RSC Kromatografi Monographs Editor seri: R.M. Smith, Loughborough University of Technology, Inggris Penasehat: JC Berridge, Sandwich, Inggris, GB Cox, Indianapolis, Amerika Serikat , I.S. Lurie, Virginia, Amerika Serikat, PJ Schoenmakers, Eindhoven, Belanda, CF Simpson, London, Inggris, G.G. Wallace, Wollongong, Australia Judul-judul dalam seri ini: Aplikasi microextraction fase padat Diedit oleh J Pawliszyn, Universitas Waterloo, Waterloo, Ontario, Kanada kapiler Electrochromatography Diedit oleh KD Bartle dan P Myers, Universitas Leeds, Inggris Integrasi Metode kromatografi, Edisi Kedua N Dyson, Dyson Instrumen, Inggris Siklodekstrin di Kromatografi 'Cs, Hungaria Academy of Sciences, Budapest, Hongaria Deteksi elektrokimia dalam HPLC Obat dan Racun RJ Flanagan, Guy dan St Thomas 'NHS Foundation Trust, London, Inggris, D Perrett , Sekolah Queen Mary Kedokteran dan Kedokteran Gigi, London, Inggris dan R Whelp ton, University of London, London, Inggris HPLC: Sebuah Panduan Praktis T Hanai, Kesehatan Research Foundation, Kyoto, Jepang Ditulis dgn tanda penghubung Teknik dalam Analisis Spesiasi Diedit oleh J Szpunar dan R Lobinski, CNRS, Pau, Prancis Kolom dikemas SFC TA Berger, Hewlett Packard, Wilmington, Delaware, Amerika Serikat Pemisahan dengan Kromatografi Cair Fullerenes Diedit oleh Kiyokatsu Jinno, Toyohashi University of Technology, Jepang Validasi Sistem Kromatografi Data: Temu Usaha dan Persyaratan Peraturan RD McDowall, McDowall Consulting, Bromley, Kent, Inggris Bagaimana untuk mendapatkan judul masa depan publikasi: Sebuah rencana standing order yang tersedia untuk seri ini. Perintah berdiri aka n membawa masing-masing volume pengiriman baru setelah publikasi. Untuk informas i lebih lanjut silahkan hubungi: Penjualan dan Customer Care, Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Sc ience Park, Milton Road, Cambridge, CB4 0WF Telepon: 144 (0) 1223 420066, Faks: 144 (0) 1223426017, Email: sales@rsc.org

ISBN 0-85404-535-X Sebuah catatan katalog untuk buku ini tersedia dari British Library # The Royal Society Kimia 2005 All rights reserved Selain berurusan adil untuk tujuan penelitian untuk non-komersial atau untuk stu di pribadi, kritik atau tinjauan, sebagaimana diizinkan dalam Copyright, Desain dan Paten dan Hak Cipta Act 1988 dan Peraturan Hak Terkait 2003, publikasi ini t idak boleh direproduksi, disimpan atau ditransmisikan, dalam bentuk apapun atau dengan cara apapun, tanpa izin tertulis sebelumnya dari The Royal Society of Che mistry, atau dalam kasus reproduksi sesuai dengan ketentuan lisensi yang dikelua rkan oleh Badan Copyright Licensing di Inggris, atau di sesuai dengan ketentuan dari lisensi yang dikeluarkan oleh Organisasi Hak Reproduksi yang sesuai di luar Inggris. Pertanyaan tentang reproduksi luar persyaratan yang dinyatakan di sini harus dikirim ke The Royal Society of Chemistry di alamat dicetak di halaman in i. Diterbitkan oleh The Royal Society Kimia, Thomas Graham House, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0WF, Inggris Amal Terdaftar Nomor 207890 Untuk informasi lebih lanjut lihat situs web kami di www.rsc.org Mengeset oleh Alden Bookset, Northampton, Inggris Dicetak oleh Athenaeum Press Ltd, Gateshead, Tyne and Wear, Inggris

Sampai saat ini kuantitatif KLT penuh dengan kesalahan eksperimental. Na mun, pengenalan scanner spectrodensitometric komersial memungkinkan kuantifikasi analit langsung pada lapisan KLT. Awalnya daerah puncak diukur secara manual, t etapi kemudian integrator dicapai ini secara otomatis. Kemajuan utama berikutnya adalah munculnya HPTLC (kinerja kromatografi lapis tip is Tinggi). Pada l973 Halpaap adalah salah satu yang pertama untuk mengakui keun tungan dari menggunakan ukuran rata-rata partikel yang lebih kecil dari gel sili ka (sekitar 5-6 mm) dalam penyusunan pelat KLT. Ia membandingkan efek ukuran par tikel pada waktu pengembangan, nilai-nilai Rf dan piring height.19 Pada pertenga han 1970-an ini, diakui bahwa HPTLC menambahkan dimensi baru untuk TLC seperti i tu menunjukkan bahwa presisi dapat ditingkatkan sepuluh kali lipat, waktu analis is dapatdikurangi dengan faktor yang sama, fase kurang bergerak yang diperlukan, dan jarak pengembangan pada lapisan bisa reduced.20 Teknik ini sekarang bisa di buat sepenuhnya berperan untuk memberikan akurasi yang sebanding dengan HPLC. Ko mersial piring pertama kali disebut''nano-KLT pelat''oleh produsen, (Mercka), ta pi ini segera berubah menjadi sebutan''''HPTLC. Pada tahun 1977 publikasi HPTLC besar pertama muncul, hanya disebut''HPTLC kinerja kromatografi lapis tipis ting gi''disunting oleh Zlatkis dan Kaiser.21 Dalam buku Halpaap dan Ripphahn menggam

barkan hasil komparatif mereka dengan 5 baru 5 cm piring HPTLC dibandingkan konv ensional KLT untuk serangkaian lipofilik dyes.22 fase Berikat kemudian diikuti s ecara berurutan. Fase terbalik HPTLC dilaporkan pada tahun 1980 oleh Halpaap et al.23 dan ini seg era menjadi komersial tersedia sebagai pra-dilapisi pelat. Pada tahun 1982 Jost dan Hauck24 melaporkan (NH2-) pelat amino dimodifikasi HPTLC, yang segera diikut i oleh siano-terikat (1985) 25 dan diol-berikat (1987) 26 fase. Tahun 1980-an ju ga melihat perbaikan dalam scanner spectrodensitometric dengan kontrol komputer penuh menjadi mungkin, termasuk pilihan untuk kemurnian puncak dan pengukuran UV penuh / spektrum terlihat untuk semua komponen terpisah. Beberapa pembangunan o tomatis (AMD) membuat penampilan pada tahun 1984 karena pekerjaan perintis Burge r.27 Peningkatan ini memungkinkan peningkatan yang ditandai dalam jumlah dan res olusi komponen terpisah. Dalam beberapa tahun terakhir TLC / HPTLC penelitian telah memasuki bidang pemis ahan kiral menggunakan sejumlah selektor kiral dan fasa diam kiral. Hanya satu j enis kiral pra-dilapisi pelat saat ini tersedia secara komersial, yang didasarka n pada prinsip pertukaran ligan dan diproduksi secara komersial baik sebagai TLC atau piring HPTLC. gu nther telah melaporkan hasil dengan asam-asam amino dan t urunannya pada plate28 TLC dan Mack dan Hauck sama dengan equivalent.29 HPTLC me reka Pada saat ini semua langkah dari proses KLT dapat dikendalikan komputer. Penggun aan sangat sensitif (CCD) kamera ditambah biaya perangkat telah memungkinkan chr omatographer untuk menyimpan gambar elektronik kromatogram untuk penggunaan masa depan (identitas atau pengujian stabilitas) dan untuk masuk langsung ke laporan di kemudian hari. HPTLC piring tersedia secara komersial dilapisi dengan silika gel murni khusus 4-5 mm bola telah menambahkan kemampuan lebih lanjut untuk tek nik ini. Gangguan latar belakang telah berkurang, dan resolusi lebih ditingkatka n, yang telah memungkinkan TLC harus ditulis dgn tanda penghubung secara efektif dengan spektroskopi Raman.

BAB 2 Sorben DAN TLC LAPIS 1. Sorben Seleksi 1.1. Pengantar Setidaknya ada 25 bahan inert yang tersedia sebagai sorbents di KLT, beberapa ya ng telah lebih banyak digunakan daripada yang lain. Sejumlah yang lebih penting akan dibahas dalam bab ini. Jelas untuk pemisahan optimal, penting bahwa bahan y ang benar dipilih. Beberapa sorbents memiliki berbagai aplikasi spesifik (misaln ya gel silika diresapi dengan kafein untuk hidrokarbon poliaromatik, atau gel si lika diresapi dengan pemilih kiral untuk pemisahan enantiomer asam amino dan tur unannya). Dengan gel silika atau Sebaliknya aluminium oksida digunakan untuk ber bagai aplikasi. Silika gel dan alumina juga dapat dibagi menjadi beberapa yang b erbeda, sorbents terpisah tergantung pada ukuran pori-pori, ukuran partikel, dan pH. Sebelum memilih sorben, pertimbangan harus diberikan untuk senyawa-senyawa yang akan dipisahkan. Karakteristik, seperti polaritas, kelarutan, ionisability, berat molekul, bentuk dan ukuran analit adalah penting dalam menentukan mekanis me pemisahan, dan karenanya sebagian besar mendefinisikan kedua jenis sorben dan pelarut yang digunakan baik untuk persiapan sampel dan dalam pengembangan. Pada tahun 1973 Scott1 diperiksa lebih dari 1100 kertas untuk menentukan sorbent s adalah yang paling teratur digunakan dalam KLT. Silica gel sejauh ini (%, 64) yang paling populer, diikuti oleh selulosa (, 9%), dan alumina (, 3%). Sejak itu

gel silika tetap yang paling banyak digunakan, tetapi perubahan yang nyata tela h terjadi dengan munculnya fase yang terikat secara kimiawi telah membuka berbag ai kemungkinan baru pemisahan. Fase stasioner cenderung lebih baru untuk sebagia n besar untuk mengatasi daerah-daerah tertentu pemisahan mana baik resolusi komp onen sampel adalah miskin atau tidak ada. Sebagai daftar aplikasi untuk beberapa sorbents sangat luas, lebih baik untuk merujuk pada bibliografi yang sangat bai k atau jasa abstrak yang tersedia untuk TLC (misalnya Camag Bibliografi Servicea ) ketika sebuah metode tertentu dari literatur diperlukan. Jika ini tidak tersed ia untuk pengguna atau prosedur baru atau yang ditingkatkan diperlukan, maka inf ormasi dasar dalam Tabel 1 akan membantu untuk memastikan bahwa sorben optimal u ntuk jenis pemisahan yang dipilih. Tabel 1 Pilihan KLT optimal / sorbents HPTLC untuk senyawa dan kelas senyawa 1,2 Silika Berdasarkan Sorben 1.2.1 Silica Gel Silica gel, juga disebut asam silikat dan kieselgel, merupakan bahan berpori put ih amorf, biasanya dibuat oleh presipitasi dari larutan silikat dengan penambaha n asam. Proses ini tidak berarti sederhana seperti asam polysilicic dibentuk ole h polikondensasi. Jadi yang disebut''primer''partikel muncul. Sebagai partikel t umbuh, air dihilangkan dan pembentukan gel terjadi. Kontrol suhu dan pH selama t ahap ini akan memiliki bantalan ditandai pada kualitas dari gel terbentuk. Parti kel koloid dengan demikian mengembangkan, yang berkondensasi lebih lanjut dan me nyusut untuk membentuk jaringan tiga dimensi digambarkan sebagai hydrogel2 (liha t Gambar 1). Setelah mencuci dan pemanasan (, 120-C) gel keras namun berpori amo rf terbentuk, disebut xerogel atau gel silika. Hal ini xerogel yang digunakan un tuk KLT. Gambar 1 Bagian dari struktur gel silika khas Struktur ini diselenggarakan bersama oleh silikon dan oksigen terikat, disebut s iloksan kelompok. Kelompok hidroksil sisa pada permukaan account untuk banyak si fat adsorptif dari silika gel memberikan karakteristik pemisahan yang unik. ''Si tus ini aktif''dapat bervariasi sesuai dengan lingkungan lokal mereka. Tiga jeni s gugus hidroksil yang mungkin seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Yang pali ng produktif adalah kelompok hidroksil tunggal terikat pada atom silikon, yang t erkait dengan matriks gel silika melalui tiga obligasi siloksan. Jenis kedua ada lah dimana dua gugus hidroksil yang terikat pada sebuah atom silikon tunggal, se ring disebut kelompok hidroksil geminal. Jenis ketiga, yang adalah jauh lebih ja rang, adalah ikatan tiga kelompok hidroksil untuk satu atom silikon. Hanya satu siloksan mengikat ikatan kelompok ini dengan silika gel matrix.3 Namun, permukaan''''yang tersedia aktif agak lebih rumit dengan kehadiran air ba hwa hidrogen obligasi ke permukaan kelompok hidroksil. Gambar 3 menunjukkan bahw a ada cukup banyak cara yang berbeda-ikatan hidrogen dapat terjadi dengan air. B ahkan multi-lapisan air, fisik teradsorpsi, yang mungkin. Hidrasi dari gel untuk TLC dianggap 11-12% air ketika kelembaban relatif adalah 50% pada 20-C.4 seperti gel biasanya siap untuk digunakan tidak memerlukan aktiv asi pra-. Aktivasi hanya diperlukan jika pelat KLT telah terkena kelembaban ting gi, dan kemudian hanya membutuhkan pemanasan sampai 105-C selama 30 menit diikut i dengan pendinginan dalam suasana yang bersih pada kelembaban relatif 40-50%. A ir diselenggarakan di struktur baik sebagai fisik teradsorpsi atau hidrogen-air terikat, yang terakhir yang lebih tegas held.5 Sebagai bukti ini, desorpsi hidro gen-ikatan air membutuhkan 10 kkal mol ?? 1 sementara air terikat secara fisik m embutuhkan, 6.6- 8,2 kkal mol ?? 1 aktivasi energy.6 Gambar 2 jenis gel silika permukaan gugus hidroksil (a) monohydroxyl (tunggal), (b) dihydroxyl (geminal), (c) trihydroxyl

