1136-2357-1-SM

ISSN : 1693-9883

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 -135

PETUNJUK PELAKSANAAN VALIDASI METODE DAN CARA PERHITUNGANNYA

HarmitaDepartemen Farmasi FMIPA-UI

ABSTRACT

Each analysis method by some reason, must be validated. Theparameters are selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD,LOQ, ruggedness, and robustness. The parameters need to becalculated by assay methods.

This paper try to give some information above these methodsbase on some literatures (USP 23rd, WHO, journal, etc).

Key words : Validation method, Parameter, Assay and calculation methods.

VALIDASI METODA ANALISIS

Validasi metoda analisisadalah suatu tindakan penilaianterhadap parameter tertentu,berdasarkan percobaanlaboratorium, untuk mem-buktikan bahwa parametertersebut memenuhi persyaratanuntuk peng-gunaannya.

PARAMETER PENAMPILANANALISIS

Beberapa parameter analisisyang harus dipertimbangkandalam validasi metode analisisdiuraikan dan didefinisikansebagaimana carapenentuannya.

1. Kecermatan (accuracy) Definisi:Kecermatan adalah ukuran

yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil

analis dengankadar analityangsebenarnya.Kecermatandinyatakansebagai persenperolehankembali(recovery)analit yangditambahkan.Kecermatanhasil analissangat ter-gantung kepadasebaran galatsiste-matik didalamkeseluruhantahapananalisis. Olehkarena itu untukmen-capaikecermatanyang tinggihanya dapatdilakukan

dengan cara mengu-rangi galatsistematik tersebut sepertimenggunakan peralatan yangtelah dikalibrasi, menggunakanpereaksi dan pelarut yang baik,pengontrolan suhu, danpelaksanaannya yang cermat, taatasas sesuai prosedur.

Cara penentuan:

Kecermatanditentukandengan duacara yaitumetodesimulasi(spiked-placeborecovery) ataumetode

penambahanbaku (standardadditionmethod).Dalam metodesimulasi, se-jumlah analitbahan murni(senyawa

Vol. I, No.3, Desember 2004

117

REVIEW ARTIKEL

pembanding kimia CRM atauSRM) ditambahkan ke dalamcampuran bahan pembawasediaan farmasi (plasebo) lalucampuran tersebut dianalisis danhasilnya dibandingkan dengankadar analit yang ditam-bahkan(kadar yang sebenarnya). Dalammetode penambahan baku,sampel dianalisis lalu sejumlahter-tentu analit yang diperiksaditam-bahkan ke dalam sampeldicampur dan dianalisis lagi.Selisih kedua hasil dibandingkandengan kadar yang sebenarnya(hasil yang diharapkan). Dalamkedua metode tersebut, per-senperoleh kembali dinyatakan seba-gai rasio antara hasil yangdiperoleh dengan hasil yangsebenarnya. % Perolehan kembalidapat ditentukan dengan caramembuat sampel pla-sebo(eksepien obat, cairan biologis)kemudian ditambah analitdengan konsentrasi tertentu(biasanya 80% sampai 120% darikadar analit yang diperkirakan),kemudian dianalisis denganmetode yang akan divalidasi.

Tetapi bila tidakmemungkinkan membuat sampelplasebo karena matriksnya tidakdiketahui seperti obat-obatanpaten, atau karena ana-litnyaberupa suatu senyawa endo-genmisalnya metabolit sekunderpada kultur kalus, maka dapat di-pakai metode adisi.

Metode adisi dapat dilakukandengan menambahkan sejumlahanalit dengan konsentrasitertentu pada sampel yangdiperiksa, lalu dianalisis denganmetode tersebut. Persenperolehan kembali ditentukandengan menentukan berapapersen

analit yang ditambahkan tadidapat ditemukan.

Kriteria kecermatan sangattergantung kepada konsentrasianalit dalam matriks sampel danpada keseksamaan metode(RSD). Vander-wielen, dkkmenyatakan bahwa se-lisih kadarpada berbagai penentuan (Xd)harus 5% atau kurang padasetiap konsentrasi analit padamana prosedur dilakukan. Hargarata-rata selisih secara statistikharus 1,5% atau kurang. Kriteriatersebut dinyatakan secaramatematik sebagai berikut:

Xd . 100 < 5%X0

Xd . 100 --(S(0,95 n – I

))<

1,5%X0 n

Xd = Xi – X0

Xi = hasil analisisX = hasil yang sebenarnya

I 0= nilai t pada tabel t’ student padaatas 95%

S = simpangan baku relatif darisemua pengujian

n= jumlah sampel yang dianalisis

Kadar analit dalam metodepenambahan baku dapatdihitung sebagai berikut:

C=

R1

C + S R2

118 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN

REVIEW ARTIKEL

C = SR

1

R2 – R1

C = kadar analit dalam sampelS = kadar analit yang

ditambahkan pada sampelR1 = respon yang diberikansampel R2 = respon yangdiberikan campuran

sampel dengan tambahan analit

Perhitungan perolehankembali dapat juga ditetapkandengan rumus sebagai berikut:

