1_Introdução ao DNA
-
Upload
filippo-pugliesi -
Category
Documents
-
view
48 -
download
3
Transcript of 1_Introdução ao DNA
1
GENÉTICA MOLECULAR
Química
Biologia
Física
Biomol
Biologia Molecular?
Fusão de três áreas da CIÊNCIA BÁSICA
2
Biologia Molecular?
Características Biológicas e Mecanismos defuncionamento das moléculas
Estuda os aspectos físicos, químicos e biológicos das
moléculas principalmente macromoléculas os ácidos
nucléicos e seus produtos, as proteínas
Ciência recente com o início (aproximado) na décadade 50
Uma ciência básica que permitiu grandes avanços emciência aplicada como a Engenharia Genética eBiotecnologia
Parte das metodologias utilizadas em biologiamolecular subsídios para outras áreas comofisiologia, medicina, física, botânica, zoologia dentreoutros
Biologia Molecular?
3
1) Ácidos Nucléicos: Características principais
2) O código genético e controle do fluxo informação genética
3) Introdução ao DNA recombinante
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
1) Ácidos Nucléicos: características principais
•DNA e a informação genética
•A dupla hélice do DNA e o dogma central da
biologia molecular
•Estrutura do DNA
•Topologia do DNA
•Cromossomos, cromatina e Nucleossomo
•Replicação do DNA
•Mutabilidade e reparo de DNA
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
4
•Mecanismos de transcrição em procariotos
•Mecanismos de transcrição em eucariotos
•Processamento de RNA
•Mecanismos de tradução
•Código genético
2) O código genético e o fluxo informação genética
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
3) O controle da informação genética
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
•Regulação gênica em eucariotos
•Regulação gênica em procariotos
•Regulação gênica durante o desenvolvimento
5
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
•Aplicações da biologia molecular
•Técnicas de análise
4) Introdução ao DNA recombinante
• 3 provas teóricas parciais, não cumulativas
• Apresentação de seminário
• Será considerado aprovado o aluno que obtiver a média das
notas maior ou igual a 6.0 e frequência maior ou igual a 75%.
• A disciplina não oferecerá prova substitutiva e sim a possibilidade
de uma avaliação complementar (recuperação). Esta avaliação
englobará toda a disciplina ministrada no período a que se refere.
•Para participar do processo de recuperação o aluno deverá ter
obtido nota final igual ou superior a 5,0 e frequência maior ou igual
a 75%.
•Alternativamente, poderão ser solicitados a realização de
trabalhos de pesquisa extra-classe que contribuirão na média de
avaliação.
AVALIAÇÃO
6
• Prova I – 09/11• Prova II – 07/12• Prova III – 18/01
•Alterações nas datas de prova só serãofeitas mediante situações excepcionais
AVALIAÇÃO
Bibliografia Básica:1. WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; BELL S. P.; GANN A.; LEVINE
M.; LOSICK R. Biologia Molecular do Gene, 5ª.edição, Editora Artmed, 2006
2. WATSON, J. D. ; MYERS, R. M.; CAUDY, A. A.; WITKOWSKI, J. A. DNA recombinante, genes e genomas, 3ª edição, Editora Artmed, 2008
3. LEWIN, B. Genes IX , Editora Artmed, 2008
Bibliografia Complementar1. ALBERTS, B. LEWIS, J.; BRAY, D. Biologia Molecular da
célula, 4ª Edição, Editora Artmed 2004
2. LODISH, H., BERK, A.; MATSUDAIRA P. e colaboradores. Biologia Celular e Molecular -– 5ª Edição, Editora Artmed
BIOLOGIA MOLECULAR - CBNC 22 BIBLIOGRAFIA BÁSICA
7
BIOLOGIA MOLECULAR
O DNA COMO MATERIAL
GENÉTICO
DNA e RNA forma descritos pelaprimeira vez em 1869 por F.Miescher (biólogo suíço)
Isolou um material contendofósforo do núcleo das células nopus descartado de bandagenscirúrgicas nucleína
Relatou que o conteúdo donúcleo era constituído de umaporção acídica (DNA) e umaalcalina (histonas)
Friedrich Miescher
Bases Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
8
A composição química do DNA foi
determinada em 1909 pelo médico russo
Phoebus Levene no Instituto Rockefeller
(bases nitrogenadas, açúcar e fosfato) e
demonstra que estes são polímeros, ou
seja, formados por muitas repetições de uma
mesma subunidade.
