PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL HERBA SAMBILOTO (Andrographis paniculata) TERHADAP TUBULUS SEMINIFERUS MENCIT JANTAN THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF SAMBILOTO (Andrographis paniculata) ON MICE SEMINIFEROUS TUBULESDicky M. Rizal 1, Valentina S. Halim2 Bag. Ilmu Faal, Fakultas Kedokteran UGM Program studi Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi UGM1

2

ABSTRAK Sambiloto (Andrographis paniculata) banyak digunakan dalam pengobatan berbagai macam penyakit, antara lain influenza, kanker, anti inflamasi bahkan anti HIV. Namun, efeknya terhadap sistem reproduksi, terutama terhadap sistem reproduksi pria, masih kontroversial. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol herbal sambiloto terhadap tubulus seminiferus mencit jantan dewasa. Penelitian dilakukan dengan menggunakan hewan coba (mencit jantan) sebanyak 5 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 5 mencit jantan dewasa yang di beri makan dan minum secukupnya. Kelompok I adalah kontrol negatif, hanya di beri CMC-Na secara peroral selama 48 hari. Kelompok II, III dan IV adalah kelompok yang di beri perlakuan yaitu pemberian ekstrak etanol sambiloto secara oral selama 48 hari dengan dosis 11,25mg/30gBB; 22,5mg/30gBB; dan 45 mg/30gBB. Setelah pengujian selesai pada masing-masing kelompok , hewan uji di bunuh secara dekapitasi, di bedah dan diambil testisnya serta di awetkan dengan formalin 10%. Analisis dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan analisis histologi tubulus seminiferus, kemudian hasilnya dibandingkan antar kelompok Hasil penelitian ini menunjukkan terdapat kerusakan ringan sampai berat pada masing-masing tubulus seminiferus kelompok uji. Kerusakan ini semakin meningkat seiring dengan kenaikan dosis ekstrak etanol herba sambiloto yang di berikan. Disimpulkan bahwa ekstrak etanol herba sambiloto yang di berikan peroral selama 48 hari pada mencit jantan dapat menyebabkan kerusakan tubulus seminiferus testis pada dosis 11,25 mg/30gBB, 22,5mg/30gBB dan 45mg/30gBB. Kata kunci : Andrographis paniculata, tubulus seminiferus, spermatogenesis

ABSTRACT Sambiloto (A. paniculata) has been used as a herbal therapy for common cold, cancer, anti inflammation, and anti HIV. The effect of sambiloto on reproductive system, especially male reproductive system, is debatable until know. The aim of this research is to evaluate the effect of A. paniculata in mice seminiferous tubules. The mice is grouped into 5 groups. Groups I is a negative control and group II, II and IV is given orally ethanol extract of A. paniculata with the dose 11,25mg/30gHW; 22,5mg/30gHW; dan 45 mg/30gHW during 48 days. After that, the mice were killed with decapitation methode and the testicle were remove in the formalin 10%. Descriptive analysis was done on seminiferous tubules tissue and compared between each groups. This research showed that mild until severe damage of seminiferous tubules in treatment groups were observed compared the control groups. The degree of the damage increase following the dose of ethanol extract of A. paniculata. Key words : Andrographis paniculata, seminiferous tubules , spermatogenesis

Alamat korespondensi : Bagian Ilmu Faal, Fakultas KedokteranUGM Sekip Utara, Yogyakarta E-mail : dickymd@yahoo.com