Sifat sintetis dari silika gel untuk kromatografi memungkinkan kontrol yang cerm at dari ukuran pori, volume pori dan ukuran partikel. Ukuran pori-pori bervarias i 40-150 A untuk komersial pra-dilapisi pelat KLT dengan satu pengecualian dari 50 000 A untuk aplikasi khusus. Kisaran ukuran partikel silika gel untuk TLC bia sanya 5 sampai 40 mm dengan rata-rata menjadi 10 sampai 15 mm tergantung pada pr odusen. Hal ini memiliki dampak yang besar pada resolusi komponen sampel. Jadi d alam TLC, seperti dalam HPLC, mengurangi ukuran partikel menurunkan ketinggian s etara dengan sepiring teoritis puncak dan karenanya meningkatkan efisiensi. Sepe rti diilustrasikan dalam Gambar 4, ketika partikel silika gel yang lebih kecil d ari 5 sampai 6 mm digunakan untuk menyiapkan pelat HPTLC, hasil resolusi ditingk atkan. Gambar 3 (a) Cara di mana ikatan hidrogen air kepada kelompok hidroksil permukaa n gel silika, (b) Pembentukan multi-lapisan air hidrogen terikat Ukuran pori mempengaruhi selektivitas dan karenanya dapat digunakan untuk efek y ang baik dalam mengubah tingkat migrasi dan resolusi komponen sampel. Ukuran por i yang paling umum digunakan dalam KLT adalah 40, 60, 80, 100 A, dengan silika g el 60 Sebuah menjadi yang paling populer dan serbaguna kelompok. Silica gel 60 A (biasa disebut silika gel 60) telah direkomendasikan untuk berbagai pemisahan s eluruh industri dan lembaga penelitian. Sebagai kadar air memainkan peranan pent ing dalam retensi analit pada lapisan kromatografi, sangat penting bahwa kelemba ban teradsorpsi oleh gel silika dipertahankan pada tingkat konstan. Pada Gambar 5 kurva adsorpsi air ditampilkan untuk rentang ukuran pori gel silika, 40, 60 da n 100 A. Pada tingkat normal kelembaban di laboratorium sebagian besar (40-60% k elembaban relatif), variasi dalam penyerapan kelembaban dengan silika gel 60 A m emiliki sedikit efek pada tingkat migrasi dari komponen sampel yang paling. Peru bahan dalam air adsorpsi atas perubahan-perubahan kecil dalam kelembaban relatif (RH) untuk gel silika 40 adalah cukup ditandai (dari 20-40% di atas kisaran 4060% RH). Ini akan mempengaruhi tingkat migrasi dari komponen sampel, dan meskipu n dengan perbedaan kelembaban kontrol hati-hati dapat dimanfaatkan untuk meningk atkan perpisahan, mereka juga dapat menjadi sumber masalah sehubungan dengan rep roduktifitas. Meskipun kontrol kelembaban tidak perhatian begitu banyak untuk ge l silika 100 A, nt sorb akibatnya kurang polar chromatographically karena adsorp si kelembaban relatif kurang sehingga tingkat migrasi rendah dari komponen sampe l. Gambar 4 Pengaruh distribusi ukuran partikel pada resolusi. Pemisahan karoten be rkonsentrasi pada gel silika 60 Karena variasi kandungan air dengan kelembaban relatif jelas ada, Brockmann dan Schodder memperkenalkan skala untuk mengkarakterisasi berbagai gel silika (lihat Tabel 2). Ini gel silika skala dinilai dari I sampai V. Ini dirancang untuk men gkarakterisasi gel silika sesuai aktivitas kromatografi mereka atau selektivitas sebagai perubahan air teradsorpsi. Dengan meningkatnya kadar air, kromatografi lapisan menjadi lebih polar dan zat terlarut diterapkan ke lapisan menunjukkan p eningkatan migrasi ke arah depan pelarut meskipun tidak ada perubahan telah dibu at untuk pelarut dalam tangki KLT. Gambar 5 adsorpsi isoterm Air untuk silika, gel 40 60 dan 100 A (Dengan izin dar i Merck) Perubahan diameter pori juga akan menyebabkan perubahan dalam selektivitas. Pada kelembaban relatif konstan penyerapan kelembaban akan bervariasi tergantung pad a ukuran pori seperti dapat dilihat pada Gambar 5. Sebagai contoh pada kelembaba n relatif 50%, nilai-nilai berikut dapat dibaca dari grafik untuk gel silika den gan 40, 60 dan 100 A pori-pori, 27%, 13% dan 8%, masing-masing. Sebagai aturan u

mum zat terlarut berpindah lebih cepat dengan pelat silika gel 40 dan lebih lamb at dengan gel silika 100 dibandingkan dengan gel silika 60. Ini adalah efek dari variasi dari polaritas dari berbagai jenis gel silika. Selanjutnya karakteristi k fisik gel, silika 40 60 dan 100 ditunjukkan pada Tabel 3. Tabel 2 Brockmann dan Schodder grading aktivitas gel silika menurut kadar air Tabel 3 Variasi karakteristik fisik dari gel silika menurut diameter por i KLT pelat silika gel sangat serbaguna atas berbagai aplikasi. Terdiri dari campu ran pelarut non-polar (misalnya heksana atau sikloheksana) dan kutub (metanol as etonitril, misalnya atau air) konstituen dapat digunakan tanpa lapisan kromatogr afi atau pengikat terpengaruh. (Contoh tipikal pada Gambar 6.) Sering pengubah a sam (misalnya asetat, asam propionat atau format) atau pengubah dasar (misalnya larutan amonia, piridin atau amina) dimasukkan ke dalam pelarut berkembang untuk meningkatkan resolusi. Ini juga baik ditoleransi oleh lapisan mengakibatkan pem isahan yang Gambar 7, dan 8 adalah contoh yang khas. 1.2.2 Silica Gel Fase Berikat Terbalik-Fase. Secara tradisional minyak silikon atau parafin telah digunakan un tuk menghasilkan lapisan fase terbalik. Piring ini memiliki keunggulan yang dapa t digunakan dengan eluen sampai to100% air dan relatif mudah untuk prepare.7-10 Namun, mereka bisa menderita kebocoran fase stasioner atau''''pengupasan selama kromatografi. Seringkali untuk pekerjaan kualitatif kerugian ini dapat diakomoda si. Di mana analisis kuantitatif benar-benar penting adalah penting bahwa lapisa n fase terbalik sepenuhnya direproduksi, memberikan gangguan latar belakang yang sama dan rendah selama pemindaian dan tidak mengubah polaritas fase gerak. Hal ini telah menghasilkan dalam pengembangan terikat-silika gel dan fase TLC HPTLC untuk fase terbalik bekerja. Gambar 6 Pemisahan kortikosteroid pada gel silika 60 Sorben lapisan: silika gel HPTLC 60 pelat kaca F254 (Merck) Handphone fase: kloroform / metanol (93 7 v / v) Deteksi: 0,5% b / v dalam metanol biru tetrazolium Zona: 1, prednisolon, 2, hidrokortison, 3, prednison, 4, kortison, 5, corticoste rone, 6, cortexolone, 7, 11-dehydrocorticosterone, 8, 11-desoxycorticosterone (d ari Rf terendah) Konsentrasi: 20 ng per substansi Silica gel dapat kimia terikat oleh reaksi dengan organosilanes dari berbagai pa njang rantai. Dimetil, etil, oktil, undecyl, oktadesil dan fenil semuanya telah digunakan secara komersial untuk menghasilkan panjang rantai karbon dari 2, 8, 1 2, 18 dan Tabel Variasi 3 aromatik dari karakteristik fisik dari gel silika menu rut cincin diameter pori terikat dengan matriks siloksan . (Untuk contoh struktu r, lihat Gambar 9.) Semua modifikasi kimia seperti di TLC dan piring HPTLC forma t yang banyak tersedia dari produsen utama kromatografi lapisan. Ikatan dari org anosilanes untuk gel silika dapat dilakukan dalam kondisi anhidrat, di mana jeni s ikatan monolayer, atau di bawah kondisi hidro, di mana lapisan polimer terjadi . Dalam pembentukan monolayer, mono, organosilanes bi-atau tri-fungsional dapat digunakan dan reaksi mungkin dengan silanols permukaan yang ditunjukkan pada Gam bar 10. Stoikiometri reaksi jelas tergantung pada konsentrasi gugus silanol (SiOH) di permukaan, dan seperti dapat dilihat dari persamaan reaksi, hasil dalam o rgano-kelompok yang terikat melalui kelompok siloksan (Si-O-Si). Hal ini benar a pakah hasil modifikasi pada mono atau lapisan polimer. Dalam pembentukan lapisan polimer keberadaan air memulai konversi organosilanes untuk organosilanetriols melalui hidrolisis. Ini segera menjalani kondensasi dengan silanols permukaan si

lika gel sehingga ikatan ganda untuk surface.11 Dengan fase terikat, hanya kelompok silanol diakses pada matriks gel silika dapa t dimodifikasi. Jenis dan derajat hasil modifikasi perbedaan yang nyata dalam hi drofobik antara sorbents. Dalam kromatografi partisi semacam ini di mana fase ge rak dan fase diam telah terbalik dalam polaritas, adalah penting bahwa eluen yan g digunakan adalah kutub, misalnya asetonitril / air atau metanol / air, tetapi tidak begitu kutub bahwa permukaan fase terikat tetap unwetted. Sebagai tingkat modifikasi permukaan dan meningkatkan panjang rantai alkil, lapisan menjadi lebi h hidrofobik, dan hanya mungkin untuk menggunakan konsentrasi yang relatif renda h air sebagai tekanan biasanya tidak diterapkan. Demikian beberapa tersedia seca ra komersial Rp18 pelat HPTLC mana gel silika telah silanised semaksimal mungkin hanya dapat digunakan dengan sampai 25% air dalam campuran pelarut berkembang. Hasil peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi air adalah pelarut depan tidak merata dan membasahi lapisan lengkap. Namun, dengan mengurangi tingkat cakupan p ermukaan C18 adalah mungkin untuk menghasilkan fase air benar-benar toleran, (mi salnya RP18W HPTLC piring dari Merck). Logikanya KLT piring silanisation rendah juga dapat diproduksi yang benar-benar dapat dibasahi. Tabel 4 menunjukkan cakup an permukaan dicapai oleh salah satu produsen. Terlepas dari HPTLC, sepenuhnya s ilanised Rp2 8 dan 18, semua yang lain dapat digunakan dengan konsentrasi tinggi pelarut berair jika diperlukan. Gambar 7 Pemisahan flavonoid Sorben lapisan: silika gel HPTLC pelat kaca 60 (Merck) Handphone fase: etil asetat / air / asam format (85 15 10 v / v) Deteksi: 1% b / v diphenylboric asam-2-aminoethyl ester dalam metanol Peaks: 1, rutin, 2, hyperoside, 3, quercitrin, 4, quercitin Konsentrasi: 30 ng per substansi Pemindaian: spectrodensitometry fluoresensi, eksitasi 436 nm dan pada emisi pada 546 nm. (Untuk rincian spectrodensitometry, lihat Bab 7.) Dicetak ulang dari kromatografi lapis tipis, Reagen dan Deteksi Metode, volume 1 a, 1990, p 279, dengan milik penulis dan penerbit, Wiley-VCH Gambar 8 Pemisahan alkaloid Sorben lapisan: silika gel 60 WF254 pelat kaca (Merck) Fase gerak: aseton / toluena / etanol / soln amonia. (25% b / b) (40 40 6 2 v / v) Visualisasi: 0,15% b / v hexachloroplatinic (IV) asam dalam 3% b / v larutan kal ium iodida Peaks: 1, narceine, 2, morfin, 3, kodein, 4, thebaine; 5, papaverine, 6, narcoti ne Konsentrasi: 1 mg per substansi Deteksi: reflektansi spectrodensitometry pada 540 nm Dicetak ulang dari kromatografi lapis tipis, Reagen dan Deteksi Metode, 1b volum e,, 1994 p363, dengan milik Wiley-VCH Gambar 9 kimia C8 alkil terikat kelompok terikat ke permukaan silika gel Gambar 10 Reaksi antara silika gel dan (a) monofungsional, (b) bifunctional, dan (c) organosilanes trifunctional Tabel 4 Cakupan rasio kromatografi lapisan dimodifikasi secara kimia (Dengan izin dari Merck) Banyak yang telah diterbitkan pada perbandingan dari berbagai produsen 'precoate d kimia terikat HPTLC / TLC piring dan tidak mengherankan, berdasarkan kesamaan