Em 1929 Levene também estabeleceu que
existia uma diferença química entre os dois
ácidos nucléicos, o DNA e o RNA, termos que
começaram a ser largamente utilizados.
No entanto, Levene morreu em1940, antes
que o significado dessas moléculas fosse
esclarecido.
Phoebus Aaron Theodor Levene
Bases Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Durante muito tempo se acreditou que era impossívelque as características genéticas fossem codificadaspor uma molécula linear simples formado por somente4 nucleotídeos como o DNA
Acreditava-se que ele formava um arcabouço para asmoléculas o qual seria o verdadeiro material genético
Proteínas eram consideradas pela maioria grande maioria da comunidade científica como o provável constituinte genético.
O DNA Como Material Genético
9
Em 1928, Frederick Griffith fez uma sériede experimentos com ratos infectadoscom a bactéria Streptococcus
Griffith tinha duas linhagens da bactériaStreptococcus.
A linhagem S (smooth) – possuia umenvelope de polissacarídeo que tornava aaparência das colônias lisas e brilhantes.
A linhagem R (rough) – as colônias nãopossuíam este envelope e as colôniastinham uma aparência opaca e masrugosa.
Frederick Griffith
O DNA Como Material Genético
O DNA Como Material Genético
10
Princípio Transformante -DNA
Frederick Griffith - 1928
Em 1931 Oswald Avery,Collin MacLeod e MaclynMacCarty deramprosseguimento aosexperimentos de F.Griffith O. Avery C. Macleod M. MacCarthy
O DNA Como Material Genético
Os resultados de seus esforços foram publicadosem 1941
Romperam células S mortas e removeram os lipídeos ecarboidratos
Dividiram o extrato purificado em três frações:
Fração 1 + Protease
Fração 2 + RNAse
Fração 3 + DNAse
11
Qual o componente celular responsável pela “informação”?
Princípio transformante - Griffiths
O DNA Como Material Genético
Avery, MacLeod e MacCarty demonstraram que o DNAé o material genético???
Parte do meio científico ainda não ficou convencida...
Acreditavam que o DNA era um catalisador para aativação de genes constituídos de proteínas...
No início dos anos 50 muitos cientistas testavam osbacteriófagos
Sabiam que o vírus injetava “algo” na bactéria quecausava sua propagação
O que era injetado DNA ou proteína?
12
O DNA Como Material Genético
Bacteriófagos vírus que infectam bactérias
Compostos unicamente por DNA e proteína!
Cabeça
Cauda
Fibras da
Cauda
Célula
bacteriana
Fagos
DNA, Proteína ouDNA
+ Proteína?
Cabeça
Cauda
Fibras da
Cauda
DNA, Proteína ouDNA
+ Proteína?
Microscopia eletrônica de transmissão do
fago T2 infectando E. coli. O fago T2
utiliza parte da cauda para injetar seu
material genético na bactéria
Bacteriófago T2
Infectando uma
célula de E. coli
Bacteriófago T2
Injeção do
material genético
Propagação
Lise
O DNA Como Material Genético
Ciclo lítico de um bacteriófago
*Existe também um ciclo denominado delisogênico o material genético do vírus éincorporado ao do hospedeiro
13
O DNA Como Material Genético
Após o fim da segunda guerramundial (08/05/1945), diversosfísicos que haviam trabalhadoanteriormente com energianuclear estavam migrando paraa biologia
Martha Hershey e Alfred Chase
Eles começaram a trabalhar com bactérias ebacteriófagos (ou fagos), o que posteriormenteajudou a fundar a BIOLOGIA MOLECULAR!
