulação. Justifique.

3. Considere a lisina.

a. Indique os equilíbrios ácido-base deste aminoácido (escreva a estrutura de todas as

formas e depois converta-as na forma LHn x+).

b. Calcule a carga formal a pH = 7. Qual a forma que existe predominantemente a este

pH.

c. Qual a direcção de migração quando sujeito a uma electroforese a pH = 11,5 (calcule

o seu ponto isoeléctrico).

4. Os aminoácidos podem ser usados como tampões. Uma solução tampão é aquela

em que o pH não varia apreciavelmente quando se lhe adiciona ácido ou base. A zona

na qual uma dada solução é tampão efectivo é designada por “zona tampão” e é

geralmente definida por pKa ±1.

a. Indique a zona tampão da glicina, histidina, aspartato e lisina.

b. Escolha um aminoácido para tamponizar a pH = 4, 6, 9 e 12.


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c. Uma proteína contendo 110 aminoácidos será melhor ou pior tampão que a solução

de concentração equivalente dos seus aminoácidos constituintes. Justifique.

5. Considere o tripeptídeo Ala-His-Val.a. Escreva a estrutura primária do tripeptídeo. Refira as características desta ligação.

b. Indique os equilíbrios ácido-base (escreva a estrutura primária e depois converta-a

na forma LHn x+).

c. Calcule a pH = 5 e a pH = 9 a percentagem de cada uma das formas e a respectiva

carga formal.

6. A análise qualitativa de um peptídeo revelou a sua composição em aminoácidos

(Ala, Lis, Glu); o resíduo (Ala) foi identificado como sendo o N-terminal e o resíduo (Lis)

como sendo o C-terminal. A sequência de aminoácidos foi determinada efectuando-se

uma titulação ácido-base.

a. Com base na curva de titulação determine o número de aminoácidos do peptídeo e

a respectiva sequência. Justifique.

b. Represente o peptídeo na forma LHn

x+ indicando todos os equilíbrios e respectivos

valores de pKa.


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c. Determine a percentagem do peptídeo desprotonado a pH = 7,0.

d. Se pretendesse separar o peptídeo anterior de um outro com sequência Lis-Glu-Ala

e p.i. = 6,6 que pH escolheria? Justifique.

7. Considere os seguintes peptídeos:

I. Arg-Ala-Ser-Ala

II. Arg-Ala-Ser-Glu

III. Glu-Arg-Ser-Glu

Uma das seguintes curvas de titulação corresponde a um dos peptídeos anteriores (I, II

ou III). Identifique o peptídeo a que esta curva se refere. Justifique a sua escolha.

8. Embora nem sempre seja possível predizer a estrutura tridimensional de uma

proteína a partir da sequência de aminoácidos, é no entanto, possível em certos casos

fazer previsões.

(1) Gli-Ala-Gli-Ala-Gli-Ser-Gli-Ala-Gli

(2) Cis-Ser-Val-Cis-Gli-Ala-Ser-Cis-Glu

(3) Gli-Ser-Gli-Ser-Gli-Ala-Gli-Ser-Gli

(4) Gli-Ala-Pro-Gli-Glu-HiPro-Gli-Ala-HiPro


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a. Qual a estrutura que lhe parece mais adequada para os peptídeos (1), (2), (3) e (4)?

Justifique.

b. Refira as características de cada uma das estruturas identificadas. Dê um exemplo

para cada tipo de estrutura.

9. Considere três proteínas A, B e C em cujas estruturas predominam uma hélice ,

folha e tripla hélice (tipo colagénio). Deduza o tipo de estrutura secundária

predominante nas proteínas A, B e C a partir da composição de aminoácidos.

Proteína A B C

AlaAspArgCisGluGliHisHiProIluLeu

LisMetFenProSerTrpTirVal

29.40.51.3-1.044.60.2-0.70.5

0.3-0.50.312.20.25.22.2

5.07.26.011.212.18.10.7-2.86.9

2.30.52.57.510.21.24.25.1

10.75.04.5-7.133.00.49.40.92.4

3.40.81.212.24.3-0.42.3

10. Considere o esquema da seguinte proteína:

a. Indique os motivos estruturais presentes.

b. Refira quais as interacções que estabilizam

a estrutura tridimensional das proteínas globulares.