dengan kemasan HPLC, ada terlihat variations.12-16 Sebagai contoh, beberapa prod usen merekomendasikan penggunaan hingga 3 % natrium klorida dalam fase gerak unt uk mencapai keterbasahan lebih baik, sedangkan yang lain tidak. Dalam beberapa k asus tidak hanya masalah kelengkapan silanisation lapisan, tetapi juga pilihan p engikat. Banyak pengikat baik sebagian atau seluruhnya larut dalam air. Hal ini dapat mengakibatkan penghapusan lapisan sorben dengan pelarut mengandung propors i yang tinggi dari air. Sebagai variasi ini dapat memiliki dampak besar pada pil ihan fase terbalik layer dan pada kualitas pemisahan akhirnya, penting untuk men gikuti rekomendasi produsen untuk mendapatkan hasil optimal dengan piring khusus mereka. Fase terbalik TLC sekarang banyak digunakan dalam berbagai aplikasi. Untuk nama tapi Proctor, sedikit dan Horobin telah menerbitkan luas tentang penerapan untuk pewarna identifikasi dan kemurnian dalam noda biologis, 17 Kaiser dan Rieder un tuk optimasi analisis jejak lingkungan, 18 Armstrong dkk. pada penentuan berat m olekul polimer dan distribusi, 19,20 Sherma dkk. pada pemisahan asam amino, 21 V anhaelen dan Vanhaelen-Fastre 'dengan resolusi flavonoid alami dan fenol, 22 Ami dzhin et al. dan McSavage dan Wall untuk identifikasi densitometri trigliserida, 23,24 dan Giron dan Groell yang menggambarkan pemisahan diastereoisomer dari ze ranol.25 Gambar 11 dan 12 menunjukkan dua contoh yang menunjukkan fleksibilitas dari fase terbalik kromatografi planar. Sebelum meninggalkan subjek fase terbalik piring, perhatian khusus harus terbuat dari difenil-ikatan lapisan. Meskipun bagian berikat adalah aromatik dan akan d iharapkan untuk memberikan selektivitas sangat berbeda dengan fase terikat alifa tik, tampaknya memiliki sifat pemisahan yang sangat mirip dengan Rp2. Pelat ini telah digunakan untuk pemisahan steroid, sulfonamid dan peptida, tetapi dalam ke banyakan kasus resolusi dicapai adalah sedikit lebih baik dari yang diperoleh de ngan silika (C2) etil terikat gel layer.26 Amino-Berikat Tahap. Dengan cara yang sama bahwa berbagai ikatan alkil sorbents telah disiapkan, silika gel 60 juga telah secara kimia terikat dengan kelompok-k elompok aminopropil melalui hubungan siloxane (lihat Gambar 13). Lapisan yang di hasilkan cukup stabil, dan tidak seperti fase-ikatan alkil banyak adalah hidrofi lik. Dengan pilihan hati-hati pengikat, lempeng-lempeng ini dapat digunakan deng an fase gerak yang terdiri sepenuhnya dari air atau buffer. Kelompok propil memi liki beberapa sifat hidrofobik dan karena itu dapat digunakan untuk pemisahan da ri jenis fase terbalik menggunakan eluen berdasarkan berair. Karena amino (-NH2) kelompok adalah polar, kromatografi fase normal juga dimungkinkan dengan menggu nakan eluen organik lebih kurang polar dibandingkan silika dan ini memang daerah dimana sebagian besar aplikasi telah dilaporkan. Fase berperilaku dalam banyak hal seperti silika dinonaktifkan. Aplikasi utama untuk seperti biasa-fase pemisa han telah di resolusi dan penentuan steroid. Namun, penting untuk diingat bahwa fungsi amino adalah amina primer dan karenany a kimia cukup reaktif. Tergantung pada sampel dan kondisi fasa gerak, adalah mun gkin untuk memiliki reaksi yang tidak diinginkan terjadi di piring selama pengem bangan, misalnya keton atau aldehida dapat bereaksi dengan amina primer dalam ko ndisi alkali untuk membentuk basis Schiff. Di sisi lain, reaktivitas gugus amino dapat digunakan untuk keuntungan. Jadi isomer optik dapat dengan mudah terikat Sorben dan Lapisan TLC 17 dalam kondisi ringan dengan langsung dalam reaksi in s itu pada lapisan HPTLC untuk menghasilkan''''Pirkle jenis fase diam kiral (dijel askan lebih lengkap di bawah kiral-fase terikat dalam bab ini). Gambar 11 Pemisahan nukleobasa pada pelat silika gel Rp2 HPTLC Handphone fase: asetonitril / air (60 40 v / v) Contoh diterapkan: 200 nl (0,1% b / v larutan) Deteksi: UV 254 nm (TLC / HPTLC pemindai) Peaks: 1, sitosin, 2, adenin, 3, guanin, 4, urasil (Dengan izin dari Merck) Namun, sifat dasar dari kelompok amino yang telah menyebabkan area aplikasi unik . Dengan pKa ,9.5-11 untuk kelompok amino, lapisan HPTLC dapat digunakan sebagai

basa lemah anion exchanger. Dalam mode ini pemisahan yang memuaskan dari nukleo tida, asam mono dan polysulfonic, purin, pirimidin dan fenol semua telah achieve d.27-29 yang digunakan adalah campuran eluen netral yang sederhana etanol / bera ir larutan garam, yang menyediakan kondisi ideal untuk pertukaran ion terjadi . Kehadiran natrium atau lithium klorida membantu mencegah interaksi sekunder dan karenanya menghasilkan lebih tajam, bintik-bintik kurang menyebar atau band dala m kromatogram. Contoh pemisahan jenis ini ditunjukkan pada Gambar 14-16. Sebelum nya pemisahan semacam itu hanya dapat dicapai dengan PEI-selulosa (dijelaskan ke mudian dalam bab ini). Silika gel kinerja amino berikatan tinggi memberikan reso lusi lebih baik. Menggunakan mekanisme pertukaran ion yang dominan di sini, adalah mungkin untuk mempengaruhi laju migrasi dari analit dengan menggunakan larutan garam sebagai e luen dan memvariasikan konsentrasi. Hal ini dapat dilakukan dengan cara yang ter kontrol untuk mendapatkan kondisi optimum pemisahan. Dengan meningkatnya kekuata n ion, anion kurang dipertahankan dan bergerak ke depan pelarut. Hal ini ditunju kkan pada Gambar 17 dengan adenosin dan beberapa asam oligoadenylic. Seperti yan g diharapkan, adenosin bermuatan sebagian besar tidak terpengaruh oleh mekanisme pertukaran ion, dan menunjukkan sedikit perubahan nilai tingkat migrasi dengan meningkatnya konsentrasi lithium klorida. Tentu saja, perubahan pH juga akan mem pengaruhi mobilitas analit yang dipisahkan oleh ionexchange. Fitur lain yang unik dari amino-ikatan lapisan adalah kemampuan mereka untuk men yediakan reagen-bebas deteksi zat kimia tertentu. Proses ini pada dasarnya termo kimia dan terdiri dari pemanasan lapisan kromatografi setelah pembangunan untuk suhu minimal 105-C dan kadang-kadang setinggi 220-C. Pada paparan sinar UV panja ng gelombang pendek atau panjang setelah pemanasan, derivatif menunjukkan fluore sensi kuat. Jenis visualisasi sangat berguna untuk analisis kuantitatif sebagai latar belakang pada lapisan kromatografi tetap tidak terpengaruh. Seluruh proses ini dikenal sebagai aktivasi fluoresensi termokimia dan dijelaskan secara lebih rinci dalam Bab 6 (bagian 3.2). Teknik ini telah terbukti sangat cocok untuk de teksi fluorimetric karbohidrat, katekolamin, hormon steroid, dan asam buah (liha t contoh pada Gambar 18 yang menggambarkan efek dengan pemisahan karbohidrat).

Gambar 12 Pemisahan steroid pada pelat silika gel Rp18 HPTLC (Dengan izin dari Merck) Gambar 13 kelompok aminopropil kimia terikat terikat ke permukaan silika gel Gambar 14 Pemisahan nukleotida pada lapisan NH2 terikat (Pemisahan terjadi karen a variasi dalam afinitas untuk PO4 3 ?? kelompok) 10 cm piring kaca Sorben lapisan: silika gel F254 NH2 HPTLC 60 10 Handphone fase: 0,2 M natrium klorida dalam etanol / air (30 70 v / v) Deteksi: UV 254 nm, TLC / HPTLC pemindai III (CAMAG) (Dengan izin dari Merck) Siano-Berikat Tahap. Siano-fase terikat, yang disiapkan oleh ikatan kimia dari k elompok cyanopropyl melalui siloksan untuk gel silika, menyediakan jenis lebih l anjut dari fase terikat untuk TLC. Laporan pertama dari penggunaan siano-terikat piring adalah untuk pemisahan dari enam aromatics.30 polynuclear Hal ini diikut i dengan pemeriksaan singkat kesesuaian lapisan siano-untuk pemisahan pewarna li pofilik dan PTH-amino acids.31 Lebih baru-baru fase ini telah menjadi komersial tersedia sebagai pelat silika gel HPTLC menggunakan 60 dari Merck.32 Cakupan per mukaan lapisan ini kelompok siano adalah 3,5 mmol m ?? 2. Ikatan dengan matriks silika adalah sama seperti yang untuk-amino terikat lapisan seperti yang ditunju kkan pada Gambar 19. Fase siano mengisi celah dalam berbagai fase stasioner sili ka gel dengan sifat penengah antara terbalik dan normal-fase bahan. Oleh karena

itu dengan pilihan ponsel baik fase pemisahan terbalik atau normal-fasa dapat di lakukan pada lapisan KLT siano-berikat. Hal ini ditunjukkan pada Gambar 20, untu k serangkaian steroid dipisahkan bawah kedua fase kondisi normal, dengan eluen k ekuatan tinggi pelarut, dan di bawah kondisi fase terbalik, dengan kekuatan rend ah fase pelarut ponsel. Untuk fase normal, analit kurang dipertahankan pada fase siano dari pada silika gel 60, tetapi lebih dipertahankan daripada ikatan alkil -fase. Efek sebaliknya adalah kasus untuk kondisi fase terbalik. Tentu saja, uru tan elusi biasanya terbalik ketika mengubah antara normal dan fase terbalik mode . Gambar 15 Pemisahan turunan purin pada gel silika HPTLC 60 NH2 piring Fase gerak: etanol / air (80 20 v / v) dengan natrium klorida jenuh Contoh diterapkan: 300 nl dari 0,1% b / v solusi Deteksi: UV 254 nm (TLC / HPTLC pemindai) Peaks: 1, asam urat, 2, xanthine, 3, hipoksantin; 4, guanin, 5, adenin (Dengan izin dari Merck) Siano piring telah digunakan untuk berbagai macam aplikasi: turunan benzodiazepi n, pestisida, peliat, antibiotik tetrasiklin, fenol, beberapa estrogen, ester as am galat, alkaloid dan sorbat acid.32, 33 Dua contoh lebih lanjut dari pemisahan mungkin dengan piring siano diberikan dalam Gambar 21 dan 22. Dalam Gambar 21 t iga steroid dasar-line diselesaikan di bawah normal-fase kondisi lebih dari jara k migrasi depan pelarut dari 7 cm. Dengan perbandingan Gambar 22 menunjukkan pem isahan fase terbalik dari delapan alkaloid selama jarak migrasi yang sama. Penam bahan amonium bromida 0,1 M untuk pelarut ketika kondisi reversedphase digunakan , meningkatkan bentuk puncak. Kepribadian ganda normal dan fase terbalik-untuk tahap siano-ikatan yang unik me mungkinkan pemisahan dua dimensi yang harus dicapai. Sampel diterapkan sebagai t empat dekat salah satu sudut piring. Lapisan ini dikembangkan linear dalam satu dimensi dengan fase normal yang khas pelarut. Migrasi ini dibiarkan berlanjut sa mpai depan pelarut hampir mencapai ke atas piring. Setelah pengeringan yang tepa t, lapisan ini kemudian dikembangkan dalam dimensi kedua (pada 90 - ke arah yang pertama) menggunakan eluen fase terbalik. Migrasi dari depan pelarut dibiarkan terus seperti sebelumnya. Hasil pemisahan menunjukkan pola sidik jari''''dari ko mponen sampel, unik untuk sistem pelarut digunakan. Gambar 23 menunjukkan pemisa han metabolit asam empedu dan kolesterol, resolusi sulit dicapai dalam satu dime nsi TLC. Dua-dimensi pemisahan yang mudah dilakukan di TLC dan sangat berguna un tuk sampel yang mengandung banyak komponen yang tidak mudah diselesaikan dengan teknik lain. Diol-Berikat Tahap. Polaritas fase diol-ikatan ini sangat mirip dengan fase sian o. Gambar 24 mengilustrasikan hal ini retensi serupa steroid netral di bawah ked ua kondisi normal dan fase terbalik meskipun fase diol-ikatan digunakan untuk no rmal-preferentially fase pemisahan partisi. Pelat dimodifikasi untuk tingkat maksimum mungkin dengan kelompok alkil eter ber damping diol terikat melalui siloksan ke permukaan gel silika dengan prosedur si lanisation biasa. Struktur yang dihasilkan dari kelompok diol terikat pada matri ks gel silika ditunjukkan dalam Gambar 25. Gambar 16 Pemisahan asam sulfonat naftalena pada HPTLC NH2 piring Handphone fase: etanol / amonia, pH 12 (60 40 v / v) th 0,18 mM natrium klorida Contoh diterapkan: 200 nl sebesar 0,5% b / v solusi Deteksi: UV 254 nm (TLC / HPTLC pemindai) Peaks: 1, naftalena-1 ,3,7-trisulfonic asam; 2, naftalena-1 ,3,6-trisulfonic asa m; 3, naftalena-1 ,5-disulfonic asam; 4, naftalena-1-asam sulfonat (Dengan izin dari Merck) Gambar 17 Ketergantungan dari nilai-nilai Rf adenosin dan oligomer pada konsentr