Em 1952 Hershey e Chasedemonstraram o papelessencial do DNA através deexperimentos utilizandoisótopos radiativos
Proteínas do
fago marcadas
com 35S
1.Cultura de bactérias e
infecção por fagos
crescidos previamente
na presença de 35S
2. Agitação da
cultura em um
liquidificador
capsídio se
desprende
3.Radioatividade
encontrada nas
proteínas
5. Radioatividade é
encontrada no
meio líquido
4.Separação
capsídios no meio
líquido bactérias
fundo (sólido)
O DNA Como Material Genético
O experimento de Hershey e Chase
Centrifugação
Material genético injetado pelo fago é o DNA
14
DNA do
fago
marcado
com 32P
1.Cultura de bactérias e
infecção por fagoscrescidos previamentena presença de 32P
2. Agitação da
cultura em um
liquidi.
capsídio se
desprende
3.Radioatividad
e encontrada
no DNA
5. Radioat. é
encontrada
no meio
sólido
4. Separação
capsídios no
meio líquido
bactérias
fundo (sólido)
O DNA Como Material Genético
O experimento de Hershey e Chase
Radiação encontrada no interior das bactériasMaterial genético injetado pelo fago DNA
Centrifugação
15
PROVA DEFINITIVA
DNA É O MATERIAL GENÉTICO
Em 1952 quando foi provada que a molécula deDNA era realmente a detentora da informaçãogenética começou-se a dar importância às suascaracterísticas químicas e estruturais
Muitos trabalhos que haviam sido negligenciadoscomeçaram a mostrar sua importância
Em 1938, o físico britânico William
Thomas Astbury (1898-1961),
discípulo de Lawrence Bragg, é o
primeiro a estudar o DNA pela
cristalografia por raio X e a
estabelecer que sua estrutura
apresenta a forma de um longo
filamento
William T. Atsbury
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
16
Início da década de 1950 Alexander
Robertus Todd, químico orgânico
(Cambridge), determinou como eram
constituídos os nucleotídeos
Alexander Robertus Todd
Nobel 1957
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Os nucleotídeos que compõe o
DNA tem como arcabouço um
acúcar: A RIBOSE é constituída
de cinco carbonos que são
numerados, por convenção no
sentido anti-horário da molécula
de O presente em seu anel
Pentose açúcar que possui
um anel com 5 átomos.
Ligado ao anel há um
grupo fosfato, composto de
um átomo de fósforo ligado
covalentemente a 4
átomos de oxigênio
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
17
Os nucleotídeos possuem:
ligada quimicamente
a um açúcar (pentose) e este a um grupo fosfato.
Uma base nitrogenada
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
As bases nitrogenadas que compõe os nucleotídeospossuem anéis formados por C-N. Entretanto tamanhosdistintos. Pirimidinas possuem um anel enquanto aspurinas ocorre um anel fusionado à outro.
18
Bases Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Uma diferença entre DNA e RNA ...
OH
Desoxiibose
HOH
Ribose
OH
DNARNA
C1’ - Se liga a base
nitrogenada
ERRADO!!!!!
C5’ - Se liga o grupamento
fosfato
C3’ – OH deste carbono é
utilizado na ligação
fosfodiester
Os carbonos com maior
importância estrutural são:
Bases Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Outra diferença entre DNA e RNA ...
19
A.Todd também
concluiu que estes
estavam unidos a
grupos fosfatos nas
posições 3`e 5` das
moléculas de
desoxirribose, o
açúcar do DNA. Essas
ligações recebiam a
denominação de
ligações fosfodiéster.
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Totalmente
diferente
do modelo
anterior ...
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
A ligação
fosfodiester
também
ocasiona uma
polarização da
molécula de
DNA.
Em umaextremidadeela terminacom o grupoP ligado aocarbono 5’
Na outraextremidadetermina comOH (ligado docarbono 3’ )
20
Em 1949 Erwin Chargaff fez uma
descoberta espetacular
Trabalhando hidrólise de DNA com
cromatografia em papel ele determinou
que existia uma relação na proporção
de purinas e pirimidinasErwin Chargaff
DNA
Hidrólise
Nucleotídeos
Cromatografia
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
1) Os nucleotídeos não estão presentes
em quantidades equivalentes (ex: 25%
A, 25% C,...)
A
C
G
T
2) A proporções relativas não são
aleatórias....
Feita a cromatografia e possível
quantificar a quantidade de cada base
Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%
Qual a importância destes dados?
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
21
1) A quantidade de bases púricas e pirimídicas são
equivalentes:
Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%.