% Perolehan kembali =(CF

-

CA)x 100C*A

CF = konsentrasi total sampelyang diperoleh daripengukuran

CA = konsentrasi sampelsebenarnya C*A = konsentrasianalit yang di-

tambahkan

Pada metode penambahanbaku, pengukuran blanko tidakdiperlukan lagi. Metode ini tidakdapat diguna-kan jikapenambahan analit dapatmengganggu pengukuran,misalnya analit yangditambahkan menyebab-kankekurangan pereaksi, mengubahpH atau kapasitas dapar, dll.Kriteria kecermatan dilakukansama seperti pada metodesimulasi.

Pada percobaan penetapan

ke-cermatan, sedikitnya limasampel yang mengandunganalit dan plaseo yang harusdisiapkan dengan kadar antara50% sampai 150% dari kan-dungan yang diharapkan.

Persen perolehan kembaliseha-rusnya tidak melebihi nilaipresisi

RSD. Rentang kesalahan yangdi-ijinkan pada setiapkonsentrasi analit pada matriksdapat dilihat pada tabel dibawah ini:

Analit pd matrik Rata-rata yg

sampel, %diperoleh , %

100 98-102> 10 98-102> 1 97-103> 0,1 95-1050,01 90-1070,001 90-1070,000.1 (1 ppm) 80-1100,000.01 (100 ppb) 80-1100,000.001 (10 ppb) 60-1150,000.000.1 (1 ppb) 40-120

Contoh perhitungan:

Perolehan kembali Analit

Dianggap bobot tiap tablet 175 mg.

Penimbangan 20 tablet : 20 x175 mg = 3500 mg.

Komposisi tablet tdd :

Zat aktif : 20 x 7,5 mg = 150 mg

Berat zat tambahan :3500 mg – 150 mg = 3350 mg

Penimbangan serbuk plasebo: 3.364,791 mg ditambahkan dengan Meloksikam: 151,043 mg = 3.515,834 mg

Meloksikam yg ditambahkan: 151,043 x 99,34% = 150,046 mg

Vol. I, No.3, Desember 2004 119

PEROLEHAN KEMBALI 80,100 DAN 120 %

Perbandingan yang digunakanuntuk spike placebo : baku yangditambah-kan = 70:30

Perolehan kembali 80% = 80%x 4 mg = 3,2 mgTerdiri dari serbuk plasebo =70/100 x 3,2 mg = 2,24 mg

1% Penimbangan setara 2,24mg serbuk plasebo =2,24/150,05 x 3515,83 mg= 52,49 mg

2% Baku = 30/100 x 3,2 mg= 0,96 mg

Penimbangan baku : 9,664 mg x99,34 % = 0,96 mg, larutkandalam metanol 20 ml. Pipet 2ml untuk sekali penam-bahan

sebagai baku.

Rec 100% = 100% x 4 mg = 4 mg Terdiri dari serbuk plasebo =70/100 x 4 mg = 2,80 mg

1% Penimbangan setara 2,8mg serbuk plasebo =2,80 /150,05 x 3515,83 mg= 65,608 mg

2% Baku = 30/100 x 4 mg =1,2 mg

Penimbangan baku : 24,315 mgx 99,34 % = 24,1545 mg,larutkan dalam metanol 100 mlmetanol. Pipet 5 ml untuk sekalipenambahan sebagai baku.

Rec 120% = 120% x 4 mg = 4,8mg Terdiri dari serbuk plasebo =70/100 x 4,8 mg = 3,36 mg

1% Penimbangan setara 3,36mg serbuk plasebo =

3,36 /150,05 x 3515,83mg = 78,73 mg

1% Baku = 30/100 x 4,8 mg= 1,44 mg

Penimbangan baku : 30,128 mgx 99,34 % = 29,929 mg,larutkan dalam metanol 100 mlmetanol. Pipet 5 ml untuk sekalipenambahan sebagai baku.

Contoh perhitungan %Perolehan kembaliRata-rata area :

1712875 + 1718115 = 17154952

Jumlah meloksikam total :1715495 +3282,9347 x 50

6569,9521100

0

= 3,234 mg (CF)

Penimbangan serbuk plasebo : 53,215 mg

Baku yang ditambahkan : 0,96 mg (C*A)

Dalam 53,215 mg serbuk plasebo terdapat meloksikam sebanyak :

53,215 / 3515,834 x 150,046 mg = 2,271 mg (CA)

% Perolehan kembali =(C

F - C

A)

x 100

C*A

1% Perolehan kembali = 3,234 – 2,271

x 100 % = 100,31 %0,960


METODE SPIKED PLACEBO RE-

Rata rata luas puncak piroksikam :

COVERY 1541890,5

Penimbangan baku meloksikam :Ratio M/P = 1,3499211

Kadar meloksikam=

79,615 mg (99,34%) meloksikam!

