1783422030.Guía de laboratorio de Bioquímica 2013A.pdf

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Gua de Laboratorio de Bioqumica General L.D. Caicedo

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GUA DE LABORATORIO DE

BIOQUMICA

Por: Luz Dary Caicedo Bejarano

Universidad Santiago de CaliFacultad de Ciencias Bsicas

Programa de Qumica2013


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INTRODUCCIN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

De: RIASCOS, M. NAVIA, C.G. Prcticas de laboratorio de qumica general. Universidaddel Valle, Departamento de Qumica. 2000.

NORMAS DE SEGURIDAD:

Al llegar al laboratorio, conozca donde se localiza la fuente de agua, la ducha, los

extintores y las salidas de emergencia. Aprenda a usarlos adecuadamente y no dude enutilizar este equipo si es necesario. Es importante reiterar al iniciar la practica delaboratorio los seguros de las puertas que son acceso a las salidas de emergencia.

Utilice la ducha de seguridad si su ropa se incendia o si sobre su ropa se derrama grancantidad de un reactivo corrosivo. Qutese de inmediato la prenda afectada. El pudor nocuenta en ese momento, solo cuenta la rapidez con la cual usted enfrente el problema.

2. Antes de entrar al laboratorio adems de tener presente las normas de seguridad esimportante que lea muy bien la gua, realice un diagrama de flujo y consulte lapeligrosidad y modo de empleo de los reactivos a utilizar. Sea consciente de los riesgosque corre al realizar determinados procedimientos en el laboratorio, sea prevenido y

actu con cautela. Destine una libreta para el curso del laboratorio en la cual consignaratoda la informacin que debe conocer y manejar antes, durante y despus de laspracticas de laboratorio.

3. Vstase adecuada y cmodamente el da de laboratorio. Evite ropa inflamable. Usepantaln largo y preferiblemente de algodn. No lleve anillos ni pulseras durante eltiempo que dure el laboratorio. Pngase calzado con suela antideslizante, no utilicesandalias que dejen los dedos destapados. Si su cabello es largo utilice un gancho parasujetarlo. En todo momento utilice bata de laboratorio completamente abotonada, estapuede protegerlo de algunas quemaduras y evitar que sus ropas se deterioren porsalpicaduras de reactivos. Mantenga y lave su bata de laboratorio aparte de la ropa queusa normalmente.

4. Proteja siempre en forma adecuada sus ojos. El riesgo de una lesin grave en losojos, obliga a que todos (estudiantes, profesores y visitantes) en el laboratorio llevensiempre una proteccin adecuada, desde el inicio hasta el final de la practica. Los ojospueden sufrir daos irreversibles por salpicaduras de reactivos o esquirlas de vidrio quevuelan en un accidente. MANTENGA PUESTAS LAS GAFAS DE SEGURIDAD auncuando usted no este realizando algo peligroso; sus vecinos pueden tener un accidente yafectarlo a usted. Recuerde una pequea gotica de reactivo concentrado puedeocasionarle la perdida de la visin.

En caso de que lleguen salpicaduras de reactivos lave inmediatamente con abundanteagua. Si solo un ojo es afectado, proteja el sano durante el lavado. Abra bien losprpados y mueva el ojo afectado en diferentes sentidos, Avise a su instructor deinmediato y acuda al mdico lo antes posible.


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Nunca use lentes de contacto ya que las sustancias qumicas pueden penetrar porcapilaridad debajo de ellos por lo que no ser fcil de enjuagarlos.

5. Nunca trabaje solo sin supervisin en el laboratorio. No realice ningn experimento sinprevia autorizacin.

6. Mantenga su rea de trabajo limpia, seca y ordenada. Siga cuidadosamente lasinstrucciones para el ensamble de equipo y antes de ponerlo en funcionamiento hagaque su instructor lo revise. Mantenga libros y objetos personales retirados del sitio detrabajo. Ellos pueden interferir su labor y resultar peligrosos, si usted salpica o riega unreactivo lmpielo rpidamente. Provase de un pedazo de dulce abrigo para la limpieza

de las mesas de trabajo.

7. Lea los rtulos de los reactivos cuidadosamente. El uso errneo de sustancias puedecausar serios accidentes. Evite contaminar los reactivos puros. Nunca devuelva elexceso de reactivo a los frascos tome solo la cantidad que usted va a necesitar.

Rotule correctamente los envases de las soluciones preparadas para las practicas y delos desechos producidos en las mismas. El rotulo debe contener en el caso de lassoluciones: Nombre, formula, concentracin, fecha de preparacin y personaresponsable. Y en el caso de los desechos: Nombre practica, fecha, composicin,concentracin, persona responsable.

Los procedimientos para la recuperacin de desechos o su eliminacin previamenteinocuos sern realizados en un trabajo coordinado por su instructor.

8.La mayora de los productos qumicos del laboratorio son txicos; algunos ms txicosque otros como soluciones concentradas de cidos y bases fuertes, corrosivos para lapiel. En el manejo de los productos qumicos, evite el contacto con la piel, ojos y mucosaen todos los casos. Si ocurren salpicaduras sobre la piel elimnelas previamente con untrapo seco y seguidamente lave inmediatamente el rea afectada con bastante agua fra;en el caso de soluciones corrosivas la rapidez con que usted actu es factor importantepara evitar dao en la piel. Debido al peligro de reabsorcin, no use nunca solventesorgnicos en el lavado

9. Evite las chanzas, juegos y manifestaciones de cario y visitas de sus amigos hasta

que termine la practica de laboratorio. No permita bajo ningn motivo la presencia denios en los laboratorios.

10. NUNCA INGIERA COMIDAS O BEBIDAS Y NUNCA FUME EN ELLABORATORIO. Lave sus manos antes y despus de terminada la practica

11. Las lesiones ms comunes en un laboratorio de qumica son las cortaduras yquemaduras. Descarte el material de vidrio que se ha resentido o quebrado y deposteloen el lugar indicado para tal propsito. Pula con fuego las puntas cortantes de tubos yvarillas de vidrio. Nunca intente forzar la entrada de un tubo de vidrio o termmetro por elagujero de un tapn. Previamente asegrese de lubricar con glicerina o agua jabonosa,tubo y agujero. Proteja sus manos con varias capas de toalla o unos guantes resistentesmientras inserta el vidrio o el material cortante en el tapn. Nunca toque con su piel


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mallas de calentamiento, material de vidrio, aros y materiales de laboratorio quepreviamente hayan sido sometidos a calentamiento. Si es necesario hacerlo usteddeber ser extremadamente cuidadoso de lo contrario podra ocasionarle quemadurasmuy graves.

12. Muchos qumicos que usted utiliza son txicos y pueden ocasionarle severasquemaduras en las mucosas si usted los ingiere. Siempre utilice una pera de cauchopara succionar o extraer los lquidos con una pipeta, NUNCA UTILICE LA BOCA NIPRUEBE UN REACTIVO.

13. Cualquier experimento en el cual se puedan producir humos txicos o irritantes,deber realizarse dentro de la campana extractora (revisar su funcionamiento antes deiniciar el procedimiento). Para probar el olor de una sustancia, coloque la boca del

recipiente alejada de su nariz, y con su mano ventilen poco los vapores hacia su nariz.No inhale profundamente, olfatee suavemente.

14. Nunca agregue agua a un cido concentrado. Diluya el cido lentamente adicionandoel cido al agua con agitacin constante. Las bases debern ser diluidas en formaanloga. Nunca mezcle los cidos concentrados con bases concentradas sin tomar lasprecauciones del caso. Recuerde que se produce una reaccin fuertemente exotrmica.

15. Los mecheros pueden causar serias quemaduras. Encindalo solo cuando vaya autilizarlo. Previamente perctese que no hayan lquidos inflamables como alcohol,benceno, ter o acetona. Estos debern encontrarse a una distancia prudencial. Nuncause mechero para calentar lquidos inflamables. Use una malla de calentamientoelctrico, una plancha o un bao mara.

16. Cuando caliente un liquido en un tubo de ensayo, coloque la boca del tubo lejos deusted y de sus vecinos, hgalo en forma suave. Nunca caliente un liquido en unrecipiente completamente cerrado.

17. No agregue residuos qumicos a las canecas destinadas para desechos domsticos.No emplee los vertederos para eliminar todo tipo de desechos como papel, pedazos devidrio, algodn, etc. Nunca arroje en el vertedero lquidos inflamables o voltiles,sustancias corrosivas o compuestos que puedan producir vapores txicos mucho menossustancias slidas.