asi lithium klorida dalam fase gerak pada lapisan HPTLC NH2 Handphone fase: metanol / air (90 10 v / v) th lithium klorida Contoh diterapkan: 200 nl dari 0,1% b / v solusi Deteksi: UV 254 nm Senyawa: * adenosin; ^ ApA, m Apapa; j ApApApA (Dipetik dari W. Jost, dan DIA Hauck, Kemajuan dalam Kromatografi,, 1987 p 157 o leh milik Marcel Dekker Inc) Gambar 18 Pemisahan karbohidrat pada silika gel piring HPTLC NH2 Fase gerak: AMD gradien berdasarkan asetonitril-air-aseton. (15 langkah) (AMD te knik dijelaskan dalam Bab 5) Deteksi: UV 366 nm (Gambar dipanaskan pada 150-C selama 3-4 menit) Peaks: 1, maltohexose, 2, maltopentose, 3, maltotetrose, 4, maltotriose; 5, malt osa, 6, sakarosa, 7, glukosa; 8, fruktosa, 9, xilosa, 10, rhamnose; 11, deoksi-r ibosa (Dipetik dari CAMAG aplikasi catatan A-58.1 oleh courtesy of CAMAG, Muttenz, Swi ss) Gambar 19 kelompok cyanopropyl kimia terikat terikat ke permukaan silika gel Gambar 20 Pemisahan perbandingan pelat silika gel CN ??HPTLC dengan lapisan beri kat lain di bawah, (a) normal fase adsorpsi, (b) fase terbalik partisi Handphone fase: (a) minyak eter (40-60-C) / aseton (80:20 v / v) (b) aseton / ai r (60: 40 v / v) Senyawa: * hidrokortison, substansi j Reichstein itu; m metiltestosteron (Dipeti k dari Prosiding Simposium Internasional 2 pada HPTLC Instrumental -, Wu rzburg 1985 1985, p86, dengan sopan santun Prof Dr RE Kaiser, Institut fu R Chromatogra phie) Gambar 21 Pemisahan hormon steroid pada silika gel 60 CN HPTLC piring. Normalpha se pemisahan Handphone fase: petroleum eter (40-60-C) / etanol (80 20 v / v) Contoh diterapkan: 200 nl (20 mg/10 ml) Deteksi: 5% asam perklorat dalam metanol diikuti dengan pemanasan pada 110-C sel ama 5 menit. UV 366 nm, CAMAG TLC / HPTLC pemindai Peaks: 1, 1,4-androstene-3 ,17-dion, 2, 2-progesteron 3, 3-pregnenolon (Dengan izin dari Merck) Gambar 22 Pemisahan alkaloid pada silika gel 60 CN HPTLC piring. Pemisahan fase terbalik Handphone fase: methanol/propan-1-ol/25% amonia soln. / air (30 20 TH 1 50 v / v ) th 0,1 mol l ?? 1 amonium bromida Contoh diterapkan: 300 nl Deteksi: UV 254 nm, CAMAG TLC / HPTLC pemindai Peaks: 1, emetine klorida (40 mg/10 ml), 2, kina (10 mg), 3, atropin (300 mg), 4 , brucine (10 mg); 5, skopolamin (300 mg); 6, kafein ( 30 mg); 7, nikotinamida ( 20 mg), 8, tropik asam (300 mg) (Dengan izin dari Merck) Gambar 23 2-D pemisahan metabolit asam kolesterol dan empedu di piring silika ge l 60 CN HPTLC Handphone fase: 1 Dimensi: aseton / air (50 50 v / v) dimensi 2: minyak eter (40 -60-C) / aseton (70 tanggal 30 v / v) Deteksi: MnCl2-asam sulfat. Panas untuk 110-C (5 menit.). UV 366 nm

Senyawa: 1, asam kolat, 2, asam dehydrocholic, 3, metil ester asam kolat, 4, asa m chenodesoxycholic; 5, asam desoxycholic, 6, 7-hidroksi-kolesterol, 7, asam lit hocholic; 8, kolesterol (Dengan izin dari Merck) Gambar 24 Pemisahan perbandingan pelat silika gel diol HPTLC dengan lapisan beri kat lain di bawah, (a) normal fase adsorpsi, (b) fase terbalik partisi Handphone fase: (a) minyak eter (40-60-C) / aseton (80 20 v / v) (b) aseton / ai r (60 40 v / v) Senyawa: j hidrokortison, substansi m Reichstein itu; * metiltestosteron (Dengan izin dari Merck) Gambar 25 kimia terikat propil-glikol kelompok terikat ke permukaan silika gel Lapisan adalah hidrofilik di alam dan sering berperilaku dalam cara yang mirip d engan gel silika dimodifikasi 60 dalam perilaku kromatografi nya. Namun, sebagai mekanisme utama adalah fase normal partisi, retensi komponen sampel dapat diuba h diduga. Ada juga dua perbedaan utama lainnya: 1. Kelompok-kelompok hidroksil dari fase diol mengambil bentuk suatu glikol. Sil ica gel 60 telah sebagai aktif kelompok yang''''primer hidroksil (silanol). Seba gai fungsi hidroksil menentukan retensi, sifat ini dapat mempengaruhi kromatogra fi. 2. Fungsi diol diikat melalui kelompok spacer alkil eter. Hal ini juga dapat mem pengaruhi perilaku kromatografi. Jadi sebagai komponen aturan umum sampel bermig rasi lebih lanjut pada tahap diol dibandingkan dengan gel silika 60 untuk jarak yang sama mengembangkan depan pelarut dan pelarut migrasi. Piring HPTLC diol telah terbukti berguna untuk sejumlah glikosida digitalis term asuk pemisahan, steroid anabolik, amina aromatik dan terutama dihydroxybenzoic a cids.34-36 Angka 26 dan 27 menunjukkan dua ini. Sebuah pemisahan dasar-line deka t glikosida digitalis terapi yang berguna dengan mudah dapat diperoleh melalui j arak migrasi pelarut dari 8 cm. Dengan perbandingan pemisahan yang lebih sulit d ari steroid yang ditunjukkan pada Gambar 27 dengan estradiol saja diselesaikan d ari etinilestradiol. Gambar 26 Pemisahan glikosida digitalis pada silika gel 60 piring diol HPTLC Handphone fase: etil asetat / amonia soln. 25% (100 TH 1 v / v) Contoh diterapkan: 100 nl dari 0,1% b / v soln Deteksi: MnCl2 - asam sulfat. Panas pada 110-C selama 10 menit UV 366 nm, CAMAG TLC / HPTLC pemindai Peaks: 1, lantoside C, 2, digoksin, 3, digitoxin, 4, digoxigenin, 5, a-acetyldig oxin, 6, digitoxigenin (Dengan izin dari Merck) Gambar 27 Pemisahan steroid anabolik pada silika gel 60 piring diol HPTLC Handphone fase: di-iso-propil eter / asam asetat (100 1 v / v) Contoh diterapkan: 300 nl dari 0,1% b / v soln Deteksi: MnCl2 - asam sulfat. Panas pada 110-C selama 5 menit. UV 366 nm CAMAG T LC / HPTLC pemindai Peaks: 1, 19-nortestosterone, 2, methoxyprogesterone, 3, progesteron, 4, 17bestr adiol; 5, 17a-etinilestradiol, 6, meso-hexestrol (Dengan izin dari Merck) Fase kiral-Berikat. Karena salah satu enansiomer obat mungkin terapi aktif, seda ngkan yang lainnya mungkin non-aktif, dari aktivitas yang berbeda atau bahkan be racun, pemisahan isomer optik telah menjadi kebutuhan yang semakin penting dalam industri farmasi. Ada juga peningkatan minat di bidang agrokimia mana pestisida

dapat bervariasi dalam potensi tergantung pada isomer optik ini. Pada saat ini terdapat banyak fase stasioner yang telah dikembangkan untuk HPLC dan GC, yang a kan menyelesaikan sejumlah besar enantiomer. Namun, dalam kromatografi planar ol eh fase perbandingan beberapa berikat saat ini tersedia secara komersial, meskip un nomor telah dijelaskan dalam literatur. Pada tahun 1983, Wainer et al.37 melaporkan persiapan sukses dari sebuah piring ionicallybonded kiral KLT menggunakan N-(3,5-dinitrobenzoyl)-R-(-)-phenylglycine , fase awalnya dirancang oleh Pirkle et al.38, 39 ini reagen dilarutkan dalam te trahidrofuran dan memungkinkan untuk bermigrasi linear melalui pelat KLT amino-b erikat. Proses ini lambat dan lengkap derivatisasi atas seluruh piring sulit kar ena migrasi pelarut baik di depan dari zona reaksi. Gugus amino terikat adalah a mina primer dan dengan demikian reaktif cukup untuk reaksi segera terjadi. Hal i ni dimungkinkan untuk mempersiapkan pelat tersebut baik dengan ikatan ionik atau ikatan kovalen lebih stabil dengan teknik pencelupan. Proses ikatan kovalen dic apai di bawah atmosfer nitrogen dan dengan adanya katalis. Kedua R-aphenylglycin e dan L-leusin derivatif telah disusun. Lempeng ini relatif stabil jika ditumpuk disimpan dalam kondisi kering dalam desikator. Untuk sebagian besar aplikasi, i katan ion adalah cukup memadai untuk rentang pemisahan kiral mungkin dengan fase ini. Pelat disiapkan hanya dengan mencelupkan piring HPTLC aminobonded dalam la rutan 0,3% dari pemilih kiral dalam kering tetrahidrofuran (THF). Kelebihan reag en dihapus dengan pelarut kering. Tahap kiral yang dihasilkan memiliki struktur yang ditunjukkan pada Gambar 28. Gambar 28 Struktur dari reagen Pirkle terikat pada silika gel aminopropil. (R1 a dalah-H, dan R2 adalah alkil-atau-aril) Gambar 29 Interaksi 2,2,2-trifluoro-1-etanol (9-anthryl) dengan Pirkle reagentbo nded lapisan (R1 adalah-H, dan R2 adalah alkil-atau-aril)

Gambar 30 Pemisahan (TH) dan (??) enantiomer 2,2,2-trifluoro-1-etanol (9-anthryl ) menggunakan CSP1 amino terikat HPTLC piring. Handphone fase: n-hexane/propan-2 -ol (80 20 v / v). Scan di 380 nm dengan scanner TLC / HPTLC CAMAG Pengakuan kiral enantiomer pada fase ini''''Pirkle tergantung pada interaksi yan g melibatkan hidrogen threepoint-ikatan, interaksi antara kelompok-kelompok arom atik pp atau tidak jenuh, di mana satu adalah p-donor dan satunya p-akseptor, da n dipol susun. N-(3,5-dinitrobenzoyl)-R-(-)-a-phenylglycine dapat menyediakan si tus untuk hidrogen-ikatan di 4NH dan 4C fungsi O dan kelompok bertindak sebagai akseptor dinitrophenyl p-. Jika dalam sampel, kelompok yang dapat ikatan hidroge n yang hadir dekat dengan pusat kiral dan gugus aromatik hadir yang merupakan pdonor, maka salah satu enansiomer akan dipertahankan lebih kuat dari yang lain k arena interaksi yang lebih menguntungkan. Seperti tiga titik interaksi biasanya menghasilkan enantiomer diselesaikan dengan baik (lihat Gambar 29). Namun, pemis ahan yang memadai seringkali dapat diperoleh dengan interaksi yang lebih sedikit . Menggunakan jenis-kiral terikat TLC piring, pemisahan senyawa tes seperti (^) 2,2,2 - trifluoro-1-(9-anthryl) etanol (yang mengandung karbon tunggal pusat asi metris) dan (^) 2,20 -bi-2-naftol (ketidaksimitrisan akibat rotasi terhalang) ke masing-masing enansiomer telah demonstrated.40 (enansiomer pemisahan mantan dit unjukkan pada Gambar 30.) Hexobarbital, beberapa derivatisasi benzodiazepin dan b-blocking obat juga telah dipisahkan pada kedua L-leusin dan Ra-phenylglycine kiral phases.40, 41 Namun, b-blocker diperlukan dengan 1-isocyanatonaphthalene sebelum pemisahan. Masalah u tama dengan jenis fase diam kiral adalah sensitivitas yang relatif rendah dan ap likasi yang terbatas. Secara khusus deteksi reagen banyak yang tidak dapat digun akan karena reaksi dengan asam amino hadir latar belakang pada permukaan silika gel menghasilkan warna latar belakang. Selain itu''''Pirkle masker pemilih kiral

