1

1.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1. Η γένεση και αναδιαµόρφωση των αγγείων

1.1.1. Ορισµοί-γενικά

To αιµοφόρο αγγειακό σύστηµα χρησιµεύει για τη µεταφορά και κατανοµή του

αίµατος στα διάφορα όργανα του σώµατος και µε αυτό τον τρόπο εξυπηρετεί τη θρέψη

και οξυγόνωση των ιστών, την απέκκριση των άχρηστων και επιβλαβών προϊόντων της

ανταλλαγής της ύλης, τη µεταφορά των ορµονών, τη διαρρύθµιση της θερµοκρασίας

του σώµατος και την άµυνα του οργανισµού.

Το αγγειακό σύστηµα αναπτύσσεται µέσω των µηχανισµών της αγγειακής

διαφοροποίησης (vasculogenesis) και της αγγειογένεσης (angiogenesis). Κατά την

αγγειακή διαφοροποίηση τα αιµοφόρα αγγεία αναπτύσσονται de novo από

διαφοροποίηση αρχέγονων ενδοθηλιακών κυττάρων (αγγειοβλαστών) in situ µε τελικό

αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός άωρου πλέγµατος, ενώ κατά την αγγειογένεση ο

σχηµατισµός νέων τριχοειδών αγγείων γίνεται από προϋπάρχοντα. Eπίσης µε τη

διαδικασία της αγγειακής µυογένεσης (vascular myogenesis), της προσέλκυσης δηλαδή

περιενδοθηλιακών κυττάρων στο άωρο αγγείο, το αγγειακό δίκτυο σταθεροποιείται.

Το αγγειακό σύστηµα στα περισσότερα όργανα δηµιουργείται µε αγγειακή

διαφοροποίηση µε εξαίρεση τον εγκέφαλο και τους νεφρούς που δηµιουργείται µε

αγγειογένεση. H δηµιουργία νέων αγγείων στον ενήλικα λαµβάνει χώρα κυρίως µέσω

αγγειογένεσης αλλά και µέσω αγγειακής διαφοροποίησης.

Η διαδικασία της αγγειογένεσης στον ενήλικα είναι αυστηρώς ρυθµιζόµενη και

αυτοπεριοριζόµενη και σε φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζεται µόνο στην επουλωτική

διαδικασία και στο ενδοµήτριο της γυναίκας κατά τη διάρκεια του γενετήσιου κύκλου.

Όµως σε αρκετές παθολογικές καταστάσεις η αγγειογενετική διαδικασία χάνει τον

αυτοπεριοριστικό της χαρακτήρα. Το φαινόµενο αυτό παρατηρείται κατά την διάρκεια

της ανάπτυξης και προόδου αρκετών ασθενειών, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, η

ψωρίαση, οι συµπαγείς όγκοι και µια πλειάδα νοσηµάτων του οφθαλµού µε

προεξάρχουσα την διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια και την ηλικιακή εκφύλιση της

ωχράς.

2

Εικόνα 1

Η γένεση και αναδιαµόρφωση των αγγείων (Yancopoulos et al., 2000)

1.1.2. Αγγειακή διαφοροποίηση (vasculogenesis)

Οι πρώτες ενδείξεις ανάπτυξης αιµοφόρων αγγείων στο έµβρυο εντοπίζονται

στο λεκιθικό ασκό ως εστιακές συναθροίσεις µεσεγχυµατικών κυττάρων, οι οποίες

είναι γνωστές ως αιµατικές νησίδες. Στις αρχές του 1900 παρατηρήθηκε ότι κύτταρα

από έµβρυα ήταν ικανά να δηµιουργήσουν νέα αγγεία. Τότε εµφανίστηκε και ο όρος

αγγειοβλάστη για να περιγράψει το κύτταρο από όπου προέρχονται όλα τα

ενδοθηλιακά κύτταρα και ο όρος αιµαγγειοβλάστη που αναφέρεται σε έναν κοινό

αρχέγονο κύτταρο από όπου προκύπτουν τα ενδοθηλιακά και τα αιµοποιητικά κύτταρα.

100 χρόνια αργότερα η παρουσία της αιµαγγειοβλάστης επιβεβαιώθηκε (Choi, 1998).

Στη διαφοροποίηση του πολυδύναµου αρχέγονου εµβρυϊκού κυττάρου σε

αιµαγγειοβλάστη, ο FGF-2 (Fibroblast Growth Factor) παίζει σηµαντικό ρόλο (Krah et

al., 1994). Τα πρώτα στάδια διαφοροποίησης της αιµαγγειοβλάστης λαµβάνουν χώρα

στις αιµατικές νησίδες, αλλά ο µοριακός µηχανισµός µε τον οποίο πραγµατοποιείται

δεν είναι γνωστός. Αρκετά γονίδια έχουν αναγνωριστεί ότι ενέχονται σε αυτή τη

3

διαδικασία (Carmeliet, 1999) όπως τα Ets-1(Vandenbunder et al., 1989), Hex (Thomas

et al., 1998),Vegf (Xiong et al., 1999), Hox (Belotti et al., 1998; Boudreau et al., 1997),

οι Id-πρωτεΐνες (Lyden et al., 1999) κτλ. Κοινοί δείκτες για τα αρχέγονα ενδοθηλιακά

και τα αιµοποιητικά κύτταρα αποτελούν το CD31, το CD34 και ο υποδοχέας του

VEGF, VEGFR-2 (Yamaguchi et al., 1993). Κατ’αυτό τον τρόπο απαλοιφή του

γονιδίου του VEGFR-2 στα ποντίκια έχει ως αποτέλεσµα εµβρυϊκό θάνατο και

απώλεια ανάπτυξης του αγγειακού και του αιµοποιητικού συστήµατος (Shalaby et al.,

1995). Επίσης ποντίκια στα οποία έγινε απαλοιφή του VEGFR-1 αποτυγχάνουν να

οργανωθούν σε φυσιολογικές αγγειακές δοµές οδηγούµενα σε υπερανάπτυξη

ανώµαλων ενδοθηλιακών κυττάρων (Fong et al., 1995) (βλέπε και κεφάλαιο 1.3.2).

Η διάκριση των αγγείων σε αρτηρίες και φλέβες λαµβάνει χώρα πρώιµα κατά

την εµβρυϊκή ανάπτυξη. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι συγκεκριµένα Notch

προσδέµατα όπως το DeltaC (Wilkinson, 2000) εκφράζονται στο ενδοθήλιο των

αρτηριών και ότι ελαττωµατική µεταγωγή του σήµατος από το Notch προκαλεί

προβληµατική αγγειακή αναδιαµόρφωση (Krebs et al., 2000). Επίσης µέλη της

οικογένειας των εφρινών (ephrins) και των υποδοχέων τους φαίνεται να παίζουν ρόλο

σε αυτή τη διαδικασία (Wilkinson, 2000). Έτσι κατά τη διάρκεια της εµβρυϊκής

ανάπτυξης η εφρίνη Β2 (ephrin B2) εκφράζεται ειδικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα των

αρτηριών και στη συνέχεια επεκτείνεται και στα αρτηριακά λεία µυϊκά κύτταρα (Gale

et al., 2001) (Εικ1). Αυτή η ειδικότητα της έκφρασης της εφρίνης Β2 συνεχίζεται και

στην ενήλικη ζωή (Gale et al., 2001; Shin et al., 2001). Σε αντίθεση ο υποδοχέας της

EphB4 εκφράζεται στις φλέβες.

Παρ’όλο που αρχικά είχε θεωρηθεί ότι η αγγειακή διαφοροποίηση περιορίζεται

αυστηρά στην εµβρυϊκή ζωή, έχει δειχθεί πλέον ότι ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα

(EΠK) (Endothelial Progenitor Cells, EPCs) κυκλοφορούν και µετά τη γέννηση και

προσελκύονται σε περιοχές in situ ανάπτυξης αγγείων (Asahara et al., 1999; Kalka et

al., 2000; Rafii, 2000), όπου και συµµετέχουν στην δηµιουργία των νέων αγγείων. Tα

θετικά στους δείκτες CD34/VEGFR-2/AC133 EΠK, που προέρχονται από το µυελό

των οστών των ενηλίκων έχουν υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναµικό (Lin et al., 2000).

Ως προς τον µηχανισµό µε τον οποίο τα EΠK κινητοποιούνται και προσελκύονται στις

περιοχές της αγγειακής διαφοροποίησης, η συµµετοχή της ΜΜP-9 και της sKitL

(stem-cell cytokine-soluble kit ligand) έχει περιγραφεί. Αρκετοί επίσης αυξητικοί

παράγοντες συµπεριλαµβανοµένων των VEGF και GM-CSF (Granulocyte Macrophage

Colony Stimulating Factor) έχουν δειχθεί, ότι µπορούν να προσελκύσουν EΠK από το

4

µυελό των οστών σε περιοχές νεοαγγείωσης µετά τη γέννηση (Asahara et al., 1999;

McBride and Ruiz, 1998; Takahashi et al., 1999a). Η διαφοροποίηση των EΠK

πιθανώς επάγεται από τον VEGF µέσω του VEGFR-2 και τον FGF-2 (Carmeliet et al.,

1996; Ferrara, 1999; Ferrara et al., 1996; Shalaby et al., 1997), ενώ ο VEGFR-1 έχει

δειχθεί ότι καταστέλλει την κατεύθυνση διαφοροποίησης των EΠK (Fong et al., 1999).

Η διαδικασία αυτή προσέλκυσης ΕΠΚ εµφανίζεται και στην αγγειογένεση των όγκων

(Lyden 2001, Reyes 2002).

1.1.3. Aγγειακή Μυογένεση

Το άωρο αγγειακό πλέγµα, το οποίο προέρχεται από την αγγειακή

διαφοροποίηση, προκειµένου να ανταποκριθεί στις ανάγκες των αναπτυσσόµενων

ιστών του εµβρύου, υφίσταται συνεχή αγγειογενετική αναδιαµόρφωση. Kατ'αυτή

δηµιουργούνται καινούργια αγγεία µε διαδικασίες όπως η εκβλάστηση, η

γεφυροποίηση και ο εγκολεασµός, αλλά επίσης και υποστροφή εκεί όπου τα αγγεία

υπερεπαρκούν ή δεν χρειάζονται πλέον (Εικ1). H εκβλάστηση είναι η περισσότερο

γνωστή διαδικασία και οι µοριακοί µηχανισµοί της περισσότερο κατανοηµένοι (βλέπε

κεφάλαιο 1.1.4.2). Παράλληλα µε την αγγειογενετική ανάπτυξη του αγγειακού

συστήµατος, τα αγγεία πρέπει να γίνουν λειτουργικά και το τοίχωµά τους να ωριµάσει

µε την προσέλκυση µεσεγχυµατικών κυττάρων, τα οποία θα διαφοροποιηθούν σε

περιενδοθηλιακά κύτταρα (περικύτταρα στο επίπεδο των τριχοειδών και λεία µυϊκά

κύτταρα στο επίπεδο των αρτηριδίων και αρτηριών). H διαδικασία αυτή καλείται

αγγειακή µυογένεση και είναι κεφαλαιώδους σηµασίας για την λειτουργικότητα του

αγγειακού συστήµατος.

Τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων σταθεροποιούν τα νέα αγγεία και

αναστέλλουν τον πολ/µό και τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων

(Underwood et al., 1998), ενώ η απογύµνωση της αορτής από ενδοθηλιακά κύτταρα

προκαλεί στένωσή της λόγω πολλαπλασιασµού των λείων µυϊκών κυττάρων (Orlandi

et al., 1994). Επίσης τα αγγεία υποστρέφονται πιο εύκολα όταν δεν καλύπτονται από

λεία µυϊκά κύτταρα και το αγγειογενετικό ερέθισµα είναι περιορισµένο (Benjamin et

al., 1998; Lindahl et al., 1999). Όµοια τα περικύτταρα έχουν πολλές δράσεις που

περιλαµβάνουν ρύθµιση της αιµατικής ροής και της αγγειακής διαπερατότητας µέσω

µεταγωγής σηµάτων στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εξωκυττάρια ουσία (Rucker et

al., 2000). Συνολικά λοιπόν τα περιενδοθηλιακά κύτταρα µε µια ποικιλία

5

αγγειοδραστικών πεπτιδίων, και κυτταροκινών που εκκρίνουν, αλλά και µε την

αλληλεπίδρασή τους µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα, εξασφαλίζουν σταθεροποίηση,

στεγανοποίηση και ρύθµιση του τόνου των αγγείων.

Η προέλευση των λείων µυϊκών κυττάρων δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί

(Carmeliet, 2000a). Τα λεία µυϊκά κύτταρα µπορεί να διαφοροποιούνται από

µεσεγχυµατικά κύτταρα, αρχέγονα κύτταρα του µυελού των οστών, µακροφάγα ή

ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατα ένα κοινό αρχέγονο αγγειακό κύτταρο έχει

αναγνωριστεί, το οποίο διαφοροποιείται σε ενδοθηλιακό κύτταρο υπό την επίδραση

του VEGF και σε λείο µυϊκό κύτταρο υπό την επίδραση του PDGF-BB (Platelet

Derived Growth Factor-BB) (Yamashita et al., 2000).

Η προσέλκυση των περιενδοθηλιακών κυττάρων πραγµατοποιείται µε τη δράση

µιας σειράς παραγόντων. Ο PDGF-BB είναι χηµειοτακτικός για τα λεία µυϊκά κύτταρα

(Lindahl et al., 1998), ενώ ο VEGF έχει επίσης συµµετοχή σε αυτή τη διαδικασία

πιθανώς µέσω ελευθέρωσης PDGF ή σύνδεσης του στους υποδοχείς του. Ποντίκια στα

οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου Pdgfb πέθαναν κατά την εµβρυϊκή ζωή και τα

περικύτταρα απουσίαζαν από αρκετά αγγεία µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό

µικροαγγειακών ανευρυσµάτων (Hellstrom et al., 2001b). Επιπλέον ποντίκια, στα

οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου Edg1 (sphingosine 1-phosphate-1-endothelial

differentiation sphingolipid G protein-coupled receptor-1) παρουσίαζαν παρόµοιο

φαινότυπο µε αδυναµία των περιενδοθηλιακών κυττάρων να µεταναστεύσουν στα

αιµοφόρα αγγεία (Liu et al., 2000). Ο µοριακός µηχανισµός µε τον οποίο αυτό

πραγµατοποιείται, δεν είναι γνωστός. Η Ενδοθηλίνη–1 είναι επίσης χηµειοτακτική για

τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, τα οποία µετατρέπει σε λεία µυϊκά κύτταρα στα

θωρακικά αγγεία, (Yanagisawa et al., 1998) ενώ ο ιστικός παράγοντας προάγει την

προσέλκυση περικυττάρων πιθανώς µέσω έναρξης της πήξης και παραγωγής

θροµβίνης (Osterud and Bjorklid, 2001).

Οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα των νεαρών αγγείων

και τα περιενδοθηλιακά κύτταρα σταθεροποιούνται µε την Ang1 (Angiopoitin 1) και

τον Tie2 υποδοχέα. Ο τελευταίος µάλιστα επάγει τη διακλάδωση και τη διαµόρφωση

των αγγείων (Gale and Yancopoulos, 1999; Lindahl et al., 1998; Suri et al., 1996).

∆υσλειτουργία του Tie2 έχει ως αποτέλεσµα ελαττωµένα λεία µυϊκά κύτταρα και

αγγειακές ανωµαλίες στους ανθρώπους. Μέλη της οικογένειας TGFβ (Transforming

Growth Factor β) περιλαµβανοµένου του TGFβ1 παίζουν επίσης ρόλο στην ωρίµανση

των αγγείων µε το να ενεργοποιούν τη διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών κυττάρων

6

προς λεία µυϊκά κύτταρα ή περικύτταρα και την εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας, ενώ

ταυτόχρονα αναστέλλουν τον πολ/µό και τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών

κυττάρων. Οι αλληλεπιδράσεις Ephrin-Eph µπορούν επίσης να µεταβιβάσουν σήµατα

από το ενδοθήλιο στα µεσεγχυµατικά κύτταρα (Gale and Yancopoulos, 1999). Ο basic

helix-loop-helix µεταγραφικός παράγοντας dHAND απαιτείται για την φυσιολογική

αµοιβαία αλληλεπίδραση µεταξύ αγγειακών µεσεγχυµατικών και ενδοθηλιακών

κυττάρων, όπως και για την διαφοροποίηση των λείων µυϊκών κυττάρων (Yamagishi et

al., 2000). Τέλος, µόρια συγκόλλησης όπως η νευρική καντχερίνη (N-cadherin) παρέχει

περαιτέρω µόνιµες συνδέσεις µεταξύ ενδοθηλίου και µεσεγχυµατικών κυττάρων

(Moiseeva, 2001).

1.1.4. Αγγειογένεση

Oπως αναφέρθηκε παραπάνω, αγγειογένεση καλείται η δηµιουργία νέων

αγγείων από προϋπάρχοντα (κεφάλαιο 1.1.1). Eτσι, νέα αγγεία µπορούν να προκύψουν

κατά την εµβρυϊκή ανάπτυξη από το άωρο αγγειακό πλέγµα της αγγειακής

διαφοροποίησης (κεφάλαιο 1.1.2). Στην περίπτωση αυτή η διαδικασία της

αγγειογένεσης είναι στενά συνδεµένη µε την διαδικασία της αγγειακής µυογένεσης

(κεφάλαιο 1.1.3). Στους ενήλικες οργανισµούς όµως, η αγγειογένεση λαµβάνει χώρα

από ήδη ώριµα αγγεία, είτε αυτή είναι φυσιολογική (επανόρθωση ιστών,

αναπαραγωγικό σύστηµα της γυναίκας), είτε παθολογική (αγγειογενετικές νόσοι

περιλαµβανοµένων και αυτών του οφθαλµού). H αγγειογένεση από ώριµα αγγεία

συνήθως συµβαίνει µε την διαδικασία της εκβλάστησης, της οποίας οι µοριακοί

µηχανισµοί είναι περισσότερο µελετηµένοι και σε αυτούς βασικά αναφέρεται το

κεφάλαιο αυτό.

1.1.4.1. Iσορροπία διεγερτών και αναστολέων της αγγειογένεσης

Η διαδικασία της αγγειογένεσης είναι αυστηρώς ρυθµιζόµενη και πρόσφατα

δεδοµένα δείχνουν ότι σηµαντικό ρόλο παίζει η ισορροπία µεταξύ διεγερτών και

αναστολέων της αγγειογένεσης. Έτσι η δηµιουργία νέων τριχοειδών ενεργοποιείται

όταν η παραγωγή διεγερτών αυξάνεται ή όταν η παραγωγή των αναστολέων µειώνεται

ή όταν συµβαίνουν αµφότερα συγχρόνως (Liotta et al., 1991).

7

Ο αριθµός των παραγόντων που αναγνωρίστηκαν ως αγγειογενετικοί διεγέρτες

είναι συνεχώς αυξανόµενος. Έτσι εκτός από το VEGF που ενέχεται σε όλα τα στάδια

της αγγειογένεσης (βλέπε κεφάλαιο 1.1.4.2), αρκετοί άλλοι παράγοντες έχουν επίσης

ενοχοποιηθεί, οι οποίοι διαδραµατίζουν κάποιο ρόλο σε ένα ή περισσότερα στάδια της

αγγειογένεσης.

O FGF-2 ενεργοποιεί τον πολ/µό, τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών

κυττάρων και προσελκύει µεσεγχηµατικά ή/και φλεγµονώδη κύτταρα που παράγουν

πολλούς αγγειογενετικούς παράγοντες (Carmeliet, 2000b). O PDGF είναι επίσης

αγγειογενετικός παράγοντας και προσελκύει περικύτταρα και λεία µυϊκά κύτταρα γύρω

από τα νεαρά αγγεία (Lindahl et al., 1999; Lindahl et al., 1998). Επίσης από µελέτες

απαλοιφής γονιδίων σε ποντίκια βρέθηκε ότι η συνθετάση του ΝΟ έχει αγγειογενετική

δράση in vivo (Murohara et al., 1998).