18. Al finalizar la practica de laboratorio, devuelva todo el equipo desarmado, limpio yseco. Revise que las instalaciones hidrulicas y de gas estn cerradas. Equipos,

campanas de extraccin y extractores de pared estn apagadas.

PLAN DE EVACUACIN

Reconocimiento del lugar: Consiste en identificar los pasillos que conducen a lassalidas de emergencia, revisar que los seguros que tengan se puedan retirar fcilmente ya cual lugar conducen.

2. Trazar la ruta de evacuacin desde la primera puerta hasta el lugar donde las

personas no corran riesgos.


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3. Identificar en el grupo los lideres, estos deben ser personas que no sean nerviosas,requiere personal que acte con calma pero rpido e inteligentemente. Ellos ayudaran acalmar al resto de personas, y a conducirlas en orden por la ruta establecida.

4. Informar el plan al grupo de estudiantes y recomendarles:

Caminar rpido pero NO CORRER.No empujar, ni armar desorden.No gritar, el pnico lo siembra una sola persona y por lo general es contagioso.Bajar con cuidado las escaleras de evacuacin.No cargar implementos innecesarios en el momento de la evacuacin. Estospueden entorpecer el desplazamiento normal.

No devolverse por objetos u otras personas. De las personas que quedan seencargan los lideres. El devolverse puede ocasionarle lesiones fsicasirreversibles incluso prdida de la vida.Personas inexpertas no pueden colaborar, en lugar de ayudar entorpecen lalabor. La mejor ayuda que cada persona puede aportar es evacuar en silenciorpida y ordenadamente.En caso de incendios evacuar de la siguiente manera: De ser posible humedecerun pauelo o trapo y ponrselo en la nariz. Despejar el lugar arrastrndose por elpiso ya que a esta altura hay una capa de oxgeno(esta cantidad de oxgeno estentre el piso y el humo).

REGLAMENTO PARA LA EVALUACIN DEL LABORATORIO

La calificacin correspondiente al trabajo en el laboratorio es individual. Estacalificacin debe ser emitida al final de cada sesin de laboratorio, el estudiante tienederecho a conocerla inmediatamente y a efectuar reclamaciones en caso de no estar deacuerdo con ella. Para colocar esta nota se debe tener en cuenta los siguientes factores:

El estudiante debe conocer, antes de iniciar el curso, el peso que el instructor le dar acada uno de estos factores.

Para emitir la nota de trabajo en laboratorio es indispensable que el instructor

interaccione fuertemente con el estudiante desde la primera sesin de laboratorio. Sinuna fuerte interaccin entre el instructor y el estudiante no se podr emitir unacalificacin correcta.

2. El informe de la prctica de laboratorio debe ser entregado por el estudiante a lossiete(7) das calendario siguiente a su realizacin. Es obligacin del instructor delaboratorio dar a conocer a sus estudiantes la calificacin del informe y lascorrespondientes correcciones dentro de los ocho (8) das hbiles siguiente a la entregapor parte del estudiante.

3. Es obligacin del instructor de laboratorio hacer conocer a sus estudiantes, antes deiniciar el curso, el tipo de informe de laboratorio que exigir y las pautas que seguir ensu calificacin.


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4. El incumplimiento sin causa justificada con las prcticas o no entrega de los trabajosacadmicos exigidos(informes de laboratorio en este caso), dentro de las fechasestablecidas, se sanciona con una calificacin de cero.

5. La copia de un informe de laboratorio de otro del mismo semestre o semestresanteriores, es considerada como fraude y se sanciona con una calificacin de cero, enese informe.

FORMATO DE EVALUACIN DE LA PRCTICA DE LABORATORIO DEBIOQUMICA

LABORATORIO # ___ TEMA: _______________________ GRUPO No. ____

FACTORES DEEVALUACIN

NOMBRES DE LOS ESTUDIANTES QUE ASISTIERON ALA PRCTICA

Destreza experimental1.5 PUNTOSRespuestas orales enclaseOrden y aseo0.5 PUNTOSCumplimiento delhorario0.5 PUNTOSDiagrama de flujo1.5 PUNTOSIniciativa y creatividad

medidas de seguridad1.0 PUNTOBata de laboratorio

Gafas

Otras observaciones

PAUTAS A SEGUIR EN LA PRESENTACIN DE INFORMES DELABORATORIO

Buena redaccin, ortografa, normas generales en cuanto a unidades, abreviaturasentre otras.

1. El informe se presentar en hojas de tamao carta con mrgenes segn las

normas tcnicas de ICONTEC.


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2. El texto se copiar a doble espacio, iniciando los prrafos en el margenizquierdo; las tablas y/o figuras irn numeradas en forma consecutiva connmero arbicos y llevarn un titulo lo ms breve posible. Ej: Figura 1

3. El contenido debe ser claro y conciso con respecto a la explicacin y anlisis delos resultados obtenidos.

4. Todo informe debe incluir:

a. INTRODUCCIN: Comprende el planteamiento del problema, sindesarrollar el tema ni dar conclusiones. Debe destacarse bases tericaso prcticas del trabajo, objetivos, importancia. (vale 0.5/5)

b. PARTE EXPERIMENTAL: Publicar lo realizado, expresando en suspropias palabras (Se aclara que no es transcribir el procedimiento queaparece en las guas de laboratorio), indicando las variaciones a lasguas que se hayan tenido que hacer en el proceso. Los datos debenpresentarse en forma tabular donde sea permitido y tener en cuenta lasunidades SI para las mediciones. (Vale 1.0/5)

c. RESULTADOS Y DISCUSIN: Esta es la parte ms crtica de suinforme. Recuerde que cada supuesto realizado debe ser explicado.Deben aparecer las ecuaciones que haya aplicado. Recuerde que losdatos y resultados deben ir acompaados de sus unidades y reportarseen forma tabular o grfica donde sea necesario. (Debe escoger la mejor

representacin). La discusin debe realizarse de acuerdo a losresultados obtenidos en la prctica, haciendo un anlisis y dando lasposibles fuentes de error. (Vale 2.0/5)

d. CONCLUSIN: Ser el balance final de las prctica o investigacin. Sepresentaran en forma lgica, clara y concisa los resultados de la misma.Un ltimo punto son las causas de error analizando su efecto sobre losresultados obtenidos. (Vale 0.5/5)

e. ANEXO: Generalmente los informes tienen preguntas de consulta, aqudeben aparecer estas respuestas. (Vale 1.0/5)

f. NOTA: Durante todo su informe deben aparecer las llamadas para sus

citas bibliogrficas con nmeros arbigos en forma exponencial con loque dar los crditos respectivos en la seccin de bibliografa, que es laltima parte de su informe, la cual es obligatoria.

g. BIBLIOGRAFA: Segn las normas de ICONTEC para libros con autor,libros con editor, publicaciones seriadas y normas tcnicas.


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COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA

De: PRIETO, S., AMICH, S., SALVE, M.L. Laboratorio clnico, principios generales. McGraw-Hill, Interamericana. 1. edicin. 1997.

FUNDAMENTOS TERICOS

1. INTRODUCCIN

1.1.1 Naturaleza de la radiacin electromagntica

La radiacin electromagntica es una forma de energa radiante. Tiene propiedadesondulatorias, propagndose en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio sedefinen:

Longitud de Onda (): Se define como la distancia entre dos mximos de un ciclocompleto del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, segn el SistemaInternacional de Unidades (SI), en nanmetros (nm, 10-9 m). Se pueden encontrar

otras unidades, ya obsoletas, que serian ngstroms (A) y milimicras(m). La relacinentre estas medidas es:

1nm =1m = 10 A = 10 9m

Frecuencia (): Es el numero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud deonda:

c

Siendo c = velocidad de la luz.

La luz esta formada de fotones, paquetes discontinuos de energa. La energa de unfoto depende de su frecuencia y de su longitud de onda:

ChhE

**

Siendo h = constante de Plank (6,62* 10 27erg/seg)

Como se puede observar en la relacin anterior, la relacin entre la longitud de onday la energa de una adicin electromagntica es inversa, de manera que cuantomayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energa.


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El espectro electromagntico cubre un amplio intervalo de energa radiante,incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta ondas de radio,de longitud de onda larga.