indikator neon anorganik (F254s) dimasukkan ke dalam amino-piring HPTLC berikat . Sebuah cara yang mungkin untuk mengatasi masalah melibatkan ikatan bagian dari pelat HPTLC dengan reagen Pirkle, bercak racemate di tepi bawah daerah ini, dan melanjutkan dengan migrasi linier normal dengan pelarut yang sesuai sampai enan siomer terpisah, dan melewati ke zona tidak bereaksi. Isomer dipisahkan kemudian dideteksi dengan cara normal di bawah sinar UV atau dengan reagen derivatisasi. Dengan cara ini sensitivitas ditingkatkan. Pelarut untuk pemisahan pada fase in i Pirkle''''terdiri hampir seluruhnya dari n-heksana - propan-2-ol campuran. Brunner dan Wainer juga menyiapkan piring urea-ikatan naphthylethyl TLC mengikut i metode yang dijelaskan oleh Oi, et al.42 43 R-(-) -1 - (1-naftil) isosianat et il direaksikan dengan silika gel jenis aminopropil HPLC. TLC fase terikat hanya dengan mencelupkan sebuah disiapkan pelat KLT / HPTLC aminopropil ke dalam larut an 1% dari isosianat naftil dalam diklorometana selama lima menit. Fase ini tida k menderita dari masalah latar belakang gangguan pada UV yang terkait dengan fas e Pirkle sebelumnya. Yang bagian naftil adalah p-dasar (p-donor) dan karena itu sangat berguna untuk pemisahan enansiomer mengandung asam p-kelompok, misalnya d initrobenzoyl turunan dari asam amino. Serangkaian dari asam-methylarylacetic, ( ibuprofen, dan naproxen fenoprofen) juga telah dipisahkan setelah konversi untuk masing-masing 3,5-dinitroanilides. Persiapan fase b-siklodekstrin, terikat silika, juga telah described.44, 45 Hasi l kromatografi yang diperoleh sangat bergantung pada sumber gel silika, cakupan lapisan, dan jenis pengikat yang digunakan. Fase gerak digunakan dengan fase ini terdiri dari metanol atau asetonitril dalam air atau buffer. Penggunaan buffer meningkatkan resolusi dan efisiensi. Beberapa pemisahan enantiomer dansyl asam a mino, alanin-b-naphthylamides dan metallocenes telah dilaporkan pada fase ini. N amun, sebagian kiral KLT bekerja dengan siklodekstrin telah dicapai dengan mengg unakan mereka sebagai aditif fase gerak. Saat ini lapisan kiral paling sukses TLC (dan satu-satunya yang tersedia secara komersial) bukan fase terikat, tetapi fase dilapisi terdiri dari turunan asam am ino hidroksiprolin di hadapan garam tembaga. Ini membentuk fase ligandexchange k etika dilapisi pada sebuah berikat Rp18 fase terbalik piring. Metode persiapan d idasarkan pada karya Davankov et al. 46,47 yang mengembangkan teknik ini dengan kolom HPLC. Ini melibatkan mencelupkan sebuah pelat KLT Rp18 terikat ke dalam la rutan (II) asetat tembaga (0,25% b / v) diikuti oleh larutan pemilih kiral (0,8% ), biasanya N-(20-hydroxydodecyl)-4-hidroksiprolin (Gambar 31). Setelah pengerin gan udara piring siap digunakan. Gambar 31 Struktur pemilih kiral, (2S, 4R, 20RS)-N-(20hydroxydodecyl)-4-hidroksi prolin digunakan dalam penyusunan pertukaran ligan piring Gambar 32 Pemisahan dipeptides pada Chir HPTLC piring Fase gerak: metanol-propan-1-ol-air (50 10 40 v / v) Deteksi: ninhidrin semprot (0,5% b / v pada butan-1-ol). Panas pada 120-C selama 10 menit. Terlihat scan pada 420 nm (CAMAG TLC / HPTLC Scanner) Peaks: 1, D-Leu - L-Leu, 2, L-Leu - D-Leu (Dengan izin dari Merck) Mekanisme pemisahan enantiomer melibatkan pembentukan kompleks diastereoisomeric dengan ion logam. Stabilitas ini kompleks transien berbeda tergantung pada isom er optik individu dan karenanya retensi pada fase diam akan bervariasi dan enant iomer dapat diselesaikan. Ini pelat ligandexchange tersedia dari Macherey-Nagelb sebagai''''Chiralplates dan Merck sebagai''''Chir. Chiralplate adalah piring ka ca TLC, sementara Chir adalah baik suatu HPTLC atau piring kaca TLC. Kedua jenis ligan-tukar pelat telah terbukti cocok untuk resolusi yang paling asam amino, t erhalogenasi, N-alkil dan hidroksi asam-asam amino, turunan thiaxolidine, dipept ides dan catecholamines.48-51 Sebagai contoh resolusi yang sangat baik sering di peroleh, Gambar 32 menunjukkan pemisahan dari dua isomer optik dari peptida deng an campuran pelarut sederhana. Kuantifikasi juga telah terbukti berhasil, dengan

kedua TLC dan lapisan HPTLC dan, misalnya telah memungkinkan untuk mengukur jum lah nanogram L-triptofan di hadapan jumlah mikrogram D-triptofan. Gambar 33 menu njukkan kromatogram, sementara kurva kalibrasi untuk menentukan konsentrasi yang tidak diketahui satu enansiomer ditunjukkan pada Gambar 34. Gambar 33 Penentuan komposisi enantiomerik DL-triptofan pada rasio ekstrim dari antipodes, sebuah: 1:100, b: 1:200, c: 1:1000 Handphone fase: metanol-air-asetonitril (50 50 30 v / v) Peaks: 1, D-triptofan, (a) 10 mg, (b) 10 mg, (c) 10 mg, 2, L-Tryptophan, (a) 100 ng, (b) 50 ng, (c) 10 ng (M. Mack, HE Hauck, dan H. Herbert, J. Planar Kromatografi, 1988, 1, 307, dengan izin dari penerbit) Gambar 34 Kurva Kalibrasi D-Tryptophan Contoh diterapkan: 75 ng Konsentrasi: 100, 250, 500, 750, 1000, dan 1500 ng Deteksi: ninhidrin semprot (0,5% b / v pada butan-1-ol). Panas pada 120-C selama 10 menit. Scan di 520 nm (CAMAG TLC / HPTLC Scanner) (M. Mack, HE Hauck, dan H. Herbert, J. Planar Kromatografi, 1988, 1, 308, dengan izin dari penerbit) 1,3 Non-silika Sorben 1.3.1 Selulosa Selulosa, sebuah produk dari alam, memiliki struktur polimer yang terdiri dari u nit glukopiranosa bergabung bersama oleh jembatan oksigen. Seperti ditunjukkan d alam Gambar 35, sebuah profesi kelompok hidroksil yang hadir yang tersedia untuk hidrogen-ikatan. Air teradsorpsi atau alkohol dapat dipertahankan oleh interaks i ini, membuat selulosa fase yang ideal untuk pemisahan zat hidrofilik seperti a sam amino, karbohidrat, ion anorganik dan asam nukleat derivatives.52-59 Dua jenis selulosa yang digunakan dalam kromatografi planar. Salah satunya adala h serat asli dengan polimerisasi yang khas antara 400-500 unit glukopiranosa, (d igunakan untuk kromatografi kertas dan dalam beberapa lapisan KLT). Yang lainnya adalah bentuk mikrokristal yang biasa disebut 'Avicel', serbuk halus digunakan secara luas di kedua TLC dan HPTLC, dan disiapkan oleh teknik hidrolisis. Ia mem iliki derajat polimerisasi 4-20 unit glukopiranosa. Selulosa diperoleh dari seju mlah bahan baku, termasuk kayu dan kapas. Namun, mantan penyulingan tidak memerl ukan lebih banyak dan memiliki kandungan selulosa yang lebih rendah. Gambar 35 Struktur selulosa menggambarkan efek-ikatan hidrogen dengan air Untuk persiapan TLC / HPTLC piring, teknik bubur mirip dengan yang dibutuhkan un tuk gel silika digunakan. Namun, tidak seperti gel silika, pengikat tidak diperl ukan. Hasil kromatografi diperoleh dengan baik berserat atau jenis mikrokristali n dapat berbeda. Namun, apapun jenis, resolusi sampel umumnya tidak tajam didefi nisikan sebagai yang diperoleh dengan gel silika. Bintik-bintik dan band lebih m enyebar dan waktu pemisahan biasanya lebih panjang. Pra-dilapisi pelat tersedia dari sebagian besar pemasok pelat KLT, tetapi pasokan hanya sedikit lapisan kine rja tinggi. Difusi zona kromatografi sangat berkurang dengan selulosa HPTLC, tap i harus ingat untuk mematuhi ketat penerapan jumlah kecil (, 100 ng) dari sampel dengan diameter tempat terakhir sekitar 1 mm. Komersial pra-dilapisi pelat selu losa biasanya dibuat sebagai lapisan tipis daripada gel silika, nominal 0,1 mm t ebal. Dalam beberapa tahun terakhir selulosa telah menurun dalam popularitas sebagai m etode telah beralih ke yang didasarkan pada silika gel atau dengan teknik lain. Namun, banyak pemisahan telah didasarkan pada selulosa dan masih secara luas dig unakan untuk pemisahan asam amino, terutama di laboratorium klinis rumah sakit d i mana peningkatan abnormal pada asam-asam amino tertentu dalam sampel darah ata u urin dapat menunjukkan adanya sejumlah penyakit ( peningkatan fenilalanin meru

pakan indikasi dari phenylketourea). Dua-dimensi metode yang digunakan dengan du a perkembangan pada setiap dimensi dengan pengeringan menengah. Sebuah asam amin o yang khas''''pola sidik jari yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar 36. Aminoasam yang dideteksi dengan ninhidrin semprot setelah pembangunan atau ninhidrin dapat dimasukkan ke dalam langkah pembangunan akhir sebagai bagian dari campuran pelarut. Prosedur ini yang terakhir menghindari masalah menggunakan reagen semp rot berpotensi berbahaya dan mempersingkat waktu analisis. Namun, penting dalam hal ini untuk memastikan bahwa pelarut berkembang akhir tidak mengandung amonia, amina, atau amida seperti ini biasanya akan membentuk kromofor diwarnai dengan ninhidrin tersebut. Kromatogram yang dihasilkan akan menjadi miskin karena warna latar belakang yang tinggi. Gambar 36 2-dimensi pemisahan asam-asam amino pada selulosa dilapisi lembaran al uminium KLT Handphone fase: Sebuah pelarut: butan-1-ol-asam propionat air (40 10 10) [1 dime nsi] pelarut B: pentan-1-ol-butanone-piridin-air (20 20 20 15) [2 dimensi] Deteksi: ninhidrin semprot (0,5% b / v pada butan-1-ol). Panas pada 120-C selama 10 menit 1.3.2 Fase Selulosa Berikat PEI Selulosa. PEI selulosa adalah selulosa dimodifikasi polyethyleneimine yang b ertindak sebagai penukar anion kuat dasar. Ia telah menggunakan cukup spesifik t ermasuk analisis nukleotida, nukleosida, dan nukleosida-basa, asam vanadylmandel ic (VMA), dan gula phosphates.60 Untuk aplikasi ini PEI selulosa adalah sorben p ilihan selama bertahun-tahun. Sebagian besar pemisahan sekarang dicapai pada ami no terikat lapisan silika gel dengan resolusi ditingkatkan. TLC PEI lapisan selu losa memerlukan penyimpanan pada 0-4-C untuk mengurangi kerusakan. Sebagai pirin g menjadi tua, lapisan mengambil pada warna cokelat pucat, dan harus dibuang. Selulosa asetat. Selulosa asetat, terutama triacetyl-selulosa, yang disiapkan ol eh reaksi kimia dari kelompok hidroksil pada selulosa untuk menghasilkan lapisan dengan karakteristik fase terbalik. Penggunaan utama selama bertahun-tahun tela h untuk pemisahan hidrokarbon poliaromatik, daerah penting dari bunga. Namun, da lam banyak kasus telah digantikan oleh terikat terbalik-fase gel silika. Dalam masa yang lebih baru penggunaan selulosa asetat sebagai lapisan kiral untu k pemisahan isomer optik telah investigated.61 Resolusi enansiomer sangat tergan tung pada struktur selulosa dan isi asetil dari triasetat selulosa. Hasil terbai k diperoleh dengan lapisan mikrokristalin selulosa triasetat (ukuran partikel 10 mm) dengan silika gel 60 pengikat. Meskipun garam natrium dari karboksimetilsel ulosa juga telah digunakan sebagai pengikat, silika gel memungkinkan penggunaan eluen berbasis berair. Seperti kolom pemisahan enantiomer, campuran etanol atau propan-2-ol (70-80%) dengan air (20-30%) berfungsi dengan baik sebagai fase gera k. Resolusi bervariasi sesuai dengan konsentrasi pelarut organik dalam eluen. In i juga telah mengamati bahwa suhu memiliki efek yang nyata pada kualitas pemisah an. Umumnya sebagai kenaikan suhu 25-40-C, resolusi enantiomer decreases.61 Rasemat dari sejumlah spesies organik telah dipisahkan pada lapisan KLT dari mik rokristalin selulosa triasetat. Ini termasuk senyawa tertentu seperti benzoin, k apur barus metil eter, flurbiprofen, 1 - (2-naftil) etanol, aminoglutethimide, 1 ,10-binaphthyl-2 ,20-diamina, N-[1 - (naftil) etil] asam phthalamic, dan beberap a derivatised amino-acids.61 Namun, sampai saat ini penggunaan kromatografi lapi san ini belum dikembangkan secara komersial mungkin karena waktu pengembangan ya ng lama yang dibutuhkan (sekitar 2,5 jam) untuk migrasi cukup analit. Karboksimetil (CM) dan Diethylaminoethyl (DEAE) Selulosa. Karboksimetil selulosa dan diethylaminoethyl yang dipersiapkan sebagai pertukaran ion media, mantan ad alah asam lemah dan yang terakhir adalah sangat dasar. Kapasitas pertukaran seri ng dekat dengan orang-orang untuk resin pertukaran ion, tetapi perilaku mereka s ering sangat berbeda. Hal ini disebabkan sifat hidrofilik selulosa dasar dibandi ngkan dengan sifat hidrofobik dari polimer dasar dalam bahan resin. 1.3.3 Oksida Aluminium