50labu tentukur 200ml. Larutkan dalam

1,3499211 - 0,01700 x

= 3,852mg

metanol. Ultrasonik selama 30 menit. 0,0173

1000

Pipet 2, 4, 6, 10 dan 15 ml larutan !

Serbuk plasebo yang ditimbang92,053 mg mengandung

labu tentukur 50 ml dan tambahkan

92,0532 ml larutan baku dalam. Tambahkan

fase gerak s/d tanda.

3516,831 x 150,046 =

3,92857 mg

Larutan baku dalam :81,212 mg ! labu tentukur 100 ml dilarutkan dalam metanol.

(lihat tabel 1 di bawah ini)

Keterangan :Persamaan regresi : y = 0,0173 x+ 0,01700; r = 0,9999

Contoh perhitungan :Rata rata luas puncak meloksikam : 2081430,5

1% PerolehanKembali =3,853

3,929 x

100%

1=98,0

2. Keseksamaan(precision) Definisi: Keseksamaan adalah

ukuran yangmenunjukkanderajat kese-suaian antarahasil ujiindividual,diukur melaluipenyebaranhasil in-dividualdari rata-ratajika prosedurditerapkansecaraberulang padasampel-sampelyang diambildari campuranyang homogen.

Tabel 1. Hasil pengukuran kurva kalibrasi meloksikam menggunakan baku dalam

Konsentrasi Luas krotamogram rata rata Angka banding luasmeloksikam mV.det kromatrogram( g/ml) meloksikam

dan piroksikamPiroksikam Meloksikam

15,818 1551193,0 449819,0 0,2900

31,636 1546303,5 868274,5 0,5615

47,454 1545185,0 1303159,0 0,8434

79,090 1554005,0 2149441,0 1,3832

118,634 1553935,5 3207326,5 2,0640

Vol. I, No.3,

Desember 2004 121

REVIEW ARTIKEL

Cara penentuan:Keseksamaan diukur sebagai

simpangan baku atau simpanganbaku relatif (koefisien variasi). Ke-seksamaan dapat dinyatakansebagai keterulangan(repeatability ) atau ketertiruan(reproducibility). Keter-ulanganadalah keseksamaan metode jikadilakukan berulang kali olehanalis yang sama pada kondisisama dan dalam interval waktuyang pendek. Keterulangan dinilaimelalui pelaksanaan penetapanterpisah leng-kap terhadapsampel-sampel identik yangterpisah dari batch yang sama,jadi memberikan ukurankeseksama-an pada kondisi yangnormal. Keter-tiruan adalahkeseksamaan metode jikadikerjakan pada kondisi yangberbeda. Biasanya analisisdilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbedamenggunakan pera-latan,pereaksi, pelarut, dan analis yangberbeda pula. Analis dilakukanterhadap sampel -sampel yangdi-duga identik yang dicuplik daribatch yang sama. Ketertiruandapat juga dilakukan dalamlaboratorium yang sama denganmenggunakan pera-latan,pereaksi, dan analis yang ber-beda. Kriteria seksama diberikanjika metode memberikansimpangan baku relatif ataukoefisien variasi 2% atau kurang.Akan tetapi kriteria ini sangatfleksibel tergantung padakonsentrasi analit yang diperiksa,jumlah sampel, dan kondisilabora-torium. Dari penelitian

dijumpai bahwa koefisien variasimeningkat dengan menurunnyakadar analit yang dianalisis.Ditemukan bahwa

koefisien variasi meningkatseiring dengan menurunnyakonsentrasi analit. Pada kadar1% atau lebih, standar deviasirelatif antara labo-ratoriumadalah sekitar 2,5% ada padasatu per seribu adalah 5%. Padakadar satu per sejuta (ppm)RSDnya adalah 16%, dan padakadar part per bilion (ppb)adalah 32%. Pada me-todeyang sangat kritis, secaraumum diterima bahwa RSDharus lebih dari 2%.

Karena metode presisiadalah fungsi penetapan kadarpada rentang yang dapatditerima menurut De-besis et.al. pada analisa mengguna-kanmetode HPLC akan digunakanketentuan presisi berikut: (lihattabel 2 di sebelah).

Untuk menetapkan presisibahan campuran dan bahansisa pada artikel obat, formulaberikut ini harus di-gunakanuntuk menentukan metodeketertiruan yang tepat(interlabo-ratorium).

RSD < 2 (1-0,5 log c)

dan untuk keterulangan :

RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,673 = konsentrasi analit sebagai

fraksi desimal (contoh: 0,1%= 0,001)

Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:

1. Hasil analisis adalah x1, x2,x3, x4,

.....................x

n

maka simpangan bakunya adalah

SD =( (x - x )2 )

n – 1122 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN

Tabel 2. Rentang maksimum yang diperbolehkan (Perhitungan dibuat berdasarkan atas kepercayaan 99%).