El espectro electromagntico se divide en regiones que abarcan intervalos delongitudes de onda ms estrechos

ESPECTRO ELECTROMAGNTICO

RayosGamma(R8)

Rayos X Ultravioleta(UV)

Visible Infrarrojo(IR)

Microondas

Longitud deOnda (nm)

0,1 1 180 390 750 400*10

Longitud de Onda Nombre de la regin Color absorbido Color complementario180-220 UV corto No visible -------------220-340 UV No visible ------------340-430 Visible Violeta Amarillo-verdoso430-475 Visible Azul Amarillo475-495 Visible Verde-azul Naranja495-505 Visible Azul-verde Rojo

505-555 Visible Verde Prpura555-575 Visible Verde-amarillo Violeta575-600 Visible Amarillo Azul600-620 Visible Naranja Azul-verde620-700 Visible Rojo Verde-azul

1.1.2 Descomposicin del espectro en colores y sus complementarios.

El ojo humano responde a la radiacin electromagntica entre los 380 y 750 nmaproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestralimitacin. y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) ymenores (UV).

La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiacionesde distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como blanca.

En la regin visible, la luz se descompone en colores y sus colores complementarios. Sihacemos incidir un haz de luz blanca sobre una solucin que absorbe luz a una longitudde onda determinada, esta transmitir todas las dems longitudes de onda, apareciendoa la vista del color complementario al que corresponde a la longitud de onda absorbida.

En consecuencia, una luz que se observa de un color determinado al ojo humano,deber ser iluminada para las mediciones fotomtricas con un haz de luz de longitud deonda del color que absorbe, es decir, el complementario.

Ejemplo: una solucin de color rojo se irradia con una luz de aproximadamente 500 nm.


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1.2 Fenmenos de interaccin entre luz y materia

Cuando se produce una interaccin entre un haz de luz y la materia, se producen, entreotros, fenmenos de absorcin o emisin energtica.

1.2.1 Proceso de absorcin. Cuando una pelcula, que se encuentra en estado dereposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe energa, y pasaa lo que se denomina estado excitado.

En la partcula se producen cambios que dependen de las caractersticas de la propiapartcula (tipo de enlaces, etc.)y de la energa (longitud de onda) de la luz queinteracciona.

La partcula en estado excitado tiende a regresar espontneamente a su estadofundamental, desprendiendo la energa absorbida en forma de calor:

calorAAhA 00 **

Siendo A0= absorbente en estado fundamentalA*= absorbente en estado excitadoh* =energa del fotn absorbidoh= constante de Plank= frecuencia de la radiacin

1.2.2 Espectro de absorcin. Cada especie absorbente(cromgeno) tiene lo que se

llama un espectro de absorcin caracterstico. Este espectro representa la relacin entrela longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solucin de la especie,en condiciones definidas de trabajo. Al grafico que resulta de representar en un eje decoordenadas absorbancia (ordenadas) frente a excitacin de onda (abscisas) es a lo quellamamos espectro de absorcin.

Los espectros de absorcin son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de ondams adecuada para una medida cuantitativa (excitacin de onda a la que la excitacin esmxima), como para fines de excitacin cualitativa.

Proceso de emisin. Algunos compuestos tienen la excitacin, tras ser excitados, deretornar a su estado fundamental, excitacin una emisin de energa radiante. La luz

emitida se puede medir, y ello consiste el principio de algunas tcnicas, como laFotometra de llama, o la Fluorescencia.

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0 *0** hAAhA

Siendo A0= absorbente en estado fundamentalA*= absorbente en estado excitado

1*h = energa de excitacin

2*h = energa de emisin


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1.3 Espectrofotometra de absorcin

La espectrofotometra de absorcin consiste en la medida de la radiacin que llega a undetector tras producirse un fenmeno de absorcin de luz por parte de una sustanciaabsorbente. En qumica clnica, el material en estudio es generalmente una solucin, ylas medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y800nm

La expresin determinacin fotomtrica se defini originalmente como la medida deuna intensidad de luz, sin tener en cuenta la longitud de onda; por otro lado, sedenominaron determinaciones espectrofotomtricas a aquellas que median laintensidad de la luz en un espectro de longitudes de onda mucho ms estrecho.

Hoy da, ya no constituyen una base valida para la distincin entre fotmetro yespectrofotmetro la longitud de onda de medida: ambos aparatos se distinguen por elsistema que poseen para seleccionar la longitud de onda medida; as, se conoce comofotmetro o colormetro a aquel que emplea filtros, mientras que el espectrofotmetroes aquel que emplea prismas o redes de difraccin.

Las determinaciones espectrofotomtricas han tenido un gran auge en los ltimos aos.Sus principales ventajas son la sensibilidad relativamente elevada, la facilidad con quepermiten realizar determinaciones rpidas, y un grado de especificidad relativamentealto. Todo esto, unido a su adaptacin en los auto analizadores, la hacen tcnicaimprescindible hoy por hoy en el laboratorio clnico.

2. LEYES DE ABSORCIN

Cuando un haz de luz de intensidad lo incide sobre una cubeta cuadrada quecontiene una solucin coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, seproduce en la solucin un proceso de absorcin, y el haz de luz que sale despus deatravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is:

Se define como transmitancia la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida:

T= Is/Io

En la practica se define el porcentaje de transmitancia:

% T= Is/Io *100

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar as solo laabsorcin del compuesto de inters, hay que hacer una primera medida con unasolucin de referencia o blanco, que contiene todos los posibles compuestos queparticipan en la lectura, menos el compuesto a medir.

Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a que esta medidainicial, y se deben hacer en la misma cubeta que se utilizo para la medida del blanco.


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El valor experimental de la transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la relacin entrela concentracin de una solucin y su transmitancia es inversa y logartmica yconcentracin mientras que la relacin entre la absorbancia y la concentracin esdirectamente proporcional:

TTIoIsA /1log%log/log

TT

log100log%

100log

TA %log2

De esta relacin matemtica se deduce que la relacin logartmica entre A y %T se

traduce en dos escalas:

0100log2100%....1000% ATSiadevaT

0log20%....0 ATSiadevaA

En los aparatos que se usan hoy en da, las lecturas de %T son transformadas enabsorbancia y presentadas as al operador, pero conviene no olvidar que la absorbanciano es en si misma una cantidad medible, sino que se obtiene por clculo matemtico apartir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotomtrico.

Si representamos grficamente en un eje de coordenadas la relacin entre absorbancia y

concentracin, observamos una lnea recta, y la proporcin es directa; la grficaresultante de representar %T frente a concentracin es una curva, y la proporcin esinversa; si empleamos papel semilogartmico, la grfica de %T frente a concentracin seconvierte en una recta.

Como hemos dicho, al aumentar la concentracin del compuesto absorbente en solucin,ms luz es absorbida y menos transmitida, lo que se observa en las grficas.

La relacin entre las cantidades de absorbente en una solucin y el grado en que estasolucin absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorcin.

La Ley de Beerestablece la relacin entre el grado de absorbancia de una solucin yotras dos variables: la concentracindel absorbente y la longituddel trayecto que el

haz de luz recorre a travs de la solucin. Segn esta ley, la absorbancia de unasolucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz:

cxbxaA

Siendo: A = Absorbanciaa = coeficiente de absorcinb = longitud del paso de luz en centmetrosc= concentracin de absorbente

Esta ecuacin constituye la base de anlisis cuantitativo de las determinaciones

espectrofotomtricas.


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Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorcin es unaconstante, relacionada con la naturaleza qumica del soluto, y tiene unidades recprocasa, b, c.

El coeficiente de absorcin a se denomina coeficiente de extincin molar,

representado con el smbolo cuando las unidades de b son centmetros y las de c sonmoles / litro. El coeficiente de extincin molar es constante para un compuesto dadocuando se fijan condiciones de longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otrosfactores. Sus unidades son 1/mol x cm.

En la prctica, el significado del coeficiente de extincin molar es el siguiente: cuanto

mayor sea en una sustancia(cromforo) para unas condiciones de trabajo

determinadas, mayor ser la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones detrabajo y, por tanto, mayor ser la sensibilidad del mtodo que lo emplea. (Para una

misma concentracin de cromgeno, si aumenta, A aumenta.)

La ley de Beer tiene una aplicacin prctica: determina los mtodos experimentales paraaveriguar la concentracin de una sustancia de inters en una solucin. Basndonos enla relacin lineal entre absorbancia y concentracin, podemos conocer la concentracinde una solucin problema de dos maneras:

a. Por comparacin con una solucin conocida:

Si tenemos dos soluciones, P(problema) y S(estndar de concentracin conocida),podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:

As

ApxCsCp

Cp

Cs

Ap

As

Siendo:

Cp= concentraciones del problema;Ap= absorbancia del problema;Cs= concentracin de la solucin estndarAs= absorbancia la solucin estndar

Conocemos el valor de Cs, y para la serie de anlisis determinamos experimentalmenteel valor de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs/As, estableciendoas el valor de un factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbencias desucesivos problemas que se ensayen en la misma serie, nos dar el valor de lasconcentraciones de estas soluciones problema.