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11. Considere o esquema da seguinte proteína:

a. Indique os motivos estruturais presentes.

b. Qual o nível de organização representado. Justifique.

c. Que aminoácidos espera encontrar no exterior e no interior da proteína. Justifique.

12. A principal força “motriz” no enrolamento das proteínas é o movimento das

cadeias laterais dos aminoácidos hidrofóbicos “para longe” do ambiente aquoso.

Explique.

13. Verificou-se que uma mutação que altera a alanina no interior de uma proteína por

valina conduz a uma perda de actividade. No entanto, a actividade é recuperada

quando uma segunda mutação, numa posição diferente, altera uma isoleucina por

glicina. Explique os factos.

14. Comente as seguintes afirmações:

a. A conformação mais estável de uma proteína do ponto de vista termodinâmico é

aquela que corresponde a um mínimo de energia.

b. Solventes orgânicos desnaturam as proteínas por dificultarem a existência de

interacções iónicas.


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Anexo

Aminoácidos com cadeia lateral apolar

Nome Símbolo

Fórmula de

estrutura Massa (Da)

pK1

(α-COOH)

pK2

(α-NH3)

GlicinaGliG

H2N CH C

H

O-

O

57 2,35 9,78

AlaninaAlaA

H2N CH C

CH3

O-

O

71,1 2,35 9,87

ValinaValV

H2N CH C

CH

O-

O

CH3

CH3

99,1 2,29 9,74

LeucinaLeuL

H2N CH C

CH2

O-

O

CH CH3

CH3

113,2 2,33 9,74

IsoleucinaIleI

H2N CH C

CH

O-

O

CH3

CH2

CH3

113,2 2,32 9,76

MetioninaMetM

H2N CH C

CH2

O-

O

CH2

S

CH3

131,2 2,13 9,28

ProlinaProP

HN

C

O-

O

97,1 1,95 10,64

FenilalaninaFenF

H2N CH C

CH2

O-

O

147,2 2,20 9,31


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11

TriptofanoTrpW

H2N CH C

CH2

O-

O

HN

186,2 2,46 9,41

Aminoácidos com cadeia lateral polar sem carga a pH 7

Nome SímboloFórmula deestrutura

Massa(Da)

pK1 (α-COOH)

pK2 (α-NH3)

pk3 (R)

SerinaSerS

H2N CH C

CH2

O-

O

OH

87,1 2,19 9,21

TreoninaThrT

H2N CH C

CH

O-

O

OH

CH3

101,1 2,09 9,10

AsparaginaAsnN

H2N CH C

CH2

O-

O

C

NH2

O

114,1 2,14 8,72

GlutaminaGlnQ

H2N CH C

CH2

O-

O

CH2

C

NH2

O

128,1 2,17 9,13

TirosinaTir

Y

H2N CH C

CH2

O-

O

OH

163,2 2,20 9,21 10,46(fenol)

CisteínaCisC

H2N CH C

CH2

O-

O

SH

103,1 1,92 10,70 8,37(sulfidril)


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Aminoácidos com cadeia lateral polar carregados a pH 7

NomeSímbolo

Fórmula deestrutura

Massa(Da)

pK1 (α-COOH)

pK2 (α-NH3)

pk3 (R)

Lisina

LisK

H2N CH C

CH2

O-

O

CH2

CH2

CH2

NH2

128,2 2,16 9,06 10,54(ε-NH3)

ArgininaArg

RH2N CH C

CH2

O-

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH

156,2 1,82 8,99 12,48(guanidina)

HistidinaHisH H

2N CH C

CH2

O-

O

N

NH

137,1 1,80 9,33 6,04(imidazol)

ÁcidoaspárticoAspD

H2N CH C

CH2

O-

O

C

OH

O

115,1 1,99 9,90 3,90(γ-COOH)

ÁcidoGlutâmicoGluE

H2N CH C

CH2

O-

O

CH2

C

OH

O

129,1 2,10 9,47 4,07(γ-COOH)


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Aminoácidos e proteínas - identificação e purificação

1. Supondo que tem uma mistura de Ala, Val, Glu e Lis a pH = 6.

Desenhe a forma de uma tira de papel revelada pela ninidrina (composto que colora asolução) após realização da electroforese. Indique o ânodo e o cátodo, a origem e a

0posição de cada um dos aminoácidos (Nota: calcule a carga formal de cada

aminoácido)

2. Explique brevemente porque é que a maior parte das proteínas globulares:

a. Precipitam a pH baixo.

b. A solubilidade aumenta, depois diminui e finalmente precipitam à medida que a

força iónica aumenta de zero a um valor elevado.

c. Precipitam por aquecimento.