Portanto existia uma razão 1 entre purinas e pirimidinas
Como também razão 1 entre A/T e G/C
A (31%)
T (29%)
C (20%)
G (20%)~ 1 = 1
A (31%) + G (20%) ~ 50%
T (29%) + C (20%) ~ 50%
2) Existem uma razão entre determinadas purinas e
pirimidinas:
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
A proporções eram verdadeiras somente para espécie
humana?
Chargaff investigou a proporção para diversas espécies….
A razão 1 entre purinas e pirimidinas Como também razão
1 entre A/T e G/C ficaram conhecidas como Regras de
Chargaff
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
22
Uma vez que sua importância foi reconhecida, além davalorização e reconhecimento dos trabalhos mencionados,começou uma corrida para se a investigar como a moléculade DNA é estruturada.
L. Pauling e Robert Corey CalTech
M. Wilkins e R. Franklin KingsCollege
J. Watson e F. Crick Cambrige
A corrida teve envolvimento devários grupos extremamenterespeitados
Nobel 1954 e 1962
Linus Carl Pauling
Química 1954 -Pesquisa
sobre a natureza da ligação
química e sua aplicação à
elucidação da estrutura das
substâncias complexas.
Paz 1962 - por tentar proibir
o uso das armas nucleares
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Em 1953 Paulingpublicou um artigo emque proponha aestrutura do DNA combase em dadoscristalográficos
Pauling... Duas vezesprêmio Nobel, descobriua ordenação de orbitaisquímicos, a alfa hélicede proteínas...
Até os gênios erram ...
No artigo o DNA possuíauma tripla hélice!!!!!
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
23
Enquanto isso no Kings College…
Gerador
de raios X
Feixe deraios X
Cristal deDNA
(fibras)
Padrão dedifração
Maurice Wilkins e R. Franklin
R. Franklin, sob orientação de M.Wilkins, obtinha o padrão dedifração de cristais de DNA
Difração de raios X de fibras de DNA
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Equipamentos dotamanho deprédios
Geradores de raios-X…
Ou maiores…
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
24
Voltando a Rosalind Franklin e ao padrão de difração obtido
Difração de raios X de fibras de DNAR. Franklin
Padrão sugeria uma molécula helicoidal
Mas nem R. Franklin nem seu orientador M. Wilkinssouberam interpretar os resultados...
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Neste mesmo ano (1953) JamesWatson e Francis Crick visitaram olaboratório de M. Wilkins e R.Franklin...
E proporam uma teoria utilizando os dados de Franklin....
Analisaram os difratogramas…
James Dewey Watson e Francis Crick
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
25
A interpretação
James Dewey Watson e Francis Crick
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
26
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Micro () = 10-6
Nano (n)= 10-9
Angstrons (Å) = 10-10
Pico (p)= 10-12
Femto (f)= 10-15
Atto (a)= 10-18
Zepto (z)= 10-21
Algumas unidades de medida utilizadas em
trabalhos de biologia molecular
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
A dupla hélice apresenta raio de1nm.
Distância entre as bases de 0.34nm.
Pares de bases em posiçõesequivalentes ocorrem a cada 34nm.
A conformação helicoidal típicaproduz dois tipos cavidades: menor(12 Å) e maior (22 Å)
As bases nitrogenadas pareadas no
centro da molécula e unidas por pontes
de H. Sendo que o pareamento A/T
possui 2 pontes H e G/C três.
Grupamentos fosfato-açúcar do
esqueleto estão posicionados para o
exterior da dupla hélice
27
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Outro observação de Watson e Crick é que as fitas
são antiparalelas
3’
5’
5’
3’
A extremidades 3’ (hidroxila-OH) 5’ (fosfato-P) sãoinvertidas nas duas fitas
O modelo propõe o pareamento entre purinas epirimidinas (A/T e C/G)
Pareamento A/T e C/G): explica as regras de Chargaff!!!!
O pareamento de nucleotídeos semelhantes não se adequaao diâmetro uniforme da hélice de DNA indicado pelosdados de difração Diâmetro da mol.
de DNA (2nm/20 A)
Purina + Purina: muito grandes
Pirimidina + Pirimidina: muito pequenas
Purina + Pirimidina: distância consistente
com os dados de difração de raios-X
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
28
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Space Filling Model=Leva em conta o raioatômico= mais próximodo real
Principais característicasdo DNA descritas porWatson e Crick.