Rentang yang Penetapan tunggal Penetapan duplodapat diterima Metode RSD Sistem RSD Metode RSD Sistem RSD(% klaim) (%) (%) (%) (%)

98,5 - 101,5 0,58 0,41 0,82 0,58

97- 103 1,2 0,82 1,6 1,2

95- 105 1,9 1,4 2,7 1,9

90 - 110 3,9 2,8 5,5 3,9

90 - 115 4,8 3,4 6,9 4,8

90- 125 6,8 4,8 9,6 6,8

85 - 115 5,8 4,1 8,2 5,8

75- 125 9,7 6,9

50- 150 19,4 13,7

2. Simpangan baku relatif ataukoefisien variasi (KV) adalah:

KV =SD x

100%x

Percobaan keseksamaandilaku-kan terhadap paling sedikitenam replika sampel yang diambildari campuran sampel denganmatriks yang homogen. Sebaiknyakesek-samaan ditentukanterhadap sampel sebenarnya yaituberupa campuran dengan bahanpembawa sediaan farmasi(plasebo) untuk melihat pengaruhmatriks pembawa terhadapkeseksamaan ini. Demikian jugaharus disiapkan sampel untukmeng-analisis pengaruh pengotordan hasil degradasi terhadapkeseksamaan ini.

Contoh uji homogenitasCara kerja :Standar 100 ppm1- Timbang 25,0 mg

tetrasiklin HCl. Masukankedalam labu ukur 50,0

ml. Tambahkan air sampai 50,0 ml, kocok (lakukan triplo).

1- Pipet 2,0ml larutandiatas. Ma-sukan kedalam labuukur 10,0 ml.Tambahkanair sampai10,0 ml.Kocok (dibuat10 labu).

Standar 1000 ppm

1- Timbang50,0 mgtetrasiklinHCl. Masukanke dalamlabu ukur25,0 ml.

Tambahkanair sampai10,0 ml,kocok(lakukantriplo)

2- Pipet 5,0ml larutandiatas. Ma-sukan kedalam labuukur 10,0 ml.Tambahkanair sampai10,0 ml.Kocok (dibuat10 labu)

Suntikan 20 lstandar 100ppm danstandar 1000ppm padaHPLC dengankecepatan alir1,0 ml/menitdan panjanggelombang 360nm.

Vol. I, No.3,

Desember 2004

123

Tabel 3. Homogenitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi KonsentrasiTetrasiklin HCl Area Tetrasiklin Area

(ppm) (ppm)

100 1782560 1000 17824940100 1784392 1000 17830710100 1784506 1000 17831960100 1784857 1000 17851970100 1785275 1000 17853480100 1807112 1000 17895130100 1808175 1000 17899070100 1809577 1000 17921150100 1823930 1000 17933210100 1853383 1000 17959770

Nilai F 4,31

S2N

(terbesar) Σ (x –F =S2 =

x )2

N – 1S2(terkecil

)l

S2 =

variansi F <

F tabel

Contoh perhitungan uji keseksama-an (presisi)

Cara kerjaa. Pembuatan larutan baku1-Timbang baku Tetrasiklin HCl

20,0; 30,0 mg masing-masingma-sukan ke dalam labu ukur50,0 ml. Maka diperolehkonsentrasi larut-an berturut-turut sebesar 400, 500 dan600 ppm.

2-Larutkan dengan air sampai50,0 ml, kocok.

3-Suntikkan l larutan baku padaHPLC.

b. Pembuatan larutan uji1-Timbang serbuk obat

Tetrasiklin HCl yang kadarnya80 %, 100 %,

120 %sebesar 100,0mg (masing-masing 6,setiap 100mg serbukobatmengandungtetrasiklin HCl50 mg).Masukan kedalam labuukur 100,0ml. Makaakan diper-olehkonsentrasilarutanberturut-turutsebesar 400,500 dan 600ppm.

1-Larutkandengan airsampai100,0 ml,kocok

2-Saringdengankertas saringDura-pore

membran filter 0,45 mm HV. 3-Suntikan 20 l larutan uji pada

HPLC. Hitung % kadarnya.

Presisi dilakukan pada sediaanserbuk obat Tetrasiklin HCldengan konsentrasi 80 %, 100

%, 120 %kadarTetrasiklin HCl,masing-masingenam kalipenimbanganyang dilaku-kan pada hari

yang berbedaselama 3 hari.Hasilperhitungantersebut dapatdilihat padatabel-tabelberikut ini.


