1. Trazabilidad

PCR Y SEGURIDAD ALIMENTARIA

3. Detección de fraudes alimenticios

4. Detección de microrganismos en alimentos

2. Alimentos transgénicos

Objetivo : garantizar la seguridad alimentaria y contribuir a que dejen de comercializarse alimentos y piensos que no son seguros.

1.-TRAZABILIDAD

Trazabilidad : supone el uso de marcadores genéticos polimórficos para establecer un sistema de control de

origen geográfico y seguimiento de los animales, desde su nacimiento hasta su venta de sus partes en la

carnicería.

En el campo de la producción cárnica, se trata de autentificar la población animal que da origen a la

carne, permitiendo controlar las denominaciones de origen y marcas de calidad, así como también llevar a cabo el seguimiento de individuos y productos que

nos permitirá la identificación del foco original de posibles patologías

Sistemas de identificación en ganado bovino

En cuanto a los sistemas de identificación y movimiento de ganado bovino, el Reglamento (CE) 1760/2000 del Consejo y del Parlamento Europeo, que establece un sistema de

identificación y registro de los animales de la especie bovina, enumera en su artículo 3 los elementos que han de constituir dicho sistema:

- Marcas auriculares, destinadas a identificar individualmente a cada animal

- Pasaporte para los animales- Registros individuales llevados en cada explotación- Bases de datos informatizadas

TRAZABILIDAD GENÉTICA

Sistema de identificación de animales y productos basado en el ADN contenido en los mismos

Sistema con objetividad, repetibilidad y seguridad no alcanzable con ningún otro sistema

Instrumento potente para controlar y autentificar los sistemas de identificación tradicionales (crotales, tatuajes, sistemas electrónicos...), puesto que la información genética contenida por un individuo es inalterable durante toda su vida, está presente en cada parte de su organismo y es única en cada sujeto.

• Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. • Si tenemos en cuenta que el genoma de cada animal contiene aproximadamente 3x109 pares de bases (pb), las posibilidades que existen de variación entre los distintos individuos son enormes (3x106)

Fundamentos de la identificación genética

• Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual.• Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis.• Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas.

¿Cómo se genera esta gran variación genética?

Imposibilidad de la existencia de individuos genéticamente idénticos

BASE DE DATOSsexo

explotación

procedencia

número de identificación individual

identificación del padre y de la madre

Resultados degenotipos

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

1. Toma de muestra: Cualquier muestra de células nucleadas, casi en cualquier estado.

2. Recogida de información de la muestra y establecimiento de una base de datos.

3. Análisis de diferentes marcadores genéticos en las muestras.

Marcadores genéticos aplicados a la identificación individual

Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, y por tanto poder ser usado como sistema de

trazabilidad, necesita reunir una serie de características:

• Que sea muy polimórfico, • Que esté distribuido por todo el genoma. • Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la

aplicación• Que sea público .• Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva.• Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de

la que se obtendrá el ADN.• Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios• Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y

abaratar los costes.• Que sea estable

Especie MicrosatéliteCromoso

maTamaño Nº alelos

Bovina

ETH225(D9S1) 9140-158 8

INRA023(D3S10) 3196-222 10

ETH104(D5S3) 5209-223 7

BM2113(D2S26) 2125-143 10

BM1824(D1S34) 1178-190 5

TGLA227(D18S1) 1877-97 10

TGLA126(D20S1) 20113-125 7

TGLA122(D21S6) 21137-183 15

SPS115(D15) 15246-260 7

Microsatélites estandarizados a nivel internacional (ISAG)

Especie MicrosatéliteCromoso

maTamaño Nº alelos

Ovina

OARFCB20 2 92-118 12

MAF65 15 121-137 3

INRA063 14 169-207 7

MAF214 16 181-265 6

OARAE129 5 135-165 5

BM1329 6 162-174 5

INRA005 10 120-154 13

SPS113 15 138-150 4

MCM527 5 165-179 10

D5S2 - 190-210 7

NRA23 1 201-219 8

OARCP49 17 82-138 7

OARFCB11 2 122-146 9

CSRD247 - 215-261 11

HSC 20 269-301 14

OARFCB304 19 148-190 9

BM1258 - 100-128 -

BM1818 - 258-270 -

INRA132 - 152-172 -

Especie MicrosatéliteCromoso

maTamaño Nº alelos

Caprina

OARFCB20 2 93-109 12

ILSTS87 6 137-155 8

SRCRSP23 - 85-119 15

INRA063 14 173-179 7

SRCRSP05 21 158-180 6

SRCRSP08 - 209-235 7

SRCRSP24 - 139-163 9

INRA005 10 118-126 13

MAF65 15 121-157 3

MCM527 5 152-168 6

CSRD247 - 221-247 11

INRA23 3 197-215 9

BM1258 23 110-120 -

BM1329 6 145-161 -

BM1818 23 258-270 -

I NRA132 23 152-172 -

Efecto del número de microsatélites en la probabilidad de que dos muestras coincidan por azar