3. Pretende-se purificar uma solução contendo uma mistura de duas proteínas: um

citocromo c (p.i. = 10,6) e uma ferredoxina (p.i. = 3,2). Sabe-se que a massa molecular

do citocromo c é 13.000 e o da ferredoxina é de 6.000.

Que técnicas poderia escolher para separar estas duas proteínas? Qual o princípio base

de cada técnica.

4. Suponha que pretendia separar duas proteínas utilizando, exclusivamente, um

método cromatográfico.

proteína Massa molecular

(kDa)

p.i.

A 220 5,7

B 310 8,5

a. Qual o método mais eficaz para separar as duas proteínas. Justifique.

b. Descreva como procederia experimentalmente para obter as duas proteínas em

fracções separadas. Apresente o respectivo diagrama de eluição.


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5. A solubilidade de duas proteínas em função de (NH4)2SO4 é indicada na figura.

Tendo em conta os dados, como é que procederia para separar as proteínas A e B?

6. Qual o efeito dos seguintes factores na afinidade da hemoglobina pelo oxigénio?

a. Variação do pH de 7,2 para 7,4. Justifique.

b. Variação da concentração de DPG de 2x10-4 para 8x10-4 M. Justifique.

c. Dissociação de 22 nas respectivas subunidades. Justifique.

Nota: Para cada uma das alíneas desenhe a curva de ligação do oxigénio para ambas as

situações.

7. As curvas de ligação do oxigénio de duas hemoglobinas são apresentadas na figura:


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Apesar da curva da hemoglobina X ser hiperbólica e a da hemoglobina Y ser sigmoidal

ambas estão 50 % saturadas a uma pressão parcial de 30 mm Hg.

a. Qual das hemoglobinas tem maior afinidade pelo oxigénio a 20 mm Hg. E a 40 mm

Hg. Justifique.b. Qual das hemoglobinas apresenta maior eficiência em relação à libertação de

oxigénio do sangue arterial (75 mmHg) para o músculo (20 mmHg)? Justifique.

8. A curva de saturação pelo oxigénio é diferente para o sangue fetal e sangue

materno.

a. Qual das hemoglobinas tem uma maior afinidade pelo oxigénio em condições

fisiológicas. Explique.

b. Qual o significado fisiológico desta diferença.

c. Quando todo o 2,3-difosfoglicerato é removido as curvas de saturação são

deslocadas para a esquerda. Qual o efeito do DPG na afinidade pelo oxigénio da

hemoglobina.

d. Indique uma razão para a diferente afinidade pelo oxigénio dos dois sangues.


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Enzimas - cinética enzimática

1. Para estudar o efeito da concentração de substrato na velocidade de uma reacção

enzimática, adicionou-se uma quantidade constante de enzima numa série de misturasreaccionais contendo diferentes quantidades de substrato. A velocidade inicial foi

medida pelo número de moles de substrato consumidas por minuto. De acordo com a

tabela das velocidades iniciais determinadas:

[S](M)

v

(M/min)

1,3x10-5 12

1,5x10-4

452,0x10-4 48

2,0x10-3 60

2,0x10-2 60

2,0x10-1 60

a. Calcule a VMax da reacção.

b. Explique porque razão v é constante para S 2,0x10-3 M.

c. Qual é a concentração de enzima livre quando S = 2,0x10-2 M?