PENDAHULUAN Andrographis paniculata yang lebih dikenal di Indonesia dengan nama sambiloto (Medicinal herb index in Indonesia,1986) diduga berasal dari daerah Asia Selatan dan Cina, yang di kenal dengan nama Chuan Xin Lian (Behr, 2000) Tanaman ini di kenal sebagai tanaman obat tradisional Cina sejak beberapa ratus tahun yang lalu dan juga telah tercantum dalam Chinese Pharmacopoeia (Behr, 2000) A. paniculata juga dikenal di India sebagai Kalmegh dan juga termasuk sebagai tanaman obat. (Draco Natural Product, 2003). Bagi masyarakat Indonesia, sambiloto di kenal juga dengan nama bidara, sadilata atau takila, sering digunakan sebagai pengobatan tradisional antara lain obat batuk dan penurun panas. Komponen primer A. paniculata adalah andrografolid yang mempunyai rasa pahit, berupa kristal hampir tak berwarna dan berstruktur seperti cincin yang merupakan diterpen lakton. Selain itu homoandrografolid, andrografon, andrografan dan andrografosterin telah berhasil diisoloasi dari akar A. paniculata berupa polimetoksiflavon. Secara spesifik, daun dan percabangannnya mengandung 14deoksiandrografolid (andrografis A), andrografolid (andrografis B) dan neoandrografolid (andrografis C) (Aleason, 2003). Berdasarkan penelitian Rao dkk. (2004), sambiloto juga mengandung flavonoid antara lain 5,7,2',3'tetramethoxyflavanone and 5-hydroxy7,2',3'-trimethoxyflavone (flavonoid and andrografolid). Beberapa penelitian menunjukkan adanya manfaat dari A. paniculata antara lain anti influenza dan anti piretik (Research group of Sichuan Provincial Her Institute, 1973 ) anti HIV secara in vitro (Chan, 2001), hepatoprotektif (Handa, 1990). Studi formal toksikologi hewan dan percobaan klinik pada manusia menyebutkan bahwa andrografolid dan componen lain dari A. paniculata mempunyai efek toksik yang rendah. Pemberian pada kelinci dengan dosis 10 mg/kgBB secara intra vena tidak

menimbullkan respon abnormal kardiovaskuler, tes enzim hati, dan tidak ada abnormalitas pada organ seperti hati, limpa, jantung dan ginjal. Uji toksisitas lain yaitu pemberian andrografolid pada tifus dan kelinci dengan dosis 1 g/kgBB selama 7 hari tidak mempengaruhi berat badan, hitung sel darah dan fungs ginjal (www.altcancer.com/andcan.htm) Sedangkan menurut Burgos et al (2000), efek pemberian A.paniculata terhadap sistem reproduksi pria antara lain telah di teliti untuk organ vas deferens dan testis. Pemberian A. paniculata secara in vitro pada vas deferens tikus coba menghasilkan penemuan adanya blokade terhadap Voltage Operated Calcium channel (VOC) yang mempengaruhi kontraksi vas deferens. Penelitian efek pemberian A. Paniculata terhadap testis menghasilkan perbedaan kesimpulan dari beberapa peneliti. Menurut Akhbarsah (1990) pemberian serbuk daun kering A. paniculata pada tikus albino jantan secara oral dengan dosis 20 mg serbuk setiap hari selama 60 hari menghasilkan penghentian spermatogenesis dan kerusakan tubulus seminiferus testis. Sedangkan pada penelitian lain oleh Burgos (1997) menyebutkan bahwa pemberian ekstrak kering A. paniculata terhada tikus SD selama 60 hari dengan dosis 20, 200 dan 1000mg/kgBB tidak menimbulkan efek toksik terhadap organ reproduksi pria antara lain berat testis, histologi, sel leydig dan kadar testosterona . Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol A. paniculata terhadap tubulus seminiferus mencit jantan.

METODOLOGI PENELITIAN Bahan. Penelitian ini menggunakan hewan coba mencit jantan galur DDI yang berumur 2 bulan dengan berat badan antar 28,8 gram33 gram yang di peroleh dari Pusat Pemeliharaan Hewan Uji Fakultas Farmasi UGM. Ekstrak etanol A. paniculata di dapatkan dari berbagai proses yang

dilakukan di Fakultas Farmasi UGM. Herba sambiloto tersebut diperoleh dari Cangkringan Sleman, Yogyakarta dalam kondisi hampir berbunga. Jalannya Peneltian Mencit dikelompokkan dalam 1 kelompok kontrol dan 5 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan. Kelompok kontrol hanya mendapat NaCl dan makanan yang sama dengan kelompok perlakuan. Kelompok II, III dan IV adalah kelompok yang di beri perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol sambiloto secara oral selama 48 hari dengan dosis 11,25mg/30gBB; 22,5mg/30gBB; dan 45 mg/30gBB. Setelah pengujian selesai pada masing-masing kelompok , hewan uji di bunuh secara dekapitasi, di bedah dan diambil testisnya serta di awetkan dengan formalin 10%, kemudian diproses menjadi

