16. Estudio pormenorizado dealgunas proteínas

Hemoproteínas:Hemoglobina y Mioglobina

Hemoproteínas

Son proteínas conjugadas cuyo grupo prostético es una porfirina coordinada a un ion metálico. Suelen estar relacionadas con todos los aspectos del metabolismo aeróbico

- Transportadores de oxígeno como la hemoglobina y la mioglobina- Clorofilas: porfirinas coordinadas a un ion Mg++

- Transportadores electrónicos como los citocromos- Enzimas relacionadas con el transporte electrónico como la citocromo oxidasa- Enzimas relacionadas con el stress oxidativo, como las peroxidasas- Coenzimas cobamídicas o corrinoides (vit. B12)

Fe++N

CH3

HO N

CH2 CH2

CH3

COO-

N

H3C CH

CH2

N

C CH2

CH2

COO-

O

HHemo a:

citocromo oxidasa

Fe++N

CH3

CH2CH2SCys 14

N

CH2 CH2

CH3

COO-

N

H3C CH2 CH2 S Cys 17

N

H3C CH2

CH2

COO-

Hemo c:citocromo c

Citocromo c

Hemo c

Fe

Met 80

His 18

Cys 17

Cys 14

Entorno del grupo hemoen el citocromo c

Fe++N

O

O

N

CH2

R

CH3

N

H3C CH

CH2

N

CH3C

O

C

O

OCH3

CH3 en clorofila a

CHO en clorofila bR:

Clorofilas

Mg++

Bacterioclorofila

1 L de sangre arterial desprende 200 mL de O2 STP. Dada su poca solubilidad, es de suponer que la mayoría circula en forma de alguna combinación química.

En efecto, el oxígeno circula en combinación con la hemoglobina,presente a la concentración de 145 g/L en sangre, toda ella en el interior del hematíe (eritrocito, góbulo rojo), a su vez en cantidadde unos 5 x 106 por l.

El peso molecular de la hemoglobina es de 64000 (2.2 mmoles.L-1); los 200 mL de O2 suponen 8.8 mmoles.L-1; por tanto, el transportese hace en razón de 8.8/2.2 = 4 moles de oxígeno por mol de hemo-globina.

Transporte en sangre de O2

Teniendo en cuenta que en la molécula de hemoglobina hay cuatroátomos de hierro, podemos decir que el transporte tiene lugar en una proporción de un mol de oxígeno por mol de hierro.

La sangre arterial está equilibrada con una presión parcial deoxígeno de aproximadamente 95-100 mm Hg. La sangre venosaestá equilibrada con una presión parcial de oxígeno de aproximadamente 40 mm Hg.

La sangre arterial está saturada prácticamente a 100 %; la venosa, un 70 %. Por tanto, el paso por los tejidos periféricos desprende un30 % del oxígeno combinado con la hemoglobina.

Hemoglobina: proteína globular, conjugada y oligomérica

- Grupo prostético: hemohemo: protoporfirina IX + ion ferroso Fe2+

- Cuatro subunidades, iguales dos a dos:Hemoglobina A1 (HbA1):

Hemoglobina A2 (HbA2):

Hemoglobina fetal (HbF):

Hemoglobina Gower 1:

Hemoglobina Gower 2:

Hemoglobina Portland:

- Se conoce, además, un gran número de hemoglobinas mutantes.

Fe++N

CH3

CHH2C

N

CH2 CH2

CH3

COO-

N

CH

CH2

H3C

N

H3C CH2

CH2

COO- Grupo Hemo b:Protoporfirina IX + Fe

His 93

Hélice F

Hélice E

Entorno delgrupo hemo

en lamioglobina

Fe++

Tanto en la hemoglobina como en la mioglobina, el hierro siempre está en estado ferroso, Fe ++

Cuando el ion ferroso, Fe++ se oxida a férrico, Fe +++, la hemoglobina se convierte en metahemoglobina, queno es funcional

Conviene no confundir metahemoglobina conoxihemoglobina, que es la forma oxigenada (pero no oxidada) de la hemoglobina

Desoxihemoglobina + 4O2 Oxihemoglobina

Cadena V-LSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHF-DLSH-----GSA 53Cadena VHLTPEEKSAVTALWGKV--NVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNP 58Mioglobina -GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59 *: : * **** . * *.* *:: .* * * * .*. ..