Aluminium oksida atau alumina, silika seperti gel, adalah sorbent sintetis. Hal ini dibuat dalam tiga rentang pH, asam, basa, dan netral untuk berbagai jenis sa mpel. Jadi dalam kondisi berair senyawa asam seperti fenol, sulfonat, karboksila t, dan asam amino yang dipisahkan pada alumina asam, sedangkan senyawa dasar, am ina, imines, dan pewarna dasar, dipisahkan pada alumina dasar. Senyawa netral, s eperti aldehid, keton dan lakton yang dikromatografikan pada alumina netral. Dar i tiga jenis, alumina dasar adalah yang paling banyak digunakan. Dalam non-berai r eluen, hidrokarbon aromatik, karotenoid, porphorins, alkaloid, dan steroid dap at teradsorpsi. Seperti dengan gel silika, alumina juga akan bervariasi dalam ke giatan sesuai dengan kadar air. Tingkat aktivitas telah dinilai sesuai dengan Br ockmann dan Schodder.62 Tabel 5 menunjukkan grading Brockmann sesuai dengan kada r air dari alumina. Beberapa produsen menawarkan tipe T dan E dalam jangkauan pelat TLC alumina mere ka. Biasanya ada perbedaan dalam ukuran pori-pori, tetapi perlu dicatat bahwa ti pe T dinyalakan pada suhu yang lebih tinggi. Nilai Brockmann untuk tipe E menyer upai aktivitas yang saya sedangkan tipe T menyerupai aktivitas II. Alumina kimia wi lebih reaktif dari silika gel dan ini dapat menyebabkan masalah dengan bebera pa sampel. Reaksi dapat terjadi dalam hilangnya lapisan sorben menyebabkan anali t selama kromatografi. Seperti selulosa, alumina sekarang juga menurun dalam pop ularitas, dan satu akan perlu untuk berkonsultasi dengan bibliografi tua untuk a plikasi. 1.3.4 kieselguhr Kieselguhr adalah tanah diatom alami, terdiri dari sisa-sisa kerangka organisme laut mikroskopis disimpan di masa lalu. Meskipun silikon dioksida terutama, juga mengandung berbagai jumlah oksida lainnya dari aluminium, besi, titanium, magne sium, natrium, kalium dan kalsium sebagai oksida, hidroksida, dan karbonat (seki tar 10% dalam semua) .63 Hal ini banyak digunakan sebagai filter bantuan karena porositas tinggi (diameter pori rata-rata cukup bervariasi, biasanya 65 000 A). Kieselguhr digunakan dalam hubungannya dengan 15% dari pengikat kalsium sulfat u ntuk menghasilkan pelat KLT. Variabilitas ukuran pori dan luas permukaan membata si penggunaan kieselguhr untuk TLC berkualitas, presisi tinggi. Telah digunakan di masa lalu untuk pemisahan senyawa polar dengan mekanisme partisi. Komersial p ra-piring dilapisi dengan bahan pengikat organik tahan abrasi telah tersedia sel ama bertahun-tahun, meskipun penggunaan mereka telah berkurang dalam beberapa ka li. Tabel 5 Brockmann dan Schodder grading aktivitas untuk aluminium oksida untuk kr omatografi

Gambar 37-ikatan Hidrogen dari air dengan poliamida (nilon 66). Senyawa yang aka n membentuk ikatan hidrogen kuat akan membutuhkan pelarut elutive kuat untuk men yebabkan migrasi 1.3.5 Poliamida Fase poliamida yang dihasilkan dari polycaprolactam (nilon 6), polyhexamethyldia minoadipate (nilon 66), atau asam polyaminoundecanoic (nilon 11). Pemisahan krom atografi pada poliamida tergantung pada ikatan hidrogen-kemampuan amida dan gugu s karbonil (Gambar 37). Kekuatan ikatan yang dihasilkan tergantung pada jumlah d an posisi fenolik apapun, gugus hidroksil atau karboksil hadir dalam komponen sa mpel. Retensi relatif dari analit bergantung pada pelarut eluting yang mampu mem isahkan obligasi ini. Sebagai pelarut bermigrasi melalui sorben, analit terpisah sesuai dengan kemudahan pemindahan. Campuran dari fenol, indol, steroid, basa asam nukleat, nukleosida, dinitrosulfo nyl (DNS), dinitrophenyl (DNP), dan isotiosianat dimethylaminoazobenzene (DABITC ) derivatised asam amino, senyawa nitro aromatik dan semuanya telah diselesaikan pada polyamide.64-67 A berbagai pra-dilapisi lembaran dengan aluminium atau bac king plastik tersedia secara komersial, termasuk satu cukup unik lembar 15 cm pe rsegi plastik yang dilapisi pada kedua sisinya dengan poliamida 6. Dengan pelat

ini, sampel yang mengandung, misalnya, asam amino derivatif yang diterapkan ke s atu sisi sementara standar diletakkan di sisi lain. Setelah kromatografi aminoac ids dikenal dapat diambil segera. Pendekatan baru ini telah berhasil diterapkan untuk PTH, dansyl, dan DNP asam-asam amino. 1.3.6 Fase stasioner Miscellaneous Kurang fase lainnya yang umum digunakan termasuk magnesium silikat, kitin dan Se phadexTM. Magnesium silikat bubuk, putih keras sering dikenal dengan nama Floris ilTM. Para produsen, Floridin, (Pittsburgh, AS) memberikan luas permukaan kelas TLC 298 m2 g sebagai ?? 1 dan pH sebagai 8,5. Telah dilaporkan sebagai cocok unt uk pemisahan karbohidrat dan derivatives.68 Kitin adalah polisakarida terdiri terutama dari 2-acetamide-2-deoksi-D-glukan mo lekul dihubungkan melalui jembatan oksigen dalam tipe yang sama struktur selulos a tetapi dengan sifat dasar. Luas permukaan spesifik yang khas rendah, hanya 6 m 2 g ?? 1. Kitin telah digunakan terutama untuk pemisahan asam amino, tetapi juga telah diterapkan untuk ion anorganik, asam nukleat, fenol dan dyes.69 Sephadex adalah nama dagang dari Kimia Pharmacia Baik untuk berbagai bahan filtr asi gel. Mereka dimodifikasi gel dekstrin, hidrofilik dan netral di alam. Mereka jarang digunakan dalam KLT sebagai lapisan sulit untuk menyiapkan, dan memerluk an pra-bengkak selama berjam-jam sebelum digunakan. Sephadex telah digunakan unt uk pemisahan peptida dan nukleat acids.70 1.3.7 Fase stasioner Campuran Fase campuran, misalnya silika gel / kieselguhr, silika gel / alumina dan selulo sa / silika gel kadang-kadang digunakan untuk aplikasi khusus. Namun, mereka ham pir selalu memerlukan persiapan lapisan khusus dengan rasio tertentu komponen. B eberapa komersial pra-dilapisi pelat yang tersedia. Silica gel / kieselguhr tela h digunakan untuk ion anorganik, herbisida dan beberapa steroids.71-73 Selulosa / silika gel menemukan aplikasi dalam pemisahan pengawet makanan, dan antibiotic s.74, 75 Silica gel / alumina telah sedikit digunakan dalam terakhir dua puluh t ahun. 1.3.8 Fase Ganda Piring fase ganda adalah inovasi yang lumayan baru yang melibatkan dua fase stas ioner yang berbeda pada satu pelat KLT. Biasanya dua fase yang normal dan fase t erbalik seperti dalam kasus Multi Whatmanc KCS5 dan sc5 piring fase ganda, tetap i kombinasi lain yang mungkin jelas. Adalah penting bahwa ada, tajam lurus, anta rmuka tingkat antara fase. Pelat yang digunakan dalam dua dimensi, dalam satu ar ah sebagai pemisahan yang normal-fase pada gel silika, kemudian setelah pengerin gan, dalam arah kedua sebagai pemisahan fase terbalik pada gel silika Rp18. Hal ini menghasilkan peta''dua dimensi''atau''''sidik jari dari komponen sampel. Dua -dimensi TLC memungkinkan untuk resolusi sejumlah besar komponen dari perkembang an linier normal. Contoh penggunaan plat fase ganda ini meliputi pemisahan sulfo namida dan empedu acids.76 2 Persiapan Lembar TLC dan Pelat 2,1''Home Made''Pelat TLC Sebelum munculnya komersial pra-dilapisi pelat KLT, lapisan silika gel dan sorbe nts lain (misalnya selulosa atau aluminium oksida) harus dipersiapkan terlebih d ahulu prosedur pemisahan. Sebuah metode yang khas adalah untuk benar-benar campu ran 30 g sorben dengan 60 ml air dengan gemetar dalam labu kaca. Bubur yang diha silkan dipindahkan ke spreader dan diterapkan secara merata di atas permukaan pi ring dalam satu operasi menyebar. Bubur diterapkan diizinkan untuk menetapkan da n kering selama sekitar 30 menit. Akhir aktivasi selesai dalam oven selama 30 me nit pada suhu maksimum 105-C. Untuk meningkatkan pengikatan gel silika ke backin g lembam binder gipsum ditambahkan; Stahl dianjurkan 13% dari kalsium sulfat. Me skipun lapisan lembut dan mudah rusak, itu tetap menempel ke backing kaca ketika fase bergerak bermigrasi melintasi plate. Ini pelat silika gel diberi sebutan'' ''silika gel G. Pengikat organik juga telah digunakan termasuk karboksimetilselu losa, pati (1-2%), dan alkohol polivinil (1-5%). Meskipun memberikan yang mengik at kuat untuk sebagian besar pada konsentrasi yang lebih rendah dari pengikat, m ereka sering menderita solubilisation dalam pelarut berbasis air dan charring se telah pengobatan dengan asam sulfat solusi yang kuat dan pemanasan.

2,2 Pra-dilapisi TLC / Lembar HPTLC dan Pelat Diproduksi secara komersial pra-dilapisi pelat TLC dan menggunakan binder polime r HPTLC organik pada konsentrasi sekitar 1-2%. Ini pengikat jauh lebih tahan ter hadap serangan kimia atau elusi, memastikan permukaan halus tahan abrasif, dan e fektif mengikat silika gel ukuran partikel yang lebih kecil ke yang tepat dukung an seperti kaca, aluminium atau plastik. Pelarut polar cukup kuat dan reagen det eksi dapat digunakan tanpa mempengaruhi cukup. Keuntungan tambahan adalah bahwa piring memberikan lapisan gel silika yang sangat aktif yang tidak dinonaktifkan oleh konsentrasi yang cukup dari binder anorganik. Selalu ada perbaikan yang nya ta dalam kualitas pemisahan antara piring tersebut dan mereka terdiri dari silik a gel G. Kebanyakan dan pelat KLT silika gel HPTLC diproduksi dengan permukaan y ang seragam dan ketebalan lapisan 0,20-0,25 mm (pengecualian utama adalah selulo sa dengan ketebalan lapisan 0,1 mm). Lempeng ini diproduksi secara komersial mem berikan hasil yang jauh lebih direproduksi dibandingkan dengan mereka yang buata n''''. Ini adalah keuntungan utama dalam pekerjaan analitis di mana hasil kuanti tatif berulang sangat penting. Ukuran partikel, diameter pori, kelancaran dan ke tebalan permukaan, dan kualitas lapisan tahan abrasif perlu dikontrol dalam tole ransi baik oleh produsen untuk memastikan kualitas tinggi seperti dan hasil dire produksi. 3 Cutting TLC / Lembar HPTLC dan Pelat Meskipun pelat TLC dengan mudah dapat dipotong dengan pemotong kaca, dan lembara n plastik dan aluminium dapat dipotong dengan gunting, perawatan tidak perlu dia mbil untuk menghindari kerusakan pada lapisan kromatografi. Sepasang bersih dari karet atau sarung tangan plastik saat memotong penting pelat kaca untuk mencega h kontaminasi dari layer dan kerusakan pada tangan. Pemotongan aluminium dan lem baran plastik perlu dilakukan sedemikian rupa sehingga jumlah minimum kerusakan lapisan sekitarnya terjadi. Sepasang besar gunting lebih disukai dengan sebagai gunting memotong sesedikit mungkin. Selalu sudut gunting di sekitar 30 - dari ve rtikal ke satu sisi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 38. Gambar 38 Pemotongan aluminium lembaran didukung TLC. Sudut potong adalah pentin g untuk membatasi kerusakan pada lapisan. Pemotongan benar untuk miring kiri 30 - dari vertikal ditunjukkan pada contoh (a), sedangkan memotong ke kanan pada co ntoh (b) menyebabkan retak dari lapisan di sekitar memotong Pemotongan yang buruk akan mengakibatkan celah kapiler antara lapisan kromatogra fi dan foil. Hal ini akan menyebabkan fase gerak untuk bermigrasi lebih cepat di tepi dibandingkan dengan pusat lapisan, dan fase bergerak untuk bermigrasi dari tepi lapisan ke pusat. Hal ini akan menyebabkan bintik-bintik atau band dekat t epi kromatogram untuk menjadi trek cacat dan kromatografi untuk menjadi terdisto rsi. 4. Kelembaban Efek dengan Pelat TLC Kelembaban relatif didefinisikan sebagai jumlah uap air di udara jenuh pada suhu tertentu. Hal ini biasanya dinyatakan sebagai persentase dan dalam kebanyakan k asus akan bervariasi dari 40-60% untuk kondisi yang nyaman. Di laboratorium, sor bents TLC akan menyesuaikan diri dengan konsentrasi kesetimbangan uap air tergan tung pada kelembaban relatif. Adsorpsi adalah pengeringan sehingga ditegakkan re versibel dapat digunakan untuk menurunkan kelembaban relatif dari lapisan sorben . Sering KLT pelat dan lembaran yang dipanaskan pada 120-C untuk setidaknya sete ngah jam untuk mencoba mencapai lebih banyak aktivitas konstan. Benar-benar ada gunanya untuk prosedur ini sebagai pelat KLT setelah terkena dengan kondisi seki tar yang dibutuhkan hanya beberapa menit di paling untuk menyesuaikan kadar air terhadap lingkungan sekitarnya. Untuk alasan yang sama biasanya latihan berarti untuk mencoba untuk meremajakan lapisan KLT tua dengan pemanasan. Gambar 39 Pengaruh kelembaban relatif (RH) pada pemisahan oligophenylenes pada p