Mέλη της TGFβ υπεροικογένειας και ο TNFα είναι πολυπαραγοντικές

κυτταροκίνες που έχουν αναφερθεί ότι επάγουν ή αναστέλλουν την νεοαγγείωση

ανάλογα µε τα µοντέλα που έχουν χρησιµοποιηθεί (Pepper, 1997) (Gohongi et al.,

1999; Guo et al., 2000). Πρόσφατα µάλιστα χυµοκίνες όπως η MCP-1 έχουν δειχθεί ότι

επάγουν τον πολλαπλασιασµό του ενδοθηλίου (Belperio et al., 2000). Τέλος ένας

συνεχώς αυξανόµενος αριθµός από παράγοντες, των οποίων ο ενδογενής ρόλος στην

αγγειογένεση δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως περιλαµβάνει την ερυθροποιητίνη, τον

IGF-1 (Insulin-like Growth Factor), τον EGF (Epidermal Growth Factor), τον ιστικό

παράγοντα (Tissue Factor), τον HGF (Hepatocyte Growth Factor), τις ιντερλευκίνες και

τις ορµόνες.

Συνολικά η αγγειογενετική εκβλάστηση ρυθµίζεται όπως αναφέρθηκε

παραπάνω από µια ισορροπία µεταξύ ενεργοποιητών και αναστολέων. Tέτοιοι

αναστολείς έχουν αναφερθεί και περιλαµβάνουν την αγγειοστατίνη (angiostatin), την

ενδοστατίνη (endostatin), την αντιθροµβίνη III (antithrombin III), την

ιντερφερόνη β και άλλα µόρια.

8

Εικόνα 2

Η ισορροπία αγγειοποιητινών και VEGF κατά την αγγειακή αναδιαµόρφωση

(Hanahan, 1997).

Επίσης η ισορροπία ανάµεσα στους διεγέρτες της αγγειογένεσης, όπως ο

VEGF, και µόρια της οικογένειας των αγγειοποιητινών διαδραµατίζει ουσιαστικό ρόλο

στην ενεργοποίηση της αγγειογένεσης ή την υποστροφή των αγγείων. Έτσι, η

αγειοποιητίνη 1 (Ang1) µέσω φωσφορυλίωσης του Tie 2 υποδοχέα της είναι

χηµειοτακτική για τα ενδοθηλιακά κύτταρα, προκαλεί εκβλάστηση των κυττάρων,

ισχυροποιεί τη δράση του VEGF και ενεργοποιεί τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ

ενδοθηλιακών και περιενδοθηλιακών κυττάρων (Gale and Yancopoulos, 1999; Suri et

al., 1996; Suri et al., 1998). Xαµηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης του Tie 2 έχουν επίσης

ανιχνευθεί στο µη ενεργοποιηµένο αγγειακό δίκτυο υποδεικνύοντας συµµετοχή του Tie

2 στη διατήρηση των αγγείων. H αγειοποιητίνη 2 (Ang-2), ένα άλλο µέλος της

οικογένεια των αγγειοποιητινών, είναι αναστολέας της µεταγωγής του σήµατος από τον

Tie2 και ένας φυσικός ανταγωνιστής της Ang1. H Ang2 εµφανίζεται στις περιοχές

νεοαγγείωσης και αγγειακής αναδιαµόρφωσης και ενέχεται, στη µείωση των επαφών

µεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων, την απώλεια επαφής τους από τα λεία µυϊκά

κύτταρα και τη χαλάρωση της εξωκυττάριας ουσίας, τα οποία επιτρέπουν την

πρόσβαση των διεγερτών της αγγειογένεσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά και την

9

µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Gale and Yancopoulos, 1999;

Maisonpierre et al., 1997). Κατά συνέπεια, η Ang2 παρουσία διεγερτών της

αγγειογένεσης είναι αγγειογενετική, απουσία τους όµως, η προκαλούµενη

αποσταθεροποίηση του αγγείου οδηγεί σε υποστροφή του (Maisonpierre et al., 1997)

(Εικ2).

1.1.4.2. Στάδια της αγγειογενετικής εκβλάστησης

H διαδικασία της νεοαγγείωσης αρχίζει µε αγγειοδιαστολή που οφείλεται

κυρίως στο µονοξείδιο του αζώτου (NO). O VEGF, ο οποίος επάγεται µεταγραφικά

από το NO (Kimura et al., 2000), αλλά και από άλλα αγγειογενετικά ερεθίσµατα όπως

η υποξία, αυξάνει τη διαπερατότητα των αγγείων προκαλώντας αφενός µεν

σχηµατισµό ανοιγµάτων και κυστικών κενοτοπίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα,

αφ’ετέρου ανακατάταξη των κυτταρικών µορίων συγκόλλησης όπως το PECAM-1 και

η αγγειακή ενδοθηλιακή καντχερίνη (VE-cadherin), µέσω ενεργοποίησης µια σειράς

κινασών (Eliceiri et al., 1999; Gale and Yancopoulos, 1999).

Στη συνέχεια ακολουθεί εξαγγείωση πρωτεϊνών του πλάσµατος, οι οποίες

παρέχουν µια προσωρινή οδό για τα προς µετανάστευση κύτταρα. Αν όµως αυτή η

διαρροή είναι εκτεταµένη, µπορεί να έχει δραµατικά αποτελέσµατα όπως ενδοκράνια

υπέρταση, µετάσταση, κυκλοφορική ανεπάρκεια ή τύφλωση. Γι’αυτό το λόγο η

αγγειακή διαπερατότητα πρέπει να είναι αυστηρά ελεγχόµενη. H Aγγειοποιητίνη 1

(Ang1), το πρόσδεµα για τον ενδοθηλιακό υποδοχέα Tie2, είναι ένας ενδογενής

παράγοντας που αναστέλλει την διαπερατότητα των αγγείων και έτσι παρέχει

προστασία από µια εκτεταµένη εξαγγείωση του πλάσµατος (Thurston et al., 2000).

Όταν η Ang1 χορηγείται σε ώριµα αγγεία τα προστατεύει από την εξαγγείωση του

πλάσµατος, χωρίς να επηρεάζει τη µορφολογία τους.

Προκειµένου τα ενδοθηλιακά κύτταρα να ενεργοποιηθούν από τους

αγγειογενετικούς παράγοντες και να µεταναστεύσουν, χρειάζεται να χαλαρώσουν οι

κυτταρο-κυτταρικές συνδέσεις και να µειωθεί η περιαγγειακή υποστήριξη, δηλαδή το

ώριµο αγγείο να αποσταθεροποιηθεί. Η Ang-2 διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο σε αυτή

τη διαδικασία όπως έχει αναφερθεί παραπάνω (βλέπε και κεφάλαιο 1.1.4.1).

Η διάσπαση της βασικής µεµβράνης και της εξωκυττάριας ουσίας γίνεται µε

µια σειρά πρωτεασών και όχι µόνο παρέχει χώρο στα ενδοθηλιακά κύτταρα για να

µεταναστεύσουν, αλλά και ελευθερώνει αυξητικούς παράγοντες όπως ο FGF-2, ο

10

VEGF, ο IGF-1, οι οποίοι φυσιολογικά βρίσκονται αποµονωµένοι και ανενεργοί µέσα

στην εξωκυττάρια ουσία. Eπιπλέον, µπορούν να εκτεθούν κρυφές θέσεις συγκόλλησης

για τα προς µετανάστευση κύτταρα που πριν καλυπτόταν από µη διασπασµένα

συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας. Πάνω από 20 µεταλλοπρωτεινάσες (MMPs)

έχουν περιγραφεί, οι οποίες παίζουν κεντρικό ρόλο στην αγγειογένεση (Nelson et al.,

2000), ενώ φυσικοί αναστολείς τους περιλαµβάνουν τους ιστικά εντοπιζόµενους

αναστολείς των µεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) (Brew et al., 2000). Μια λεπτή

ισορροπία ανάµεσα στις µεταλλοπρωτεινασες και τους αναστολείς τους είναι

σηµαντική. Έτσι εκτεταµένη πρωτεόλυση της πλασµίνης µπορεί να αναστείλει την

καρκινική και φλεγµονώδη αγγειογένεση (Bajou et al., 1998).

Kαθώς οι φυσικοί φραγµοί µειώνονται, τα ενδοθηλιακά µεταναστεύουν στον

εξωκυττάριο χώρο, όπου αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Σε αυτό το στάδιο η

συνδυαστική δράση παραγόντων όπως ο VEGF, ο FGF-2 ,οι αγγειοποιητίνες και οι

υποδοχείς τους είναι καθοριστική, παρ'όλο που και άλλα µόρια µπορεί να ενέχονται σε

αυτή τη διαδικασία (βλέπε και κεφάλαιο 1.1.4.1).

O VEGF-Α, ο PIGF, ο VEGF-B, ο VEGF-C, ο VEGF-D και οι υποδοχείς τους

έχουν ειδικές δράσεις που περιλαµβάνουν επαγωγή του πολ/µού, της µετανάστευσης

των ενδοθηλιακών κυττάρων και της διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας (βλέπε

κεφάλαιο 1.2.3).

1.1.4.3. Μορφοποίηση, Οργάνωση και Σταθεροποίηση των αγγείων

Προκειµένου να µορφοποιηθεί η αγγειακή εκβλάστηση σε αγγείο θα πρέπει να

αυλοποιηθεί και στη συνέχεια να σταθεροποιηθεί, να οργανωθεί και να ωριµάσει, ώστε

να ανταποκριθεί στις τοπικές ανάγκες.

Το ανώριµο αγγείο έχει αρχικά τη µορφή συµπαγών κορµών που ακολούθως

αυλοποιούνται. Όταν αυτή η διαδικασία δεν πραγµατοποιείται σωστά, τα αγγεία είναι

δοµικά και λειτουργικά ανώµαλα. Έτσι τα αγγεία των όγκων είναι ανώµαλα

διασταλµένα έχουν πολλές διακλαδώσεις και βραχυκυκλώσεις. Αυτό µπορεί να

οφείλεται σε µια ανισορροπία µεταξύ αγγειογενετικών παραγόντων όπως ο VEGF και

µορίων όπως οι αγγειοποιητίνες. Ως αποτέλεσµα η αιµατική κυκλοφορία σε αυτά τα

αγγεία είναι χαοτική (Baish and Jain, 2000).

Η διάµετρος του αυλού ρυθµίζεται αυστηρά από διάφορους παράγοντες. Ενώ

λοιπόν ο VEGF121, ο VEGF165 και οι υποδοχείς τους αυξάνουν το σχηµατισµό

11

αυλού, ο VEGF189 µειώνει τη διάµετρο του. Η Ang1 σε συνδυασµό µε το VEGF

αυξάνει τη διάµετρο του αυλού (Suri et al., 1998), ενώ στο σχηµατισµό του ενέχονται

και διάφορες ιντεγκρίνες (α5β1 και ανβ3) (Bayless et al., 2000). Η εκτεταµένη επίσης

πρωτεόλυση µπορεί να δηµιουργήσει αγγειακές κύστες και να εµποδίσει τη δηµιουργία

αυλού. Τέλος, υπάρχουν και αρκετοί αναστολείς σχηµατισµού του όπως η

θροµβοσποντίνη και ένα πρόσφατα αναγνωρισµένο γονίδιο tubedown(tbdn-1), το οποίο

έχει οµολογία µε τις ακετυλοτρανσφεράσες (Gendron et al., 2000).

Ουσιαστικό ρόλο προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η λειτουργική ωρίµανση

του αγγείου διαδραµατίζει η προσέλκυση και διαφοροποίηση των περιενδοθηλιακών

κυττάρων στο τοίχωµα του (η οποία πραγµατοποιείται µε µηχανισµούς ανάλογους µε

αυτούς που αναφέρονται στο κεφάλαιο 1.1.3).

Με το σχηµατισµό των νέων αγγείων, τα ενδοθηλιακά κύτταρα γίνονται

αξιοσηµείωτα ανθεκτικά σε εξωγενείς παράγοντες µε επιβίωση που αντιστοιχεί σε

χρόνια. Μειωµένη επιβίωση του ενδοθηλίου ή απόπτωση του προκαλεί υποστροφή των

αγγείων στο έµβρυο (Carmeliet et al., 1999a), η οποία είναι φυσιολογική στον

αµφιβληστροειδή µετά τη γέννηση και στην ωοθήκη κατά το γενετήσιο κύκλο. Ο

αριθµός των παραγόντων που αναγνωρίστηκαν ότι ρυθµίζουν την ενδοθηλιακή

απόπτωση είναι εκτενής και ποικίλουν ανάλογα µε το στάδιο ανάπτυξης, τη θέση, τη

λειτουργία, τον τύπο του αγγείου καθώς και τα γύρω φυσιολογικά ή παθολογικά

ερεθίσµατα (Kockx and Knaapen, 2000; Stefanec, 2000).

Η οργάνωση του αγγειακού δικτύου σε τρεις διαστάσεις έχει απασχολήσει τους

επιστήµονες από πολύ παλιά. Αρκετοί αγγειογενετκοί παράγοντες έχουν αναγνωριστεί

ότι επηρεάζουν τη διαδικασία της διακλάδωσης, αλλά οι γνώσεις σχετικά µε τους

µηχανισµούς µε τους οποίους πραγµατοποιείται, είναι ελλιπείς (Carmeliet, 2000c).

Ο VEGF φαίνεται να συµµετέχει στην πολυπλοκότητα του αγγειακού δικτύου

µε το να ενεργοποιεί τη δηµιουργία αγγειακών εκβλαστήσεων(Pettersson et al., 2000).

Έµβρυα που είναι ετερόζυγα στο VEGF έχουν λιγότερες εκβλαστήσεις (Carmeliet et

al., 1996) (Ferrara, 1999). Επιπλέον, ποντίκια, τα οποία εκφράζουν µόνο το VEGF120,

έχουν ελαττωµένη διακλάδωση των µυοκαρδιακών αγγείων (Carmeliet et al., 1999b).

H έκφραση του PDGF-BB, ο οποίος είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη διακλάδωση των

αεραγωγών, είναι µειωµένος σε αυτά τα ζώα. Είναι όµως πιθανό ο VEGF να λειτουργεί

ο ίδιος ως παράγοντας διακλάδωσης µε το να επιδρά απευθείας στα ενδοθηλιακά ή και

στα λεία µυϊκά κύτταρα.

12

Η Ang1 και ο υποδοχέας Tie2 επάγει τη δηµιουργία αγγειογενετικών

εκβλαστήσεων (Gale and Yancopoulos, 1999). Απενεργοποίηση του γονιδίου της Ang1

και του Tie2 είχε ως αποτέλεσµα διασταλµένα αγγεία τριχοειδικής µορφής µε

οµοιόµορφο µέγεθος, τα οποία αποτυγχάνουν να οργανώσουν ώριµο και πολύπλοκο

δίκτυο από µεγάλα αγγεία που διακλαδίζονται σε µικρότερους κλάδους.

Η ρενίνη είναι ένας παράγοντας διακλάδωσης για τις νεφρικές αρτηρίες

(Gomez, 1998), ενώ ο FGF-1 είναι ένας παράγοντας διακλάδωσης για τις

µυοκαρδιακές αρτηρίες (Fernandez et al., 2000), γεγονός που έρχεται σε συµφωνία µε

το ρόλο των FGF-σχετιζόµενων σηµάτων στη διακλάδωση των αεραγωγών. Επίσης, η

µεταγωγή του σήµατος από µόρια όπως τα Notch, Delta και Jagged, τα οποία φαίνεται

να συµµετέχουν στη διακλάδωση των αεραγωγών, τώρα αρχίζουν να σχετίζονται µε

την αγγειογένεση (Krebs et al., 2000; Xue et al., 1999).

Αρκετοί άλλοι παράγοντες φαίνεται επίσης να ενέχονται µε διαφορετικούς

ρόλους στη διαµόρφωση των αγγείων και περιλαµβάνουν τους VEGFR3, Tie1, tal-1,

Ets family, GTP-binding factors, VCAM-1, α4 ιντεγκρίνη και φιµπρονεκτίνη

(Carmeliet, 2000c).

Η ικανοποίηση τέλος των τοπικών φυσιολογικών αναγκών είναι ουσιαστική

παράµετρος στην ανάπτυξη των νέων αγγείων. Γι αυτό το λόγο τα ενδοθηλιακά

κύτταρα πρέπει να έχουν ειδικά χαρακτηριστικά, ώστε να ανταποκρίνονται στις

εκάστοτε απαιτήσεις. Για παράδειγµα η ανάπτυξη του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού

απαιτεί συνδέσεις µεταξύ αστρογλιακών κυττάρων τα οποία εκφράζουν gFAP,

περικυττάρων και επαρκή επίπεδα αγγειοτενσινογόνου (Lindahl et al., 1998).

Οι σφικτές συνδέσεις µεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαµβάνουν

αρκετές µεµβρανικές και κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες από τις οικογένειες των

καντχερινών, οκλουντίνων, κλαουντίνων (Rubin and Staddon, 1999; Tsukita and

Furuse, 1999). Η κυτταρική µεµβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων µε το που έρχονται

σε επαφή µεταξύ τους, υφίσταται δοµικές και λειτουργικές τροποποιήσεις, οι οποίες

είναι κρίσιµες για τη ρύθµιση της αγγειακής διαπερατότητας. Άλλες πρωτεΐνες όπως οι

7H6, cingulin και jam παίζουν ρόλο στη διαµετανάστευση (transmigration) των

µονοκυττάρων και τη ρύθµιση της διαπερατότητας (Bazzoni et al., 1999; Tsukita and

Furuse, 1999).

Σε αντίθεση τα ενδοθηλιακά κύτταρα των ενδοκρινών αδένων δεν έχουν

σφικτές συνδέσεις. Σε αυτές τις περιπτώσεις, το ενδοθήλιο είναι ως επί το πλείστον

ασυνεχές επιτρέποντας τη µεταφορά µεγάλων όγκων µορίων και ιόντων. Συνολικά, οι

13

παράγοντες που καθορίζουν τις ιδιότητες του ενδοθηλίου είναι άγνωστοι. Τα τελευταία

χρόνια όµως έχει δοθεί έµφαση στην παρακρινική σχέση µεταξύ των κυττάρων των

αγγείων και των ειδικών για κάθε ιστό κυττάρων στην ανάπτυξη των ιδιοτήτων που

πρέπει να διαθέτει το αγγείο προκειµένου να ανταποκριθεί στις τοπικές ανάγκες (Risau,

1995; Risau, 1998). Επίσης ο VEGF φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο.

1.2. Ο Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας (Vascular

Endothelial Growth Factor, VEGF)

1.2.1. Οι µορφές του VEGF

Ένας από τους περισσότερο σηµαντικούς ρυθµιστικούς παράγοντες της

αγγειογένεσης είναι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (Vascular

Endothelial Growth Factor, VEGF) (Ferrara, 2001). H υπερέκφραση του VEGF παίζει

σηµαντικό ρόλο στην δηµιουργία παθολογικής αγγειογένεσης ανατρέποντας την

ισορροπία διεγερτών και αναστολέων της. Eιδικότερα στους καρκίνους, ο VEGF

υπερεκφράζεται σαν αποτέλεσµα της υποξίας (Shweiki et al., 1992; Shweiki et al.,

1995) ή µεταλλάξεων ογκογονιδίων (Kerbel and Folkman, 2002). Προεξάρχων είναι

επίσης ο ρόλος του στις αγγειογενετικές παθήσεις του οφθαλµού (βλέπε κεφάλαιο 1.3).

H πολυπλοκότητα της µεταγωγής του σήµατος από το VEGF συνίσταται στην

πολυκλοκότητα των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των διαφόρων µορφών του VEGF και

των υποδοχέων του (Εικ3), όπως και των περαιτέρω διαµεσολαβητών που

µεταβιβάζουν το σήµα.