Cadena QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL 113Cadena KVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHF 118Mioglobina DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKH 119 .:* ** .* *: . : : .. : .*:: *. * :: :.::.. :: .* :

Cadena PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR------ 141Cadena GKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH------ 146Mioglobina PGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG 153 :* . .:.: :* : . . :: :*:

Homología de secuencia - - Mioglobina

N

C

Hélice A

Hélice B

Hélice C

Hélice D

Hélice

EH

élic

e F

lice G

Hél ce H

Subunidad

Subunidad

Mioglobina

Situación delgrupo hemo

Hemoglobina A1

(forma T, desoxi-)

12

2

1

Hemoglobina A1

(forma R, oxi-)

1

1

2

2

Entorno delgrupo hemo en la

desoxihemoglobina

Hélice F

Hélice E

His 87 His 92

Entorno delgrupo hemo en laoxihemoglobina

Hélice F

Hélice E

O2

His 87 His 92

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

Saturación de O2 en Mioglobina y Hemoglobina

Hemoglobina

Mioglobina

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

Vol., Hb

Vol., Mb

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

P50 Mb P50 Hb

Concepto de P50

Efecto del pH sobre la saturación de la hemoglobina

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

pH 7.4

pH 7.0

pH 6.6

(Efecto Bohr)

Efecto de la presión parcial de CO2

PO2, mm Hg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

40 mmHg

60 mmHg

80 mmHg

Efecto del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) sobre la saturación de la hemoglobina

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Sat

urac

ión

de O

2, %

0

20

40

60

80

100

00.1 mM

1 mM

ss s s s s

ss ss

L

ii i i i i

i i i

i

Forma R, oxi-

Forma T, desoxi-

Modelo MWC

C

COO-

(CH2)3 NH

C NH2+

H2N-OOC CH2 C

+H3N (CH2)4 C

+H3N C Val 1

Lys 127

Asp 126Arg 141

Contacto , desoxihemoglobina

Arg 141 (C-t)Asp 126

Lys 127

Arg 141 (C-t)

Desoxi- Oxi-

Contacto

Lys 127

Asp 126

C(CH2)3 NH

C NH2+

H2NArg 92

CH2 CCH2-OOC

C (CH2)4 NH3+

-OOCCH CH2

NH

+HNLys 40

His 146 (C-t)

Glu 43

Contacto , desoxihemoglobina

Lys 40

Arg 92

Glu 43

His 146 (C-t)

His 146 (C-t)

Lys 40

Glu 43

Arg 92

Contacto

Desoxi- Oxi-

Tyr 42

Tyr 42

Asp 99 Asp 99

Forma T, desoxi- Forma R, oxi-

Contacto

NH+HN

CH2 C

C CH2 COO-

Asp 94

His 146

Contacto , desoxihemoglobina

Forma T, desoxi- Forma R, oxi-

2,3-BPG

His 2His 2

His 2

His 2

Val 1Val 1

Val 1

Val 1

Lys 82

Lys 82Lys 82

Lys 82

His 143

His 143

His 143

His 143

Contacto

Movimiento delion Fe++ en la

oxigenación de lahemoglobina

Forma T, desoxiHb

Forma R, oxiHb

Inmunoglobulinas

Todos los organismos vivientes tienen mecanismos para distinguir lo propio de lo extraño

- Hongos y plantas, por ejemplo, mediante la producción de metabolitos secundarios potencialmente tóxicos para otros organismos: antibióticos, alcaloides, etc.

- Bacterias, mediante el sistema de restricción de DNA: DNAs extraños son degradados específicamente por las enzimas de restricción

- Vertebrados, mediante el sistema inmune.

El sistema inmune consta de dos tipos de respuesta:

- La inmunidad celular, mediante la cual células inmunocompe- tentes ( linfocitos T) eliminan células extrañas introducidas en el organismo (p.e. un injerto, un tumor, una célula transforma- da por un virus, etc.)

- La inmunidad humoral, en la que otras células inmunocom- petentes (linfocitos B) producen proteínas específicas dirigidas contra lo extraño, llamadas anticuerpos.

- Todos los anticuerpos pertenecen a una superfamilia de proteínas conocidas como inmunoglobulinas

Llamamos antígeno a la molécula que, introducida en un orga-nismo, produce una respuesta inmune, sea humoral o celular.

En la inmunidad humoral, el antígeno se une específicamente a un linfocito B que produce un anticuerpo complementario. Estelinfocito se multiplica (clon celular) y se transforma en célula plasmática o plasmocito, que es la célula encargada de la producción de anticuerpos.

Cada linfocito B produce un solo y único tipo de anticuerpo. Poresa razón, los anticuerpos obtenidos de un único clon de linfocitos B reciben el nombre de anticuerpos monoclonales.

El estudio de las inmunoglobulinas se vio facilitado por lanaturaleza de los mielomas, tumores malignos de célulasplasmáticas, que producen un solo tipo de anticuerpo (anti-cuerpo monoclonal).