"We wish to suggest a
structure for the salt of
deoxyribose nucleic acid
(D.N.A.). This structure
has novel features which
are of considerable
biological interest...
...It has not escaped our
notice that the specific
pairing we have postulated
immediately suggests a
possible copying
mechanism for the genetic
material."
-James Watson Francis
Crick
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
29
... Now our model for deoxyribonucleic acid is, in
effect, a pair of templates, each of which is
complementary to other . We imagine that prior to
duplication the hydrogen bonds are broken, and the
two chains unwind and separated. Each chain hen
acts as a template for the formation on to itself of a
new companion chain, so that eventually have two
pairs of chains, where we only have one before.
Moreover, the sequence of the pairs of bases will have
been duplicated exactly.....
Um mês depois...
Implicações sem precedentes na história da genética!!!!
Explicaria como a informação genética é perpetuada
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Neste trabalho Watson e Crick propõe que a replicaçãoSEMICONSERVATIVA do DNA
Replicação = construçào de réplicas de uma molécula
Na dupla fita de DNA, uma fita é o exato complemento da
outra
Replicação semiconservativa?
30
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
No momento da divisão celular as fita mãe serviria demolde para a síntese de uma nova fita dupla
A nova dupla fita conteria uma fita recém formada(“filha”) e uma fita velha (“mãe”)
Metade dupla fita = velha/Metade dupla fita = nova semiconservativa (sempre é conservada uma das fitasmãe a cada divisão celular)
Fita
Mãe
MOLÉCULA
FILHA
Fita
Filha
Fita
Mãe
Fita
Filha
Região do DNA parental
Região de replicação doDNA: parental. Novosnucleotídeos são pareadoscom os das fitas parentais
Regiãoreplicada doDNA
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
A genética passaria a tratar as “entitades genéticas” (A/a) como constituintes físicos
Explica como a informação genética é mantida de geração para geração
MOLÉCULA
FILHA
31
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
1) Seria realmente necessária uma fita molde para a síntesede uma nova molécula de DNA?
Arthur Kornberg começou a trabalhar com extratosbacterianos (E. coli) livres de células foi capaz deresponder a primeira pergunta
Arthur Kornberg
Apesar das teorias existiam céticos que questionavam doispontos básicos:
2) A replicação do DNA é semiconservativa?
Em 1954 conseguiu isolar uma novaproteína que era capaz de replicar oDNA na presença de precursores dealta energia. A esta enzima se deu onome de DNA polimerase
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
A enzima só conseguia sintetizar novasfitas de DNA na presença de fitas velhas...
Demonstra a necessidade de fitas mãecomo molde para a síntese de novas fitas
Desoxinucleotídeostri-fosfatados (dATP,dCTP, dTTP e dCTP)
+
DNA polimerase I
+
Fita Molde
Incubação emtubo de ensaio(replicação “invitro”)
Replicas damolécula deDNA
O experimento de A. Kornberg
Arthur Kornberg
Nobel Medicina 1959
32
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
E a replicação semiconservativa???
Muitos não acreditavam que a replicaçãopudesse acontecer como descrito por Watson eCrick.
Célula Parental
Segunda
Replicação
Primeira
Replicação
As fitas parentais seseparam e cada uma servecomo molde para umanova fita complementar
Modelo Conservativo Modelo DispersivoModelo Semi-conservativo
Cada dupla fita novacontém uma mistura departes “velhas”e “novas”
As fitas parentaispermanecem inalteradas eambas as duplas fitas filhassão novas
Três modelos tentavam explicar a replicaçãodo DNA
33
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Em 1958 Matthew Meselson e
Franklin Stahl descobriram como o
DNA se replicava utilizando E. coli.