Tabel 4. Presisi Tetrasiklin 80 %

Konsentrasi TetrasiklinArea

Presentasi kadarHCl (ppm) (%)

400 7168141 80,34400 7159952 80,26400 7112864 79,79400 7136432 80,03400 7116750 79,83400 7127785 79,94

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,236

RSD ( < 2 % ) 0,28

Tabel 5. Presisi Tetrasiklin HCl 100 %



500 9184380 100,39500 9305120 101,59500 9502175 103,65500 9335870 101,89500 9283175 101,47500 9193470 100,48


RSD ( < 2 % ) 1,17

Tabel 6. Presisi Tetrasiklin HCl 120 %



600 11206510 120,50600 11157635 120,01600 11124382 119,68600 11132680 119,76600 11173120 120,16600 11227365 120,70


RSD ( < 2 % ) 1,34


Tabel 7. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %



400 7158750 80,25400 7126435 79,93400 7109690 79,76400 7142460 80,09400 7171155 80,37400 7129140 79,96


RSD ( < 2 % ) 0,28




500 9195010 100,50500 9312420 101,66500 9392500 102,46500 9311795 101,66500 9176435 100,31500 9137890 99,93


RSD ( < 2 % ) 0,97




600 11216645 120,60600 11134340 119,78600 11231470 120,75600 11175835 120,19600 11149590 119,93600 11197365 120,41


RSD ( < 2 % ) 0,32


Tabel 10. Persisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %



400 7114565 79,81400 7188390 80,54400 7132320 79,99400 7157255 80,24400 7168430 80,35400 7125835 79,92


RSD ( < 2 % ) 0,35

3. Selektivitas (Spesifisitas) Penyimpangan hasil jika adameru- DefinisiSelektivitas atau spesifisitas

suatu metode adalahkemampuannya yang hanyamengukur zat tertentu saja secaracermat dan seksama denganadanya komponen lain yangmungkin ada dalam matrikssampel. Selektivitas seringkalidapat dinyata-kan sebagai derajatpenyimpangan (degree of bias)metode yang dilakukan terhadapsampel yang mengandung bahanyang ditambahkan berupacemaran, hasil urai, senyawasejenis, senyawa asing lainnya,dan diban-dingkan terhadap hasilanalisis sam-pel yang tidakmengandung bahan lain yangditambahkan.

Cara penentuan:Selektivitas metode ditentukan

dengan membandingkan hasil ana-lisis sampel yang mengandungcema-ran, hasil urai, senyawasejenis, se-nyawa asing lainnyaatau pembawa plasebo denganhasil analisis sampel tanpapenambahan bahan-bahan tadi.

pakan selisihdari hasil uji

keduanya. Jikacemaran dan

hasil urai tidakdapat

diidentifikasiatau tidak dapatdiperoleh, maka

selektivitasdapat

ditunjukkandengan cara

menga-nalisissampel yangmengandung

cemaran atauhasil uji urai

dengan metodeyang hendak

diuji lalu diban-dingkan dengan

metode lainuntuk pengujian

kemurnianseperti kroma-

tografi, analisiskelarutan fase,

danDifferentialScanning

Calorimetry.Derajatkesesuaiankedua hasilana-lisistersebutmerupakanukuranselektivitas.Pada metodeanalisis yangmelibatkankromatografi,selek-tivitasditentukanmelalui perhi-tungan dayaresolusinya(Rs).

Cara kerja :Untuk uji

selektifitasmaka zat yangakan diuji harusditentuka dulupanjanggelombangmaksimum.Dalam hal inilarutantetrasiklin HCl

mempunyai panjang gelombangmaksimum 360 nm. Selanjutnya

Vol. I, No.3, Desember 2004 127dibuat larutan baku, larutan uji dan larutan blanko.a. Pembuatan larutan baku

tetra-siklin HCl1- Timbang 25,0 mg baku

Tetrasiklin HCl, masukankedalam labu ukur 50,0 ml.

2- Larutkan dengan air sampai50,0 ml, kocok.

3- Suntikkan 20 l larutan ujipada HPLC. Amati puncaknyapada kromatogram HPLC.

2. Pembuatan larutan ujitetrasiklin HCl

1- Timbang 100,0 mg serbukobat tetrasiklin HCl, masukankedalam labu ukur 100,0 ml.

matik yang baik, proporsionalter-hadap konsentrasi analitdalam sampel. Rentang metodeadalah pernyataan batasterendah dan tertinggi analityang sudah ditun-jukkan dapatditetapkan dengan kecermatan,keseksamaan, dan linearitasyang dapat diterima.

Cara penentuan:Linearitas biasanya

dinyatakan dalam istilahvariansi sekitar arah garisregresi yang dihitung berda-sarkan persamaan matematikdata yang diperoleh dari hasiluji analit dalam sampel denganberbagai kon-sentrasi analit.Perlakuan matematik dalampengujian linearitas adalah

1- Larutkandengan airsampai100,0melalui

persamaangaris lurus ml, kocok.

dengan metode

kuadrat terkecil an-1- Saring dengan kertas saring

tara hasil analisis terhadapkonsen-Durapore membranefilter 0,45 trasi analit. Dalambeberapa kasus,

m HV1- Suntik

an 20 llarutanujipadaHPLC.AmatipuncaknyapadakromatogramHPLC.

HasilkromatogramTetrasiklinHCl

standardansampelharusmenun-jukkanwakturetensiyangsama danpadadaerahsekitarwakturetensitetrasiklintersebuttidakboleh adagangguanyang

dapat dilihat darikromatogram larutamblanko.