En algunos mielomas humanos se produce la llamada proteínade Bence-Jones, que es excretada en la orina, a partir de la quese puede purificar.

Es fácil inducir mielomas en ratón.

A partir de todas estas circunstancias se pueden obtener anti-cuerpos químicamente puros (monoclonales) lo cual facilitael estudio químico de las inmunoglobulinas

Porter, 1959:

El tratamiento con papaína escinde la molécula deinmunoglobulina (Ig) en tres fragmentos, dos de ellosidénticos: dos Fab y un Fc

Fab: Antigen Binding (fijador de antígeno)Fc: Crystallizable (cristalizable)

Edelman, 1959:

El tratamiento con mercaptoetanol y guanidina 8M, seguidode cromatografía, disocia la Ig en dos componentes de pesosmoleculares 50 kDa (H, de heavy, pesado) y 25 kDa (L, delight, ligero). Como el peso molecular de la Ig nativa es de150 kDa, se deduce que su estructura es H2L2

Por estudios inmunológicos, se detectan los siguientes isotipos:

- Cadena ligera: - Cadena pesada:

En los dominios constantes puede haber una ligera variabilidaden cada cadena (afecta a uno o dos aminoácidos) dando lugar alas variantes conocidas como alotipos

En los dominios variables hay muy poca homología de secuencia;cada anticuerpo es único hacia su antígeno: los idiotipos

En cualquier caso, en cada anticuerpo las dos cadenas ligeras y las dos pesadas son iguales entre sí.

VH

VH

CH1

CH1

VL

VL

CL

CL

CH2

CH2

CH3

CH3H

L

H

L

Cadena pesada o H:

Cadena ligera o L:

Puente disulfuro

C

N

N

C

C

N

N

C

Inmunoglobulinas

Cadenas ligeras

212 aminoácidos2 dominios:

VL, N-t (108aa) CL, C-t (104 aa)

Cadenas pesadas

Variable; 450 aminoácidos en IgGCuatro o cinco dominios:

VH, N-t (108 aa)CH1, CH2, CH3 (y CH4)

En los dominios constantes hay posibilidad devariaciones alotípicas (uno o dos aminoácidos solamente)

1 30 50 93

N C

N C35 60 87 105

L

H

Regiones hipervariables (CDR) en el dominiovariable de las cadenas H y L en las Ig

Dominio deInmunoglobulina

N

C

VL

CL

Cadena ligera, L

N

C

VH

CH1

CH2

CH3

Oligosacárido

Cadena pesada, H

Puente disulfuro entre cadenas pesada y ligera

H

L

Cys H128

Cys L 214 (C-t)

Inmunoglobulina G

Fc

Fab

Fab

H1

H2

L1

L2

Oligosacárido

Inmunoglobulina G

- Constituye el 70-80 % de las Ig séricas- Contingente mayoritario de la respuesta inmune secundaria- Cuatro tipos distintos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4- Monomérica- Bajo contenido en carbohidrato (2-3 %)

Inmunoglobulina A

- Constituye el 10-20 % de las Ig séricas- Es la Ig propia de las secreciones (jugo gástrico, saliva, leche)- Dos tipos: IgA1, IgA2- Normalmente dimérica: unión covalente por el péptido J- Alto contenido en carbohidrato (7-12 %)

Inmunoglobulina M

- Constituye el 5-10 % de las Ig séricas- Es la respuesta inmune primaria- Cinco dominios en la cadena pesada- Elevada proporción de carbohidrato (12 %)- Pentámero unido por disulfuros y un péptido J

Inmunoglobulina D

- Muy baja concentración en suero (1 %)- Posiblemente relacionada con el receptor de antígeno- Alto contenido en carbohidrato (9-14 %)

Inmunoglobulina E

- La más minoritaria- Cinco dominios en la cadena H- Membrana de mastocitos y basófilos- Relacionada con inmunidad a parásitos helmínticos- Relacionada con fenómenos de hipersensibilidad (alergia) inmediata: fiebre del heno, asma.- Alto contenido en carbohidrato

Colágeno

Proteína fibrosa, constituída por empaquetamiento demoléculas de tropocolágeno o monómero de colágeno

Tropocolágeno: tres helicoides entrecruzados, cada unode peso molecular en torno a los 300 kDa, alrededor de 1000 aminoácidos, con una gran cantidad de residuos de Gly, así como de Pro, normal o hidroxilada.

Los residuos de Lys pueden aparecer asimismo modificados,bien como 5-hidroxilisina, o como lisina aldehídica (Al-lisina).

Es muy abundante en todos los tejidos de origen mesodérmico,particularmente en tendones, dermis, fascias y hueso.