Η οικογένεια του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα περιλαµβάνει

τον αυξητικό παράγοντα του πλακούντα (PIGF), τον VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,

VEGF-D και το ιικό οµόλογο του VEGF, VEGF-E (Eriksson and Alitalo, 1999;

Ferrara, 1999; Olofsson et al., 1998; Persico et al., 1999). O VEGF-A ο οποίος έχει

µελετηθεί πιο εκτεταµένα είναι µια διµερής 36-46kd γλυκοζιλιωµένη πρωτεΐνη µε µια

αµινοτελική αλληλουχία σήµατος και µια περιοχή σύνδεσης µε την ηπαρίνη. Στους

ανθρώπους έχουν αναγνωριστεί τέσσερις διαφορετικές ισοµορφές του VEGF-A µε

διαφορετικό αριθµό αµινοξέων: VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189,

VEGF206. Οι µορφές αυτές έχουν προκύψει από εναλλακτικό µάτισµα του mRNA

(Charnock-Jones et al., 1993; Plate and Warnke, 1997). Οι ιδιότητες του native VEGF

14

αντιστοιχούν στενά µε εκείνες του VEGF165. Όλες οι µορφές εκτός από το VEGF121

συνδέονται µε την ηπαρίνη. Οι µακρύτερες συνδέονται µε την εξωκυττάρια ουσία, ενώ

οι µικρότερες διαχέονται ελεύθερα. Ο VEGF165 έχει ενδιάµεσες ιδιότητες, δηλαδή

εκκρίνεται, αλλά ένα σηµαντικό ποσοστό παραµένει συνδεδεµένο µε την κυτταρική

επιφάνεια και την εξωκυττάρια ουσία. Το τελευταίο µπορεί να ελευθερωθεί σε µια

µορφή ενός βιοενεργού µορίου που µπορεί να διαχέεται µέσω διάσπασης του στο

καρβοξυτελικό άκρο από την πλασµίνη.

Ο κεντρικός ρόλος του VEGF στην εµβρυϊκή ανάπτυξη των αγγείων φαίνεται

από το ότι αδρανοποίηση ενός αλληλίου του γονιδίου του VEGF-A στα ποντίκια

προκαλεί θανατηφόρα διακοπή της αγγειακής ανάπτυξης και τα ποντίκια δεν

επιβιώνουν πέραν της εµβρυϊκής ηµέρας 11. ∆ιαγονιδιακά οµόζυγα ποντίκια που

εκφράζουν µόνο VEGF120 και στερούνται των µακρύτερων ισοµορφών, οι οποίες

συνδέονται µε την ηπαρίνη VEGF164 και 189, πεθαίνουν λίγο µετά τη γέννηση λόγω

αιµορραγίας και ισχαιµικής µυοκαρδιοπάθειας (Carmeliet et al., 1999b).

Η έκφραση του VEGF ρυθµίζεται από την υποξία (Carmeliet et al., 1998; Jiang

et al., 1996; Marti and Risau, 1998; Tuder et al., 1995) και από άλλα ερεθίσµατα που

περιλαµβάνουν τον FGF-2, τον TGF-β και την IL-1β (Brogi et al., 1994; Li et al., 1997;

Li et al., 1995; Ramos et al., 1998; Stavri et al., 1995a; Stavri et al., 1995b) στους

διαφόρους τύπους κυττάρων.

Ο VEGF-A εµπλέκεται στην αυξηµένη αγγειακή διαπερατότητα και την

αγγειογένεση. Οι VEGF-C και D παράγονται σαν µεγάλες πρόδροµες µορφές, οι οποίες

στη συνέχεια υφίστανται τροποποιήσεις σε ώριµες µορφές µε διάφορες ειδικότητες στη

σύνδεση τους µε τους υποδοχείς (Joukov et al., 1997). O VEGF-C φαίνεται να

λειτουργεί ως αυξητικός παράγοντας στα λεµφαγγεία (Jeltsch et al., 1997; Kukk et al.,

1996). ∆ιαγονιδιακά ποντίκια, τα οποία υπερεκφράζαν VEGF-C στα κερατινοκύτταρα

της επιδερµίδας παρουσίαζαν διογκωµένα λεµφαγγεία στο δέρµα του ποντικιού, ενώ

υπερέκφραση VEGF164 στην ίδια περιοχή έδειξε µόνο υπερπλασία των αιµοφόρων

αγγείων (Jeltsch et al., 1997). Ποντίκια στα οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου του

VEGF-B ήταν υγιή και γόνιµα, αλλά είχαν µικρότερες καρδιές και παρουσίαζαν

αγγειακή δυσλειτουργία µετά από πειραµατική στεφανιαία απόφραξη καθώς και

προβληµατική ανάρρωση µετά από πειραµατική καρδιακή ισχαιµία (Bellomo et al.,

2000; Olofsson et al., 1999). Ο VEGF-B έχει επίσης δειχθεί να επάγει την έκφραση και

την ενεργότητα του u-PA (Olofsson et al., 1998). Τέλος, ο PIGF µαζί µε το VEGF

15

προκαλεί αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων, πολλαπλασιασµό, χηµειοταξεία και

αγγειογένεση (Cao et al., 1996; Torry et al., 1999).

1.2.2. Οι υποδοχείς του VEGF

Αρχικά είχαν αναγνωριστεί θέσεις σύνδεσης του VEGF µόνο στα ενδοθηλιακά

κύτταρα των αγγείων in vivo και in vitro. Τελικά όµως διαπιστώθηκε η ύπαρξη των

υποδοχέων και σε κύτταρα προερχόµενα από το µυελό των οστών.

Tρία µέλη της οικογένειας των υποδοχέων έχουν αναγνωριστεί (Εικ3). ∆ύο

υψηλής συγγένειας υποδοχείς µε δράση τυροσινικών κινασών έχουν αναγνωριστεί για

το VEGF-A :ο VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase-1 or Flt-1) και ο VEGFR-2 (Kinase

insert domain-containing receptor or KDR). O τρίτος υψηλής συγγένειας υποδοχέας

VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase-4 or Flt-4) είναι υποδοχέας για τους VEGF-C και

VEGF-D (Joukov et al., 1996). Ο VEGF-C και VEGF-D συνδέονται και µε το VEGFR-

2 αλλά µε λιγότερη συγγένεια σε σχέση µε το VEGFR-3 (Achen et al., 1998; Joukov et

al., 1996). Ο VEGF-B και ο PIGF συνδέονται µε υψηλή συγγένεια µόνο µε το VEGFR-

1 (Olofsson et al., 1998) (Clauss et al., 1996), ενώ ο VEGF-E συνδέεται ειδικά µε το

VEGFR-2 (Eriksson and Alitalo, 1999; Meyer et al., 1999; Veikkola and Alitalo, 1999).

Οι τρεις υποδοχείς του VEGF µε τη δράση

τυροσινικών κινασών σχετίζονται δοµικά µε την οικογένεια του PDGFR και περιέχουν

εφτά εξωκυττάριες περιοχές µε µορφή ανοσοσφαιρίνης (Ig), µια µονή υδροφοβική

διαµεµβρανική περιοχή και µια συντηρηµένη ενδοκυττάρια περιοχή τυροσινικής

κινάσης (Millauer et al., 1993; Neufeld et al., 1999; Terman et al., 1992; Veikkola et

al., 2000). To γονίδιο του VEGFR-1 κωδικοποιεί δύο πολυπεπτίδια: µια πλήρους

µεγέθους µεµβρανική πρωτεΐνη (υποδοχέας VEGFR-1) και µία µικρού µεγέθους

«διαλυτή» VEGF-συνδεόµενη πρωτεΐνη («διαλυτή» µορφή του VEGFR-1) (Shibuya,

2001).

16

Εικόνα 3

Οι υποδοχείς του VEGF (Veikkola et al., 2000)

Επιπλέον η neuropilin-1 (NP-1) αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως συν-υποδοχέας

για τον VEGF165 και ενισχύει τη σύνδεση του VEGF-A στον VEGFR-2 (Fuh et al.,

1998). Η NP-1 είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη χωρίς δράση τυροσινικής κινάσης.

Μελέτες µε στόχο τα γονίδια των υποδοχέων τουVEGF έχουν δείξει ότι και οι

τρεις είναι ουσιαστικοί για τη φυσιολογική ανάπτυξη του εµβρυϊκού αγγειακού

συστήµατος. Ποντίκια στα οποία έγινε απαλοιφή του VEGFR-1 πεθαίνουν ενδοµήτρια

ανάµεσα στην 8.5 και 9.5 εµβρυϊκή ηµέρα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα αναπτύσσονται

στα εµβρυϊκά σηµεία, αλλά αποτυγχάνουν να οργανωθούν σε φυσιολογικές αγγειακές

δοµές οδηγούµενα σε υπερανάπτυξη ανώµαλων ενδοθηλιακών κυττάρων (Fong et al.,

1995). Το ενδιαφέρον είναι ότι ποντίκια που δεν έχουν το γονίδιο του PDGF-B,

σχηµατίζουν τριχοειδή, τα οποία δεν έχουν περικύτταρα και παρουσιάζουν υπερπλασία

των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτό κάνει πιθανή την υπόθεση ότι η ανώµαλη

ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων στην περίπτωση έλλειψης του VEGFR-1

οφείλεται στην απώλεια ή δυσλειτουργία των περικυττάρων και ενισχύει την άποψη ότι

ο VEGFR-1 µπορεί να είναι ένας υποδοχέας των περικυττάρων.

Ποντίκια στα οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου του VEGFR2 επίσης

πεθαίνουν ενδοµήτρια ανάµεσα στην εµβρυϊκή ηµέρα 8.5 και 9.5. Αυτά τα ποντίκια

17

στερούνται αγγειακής διαφοροποίησης και αποτυγχάνουν να σχηµατίσουν αιµατικές

νησίδες. Τα πρόδροµα αιµατοποιητικά κύτταρα έχουν σοβαρά βλαφτεί και δεν

µπορούν να αναπτυχθούν οργανωµένα αγγεία στο έµβρυο και το λεκιθικό ασκό

(Shalaby et al., 1995).

Ποντίκια στα οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου του VEGFR3 πεθαίνουν

ενδοµήτρια κατά την 9.5 εµβρυϊκή µέρα. Η αγγειακή διαφοροποίηση και η

αγγειογένεση πραγµατοποιείται σε αυτά τα ποντίκια, αλλά υπάρχει µια ανώµαλη

οργάνωση µεγάλων αγγείων µε ελαττωµατικούς αυλούς που οδηγούν σε διαρροή

υγρού στην περικαρδική κοιλότητα και καρδιαγγειακή ανεπάρκεια.

Υπερέκφραση της NP-1 στα ποντίκια προκαλεί ποικίλες ανωµαλίες στο

εµβρυϊκό καρδιοαγγειακό σύστηµα συµπεριλαµβανοµένης περίσσειας τριχοειδών και

αιµοφόρων αγγείων, διασταλµένα αιµοφόρα αγγεία και δυσπλασία της καρδιάς.

Ποντίκια στα οποία τέλος έγινε απαλοιφή του γονιδίου της NP-1 εµφάνισαν

προβληµατική αγγείωση του νευρικού συστήµατος, ελαττωµατική ανάπτυξη της

αορτής, µεγάλα αιµοφόρα αγγεία και εκτεταµένη αγγείωση του λεκιθικού ασκού.

Ο VEGFR-1 επάγεται από την υποξία µέσω ενός µηχανισµού εξαρτώµενου από

τον HIF. Προσδέµατα για τον VEGFR-1 αποτελούν ο PLGF, ο VEGF-A, ο VEGF-B

και ο υποδοχέας µετά την πρόσδεση υφίσταται ασθενή τυροσινική φωσφορυλίωση.

Παραµένει αινιγµατικό κατά πόσο ο VEGFR-1 είναι ικανός να µεταβιβάσει σηµαντικά

µοριακά σήµατα στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι µελέτες που έχουν γίνει στη µεταγωγή

του σήµατος από το VEGFR-1 έχουν αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Ενώ µε

βιοχηµικές µεθόδους έχει βρεθεί αλληλεπίδραση του VEGFR-1 µε γνωστά

ενδοκυτταρικά µόρια-διαµεσολαβητές, δεν έχει συσχετιστεί αυτή η αλληλεπίδραση µε

τη βιολογική δράση του VEGFR-1(Cunningham et al., 1995).

Ο PIGF, ο οποίος συνδέεται µόνο µε το VEGFR-1, δεν µπόρεσε να επάγει

µετανάστευση ή πολ/µό στα HUVE κύτταρα και ο VEGF δεν είχε κάποια βιολογική

δράση σε PAE κύτταρα (Porcine aortic endothelial cells) που υπερεκφράζαν VEGFR-1.

Ο VEGFR-1 ενέχεται στην επαγόµενη από το VEGF έκφραση των

µεταλλοπρωτεινασών στα λεία µυϊκά κύτταρα (Wang and Keiser, 1998) και τα

ενδοθηλιακά κύτταρα του πνεύµονα. Οι καλύτερα χαρακτηρισµένες ανταποκρίσεις που

ρυθµίζονται από το VEGFR-1 είναι η ενεργοποίηση της µετανάστευσης και αύξηση

της έκφρασης του ιστικού παράγοντα στα µονοκύτταρα, παρ’όλο που ο βιολογικός

ρόλος αυτών των γεγονότων in vivo δεν είναι ακόµα αναγνωρισµένος (Barleon et al.,

1996; Clauss et al., 1996). Αξιοσηµείωτα ποντίκια που εκφράζουν µόνο την

18

εξωκυττάρια περιοχή του VEGFR-1 χωρίς την κυτταροπλασµατική που διαθέτει και

την ενζυµατική δραστικότητα, είναι γόνιµα και αναπτύσσονται φυσιολογικά (Hiratsuka

et al., 1998). Η καταστολή της επαγόµενης από το VEGF µετανάστευσης των

µακροφάγων in vitro ήταν ο µόνος φαινότυπος που παρατηρήθηκε σε αυτά τα ποντίκια.

Τέλος, υπάρχουν αρκετές ενδείξεις τελευταία ότι ο VEGFR-1 µπορεί να λειτουργεί ως

αρνητικός ρυθµιστής του VEGFR-2 (Kendall and Thomas, 1993; Roeckl et al., 1998).

Ο VEGFR-2 ενεργοποιείται, όταν συνδέεται µε το πρόσδεµα και επάγεται έτσι

ο διµερισµός του και η transφωσφορυλίωση (αυτοφωσφορυλίωση) των τυροσινών που

βρίσκονται στην κυτταροπλασµατική περιοχή. Όπως και άλλοι υποδοχείς που

διαθέτουν και ενζυµατική δράση, ο VEGFR-2 έχει περιγραφεί, ότι συνδέεται µέσω των

φωσφορυλιωµένων τυροσινών µε µια σειρά πρωτεϊνών που διαθέτουν περιοχή src

homology domains(SH)2 όπως οι Grb2, Nck, Shc, οι τυροσινικές φωσφατάσες που

περιέχουν SH2 domain SHP-1/-2 (Guo et al., 1995) (Kroll and Waltenberger, 1997) και

η PLCγ.

Συνολικά σχεδόν όλες οι δράσεις του VEGF που έχουν περιγραφεί ως τώρα στο

ενδοθηλιακό κύτταρο, φαίνεται να πραγµατοποιούνται µέσω του VEGFR-2. Έτσι, στα

PAE κύτταρα, τα οποία υπερεκφράζουν VEGFR-2 και όχι VEGFR-1, ο VEGF

ενεργοποιεί την παραγωγή ΝΟ (Kroll and Waltenberger, 1999), αυξάνει την έκφραση

της ενδοθηλιακής συνθάσης του µονοξειδίου του αζώτου (eNOS) (Shen et al., 1999),

κινητοποιεί το Ca++ (Cunningham et al., 1995), και επάγει τον πολ/µό και την

µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Waltenberger et al., 1994). Ο VEGF

επίσης ενεργοποιεί την PLCγ και τις ERK1/2 στα NIH3T3 κύτταρα, τα οποία

εκφράζουν VEGFR-2 (Takahashi and Shibuya, 1997). Τέλος, ο VEGFR-2 ενέχεται

στην ενεργοποίηση της αντιαποπτωτικής οδού PI3K/Akt (Gerber et al., 1998b) όπως

και της τυροσινικής κινάσης c-Src (He et al., 1999). Μεταλλαγµένες µορφές του

VEGF, οι οποίες δένονται µόνο µε τον VEGFR-2 είναι πλήρως ενεργά µιτογόνα και

µπορούν να αυξήσουν τη διαπερατότητα στα αγγεία, ενώ µορφές που δένονται µόνο µε

το VEGFR-1στερούνται και των δύο δραστικοτήτων.

1.2.3. Mεταγωγή του σήµατος από το VEGF

Ο VEGF όπως αναφέρεται και παραπάνω συµµετέχει σε όλα τα στάδια της

αγγειογένεσης. Οι κυριότερες βιολογικές δράσεις του VEGF αφορούν την επαγωγή του

19

πολλαπλασιασµού, της µετανάστευσης και της επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων

καθώς και την αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων. Η µεταγωγή του σήµατός του

σε αυτές περιγράφεται στα ακόλουθα κεφάλαια (Εικ4).

1.2.3.1. Eπιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων

Ένας θεµελιώδης µηχανισµός µε τον οποίο ο VEGF προάγει το σχηµατισµό

νέων αγγείων και διατηρεί την πυκνότητά τους είναι η επαγωγή της επιβίωσης των

ενδοθηλιακών κυττάρων και η ενεργοποίηση του αντιαποπτωτικού µηχανισµού.

Aρχικά είχε δειχθεί ότι ο VEGF είναι παράγοντας επιβίωσης για τα αγγειακά

ενδοθηλιακά κύτταρα του αµφιβληστροειδούς (Alon et al., 1995). O VEGF αναστέλλει

άµεσα την απόπτωση στα HUVE κύτταρα εν µέρει µέσω της εξαρτώµενης από την

PI3K ενεργοποίησης της αντιαποπτωτικής κινάσης Akt/PKB (Gerber et al., 1998b;

Thakker et al., 1999). Η Akt µε τη σειρά της καταστέλλει αποπτωτικούς µηχανισµούς

όπως τη BAD την κασπάση 9 και το p38 και επάγει µηχανισµούς επιβίωσης µέσω

ενεργοποίησης του NFkappaB και της µεταγραφής γονιδίων επιβίωσης (Datta et al.,

1999). Επίσης έχει δειχθεί ότι µπορεί να επιδράσει απευθείας στο µιτοχόνδριο (Datta et

al., 1999). Mακροπρόθεσµα η επίδραση του VEGF στην επιβίωση των ενδοθηλιακών

κυττάρων φαίνεται να εξασφαλίζεται από την αύξηση της έκφρασης µορίων που

συνιστούν τον αντιαποπτωτικό µηχανισµό του κυττάρου όπως τα Bcl-2 και A1 (Gerber

et al., 1998a), τα οποία αναστέλλουν την ενεργοποίηση των κασπασών και αυξάνουν

µε τη σειρά τους την έκφραση δύο µελών της οικογένειας IAP (inhibitors of apoptosis)

τη survivin και του XIAP (Tran et al., 1999).

H τυροσινική κινάση FAK παίζει ρόλο στη µεταγωγή του σήµατος από τις

ιντεγκρίνες (Zachary and Rozengurt, 1992) και ενέχεται έντονα στη διατήρηση

µηνυµάτων επιβίωσης σε αρκετούς τύπους κυττάρων συµπεριλαµβανοµένων και των

ενδοθηλιακών (Ilic et al., 1998; Levkau et al., 1998). Έχει δειχθεί ότι ο VEGF αυξάνεί

την τυροσινική φωφορυλίωση και την αλληλεπίδραση της FAK µε την παξιλλίνη

(paxillin) στις εστιακές προσκολλήσεις (focal adhesions) στα HUVE κύτταρα (Abedi

and Zachary, 1997; Rousseau et al., 2000; Wu et al., 2000). Tέλος ο VEGF ενεργοποιεί

την τυροσινική φωσφορυλίωση της σχετιζόµενης µε την FAK τυροσινικής κινάσης

Pyk2 (Liu et al., 1997).

20

H ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα σηµαντικό σύστηµα επιβίωσης για τα νεαρά

αιµοφόρα αγγεία κατά τη διαδικασία της νεοαγγείωσης (Brooks et al., 1994).

