1. vaja - Biolosko tveganje, asepticno delo ter...
7
27. 2. 11 1 BIOKEMIJSKI PRAKTIKUM Seminarji: ponedeljek, 12-13:30 Vaje: torek, 13-16 in 16-19 sreda, 13-16 in 16-19 BIOKEMIJSKI PRAKTIKUM Asistenti: dr. Miha Pavšič ([email protected]) Marina Klemenčič ([email protected]) Matevž Korenč ([email protected]) Ocenjevanje: 20% sprotna preverjanja znanja 80% kolokvij Datum Vaja 22.2. Biološko tveganje, aseptično delo ter homogenizacija tkiva in centrifugiranje 1.3. Homogenizacija tkiva in frakcionirno obarjanje proteinov z amonijevim sulfatom 8.3. Razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo 15.3. Kromatografske metode: Ionsko-izmenjevalna kromatografija Kromatografske metode: Afinitetna kromatografija 22.3. Testi aktivnosti 29.3. Bradfordova metoda 5.4. Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS PAGE) in Western prenos 12.4. Imunološke metode – Določanje govejih IgG v siru 19.4. Določanje števila cisteinov v proteinu 3.5. Kinetika encimsko kataliziranih reakcij 10.5. Določanje holesterola 17.5. Izolacija kromosomske DNA iz goveje vranice in hiperkromni efekt 24.5. Izolacija DNA in agarozna elektroforeza (1.6.) Presnova ali metabolizem (računalniška) (8.6.) Rasmol (računalniška)
Transcript of 1. vaja - Biolosko tveganje, asepticno delo ter...
27. 2. 11
1
BIOKEMIJSKI PRAKTIKUM
Seminarji: ponedeljek, 12-13:30 Vaje: torek, 13-16 in 16-19 sreda, 13-16 in 16-19
BIOKEMIJSKI PRAKTIKUM
Asistenti: dr. Miha Pavšič ([email protected]) Marina Klemenčič ([email protected]) Matevž Korenč ([email protected])
Ocenjevanje: 20% sprotna preverjanja znanja 80% kolokvij
Datum Vaja
22.2. Biološko tveganje, aseptično delo ter homogenizacija tkiva in centrifugiranje
1.3. Homogenizacija tkiva in frakcionirno obarjanje proteinov z amonijevim sulfatom
8.3. Razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo
15.3.
Kromatografske metode: Ionsko-izmenjevalna kromatografija Kromatografske metode: Afinitetna kromatografija
22.3. Testi aktivnosti
29.3. Bradfordova metoda
5.4. Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS PAGE) in Western prenos
12.4. Imunološke metode – Določanje govejih IgG v siru
19.4. Določanje števila cisteinov v proteinu
3.5. Kinetika encimsko kataliziranih reakcij
10.5. Določanje holesterola
17.5. Izolacija kromosomske DNA iz goveje vranice in hiperkromni efekt
24.5. Izolacija DNA in agarozna elektroforeza
(1.6.) Presnova ali metabolizem (računalniška)
(8.6.) Rasmol (računalniška)
27. 2. 11
2
1. vaja – Biološko tveganje, aseptično delo ter homogenizacija tkiva in centrifugiranje
h'p://narocanje.dnevnik.si/novice/eu/256680; 16.2.2011
Uredbe o merilih za uvrstitev dela z GSO v zaprtem sistemu v varnostni razred in zadrževalnih in drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred (Ur. list RS 33/2004).
27. 2. 11
3
ASEPTIČNO DELO - z vsemi mikrobi postopamo kot da so zdravju škodljivi, - razkuževanje rok (pred in po delu) in opreme, pipetiranje z usti prepovedano, - aseptično z mikrobi ob plamenu, da ne okužimo gojišč z mikrobi iz okolja ali laboratorija z delovnimi mikrobi, - prepovedano početi karkoli kar bi privedlo do nastanka aerosolov, - sortiranje in avtoklaviranje (sterliliziranje) smeti - razlitje razkužiti (stančevina, 30' razkužilo)
V primeru nezgode nujno obvestite asistenta!
http://www.arabslab.com ; 16.2.2011
27. 2. 11
4
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Flame; 16.2.2011
HOMOGENIZIRANJE
homogenizírati -am nedov. in dov. (i) delati homogeno: homogenizirati snov - agr. homogenizirati mleko, povzročati, delati, da je maščoba
enakomerno porazdeljena po vsej tekočini; - metal. homogenizirati jeklo, s toplotno obdelavo dosegati
enakomerno sestavo in kristalno strukturo
http://www.nextadvance.com/; 16.2.2011
Metoda homogenizacije je odvisna od vrste tkiva iz katerega želeno snov izoliramo, pogoji pa morajo biti takšni, da se struktura in s tem funkcija želene snovi, ne spremeni. Metode lahko razdelimo v 3 glavne skupine: FIZIKALNE METODE KEMIČNE METODE ENCIMSKE METODE
27. 2. 11
5
FIZIKALNE METODE TERILNICA ULTRAZVOK
h'p://www.gimvic.org ; 16.2.2011
- Zamrznjeni organi - Odpornejši materiali rastlinskega in
bakterijskega izvora - Z nizko temperaturo preprečujemo
delovanje encimov, še posebej proteaz, nukleaz
- Pretvorba elektičnih pulzov v vibracije - Vzorec se segreva – delovanje na ledu! - Groba metoda
h'p://biotech.matcmadison.edu; 16.2.2011
FIZIKALNE METODE OSMOZNI ŠOK TEFLONSKI HOMOGENIZER
h'ps://www.msu.edu; 16.2.2011
- Osmoza je? - Nežna metoda, primerna samo
za živalska tkiva; celice obdane s steno ne popokajo!
- Razbijanje mejkejših tkiv zaradi strižnih sil, ki nastanejo zaradi trenja med batom in steklom
http://www.krackeler.com/; 16.1.2011
KEMIČNE METODE
Nežna metoda za razbijanje celic brez stene je tudi uporaba različnih detergentov, ki raztapljajo membrane.
http://learn.genetics.utah.edu/; 16.1.2011
27. 2. 11
6
ENCIMSKE METODE
h'p://www.bmrb.wisc.edu; 16.1.2011
Lizocim je encim, s katerim lahko obdelamo stene bakterij, saj katalizira cepitev vezi med dvema monosaharidnima enotama v bakterijski steni.
Za disintegracijo celic drugh vrst tkiv lahko uporabimo tudi npr. celulaze (rastline), hitinaze (glive), fosfolipaze pa lahko uporabimo za vse vrste membran. Za odstranitev lipidov lahko upobimo lipaze, za proteine pa različne vrste proteinaz.
CENTRIFUGIRANJE
Centrifugiranje je proces, pri katerem zaradi centrifugalne sile pride do posedanja delcev. Aparatura je centrifuga, posoda, v kateri se nahajajo vzorci pa rotor. Velikost nekaterih delcev je premajhna, da bi se posedli zaradi gravitacije, kar pomeni, da za njihovo posedanje potrebujemo večjo silo.
http://glossary.periodni.com/; 18.2.2011
Če se delec (m [g]) vrti (v [m/s]) v centrifugi (r [m]) je sila (F), ki deluje nanj:
F = m * v2 / r
(seveda delec čuti tudi gravitacijsko silo G = m * g)
http://www.currentprotocols.com/protocol/et0501; 18.2.2011
27. 2. 11
7
Za ločevanje subcelularnih frakcij se lahko uporablja ultracentrifugiranje.
1. VAJA
- Sterilno precepljanje bakterijske kulture E.coli na plošče LB
- Homogenizacija govejih jeter in ločitev frakcij