Como todas as bactérias E. coli
possui um único cromossomo
(principal) circular
Matthew Meselson e Franklin Stahl
Em condições ótimas E. coli se
divide a cada 20 minutos
34
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Centrifugação do
DNA em CsCl
50.000g por 2-3 dias
Cultura em meio
contendo 15N
Cultura em meio
contendo 14N
-Denso
+ Denso
DNA pesado
(contendo 15N)
DNA leve
(contendo 14N)
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Cultura em meio
contendo 15N
Transferência para
meio contendo 14N
Extração do DNA
Centrifugação
20 min. de cultura 40 min. de cultura
20 min. de cultura
apresentava um
DNA de massa
intermediária, uma
mistura de 14N e 15N
40 min. de cultura
apresentava um DNA de
massa intermediária
, uma mistura de 14N e15N e outro com somente14N
35
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Célula Parental
Segunda
Replicação
Primeira
Replicação
Modelo Conservativo Modelo DispersivoModelo Semi-conservativo
Resultado da centrifugação de DNA após 20min de cultura em 14N
Resultado da centrifugação de DNA após 40min de cultura em 14N
X
X
OK!OK!
OK! X
Os resultados de Meselson e Stahl comprovam que a
replicação do DNA é semi-conservativa
36
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos
Rosalind Franklin
Graças descobertas efetudas peladescoberta da estrutura do DNA esuas implicações o pêmio Nobelde fisiologia e medicina de 1962foi para…
Maurice WilkinsFrancis CrickJames Watson
XObtenção dos cristais e padrão de
difraçãoInterprertação da estrutura do DNA e
suas implicações biológicas
DESCRIMINAÇÃO SEXUAL!!!!!!
Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos NucléicosE R. Franklin?
Morreu em 1958 vítima da radiação-X que utilizava emseus trabalhos...
Prêmio Nobel não é póstumo…
Afirmou nunca ter entregue seus dados para Watson e Crick...
Entretanto o trabalho deles se baseou em seus difratogramas..
Wilkins ou Bragg passaram os dados…
37
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Após todos os estudos a comunidade ainda não havia
compreendido como a informação genética poderia estar
contida em um alfabeto de apenas quatro letras:
Mesmo com apenas quatro letras, as posições possíveis
vão depender do tamanho do genoma (4N)- onde N é o
número de letras da seqüência)
Apesar do DNA conter as informações para a construção
de uma proteína estava claro que não era o DNA que
construía
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Diversos trabalhos mostravam a síntese de proteínas em
locais onde não ocorria o DNA
Síntese protéica de eucariotos ocorre no citoplasma*
enquanto o DNA se encontra isolado no núcleo
Deveria haver alguma molécula capaz de transferir a
informação existente no DNA para o citoplasma...
38
As atenções foram concentradas para uma segunda
molécula de ácido nucléico ainda pouco estudada... O
RNA
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Célula de Tetrahimena cultivada
com Citidina radioativa, todo o RNA
sintetizado se encontra no núcleo
(partículas negras)
Célula após doze minutos de
transferência para meio contendo
citidina não radioativa, o RNA se
encontra no citoplasma
Demonstra que o RNA é sintetizado no núcleo e migra
para o citoplasma
Torbjörn Casperson e Jean Brachet, demonstraram que o
RNA esta presente em altas quantidades no citoplasma
DNA RNA
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
O RNA é uma molécula linear, não ramificada, também com
quatro tipos de nucleotídeos unidos por ligações
fosfodiéster 3’ 5’
Possui duas diferenças quanto a molécula de DNA
1) O açúcar é uma ribose que difere unicamente por
possuir uma hidroxila no C 2’
39
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
2) Enquanto o DNA
possui a pirmidina
Timina no RNA existe a
substituição desta base
por uma Uracila, a qual
tem ausência de um
grupo metila no carbono
5 da base nitrogenada.
Os polirribonucleotídeos assim como os
desoxipolirribonucleotídeos podem formar moléculas
dupla fita
Não são usuais, normalmente ocorrem entre duas
partes da mesma molécula de RNA fita simples*
(muitas vezes possuem caráter regulatório)
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Fácil imaginar uma molécula de RNA como a detentora da
mensagem genética para o citoplasma
Em 1958 era de credo geral que a informação presente no
DNA cromossômico, servia de molde para a síntese do
RNA que se deslocavam para o citoplasma e serviam de
informação para a síntese de proteína
F. Crick se referiu a este processo como o DOGMA
CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
40
DNA
REPLICAÇÃO
Tradução
Transcrição
RNA
Proteína
REPLICAÇÃO
Transcrição
reversa
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Filme
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Como a informação era passada do RNA Proteína?
Havia uma teoria simplista que de alguma maneira a
molécula de RNA formava invaginações que reconheceria
o aminoácido e, de maneira também inexplicável, ligaria
uma aminoácido à outro até formar a proteína...