4. Linearitas danRentang Definisi:Linearitas adalah

kemampuan metodeanalisis yangmemberikan responyang secara langsungatau dengan bantuantransformasi mate-

untukmemperolehhubunganpro-porsionalantarahasilpengukurandengankonsentrasi analit,data yangdiperolehdiolahmelaluitransfor-masimatematik dulu

sebelumdibuatanalisisregresinya.

Dalampraktek,digunakan satuserilarutanyangberbedakonsen-trasinyaantara 50– 150%kadaranalitdalamsampel.

Di dalampustaka,seringditemukan rentangkonsen-trasi yang

digunakan antara0 – 200%.Jumlahsampelyangdianalisis

sekurang-kurangnyadelapan buah sampelblanko.

Sebagaiparameter adanya hu-bungan linier

digunakankoefisienkorelasi rpadaanalisis

regresilinier Y =a + bX.Hubungan linieryang

128 MAJALAH ILMU KEFAR MASIANideal dicapai jika nilai b = 0 danr = +1 atau –1 bergantungpada arah garis. Sedangkannilai a menun-jukkan kepekaananalisis terutama instrumenyang digunakan. Param-eterlain yang harus dihitung adalahsimpangan baku residual (Sy).Dengan menggunakankalkulator atau perangkat lunakkomputer, semua perhitunganmatematik ter-sebut dapatdiukur

^ 2

Sy =

Σ ( y1 – y1)

N – 2

di mana ^

y1 = a + bxS

y Sx

0 =

bSx0 = standar deviasi dari

fungsi Vx0 = Sx

x0

Vx0 = koefisien variasi dari fungsi

Contoh penentuan linearitas Cara kerja :1. - Timbang baku tetrasiklin

HCl (B1, B2, B3) masing-masing sebesar 20,0;22,5; 25,0 mg. Masukkankedalam labu ukur 25,0ml.

1-Larutkan dengan airsampai 25,0 ml, kocok.

2. - Timbang baku TetrasiklinHCl (B4, B5) masing-masing sebe-sar 30,0;35,0 mg. Masukkankedalam labu ukur 50,0ml.

1-Larutkan dengan airsampai 50,0 ml, kocok.

Standar 1 :Pipet 1,0 ml larutan baku B3.

Masukan kedalam labu ukur10,0 ml. Tambahkan air sampai10,0 ml, kocok.Standar 2 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B3.Masukkan ke dalam labu ukur25,0 ml. Tambahkan air sampai25,0 ml, kocok.Standar 3 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B4.Masukkan kedalam labu ukur10,0 ml. Tambahkan air sampai10,0 ml, kocok.Standar 4 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B1.Masukkan kedalam labu ukur10,0 ml. Tambahkan air sampai10,0 ml, kocok.Standar 5 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B3.Masukkan kedalam labu ukur

10,0 ml. Tambahkan air sampai10,0 ml, kocok.Standar 6 : Larutan bakuB4 Standar 7 : Larutanbaku B5 Standar 8 :Larutan baku B1 Standar9 : Larutan baku B2Standar 10 : Larutanbaku B3

Suntikkan 20 l standar(sampai dengan standar 10 padaHPLC pada λ : 352 nm dankecepatan alir 1,0 ml/menit.Hubungan linear antarakonsentrasi (ppm) dan area Tetra-siklin HCl dalam pelarut air pada10 perbedaan tingkat konsentrasiantara 100 – 1000 ppmditunjukkan pada tabel 9. Hasildari analisis regresimenggunakan model y = ax + bdapat dilihat pada tabel 11.


Tabel 11. Linearitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi Tetrasiklin HClArea

(ppm)

100 1791763200 3583526300 5375289400 7167052500 9078290600 11190450700 12542340800 14334110900 16125870

1000 17918670

Slop b 17937,62Aksis Intersep a 45047,55Koefisien Korelasi (r) 0.999Proses Relatif Standar Deviasi (VxO) 1,504 %ANOVA Lineariti testing 12063,95172

5. Batas Deteksi dan Batas Kuan- kan instrumen atau tidak.Pada titasiDefinisi:Batas deteksi adalah jumlah

ter-kecil analit dalam sampel yangdapat dideteksi yang masihmemberikan respon signifikandibandingkan dengan blangko.Batas deteksi me-rupakanparameter uji batas. Bataskuantitasi merupakan parameterpada analisis renik dan diartikansebagai kuantitas terkecil analitda-lam sampel yang masih dapatmeme-nuhi kriteria cermat danseksama.