FactorFsiendoApxFApxAs

CsCp :

b. Curva de calibracin:

Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia(ordenadas) frente

a concentracin(abscisas).


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El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones deconcentraciones conocidas, y determinar absorbancias; a continuacin, se construye lacurva de calibracin(que debe ser una recta), representando las concentraciones frente asus absorbancias grficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, suconcentracin se averigua por interpolacin de las absorbancias de las solucionesproblema en la recta de calibracin.

Estas dos formas de trabajo slo son vlidas si el cromgeno obedece la ley de Beer, ytanto las soluciones estndar como los problemas son ledas en idnticas condiciones.

En las determinaciones fotomtricas se deben conocer la linearidadque es el intervalode concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entreconcentracin y absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la

concentracin de cromgeno en la solucin sobrepasa los limites de linearidad, la Leyde Beer deja de cumplirse, convirtindose la recta de la grfica en una curva a partir deese punto de concentracin. La lectura de una absorbancia fuera de los limites delinearidad, se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno; ante estasituacin, hay que diluir la muestra, para que su concentracin entre dentro de los limitesde linearidad.

3. INSTRUMENTACION

Todos los fotmetros y espectrofotmetros constan esencialmente de:Fuente estable de energa radiante.Rendijas de entrada y salida.Selector de longitud de onda.Cubeta destinada a contener la muestra.Detector de energa radiante.Presentacin de datos.

3.1 TIPOS DE APARATOS:

En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos:

Fotmetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromtica a longitudes de ondadiscretas.

Espectrofotmetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes dedifraccin, obteniendo luz monocromtica en un intervalo continuo de longitudes deonda.

Segn la disposicin de los componentes fotomtricos, se pueden clasificar enespectrofotmetros de haz simple o de doble haz.

Espectrofotmetros de h az simple:

Constan esquemticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasaa travs de un monocromador que seleccionar la longitud de onda deseada; unasrendijas de entrada y salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz


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difusa; la luz pasa a travs de la cubeta, donde no se produce el proceso de absorcin;la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energa radiante enenerga elctrica, que es registrada en un lector.

Al trabajar con estos aparatos, es necesario unajuste inicial a0por100de transmitancia,que se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta eldetector. A continuacin se hace un blanco, colocando una cubeta con todos loscomponentes de la solucin de trabajo exceptuando el cromgeno, y haciendo un ajustea 100 por 100 de transmitancia (o de absorbancia). Se hacen lecturas deestndares(soluciones de concentracin conocida), y a continuacin las de lassolucionesproblema(concentracin desconocida), y se averigua la concentracin de losproblemas por comparacin con los estndares.

Espectrofotmetros de doble h az:

Se clasifican tales en el espacio y en el tiempo.

1. Espectro fotmetros d e doble haz en el espacio:Todos los componentes estn duplicados menos la lmpara. Dos haces de luz pasan almismo tiempo a travs de los diversos componentes separados en el espacio. Estadisposicin compensa las variaciones de intensidad de la fuente de energa radiante ytambin las variaciones de absorbancia a medida que se vara la longitud de onda delectura en una operacin de barrido.

2. Espectrofotmetros de d oble haz en el t iempo:Normalmente utilizan los mismos componentes que un instrumento de haz simple. Dos

haces de luz pasan a travs de los mismos componentes, pero no en el tiempo. Empleanun chopper, consiste en un interruptor rotativo del haz luminoso(es una rueda giratoriacon secciones plateadas y rendijas alternas) colocado a continuacin de la rendija desalida. Un sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs deuna cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector ve alternativamente elhaz de luz procedente de la muestra y el de referencia. Esta disposicin compensa lavariacin de la fuente de energa radiante, as como las variaciones de sensibilidad deldetector.

3.2 COMPONENTES

Fuen te de ener ga rad ian te

La misin de la fuente de energa es proporcionar energa radiante en forma de luzvisible o no visible.

Existen distintas lmparas que emiten en distintas zonas del espectro visible y UV.

Lmparas de fi l amento de tu ngs teno:Se utiliza habitualmente como fuentes de radiacin para longitudes de onda delespectro visible y UV prximo; son fuente de un espectro continuo de energaradiante entre 360 y 950 nm.

Lmparas de fi lamento de haluro s de tu ngs teno:Son de mayor duracin, producen mayor luz a longitudes de onda cortas, yemiten energa radiante de mayor intensidad que las de filamento de tungsteno.

Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.


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Lmp aras de hid rgeno y deut erio:Producen un espectro continuo en la regin UV(220 a 360 nm). Se emplean paramedidas en esta regin del espectro, siendo ms usada la de deuterio, de mayorintensidad que la de hidrgeno.

Lmp aras de vapo res de mercu rio:Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas(313, 365, 405, 436 y 546 nm). Son muy tiles para propsitos de calibracin de longitudes de onda,pero no son utilizadas en muchos espectrofotmetros. Se emplean enespectrofotmetros para cromatografa HPLC.

Consideracin prctica:

Es importante tener en cuenta que la cantidad de luz emitida por una lmpara no esconstante en un intervalo continuo de longitudes de onda, presentado mximos ymnimos, propiedad que vara en los diferentes tipos de lmparas, e incluso con losdiferentes fabricantes; esto nos llevar a buscar siempre el tipo de lmpara que resultems adecuado en la prctica para los anlisis que queremos realizar. Conviene tenertambin en cuenta que las lmparas sufren con las subidas y bajadas bruscas detensin, que se traducen en cambios en las lecturas de absorbancias, y que la lmparatiene una vida limitada, hacindose necesaria su vigilancia para el buen funcionamientodel instrumento.Rendijas:La funcin de las rendijas de entrada es reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luzdispersa entre el sistema de seleccin de longitud de onda.

Las rendijas de salida tienen como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta,lo que generara desviaciones a la Ley de Beer.

Sistemas de seleccin de longitud de ondaSu finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de ondadeseados para el anlisis. Se clasifican en filtros y monocromadores.

Filtros:Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente unalongitud de onda y absorbe todas las dems. Existen dos tipos:

Fi l tros d e vidr io y f i l t ros Wrat ten:Basados en la transmisin selectiva de la luz. Los filtros Wrattenconsisten en una capa

de gelatina coloreada entre dos laminas de vidrio transparente. Los filtros de vidrio estncompuestos por una o ms capas de vidrio coloreados. Ambos tipos transmiten msenerga radiante en una parte del espectro que en otras. Son preferibles los filtros devidrios por ser ms duraderos, y menos susceptibles de dao por el calor y la luz solar.

Filtros de interferencia:Basados en el principio de interferencia. Cuando la luz choca con una fina pelcula, unaparte es reflejada en la superficie frontal de la pelcula mientras que la que penetra enella es reflejada por la cara interior. Este ltimo rayo de luz ha viajado ms que elprimero, y la diferencia de recorrido viene dada por el espesor de la pelcula. Si ambosrayos reflejados(en la cara frontal y en la cara interior de la pelcula) estn en fase, suintensidad queda duplicada, mientras que si estn fuera de fase se anulan entre s. Deesta forma, cuando la luz blanca incide sobre una pelcula de este tipo, algunas de sus


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longitudes de onda quedan aumentadas, mientras que otras se anulan. Los filtros deinterferencia separan intervalos ms estrechos de longitud de onda que los de vidrio.

Monocromadores:Los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho ms estrechas quelos filtros, y tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fcilmente dentro de unaamplia zona del espectro. El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o unared de difraccin.

Prismas:Son fragmentos con forma de cua, de vidrio, cuarzo, cloruro sdico o cualquier otromaterial que permita la transmisin de la luz. Debido a la variacin del ndice derefraccin en funcin de la longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa

en mayor o menor medida segn la longitud de onda de la luz. La dispersin de la luz noes lineal, es decir, se hace cada vez menor a medida que se acortan las longitudes deonda. Cuando se pretende trabajar en la zona visible del espectro y en la UV prxima, sepueden utilizar prismas de vidrio, pero para trabajar en el UV lejano, han de ser decuarzo.

Redes de difraccin:Consisten en un gran nmero de lneas(hendiduras) paralelas, situadas a distanciasiguales entre s, trazadas sobre un vidrio o una superficie metlica. Cuando incide la luzblanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeo prisma; la luz se reflejao atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores.