Aλληλεπίδραση µεταξύ αυτού του συστήµατος και των υποδοχέων του VEGF φαίνεται

από το ότι ο VEGFR2 αλληλεπιδρά ειδικά µε την ανβ3 ιντεγκρίνη και η ενεργότητα

του VEGFR2 όπως και η πολλαπλασιαστική ικανότητα του VEGF αυξάνονται όταν τα

ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλώνται στο πρόσδεµα της ανβ3, τη βιτρονεκτίνη (Soldi

et al., 1999). Παρ'όλο που αυτή η αλληλεπίδραση VEGFR2-ανβ3 αποτελεί έναν

ενδιαφέρον µηχανισµό µε τον οποίο ο VEGF θα µπορούσε να προάγει της

αγγειογενετικές του ιδιότητες, διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία στερούνται της β3

υποµονάδας δεν παρουσίασαν προβλήµατα στην νεοαγγείωση του αµφιβληστροειδούς

(παρά της έντονης συσχέτισης της ιντεγκρίνης ανβ3 µε αυτή τη διαδικασία (Xia, 1996

#324)). Tέλος και άλλες ιντεγκρίνες όπως οι α1β1 και α2β1 έχουν συσχετιστεί µε την

επαγόµενη από το VEGF νεοαγγείωση (Senger et al., 1997).

Άλλοι παράγοντες που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στην επιβίωση του

ενδοθηλίου, περιλαµβάνουν τις αγγειοποιητίνες µέσω των υποδοχέων τους Tie1 και

Tie2. Η Ang1 προάγει, ενώ η Ang2 καταστέλλει την επιβίωση (Gale and Yancopoulos,

1999; Holash et al., 1999; Suri et al., 1998). Η Ang1 έχει δειχθεί ότι προκαλεί επιβίωση

των ενδοθηλιακών κυττάρων µέσω της σύνδεσής της µε τον Tie2 και ενεργοποίησης

της Akt που επάγει το αντι αποπτωτικό γονίδιο syrvivin (Papapetropoulos et al., 2000).

Η διατήρηση της αγγειακής πυκνότητας στα διάφορα αγγειακά δίκτυα απαιτεί

επίσης και αιµοδυναµικούς παράγοντες, οι οποίοι όχι µόνο παρέχουν θρεπτικές ουσίες,

αλλά και µειώνουν τον ρυθµό ανανέωσης του ενδοθηλίου και αναστέλλουν την

απόπτωση από τον TNFα (Dimmeler et al., 1996).

1.2.3.2. Πολλαπλασιασµός των ενδοθηλιακών κυττάρων

O VEGF ενεργοποιεί την µέσω του VEGFR2 τη DNA σύνθεση και το

πολλαπλασιασµό σε µια πλειάδα τύπων ενδοθηλιακών κυττάρων. O VEGF ενεργοποιεί

ισχυρά τις κινάσες ERK1/2, οι οποίες είναι γνωστό ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στον

πολλαπλασιασµό των κυττάρων (Abedi and Zachary, 1997; Wheeler-Jones et al.,

1997). Eπίσης ο επαγόµενος από το VEGF πολλαπλασιασµός, η σύνθεση της κυκλίνης

D1 και η ενεργοποίηση της CDK-4 έχει περιγραφεί ότι αναστέλλονται από µια

ανενεργή µεταλλαγµένη µορφή της JNK1 και έναν ειδικό αναστολέα των ERK1/2

(Pedram et al., 1998). Eπιπλέον µια ανενεργή µεταλλαγµένη µορφή της ERK-2

21

διέκοπτε την ενεργοποίηση της JNK από το VEGF αποδεικνύοντας έτσι ότι η

πολλαπλασιαστική απόκριση στο VEGF µπορεί να ενέχει µια αλληλεπίδραση µεταξύ

των οδών των ERK1/2 και JNK (Pedram et al., 1998). O VEGF επίσης προκαλεί την

τυροσινική φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της PLCγ που οδηγεί στην παραγωγή

διαγλυκερόλης και P1,4,5p3 και την επακόλουθη ενεργοποίηση της PKC και την

απελευθέρωση Ca++. Mελέτες που χρησιµοποίησαν PKC αναστολείς έδειξαν ότι οι

PKC α και ζ ισοµορφές παίζουν έναν σηµαντικό ρόλο στον επαγόµενο από το VEGF

πολλαπλασιασµό (Higaki et al., 1999; Takahashi et al., 1999b; Wellner et al., 1999; Xia

et al., 1996). Το τελικό µάλιστα αποτέλεσµα προκύπτει από µια συνδυασµένη αύξηση

της ενεργότητας ορισµένων PKC ισοµορφών και τη µείωση της ενεργότητας της PKCδ

(Harrington et al., 1997).

Τελευταίες µελέτες έχουν δείξει πως και η PI3K παίζει σηµαντικό θετικό ρόλο

στον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό των κυττάρων µέσω ενεργοποίησης

µεσολαβητών όπως η p70 S6 κινάση (Yu and Sato, 1999). Η p70 S6 κινάση έχει

δειχθεί ότι προάγει την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο µέσω επαγωγής της κυκλίνης D1.

H κύρια οδός µέσω της οποίας πολλοί υποδοχείς µε δράση τυροσινικής κινάσης

ενεργοποιούν τις ERK1/2 αφορούν την τυροσινική φωσφορυλίωση του υποδοχέα και

την αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση δευτερευόντων διαµεσολαβητών όπως οι GRB-2

και SOS. Αυτές µε τη σειρά τους ενεργοποιούν το Raf-1 και τις ERK1/2 κυρίως µέσω

µιας οδού εξαρτώµενης από το Ras (Robinson and Cobb, 1997). Όσον αφορά το VEGF

η ενεργοποίηση της Raf-MEK-ERK οδού φαίνεται να πραγµατοποιείται µέσω ενός Ras

ανεξάρτητου αλλά PKC εξαρτώµενου µηχανισµού (Doanes et al., 1999; Takahashi et

al., 1999b).

1.2.3.3. Mετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων

H διάσπαση της βασικής µεµβράνης είναι ουσιαστική για την µετανάστευση

του ενδοθηλιακού κυττάρου και είναι ένα ουσιαστικό βήµα στην έναρξη της

νεοαγγείωσης. O VEGF επάγει την έκφραση µεταλλοπρωτεινασών (Lamoreaux et al.,

1998)και αυτά τα ένζυµα φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στην επαγόµενη από το

VEGF µετανάστευση in vivo. Ένας µεγάλος όγκος ευρηµάτων δείχνει πως η

σχετιζόµενη µε τη FAK µεταγωγή του σήµατος είναι κρίσιµη για τον ρυθµό

ανανέωσης των εστιακών προσκολλήσεων (Focal Adhesion), την οργάνωση των

ινιδίων της ακτίνης και τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. O VEGF

22

επάγει την τυροσινική φωσφορυλίωση της FAK και της παξιλλίνης και προάγει την

προσέλκυση της FAK στις νέες εστιακές προσκολλήσεις (Focal Adhesion) στα HUVE

κύτταρα (Abedi and Zachary, 1997). Έχει περιγραφεί πως η πρωτεΐνη θερµικού σοκ

Hsp90 διευκολύνει την φωσφορυλίωση της FAK και αναστολή της µε γελνταµυκίνη

ανέστειλε την επαγόµενη από το VEGF µετανάστευση(Rousseau et al., 2000). Eπίσης ο

VEGF ενεργοποιεί την κινάση p38 στα HUVE κύτταρα και ένας φαρµακευτικός

αναστολέας της αναστέλλει την αναδιοργάνωση της ακτίνης και την µετανάστευση των

κυττάρων (Rousseau et al., 2000; Rousseau et al., 1997).

Επιπλέον υπάρχουν πολλές ενδείξεις ότι η παραγωγή του NO, το οποίο

επάγεται από το VEGF, µπορεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην επαγόµενη από το

VEGF µετανάστευση και αγγειογένεση (Goligorsky et al., 1999; Noiri et al., 1997). Tο

NO έχει δειχθεί ότι ρυθµίζει την πυκνότητα των εστιακών προσκολλήσεων και την

τυροσινική φωσφορυλίωση της FAK στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποδεικνύοντας έτσι

µια αλληλεπίδραση ανάµεσα στις οδούς των NO και FAK στη µετανάστευση

(Goligorsky et al., 1999). Έχει δειχθεί ότι η εξαρτώµενη από την Akt φωσφορυλίωση

της eNOS στη σερίνη 1177 απαιτείται για την επαγόµενη από το VEGF µετανάστευση

(Dimmeler et al., 2000).

Τέλος η PLCγ φαίνεται να ενέχεται στη διατήρηση κυτταρικών αποκρίσεων

που συνδέονται µε την επαγόµενη από το VEGF µετανάστευση (Abedi and Zachary,

1995; Landgren et al., 1998).

1.2.3.4. Aύξηση της διαπερατότητας των αγγείων

O VEGF αρχικά είχε αναγνωριστεί ως παράγοντας που αυξάνει την αγγειακή

διαπερατότητα (Clauss et al., 1990; Connolly et al., 1989). Παρ'όλα αυτά ο µηχανισµός

µε τον οποίο αυτό πραγµατοποιείται δεν είναι γνωστός. O σχηµατισµός των (fenestrae)

ανοιγµάτων, ειδικών περιοχών της πλασµατικής µεµβράνης, τα οποία είναι πολύ

διαπερατά σε µικρά µόρια, µπορεί να είναι ένας ενδιαφέρον µηχανισµός µε τον οποίο ο

VEGF αυξάνει τη διαπερατότητα των αγγείων. Oι οδοί µεταγωγής του σήµατος που

ενέχονται στην επαγόµενη από το VEGF αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας δεν

έχουν διευκρινιστεί και πιθανώς απαιτείται αλλαγή στη σύσταση της εξωκυττάριας

ουσίας. O επαγόµενος από το VEGF σχηµατισµός των ανοιγµάτων σχετίζεται µε τα

caveolae, µικρές εγκολπώσεις της πλασµατικής µεµβράνης, οι οποίες συµµετέχουν στη

διαδικασία της ενδοκύττωσης και της εξωκύττωσης. O VEGF επάγει ακόµα την

23

εµφάνιση κυστικών κενοτοπίων, τα οποία ενώνονται µεταξύ τους και σχηµατίζουν

κανάλια που συνδέουν τον αυλό των αγγείων µε το διάµεσο χώρο και διευκολύνουν τη

δίοδο των µορίων. Έχει ήδη δειχθεί ο ρόλος του NO και της PGI2 στην επαγόµενη από

το VEGF αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Eπιπλέον αρκετές µελέτες έχουν

εµπλέξει την τυροσινική φωσφορυλίωση της PLCγ, την ενεργοποίηση της PKC και την

κινητοποίηση του ενδοκυττάριου Ca++ ως διαµεσολαβητές στην προκαλούµενη από το

VEGF αυξηµένη φλεβική διαπερατότητα.

Φωσφορυλίωση των ενδοκυττάριων συστατικών στις σφικτές συνδέσεις και

στις θέσεις προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων µπορεί να οδηγήσουν σε

διάσπαση των κυτταρο-κυτταρικών συνδέσεων που οδηγεί σε αυξηµένη

αγγειοδιαπερατότητα. Κατ’αυτό τον τρόπο ο VEGF αυξάνει την φωσφορυλίωση της

ενδοθηλιακής καντχερίνης (VE-cadherin) και της β-κατενίνης (β-catenin) που όµως δεν

σχετίζονται µε µορφολογικές αλλαγές των εστιακών προσκολλήσεων στα HUVE

κύτταρα. O VEGF ενεργοποιεί επίσης τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών των σφικτών

συνδέσεων όπως η οκλουντίνη (occludin) και zona occludin 1. Επιπλέον έχει δειχθεί

ότι ο VEGF ενεργοποιεί την Src κινάση, η οποία µε τη σειρά της επάγει τη

φωσφορυλίωση της FAK και έτσι διευκολύνει την αλληλεπίδραση της FAK µε την

ιντεγκρίνη ανβ5 και αυτή η αλληλεπίδραση θεωρείται απαραίτητη για την επαγόµενη

από το VEGF αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Tέλος, υπάρχουν κάποιες

ενδείξεις ότι ο VEGFR2 δεν ενέχεται σε αυτή τη διαδικασία.

24

Εικόνα 4

Η µεταγωγή του σήµατος από το VEGF Περιγράφονται τα σήµατα που είναι υπεύθυνα για τις επαγόµενες από το VEGF βιολογικές δράσεις που σχετίζονται µε την µετανάστευση, επιβίωση, πολλαπλασιασµό και την αγγειακή διαπερατότητα. 1.3. Η αγγειογένεση του οφθαλµού και ο ρόλος του VEGF

1.3.1. Η ανατοµία του αγγειακού δικτύου του αµφιβληστροειδούς και η

εµβρυϊκή του ανάπτυξη

Ο αµφιβληστροειδής έχει διπλή αγγειακή παροχή. Οι έσω στοιβάδες

αγγειώνονται από ένα λεπτό δίκτυο αγγείων του αµφιβληστροειδούς, ενώ οι έξω

στοιβάδες όπου βρίσκονται και οι φωτουποδοχείς, στερούνται αγγείων και εξαρτώνται

από το εκτεταµένο διαπερατό δίκτυο των τριχοειδών του χοριοειδούς (χοριοτριχοειδή).

Τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του αµφιβληστροειδούς συνδέονται µε σφικτές

συνδέσεις µεταξύ τους και σχηµατίζουν τον έσω αιµατο-αµφιβληστροειδικό φραγµό µε

αποτέλεσµα η µεταφορά ουσιών από το αίµα στη διάµεση ουσία να είναι αυστηρή και

να υπόκειται σε ειδικούς ρυθµιστικούς µηχανισµούς. Αντίθετα η κυκλοφορία του

χοριοειδούς δεν έχει τέτοιους φραγµούς. Η στοιβάδα του µελάγχρου επιθηλίου

αποτελεί τον έξω αιµατο-αµφιβληστροειδικό φραγµό (Εικ5).

25

Εικόνα 5

Ανατοµία του χοριοαµφιβληστροειδούς (Witmer et al., 2003)

Η ανάπτυξη του αγγειακού δικτύου στον αµφιβληστροειδή θεωρείται ότι

γίνεται µε έναν συνδυασµό αγγειακής διαφοροποίησης και αγγειογένεσης. Κατ’αυτό

τον τρόπο τα επιφανειακά αγγεία του αµφιβληστροειδούς σχηµατίζονται µε αγγειακή

διαφοροποίηση που αρχίζει από το οπτικό νεύρο και αναπτύσσονται από τον οπίσθιο

προς τον πρόσθιο πόλο. Αυτά τα πρωτογενή αγγεία κατευθύνονται από ένα πλέγµα

αστροκυττάρων και ένα µέτωπο από µη ταυτοποιηµένα ατρακτοειδή κύτταρα, τα οποία

θεωρείται ότι αντιπροσωπεύουν µεσεγχυµατικά ή αρχέγονα ενδοθηλιακά κύτταρα

(Hughes et al., 2000; Provis, 2001). Στη συνέχεια µε τη διαδικασία της αγγειογένεσης

αγγειακές προβολές από τα επιφανειακά αγγεία του αµφιβληστροειδούς διεισδύουν

στον αµφιβληστροειδή και σχηµατίζουν το ενδιάµεσο και εν τω βάθει τριχοειδικό

δίκτυο (Hughes et al., 2000; Senger et al., 1997). Πρόσφατες µελέτες υπογραµµίζουν

ότι τα περικύτταρα απαιτούνται στις αρχικές φάσεις της ανάπτυξης των αγγείων του

αµφιβληστροειδούς πιθανολογώντας έτσι ένα ρόλο των περικυττάρων στο σχηµατισµό

των αιµοφόρων αγγείων διαφορετικό από αυτόν της σταθεροποίησης τους, ο οποίος

έχει ήδη περιγραφεί. Η διαδικασία της ανάπτυξης των αγγείων του αµφιβληστροειδούς

ολοκληρώνεται λίγο πριν τη γέννηση στους ανθρώπους και µερικές εβδοµάδες µετά τη

γέννηση σε αρκετά θηλαστικά συµπεριλαµβανοµένων των τρωκτικών.

Στον ενήλικα τα ενδοθηλιακά κύτταρα των µικροαγγείων του

αµφιβληστροειδούς καλύπτονται από περικύτταρα στα τριχοειδή και λεία µυϊκά

κύτταρα στα µεγαλύτερα αγγεία. Tα ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα έχουν την

ικανότητα να αυτορυθµίζουν τη διαπερατότητα των αγγείων και έτσι να εξασφαλίζουν

την οµοιόσταση στα µικροαγγεία του αµφιβληστροειδούς (Hirschi and D'Amore,

1996).

1.3.2. Ο VEGF και οι υποδοχείς του στο φυσιολογικό οφθαλµό

Η συµµετοχή του VEGF-A και των υποδοχέων του VEGFR-1 και VEGFR-2

στην ανάπτυξη των αγγείων του αµφιβληστροειδούς έχει ήδη περιγραφεί (Provis et al.,

1997; Robinson et al., 2001). Τα αγγεία του χοριοειδούς αναπτύσσονται µετά από µία

26

αιχµή παραγωγής του VEGF-A από το µελάγχρουν επιθήλιο (RPE) υπονοώντας ότι ο

VEGF-A ενέχεται και στην ανάπτυξη των αγγείων του χοριοειδούς (Yi et al., 1998).

Οι VEGFR-1 και VEGFR-2 εκφράζονται και εκτός των αγγείων στον

αναπτυσσόµενο αµφιβληστροειδή. Επιπλέον η χορήγηση ενός ανταγωνιστή του VEGF

υποδοχέα πριν την έναρξη της αγγειακής ανάπτυξης προκαλεί µείωση του ολικού

πάχους του νευροαµφιβληστροειδούς (Robinson et al., 2001). Τα δύο παραπάνω

γεγονότα οδηγούν στο συµπέρασµα ότι ο VEGF-A και οι υποδοχείς του ενέχονται

στην φυσιολογική ανάπτυξη του νευροαµφιβληστροειδούς στα ποντίκια ανεξάρτητα

από την ανάπτυξη των αγγείων.

Ο ακριβής ρόλος του VEGF στον φυσιολογικό αµφιβληστροειδή δεν έχει

διαλευκανθεί πλήρως. ∆ιάφορες µελέτες έχουν δείξει την έκφραση του mRNA και της

πρωτεΐνης του VEGF-A στο φυσιολογικό αµφιβληστροειδή (Gilbert et al., 1998; Kim

et al., 1999; Smith et al., 1999; Stitt et al., 1998). Επιπλέον, οι VEGF υποδοχείς έχει

δειχθεί ότι εκφράζονται και εκτός των αµφιβληστροειδικών µικροαγγείων (Gilbert et

al., 1998; Kim et al., 1999; Stitt et al., 1998). Παρ’όλα αυτά υπάρχουν αντιφατικές

µελέτες ως προς το πρότυπο έκφρασης των VEGF-A και των υποδοχέων και την

ακριβή κυτταρική εντόπισή τους οφειλόµενες πιθανώς στις µεθόδους που

χρησιµοποιήθηκαν. Σε µια µελέτη µε τη χρήση πολύ ειδικών αντισωµάτων έναντι των

υποδοχέων του VEGF υπήρξαν ισχυρές ενδείξεις ότι ο VEGFR-1 είναι ο µόνος

υποδοχέας που εκφράζεται στα µικροαγγεία του φυσιολογικού αµφιβληστροειδούς του

ανθρώπου και του πιθήκου, και πιθανώς µόνο στα περικύτταρα (Witmer et al., 2002).

Αυτό υποδεικνύει ότι µόνο αυτός ο υποδοχέας ενέχεται στη µεταγωγή του σήµατος του

VEGF στο φυσιολογικό αγγειακό αµφιβληστροειδή. Επιπλέον σε αυτή τη µελέτη

έδείξαν πως και οι τρεις υποδοχείς είναι παρόντες στο νευροαµφιβληστροειδή και

κυρίως στις νευρικές συναπτικές περιοχές. Ειδικά η έκφραση του VEGFR-3

παρουσίαζε ένα πρότυπο, το οποίο ταυτιζόταν µε τα συναπτικά συµπλέγµατα των

κονίων. Η έκφραση των υποδοχέων του VEGF σε αυτά τα νευρικά στοιχεία

υποδεικνύει δράση του VEGF και στα µη αγγειακά κύτταρα του

νευροαµφιβληστροειδούς.