2. Supondo uma enzima que obedece à cinética de Michaelis-Menten:

a. Qual é a Vmax em mol/min se v = 35 mol/min quando S = KM?

b. Qual é o KM desta enzima se v = 40 mol/min quando S = 2x10-5 M?

c. Se I é um inibidor competitivo, com uma constante K i = 4x10-5 M, qual será o valor

de v, quando S = 3x10-2 M e I = 3x10-5 M?

d. Se I é um inibidor não competitivo, com uma constante Ki = 4x10-5 M, qual será o

valor de v, quando S = 3x10-2 M e I = 3x10-5 M?

e. Represente graficamente como seriam as curvas de v em função de concentração de

substrato para esta enzima nas seguintes condições, indicando VMax e KM:

i. na ausência de inibidor;

ii. na presença de inibidor competitivo;

iii. na presença de inibidor não competitivo.

iv. na presença de inibidor incompetitivo.


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3. A cinética de uma dada enzima foi medida em função da concentração de substrato

na presença e ausência de um inibidor I, de concentração 2x10 -3 M. Os resultados

obtidos encontram-se na tabela:

[S](M)

v

(M/min)

v

(M/min)

sem inibidor com inibidor

0,3x10-5 10,4 4,1

0,5x10-5 14,5 6,4

1,0x10-5 22,5 11,5

3,0x10-5 33,8 22,6

9,0x10-5 40,5 33,8

a. Construa um gráfico de Lineweaver-Burk a partir dos dados da tabela. Mostre que se

trata de um inibidor competitivo. Justifique.

b. Calcule os valores de VMax e KM na ausência e na presença do inibidor.

c. Calcule a constante de ligação do inibidor à enzima.

4. Considere os valores das velocidades iniciais de uma reacção enzimática para várias

concentrações de substrato e em presença de um inibidor:

[S](M)

v

(M/min)

v

(M/min)

sem inibidor com inibidor

0,50x10-4 0,42 0,17

0,67x10-4 0,50 0,20

1,00x10-4 0,60 0,24

2,70x10-4 0,66 0,27

5,30x10-4 0,88 0,36

a. Construa um gráfico de Lineweaver-Burk a partir dos dados da tabela. De que tipo

de inibição se trata. Justifique.

b. Calcule os valores de VMax e KM na ausência e na presença do inibidor.

c. Que informação adicional seria necessária para calcular Ki?


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d. Explique como pode determinar K i graficamente.

5. As enzimas são moléculas proteicas que actuam como catalisadores biológicos. De

que modo a temperatura, concentração de enzima, concentração de substrato e o pHinfluenciam a velocidade de uma reacção enzimática.

6. Investigou-se o efeito do pH na constante de Michaelis-Menten (K M) da enzima 6-

fosfogluconato desidrogenase. Utilizando tampões de pH a 7,6 e a 9,0 e mantendo

constante a concentração total de enzima, a actividade da desidrogenase foi medida

espectrofotometricamente seguindo a redução do fosfato de nicotinamida adenina

dinucleotídeo ao comprimento de onda 340 nm. As velocidades iniciais, medidas para

diversas concentrações de substrato, encontram-se na tabela seguinte:

[S](M)

v

(M/min)

v

(M/min)

pH 7,6 pH 9,0

1,74x10-5 74 34

2,67x10-5 85 47

5,26x10-5 98 75

16,66x10-5 114 128

a. Calcule o valor de KM da enzima para cada valor de pH.

b. A que pH a enzima tem maior afinidade para o substrato. Justifique.

7. Considere os seguintes dados:

Proteína subunidades MM(KDa)

ɛ Vol (ml) Abs 410nm

Distânciapercorrida

Citocromo c 1 32 6000 2.5 0.25

Hemoglobina 4 64 9000 1 0.6

Proteínadesconhecida

2 1 cm4 cm

a. Calcule o volume necessário para colocar no gel de SDS 4 ug de cada uma dasproteínas.b. Desenhe o gel de SDS obtido.

c. Calcule a massa molecular da proteína desconhecida considerando os seguintesvalores:


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distâncias percorridas pelos padrões: 80 KDa (1 cm), 50 KDa (2 cm), 40 KDa (3cm), 30 KDa (4 cm), 20 KDa (5 cm);distância total percorrida pelo “sample buffer” percorrida 6 cm

d. O que se pode concluir relativamente à constituição da proteína desconhecida.

e. Suponha agora que tem uma mistura de citocromo c e hemoglobina.f. Desenhe o gel obtido.

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