Parmetros de los sistemas de seleccin de longitud de onda:Con excepcin de los mecanismos pticos lser, la luz obtenida con cualquier sistemaselector de longitud de onda no es verdaderamente monocromtica, sino que comprendeun intervalo de longitudes de onda.

Es un sistema selector de longitudes de onda con una anchura igual para las rendijas deentrada y salida, la luz que emerja de la rendija de salida se representa por un tringuloissceles y se definen varios parmetros:

Ancho de banda:

Es el intervalo de longitudes de onda que pasan a travs de la rendija de salidade un mecanismo selector de longitudes de onda.

Longitud de onda nominal de un haz de luz:Es la longitud de onda en la que sehalla el mximo de intensidad de luz. Se emplea para definir los filtros.

Anchos de banda nominal:Corresponde a aquellas longitudes de onda centradas sobre la longitud de ondamxima, que transmite el 75 por el 100 del total de la luz presente en el hazemergente. Describe el grado de monocromaticidad de un monocromador.

El grado de monocromaticidad de un monocromador puede variar. En losmonocromadores, la rendija de entrada enfoca la luz sobre el prisma o red de difraccinsobre la cual ser dispersada. La rendija de salida determina el ancho de banda de la luzque ser seleccionada del espectro de dispersin. Aumentando el ancho de la rendija de


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salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace ms amplio, con lo cual aumentala intensidad de la energa, pero disminuye la pureza espectral.

En los monocromadores de red de difraccin, la rendija de salida puede ser fija, lo queresulta en un paso de banda constante. Por el contrario, en los monocromadores deprisma, la rendija de salida es variable.

Cubetas:Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin espectrofotomtrica.

Formas:Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamao menor o mayor.Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando

con las cubetas de lados paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Lasde forma redonda se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la mismaposicin.

Materiales:La mayora estn fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entrelongitudes de onda que van de 320 a 950 nm. Tambin existen cubetas de plstico. Paramedidas por debajo de 320 nm(UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, quetambin se podran emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero sucosto lo desaconseja.

Sistemas de deteccin:Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV:

clulas fotovoltaicas y fototubos. La eleccin de uno u otro sistema dependefundamentalmente de la energa radiante de que se disponga. Si se han empleado comoselectores filtros o monocromadores de baja dispersin, stos proporcionarn un haz deluz de suficiente energa como para emplear clulas fotovoltaicas. Si se empleanmonocromadores de elevado poder resolutivo, hay que recurrir a fotomultiplicadores parala deteccin.

Fot oclu las o clu las f ot ov ol taic as sem ic on du ct or as, o clu las c on cap a debarrera:Consisten en una lmina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de materialsemiconductor, como selenio u xido cuproso. Esta capa est cubierta por una capa demetal transparente que sirve como electrodo colector. Al iluminarse a travs del electrodotransparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un

ampermetro. Estos detectores son resistentes, relativamente econmicos, y sensiblesdesde el UV hasta los 1000 nm. No se requiere ningn aporte externo de energa, y lacorriente producida es directamente proporcional a la energa que llega.

Las fotoclulas muestran el llamado efecto de fatiga, consistente en que presentan unasubida inicial de corriente que luego decrece gradualmente hasta el equilibrio. Por ello,conviene esperar unos 30-60 segundos entre lecturas.

Fototubos mu lt ip l icadores:Es un tubo que contiene en su interior un ctodo consistente en una placa de metal queemite electrones de forma proporcional a la energa que incide sobre ella.

Contiene adems un nodo, que recoge los electrones, y de 9 a dinodos o niveles de

energa.


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Los electrones producidos en el primer choque contra el ctodo pasan a chocar contrauna superficie secundaria, donde cada electrn produce entre 4 y 6 electronesadicionales que van a otro nivel(dinodos), y as sucesivamente, multiplicndose de estemodo el efecto del primer choque de la luz contra el ctodo, hasta que los electronesllegan al nodo, y la seal se amplifica en cientos o miles de veces.

Los fototubos tienen un rpido tiempo de respuesta, no muestran efectos de fatiga tanaltos como otros detectores, y son muy sensibles.

Sistemas de presentacin de datos:La energa elctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentacin dedatos. Estos pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir amplificados a

aparatos con detectores del tipo fotoclulas, o bien pueden introducir amplificadores deseal, como ocurre en los aparatos con fototubos.

Hoy en da todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida tambin a laintroduccin de microprocesadores, permite clculos directos de concentracin conarreglo a factores de calibracin prefijados, y lectura contra estndares, o curvas decalibracin en memoria.

A esta presentacin digital de resultados se une tambin la posibilidad de conexin deregistradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinticas, y en la realizacinde barridos a travs de intervalos de longitudes de onda del espectro.

4. ASPECTOS PRACTICOS

4.1 Empleos de blancos

Antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un blanco: esta maniobraeliminar las posibles interferencias de absorcin o reflexin por parte de la propiacubeta o el solvente de cromgeno.

Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, slo con el solvente; seestablecer una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solucin, que marcar lascondiciones iniciales de trabajo. La absorbancia del blanco se restar de lasabsorbancias que se midan para los problemas.

Hay distintos tipos de blancos:

Blanco de suero:La lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporcin en un solventeinerte, con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que puede producir lapropia muestra(p. ej.: hemlisis, lipemia, bilirrubinemia, color de la orina, etc.), antes deque se produzca la reaccin.

Blanco de reactivos:Elimina las posibles interferencias que pueda introducir el reactivo. La lectura inicial sehace con el reactivo, antes de adicionarle la muestra.


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4.2 Desviaciones de la Ley de Beer:

Son desviaciones producidas en la linearidad de la relacin entre concentracin yabsorbancias. La recta se curva antes de su limite de linearidad. Pueden causarlasvarios factores.

Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno.

La radiacin incidente no es monocromtica.

La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto.

La luz es transmitida por otros mecanismos(luz errtica, o luz monocromtica

que llega al detector).

Los lados de la cubeta no son paralelos.

Si hay interferentes(otros cromgenos absorben tambin a esa longitud deonda).

Si existe fenmeno de fluorescencia.

4.3 Curvas de calibracin:

La curva de calibracin relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se

construye ensayando soluciones de distintas concentraciones, y estableciendo para cadauna de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda.

Para construir una curva de calibracin, se deben estudiar concentraciones que cubranel rango que se va a encontrar en la prctica, siempre que sea posible.Las unidades de concentracin empleadas en la curva deben ser las mismas que sevayan a utilizar luego para expresar los resultados.

En la construccin de la curva se emplean un mnimo de tres puntos, que se representanen la grfica, y a continuacin se traza una lnea recta que se aproxime a ellos lo msposible. Generalmente, a una concentracin de 0 corresponde a una absorbancia de 0.La curva debe abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del lmitede linealidad, para que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolacin de

cualquier resultado en esta grfica ofrezca un resultado fiable.

4.4 Empleo de factores de calibracin:

Otra forma de trabajo consiste en utilizar lo que se llama factor de calibracin; este factores el resultante de la aplicacin de la ecuacin bsica de la espectrofotometra, y se hallapor una simple regla de tres, tras el ensayo de un estndar(comparando concentracionesy absorbancias de estndar y problema).

Cs/Cp = As/Ap Cp = Cs/As x Ap Cp = F x Ap

Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantenerconstante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la

absorbancia resultante por el factor, para conocer la concentracin.


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Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes del aparato, etc.)requiere el clculo de un nuevo factor de calibracin.

De igual manera, cuando se trabaje con una curva de calibracin, cualquier ajuste en elaparato, o cambio en los reactivos con que se fabric, requieren la construccin de unanueva curva.

Los aparatos deben mantenerse limpios y evitar agentes que produzcan cualquierinterferencia en el sistema fotomtrico(polvo, suciedad de lquidos derramados, etc.). Lasfluctuaciones bruscas de luz afectan al sistema ptico del aparato, que sufre con ellas;por otro lado, hay que vigilar el estado de la lmpara, puesto que experimenta undesgaste con el tiempo.

Las cubetas a usar deben estar perfectamente limpias, y su superficie no debe presentarralladura alguna. No se deben tocar con los dedos las caras de la cubeta por las quehaya de incidir el rayo de luz.

RECUERDA:

La radiacin electromagntica es una forma de energa radiante, formada porpaquetes discontinuos de energa llamados fotones. Puede ser descrita en funcinde sus propiedades ondulatorias: longitud de onda y frecuencia de la radiacin

c

Ch

EhE *

*

El espectro electromagntico comprende un amplio intervalo de longitudes deonda, desde rayos gamma hasta microondas.