27

1.3.3. Ο VEGF και οι υποδοχείς του στο παθολογικό οφθαλµό

1.3.3.1. Ο ρόλος του VEGF στις µη αγγειογενετικές παθήσεις του

οφθαλµού

Mη παραγωγική διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια (ΜΠ∆Α)

Ο VEGF-A λειτουργεί ως παράγοντας που αυξάνει τη διαπερατότητα στη

MΠ∆A. Τόσο στον άνθρωπο όσο και στην πειραµατική MΠ∆A ο VEGF-A και η

εξαγγειωµένη αλβουµίνη συνεντοπίζονται (Murata et al., 1995; Murata et al., 1996).

Eπαναλαµβανόµενες ενέσεις υψηλών συγκεντρώσεων VEGF-A στους οφθαλµούς

αρουραίων και πιθήκων προκάλεσε έξοδο φλουροσκείνης από τα αγγεία του

αµφιβληστροειδούς και αλλαγές όµοιες µε αυτές της MΠ∆A συµπεριλαµβανοµένων

της αγγειακής ελίκωσης και των µικροανευρυσµάτων (Hofman et al., 2001; Tolentino

et al., 1996). Αυξηµένη έκφραση του VEGF-A έχει περιγραφεί στη MΠ∆A σε

ανθρώπους (Amin et al., 1997; Hofman et al., 2001; Lutty et al., 1996; Pe'er et al.,

1996), και σε in vivo πειραµατικά µοντέλα διαβητικής αµφιβληστροειδοπάθειας

(Gilbert et al., 1998; Murata et al., 1996; Sone et al., 1997). Σε µία µελέτη όµως δεν

παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση του VEGF-A στον αµφιβληστροειδή ασθενών

µε MΠ∆A σε σχέση µε µη διαβητικούς (Gerhardinger et al., 1998).

Aύξηση των επιπέδων του VEGFR-2 στην αρχική προκλινική µορφή της

διαβητικής αµφιβληστροειδοπάθειας (∆A) παρατηρήθηκε στην επαγόµενη µε

streptozotocin ∆Α σε αρουραίους (Hammes et al., 1998). Η παρουσία του VEGFR-2

στην ανθρώπινη ∆Α σχετίστηκε µε την παρουσία διαρρεόντων αγγείων του

αµφιβληστροειδούς (Witmer et al., 2002). H έκφραση του VEGFR-2 στα ενδοθηλιακά

κύτταρα πιθανώς επάγεται από την τοπική υποξία.΄Eνας άλλος µηχανισµός επαγωγής

του VEGFR-2 είναι από τον ίδιο τον VEGF-A όπως έχει δειχθεί τόσο στα µικροαγγεία

του εγκεφάλου (Plate et al., 1994) όσο και στον αµφιβληστροειδή και την ίριδα

πιθήκου σε ένα µοντέλο επαγόµενης από το VEGF αµφιβληστροειδοπάθειας (Witmer

et al., 2002). Η έκφραση του γονιδίου του VEGFR-2, επάγεται επίσης από την

αγγειοτενσίνη II in vitro (Otani et al., 1998) ,έναν παράγοντα σηµαντικό για την

οµοιόσταση του καρδιαγγειακού συστήµατος, ο οποίος παίζει ρόλο και στην ανάπτυξη

και εξέλιξη της ∆A (Danser et al., 1994). Το σύστηµα της ρενίνης αγγειοτενσίνης, στο

οποίο ανήκει και η αγγειοτενσίνη II, ενεργοποιείται στη χρόνια υπεργλυκαιµία

28

(Anderson et al., 1993). Τέλος η αγγειοτενσίνη II ενεργοποιεί την έκκριση του VEGF-

A από τα λεία µυϊκά κύτταρα και τα καρδιακά ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου in

vitro (Williams et al., 1995).

Η έκφραση του VEGFR-3 που εµφανίζει υψηλή συγγένεια µε τους VEGF-C και

-D βρέθηκε στις περιοχές όπου υπήρχαν διαρρέοντα αγγεία, υποδεικνύοντας ότι και

άλλα µέλη της οικογένειας του VEGF µπορεί να ενέχονται στην παθογένεση της ∆A

(Witmer et al., 2002).

Παρ'όλες τις ενδείξεις για το ρόλο του VEGF-A στo αρχικό στάδιo της ∆A,

παραµένει άγνωστο ποιο είναι το πρώτο σήµα που ευθύνεται για την εµφάνιση της. Η

ενδοκυττάρια "ψευδουποξία", τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης και γλυκοζιωµένων

προϊόντων, επάγουν την έκφραση του VEGF-A στα κύτταρα in vitro (Lu et al., 1998).

Τέλος η ενδοθηλιακή PKCβ, η οποία απευθείας ενεργοποιείται από τη γλυκόζη είναι

επίσης σηµαντική για τις βιολογικές δράσεις του VEGF-A στον πολ/µό των κυττάρων

και την αγγειακή διαπερατότητα (Aiello et al., 1997; Xia et al., 1996).

1.3.3.2. Ο ρόλος του VEGF στις αγγειογενετικές παθήσεις του

οφθαλµού

1.3.3.2.1. Αγγειογενετικές παθήσεις του αµφιβληστροειδούς

Η νεοαγγείωση του αµφιβληστροειδούς οφείλεται κυρίως στο σακχαρώδη

διαβήτη και αποτελεί την πρώτη αιτία τύφλωσης σε νέους ασθενείς στις ανεπτυγµένες

χώρες (Lee et al., 1998). Η αµφιβληστροειδική νεοαγγείωση (ΑΝ) αποτελεί κρίσιµη

εξέλιξη όχι µόνο του διαβήτη αλλά και άλλων παθολογικών καταστάσεων όπως η

αµφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας και η αµφιβληστροειδοπάθεια που

σχετίζεται µε τη δρεπανοκυτταρική αναιµία. (πίνακας 1) Η ηλικιακή εκφύλιση της

ωχράς (ΗΕΩ) µπορεί επίσης να σχετιστεί µε αµφιβληστροειδική νεοαγγείωση.

Σύµφωνα µε την αρχιτεκτονική του αµφιβληστροειδούς υπάρχουν δύο τύποι

νεοαγγείωσης. Η πρώτη αφορά την αµιγώς αµφιβληστροειδική νεοαγγείωση όπου

εκβλαστήσεις προερχόµενες από τα αµφιβληστροειδικά αγγεία συνήθως διαπερνούν

την έσω αφοριστική µεµβράνη και αναπτύσσονται µέσα στο υαλοειδές. Σε µερικές

όµως περιπτώσεις τα νέα αγγεία µπορεί να αναπτυχθούν προς την άλλη κατεύθυνση

δια µέσω του µη αγγειοµένου έξω αµφιβληστροειδούς στον υπαµφιβληστροειδικό

χώρο. Η δεύτερη αναφέρεται ως χοριοειδική νεοαγγείωση (ΧΝ) κατά την οποία

29

εκβλαστήσεις από τα χοριοειδικά αγγεία διαπερνούν τη µεµβράνη του Bruch και

αναπτύσσονται στον υπο-µελάγχρου επιθηλίου και υπο-αµφιβληστροειδικό χώρο.

Οι κυριότερες απειλές για την όραση που σχετίζονται µε την νεοαγγείωση είναι

η ουλοποίηση, η ελκτική αποκόλληση του αµφιβληστροειδούς και η αιµορραγία.

Η παθογένεση της νεοαγγείωσης του αµφιβληστροειδούς είναι καλύτερα

κατανοητή από την παθογένεση της ΧΝ. Αρκετές κλινικές και πειραµατικές µελέτες

έχουν δείξει πως η ισχαιµία (ή υποξία) είναι αίτιο της ΑΝ. Απόφραξη των

αµφιβληστροειδικών αγγείων, τα οποία οδηγούν σε ισχαιµία του αµφιβληστροειδή

είναι ένα χαρακτηριστικό όλων των νοσηµάτων που µπορεί να εµφανίσουν ΑΝ

(πινακας1) και χαρακτηρίζονται ως ισχαιµικές αµφιβληστροειδοπάθειες.

Πίνακας 1 Καταστάσεις που σχετίζονται µε νεοαγγείωση του αµφιβληστροειδούς Σαγχαρώδης ∆ιαβήτης Ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς Αµφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας Απόφραξη της κεντρικής φλέβας του αµφιβληστροειδούς ή κλάδου της ∆ρεπανοκυτταρική αναιµία Συστηµατικός ερυθηµατώδης λύκος Όγκοι Αποκόλληση του αµφιβληστροειδούς κτλ

1.3.3.2.1.1. Παραγωγική διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια (Π∆Α)

Η ανακάλυψη ότι ο VEGF αυξάνεται λόγω της υποξίας εστίασε την προσοχή

στον VEGF ως ένα πρωταγωνιστή στη ΑΝ.

Στην ανάπτυξη της Π∆Α ο VEGF-A λειτουργεί πιθανώς συνεργατικά µε

άλλους αυξητικούς παράγοντες όπως ο PDGF,ο IGF-1 (Smith et al., 1997), ο PIGF

(Khaliq et al., 1998), ο HGF (Grierson et al., 2000; Paques et al., 1997). Η

ενδοοφθαλµική νεοαγγείωση στην Π∆Α φαίνεται να προκαλείται από το υψηλό

επίπεδο VEGF-A στο υαλοειδές, το οποίο παράγεται από τον ισχαιµικό

αµφιβληστροειδή. Έτσι αυξηµένα επίπεδα VEGF-A έχουν βρεθεί στο υδατοειδές υγρό

και το υαλοειδές ασθενών µε Π∆Α (Adamis et al., 1994; Aiello et al., 1994a; Shinoda

et al., 1999; Wells et al., 1996).

Aνοσοιστοχηµικές µελέτες των νεοαγγειακών µεµβρανών των ασθενών µε

Π∆Α αποκαλύπτουν µια συνολική αύξηση της έκφραση του VEGF-A (Ishida et al.,

2000; Pe'er et al., 1996). Σε µοντέλα νεογνικής ισχαιµικά επαγόµενης

30

αµφιβληστροειδοπάθειας ποντικιών και αρουραίων, η έκφραση του VEGF-A

σχετίζεται µε την αγγειογένεση. Ο VEGF-Α αυξάνεται αµέσως πριν την έναρξη της

νεοαγγείωσης και µειώνεται σταδιακά, καθώς η νεοαγγείωση υποχωρεί (Miller et al.,

1997) (Pierce et al., 1995). Mια αιτία στην επαγόµενη από την υποξία έκφραση του

VEGF-A στο προαναφερθέν µοντέλο αλλά και στους ανθρώπους µε ισχαιµική

αµφιβληστροειδοπάθεια µπορεί να είναι η υψηλή κατανάλωση οξυγόνου από τα

ραβδία κατά την προσαρµογή στο σκοτάδι (Arden, 2001). Aυτό ενισχύεται από την

παρατήρηση ότι άνθρωποι και ποντίκια µε κληρονοµική δυσλειτουργία των ραβδίων

(retinitis pigmentosa) δεν εµφανίζουν νεοαγγείωση παρουσία αµφιβληστροειδικής

ισχαιµίας (Lahdenranta et al., 2001).

Ο VEGF-A προκαλεί πολ/µό των ενδοθηλιακών κυττάρων του

αµφιβληστροειδούς in vitro σε χαµηλότερα ποσά από αυτά που υπάρχουν στην ενεργή

Π∆A (Thieme et al., 1995). Tο ενδιαφέρον είναι ότι επαναλαµβανόµενες

ενδουαλοειδικές εκχύσεις VEGF-A σε πιθήκους που οδηγούν σε συγκεντρώσεις 10-

100 φορές υψηλότερες από αυτές που απαντώνται στην ενεργή Π∆A, προκαλούν

νεοαγγείωση της ίριδας χωρίς προαµφιβλητροειδική νεοαγγείωση (Hofman et al.,

2000). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει σηµαντικές διαφορές µεταξύ ίριδας και

αµφιβληστροειδή στην αγγειογενετική τους απόκριση στο VEGF-A. Μια ερµηνεία θα

µπορούσε να είναι η τοπική έκφραση αναστολέων της νεοαγγείωσης στον

αµφιβληστροειδή, ή η φύση της εξωκυττάριας ουσίας στον έσω αµφιβληστροειδή που

δεν επιτρέπει την ανάπτυξη νέων αγγείων ή µια διαφορετική ευαισθησία των

αγγειακών δικτύων των δύο ιστών στο VEGF-A. Σε σχέση µε το τελευταίο έχει δειχθεί

ότι ο VEGFR-2 δεν εκφράζεται στον αµφιβληστροειδή φυσιολογικών πιθήκων αλλά

στην ίριδα. Αυτό υποδεικνύει ότι η νεοαγγείωση είναι πιο εύκολο να αναπτυχθεί στην

ίριδα όπου υπάρχει µια ασθενής αλλά µόνιµη έκφραση του VEGFR-2 σε σχέση µε τον

αµφιβληστροειδή.

Άµεση ένδειξη ότι ο VEGF-A είναι απαραίτητος για την επαγόµενη από την

ισχαιµία νεοαγγείωση σε νεογνά ποντικιού, αποτελεί η χρήση τριών διαφορετικών

παραγόντων που αναστέλλουν τη δράση του VEGF-A και τελικά την νεοαγγείωση.

Aυτά είναι χιµαιρικοί υποδοχείς του VEGF υποδοχέα (Aiello et al., 1995), ειδικοί

αναστολείς της κινάσης του(Ozaki et al., 2000), και µη νοηµατικά φωσφοροθειωµένα

ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια (antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides) (Aiello et

al., 1994b). Παρόµοια αποτελέσµατα προήλθαν και από τη χρήση αντισωµάτων που

καταστέλλουν τη δράση του VEGF-A στην νεοαγγείωση της ίριδας στα πρωτεύοντα

31

(Adamis et al., 1996). Τα ανωτέρω δεδοµένα δείχνουν πως η νεοαγγειακή απόκριση

αναµφίβολα τροποποιείται από διάφορους παράγοντες. Παρ’όλα αυτά ο VEGF-A

φαίνεται να είναι αναγκαίος και ικανός να προκαλέσει νεοαγγείωση στον

αµφιβληστροειδή των τρωκτικών και στην ίριδα των πρωτευόντων.

Τέλος διαγονιδιακά ποντίκια, τα οποία υπερεκφράζουν VEGF165 στους

φωτουποδοχείς, αναπτύσσουν νεοαγγείωση που ξεκινά από το εν τω βάθει τριχοειδικό

δίκτυο του αµφιβληστροειδούς και επεκτείνεται στον υπαµφιβληστροειδικό χώρο

(Senger et al., 1997).

Κατά αυτό τον τρόπο ένας παράγοντας που αναστέλλει τη δράση του VEGF-A

ή τη σύνδεσή του στους υποδοχείς µπορεί έστω και µερικώς να αναστείλει την

νεοαγγείωση στον οφθαλµό.

Ένας άλλος σηµαντικός παράγοντας είναι ο PEDF, ο οποίος είναι ένας

νευροτροφικός παράγοντας για τον αµφιβληστροειδή (Aymerich et al., 2001) που έχει

και ισχυρή αντιαγγειογενετική δράση (Ogata et al., 2002) (Chader, 2001; Stellmach et

al., 2001). Στις περιοχές νεοαγγείωσης στην Π∆A έχει βρεθεί ότι τα επίπεδα του PEDF

είναι µειωµένα σε σχέση µε τους µάρτυρες (Spranger et al., 2001) σε αντίθεση µε τα

επίπεδα του VEGF-A, τα οποία είναι υψηλότερα .Eπιπλέον έχει δειχθεί ότι η παραγωγή

του PEDF µειώνεται µε την υποξία (Dawson et al., 1999), η οποία ταυτόχρονα επάγει

το VEGF-A. Aυτή η ανισορροπία έχει ήδη περιγραφεί και σε άλλη µελέτη, γεγονός

που επιβεβαιώνει την υπόθεση ότι η παθολογική νεοαγγείωση οφείλεται σε

ανισορροπία µεταξύ διεγερτών και αναστολέων της.

1.3.3.2.1.2. Ισχαιµική αµφιβληστροειδοπάθεια των νεογνών

Ενώ η υποξία παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ∆Α και της ΗΕΩ , η

υπεροξία παίζει σηµαντικό ρόλο στην αµφιβληστροειδοπάθεια των νεογνών. Η

αµφιβληστροειδοπάθεια των νεογνών είναι ένα παράπλευρο φαινόµενο στην υπεροξία

που εφαρµόζεται στα πρόωρα νεογνά προκειµένου να αυξηθεί η επιβίωση από το

αναπνευστικό stress. Η υπεροξία προκαλεί υποστροφή των αγγείων, γιατί έχει

εξαφανιστεί ο παράγοντας που είναι υπεύθυνος για την φυσιολογική ανάπτυξη ή

επιβίωση τους. Αυτός ο παράγοντας είναι πιθανότατα ο VEGF-A, ο οποίος είναι

γνωστό πως καταστέλλεται από την υπεροξία (Stone et al., 1996). Με τη λήξη της

υπεροξίας αρχίζει η προκαλούµενη από την υποξία νεοαγγείωση. Ο VEGF-A

32

αυξάνεται σε επίπεδα υψηλότερα από αυτά του αναπτυσσόµενου αµφιβληστροειδούς

µε αποτέλεσµα άναρχη νεοαγγείωση.

Πρόσφατα ένας άλλος παράγοντας ο IGF έχει βρεθεί ότι παίζει ρόλο στην

ανάπτυξη του αµφιβληστροειδούς και πιθανώς στην παθογένεια της ισχαιµικής

αµφιβληστροειδοπάθειας των νεογνών (Hellstrom et al., 2001a).

Ο λεπτοµερής µηχανισµός µε τον οποίο η υποξία οδηγεί σε αύξηση των

επιπέδων του VEGF δεν έχει διαλευκανθεί. Μια κυτταροπλασµατική αιµοπρωτείνη

φαίνεται να λειτουργεί ως αισθητήρας, ο οποίος ανιχνεύει την µειωµένη τάση του

οξυγόνου και παράγει ελεύθερες ρίζες που παίζουν ρόλο στην ενεργοποίηση

µεταγραφικών παραγόντων. Ένας µεταγραφικός παράγοντας που παίζει σηµαντικό

ρόλο είναι ο HIF-1 (hypoxia induced factor). Ο HIF-1 αναγνωρίστηκε αρχικά ως µια

πυρηνική πρωτεΐνη που επάγεται από την υποξία και συνδέεται στο στοιχείο

ανταπόκρισης της υποξίας του γονιδίου της ερυθροποιητίνης. Ενεργοποιεί δε, τη

µεταγραφή γονιδίων που ρυθµίζονται θετικά από την υποξία όπως ο VEGF, σε

διάφορες κυτταρικές σειρές. Ο HIF-1 είναι µια πρωτεΐνη που αποτελείται από δύο

υποµονάδες HIF-1 α και HIF-1β.

Στον αµφιβληστροειδή τα επίπεδα του HIF-1 α µειώνονται στην υπεροξία και

τα επίπεδα αυξάνονται µέσα σε 2hr από την έναρξη της υποξίας. Με ανοσοιστοχηµεία

έχει δειχθεί ένα χαµηλό επίπεδο έκφρασης του HIF-1, το οποίο αυξάνεται µετά από 2hr

υποξίας στα κύτταρα του έσω αµφιβληστροειδούς, της περιοχής δηλαδή που είναι πιο

υποξική.

Τα επίπεδα του mRNA του VEGF µειώνονται µε την υπεροξία και αυξάνονται

στα κύτταρα του έσω αµφιβληστροειδούς µέσα σε 6hr υποξίας. Επίσης η ισχαιµία

αυξάνει και τη σταθερότητα του mRNA του VEGF. Ένα στοιχείο ανταπόκρισης του

HIF-1 έχει επίσης βρεθεί στoν υποκινητή του VEGFR1 και του IGF-1. O IGF-1

αυξάνεται στον ισχαιµικό αµφιβληστροειδή και φαίνεται να συνεργάζεται µε το VEGF

στην ανάπτυξη της ισχαιµικής αµφιβληστροειδοπάθειας των νεογνών.

1.3.3.2.2. Αγγειογενετικές παθήσεις του χοριοειδούς

Η χοριοειδική νεοαγγείωση (ΧΝ) χαρακτηρίζεται από το σχηµατισµό νέων

αγγείων ανάµεσα στο µελάγχρουν επιθήλιο και τη µεµβράνη του Bruch που συνέχονται

33

µε τα χοριοειδικά αγγεία. Η ΧΝ θεωρείται φτωχής πρόγνωσης. Καταστάσεις που

σχετίζονται µε την εµφάνιση ΧΝ φαίνονται στον πίνακα 2.