elat silika gel 60 HPTLC Handphone fase: sikloheksana Kelembaban: (a) 20% RH, (b) 50% RH (c) 80% RH Peaks: 1, m-quinquephenyl, 2, m-quaterphenyl, 3, m-terphenyl, 4, bifenil (E. Hahn-Deinstrop, J. Planar Kromatografi, 1993, 6, 317, dengan izin dari pener bit) Banyak produsen pelat KLT paket pada kelembaban relatif standar (misalnya RH 40% ) dan sekali terkena atmosfer persentase penyerapan air biasanya akan naik untuk ambien. Dalam kondisi normal, ini akan menyebabkan hanya variasi kecil dalam ak tivitas namun kelembaban yang relatif tinggi lebih dari 60% menyebabkan perubaha n yang cepat. Dalam hal ini pemanasan piring akan mendorong off ini kelebihan ke lembaban. Untuk menjaga reproduktifitas baik karena itu penting untuk menjaga bu ngkus piring dengan baik tertutup saat tidak digunakan, dan untuk menjaga lingku ngan laboratorium dalam batas yang wajar kelembaban relatif. Menutup bungkus pir ing saat tidak digunakan juga merupakan praktik yang baik untuk menghindari adso rpsi dari setiap uap lain yang mungkin ada di atmosfer langsung. Uap asam dan al kali akan menyebabkan perubahan dalam aktivitas sorben. Kamar-kamar khusus telah dikembangkan yang mengatasi masalah kelembaban untuk se bagian besar (kembar-melalui, horisontal, dan ruang pengembangan otomatis). Ruan g ini menggabungkan solusi baik asam sulfat atau larutan garam jenuh untuk mengo ntrol kelembaban relatif. Perubahan dalam kelembaban relatif dapat mempengaruhi sejumlah faktor penting da lam TLC, misalnya nilai Rf (faktor retensi), selektivitas, tingkat migrasi depan pelarut dan posisi berbagai bidang. Mana yang normal-fase atau mekanisme adsorp si menang, peningkatan kelembaban menyebabkan retensi kurang dari analit selama pengembangan dan elusi lebih cepat. Selektivitas terkena dampak dan perubahan da lam migrasi komponen tingkat sampel hasil. Gambar 39 mengilustrasikan baik ini d engan pemisahan hidrokarbon aromatik. Kadang-kadang bahkan perubahan dalam rangk a analit dipisahkan dapat terjadi. 5. Pra-cuci Pelat TLC Terkadang pre-mencuci lapisan TLC / HPTLC diperlukan untuk menghilangkan kotoran biasanya berasal dari bahan pengikat. Biasanya ini hanya masalah jika deteksi r eagen sensitif terhadap kotoran atau pendinginan fluoresensi sedang digunakan se bagai teknik deteksi. Penggunaan fase gerak kutub menyebabkan konsentrasi kotora n tersebut di depan pelarut. Sebagai resolusi komponen sampel akan diharapkan un tuk menjadi miskin di dekat bagian depan pelarut, konsentrasi kotoran ini biasan ya tidak masalah. Non-polar fase gerak tidak menyebabkan migrasi dari kotoran da n karenanya ada gangguan sedikit latar belakang saat pemindaian. Cara terbaik un tuk pra-cuci piring adalah dengan pembangunan kosong dalam tangki KLT. Entah unt uk pemisahan fasa bergerak dapat digunakan, atau metanol, atau campuran dari met anol dan kloroform. Asam dan basa sebaiknya dihindari. Piring harus ditandai unt uk menunjukkan arah perkembangan kosong. Ketika piring yang kemudian digunakan u ntuk kromatografi sampel, arah yang sama pembangunan dapat dan harus digunakan. 6. Penggunaan Indikator berpendar / Fluorescent Untuk membantu absorbansi banyak komersial pra-dilapisi lapisan TLC mengandung i ndikator berpendar anorganik, ditampilkan pada label dengan sebutan F254 atau UV 254. Kebanyakan indikator menunjukkan hijau terang, fosfor kuning atau biru saat senang dengan cahaya UV pada 254 nm. Indikator yang telah digunakan adalah uran il asetat (kuning-hijau), mangan seng silikat, seng sulfida kadmium, seng silika t (hijau), tungstates logam alkali tanah, dan timah fosfat strontium (biru). Det eksi oleh absorbansi dalam kasus ini bergantung pada pendar yang disiram oleh ko mponen-komponen sampel. Dalam kebanyakan kasus bintik-bintik merah muda atau ung u / band yang diamati untuk pendinginan pada latar belakang berpendar hijau, sed angkan abu-noda hitam / band biasanya terlihat pada latar belakang biru. Dalam s ebagian besar aplikasi indikator anorganik cukup stabil dengan sedikit atau tida k ada elusi dari pelarut berkembang, dan mereka tetap tidak terpengaruh oleh rea gen pencelupan paling dan suhu digunakan untuk efek reaksi. Indikator neon organ

ik juga dapat digunakan. Ini adalah kode F366 atau UV366 oleh produsen. Bahan ya ng digunakan termasuk brighteners optik, sulfonat hydroxypyrene, dan pewarna rho damine fluorescein. Seperti yang ditunjukkan oleh pengkodean yang digunakan, ind ikator-indikator organik berpendar dalam sinar UV gelombang panjang (pada 366 nm ). Beberapa pra-dilapisi piring yang diproduksi dengan kedua jenis indikator had ir untuk memberikan pendinginan mungkin dengan komponen-komponen sampel pada ked ua panjang gelombang. Kadang-kadang F254s penunjukan digunakan dalam deskripsi d ari beberapa pelat TLC dan HPTLC. ''''S yang hanya menunjukkan bahwa indikator n eon tahan asam, terutama berguna di mana uap asam dapat digunakan untuk mengatur pH atau menyebabkan reaksi lebih lanjut dari analit untuk membuat mereka mampu untuk memuaskan fluoresensi. Analit Namun, banyak menyerap kurang baik atau tida k sama sekali oleh teknik ini. Dalam hal ini deteksi reagen yang cocok digunakan untuk memberikan titik berwarna / band di situ., (Lihat Bab 6). 7. Lapisan TLC Channelled Beberapa pemasok telah membuat pelat silika gel yang tersedia disalurkan untuk a plikasi khusus. Channelled KLT piring terdiri dari trek gel silika, biasanya 1 c m lebar dari atas ke bagian bawah piring, dengan spasi 1-2 mm antara trek. Tentu saja, adalah mungkin untuk membuat saluran seperti diri dengan titik logam yang tajam (misalnya bradawl adalah cukup memadai untuk tujuan) dan penggaris. Lebar saluran tersebut karena itu memutuskan oleh pengguna. Pencakar pelat diproduksi secara komersial juga tersedia yang memungkinkan enam saluran harus dipotong pa 10 cm. Unit-unit ini akan direkomendasikan seba da lapisan kaca yang didukung 10 gai mereka memberikan presisi yang jauh lebih baik daripada metode murni manual. Keuntungan utama dari saluran tersebut adalah untuk mencegah kontaminasi silang sampel yang mungkin terjadi di mana titik sampel diterapkan berdekatan atau di mana difusi yang berlebihan terjadi selama pengembangan, menyebabkan beberapa pe nggabungan komponen. Sebuah keuntungan lebih lanjut adalah ketika analit pemulih an dari lapisan KLT digunakan. Bagian dari saluran jauh lebih mudah dihilangkan tanpa kontaminasi dari komponen dipisahkan lain pada layer dan tanpa merusak tre k lainnya. 8. Konsentrasi Zona TLC / HPTLC Pelat Konsep zona konsentrasi menawarkan sejumlah manfaat untuk jenis tertentu dari an alisis. Manfaat pertama kali dijelaskan oleh Abbott dan Thomson di 196577 dan di jabarkan lebih jauh pada tahun 1969 oleh Musgrave.78 TLC / HPTLC konsentrasi pir ing zona terdiri dari dua bagian lapisan yang berbeda dengan batas tajam didefin isikan. Tidak ada kesenjangan di antara keduanya. Zona bawah digunakan untuk apl ikasi sampel dan mencakup lebar penuh dari pelat hingga 25 mm. Ini zona bawah te rdiri salah satu dari kieselguhr atau sintetis silikon dioksida berpori dari vol ume pori menengah, tetapi sangat tinggi pori-pori dengan diameter (50 000 A) dan luas permukaan yang sangat kecil internal (kurang dari 1 m2 g ?? 1). Kieselguhr menjadi bahan alami, terutama terdiri dari silika, dan sekitar 10% dari oksida logam lain dapat menyebabkan variasi dalam perilaku kromatografi. Bagian atas pi ring dilapisi dengan gel silika sorben yang normal 60. Sampel yang digunakan seb agai bintik-bintik atau band ke zona konsentrasi. Biasanya ini lebih encer (bias anya 5-10 kali) dari apa yang akan diterapkan pada lapisan gel silika yang norma l 60 KLT. Pada elusi analit kepentingan bermigrasi pada atau dekat bagian depan pelarut. Pada antarmuka mencapai mereka membentuk band yang terkonsentrasi. Ini terus bermigrasi ke gel silika 60 lapisan dan pengembangan berlanjut secara norm al. Meskipun ada keuntungan jelas untuk penggunaan piring zona konsentrasi seper ti seperti menghilangkan kebutuhan untuk posisi yang tepat dari aplikasi sampel dan volume sampel, keuntungan lebih rinci dan kerugian dari lapisan ini akan dib ahas di bab berikutnya. 9 HPTLC Pra-Pelat dilapisi HPTLC menggunakan jenis yang sama lapisan silika gel 60, seperti dalam KLT tradi sional, dengan ketebalan 0,20-0,25 mm. Namun, ukuran partikel jauh lebih kecil, biasanya berkisar 4-8 mm, dengan 5-6 mm optimal. Baru-baru ini bola baru silika gel HPTLC 60 dari ukuran partikel yang optimal 4 mm telah menjadi tersedia (liha

t perbandingan pada Gambar 40). Partikel yang lebih kecil memberikan lapisan, ag ak lembut halus. Namun, komersial pra-piring dilapisi dengan bahan pengikat poli mer HPTLC, cukup keras sehingga tidak mudah rusak oleh tabung kapiler digunakan untuk aplikasi sampel. Gambar 40 Perbandingan distribusi ukuran partikel untuk gel silika digunakan dal am TLC dan HPTLC pra-dilapisi pelat Partikel-partikel yang lebih kecil, serupa dalam ukuran dan kualitas bahan HPLC kemasan, memberikan ketinggian pelat bawah teoritis (H) dan efisiensi yang lebih tinggi karenanya. Namun, ini hanya dimanfaatkan sepenuhnya jika tidak kelebihan beban pelat dengan sampel terlalu banyak, ukuran spot tetap kecil (sekitar 1,0 mm), dan pelat dikembangkan hanya sejauh yang diperlukan untuk resolusi lengkap (seringkali hanya 5 cm dan jarang lebih dari 8 cm). Sebuah perbandingan langsung dari pelat teoritis dalam HPTLC dengan HPLC melayani tujuan kecil sebagai jumla h yang ditemukan hanya berlaku untuk tempat yang digunakan untuk perhitungan. Ma salah mendasar adalah bahwa semua analit tidak melakukan perjalanan jarak migras i yang sama dan tidak diukur dengan waktu retensi seperti dalam kromatografi kol om. Dalam kromatografi planar, pemisahan yang di kejauhan, bintik-bintik dan ban d akan memperluas untuk luasan yang berbeda, dan karenanya efisiensi hanya bisa konstan untuk kromatogram tertentu. Sayangnya sifat KLT menyebabkan situasi kaca u di mana kondisi yang biasanya bervariasi dengan waktu selama pengembangan. Ole h karena itu sulit untuk mencoba model teoritis yang akan cocok persis pemisahan . Namun, adalah mungkin untuk membuat perkiraan yang baik. Tempat yang dipilih u ntuk pengukuran harus kompak dan simetris, sehingga scanner akan merekam puncak Gaussian. Hal ini hanya akan mungkin untuk analit dengan nilai Rf antara 0,1 dan 0,9, (lihat Bab 4 untuk pengukuran Rf). Luar kisaran ini akan ada terlalu banya k bentuk distorsi dari tempat asal baik dekat atau depan pelarut. Kromatografi menyebar (difusi dan migrasi komponen selama pengembangan) ditandai oleh tingginya sebuah piring teoritis setara (HETP), H, yang memberikan dengan persamaan Knox: H - B / u + Au1 / 3 + Cu di mana u adalah kecepatan pelarut dan A, B, dan C adalah eksperimental ditemuka n koefisien. Persamaan ini pertama kali diusulkan oleh Knox untuk kromatografi kolom. Sebuah pendekatan yang lebih umum melibatkan penggunaan nilai dikurangi berdimensi: H - B / v + AV1 / 3 + Cv Persamaan ini menggambarkan kurva dengan titik minimum. Para''istilah''memperhitungkan kecepatan aliran lokal karena ukuran dan bentuk p artikel sorben. Para''b''Istilah difusi molekular zat terlarut dalam larutan, (ingat ketika fase gerak migrasi dihentikan, difusi masih akan terus). Para''c''jangka memperhitun gkan penundaan yang disebabkan oleh proses transfer massa pada penyerapan dan de sorpsi molekul zat terlarut. Dalam prakteknya, kualitas yang lebih baik ukuran partikel sorben dan lebih keci l akan menghasilkan kurva yang lebih tajam dengan minimum lebih rendah untuk per samaan (2) seperti yang ditunjukkan pada contoh pada Gambar 41. Piring HPTLC memberikan nilai HETP dari sekitar 12 mikrometer dan maksimum sekit ar 5000 pelat teoritis dapat digunakan. Sebaliknya, pelat KLT konvensional memil iki nilai HETP dari sekitar 30 mikrometer dan sekitar 600 pelat teoritis. Maka k arena itu HPTLC menawarkan peningkatan kinerja yang merupakan urutan besarnya le bih besar dari TLC. Jadi adalah mungkin untuk melaksanakan perpisahan pada HPTLC yang tidak mungkin sebelum pada pelat KLT, dan bagi mereka di mana itu mungkin, untuk mempersingkat waktu pemisahan secara dramatis. Lihat Tabel 6 untuk perban dingan piring. Gambar 41 Plat tinggi (H) versus jarak migrasi pelarut (ZF) perbandingan antara silika gel HPTLC dan TLC. Biasanya ditunjukkan dengan chloroaniline (Rf 0,35) se