F. Crick de início concordou, mas…
Como uma molécula muito hidrofílica como o RNA poderia
interagir com aminoácidos altamente hidrofóbicos (Gli, Ala,
Val, etc..)
41
Como distinguiria amino ácidos que diferiam por somente
uma grupo metila (Gli/Ala, Val/Leu, e Leu/Iso)
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Gly LeuAla Val
Iso Leu
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
F. Crick propôs que deveria existir uma molécula
adaptadora que era capaz de se ligar ao aminoácido e
também reconhecer as bases no molde de RNA
Anos mais tarde trabalhando com extratos proteicos livres
foi identificada uma molécula que era capaz de se ligar aos
aminoácidos antes que estes fossem incorporados a
proteína
A molécula também era composta por RNA e foi
denominada de RNA Transportador (tRNA ou RNAt)
AMINOÁCIDOTransferido para tRNA por uma classe de
enzimas aminoacil sintetase
Representa cerca de 10% de todo o RNA da célula
42
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
RNA transportadores são pequenas moléculas de RNA, em
a própria seqüência dos nucleotídeos são capazes de
formar pontes de hidrogênio intramoleculares resultando
em um arranjo espacial complexo com estrutura
secundária Braço
aceptor
de AA
Representação linear de um
RNA transportador. As pontes de
H estão em vermelho
Estrtutura tridimensional do RNA
transportados de Phe
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Se o RNA é somente um transportador de AA onde estava
a informção vinda do núcleo que especificava a síntese de
proteínas?
Neste momento as suspeitas da molécula que carregam a
informação recaíram em outra classe de RNA o RNA
ribossomal (rRNA ou RNAr)
Constitui aproximadamente 85 % de todo o RNA presnte
na célula
Entretanto a análise de ribossomos de E. coli e dados de
outros organismos sugeriam que não era o caso
43
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
As moléculas de RNA ribossomomal também formam
estruturas secundárias através de pontes H
Entretanto muito mais complicadas ...
rRNA16S (E. coli) rRNA23S de (E. coli)
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Formando estruturas
tridimensionais de
grande
complexidade ....
Subunidade 16S e 23S do ribossomo de E. coli
44
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
1) Os rRNA de E. coli e diversos organismos são
compostos por duas subunidades diferentes que podem
estar juntas ou separadas no citoplasma. Todas as cadeias
de rRNA das subunidades menores apresentam tamanho
~de 1500bases
2) As subunidades maiores cerca de 3000 bases
3) As cadeias de rRNA apresentam conteúdo de G + C
muito alto
Se sabia que no genoma existia grandes variações na
quantidade de AT/GC o que não se refletia nos rRNAs
Muito uniformes – sabendo que proteínas variam muito
em tamanho era de se esperar ≠s tamanhos de RNA
Muito uniformes
Entretanto a análise de ribossomos de E. coli e dados de
outros organismos sugeriam que não era o caso
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Finalmente células de E. coli
infectadas com o fago T4 forneceram
o sistema para a descoberta da
molécula que continha a informação
para síntese de proteínas
Ao infectar as células o T4 as células
de E. coli cessam a síntese de RNA
endógeno
Sintetizam somente o RNA do T4
Foi constatado que os RNAs de T4 se ligavam a
ribossomos e se posicionavam para se ligar aos tRNAs
O RNA do fago então se desloca na superfície do
ribossomo posicionando suas bases para ligação de
tRNAs
45
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Após demonstrado que este RNA dirigia a síntese de
proteínas foi detectado representantes da molécula em
diversos organismos
Por conta de trazer a informação genética contida no DNA
ele foi denominado de RNA mensageiro (mRNA ou RNAm)
mRNA reponde por somente 4-5% de todo o RNA presente
na célula
Apresenta grandes variações de tamanho o que é
condizente com a variação de tamanho existente entre
proteínas
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Foi negligenciado por sua baixa
abundância. Entretanto um RNA
pode ser lido por diversos
ribossomos
Forma estruturas helicoidais, mas
raramente estruturas secundárias
46
Fluxo da Informação Genética Contida no DNADesta forma os papeis do diversos tipos de RNA foram
elucidados
A informação da molécula de DNA segue o seguinte fluxo:
A transferência da
informação RNA
proteína ocorre no
ribossomo
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Ainda restavam perguntas: como a informação genética
presente no DNA e passada para o mRNA é traduzida?