Πίνακας 2 Καταστάσεις που σχετίζονται µε νεοαγγείωση του χοριοειδούς Εκφυλιστικές καταστάσεις 1. Ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς 2. Αγγειακές ταινίες κτλ Μυωπία Φλεγµονώδεις ή λοιµώδεις καταστάσεις 1. Οφθαλµολογική ιστοπλάσµωση 2.Σαρκοείδωση 3.Χοριοαµφιβληστροειδική τοξοπλάσµωση κτλ Όγκοι Τραύµατα κτλ

1.3.3.2.2.1. Ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς

Η χοριοειδική (ή υποαµφιβληστροειδική ) νεοαγγείωση είναι η κυριότερη αιτία

απώλεια όρασης στην ΗΕΩ και η πρώτη αιτία µη αναστρέψιµης απώλειας όρασης

στους ηλικιωµένους (Lee et al., 1998). Η παθογένεια της είναι ακόµα ελάχιστα γνωστή.

. Η υποξία είναι ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό της νεοαγγείωσης του

αµφιβληστροειδούς που µπορεί όµως να παίζει ρόλο και στην ανάπτυξη της ΧΝ. Έχει

προταθεί ότι η διάχυση του οξυγόνου από το χοριοειδή στο µελάγχρουν επιθήλιο και

τον αµφιβληστροειδή ελαττώνεται εξαιτίας της ηλικιακά σχετιζόµενης πάχυνσης της

µεµβράνης του Bruch λόγω εναπόθεσης λιποφυλικού υλικού (Campochiaro, 2000;

Holz et al., 1994).

Ένα σηµαντικό παθολογικό στοιχείο στην προχωρηµένη ΗΕΩ είναι η

διαταραχή του µεταβολισµού της εξωκυττάριας ουσίας που έχει ως αποτέλεσµα τη

δηµιουργία µιας παχυσµένης µεµβράνης του Bruch (Senger et al., 1997). Επιπλέον

πρόσφατα έχει δειχθεί ότι τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας µπορεί να

επηρεάζουν την έκφραση αγγειογενετικών παραγόντων. Έτσι για παράδειγµα κύτταρα

µελάγχρου επιθηλίου που µεγαλώνουν σε τριβλία καλυµµένα µε θροµβοσποντίνη 1

έδειξαν αυξηµένα επίπεδα εκκρινόµενου VEGF και FGF2 στο υπερκείµενο θρεπτικό

υλικό σε σχέση µε τα κύτταρα που µεγάλωναν σε πιάτα καλυµµένα µε κολλαγόνο

τύπου 4, λαµινίνη, βιτρονεκτίνη ή φιµπρονεκτίνη (Senger et al., 1997).

34

Πρόσφατα δεδοµένα επίσης υποδεικνύουν ένα κεντρικό ρόλο του VEGF-A

στην ανάπτυξη της ΧΝ. Ο VEGF-A είναι παρών στα ινοβλαστικά κύτταρα και τα

µεταδιαφοροποιηµένα κύτταρα του µελάγχρου επιθηλίου σε χειρουργικά αφαιρούµενες

µεµβράνες. Η έκφραση του VEGF-A είναι επίσης αυξηµένη στα κύτταρα του

µελάγχρου επιθηλίου στην ωχρά ασθενών µε ΗΕΩ µια κατάσταση που έχει µεγάλη

συσχέτιση µε την ανάπτυξη της ΧΝ (Kliffen et al., 1997) και σε πειραµατικά µοντέλα

ζώων (Schwesinger et al., 2001). Τα επίπεδα του VEGF-A στο υαλοειδές είναι

υψηλότερα σε ασθενείς µε ΗΕΩ και ΧΝ συγκρινόµενα µε τους υγιείς µάρτυρες (Wells

et al., 1996). Τα κύτταρα του µελάγχρου επιθηλίου εκκρίνουν συνεχώς in vitro VEGF-

A στη βασικοκυτταρική πλευρά προς τα χοριοεειδοτριχοειδή και η έκφραση αυτή

αυξάνεται µε την υποξία (Blaauwgeers et al., 1999). Στον φυσιολογικό οφθαλµό in vivo

και οι τρεις υποδοχείς του VEGF εντοπίζονται στην πλευρά των χοριοτριχοειδών που

είναι προς το µελάγχρουν επιθήλιο. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει µια παρακρινική

σχέση µεταξύ χοριοτριχοειδών και µελάγχρου επιθηλίου πιθανώς σηµαντική για τη

διατήρηση και τη ρύθµιση των χοριοτριχοειδών.

Μπορεί λοιπόν κάποιος να υποθέσει πως µε την πάροδο της ηλικίας και

ιδιαίτερα στην ΗΕΩ αυτή η παρακρινική σχέση διακόπτεται από την παχυσµένη

µεµβράνη του Bruch, η οποία εξαιτίας της συσσώρευσης λιπιδίων είναι λιγότερο

διαπερατή σε υδατοδιαλυτούς παράγοντες όπως ο VEGF. (Holz et al., 1994). Έτσι ο

VEGF-A µπορεί να µην είναι ικανός να φθάσει τα χοριοτριχοειδή και να τα

υποστηρίξει. Αυτό οδηγεί σε ατροφία των χοριοτριχοειδών, η οποία παρατηρείται

στους ηλικιωµένους οφθαλµούς (Ramrattan et al., 1994). Η υπόθεση αυτή

υποστηρίζεται ακόµα από το εύρηµα ότι πειραµατική καταστροφή των κυττάρων του

µελάγχρου επιθηλίου προκαλεί ατροφία των χοριοτριχοειδών (Korte et al., 1984). Ως

αποτέλεσµα µπορεί να αναπτυχθεί υποξία στον έξω αµφιβληστροειδή και επακόλουθη

αύξηση της έκκρισης του VEGF-A από τη βασική επιφάνεια του µελάγχρου επιθηλίου

που οδηγεί σε συσσώρευση του VEGF-A στην προς το ΜΕ επιφάνεια της µεµβράνης

του Bruch (Blaauwgeers et al., 1999; Spilsbury et al., 2000). ∆ύο πρόσφατες µελέτες

δείχνουν πως η πειραµατική υπερέκφραση του VEGF-A από τα κύτταρα του

µελάγχρουν επιθηλίου είναι ικανή να προκαλέσει ΧΝ ενισχύοντας την παραπάνω

άποψη (D'Amore, 1994; Spilsbury et al., 2000).

Όλα αυτά τα ευρήµατα µαζί συνιστούν ένα σηµαντικό ρόλο του VEGF-A στην

παθογένεια της ΧΝ επί εδάφους ΗΕΩ και καθιστούν τον VEGF-A έναν κατάλληλο

στόχο αντι-αγγειογενετικής θεραπείας σε ασθενείς µε ΗΕΩ.

35

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω η νεοαγγείωση µπορεί να συµβεί, όταν υπάρχει

αύξηση των αγγειογενετικών παραγόντων ή µείωση των αντιαγγειογενετικών. Έχουν

βρεθεί ενδείξεις ότι ο ίδιος µηχανισµός ισχύει και στην ΧΝ (Ogata et al., 2002).

Η έκφραση του PEDF είναι µειωµένη στα κύτταρα του χοριοειδικού

νεοαγγειακού ιστού σε ένα πειραµατικό µοντέλο αρουραίου όπου η ΧΝ προκαλείται µε

LASER, ενώ ή έκφραση του VEGF-A είναι έντονη. Σε αντίθεση ο PEDF εκφράζεται

έντονα στα κύτταρα του µελάγχρου επιθηλίου που περιχαρακώνουν τη ΧΝ. Μερικές

εβδοµάδες µετά την επαγωγή της ΧΝ µε laser η έκφραση του VEGF-A µειώνεται.. Γι

αυτό πιθανολογείται ότι ο PEDF που εκκρίνεται από το µελάγχρουν επιθήλιο παίζει

ρόλο στην υποχώρηση της ΧΝ. Επιπλέον σε ένα πειραµατικό µοντέλο ΧΝ αρουραίου

έχει δειχθεί ότι αναστολείς του PEDF µπορούν να καταστείλουν τη νεοαγγείωση και να

αποτελέσουν µια θεραπευτική στρατηγική για τη ΧΝ. Τέλος ενδουαλοειδικές ενέσεις

µε αδενοιούς που εκφράζουν PEDF, είχε το ίδιο αποτέλεσµα (Mori et al., 2002).

1.3.3.3. Αγγειογενετικές παθήσεις του κερατοειδούς

Ο κερατοειδής φυσιολογικά στερείται αγγείων αλλά σε ορισµένες παθολογικές

καταστάσεις τριχοειδή εισχωρούν σε αυτόν προερχόµενα από το limbus. Μία µεγάλη

ποικιλία ερεθισµάτων µπορεί να προκαλέσει διάφορους τύπους νεοαγγείωσης στον

κερατοειδή που γενικά κατηγοριοποιούνται σε τρεις οµάδες: α)επιφανειακή

νεοαγγείωση, β)αγγειακό pannus και γ)εν τω βάθει νεοαγγείωση του στρώµατος.

Στην επιφανειακή νεοαγγείωση αγγεία ξεκινούν από το επιφάνεια του

κερατοειδούς και αναπτύσσονται κάτω από το επιθήλιο. Στα αίτια συµπεριλαµβάνονται

τραύµα, ήπιο χηµικό έγκαυµα, φλεγµονή και µόλυνση.

Στο αγγειακό pannus κολλαγόνο και αγγεία αναπτύσσονται από το limbus στον

κερατοειδή. Το pannus µπορεί να σχηµατιστεί όταν το ερέθισµα παραµένει για

εκτεταµένο χρονικό διάστηµα και µπορεί να οδηγήσει σε µόνιµη ούλή.

Τέλος, η εν τω βάθει νεοαγγείωση του στρώµατος µπορεί να αφορά

οποιοδήποτε επίπεδο στο στρώµα α από το επίπεδο του Bowman ως τη µεµβράνη του

Descement. Παρατηρείται κυρίως σε συνδυασµό µε σκληρίτιδα , σοβαρές βλάβες του

προσθίου ηµιµορίου, φυµατίωση και σύφιλη.

Συνολικά οι κυριότερες αιτίες νεοαγγείωσης του κερατοειδούς αναγράφονται

στον πίνακα 3 και όπως φαίνεται ο φλεγµονώδης παράγοντας είναι σηµαντικός.

36

∆ιάφορες µελέτες έχουν ενοχοποιήσει το VEGF στη διαδικασία της

νεοαγγείωσης του κερατοειδούς. Έτσι σε ένα µοντέλο αγγειογένεσης κερατοειδή

αρουραίου επαγόµενου από φλεγµονή, αναστολή του VEGF µε ειδικά µονοκλωνικά

αντισώµατα κατέστειλε τη δηµιουργία νέων αγγείων (Ilan, et al 1998), ενώ χορήγηση

εξωγενούς VEGF προκάλεσε νεοαγγείωση στον κερατοειδή. Επιπλέον βρέθηκαν

αυξηµένα ποσά VEGF (Senger et al., 1997) και του mRNA του (Ilan, et al,1998) στον

αγγειοµένο κερατοειδή, τα οποία συµβαδίζουν µε το βαθµό της νεοαγγείωσης. Ο

VEGF θεωρείται ότι παράγεται από τα φλεγµονώδη κύτταρα (πολυµορφοπύρηνα και

τα µακροφάγα) παρ’όλο που µελέτες έχουν εντοπίσει το VEGF και στο επιθήλιο του

φυσιολογικού κερατοειδούς.

Πίνακας 3 Καταστάσεις που σχετίζονται µε νεοαγγείωση του κερατοειδούς Τραύµατα και χειρουργικές επεµβάσεις Λοιµώξεις 1.Βακτήρια και άλλοι µικροοργανισµοί (Χλαµύδια, Ψευδοµονάδα κτλ) 2. Ιοί (Απλός έρπης κτλ) 3.Πρωτόζωα Εγκαύµατα από αλκάλεα Ανοσολογικά νοσήµατα ( Stevens-Johnson syndrome κτλ) Χρήση φακών επαφής 1.3.3.4. Αγγειογενετικές παθήσεις της ίριδας

Η νεοαγγείωση της ίριδας είναι συχνή αιτία τύφλωσης και εξόρυξης του

οφθαλµού. Σχεδόν ποτέ δεν ξεκινά ως πρωτοπαθής κατάσταση, αλλά αντίθετα

αναπτύσσεται δευτεροπαθώς σε κάποιο νόσηµα που ήδη υπάρχει κάπου αλλού στον

οφθαλµό. Συµβαίνει επί εδάφους µιας ευρείας σειράς οφθαλµιατρικών και

συστηµατικών νοσηµάτων όπως ο διαβήτης και η απόφραξη της κεντρικής φλέβας. Η

νεοαγγείωση της ίριδας αναφέρεται και ως rubeosis iridis.

Στη νεοαγγείωση της ίριδας τα αγγεία σχηµατίζονται στην πρόσθια επιφάνεια

της ίριδας και στη γωνία του προσθίου θαλάµου. Ξεκινούν αρχικά από το στρώµα της

(από τα προϋπάρχοντα τριχοειδικά δίκτυα που βρίσκονται κοντά στη ρίζα της και την

κόρη) και στη συνέχεια σχηµατίζουν αγγεία στην πρόσθια επιφάνειά της κοντά στην

κόρη ή τη γωνία. Σε αντίθεση µε τα φυσιολογικά αγγεία τα νέα αγγεία έχουν αυξηµένη

διαπερατότητα και χάνουν φλουροσκείνη. Τα αγγεία µπορεί να µείνουν στάσιµα για

αρκετό χρονικό διάστηµα, µπορεί όµως να µεγαλώσουν και να αναπτυχθεί ινώδης

ιστός µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία κλειστής γωνίας προσθίου θαλάµου και

37

δευτεροπαθές νεοαγγειακό γλαύκωµα που ανταποκρίνεται φτωχά στη θεραπεία. Τα νέα

αγγεία κυµαίνονται από µικρά λεπτά αγγεία µέχρι το σχηµατισµό ενός ινοαγγειακού

καλύµµατος. Στο νεοαγγειακό γλαύκωµα νέα αγγεία αναπτύσσονται εκτός από την

ίριδα και την γωνία του προσθίου θαλάµου και στον αµφιβληστροειδή, τον οπτικό

δίσκο και το δικτυωτό σώµα.

Το ερέθισµα της νεοαγγείωσης φαίνεται να είναι η αµφιβληστροειδική υποξία

και τα αγγεία της ίριδας θεωρείται ότι είναι τα περισσότερο ευαίσθητα στα

αγγειογενετικά ερεθίσµατα.

Συνοπτικά οι αιτίες που προκαλούν νεοαγγείωση φαίνονται στον πίνακα 4 .Οι

αγγειακές παθολογικές καταστάσεις σχετίζονται περισσότερο µε ισχαιµία, ενώ οι

χειρουργικές καταστάσεις, τα τραύµατα και τα συστηµατικά νοσήµατα σχετίζονται µε

φλεγµονή. Πολλές φορές αυτά συνυπάρχουν.

Πίνακας 4 Καταστάσεις που σχετίζονται µε νεοαγγείωση της ίριδας Αγγειακά νοσήµατα (Απόφραξη κεντρικής φλέβας του αµφιβληστροειδούς ή κλάδου της , απόφραξη κεντρικής αρτηρίας του αµφιβληστροειδούς κτλ) Οφθαλµικά νοσήµατα ( νεοαγγειακό γλαύκωµα, ραγοειδίτιδα, ενδοφθαλµίτιδα κτλ) Χειρουργικές επεµβάσεις (Βιτρεκτοµή, επεµβάσεις αποκόλλησης του αµφιβληστροειδούς κτλ)

Τραύµατα Συστηµατικά νοσήµατα (∆ιαβήτης κτλ)

Νεοπλασίες (Ρετινοβλάστωµα, µεταστατικά καρκινώµατα κτλ)

1.3.4. Θεραπευτική αντιµετώπιση της νεοαγγείωσης του οφθαλµού

Επειδή ο VEGF αναφέρεται ως ίσως ο κυριότερος αγγειογενετικός παράγοντας

παρ’όλο που συνεργάζεται µε άλλους, αρκετές κλινικές δοκιµασίες πραγµατοποιούνται

αναπτύσσοντας αντι-VEGF στρατηγικές σε ασθενείς µε ΗΕΩ και διαβητική

ωχροπάθεια.

Ο VEGF και οι υποδοχείς του αποτέλεσαν από την αρχή στόχους για τον

σχεδιασµό αντι-αγγειογενετικής θεραπείας. Έτσι έχουν αναπτυχθεί µονοκλωνικά

αντισώµατα έναντι του VEGF και των υποδοχέων του, αναστολείς της τυροσινικής

κινάσης των υποδοχέων του και ριβοένζυµα µε στόχο τους υποδοχείς του.

Ένας έµµεσος τρόπος για να αναστείλει κάποιος τη δράση του VEGF είναι να

αναστείλει την ενεργοποίηση µορίων διαµεσολαβητών που βρίσκονται πιο χαµηλά από

38

την ενεργοποίηση του υποδοχέα στο κύτταρο. Για παράδειγµα έχει αναφερθεί ότι η

ενεργοποίηση της PKC λόγω υπεργλυκαιµίας και VEGF στο διαβητικό

αµφιβληστροειδή πιθανώς συνδράµει στην εξέλιξη της διαβητικής

αµφιβληστροειδοπάθειας. Έτσι PKC αναστολείς είναι ήδη σε κλινικές δοκιµασίες για

την Π∆Α και το διαβητικό οίδηµα της ωχράς (∆ΟΩ) (πίνακας 5).

Άλλοι στόχοι προς αναστολή αποτελούν οι ιντεγκρίνες ανβ3/ανβ5, οι οποίες

εκφράζονται στα νεοαγγεία και οι µεταλλοπρωτεινάσες.

Πίνακας 5

Aντιαγγειογενετικα µόρια που βρίσκονται σε κλινικές δοκιµασίες

Ένδειξη Μόριο Αναστολείς του VEGF

-anti-VEGF aptamer

- anti-VEGF µονοκλωνικό αντίσωµα (rhuFab) Ηλικιακή εκφύλιση της ωχρας

Θαλιδοµίδη

Αναστολέας της PKCζ (LY333531) Παραγωγική ∆ιαβητική

αµφιβληστροειδοπάθεια Ανταγωνιστές των ιντεγκρινών

Ένα άλλο σηµαντικό στοιχείο για την ανάπτυξη αντιαγγειογενετικής αγωγής

στον οφθαλµό αφορά τον τρόπο χορήγησης του φαρµάκου. Η τοπική εφαρµογή έχει

λιγότερες ανεπιθύµητες ενέργειες σε σχέση µε τη συστηµατική.

Η τοπική χορήγηση µπορεί να γίνει µε κολλύρια, έξω-οφθαλµικές εγχύσεις

µακράς διαρκείας, ενδουαλοειδικές ενέσεις, γονιδιακή θεραπεία ή µέσω ενδω-/εξω-

οφθαλµικών εµφυτευµένων συσκευών βραδείας αποδέσµευσης. Οι ουσίες που

µεταφέρονται µε κολλύρια συνήθως δεν φθάνουν το οπίσθιο ηµιµόριο όπου είναι και

πιο συχνή η οφθαλµολογική νεοαγγείωση. Οι πολλαπλές ενδουαλοειδικές ενέσεις

χρησιµοποιούνται ήδη σε κάποιες κλινικές δοκιµασίες, αλλά υπάρχει πάντα κίνδυνος

ενδοφθαλµίτιδας και αποκόλλησης του αµφιβληστροειδούς.