sedaan histologi dengan pewarnaan hematoksilin eosin (Meyer). Pembuatan sedaan histologi di lakukan di Laboratorium Patologi, Balai Penyidik Penyakit Hewan, Wates, Yogyakarta. Analisis dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan analisis histologi tubulus seminiferus, kemudian hasilnya dibandingkan antar kelompok. HASIL DAN PEMBAHASAN Histologi tubulus seminiferus kelompok uji menunjukkan kerusakan ringan dan berat melalui pengamatan dengan mikroskop cahaya dengan pembesara 200x dan 400x. Secara deskriptif, gambaran histologis kelompok control (kelompok I) dapat di baca di tabel 1 sedangkan gambaran histologis tubulus seminiferus kelompok uji (II, III dan IV) dapat di baca pada tabel 2, 3 dan 4.

Tabel 1. Gambaran histolosis tubulus seminiferus kelompok 1 (tanpa perlakuan) Deskripsi Sel spermatogenik Sel sertoli Lamina basalis Jar. intertisial Sel leydig Spermatogonium tidak rusak, spermatosit primer dan spermatid normal dan jumlah banyak, spermatozoa berada dalam lumen tubulus Tidak rusak, zonula ocludens jelas terlihat utuh utuh Jumlah banyak

Tabel 2. Gambaran histologis tubulus seminiferus kelompok 1 (ekstrak etanol sambiloto 11,25 mg/30gBB) Jenis kerusakan ringan berat Sel Spermatogonium tidak rusak, Spermatogonium tidak tusak, spermatosit primer spermatogenik spermatosit primer dan spermatid dan spermatid menghilang, spermatozoa tersebar jumlah sedikit, spermatozoa berada di lumen tubulus dan sebagian tersebar Sel sertoli Mulai lisis, zonula ocludens mulai Lisis lebih parah dari kerusakan ringan lisis Lamina basalis Sebagian kecil lisis Sebagian kecil lisis Jar. intertisial Sebagian kecil lisis Sebagian lisis Sel leydig Jumlah banyak Jumlah banyak

A B Gambar 1. A. Histologi tubulus seminiferus normal kelompok I (100x) B. Histologi tubulus seminiferus normal kelompok I I (200x) Keterangan gambar : 1. tubulus seminiferus normal yang lumen tubulusnya penuh spermatid 2. tubulus seminiferus normal yang lumen tubulusnya agak kosong 3. tubulus seminiferus normal yang lumen tubulusnya dipenuhi sel spermatogenik 4. tubulus seminiferus normal yang cacat karena jaringannya tergores

A Gambar 2. A. Histologi tubulus seminiferus normal kelompok I B. Histologi tubulus seminiferus normal kelompok I Keterangan gambar : 1. spermatogonium 2. spermatosit primer 3. spermatosit primer bermeiosis 4. spermatid 5. spermatid akhir 6. spermatozoa 7. sisa sitoplasma

B (400x) (400x) 8. lumen tubulus 9. nucleus sel sertoli 10. zonula occludens 11. lamina basalis 12. jaringan interstisial 13. sel leydig 14. pembuluh darah

A B Gambar 3. A. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok II (200x) B. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok II (400x) Keterangan gambar : 1. spermatogonium 5. Sisa sitoplasma 2. spermatosit primer 6. Spermatozoa 3. spermatid 7. Lamina basalis 4. spermatid akhir 8. jaringan interstisial 9. Sel leydig

A B Gambar 4. A. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok II (200x) B. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok II (400x) Keterangan gambar : 1. spermatogonium 5. lumen tubulus 2. spermatosit primer 6. sel sertoli 3. spermatid 7. lamina basalis 4. spermatozoa 8. sel myoid 9. sel leydig