Deveria haver colinearidade entres as moléculas de mRNA
e as proteínas codificadas por estas
Francis Crick, Sidney Brenner e Charles Yanosfsky fizeram
as primeiras teorias
Grupos de nucleotídeos sucessivos ao longo de uma
cadeia de DNA codificavam AA sucessivos na proteína
47
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Caso dois nucleotídeos = 4 X 4 = 16 possíveis
combinações =16 aminoácidos ?
Caso três nucleotídeos = 4 X 4 X 4 = 64 possíveis
combinações =64 aminoácidos ?
Como apenas quatro nucleotídeos especificam 20
aminoácidos ?
Através de combinações específicas
Quatro nucleotídeos = 4 X 4 X 4 X 4 = 256 possíveis
combinações =254 aminoácidos /
O consenso foi que o mais provável seria uma trinca de
nucleotídeos.
64 aminoácidos?
Algumas trincas deveriam especificar para o mesmo
aminoácido...
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Marshal Niremberg e Heinrich
Matthei trabalhando com
transcrição “in vitro” começaram
a responder as perguntas
rRNA (16 e 23S) + tRNAs + poli Uracila (5’
UUUUUUUU....3’)
Sintetizava peptídeo Phe-Phe-Phe-...
Heinrich Matthei e Marshal Niremberg
48
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Logo após este experimento o
químico orgânico, Har Gobin
Kohrana sintetizou o mRNA 5’
AGUAGUAGUAGU 3’
O poli mRNA AGU resultava em um
peptídeo poliCys
Kohrana fez diversos mRNAs
sintéticos com todas as
possibilidades existentes para as
trincas
Har Gobin Kohrana
Provou que a trinca de nucleotídeos levava a informação
para os 20 AA constituintes da proteína
61 dos 64 grupos de trincas possíveis codificam AA sendo
que a maioria é codificada por mais de uma trinca
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Nobel Medicina 1968
Três trincas não produziam
polipeptídeos
Se adicionadas em alguma
combinação que gerava
polipeptídios fim da cadeia C
As trincas ficaram
denomidas de códons
Códons que
determinavam o fim da
cadeia = códons de
terminação
49
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Quem responde pela
transcrição DNA RNA
Hurwitiz e Samuel B. Weiss
isolaram uma enzima que era
capaz de sinetizar “in vitro”
fitas de DNA utilizando um
molde de DNA e nucleotídeos
trifosfatados
(ATP, CTPG, GTP e UTP)
como precursores
Samuel B. Weiss e Jerard Hurwitiz
Após a síntese a razão AU/GC da fita de RNA era
~igual à razão AT/GC ao trecho de DNA utilizado
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Enzimas capazes de sintetizar moléculas de RNA a
partir de moléculas de DNA são denominadas de RNA
polimerases
A síntese de RNA ocorre sempre em uma direção
fixa iniciando na extremidade 5’ com término em
um nucleotídeo 3’ (5’ 3’)
Em bactérias somente uma RNApol sintetiza as três
classe de RNA. Em eucariotos.... Mais complicado!!!!!
50
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Existe uma polaridade 5’ 3’ na síntese de
moléculas do RNA (e também na replicação do DNA)
Existe polaridade na síntese de proteína ???
Carboxi terminal (C-terminal) Amino terminal (N-
terminal) ou vice versa?
Esta pergunta foi respondida utilizando uma técnica
de marcação radioativa denominada de pulso ou
marcação pulsada
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Cultura de reticulócitos de coelho (eritrócitos imaturos)
produzindo grande quantidade de e - globina
Tratados com Cys (35S) por alguns segundos
Somente Globinas com cadeias completas foram
isoladas e digeridas com Tripsina (K-R)
Deteção de radiação dos fragmentos tripticos
51
Fluxo da Informação Genética Contida no DNA
Região C-
terminal alto
teor de
radiotividade
Região N-
terminal
baixo teor de
radiotividade
Vermelhosem radição
Azulr adioativo
Setas= sítios de tripsina
Síntese proteíca N-terminal Carboxi terminal