Cara penentuan:Penentuan batas deteksi

suatu metode berbeda-bedatergantung pada metode analisisitu mengguna-

analisis yangtidakmenggunakaninstrumen batastersebutditentukandenganmendeteksianalit dalamsampel padapengenceranbertingkat. Padaanalisisinstrumen batasdeteksi dapatdihitung denganmengukurrespon blangkobeberapa kalilalu dihitungsimpangan bakurespon blangko

dan formula dibawah ini dapatdigunakanuntukperhitungan

Q = k x Sb

Sl

17 = LOD(batasdeteksi)atau LOQ(bataskuantitasi)

11 = 3 untukbatasdeteksiatau 10untukbataskuantitasi

130 MAJALAH ILMU

KEFARMASIANSb = simpangan baku respon

analitik dari blangkoSl = arah garis linear (kepekaan

arah) dari kurva antara responterhadap konsentrasi = slope(b pada persamaan garis y =a+bx)

1. Batas deteksi (Q) Karena k = 3 atau 10 Simpangan baku (Sb) = Sy/x,maka

3 Sy/xQ = Sl

Batasdeteksi dankuantitasidapatdihitung

secara statistikmelalui garisregresi linierdari kurvakalibrasi. Nilai

pengu

2. Bataskuantitasi(Q)

Q =

Sl

Perhitungan LOD dan LOQ

Tabel 12. Ha

Konsentrasi meloksikam Luas kromotogram rata-rata(mg/ml) Meloksikam (mV.det)

15,818 423452,5

31,636 832117

47,454 1252741

79,090 2101372,5

118,634 3149102

Persamaan regresi ; y = 26569,95 x – 3282,9347

No Kons.analitArea (Yi) Yi (Yi – Yi)2

( g/ml)

1. 15,818 423.452,5 417053,67 40945025,37

2. 31,636 832.117,0 837390,28 27807481,96

3. 47,454 1.252.741,0 1257461,19 22280193,64

4. 79,090 2.101.372,5 2098134,41 10485226,85

5. 118,634 31.49102,0 3148710,23 153483,73

Σ = 101671411,6

Vol. I,No.3, Desember 2004131

Y didapat dari pers regresi,misalnya: X = 15,82 maka

y = 26569,95 x –

3282,9347 =

417053,67

S (y/x)2 = Variasi variabelrespon (y), didapat dari data-data yang dekat dengan garisregresi

1= Σ (yi –yi) 2 N –2

2=101671411,60

=33890470,52

3

S (y/x) = V 33890470,52 = 5821,55

LOD= 3.SD/b LOQ=10.SD/b

=3.5821,55 =

10.5821,55

26569,9526569,9

5

=0,66 g/ml =

2,19g/ml

Cara lain untuk menentukanbatas deteksi dan kuantitasiadalah melalui penentuan rasioS/N (signal to noise ratio). Nilaisimpangan baku blankoditentukan dengan caramenghitung tinggi derau padapeng-ukuran blanko sebanyak 20kali pada titik analit memberikanrespon. Sim-pangan baku blankojuga dihitung dari tinggi deraupuncak ke puncak, jika diambildari tinggi puncak derau atas danbawah (Np-p) maka s0 = Np-p/5sedangkan kalau dari pun-cakderau bawah saja (puncak

negatif) maka s 0 = Np/2,selanjutnya perhi-tungan sepertitersebut di atas.

6. Ketangguhan metode(rugged-ness) Definisi:Ketangguhan metode

adalah derajat ketertiruan hasiluji yang diperoleh dari analisissampel yang sama dalamberbagai kondisi uji nor-mal,seperti laboratorium, analisis,instrumen, bahan pereaksi,suhu, hari yang berbeda, dll.Ketangguhan biasanyadinyatakan sebagai tidakadanya pengaruh perbedaanoperasi atau lingkungan kerjapada hasil uji. Ketangguhanmetode merupakan ukuranketertiruan pada kondisi operasinormal antara lab dan antaranalis.

Cara penentuan:Ketangguhan metode

ditentukan dengan menganalisisbeningan suatu lot sampel yanghomogen dalam lab yang

berbeda oleh analis yang ber-beda menggunakan kondisioperasi yang berbeda, danlingkungan yang berbeda tetapimenggunakan pro-sedur danparameter uji yang sama. Derajatketertiruan hasil uji kemu-dianditentukan sebagai fungsi darivariabel penentuan. Ketertiruandapat dibandingkan terhadapkesek-samaan penentuan dibawah kondisi normal untukmendapatkan ukuranketangguhan metode. Perhitung-annya dilakukan secara statistikmenggunakan ANOVA padakajian kolaboratif yang disusunoleh Youden dan Stainer.

7. Kekuatan (Robustness) Untuk memvalidasikekuatan

suatu metode perlu dibuat perubahan


metodologi yang kecil dan terusmenerus dan mengevaluasirespon analitik dan efek presisidan akurasi. Sebagai contoh,perubahan yang di-butuhkanuntuk menunjukkan keku-atanprosedur HPLC dapat mencakup(tapi tidak dibatasi) perubahankomposisi organik fase gerak(1%), pH fase gerak (± 0,2 unit),dan peru-bahan temperaturkolom (± 2 - 3° C). Perubahanlainnya dapat dilakukan bilasesuai dengan laboratorium.

Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisisyang dapat mem-pengaruhihasil bila diganti atau diubah.Faktor orisinal ini dapatdiidentifikasi sebagai A, B, danC. Perubahan nilai faktor-faktor

ini dapat diidentifikasi dengana, b, dan c. Lakukan analisispada kondisi yang telahdisebutkan pada peme-riksaanketangguhan.

NilaiPenetapan

eksperimentalfaktor

#1 #2 #3 #4

A atau a A A a a

B atau b B b B b

C atau c C c c C

Untuk menentukan efekperu-bahan A, banding rata-ratahasil (#1 + #2)/2 dengan (#3 +#4)/2, Untuk efek perubahan B,bandingkan (#1 + #3)/2dengan (#2 +#4)/2 dan sete-rusnya.

SELEKSI PARAMETER ANALITIK

Parameter analitik yang diper-lukan untuk validasi dapat bervariasi

bergantung pada tipe prosedurana-litik. Metode yangdigunakan untuk pemeriksaanproduk farmasetika dapatdiklasifikasikan seperti di bawahini :

1!Kategori I : metode analitikalun-tuk kuantitasi komponenmaupun substansi bahanbaku obat atau bahan aktif(termasuk pengawet) padahasil akhir farmasetika ter-masuk dalam kategori I.

2!Kategori II : Metode analitikuntuk menentukan campurandalam substansi bahan bakuatau kompo-nen sisa padaproduk akhir farma-setikadimasukkan dalam kategori II.Metode ini termasuk perhi-tungan kembali secarakuantitatif dan batas tes.

3!Kategori III : Metode analitikini untuk menentukanperforma ka-rakteristik(contoh: disolusi, pe-lepasanobat) termasuk dalamkategori III.

Untuk masing-masingkategori diperlukan informasianalitik yang berbeda. Tabel 13berikut mem-berikan langkah-langkah mengenai parameteranalitik yang biasanyadiperlukan untuk masing-masing kategori.

Tes SST (system suitabilitytests) Dari validasi metodeyang

dilakukan dapat diketahuiapakah suatu metode analisis(dalam hal ini kromatografi)dapat dipakai pada suatukondisi tertentu. Untukmengetahui apakah metodetadi

Vol. I, No.3, Desember

2004 133

Tabel 13. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur

analitik yang berbeda

Parameter Kualitatif Perhitungan Perhitungan kembali Perhitungan

Performa (ID) kembali Kategori II Kembali

Analitik Kategori I Kuantitatif Batas tes Kategori III

Akurasi tidak ya ya * *

Presisi tidak ya ya tidak ya

Spesifisitas ya ya ya ya *

Batas deteksi ya tidak tidak ya *

Bataskuantitasi tidak tidak ya tidak *

Linearitas tidak ya ya tidak *

Rentang tidak ya ya * *

Ketangguhan ya ya ya ya ya

* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik.

masih dapat dipakai, seyogyanyadilakukan uji SST, seperti yangdian-jurkan oleh USP XXII/XXIIIatau peneliti lainnya (Wahlich &Carr, 1990). Sebaiknya semuaparameter validasi diuji SSTnya,sedangkan khusus untukkromatografi param-eter tailingfactor dan column effi-ciency/plate count juga diuji.

DAFTAR PUSTAKA

Carr, G.P., Wahlich, J.C., Journal ofPharmaceutical andBiomedical Analysis 1990, 8:612-618.

Debesis, E. et al., SubmittingHPLC methodes to thecompendia and regulatoryagencies. Pharm. Tech.,September 1982. p. 120

Fabre. H. et.al.,Assayvalidation foran activeingredient in apharma-ceuticalformulation:Practicalapproachusingultravioletspec-trophotometry.Analyst, 1993.118: 1061.

Garfield, F.M.QualityAssurancePrinciples forAnalyticalLabora-tories.AOACInternational,USA, 1991. p.71

Ibrahim S.PenggunaanStatistikadalam Validasi

MetodeAnalitik danPenerapannya. DalamPro-sidingtemu ilmiahnasionalbidangFarmasi. VI –15. 2001.

Indrayanto G,SeminarSehariInstru-mentasi PTDitek Jaya,Surabaya,1994.

Siregar,Mirawati.,PenetapanKadarMeloksikamdalamsediaan tab-let danDarahManusiasecara


kromatografi Cair KinerjaTing-gi, Tesis S2 IlmuKefarmasian DepartemenFarmasi FMIPA-UI, 2004.

Validation of analytical proceduresused in the examination ofphar-maceutical materials.World Health Organization 1992(WHO

Technical Report Series No. 823) p. 117

Validation of CompendialMethods. United StatesPharmacopoeia 23rd revision,United States Pharma-copoeiaConvention, Rockville, MD,1995. p. 1982.

Vol. I, No.3, Desember 2004135

1136-2357-1-SM

Documents

Transcript of 1136-2357-1-SM