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12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005
ContestProteomanalyse von 10.000 Zellen
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Analyse eines Zellpellets aus 10.000 Zellen
• Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µl eingestellt.
• Zellen wurden aliquotiert und in der SpeedVac eingeengt.
• Menschliche Zellinie aus embryonalen Nierengewebe• HEK 293 Zellen wurden unter Standardbedingungen kultiviert.• Zellen wurden bei 4°C geerntet und 3 mal mit PBS-Puffer gewaschen
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Reproduzierbarkeit der Aliquotierung der Pellets von 10.000 Zellen
• Reproduzierbarkeit der Erzeugung der Zellpellets wurde mittels SDS-PAGE überprüft
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1 Marker2-7 Pellets von 10.000 Zellen
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Optimierung der Verdaubedingungen
• Für die Optimierung des Verdaus wurden verschiedene Bedingungen getestet
• Ansätze wurden mittels SDS-PAGE verglichen
Marker A Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall/Benzonase -/+ Trypsin B Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall -/+Trypsin C Phosphat-Puffer /CHAPS/95°C/Benzonase -/+ Trypsin D Phosphat-Puffer/CHAPS/ 95° -/+Trypsin E 1 M Harnstoff-Puffer/CHAPS -/+ Trypsin
Bedingungen: A B C D E - + - + - + - + - +
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Herstellung des Verdaus von10.000 Zellen
• Ausgangsmaterial: Zellpellet aus 2 Millionen Zellen• In 20 µl Lysis-Puffer (TrisHCl 30 mM; Thioharnstoff 2M; Harnstoff 7
M; CHAPS 4 %) aufgenommen• 6 x 10 Sekunden Ultraschall lysiert• 1:10 verdünnt mit 10 mM NH4HCO3-Puffer• 100 µl Trypsinlösung (0,06 µg/µl) zugegeben • Inkubation über Nacht• Volumen auf 2 ml gebracht (Wasser)• In 10 µl Aliquots aufgeteilt; entsprechend 10.000 Zellen• Aliquots in der SpeedVac eingeengt
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Reproduzierbarkeit der einzelnen Contest-Aliquots
RT: 0.00 - 65.04
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65Time (min)
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Rel
ativ
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ance
58.50953.6
61.06989.6
48.22831.6
31.81816.5
43.40914.4
39.85715.6
58.161314.5
49.30912.6
37.76844.529.06
1168.526.17712.5
22.78981.617.82
901.615.531003.6
7.89615.4
3.87819.4
NL:6.52E7Base Peak MS LCQ11138
RT: 0.00 - 64.99
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60Time (min)
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Rel
ativ
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ance
60.60953.6
63.16989.6
43.73640.7 45.34
914.541.42688.533.78
816.550.13831.6
55.101180.6
39.70844.5
31.251168.426.00
981.522.58901.719.51
1003.616.77594.6
1.691015.6
7.251577.5
NL:7.23E7Base Peak MS LCQ11137
RT: 0.00 - 65.07
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65Time (min)
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ance
60.28953.6
60.40953.6
62.92989.6
49.94831.6
41.39715.6 42.00
850.456.85977.833.56
816.5 41.03688.5
50.911161.440.90
688.630.80
1168.4
25.79981.522.18
901.619.241003.5
15.35831.6
7.47615.4
3.34860.1
NL:7.07E7Base Peak MS LCQ11139
RT: 0.00 - 65.07
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65Time (min)
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Rel
ativ
e A
bund
ance
58.33953.6
48.11831.6 61.03
989.6
54.88978.131.69
816.543.33914.439.32
688.5
54.76977.9
43.70664.0
32.171134.428.92
1168.525.87712.5
22.51981.4
17.80901.7
17.02943.60.83
948.713.26594.5
NL:6.65E7Base Peak MS LCQ11140
Basepeak-Chromatogramme von vier Contest-Verdau Proben
LCQ classicSäule: C18; Ø 75 µm x 25 cm Gradient Ameisensäure, 90 min
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2D-PAGE von 10.000 Zellen, 2 µg Protein, Cy3-markiert
(40 cm x 30 cm) 3.100 Proteinspots
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Verdau Pellet
Methode Methode Methode Such-maschine Datenbank
Agilent Technologies
3 Läufe 1D-LC-MS/MS (HPLC-Chip/MS XCT Ultra)
Spectrum Mill (A03.01.037a)
IPI.human.v306
Applied Biosystems
2 Läufe LC MALDI –MS/MS(4800 TOF/TOF Analyzer)
1 Lauf LC-MS/MS(MIDAS; 4000QTRAP)
MASCOT CDS
Bruker Daltonics
1 Lauf LC-ESI-IT MS(HCT)
1 Lauf LC-MALDI-MS/MS (Ultraflex)
2 Läufe LC-MALDI-MS/MS (Ultraflex)
MASCOT (v2.1.0)
Swissprot (21.06.2005)
GE Healthcare 3 Läufe 1D-LC-MS/MS (LTQ)
3 Läufe 2D-LC-MS/MS (LTQ)
Sequest NCBI
Protana Inc.3 Läufe LC-MS/MS( LTQ, "Proteome Reactor“)
3 Läufe LC-MS/MS( LTQ, "Proteome Reactor“)
MASCOT (v2.1.0)
NCBI (June 2005)
Thermo Electron
3 Läufe LC-MS/MS (LTQ)
Turbo-Se-quest v27 (rev.13)
NCBI (Mai 2005)
Contest-Teilnehmer
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6fach3%
5fach4% 4fach
6%
3fach10%
2fach14%1fach
63%
Insgesamt 1757 nicht-homologe
Sequenzen
Übereinstimmung (Homologiecluster) der identifizierten Proteine
zwischen den Contest-Teilnehmer
52+64
+110
+171
+2511109
Nature Methods Vol. 2,9, Sept. 2005, 647-48
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How to deal with data & results performing high-throughput proteomics
Experiments – irrespective of their size and effort and of the amount of the acquired data - have to be repeated independently several times to demonstrate their reproducibilty to get significant results
This will remove most of the „1hit wonders“
One-time experiments can not elucidate quantitative differences in two different proteomes, therefore, they should not be named quantitative!
We have to go back to scientifically sound experimental work & strategies to create value(s) for ourself and for the society who gives us the money and deserves that we do our best.