De las interacciones entre la luz y la materia se derivan de fenmenos deabsorcin o emisin energtica.

Proceso de absorcin: un tomo, molcula o ion absorben la energa de un fotnque incide sobre ellos.

Proceso de emisin: un elemento es excitado, y desprende su energa en formade energa radiante(luz medible).

Cuando se mide la absorcin de luz por una solucin, se definen los conceptosde transmitancia y absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional ala concentracin. La relacin entre transmitancia y concentracin es inversa ylogartmica.

La Ley de Beer-Lambert rige la relacin entre la absorbancia de una solucin y

su concentracin: cxbxaA


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Basndonos en la Ley de Beer, podemos comparar las absorbancias yconcentraciones de dos soluciones, y calcular as la concentracin de cualquiersolucin problema.

Para calcular la concentracin de una solucin problema, podemos recurrir aluso de factores ocurvas de calibracin.

Tipos de aparatos con arreglo al sistema selector de longitud de onda:fotmetros(filtros) y espectrofotmetros(monocromadores).

Tipos de aparatos segn la disposicin de los sistemas fotomtricos:Espectrofotmetros de haz simple y Espectrofotmetros de doble haz(en elespacio y en el tiempo).

Componentes esenciales; fuente de energa radiante, rendijas, sistema selectorde longitudes de onda, cubeta, sistemas de deteccin.

Se emplean blancos que marcan las condiciones iniciales de trabajo: blanco desuero y blanco de reactivos.

Se pueden producir desviaciones a la Ley de Beer, que hacen que la relacinentre absorbancia y concentracin deje de ser lineal.

El empleo de las curvas de calibracin y factores exige que las condiciones detrabajo sean estndar, y mantengan las mismas cuando se calcularon.

La prctica correcta de la espectrofotometra requiere el uso de aparatossometidos a un mantenimiento adecuado, as como de elementosaccesorios(cubetas, etc.)en perfecto estado.


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PRCTICA DE LABORATORIO 1

ESPECTROFOTOMETRA

ESPECTROFOTOMETRA

La espectrofotometra es una de las tcnicas de estudio ms importantes en laBiologa celular y en la molecular. Se basa, esencialmente, en la propiedad de la granmayora de las sustancias de importancia biolgica de absorber la energa radiante deuna a otra frecuencia. Esta absorcin es especfica, haciendo posible su uso comomtodo para la identificacin y cuantificacin de tales sustancias.

Objetivos:1. Efectuar el espectro de absorcin de luz visible de varias sustancias.

2. Determinar la longitud de onda de mxima absorcin de cada una de las sustancias.

3. Comprobar la relacin entre la absorbancia y la concentracin de la sustancia. (Leyde Beer-Lambert).

4. Aplicar la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentracin de una sustancia.

5. Aprender el manejo del espectrofotmetro.

LECTURA

DIAFRAGMA

PRISMA

COLIMADOR

MUESTRA FOTOCELDA

GALVAN METRO

ESPECTROFOTMETRO

Tomado de: VELEZ A. Manual de Bioqumica. Universidad Santiago de Cali. Facultadde Educacin. Qumica.

FUENTE DE LUZ


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Materiales: Reactivos:10 tubos de ensayo Azul de bromotimol(100 mg/litro)1 gradilla Rojo congo(100 mg/litro)2 pipetas de 1 ml Permanganato de potasio(100 mg/litro)2 pipetas de 2 ml cido actico al 5%(V/V)2 pipetas de 5 ml Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.53 tubos para espectrofotometraEspectrofotometro

Procedimientos:

Cada grupo de estudiantes trabajar con una sustancia diferente. Los resultadosde los espectros y de la Ley de Beer-Lambert se debern comparar en la discusin

de la prctica.

Solicite al profesor la explicacin sobre el manejo del espectrofotmetro queusar el grupo. No tiene que operarlo hasta que no se tenga la informacin necesariapara hacerlo.

1. Determinacin de los espectros de absorcin:

1.1 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH 7.5.Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir comoblanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol(100 mg/l), ms 1 ml de amortiguador defosfatos y 8 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.2 Determinar el espectro del azul de bromotimol a pH cido.Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir comoblanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, ms 9 ml de agua destilada y una gota decido actico al 5%. Mezcle bien.

1.3 Determinar el espectro del rojo congo.Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir comoblanco y otro con 1 ml de rojo congo(100 mg/l), y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.4 Determinar el espectro de una mezcla de bromotimol y rojo congo, a pH 7.5Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir comoblanco y otro con 1 ml de azul de bromotimol, ms 1 ml de amortiguador de fosfatos pH

7.5 ms 1 ml de rojo congo y 7 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1.5 Determinar el espectro del permanganato de potasio.Prepare dos tubos de ensayo as: uno con 10 ml de agua destilada que servir comoblanco y otro con 1 ml de KmnO4(100 mg/l) y 9 ml de agua destilada. Mezcle bien.

1. Realice el espectro de cada sustancia midiendo la absorcin de luz cada 30 nm,desde 400 hasta 700 nm. Cada lectura debe efectuarse con una calibracin previacon el blanco a 100% de transmitanca.

2. Realice las graficas correspondientes de absorbancia vs. longitud de onda, en nm.

3. Cul es la longitud de onda de mxima absorcin para cada sustancia?


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4. Determine la correspondencia entre el espectro de absorcin y el color de cada unade las sustancias.

5. Qu caractersticas tiene el espectro de la mezcla del azul de bromotimol y el rojocongo?

2. Comprobacin de la Ley de Beer-Lambert:

Aqu se analizara la variacin de la absorcin con respecto a la concentracin de lasustancia que absorbe.

Cada tubo, con una concentracin diferente de la sustancia, se lee a la longitud

de onda de mxima absorcin obtenida en el experimento anterior.

Se operar as: se colocar el botn de longitud de onda en el valorcorrespondiente a la longitud de mxima absorcin, se calibra con el blanco a 100%de transmitanca. Se reemplaza el blanco por las soluciones de diferenteconcentracin de la sustancia. Aqu no es necesario calibrar con el blanco de nuevo,antes de cada medicin, a menos que se sospeche que ha sucedido alteracin de lacalibracin.

Para cada una de las sustancias se deben preparar las siguientes diluciones,partiendo de la solucin original de 100 mg/l:

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7 8 Problema

Solucin de lasustancia (en ml.)

0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0

Agua destilada(en ml.)

9.75 9.5 9.0 8.5 8.0 7.0 6.0 10

Concentracin(mg/l)

El tubo problema contendr una concentracin de sustancia que deber ser encontradapor medio de la grfica de absorbancia vs. concentracin.

2.1 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul de bromotimol a pH 7.5Para esto se preparan los tubos como se indica en la tabla pero deberemplazarse 1 ml de agua destilada por 1 ml de amortiguador de fosfato pH 7.5,en cada uno de los tubos. Mezclar bien.

2.1 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con azul bromotimol a pH cidoPrepare las diluciones como se indica en la tabla y agregue a cada tubo 1 gotade cido actico al 5%. Mezclar bien.

2.3 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con rojo congo.Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.


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2.4 Comprobar la Ley de Beer-Lambert con permanganato de potasio.Prepare las diluciones como se indica en la tabla. Mezclar bien.

En cada caso, tabule sus datos, elabore una grfica de absorbancia vs. concentracin enmg/l y establezca la concentracin del problema.

Preguntas:

1. Cules son los fundamentos en los que se basan las tcnicas espectrofotomtricas?

2. Qu relacin existe entre los espectros de absorcin de las sustancias y el colorque poseen?

3. Qu aplicaciones tienen las tcnicas espectrofotomtricas?

4. Qu factores pueden producir desviaciones al aplicar la Ley de Beer Lambert.


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LABORATORIO 1: ESPECTROFOTOMETRA

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____

Asistentes: (slo los que han PARTICIPAD0 de la prctica)

_____________________________________________________________

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_____________________________________________________________

1. Qu es un espectrofotometro?_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

2. Cules son los pasos que deben seguir para el manejo del espectrofotometroanlogo y el digital.

a) Anlogo:_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

b) Digital:_____________________________________________________________

_____________________________________________________________

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DETERMINACIN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCINNombre de la sustancia: A: ______________________________________

LONGITUD DEONDA

TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

400

430

460

490

520

550

580

610

640

670

700

Nombre de la sustancia: B: Azul de bromotimol y rojo congo pH 7.5

LONGITUD DEONDA

TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

400

430

460

490

520

550

580

610

640

670

700


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Realice la grfica del espectro de absorcin de las sustancias A y B

Grafica 1.