Tabel 3. Gambaran histologis tubulus seminiferus kelompok 2 (ekstrak etanol sambiloto 22,5 mg/30gBB) Jenis kerusakan ringan berat Sel Spermatogoinium mulai Spermatogonium menghilang, hanya terdapat spermatogenik menghilang, spermatosit primer beberapa spermatogonium, tidak ada lagi dan spermatid jumlahnya Sangay spermatosit primer, spermatid dan spermatozoa sedikit, terdapat sel multinukleat,spermatozoa tersebar Sel sertoli Lisis, zonula ocludens menipis Lisis, zonula ocludens lisis dan menghilang Lamina basalis menipis Sebagian kecil lisis Jar. intertisial menipis Sebagian kecil lisis Sel leydig Jumlah banyak Jumlah banyak Tabel 4. Gambaran histologis tubulus seminiferus kelompok 3 (ekstrak etanol sambiloto 45 mg/30gBB) Jenis kerusakan ringan berat Sel Sisa sel Spermatogoinium masih sisa sel spermatogenik tersebar spermatogenik disokong oleh lamina basalis, sebagian sisa sel spermatogenik tersebar Sel sertoli Lisis, zonula ocludens lisis Lisis, zonula ocludens lisis Lamina basalis Sebagian besar lisis lisis Jar. intertisial lisis lisis Sel leydig Jumlah banyak Jumlah banyak

A

B

Gambar 5. A. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok III(200x) B. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok III(400x) Keterangan gambar : 1. spermatogonium 7. spermatosit primer mulai lisis 2. spermatosit primer 8. zonula occludens 3. spermatid 9. spermatogonium mulai lisis 4. sel multinukleat 10. jaringan interstisial 5. spermatozoa 11. sel leydig 6. lumen tubulus 12. sel myoid

A

B

Gambar 6 . A. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok III(200x) B. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok III(400x) Keterangan gambar : 1. sisa spermatogonium 2.lumen tubulus yang kosong 3.jaringan intertisial 4.sel leydig

A

B

Gambar 7. A. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok IV(200x) B. Histologi kerusakan ringan tubulus seminiferus kelompok IV(400x) Keterangan gambar : 1. spermatogonium 5. spermatozoa 2. spermatosit primer 6. lamina basalis 3. spermatid 7. jaringan interstisial mulai lisis 4. spermatid akhir 8. sel leydig

A B Gambar 8. A. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok IV(200x) B. Histologi kerusakan berat tubulus seminiferus kelompok IV(400x) Keterangan gambar : 1. spermatosit primer 2. spermatid 3. spermatid akhir 4. spermatozoa 5. lamina basalis yang lisis 6. sel leydig 7. jaringan intertisial lisis

Hasil penelitian ini secara umum menggambarkan adanya kerusakan tubulus seminiferus akibat pemberian ekstrak etanol A. paniculata. Meskipun demikian di dalam tiap-tiap kelompok uji menghadirkan kerusakan ringan maupun berat yang berbeda. Sedangkan tingkatan dosis ternyata mempengaruhi tingkat kerusakan dari tubulus seminiferus tersebut. Hal ini sangat jelas terlihat pada gambaran histologis kerusakan ringan kelompok II dimana terjadi kehilangan yang minimal dari sel-sel spermatogeniknya (spermatogonium tidak rusak, spermatosit I dan II jumlah sedikit spermatozoa masih di lumen tubulus) tabel 2. Kerusakan tersebut nampaknya semakin parah dengan bertambahnya dosis seperti terlihat pada tabel 3. kerusakan ringan kelompok III. Di temui sel-sel spermatogenik mulai hilang, spermatosit I dan II sudah hilang dan terdapat sel multinukleat. Kerusakan tersebut semkin menjadi-jadi pada kelompok IV. Tampak perubahan besar dari gambaran histologi tubulus seminiferus antara lain sel-sel spermatogenik yang hilang atau tersebar. Hal ini juga berlaku pada pengamatan perbandingan kerusakan berat antar kelompok perlakuan. Dimulai dengan masih adanya sel-sel spermatogenik pada