Tropocolágeno

Disposición de los monómeros de colágeno en la microfibrilla,

que da lugar a un patrón estriado al microscopio electrónico

Las cadenas de tropocolágeno aparecen unidas unas a otrasen la microfibrilla mediante:

- Cadena lateral de al-lisina unida a cadena lateral de lisina no modificada a través de base de Schiff y posterior reducción

- Cadena lateral de al-lisina unida a otra al-lisina a través de condensación aldólica

- Enlaces de hidrógeno entre el grupo -C=O de la prolina y el -N-H de la glicina, siempre intercatenarios

MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDR 50DVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSE 100SPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPP 150GPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG 200FQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQ 250GARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQ 300MGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVG 350AKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGAN 400GAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGE 450PGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADG 500VAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPD 550GKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGV 600PGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAG 650PPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGAN 700GAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGP 750KGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPG 800DRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPP 850GPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGP 900AGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPG 950PQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPM 1000GPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGA 1050PGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPAGARGPAGPQGPRGDKGETG 1100EQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAP 1150GKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSF 1200LPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEG 1250SRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCV 1300YPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAI 1350QLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLKGSNEIEIRA 1400EGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDVAPLDVGAP 1450DQEFGFDVGPVCFL 1464

SeñalPropéptido N-terminal

Helicoide

Propéptido C-terminal

GKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGAN

Fragmento de secuencia del colágeno I(1)

(Muchos residuos de Pro aparecen hidroxilados)

Helicoide de poliprolina

Helicoide triple deltropocolágeno

(fragmento, 14 aa/helicoide)

Cada helicoide es levógiro,pero se entrelazan en

forma dextrógira

Tropocolágeno(fragmento)

Vista lateralVista frontal

Helicoide aislado del tropocolágeno

Enlaces H a otras cadenas(grupo -C=O peptídico)

Glicina cadatres residuos

Residuos de Glyen tropocolágeno

N

C O

C

O

OH

N

C O

C

O

HO

4-Hidroxiprolina(mayoritario)

3-Hidroxiprolina(minoritario)

Hidroxilación de prolina

Enzima: procolágeno:prolina monooxigenasa (prolil hidroxilasa), requiere ácido ascórbico

La hidroxilación de prolina favorece la formación de enlaces Hentre las cadenas

NH3+

CH2

HC OH

CH2

CH2

CHN C

H O

5-Hidroxilisina

Hidroxilación de lisina

Enzima: Procolágeno:lisina monooxigenasa(lisil hidroxilasa), requiere ácido ascórbico

La lisina hidroxilada es el punto de uniónde oligosacáridos al colágeno

CHO

CH2

CH2

CH2

CHN C

OH

Al-Lisina(Lisina aldehídica)

Forma enlaces cruzados(entrecruzamientos) covalentes

entre los helicoides del colágeno

Enzima: lisil aminooxidasa

Al-Lisina

N C

(CH2)4

NH3+

OH

CHO

CH2)3

CC

O

N

H

(

Lisina

Al-lisina

N C

(CH2)4

N

OH

C

(CH2)3

CCN

H O

N C

(CH2)4

NH

OH

CH2

(CH2)3

CCN

H O

Base de Schiff Entrecruzamiento(lisil norleucina)

Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas decolágeno a través de lisina y al-lisina, (vía base de Schiff)

N C

(CH2)3

OH

CHO

CHO

CH2)3

CC

O

N

H

(

Al-lisina

N C

(CH2)3

CH

OH

C

(CH2)2

CCN

H O

CO

H

Al-lisina

Entrecruzamientoaldólico

Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas decolágeno a través de dos al-lisinas, (vía condensación aldólica)

Tipo I [1(I)]22(I) Mayoritario (huesos, piel, tendones)

Tipo II [1(II)]3 Cartílago, vítreo

Tipo III [1(III)]3 Vasos sanguíneos, cicatrices

Tipo IV [1(IV)]3 Membrana basal, cristalino[2(IV)]3

Tipo V [1(V)]22(V) Superficies celulares[1(V)]3

[1(V)][2(V)][3(V)]

Tipo VI Íntima de la aorta

Tipos de colágeno

Elastina:

Tramos sin estructura definida entrecruzadospor desmosina

N C

(CH2)4

NH3+

OH

N C

(CH2)4

NH3+

OH

N C

OH

(CH2)4

NH3+

N C

OH

(CH2)4

NH3+

N C

(CH2)4

OH

+N

(CH2)2

C

N(CH2)3

CN

(CH2)2

C

N

O

H

OH

H

O

Lys

LysLys

Lys

Desmosina

Formación de entrecruzamiento covalente entre cadenas deelastina a través de cuatro lisinas, (vía formación de desmosina)