Grfica 2:


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COMPROBACIN DE LA LEY DE BEER-LAMBERT: Variacin de laabsorcin con relacin a la concentracin.

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7 8 Problema

Solucin de lasustancia (en ml.)

0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 0

Agua destilada(en ml.)

9.75 9.5 9.0 8.5 8.0 7.0 6.0 10

Transmitancia

Absorbancia

Concentracin (mg/l)

Realice la grfica de la Absorbancia vs Concentracin y determine laconcentracin de la solucin problema mediante la ecuacin de la recta y curva decalibracin.

Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizadoen esta prctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 25.


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Haga una breve discusin y conclusin de sus resultados.

Discusin:__________________________________________________________________________________________________________________________________

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Conclusiones:

1. _____________________________________________

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2. _____________________________________________

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3. _____________________________________________

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MACROMOLECULAS DE LA LEVADURA

Objetivos:1. Separar por centrifugacin las principales macromolculas de lalevadura.(Saccharomyces ssp).

2. Identificar cualitativamente dichas macromolculas: protenas, cidos ncleicos yglucgeno.

Materiales: Reactivos:

4 tubos de centrfuga Levadura de panaderaMortero cido tricloroactico al 5 %

2 pipetas de 10 ml2 pipetas de 1 ml Arena lavada y seca1 probeta de 50 ml Alcohol etlico1 vaso de 400 ml Reactivo de yodo(lugol)1 cubeta de hielo Cloruro de sodio al 10 %1 agitador Cloruro de sodio 0.15 M1 gradilla Reactivo de Orcinol15 tubos de ensayo Sulfato de cobre 0.1 MPlancha de calentamiento Hidrxido de Sodio 10 MCentrfuga refrigerada Amortiguador salino(citrato de sodio 0.015 M

y NaCl 0.15 M en volmenes iguales).

Procedimiento:

1. En un mortero coloque el equivalente a una cucharadita de levadura de panadera,lavada y seca. Agregue una cucharadita de arena lavada y seca y triturecuidadosamente por 5 minutos.

Agregue 15 ml de cido tricloroactico al 5 % y macere cuidadosamente por tres minutosms.

Deje que la arena se asiente y decante la suspensin lechosa vertindola a un tubo decentrfuga.

Centrifugue a 3000 revoluciones durante 5 minutos.


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Usted obtendr un precipitado que contiene cidos nuclicos y un sobrenadante quecontiene glucgeno.

2. Pase el sobrenadante a un tubo de ensayo y el tubo de centrfuga con el precipitadocolquelo en un bao de hielo.

Precipite el glucgeno aadiendo 2 volmenes de alcohol etlico, agitando y enfriando enel bao de hielo.

Pase este medio a un tubo de centrfuga y centrifugue a 3000 r.p.m.

Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 1 ml de agua destilada.

Para utilizar como control coloque otro tubo de ensayo 1 ml de agua destilada y a ambosagregue 1 ml del reactivo de yodo, el cual tie el glucgeno de pardo rojizo.

Tenga en cuenta los cambios y anote sus observac iones.3. Ahora, tome el precipitado de cidos nuclicos y protenas y agrguele 15 ml decloruro de sodio al 10 %, agitando cuidadosamente.

Como tena este medio con el tubo de centrfuga, pselo a un tubo de ensayo ycolquelo en un bao de agua hirviendo por 10 minutos.

Enfre luego cuidadosamente y pase el medio a un tubo de centrfuga, centrifugando a3000 r.p.m., durante 3 minutos.

El sobrenadante contiene cidos nuclicos, pselo a un tubo de ensayo, y deje elprecipitado protico en un bao de hielo.

Tome el tubo que contiene los cidos nuclicos y preciptelos aadiendo 2 volmenes deetanol fro, lentamente y agitando sobre un bao de hielo y djelo por unos 3 minutos.

Vierta el contenido a un tubo de centrfuga y centrifugue durante 3 minutos a 3000 r.p.m.

Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 2 ml de amortiguador salino.

Coloque en otro tubo como control 2 ml de amortiguador salino, y a ambos agregue 3 mldel reactivo de orcinol; coloque los tubos en un bao de agua hirviendo durante algunosminutos.

Una coloracin verde indica la presencia de ARN.

Tenga en cuenta los cambios y anote sus observac iones.


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4. Tome el precipitado de protenas coaguladas y disulvalo con 2 ml de solucin salina0.15M.

En otro tubo de ensayo, como control coloque 2 ml de la solucin salina.

Aada a cada tubo 1 ml de la solucin de sulfato de cobre, luego 2 ml de hidrxido desodio 10 M. Mezcle y observe.

La aparicin de un color violeta indica la positividad de la prueba (Prueba del Biuret).

Tenga en cuenta los cambios y anote sus observac iones.

Preguntas:

1. Cules son los fundamentos de las tcnicas de extraccin (Cul es la utilidad de cadauno de los pasos que se sigue y de cada uno de los reactivos que se utiliza para purificarlas macromolculas y de las pruebas de identificacin empleadas en esta prctica.

2. Escriba las reacciones qumicas correspondientes de las diferentes pruebas deidentificacin utilizadas.

Preparacin de react ivos:

Reactivo de Orcinol:Se disuelven 0.1 g de FeCl3en 100 ml de HCl y se mezclan con 3.5 ml de etanol quellevan disueltos 0.3 g de Orcinol.

Amortiguador salino:Se mezclan citrato de sodio 0.015 M y NaCl 0.15 M en volmenes iguales.

Lugol:Para 500 ml, pesar 0.83 g de KI y disolver en agua. Agregar 1.3 g de Yodo metlico.

Agitar fuertemente.


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LABORATORIO 2: MACROMOLECULAS DE LEVADURA

HOJA DE REPORTE

FECHA: ____________________ SEMESTRE:_________ GRUPO: _____


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1. Describa la apariencia del macerado inicial?_____________________________________________________________

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2. Cul es la apariencia y el color del precipitado y del sobrenadante obtenido

despus de la primera centrifugacin?

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3. Qu sucede con el sobrenadante cuando se le agregan los volmenes deetanol fro? Color?_____________________________________________________________

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4. Cul es la apariencia del precipitado despus de la segunda centrifugacin?_____________________________________________________________

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5. Que observan cuando agregan el reactivo de yodo (lugol)

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13. Qu otros aspectos desean destacar de la prctica realizada?_____________________________________________________________

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14. Anexar las fichas tcnicas de los reactivos y sustancias empleadas enesta prctica.

15. Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 33


Discusin:__________________________________________________________________________________________________________________________________

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Conclusiones:

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AMINOCIDOS

Objetivos:1. Separar los componentes de una mezcla de aminocidos por medio de la

cromatografa de papel.

2. Determinar el Rfde algunos aminocidos en el sistema empleado.

3. Establecer la influencia de la estructura de la cadena lateral R de los aminocidos enel Rf.

4. Analizar la reaccin de algunos aminocidos con ciertos agentes qumicos quepermiten su reconocen cualitativo y cuantitativo.

Materiales: Reactivos:30 tubos de ensayo Nitrito de sodio(10 g/l)3 gradillas Reactivo de ninhidrina4 pipetas de 5 ml cido ntrico concentrado2 pinzas para tubos Solvente: Etanol + Agua + AmoniacoPlancha de calentamiento (80-10-10 en volumen)

NaOH 10 M1 vaso de precipitados de 500 ml cido actico glacial2 tubos capilares Fenol(1 g/l)2 clips(debe traer el grupo) Nitroprusiato de sodio(20 g/l)1 papel para cromatografa Reactivo de Milln1 erlenmeyer de 500 ml con tapn Papel indicador de pH1 estufa a 110 C Mezcla de aminocidos(1 g/l) de1 rociador alanina, leucina y cido aspartico.1 secador de pelo (debe traer el grupo) Soluciones (1 g/l) de los aminocidos:

prolina, cido asprtico, leucina,glicina, alanina, tirosina, fenialanina,triptfano, cistena, metionina, lisinay asparagina.

Procedimiento:

1. Separacin de aminocido por medio de cromatografa de papel

En el trozo de papel para cromatografa trace una lnea con lpiz, a 2 cm del bordeinferior (Maneje el papel por los bordes para no contaminarlo).


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Sobre esta lnea y a una distancia de 2 cm de separacin, coloque 3 aplicaciones de lassoluciones siguientes (en puntos separados):

a. Alanina b. cido asprtico c. Leucinad. Mezcla de alanina, leucina y cido asprtico.