kelompok II, kemudian diikuti oleh kerusakan yang semakin berat pada kelompok III dan berakhir dengan sisa sel spermatogenik yang tersebar pada kelompok IV. Hasil penelitian ini mempunyai sedikit kesamaan dengan penelitian yang di lakukan oleh Akhbarsha dkk (2000), yang juga menghasilkan kerusakan epitelium tubulus seminiferus dan tubulus seminiferus, jumlah sel spermatogenik berkurang, sedikit sel spermatogonium yang berdiferensiasi sempurna dan adanya sel raksasa multinukleat. Penelitian oleh Burgos (1997) menghasilkan kesimpulan yang sangat berbeda yaitu ekstrak sambiloto tidak menimbulkan efek toksisitas subkronik testicular. Hal ini mungkin di sebabkan oleh perbedaan jenis ekstrak yang di ujikan, hewan uji dan berbagai hal lain seperti bibit, lingkungan tempat tumbuh, rekayasa agronomi, waktu panen. Kerusakan tubulus seminiferus yang di timbulkan oleh ekstrak etanol 70% sambiloto pada penelitian ini di mungkinkan oleh adanya beberapa hiptesis. Kemungkinan penyebab pertama adalah efek sitotoksik. Hal ini dapat di amati pada kerusakan sel-sel spermatogenesis mulai dari spermatogonium sampai pada spermatozoa. Agen sitotoksik di

ketahui mempengaruhi rekombinasi meiosis pada epitelium seminiferus yang berisikan spermatogonium, spermatotosit dan spermatid. (Thompson, 2000) Sebagian kecil lamina basalis serta jaringan intersisial yang lisis memperkuat kemungkinan aksi sitotoksik ekstrak sambiloto yang di ujikan. Kemungkinan lain dari penyebab kerusakan tubulus seminiferus adalah pengaruh dari efek anti mitotik ekstrak sambiloto yang di ujikan. Pengamatan yang mendukung kemungkinan penyebab ini berasal dari munculnya kerusakan spermatogonium sampai tahap metafase. Seperti halnya agen anti mitotik yakni kolkhisin yang dapat menyebabkan berhentinya pertumbuhan selsel germinativum. (Kochman, 1998). Kerusakan ini ditandai oleh adanya sel multinukleat pada gambaran histologis testis yang di beri ekstrak etanol sambiloto. Hal lain yang di dapatkan dari penelitian ini adalah tidak terjadinya kerusakan dari sel leydig testis akibat pemberian ekstrak etanol sambiloto. Kemungkinan dari peristiwa ini adalah mekanisme aksi ekstrak sambiloto yang di ujikan tidak mempengaruhi LH dan hormon androgen. Hasil ini sama dengan hasil penelitian dari Behr (2002) yang menyatakan bahwa andrografolid tidak berhubungan dengan hormon androgen. Sedangkan pengaruh ekstrak etanol sambiloto terhadap hormon reproduksi lain yang terlibat dalam proses spermatogenesis yaitu FSH, belum dapat diketahui. Kerusakan proses spermatogenesis pada penelitian ini masih belum dapat menemukan kemungkinan penekanan ekstrak etanol sambiloto terhadap FSH. Menurut peneliti, kerusakan sel sertoli pada penelitian ini akan memberi kontribusi bagi terganggunya proses spermatogenesis, mengingat sel sertoli adalah sel yang mempunyai reseptor buat FSH. Selain itu, kerusakan sel sertoli tentu menyebabkan terjadinya gangguan produksi Androgen Binding Protein (ABP) yang merupakan salah satu produk dari sel sertoli.(Young, 2004) Sehingga meskipun produksi androgen masih normal dalam penelitian ini, tetapi hormon tersebut tidak dapat di manfaatkan dalam proses spermatogenesis