bagai standar toluena dan menggunakan sebagai fase gerak. Sebagai grafik menunju kkan, pada ZF rendah (jarak pengembangan yang singkat) resolusi ditingkatkan dia mati untuk lapisan HPTLC, tetapi efeknya berkurang dengan peningkatan jarak peng embangan Tabel 6 Perbandingan HPTLC silika gel dan lapisan kromatografi KLT HPTLC Oleh karena itu teknik, lebih cepat efisien dan sensitif dibandingkan TLC konvensional. Karena dalam analisis kuantitatif situ menggunakan spectrodensitom eters, adalah penting bahwa lapisan HPTLC digunakan untuk hasil yang paling dapa t diandalkan. HPTLC merupakan kemajuan yang cukup besar dalam praktek KLT. 9.1 HPTLC Silica Gel 60 Bulat Kebanyakan silika gel HPTLC 60 lapisan yang diproduksi dengan menggunakan silika gel bentuk partikel yang tidak teratur. Meskipun merupakan kemajuan besar atas lapisan KLT konvensional, perbaikan lebih lanjut dalam pelarut karakteristik ali ran kapiler, pengurangan ukuran partikel dan kemurnian sorben dapat dibuat denga n gel silika bulat, mirip dengan yang saat ini tersedia di kolom HPLC. Salah sat u masalah utama dengan pengurangan ukuran partikel silika gel adalah penurunan y ang menghasilkan kecepatan aliran pelarut berkembang. Sebagai proses pembangunan TLC biasanya tergantung pada aliran kapiler tanpa aplikasi tekanan eksternal, u kuran partikel yang lebih kecil dari 5 mm menghasilkan waktu pengembangan yang l ama. Hal ini dapat mengimbangi sampai batas tertentu oleh karakteristik pengikat ditingkatkan, penggunaan sorbents dengan partikel bulat dan partikel distribusi ukuran sempit, di mana aliran kapiler jauh lebih teratur pelarut adalah mungkin . Gambar 42 Perbandingan antara silika gel 60 HPTLC, (a) partikel 5-6 mm tidak ter atur dan (b) partikel mm 4 bola untuk pemisahan fase delapan pestisida HP: minya k roh (40-60-C) / aseton (70 30 v / v) Peaks: 1, hexazinon, 2, metoxuron, 3, mon uron, 4, aldicarb; 5, azinphosmethyl; 6, prometryn; 7, pyridate; 8, trifluralin (Dengan izin dari Merck) Gambar 42 menunjukkan perbaikan yang terjadi dalam resolusi pemisahan menggunaka n gel silika HPTLC tersedia secara komersial bola 60, 4 mm ukuran partikel. Kemurnian tinggi silika gel dalam lapisan ini juga memiliki manfaat tambahan dar i latar belakang kebisingan rendah pemindaian''''. Oleh karena itu mungkin untuk mendapatkan batas deteksi ditingkatkan untuk pemindaian spectrodensitometric un tuk penentuan kuantitatif analit. Latar belakang ini''''kebisingan, pada kenyata annya, cukup dikurangi seperti bahwa teknik KLT dapat ditulis dgn tanda penghubu ng untuk spektroskopi Raman sebagai alat identifikasi lebih lanjut diketahui ata u kuantifikasi, (lihat Bab 8 dimana nilai dari teknik ini ditulis dgn tanda peng hubung digambarkan ). 10. Meningkatkan Resolusi dengan Buffer dan Agen Pengompleksan 10.1 Impregnasi dari sorben sebelum Coating Lapisan Dalam prosedur ini bubur silika gel yang biasanya digunakan untuk mempersiapkan lapisan lapisan untuk aplikasi pada ke backing kaca awalnya pretreated dengan re agen impregnasi. Solusi dari buffer, reagen pengompleks, asam, basa, garam, atau air-larut senyawa organik yang efektif untuk jenis teknik impregnasi. Setelah b ubur dimodifikasi telah disiapkan itu kemudian bisa dilapisi pada pelat dukungan dengan cara yang biasa. Teknik ini terbatas pada air-larut agen. Karena persiap an pelat KLT di laboratorium sekarang jarang dilakukan, ini bukan teknik yang po puler. Impregnasi 10,2 Lapisan Dilapisi Siap Hal ini dapat dilakukan dalam tiga cara: 1. Perendaman dari pelat pra-dilapisi dalam larutan (biasanya 5-10%) dari agen m enghamili dilarutkan dalam pelarut yang mudah menguap yang cocok. Pelarut ini ke

mudian menguap dari baik pada suhu lingkungan atau ditinggikan. 2. Penyemprotan larutan reagen peresapan ke piring dan kemudian mengeluarkan pel arut seperti sebelumnya. 3. Pengembangan kosong dari pelat KLT dalam tangki kromatografi menggunakan laru tan reagen impregnasi sebagai pelarut berkembang. Migrasi akan diizinkan untuk m elanjutkan sampai depan pelarut telah mencapai puncak lapisan, dan untuk beberap a waktu setelah ini sehingga''nyata''depan pelarut telah bermigrasi cukup. Pelar ut ini kemudian dihapus seperti sebelumnya. Pada lapisan silika gel asam kali telah digunakan untuk memisahkan senyawa asam reaktif (fenol, asam) lapisan 79 dan dasar untuk pemisahan alkaloid, dan amines. 80 Impregnasi asam dicapai dengan 0,05-0,25 M asam oksalat dan basis yang diguna kan adalah kalium hidroksida. Untuk memastikan bagaimana sebuah senyawa yang tid ak diketahui akan bereaksi, piring gradien pH dapat digunakan di mana lapisan si lika gel diterapkan ke permukaan kaca dukungan, dimulai dengan pH rendah pada sa tu ujung dan menyebar di seluruh lapisan untuk pH tinggi di tepi berlawanan. Sam pel akan diterapkan pada interval yang tepat di sepanjang tepi bawah. Setelah pe mbangunan dalam pelarut yang sesuai variasi jarak migrasi dapat dibandingkan. Buffer cukup sering digunakan dalam pemisahan karbohidrat apakah pada silika gel 60 atau ikatan amino lapisan silika gel. Entah orthophosphate dihidrogen kalium atau natrium garam yang sesuai yang digunakan (0,2-0,5 M) untuk menghambat pemb entukan glycamines dari mengurangi gula. Mono-, di-, dan trisaccharides telah di selesaikan dengan baik pada silika gel 60 pelat KLT yang sebelumnya diresapi den gan 0,5 M natrium dihidrogen orthophosphate.81-83 Sebuah pemisahan tertentu dapa t diperoleh dengan impregnasi dengan senyawa yang akan membentuk kompleks koordi nasi, khelasi atau inklusi dengan komponen-komponen sampel untuk derajat yang be rbeda. Asam borat dan dinatrium tetraborate sering digunakan sebagai agen impreg nasi untuk pembentukan kompleks. Ini digunakan untuk resolusi ditingkatkan dalam pemisahan semua jenis lapisan carbohydrates.81 diresapi EDTA telah digunakan un tuk pemisahan anti-microbials.84 Perak nitrat impregnasi secara luas digunakan p ada silika gel 60 dan sebagai pertimbangan manfaat seperti khusus. 11. Nitrat perak Impregnasi Meskipun silika gel yang normal 60 adalah sorben sangat fleksibel untuk pemisaha n senyawa aromatik dan alifatik banyak organik jenuh dan tak jenuh, ada saat-saa t gel silika memiliki kekuatan menyelesaikan cukup untuk mencapai pemisahan yang memadai spesies organik tak jenuh, terutama di mana cis / trans isomerisasi dap at terlibat. Argentation atau perak nitrat KLT mengatasi masalah ini dengan cara yang unik dan memungkinkan pemisahan yang sangat baik dari berbagai jenis lipid , asam lemak, olefin, steroid dan triterpenes.85-93 Pemisahan ini didasarkan pada interaksi yang diketahui dari ion perak, Ag TH den gan ethylenic p-obligasi hadir dalam molekul zat terlarut. Kekuatan interaksi ak an tergantung pada sejumlah faktor: 1. Jumlah obligasi olefin hadir. 2. Halangan sterik di sekitar obligasi olefin. 3. Posisi obligasi dalam struktur olefin. Semakin kuat interaksi dan karenanya kompleksasi, semakin senyawa ini disimpan p ada layer. Teknik ini sangat kuat karena bahkan akan memungkinkan isomer cis dan trans dari beberapa senyawa organik untuk diselesaikan. Perbedaan retensi diama ti untuk isomer geometris seperti biasanya karena tingkat halangan sterik di sek itar ikatan rangkap. Contoh yang baik dari efek ini ditemukan dalam pemisahan as am lemak tak jenuh dan lipid. Dalam beberapa kasus, perak nitrat dapat ditambahk an ke dalam campuran pelarut yang digunakan untuk pembangunan (di mana berair be rbasis pelarut yang digunakan). Ini akan dijelaskan kemudian dalam Bab 5. Namun, dalam sejauh mayoritas kasus perak nitrat diimpregnasi pada lapisan sebelum pem bangunan. Hal ini dicapai dengan cara berikut: Celupkan gel silika dilapisi pra-TLC / piring HPTLC dalam larutan perak nitrat e ncer (20% b / v) selama 15-20 menit. Kemudian dalam ketiadaan cahaya, kering pir ing di udara, dan akhirnya mengaktifkan dalam oven pada 80-C selama sekitar 30-6 0 menit. Menggunakan prosedur ini, sekitar 1,7 g perak nitrat akan diambil oleh lapisan tebal 0,25 mm, memberikan konsentrasi perak nitrat setelah impregnasi se

kitar 40%. Sebuah prosedur yang sama dapat digunakan dengan fase terbalik pelat silika gel. Solusi perak nitrat yang dibutuhkan biasanya kekuatan rendah (1-10% b / v) dan siap dalam alkohol / air campuran untuk meningkatkan pembasahan''''dari lapisan. Pelat ini kemudian dikeringkan dengan cara yang sama seperti untuk normal fasa gel silika. Contoh penerapan dan pengembangan kromatografi dilakukan dengan cara yang persis sama seperti untuk piring unimpregnated. Sebuah contoh dari penerap an teknik ini ditunjukkan pada Gambar 43. 12. Mengisi transfer TLC Biaya transfer TLC adalah teknik unik yang bergantung pada agen meresapi pada la pisan kromatografi yang bertindak sebagai akseptor elektron p-. Ini p-akseptor b iasanya aromatik, alisiklik tak jenuh atau molekul organik heterosiklik dengan k elompok fungsional dari afinitas elektron tinggi. Para akseptor elektron berikut ini yang berbeda telah digunakan untuk peresapan: 2,4,7-trinitrofluorenone, 2,4 ,6 - trinitrophenol (asam pikrat), 1,3,5-trinitrobenzene, benzoquinon, asam urat tetramethyl, dianhydride pyromellitic, desoxycholate natrium , urea, basa asam nukleat, asam amino dan caffeine.94-98 Aplikasi industri yang telah terbukti signifikansi utama di daerah ini adalah pe misahan hidrokarbon poliaromatik menggunakan diresapi kafein HPTLC silika gel pi ring (terutama untuk deteksi dan kuantifikasi tingkat rendah hidrokarbon poliaro matik d