結 果

渡邊將人1,2、松成ひとみ1,3、○小林美里奈1、中野和明1、前原美樹1、金井貴博1、松村幸奈1、林田豪太1、 倉本桃子1、坂井理恵子1、梅山一大1,2、渡辺信之4、小野寺雅史4、長屋昌樹2、長嶋比呂志1,2

培養胚数

正常 分割率 (%)

胚盤胞 形成率 (%)

平均細胞数 (Mean ± SEM)

PFF 40 92.5 [37/40] 75.0 [30/40] 99.9 ± 8.8

mPlum 42 81.0 [34/42] 78.6 [33/42] 88.3 ± 6.0

表1. CAG-mPlumを導入したクローン胚の体外発生能

遠赤色蛍光蛋白monomeric Plum を発現するトランスジェニックブタの作出

1明大農、2明治大学バイオリソース研究国際インスティテュート、3JST, ERATO, 中内幹細胞制御プロジェクト、4国立成育医療研究センター

我々はこれまでに緑色蛍光タンパク質 (GFP)や赤色蛍光タンパク質 (Kusabira-Orange, KO)を発現するトランスジェニック (Tg)ブタを作出してきた. これら蛍光マーカー遺伝子を発現するTg動物は移植・再生医学研究において非常に有用である. 本研究では、長波長の遠赤色蛍光タンパク質 (最大蛍光波長: 649 nm)であるmonomeric Plum (mPlum)を発現するTgクローンブタの作出を目的とした. 長波長の蛍光タンパク質は短波長の蛍光タンパク質と比べて自家蛍光の影響を受けにくい利点を持ち、cell tracking等の研究利用により有用である.

背景と目的

CAG-mPlum遺伝子の導入は、ブタSCNT胚の発生を阻害せず、遠赤色蛍光タンパク質mPlumを全身発現するTgクローンブタ胎仔の作出が可能なことが明らかとなった. 全身性蛍光発現が確認された胎仔の細胞を核ドナー細胞としてmPlumブタ産仔の作出を行うことができる.

結 論

レシピエントNo. 移植胚数 正常胎仔数 正常胎仔 作出効率 (%)

P155 103 3 2.9%

表2. CAG-mPlumを導入したクローン胎仔の作出 (妊娠36-37日)

図2. クローン胎仔・内臓・細胞のmPlum蛍光発現 (妊娠36-37日目) ・ 得られた3頭の胎仔全てに全身性蛍光発現が認められた ・ 蛍光強度には個体間の差が見られた [ Li: 肝臓, St: 胃, Kd: 腎臓, In: 腸]

Wild-Type mPlum-1 mPlum-2 mPlum-3

図1. クローン胚盤胞のmPlum蛍光発現 (day 7)

PFF mPlum

材料と方法

体外成熟 除核 細胞挿入 融合 活性化

体外培養

■ 核ドナー細胞の樹立

■ 体細胞核移植 (SCNT)による胎仔作出

レシピエントブタ

胚移植

[体外成熟培地] NCSU23 + 0.6 mM cysteine, 10 ng/ml EGF, 10% pFF, 10 IU/ml eCG and hCG (前半22 hのみ） 前半22 h：5% CO2

後半17-18 h：5% CO2, 5% O2, 90% N2

5 μg/ml サイトカラシンB, 0.1 μg/ml デメコルシン

(第一極体とその直下の細胞質を吸引除去)

[融合培地] 280 mM Mannitol, 0.15 mM MgCl2 0.5 mM Hepes, 0.01% (w/v) PVA, 280 mOsmol

融合条件 [AC] 1 MHz, 4V, 5 sec, [DC] 267 V/mm, 20 µsec

[活性化用電解液] 280 mM Mannitol, 0.1 mM MgCl2 0.05 mM CaCl2, 0.01% (w/v) PVA

[活性化条件] [DC] 150V/mm, 100 µsec

[倍数体化処理 (3 h)] +5 µg/mlサイトカラシンB, 500 nM Scriptaid [Scriptaid処理 (13-15 h)] 500 nM Scriptaid

[体外培養 ] (~96 h) PZM-5 (機能性ペプチド研究所) (96 h~) PZM-5 +10% FBS 5% CO2, 5% O2, 90% N2

胎仔回収 (36-37日)

明視野

蛍光

倍数体化 Scriptaid処理

核ドナー細胞

[発情同期化] 1000 IU eCG 1500 IU hCG

5, 6日後

個体間の蛍光発現強度・特徴の解析 次世代ドナー細胞の樹立

Li Li Li Li

St St St St

Kd Kd Kd Kd In In

In In

胎仔

内臓

樹立 細胞

両者の体外発生能に有意差 (P<0.05)はみられなかった

胚盤胞でmPlum蛍光 発現が観察された

エレクトロポレーション

ブタ胎仔線維芽細胞 (PFF)

培養 (37℃, 2 days)

ピューロマイシンによる 薬剤選択 (2.5 µg/ml)

培養 (37℃, 12 days)

FACSによる mPlum陽性画分 ソーティング

mPlum核ドナー細胞樹立

mPlum cDNA

CMV-IE enhancer

Chicken beta-actin promoter

Rabbit beta-globin poly (A)

4.3 kb

intron

Puromycin N-acetyl-transferase

■ mPlum発現ベクターの構造 (CAG-mPlum)

培養2日目と7日目に 正常分割率、胚盤胞形成率を算出

BamH I Sal I

体外発生能の検証