di sebabkan tidak adanya ABP yang bertugas membawa androgen ke intratubuler. (Grover , 2004) KESIMPULAN Ekstrak etanol herba sambiloto yang di berikan peroral selama 48 hari pada mencit jantan dapat menyebabkan kerusakan tubulus seminiferus testis pada dosis 11,25 mg/30gBB, 22,5mg/30gBB dan 45mg/30gBB DAFTAR PUSTAKAAkhbarsha MA and Murugaian P,2000, Aspect of the male reproductive toxicity/male anti fertility Property of Andrographolide in Albino Rats: Effect on the testis and cauda epididymal Spermatozoa, Phytopher. Res.,vol. 14(6):423-435 Akhbarsha, MA, Manivannan B, Hamid KS, Vijayan B,1990, Anti fertility Effect of Andrographis paniculata (Nees) in Male Albino Rats, Ind. J. Exp. Bio, 28 (5) :421-426 Aleason, 2003, Andrographis paniculata, Rich Natural Products files Andrographis paniculata in Depth review in : http://www.altcancer.com/andcan.html Behr, S,2002 , Andrographis paniculata: the Key Facts for therapeutic Use, www. Scientific Affairs.com Burgos RA, Imilan M, Snchez NS, 2000, Hancke JL. Andrographis paniculata (Nees) selectively blocks voltageoperated calcium channels in rat vas deferens. J. Ethnopharmacol.,Jul;71(12):115-21. Burgos, RA, Caballero EE, Sanchez, NS, Schroeder RA, Wikman, GK, Hancke, JL. ,1997, Testicular Toxicity Assesment of Andrographis paniculata Dried Extract in Rats, J. Ethnopharmacol., 58:219-224

Chan, R.S., Ding, L., Chen, G.Q., Pan, QC, Zhao, ZL, Smith, KM,1997, Dehydroandrographolide Succinic Acid Monoester as an Inhibitor Againts the Human Immunodeficiency Virus, Proc.Soc.Exp.Bio.Med, (1):59-66. 1991 Draco Natural products.com, 2003, Plan Now for the Upcoming Cold and Flu season, www.dracoherbs.com, 2 Grover A, Sairam AR, Smith CE, and Hermo L, 2004, Structural and Functional Modifications of Sertoli Cells in the Testis of Adult Follicle-Stimulating Hormone Receptor Knockout Mice. Biology of reproduction, 71, 117129 Handa, SS, Sharma, A.1990. Hepatoprotective activity of Andrographolide Againts Galactosamine and paracetamol intoxication in Rats, Ind. J. Med. Res., 92:284-292 Kochman RH, Chehtrit BE,1998, The effect of colchisine treatment on sperm production and function:a review. Hum. Rep. vol 13 (2) : 360-362 Medicinal herb index in Indonesia, 1986, Andrographis Nees, PT Eisai, Indonesia Rao YK,Vimalamma G,Rao CV, and Tzeng YM, 2004,Flavonoids and andrographolides from Andrographis paniculata. Phytochemistry, August 1; 65(16): 231721. Research group of Sichuan Provincial Her Institute, 1973, Use a. Paniculata I, II and III to treat Acute Infection, Sich. Chin. Herb News, No.12:16,17,40 Thompson, MJ, Abdulrahman S, Baker TG, Rafferty JA, Margisson GP, Bibby MC,2000, Role of O6-alkylguanine DNA alkyl transferase in the resistance of mouse Spermatogenic cells to O6alkylating agents, J. Rep. and Fertil.,119(33):9346

Young J, Chanson P, Salenave P, Nol M, Brailly S, OFlaherty M, Schaison G and Rey R,2005, Testicular Anti-Mllerian Hormone Secretion Is Stimulated by Recombinant Human FSH in Patients with Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism. J. of Clin. Endocrinol. & Metabolism. Vol. 90, No. 2 724-728

Young J, Chanson P, Salenave P, Nol M, Brailly S, OFlaherty M, Schaison G and Rey R,2005, Testicular AntiMllerian Hormone Secretion Is Stimulated by Recombinant Human FSH in Patients with Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism. J. of Clin. Endocrinol. & Metabolism. Vol. 90, No. 2 724-728