Porcentaje de individuos incorrectamente identificados en función del número de marcadores utilizados

2.-DETECCIÓN DE OGMs EN MATERIAS PRIMAS MEDIANTE PCR

ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO

(Directiva 2001/18/CE)

Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido

modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la

recombinación natural

CULTIVOS DE GMOs EN EL MUNDO

Fuente: James, 2005 (ISAAA Brief 34)

Evolución de los cultivos transgénicos

Evolución por tipo de cultivo

NUMERO DE PAÍSES EN LOS QUE SE CULTIVAN PLANTAS TRANSGÉNICAS

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1990 1998 2001 2002 2003

99% de la superficie cultivada con plantas transgénicas

corresponde a cuatro países: Estados Unidos (66%), Argentina (23%), Canáda (23%), y

China (4%)

SOJA

MAÍZ

ALGODÓNPATATA

PRINCIPALES PAISES PRODUCTORES DE CULTIVOS TRANGÉNICOS

Octubre 1998 hasta Mayo 2003

Moratoria europea

No se ha autorizado ningún organismo transgénico

- De los 18 GMOs liberados al medio ambiente 8 son de utilización en la alimentación humana y animal

* Maíz 2 variedades tolerantes a herbicidas (Ciba Geigy y AgrEvo)

1 variedad resistente a insectos (Monsanto)

1 variedad tolerante a herbicidas y resistente a insectos (Novartis)

* Soja 1 variedad tolerante a herbicidas (Monsanto)

* Colza 3 variedades tolerantes a herbicidas (Plant Genetic System y AgrEvo)

ETIQUETADO

-La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable”

- La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003

- El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

Creación de plantas transgénicas

Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1%

Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

Mediante técnica PCR

2.-Autentificación de los componentes de los alimentos

•Diferenciación de distintas especies •Patés y quesos•Hamburguesas y productos cárnicos procesados• …

Proteícos

Métodos analíticos

Genéticos

RAPD-PCR

RAPD-PCR

Identificación de fraudes en quesos RAPD: random amplification of polymorphic DNA

Sensibilidad de 25 pg

310 pb 290 pb

750 pb

RAPD-PCRDiferenciación de

especies

340 pb

Caprino Ovino Bovino

340 pb310 pb

750 pb

B O C B/O B/C O/C O/B/C

RAPD-PCRQuesos

2

Patés

1 3

RAPD-PCR

C/Pt Pt O Pv Pll C PtC/Pt Pt O Pv Pll C Pt

RAPD-PCRPatés

RAPD-PCR

PARA DIFERENCIAR ESPECIES

BUSCAR REGIONES ESPECÍFICAS DE ESPECIE

La señal es positiva en cualquier raza de cerdos

Pietrain Chato Murciano Landrace Large White

b o cp cv pll pv pt e -

Comprobar que se amplifica en todas las razas de cerdo

Comprobar que ninguna otra especie animal daba una señal positiva

1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%

Amplificación y cuantificación mediante un fragmento específico de especie.

Cuantificación por densitometría de la banda

4.-Detección de microrganismos en alimentos

Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas

• Deterioran los alimentos

•Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación

VENTAJAS VENTAJAS

1.1.Sensibilidad Sensibilidad 2.2.Especificidad Especificidad 3.3.Capacidad de procesamiento de gran número de muestrasCapacidad de procesamiento de gran número de muestras

Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo b-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra).

Detección gen gtf mediante PCR

DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos):

DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

Microrganismos Trastorno Posible producto Método

que ocasiona portadorAcrobacter spp

Bacillus cereus

Campilobacter spp

Clostridium botulinum

Clostridium perfringens

E.Coli

Listeria spp

Salmonella spp

Shigella spp

Vibrio cholera

Yersinia enterocolitica

Diarrea

Diarrea, vómitos

Diarrea

Botulismo, vómitos

Diarrea, dolor abd.

Diarrea, colitis

Listeriosis

Gastroenteritis

Fiebre , calambres

Cólera

Yersiniosis

Carne de aves

Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos

Aves, cerdo , res y Leche cruda

Pescado, miel, latas

Carne de res y aves,Salsas

Carne y productosLácteos

Pate, leche, queso, carneMariscos, ensalada de col

Leche, huevo crudo, carnede res y ave

Mayonesa, vegetales crudosLeche y aves

Ostras crudas, pescado

Leche, tofu, canales de cerdo

RAPD-PCR

PCR

PCR múltiple

PCR anidado

PCR duplex

PCR múltipleRT- PCR

PCR-múltiple RT- PCRRT- PCR

PCR simple

RT- PCR

RT- PCR

EXISTEN KITS COMERCIALESEXISTEN KITS COMERCIALES

BAX (Qualicom, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O157:H7

PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella

Listeria

TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O 157