Ο οφθαλµός αποτελεί ένα ιδανικό όργανο, στόχο, για την ανάπτυξη γονιδιακής

θεραπείας. Παρέχει εύκολη πρόσβαση και χαρακτηρίζεται από µειωµένη ανοσολογική

απόκριση που οφείλεται είτε στον αποκλεισµό αντιγόνων, τα οποία έτσι διαφεύγουν

της αναγνώρισης από το ανοσολογικό σύστηµα, είτε, σε µια µειωµένη ανοσολογική

απόκριση (λόγω µειωµένου αριθµού αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων στον

οφθαλµό ή µειωµένης ικανότητας τους να ενεργοποιούν τα Τ-λεµφοκύτταρα). Από την

άλλη γίνεται δυνατή η µεταφορά γονιδίων που µπορεί να κωδικοποιούν εκκρινόµενες ή

39

όχι πρωτεΐνες για ένα παρατεταµένο χρονικό διάστηµα έναντι των συµβατικών

φαρµάκων. Παρατεταµένη έρευνα επίσης πραγµατοποιείται προκειµένου να υπάρχει

εξειδικευµένη και ρυθµιζόµενη έκφραση των µεταφεροµένων γονιδίων σε

συγκεκριµένες οµάδες κυττάρων µε την επιλογή των κατάλληλων υποκινητών. Οι

φορείς που έχουν χρησιµοποιηθεί εκτενέστερα είναι οι ιικοί. Κατ’αυτό τον τρόπο ήδη

µπαίνει σε κλινική δοκιµασία-φάση Ι ένας αδενοιός που υπερεκφράζει PEDF σε

ασθενείς µε σοβαρή νεοαγγείωση στο πλαίσιο της ηλικιακής εκφύλισης της ωχράς.

1.4. Φλαβονοειδή

Τα φλαβονοειδή είναι φυτικοί δευτερεύοντες µεταβολίτεςκαι χηµικά

διακρίνονται από µια κοινή φαινολικη δοµή (C6-C3-C6) µε µία ή περισσότερες

υδροξυλικές οµάδες (Εικ6). Τα φλαβονοειδή και τα ισοφλαβονοειδή εµφανίζονται

συνήθως µε τη µορφή εστέρων, αιθέρων, γλυκοζιλιωµένων παραγώγων ή µείγµα

αυτών µε αποτέλεσµα να αριθµούν πάνω από 4000 ουσίες στη φύση. Στα θηλαστικά τα

φλαβονοειδή και τα ισοφλαβονοειδή προσλαµβάνονται µε την τροφή και είναι παρόντα

στα φρούτα τα λαχανικά, τους ξηρούς καρπούς,τη σόγια, το τσάι και το κρασί.

H κύρια πηγή των ισοφλαβονών (isoflavonoids) είναι η σόγια, η οποία περιέχει

~1mg γενιστείνης /gr ξηρού φασολιού (Reinli and Block, 1996). Τα εσπεριδοειδή είναι

η κύρια πηγή φλαβονονών (flavonones). Ένα µέλος τους η εσπεριτίνη περιέχεται στο

χυµό πορτοκαλιoύ σε συγκέντρωση 125-250mg/L (Rousseff et al 1987). Η

κουερσετίνη, η κυριότερη φλαβονόλη (flavonols) στην ανθρώπινη δίαιτα, είναι

παρούσα στα φρούτα και τα λαχανικά, αλλά κυρίως στα κρεµµύδια (0.3mg/g νωπού

βάρους) (Hertog et al., 1993) και το τσάι (10-25mg/L) (Hertog et al., 1993). Οι

κατεχίνες (catechins) βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο πράσινο τσάι (1gr/L)

(Lee et al., 2000).

Έχει υπολογιστεί ότι η µέση ηµερήσια πρόσληψη φλαβονοειδών στη

Μ.Βρετανία και τις ΗΠΑ κυµαίνεται από 1mg µέχρι 1 gr (Kuhnau, 1976), η

καθηµερινή δε βρώση τρoφών πλούσιων σε φλαβονοειδή µπορεί να αυξήσει και να

σταθεροποιήσει τη συγκέντρωσή τους στο πλάσµα σε επίπεδο µΜ (Manach et al.,

1997).

Αρκετές επιδηµιολογικές µελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει µια αρνητική

συσχέτιση ανάµεσα στην κατανάλωση φρούτων και λαχανικών και τον κίνδυνο

εµφάνισης διαφόρων µορφών καρκίνου, καρδιαγγειακών και χρόνιων νοσηµάτων

40

(Adlercreutz, 1990; Miller, 1990). ∆εδοµένης δε της ευρείας παρουσίας των

φλαβονοειδών στα φρούτα και τα λαχανικά φαίνεται ότι τα φλαβονειδή πρέπει να

έχουν κάποιες βιολογικές δράσεις που να συνδράµουν στον προστατευτικό ρόλο της

δίαιτας πλούσιας σε φυτικά.

Εικόνα 6

Η δοµή της οικογένειας των φλαβονοειδών

Πράγµατι τα φλαβονοειδή έχουν πολλές βιολογικές δράσεις. Έτσι τα

φλαβονοειδή έχει περιγραφεί ότι µπορούν να αναστείλουν συγκεκριµένες βιολογικές

δράσεις των κυττάρων όπως το πολλαπλασιασµό και να επάγουν άλλες όπως την

απόπτωση (Lopez-Lazaro, 2002). H αντιφλεγµονώδη δράση των φλαβονοειδών έχει

επίσης υπογραµµισθεί. (Rotelli et al., 2003; Sackeyfio and Lugeleka, 1986).

Συγκεκριµένα η λουτεολινη έχει δειχθεί ότι µπορεί να µειώσει τη θνητότητα στην από

41

την ενδοτοξίνη επαγόµενη σήψη σε ποντίκια (Wellner et al., 1999). Τέλος υπάρχουν

µελέτες που δείχνουν ότι τα φλαβονοειδη έχουν αντιµικροβιακή (Basile et al., 1999)

(Plaper et al., 2003), αντιHIV (Olivero-Verbel and Pacheco-Londono, 2002) (Ng et al.,

1997) και αντιπηκτική δράση (Bucki et al., 2003) ενώ παρουσιάζουν και µια

προστατευτική δράση στην µετεµµηνοπαυσιακή απώλεια οστικής µάζας (Wattel et al.,

2003)

Ιδιαίτερα ως προς την ευεργετική τους δράση στο καρδιαγγειακό σύστηµα η

αντιοξειδωτική δράση των φλαβονοειδών θεωρείται καθοριστική. Η προστατευτική

δράση των φλαβονοειδών στο οξειδωτικό στρες πραγµατοποιείται είτε µέσω

δέσµευσης των ελευθέρων ριζών οξυγόνου είτε έµµεσα µέσω ενεργοποίησης των

αντιοξειδωτικών µηχανισµών άµυνας του κυττάρου είτε µέσω διατήρησης χαµηλών

επιπέδων Ca++ (Ishige et al., 2001). Κατ’αυτό τον τρόπο η κουερσετίνη και η απιγενίνη

επάγουν την έκφραση της γλουταθειόνης (Myhrstad et al., 2002). Η λουτεολίνη

µάλιστα και η κουερσετίνη έχουν περιγραφεί ότι αναστέλλουν την επαγόµενη από το

UV βλάβη του DNA (Romanova et al., 2001).

Ενας άλλος µηχανισµός µε τον οποίο φαίνεται να πραγµατοποιούν τις δράσεις

τους τα φλαβονοειδή είναι και η αναστολή συγκεκριµένων κινασών. Έχει λοιπόν

δειχθεί ότι µπορούν να αναστείλουν κινάσες των τυροσινών (Graziani et al., 1983)

(Cunningham et al., 1992) και των σερινών πιθανώς λόγω ανταγωνιστικής αναστολής

της πρόσδεσης του ATP στη ειδική θέση δέσµευσης του στις κινάσες, µια περιοχή η

οποία παρουσιάζει οµοιότητα σε όλα τα µέλη της οικογένειας των κινασών (Graziani et

al., 1983). Αναφέρονται δε ως αναστολείς των τυροσινικών κινασών. Οι κινάσες αυτές

µπορεί να αποτελούν µόρια διαµεσολαβητές κατά την ενδοκυττάρια µεταγωγή του

σήµατος και να διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στις λειτουργίες του κυττάρου. Σε µια

σειρά από µελέτες, τα φλαβονοειδή ανέστειλαν σειρά ενδοκυττάριων κινασών, η

αναστολή των οποίων πιθανά διαµεσολαβεί την δραστικότητα των φλαβονοειδών.

Τέτοια ένζυµα αποτελούν η CKΙΙ (casein kinase II) (Critchfield et al., 1997), η PKC

(Gamet-Payrastre et al., 1999) και η PI3K (Walker et al., 2000).

Ως προς την ανιαγγειογενετική δράση των φλαβονοειδών σε προηγούµενες

µελέτες (Fotsis et al., 1995; Fotsis et al., 1997), µέσα στο πλαίσιο διερεύνησης της

προστατευτικής δράσης των φυτικών τροφών, ελέγχθηκαν τα ούρα από φυτοφάγους

για την παρουσία ουσιών µε πιθανή αντικαρκινική και αντιαγγειογενετική δράση. Με

αυτό τον τρόπο αναγνωρίστηκε αρχικά το ισοφλαβονοειδές γενιστείνη όπως και ένας

αριθµός ισοµερικών φλαβονοειδών, όπως η λουτεολίνη, τα οποία ανέστειλαν τον

42

πολλαπλασιασµό σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων (Fotsis et al., 1995;

Fotsis et al., 1997). Επιπλέον στην ίδια µελέτη (Fotsis et al., 1997) δείχθηκε για πρώτη

φορά ότι τα φλαβονειδή µπορούσαν σε διαφορετικό βαθµό ανάλογα µε τη δοµή τους

να αναστείλουν τον επαγόµενο από τον FGF-2 πολλαπλασιασµό στα ενδοθηλιακά

κύτταρα καθώς και τη δηµιουργία δικτύου από τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε µια

δοκιµασία αγγειογένεσης in vitro. Η λουτεολίνη παρουσίασε ισχυρή δράση στις

προαναφερθέντες δοκιµασίες και γι’αυτό το λόγο χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα

µελέτη, σαν πρότυπο, προκειµένου να διερευνηθεί ο µοριακός µηχανισµός της

αντιαγγειογενετικής δράσης των φλαβονοειδών.

43

2. ΕΙ∆ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ∆ΙΑΤΡΙΒΗΣ

Η αγγειογένεση του οφθαλµού αποτελεί την πρώτη αιτία τύφλωσης στον

κόσµο. ∆εδοµένης της ανεπάρκειας µιας αποτελεσµατικής θεραπευτικής

αντιµετώπισης της, κρίνεται αναγκαία η διερεύνηση των µοριακών της µηχανισµών και

η ανάπτυξη επιτυχών αναστολέων της. Ο VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

αποτελεί προεξάρχοντα αγγειογενετικό παράγοντα στην αγγειογένεση του οφθαλµού

γεγονός που τον καθιστά στόχο εκτεταµένης έρευνας και ανάπτυξης ειδικών

αναστολέων των βιολογικών του δράσεων, οι οποίοι στη συνέχεια θα µπορούν να

καταστείλουν τη διαδικασία της νεοαγγείωσης επιτυχώς. Επειδή σε προηγούµενη

µελέτη είχε δειχθεί, ότι µέλη της οικογένειας των φλαβονοειδών µπορούν να

αναστείλουν την αγγειογένεση σε ένα in vitro πειραµατικό µοντέλο, θελήσαµε να

διερευνήσουµε την πιθανή ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επαγόµενη από

το VEGF νεοαγγείωση σε κερατοειδή κονίκλου και τον µοριακό µηχανισµό δράσης της

στη συνέχεια. Κατ’αυτό τον τρόπο δίνεται η δυνατότητα ελέγχου µιας ουσίας που

µπορεί περαιτέρω να χρησιµοποιηθεί θεραπευτικά ως αναστολέας της νεοαγγείωσης.

Ταυτόχρονα όµως µέσα από τη διερεύνηση του µοριακού µηχανισµού δράσης της

προκύπτουν χρήσιµα συµπεράσµατα για την βιολογική δράση του VEGF και την

αναγνώριση µορίων µεσολαβητών στη µεταγωγή του σήµατος του, των οποίων η

ενεργοποίηση ή η καταστολή είναι κρίσιµη κατά την νεοαγγείωση.

44

2.1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ∆ΟΙ

2.1.2. Υλικά

Ο ανθρώπινος VEGF165 που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα αγοράστηκε από

την R&D Systems, Inc. Η λουτεολίνη ήταν από τη SIGMA και χρησιµοποιήθηκε σε

διάλυµα DMSO/EtOH (1:1 κατά όγκο). Τα πολυκλωνικά αντισώµατα αντι-p-Akt

(Ser473), αντι-Akt, αντι-p-ERK, αντι-ERK, αντι-p-p38, αντι-p38, αντι-p-p65, αντι-p65

είναι όλα από την Cell Signaling Technology, Inc. To µονοκλωνικό αντι-

φωσφοτυροσινικό αντίσωµα (P3300) αγοράστηκε από τη SIGMA.Τα πολυκλωνικά

αντισώµατα έναντι του FLK-1 (C-1158), του ΙκΒα, και του ΙκΒβ και το αντίσωµα

αίγας έναντι της ακτίνης (SC-1616) αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology,

Inc. Το πολυκλωνικό αντι-PI3K (p85, 06-195) αντίσωµα κονίκλου ήταν από την

Upstate Biotechnology, Inc. Το µονοκλωνικό αντι-ki67 αντίσωµα ήταν προσφορά της

κ. M. Μπάη (Εργαστήριο .Παθολογικής Aνατοµικής, Iατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο

Ιωαννίνων), το αντι-p-p70S6 (Tyr 389)αντίσωµα κονίκλου ήταν προσφορά του κ. A.

Παπαπετρόπουλου (Eργαστήριο Mοριακής Φαρµακολογίας, Φαρµακευτικό Tµήµα,

Πανεπιστήµιο Πατρών) και η ραπαµυκίνη ήταν προσφορά του κ.I. Λαζαρίδη

(Εργαστήριο Βιολογίας, Iατρική Σχολή, ΠανεπιστήµιοΙωαννίνων). Το 12Ca5 (αντι-

ΗΑ) µονοκλωνικό αντίσωµα αποµονώθηκε από το αντίστοιχο υβρίδωµα στο

εργαστήριο Βιολ. Χηµείας της Iατρικής Σχολής του ΠανεπιστήµιουΙωαννίνων. Όλα τα

δευτερογενή αντισώµατα ήταν από τη DIANOVA GmbH.

2.1.2. ∆οκιµασία αγγειογένεσης στον κερατοειδή κονίκλου Στη µέθοδο αυτή χρησιµοποιήθηκαν αρσενικοί albino κόνικλοι 1.8-2 kgr. Η δοκιµασία

αγγειογένεσης στον κερατοειδή βασίζεται στην τοποθέτηση ενός διεγέρτη της

αγγειογένεσης (αυξητικού παράγοντα, καρκινικού ιστού ή κυττάρων) σε µια

παρασκευασθείσα θήκη στον κερατοειδή του κονίκλου που έχει ως αποτέλεσµα την

ανάπτυξη νέων αγγείων στον αρχικά µη αγγειοµένο κερατοειδή από τα αγγεία του

limbus (Εικ7). Με τη µέθοδο αυτή είναι δυνατόν να ελέγξει κάποιος την δυνητική

αγγειογενετική δράση ενός παράγοντα ή και την αντιαγγειογενετική δράση κάποιου

άλλου, όταν αυτός συγχορηγείται µε έναν γνωστό αγγειογενετικό διεγέρτη.

45

Προκειµένου να ελεγχθεί µε τη δοκιµασία αγγειογένεσης στον κερατοειδή

κονίκλου η αντιαγγειογενετική δράση µιας ουσίας, αυτή µπορεί να συγχορηγηθεί µε

τον αγγειογενετικό παράγοντα συστηµατικά (per.os) ή τοπικά. Στη δεύτερη περίπτωση

µπορεί να περιέχεται είτε στο ίδιο είτε σε διαφορετικό εµφύτευµα που τοποθετείται

παράλληλα και δίπλα µε αυτό του αγγειογενετικού παράγοντα ή µε απευθείας ένεση

της στο στρώµα του κερατοειδούς).

2.1.2.1. Προετοιµασία του πολυµερούς υλικού που χρησιµοποιείται ως

έκδοχο

Το υλικό που χρησιµοποιείται ως έκδοχο είναι ένα πολυµερές (ethylene-vinyl-

acetate copolymer – 40% vinyl-acetate κατά βάρος ) Elvax-40, που έχει την ιδιότητα να

αποδεσµεύει βραδέως την ουσία που έχει διαλυθεί σε αυτό. Προκειµένου να

αποφευχθούν µη ειδικές αντιδράσεις στον κερατοειδή από το Elvax-40 απαιτείται

ειδική προετοιµασία του. Έτσι, αρχικά τα σφαιρίδια του Elvax-40 πρέπει να πλυθούν

εκτεταµένα σε απόλυτη αιθανόλη στους 300C για τρεις µήνες. Στη συνέχεια,

παρασκευάζεται ένα διάλυµα (casting stock) 10% σε methylene chloride (χλωριούχο

µεθυλένιο) και ελέγχεται για τη βιοσυµβατότητά του: 200µl από αυτό το διάλυµα

αφήνονται πάνω σε µια γυάλινη επιφάνεια (µε εφαρµογή κενού), ώστε να εξατµιστεί το

methylene chloride (χλωριούχο µεθυλένιο) και ακολούθως το πολυµερές κόβεται σε

κοµµάτια κάθε ένα από τα οποία θα αποτελέσει ένα εµφύτευµα. ∆έκα από αυτά τα

εµφυτεύµατα τοποθετούνται ενδοστρωµατικά στον κερατοειδή (βλέπε παρακάτω) και ο

κερατοειδής ελέγχεται για 14 ηµέρες για πιθανή αντίδραση. Εάν έστω και ένα από τα

εµφυτεύµατα προκαλέσει την παραµικρή αντίδραση (µακροσκοπική ή ιστολογική), το

διάλυµα δεν χρησιµοποιείται και πραγµατοποιείται πιο εκτεταµένη πλύση των

σφαιριδίων του Elvax-40 για άλλες δέκα ηµέρες οπότε και παρασκευάζεται νέο

διάλυµα, το οποίο ελέγχεται πάλι στον κερατοειδή. Εάν κανένα από τα εµφυτεύµατα

δεν προκαλέσει την οποιαδήποτε αντίδραση από τον κερατοειδή, θεωρείται ότι το

διάλυµα είναι κατάλληλο για χρήση και παρασκευάζεται ένας µεγάλος αριθµός

εµφυτευµάτων, τα οποία φυλάσσονται µέχρι να χρησιµοποιηθούν. Όλα τα υλικά που

χρησιµοποιούνται στην παραπάνω διαδικασία αποστειρώνονται. Επίσης οι επιφάνειες

που έρχονται σε επαφή µε το πολυµερές πρέπει να είναι γυάλινες ή από teflon.

46

2.1.2.2. Παρασκευή των τελικών εµφυτευµάτων

Πάνω σε µια επιφάνεια από teflon τοποθετούνται συγκεκριµένες ποσότητες

VEGF165 µε η χωρίς λουτεολίνη και αφήνονται να στεγνώσουν σε εστία κάθετης

νηµατικής ροής. Στη συνέχεια ορισµένη ποσότητα πολυµερούς προστίθεται και

ακολούθως κυλίεται µε µια σπάτουλα πάνω στις περιοχές που είχαν τοποθετηθεί ο

VEGF165 και η λουτεολίνη και κόβεται σε κοµµάτια 0.5x1x1mm, κάθε ένα από τα

οποία αποτελεί ένα εµφύτευµα που περιέχει την επιθυµητή συγκέντρωση VEGF

(200ng) µε ή χωρίς λουτεολίνη ή µόνο λουτεολίνη ανάλογα µε το σχεδιασµό του

πειράµατος. Στη συνέχεια τα εµφυτεύµατα τοποθετούνται σε γυάλινα αποστειρωµένα

τριβλία και εφαρµόζεται κενό για 20min προκειµένου να εξατµιστούν και τα τελευταία

υπολείµµατα χλωριούχου µεθυλενίου. Τέλος φυλάσσονται στους 40C µέχρι την άλλη

µέρα οπότε και θα χρησιµοποιηθούν. Οι χειρισµοί και σε αυτή τη διαδικασία γίνονται

κάτω από άσηπτες συνθήκες και τα υλικά είναι όλα αποστειρωµένα.