Deje secar bien cada muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto (Utilice elaire caliente de un secador de pelo).

Cuando termine las aplicaciones y las muestras estn bien secas, enrolle el papeltratando de formar un cilindro, de modo que las muestras queden hacia fuera.Sujete elcilindro con un clip en el borde contrario al de las muestras.

Coloque el papel de filtro enrollado en el centro del erlenmeyer que contiene el solvente,de tal modo que el borde con las muestras quede sumergido en l, y tratando de que elpapel no quede inclinado y que no toque las paredes con el recipiente.Tpelo y deje desarrollar el cromat grama sin mover el recipiente, hasta que el frentedel solvente llegue a unos dos centmetros del borde superior.Cuando esto ocurra, saque el papel del erlenmeyer con unas pinzas y colquelo en unsitio ventilado para que se seque.

Una vez seco solicite al profesor el rociamiento con ninhidrina(Evite respirar estosvapores) y djelo en la oscuridad por media hora o a una temperatura de 110 C en laestufa, durante 5 minutos.

Saque el papel y observe las manchas. Rodee su permetro con una lnea hecha a lpiz

y determine el centro de la mancha.

Preguntas:

1. En qu consisten las manchas observadas?

2. Determine los Rfde los aminocidos en el cromatgrama.

3. Qu explicaciones pueden darse a las diferencias de migracin observadas?

2. Algunas reacciones qumicas con aminocidos:

Reaccin con ninhidrina:En diferentes tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solucin de los siguientes aminocidos:prolina, cido asprtico, arginina, leucina, asparagina, metionina y tirosina.Aada a cada tubo 0.5 ml de ninhidrina en acetona al 1 %.Coloque los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos.Deje enfriar a temperatura ambiente y observe la coloracin de cada tubo.Un color azul, violeta o marrn se considera positivo.La prolina debe dar un color amarillo.

Reaccin xantoproteica:En sendos tubos de ensayo coloque 0.5 ml de solucin de cada uno de los siguientesaminocidos: glicina, tirosina, triptofano, fenilalanina, y fenol.Agregue a cada tubo 0.5 ml de cido ntrico concentrado.Como la reaccin es exotrmica, deje enfriar y observe las cambios de color.


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Agregue luego a cada tubo 2 ml de NaOH 10 M.El cambio de coloracin amarilla en medio cido, a anaranjado en solucin alcalina,constituye un resultado positivo.

Prueba con nitroprusiato de sodio:Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, cisteina, tirosina, triptfano,fenilalanina, metionina, cido asprtico, arginina.Agregue 0.5 ml de nitroprusiato y luego 0.5 ml de hidrxido de amonio.La aparicin de un color rojo se considera positivo.

Reaccin con cido glioxlico:Coloque en diferentes tubos de ensayo 2 ml de glicina, tirosina, triptfano, fenilalanina,

metionina y aada 2 ml de cido actico glacial que haya sido expuesto a la luz(contienecido glioxlico).Inclinando cada tubo y sin agitar deje caer lentamente por las paredes 2 ml de cidosulfrico concentrado. Observe que se forman dos capas y en su interfase hay uncambio de color.Un anillo de color violeta se considera positivo.

CUESTIONARIO: Para todos los casos explique el fundamento qumico de lasreacciones y escriba las ecuaciones correspondientes. En la hoja de reporte, despus deanalizar sus resultados, indique cuales reacciones son generales y cuales sonespecficas.

Preparacin de react ivos:

Ninhidrina:Ninhidrina 0.6 g y disolver en 300 ml, de acetona.La acetona puede reemplazarse por etanol, etanol o isopropanol.

Solvente para la cromatografa:Para 800 ml, se mezclan 640 ml de etanol, 80 ml de agua destilada y 80 ml de amoniaco.


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LABORATORIO 3: AMINOACIDOS

HOJA DE REPORTE


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1. Separacin de aminocidos por cromatografa de papel

Realicen un esquema del cromatograma despus de haber sido revelado connihidrina (Adhieran el cromatograma realizado)


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2. Cromatografa de aminocidos:Fase estacionaria: _________________________ Fase mvil: ______________

Revelador: _______________________________________________________

Patrones: ________________________________________________________

3. Calculen el Rf para cada uno de los aminocidos?

a) Alanina: _________________

b) cido asprtico: _________________

c) Leucina: _________________

d) Mezcla: _____________________________________

4. Qu concluyen con respecto a lo observado.

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2. Algunas reacciones de los aminocidos.

En la siguiente tabla indique el color u otra caracterstica sobresaliente de lareaccin positiva de los aminocidos, con las diferentes pruebas realizadas:

Aminocido Nihidrina Xantoproteica Nitroprusiato

de sodio

cido

glioxlico

PROLINA

A. ASPARTICO

ARGININA

ASPARAGINA

CISTEINA

FENILALANINA

FENOL

GLICINA

LEUCINA

METIONINA

TIROSINA

TRIPTOFANO

5. Cules son las pruebas generales y cules son especficas para determinados

aminocidos?

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Anexe las fichas de seguridad de los reactivos y sustancias que se han utilizadoen esta prctica.

Anexar las respuestas del cuestionario de la pgina 39 y 40.


Discusin:__________________________________________________________________________________________________________________________________

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Conclusiones:________________________________________________________________________________________________________________________

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PROTENAS

Objetivos:1. Determinar el efecto de la temperatura, los solventes orgnicos, los pHextremos, la concentracin salina y los iones metlicos pesados, sobre la

estabilidad de una protena en solucin.

2. Analizar algunas de las reacciones para la determinacin de la presencia deprotenas.

3. Separar una protena en solucin por medio de insolubilizacin reversible eirreversible.

Materiales: Reactivos:15 tubos de ensayo Solucin de albmina al 2 %

2 gradillas Acetona1 termmetro HCl 9 N1 vaso de 250 ml NaCl al 20 %4 pipetas de 5 ml Sulfato de amonio4 tubos de centrfuga cido tricloroactico al 50 %1 centrifuga NaOH 5 M1 balanza Sulfato cprico 0.1 M1 probeta de 50 ml Hidrxido de amonioPlancha de calentamiento 1 huevo (debe traerlo cada grupo)1 pinza de madera

Procedimiento:

1. Coagulacin de una protena:Coloque 7 tubos de ensayo en una gradilla y numrelos.(De la clara de huevo obtenidasepare 5 ml, para el tubo, el resto se le agrega agua, se agita y se completan 100 ml.Luego se filtra y se hacen con esta solucin todos los ensayos). Vierta en cada tubo 3 mlde la solucin de albmina, excepto al No 1 que lleva los 5 ml de clara.Realice lo siguiente:

Tubo No. 1: Se calienta suavemente y poco a poco en un bao de agua,controlando la temperatura mediante un termmetro colocado en el interior del tubo.Determine la temperatura a la cual se insolubiliza la protena.

Tubo No. 2: Agregue 2 ml de acetona. Deje en reposo y observe que pasa alcabo de algunos minutos.

Tubo No. 3: Aada 1 ml de HCl 9 N. Observe.


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Tubo No. 4: Agregue 2 ml de NaCl al 20 %. Observe

Tubo No. 5: Aada 2 ml de HNO3al 20%. Observe

Tubo No. 6: Agregue 4 ml de NaOH 5 M. Observe

Tubo No. 7: Control

Preguntas:

1. Qu explicacin puede dar en cada caso?

2. Cules factores pueden causar la coagulacin de una protena?

2. Precipitacin de la protena por iones metlicos pesados

Deposite en un tubo de ensayo 3 ml de la solucin de albmina, y adale 1 ml deacetato de plomo 0.005 M. Espere algunos minutos y observe.

Preguntas:

1. En qu consiste la reaccin observada?2. Qu otras sustancias la pueden producir?

Agregue ahora 1 ml de cido etilendiaminotetractico(EDTA) 0.05 M. Agite y observe.

Preguntas:

1. Porque ocurre la reaccin observada?

3. Insolubilizacin reversible e irreversible

En un tubo de ensayo coloque 5 ml de la solucin de albmina, agregue en porcionespequeas y agitando para que se disuelva bien, 2.36 g de sulfato de amonio. Observe.En otro tubo de ensayo, coloque 5 ml de la solucin de albmina y aada 1 ml de cido

tricloroactico al 50 %. Observe.Centrifugue las suspensiones de ambos tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos.Separe el sobrenadante de ambos tubos por decantacin, deschelo y conserve elsedimento de ambos tubos.

Preguntas:

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