2.1.2.3. Χειρουργική τεχνική της εµφύτευσης

Η εµφύτευση λαµβάνει χώρα κάτω από το χειρουργικό µικροσκόπιο κάτω από

άσηπτες συνθήκες και όλοι οι χειρισµοί των ζώων υπόκεινται στον Ευρωπαϊκό

κανονισµό περί µεταχείρισης των ζωών (EEC Law No.86/609). Αρχικά,

πραγµατοποιείται αναισθησία του κονίκλου µε νατριούχο πεντοθάλη(30mg/kgr, iv) και

στη συνέχεια, παρασκευάζεται µε τη βοήθεια µιας plable iris spatula µια θήκη

(1.5x3mm) ενδοστρωµατικά στο κάτω ήµισυ του κερατοειδούς σε απόσταση 2.5-3mm

από το limbus. H απόσταση αυτή είναι πολύ σηµαντικό να τηρείται, επειδή

πλησιέστερη εµφύτευση µπορεί να προκαλέσει µη ειδική αγγειογενετική απόκριση

λόγω µηχανικού ερεθισµού, ενώ απώτερη µπορεί να εµποδίσει τη δηµιουργία ενός

αποτελεσµατικού πρανούς συγκέντρωσης του αγγειογενετικού παράγοντα και της υπό

εξέταση ουσίας ανάµεσα στη θέση εµφύτευσης και το limbus. Κατά τη διάρκεια της

χειρουργικής διαδικασίας γίνεται ενστάλαξη κολλυρίου για τοπική αναισθησία.

47

Εικόνα 7

Η δοκιµασία της αγγειογένεσης σε κερατοειδή κονίκλου Παρασκευή της θήκης στον κερατοειδή (Α), τοποθέτηση του εµφυτεύµατος (Β), (Γ) και αγγειογενετική απόκριση (∆).

2.1.2.4. Αξιολόγηση της αγγειογενετικής απόκρισης

Καθηµερινή παρατήρηση των εµφυτευµάτων πραγµατοποιείται µε

στερεοµικροσκόπιο σχισµοειδους λυχνίας χωρίς αναισθησία και καταγράφεται η όποια

αντίδραση από τον κερατοειδή (οίδηµα, κυτταρική διήθηση, νέα αγγεία, φλεγµονή).

Μια αγγειογενετική απόκριση θεωρείται θετική όταν αγγεία έχουν ξεκινήσει από το

limbus µετά από 3-4 ηµέρες και φθάνουν το εµφύτευµα σε 7-10 ηµέρες. Εµφυτεύµατα

που αποτυγχάνουν να επάγουν αγγειογενετική αντίδραση σε 10 ηµέρες θεωρούνται

αρνητικά, ενώ εµφυτεύµατα που προκαλούν ή συνοδεύονται από φλεγµονή

εξαιρούνται. Η ένταση της αγγειογενετικής αντίδρασης βαθµολογείται µε βάση τον

48

αριθµό των νέων αγγείων και την απόστασή που καλύπτουν από το limbus σύµφωνα µε

τον τύπο: αγγειογενετικός δείκτης = αXβ.

Αριθµός αγγείων α Απόσταση από το

limbus β

Eκβλαστήσεις 0.25 1 0.5

1-2 0.75 5-20 1

2 1

2-3 1.5 20-60 2

3 2

60-80 3 Εµφύτευµα 4

80-100 4

100 4.5

100-200 5

Νέα αγγεία πάνω στο

εµφύτευµα 5

>200 6

Η απόσταση του εµφυτεύµατος από το limbus διαιρείται σε τρια ίσα τµήµατα

όπως φαίνονται στη εικόνα και στο καθένα αντιστοιχεί ο συντελεστής του πίνακα (β).

Τέλος λαµβάνονται φωτογραφίες των κερατοειδών σε τακτά χρονικά

διαστήµατα και µετά το πέρας 12 ηµερών τα ζώα θανατώνονται µε ευθανασία, αφού

προηγουµένως τα µάτια αφαιρεθούν και τοποθετηθούν σε διάλυµα φορµαλδεΰδης,

ώστε να γίνει ιστολογική εξέταση.

2.1.3. Κυτταροκαλλιέργειες

Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα προερχόµενα από φλέβα οµφάλιου

λώρου(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) καλλιεργήθηκαν σε τριβλία

τα οποία είχαν πριν επωαστεί µε κολλαγόνο αρουραίου τύπου Ι και πλυθεί µε PBS. Το

θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονταν ήταν Μ199 εµπλουτισµένο µε 20% εµβρυϊκό

ορό βοός (Fetal Calf Serum, FCS), 0.05mg/ml εκχύλισµα ενδοθηλιακής ανάπτυξης

(Endothelial Cell Growth Supplement, ECGS), 0.05/ml IU ηπαρίνης και 1% πενικιλίνη

στρεπτοµυκίνη. Όταν τα κύτταρα κάλυπταν όλη την επιφάνεια του τριβλίου γινόταν

διασπορά των κυττάρων σε αραίωση των 1/4. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν

κύτταρα γενιάς 4-10.

49

Αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα προερχόµενα από αµφιβληστροειδή βοός

καλλιεργήθηκαν σε τριβλία που προηγουµένως είχαν επικαλυφθεί µε φιµπρονεκτίνη.

Το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονταν ήταν EBM (Clonetics) εµπλουτισµένο µε

ορό αλόγου (10%), 0.05mg/ml εκχύλισµα ενδοθηλιακής ανάπτυξης (Endothelial Cell

Growth Supplement ECGS), 7 IU/ml ηπαρίνη και 1% πενικιλίνη στρεπτοµυκίνη.

Ανθρώπινα εµβρυϊκά κύτταρα νεφρού 293 καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό

RPMI εµπλουτισµένο µε 10% εµβρυϊκό ορό βοός (Fetal Calf Serum FCS) και 1%

πενικιλίνη στρεπτοµυκίνη και όταν τα κύτταρα κάλυπταν όλη την επιφάνεια του

τάπητα γινόταν διασπορά τους σε αραίωση των1/4.

Όλα τα υλικά που χρησιµοποιήθηκαν στις κυτταροκαλλιέργιες ήταν ελεύθερα

ενδοτοξίνης. Ο χειρισµός των κυττάρων γινόταν σε εστία κάθετης νηµατικής ροής και

τα κύτταρα αναπτύσσονταν σε επωαστικό κλίβανο στο οποίο η θερµοκρασία

διατηρούνταν σταθερή στους 370C, επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας και η

ατµόσφαιρα ήταν εµπλουτισµένη µε 5% CO2.

2.1.4. ∆οκιµασίες απόπτωσης 2.1.4.1. µε µικροσκοπία

HUVE κύτταρα (µολυσµένα ή όχι) καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 24 φρεατίων

πάνω σε καλυπτρίδες, αφού πρώτα είχαν καλυφθεί µε κολλαγόνο. Στη συνέχεια,

πραγµατοποιήθηκε στέρηση ορρού (5%FCS) και επώαση µε VEGF (50ng/ml) µε ή

χωρίς λουτεολινη ή ραπαµυκίνη για 15hr. Τα κύτταρα στη συνέχεια µονιµοποιήθηκαν

σε 3.7% παραφορµαλδεύδη για 15min και τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν µε

χρώση του DNA µε Hoechst 33342 (Molecular Probes) κάτω από µικροσκόπιο

φθορισµού.

Επίσης, τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν µε TUNEL (TdT –mediated

dUTP-X nick end labeling). Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης αρχικά λαµβάνει χώρα

η διάσπαση του DNA. Τα σηµεία στα οποία κόβεται µπορεί να ανιχνευθούν µε

σήµανση των ελευθέρων 3’-ΟΗ που προκύπτουν µε τροποποιηµένα νουκλεοτιδια

(dUTP), τα οποία φθορίζουν. Η αντίδραση καταλύεται από ένα ένζυµο που ονοµάζεται

δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράση (TdT), το οποίο µε αυτόν τον τρόπο πολυµερίζει τα

νουκλεοτίδια στο 3’ τέλος του σπασµένου DNΑ. Κύτταρα λοιπόν που επωάστηκαν

όπως αναφέρθηκε παραπάνω, µονιµοποιήθηκαν και στη συνέχεια ακολουθήθηκε

50

διαδικασία επώασης των κυττάρων µε τα νουκλεοτιδια και το ένζυµο σύµφωνα µε το

In situ Cell Death Detection Kit. (ROCHE).

2.1.4.2. µε κυτταροµετρία ροής

HUVE κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τριβλία 6 φρεατίων τα οποία είχαν πρώτα

καλυφθεί µε κολλαγόνο και στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε στέρηση ορρού (5%FCS)

και επώαση µε VEGF (50ng/ml) µε ή χωρίς λουτεολίνη ή ραπαµυκίνη για 15hr. Tα

επιπλέοντα κύτταρα (νεκρά) µαζί µε αυτά που είχαν παραµείνει προσκολληµένα στον

τάπητα του τριβλίου και τα οποία συλλέχθηκαν µε τρυψινοποίηση, εναιωρήθηκαν σε

ψυχρό PBS. Στη συνέχεια µε τη χρήση ενός εµπορικού προϊόντος CycleTEST PLUS

DNA Reagent kit (Becton Dickinson Biosciences) αυξήθηκε η διαπερατότητα της

µεµβράνης ώστε να επιτραπεί στο DNA του πυρήνα να βαφτεί µε ιωδιούχο προπίδιο.

Ακολούθως τα κύτταρα αναλύθηκαν µε κυτταροµετρία ροής χρησιµοποιώντας Becton

Dickinson Fluorescence Activated Cell Scanner (FACS). Από το τελικό ιστόγραµµα

του αριθµού των πυρήνων σε σχέση µε το φθορισµό του DNA, τo ποσοστό των

κυττάρων τα οποία αντιστοιχούσαν στην υπο-G1 περιοχή του ιστογράµµατος

θεωρήθηκε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων.

2.1.5. ∆οκιµασίες πολλαπλασιασµού 2.1.5.1. µε µικροσκοπία

HUVE κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τριβλία 24 φρεατίων πάνω σε καλυπτρίδες

που πρώτα είχαν καλυφθεί µε κολλαγόνο και στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε στέρηση

ορρού (5%FCS για 12hr και επώαση µε VEGF (50ng/ml) µε ή χωρίς λουτεολίνη για

6hr. Τα κύτταρα στη συνέχεια µονιµοποιήθηκαν και ακολούθησε η διαδικασία του

έµµεσου ανοσοφθορισµού (βλέπε παρακάτω). Τα κύτταρα τα οποία

πολλαπλασιάζονταν (θετικά στο ki67) και τα αποπτωτικά κύτταρα (πυκτωτικοί

πυρήνες µε τη χρώση Hoechst) αναγνωρίζονταν και γινόταν αρίθµησή τους κάτω από

µικροσκόπιο φθορισµού Zeiss.

2.1.5.2. µε ενσωµάτωση θυµιδίνης [3 Η]

51

HUVE κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τριβλία 24 φρεατίων (10000 κύτταρα ανά

φρεάτιο) και στη συνέχεια µολύνθηκαν µε αδενοιούς (οι οποίοι περιγράφονται

παρακάτω) για 30hr. Στη συνέχεια τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού (5% FCS) για

12hr και έγινε επώαση µε VEGF (50 ng/ml) παρουσία ή όχι διαφόρων συγκεντρώσεων

λουτεολίνης ή ραπαµυκίνης για άλλες 24hr έτσι ώστε σε κάθε συνθήκη να

αντιστοιχούν 3 φρεάτια. Τις 6 τελευταίες hr της επώασης προστέθηκε [3Η]-µέθυλο-

θυµιδίνη (1µ Ci/ml, ICN) σε κάθε φρεάτιο. Με το πέρας της επώασης το θρεπτικό

υλικό αποµακρύνθηκε και τα κύτταρα µονιµοποιήθηκαν στους 40C µε 10%

τριχλωροοξικό οξύ (το οποίο είχε θερµοκρασία 40C). Στη συνέχεια ακολούθησε πλύση

3 φορές µε νερό και διαλυτοποίηση των µονιµοποιηµένων νουκλεικών οξέων σε

διάλυµα 0.1% NaOH κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 40C. Η ραδιενεργή θυµιδίνη

που ενσωµατώθηκε στο DNA αντιπροσωπεύει τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και

µετρήθηκε σε µετρητή β σωµατιδίων υγρού σπινθηρισµού (LKB). Οι τιµές

οµαλοποιήθηκαν µε τον αριθµό των ζωντανών κυττάρων. Για τον προσδιορισµό των

ζωντανών κυττάρων δύο φρεάτια από κάθε συνθήκη µετρήθηκαν, αφού πρώτα

βάφτηκαν µε trypan blue (τα νεκρά κύτταρα βάφονται µπλε µε το trypan blue, γιατί η

µεµβράνη τους είναι διαπερατή). Επιπλέον σε κάποια φρεάτια είχαν τοποθετηθεί

καλυπτρίδες και αφού εφαρµόστηκαν οι ίδιες συνθήκες επώασης των κυττάρων, τα

κύτταρα µονιµοποιήθηκαν και οι πυρήνες τους χρωµατίστηκαν µε Hoechst. Σε αυτή

την περίπτωση τα νεκρά κύτταρα αναγνωρίστηκαν από τον πυκνωτικό τους πυρήνα

κάτω από µικροσκόπιο φθορισµού.

2.1.6. Μέτρηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών

Στις περιπτώσεις που το διάλυµα λύσης περιείχε SDS, χρησιµοποιήθηκε η

µέθοδος BCA (bikinchromic acid, βικινχρωµικό οξύ, PIERCE). Για την πρότυπη

καµπύλη χρησιµοποιήθηκαν διαδοχικά αυξανόµενες συγκεντρώσεις BSA (2µg/µl).

Μετά από επώαση των δειγµάτων για 30min στους 37ºC, η απορρόφηση µετρήθηκε

στα 562nm.

Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Bradford (Biorad).

Η πρότυπη καµπύλη πραγµατοποιήθηκε όπως αναφέρεται και πιο πάνω, ενώ τα

δείγµατα επωάστηκαν για 5min σε θερµοκρασία δωµατίου και η απορρόφηση

µετρήθηκε στα 590nm.

52

2.1.7. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου και

ανοσοαποτύπωση κατά WESTERN

Οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωµα SDS-πολυακρυλαµιδίου 8-12%

και µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης Schleicher and Schuell, σύµφωνα µε

τις διαδικασίες που αναφέρονται στο Molecular Cloning, A Laboratory Manual

(Maniatis et al., 1989). Για τον έλεγχο της αποτελεσµατικότητας της αποτύπωσης οι

πρωτεΐνες βάφτηκαν µε Pοnseau S (0.1% σε οξικό οξύ 1%) για 30sec και ξεβάφτηκαν

µε νερό. Οι µεµβράνες επωάστηκαν σε 5% άπαχο γάλα σκόνη σε διάλυµα Western (1M

Tris pH 7.2, 0.1% Tween 20, 150mM NaCl) για 1hr σε θερµοκρασία δωµατίου ή 15hr

στους 40C.

2.1.8. Ανσοσοκατακρήµνιση του VEGFR-2, έλεγχος της τυροσινικής του

φωσφορυλίωσης και δοκιµασία ενεργότητας κινάσης

Κύτταρα, τα οποία δεν είχαν πλήρως καλύψει την επιφάνεια του τριβλίου

υποβλήθηκαν σε στέρηση ορρού (Μ199 µε 5% FCS) για 24hr και στη συνέχεια

ενεργοποιήθηκαν µε 30 ng/ml VEGF µε ή χωρίς λουτεολίνη για 5min. Τα κύτταρα στη

συνέχεια πλύθηκαν µε παγωµένο PBS το οποίο περιείχε 100nM sodium vanadate

(γνωστός αναστολέας των τυροσινικών φωσφατασών) και επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό

διάλυµα λύσης (1% CHAPS,10mM EDTA, 10% glycerol, 20mM Tris, pH7.4 και

150mM NaCl) εµπλουτισµένο µε αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών (PMSF,

Απροτινίνη, Λευκοπεπτίνη, Πεψτατίνη, ΝαF). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης των

δειγµάτων προσδιορίστηκε µε τη µέθοδο Bradford.

Για την ανοσοκατακρήµνιση του VEGFR-2 ίσα ποσά πρωτεΐνης από τα

δείγµατα επαναιωρήθηκαν αρχικά µε σφαιρίδια σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α και IgG

προερχόµενη από µη ανοσοποιηµένους κονίκλους στους 40C για 1hr. Στη συνέχεια

πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντρηση των δειγµάτων στα 10000g από όπου συλλέχθηκε το

υπερκείµενο (το ίζηµα περιείχε τα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α, την IgG που συνδέεται

µε την πρωτεΐνη Α, και µόρια ή σύµπλοκα µορίων των κυττάρων που δέθηκαν µη

ειδικά µαζί τους). Τα «καθαρά» πλέον υπερκείµενα των δειγµάτων εναιωρήθηκαν µε

ειδικό πολυκλωνικό αντίσωµα κονίκλου έναντι του VEGFR-2 στους 40C για 16hr

προκειµένου να σχηµατιστεί το σύµπλεγµα του VEGFR-2 µε το ειδικό αντίσωµα. Σε

όλα τα πειράµατα υπήρχε και ένα επιπλέον δείγµα, το οποίο επωάστηκε πάλι µε τη µη

53

ειδική ανοσοσφαιρίνη κονίκλου προκειµένου να αποκλείσουµε µη ειδική

ανοσοκατακρήµνιση του αντιγόνου. Με το πέρας της επώασης προστέθηκαν σε όλα τα

δείγµατα ίσα ποσά σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και ακολούθησε επαναιώρηση των

δειγµάτων στους 40C για άλλες 4hr προκειµένου το σύµπλεγµα αντιγόνου- να

προσδεθεί στην πρωτεΐνη Α. Στη συνέχεια τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν στις

3500rpm για 3min και το ίζηµα (πρωτεΐνη-Α, αντι-VEGFR-2, VEGFR-2) από κάθε

δείγµα πλύθηκε τρεις φορές µε διάλυµα λύσης.

Προκειµένου να ελεγχθεί το επίπεδο φωσφορυλίωσης των τυροσινών στον

υποδοχέα, τα δείγµατα εναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα Laemli και

ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (8%) και στη συνέχεια έγινε

µεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, κάλυψη των µη ειδικών

θέσεων µε 5% άπαχο γάλα και ανοσοαποτύπωση µε µονοκλωνικό αντίσωµα που

αναγνωρίζει µόνο τις φωσφορυλιωµένες τυροσίνες (διαλυµένο σε αναλογία 1/1000 σε

5%άπαχο γάλα για 15hr στους 40C) και αντι-ποντικίσιο αντίσωµα σηµασµένο µε

υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr σε θερµοκρασία

δωµατίου). Η ίση ποσότητα του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα σε όλα τα

δείγµατα επιβεβαιώθηκε µε αποµάκρυνση από τη µεµβράνη των αντιδραστηρίων

(συµπεριλαµβανοµένου του συνδεδεµένου αντισώµατος) και επανα-ανοσοαποτύπωση

µε ένα πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το VEGFR-2 (διαλυµένο σε αναλογία

1/500 σε 5%άπαχο γάλα για 15hr στους 40C) και αντίσωµα αντι-κονίκλου σηµασµένο

µε υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr σε RT).

Προκειµένου να ελεγχθεί η ενεργότητα της κινάσης του υποδοχέα τα δείγµατα

σε τελικό όγκο 25µl επανεναιωρήθηκαν σε διάλυµα 50mM HEPES pH7.4, 10mM

MnCl2, 1mM DTT και 5µCi [γ-32P]ATP για 7min σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά τα

δείγµατα επαναιωρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα Laemli και ηλεκτροφορήθηκαν σε

πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (8%). Στη συνέχεια το πήκτωµα επωάστηκε µε 2.5%

γλουταραλδεύδης για 30min, πλύθηκε δύο φορές µε 10% οξικού οξέως/40%

µεθανόλης, επωάστηκε για 1hr µε 1Μ ΚΟΗ προκειµένου να φύγει ο φωσφόρος που

ήταν συνδεδεµένος µε τις σερίνες, πλύθηκε πάλι µε διάλυµα 10% οξικού οξέως/40%

µεθανόλης και χρωµατίστηκε µε Coomassie blue. Τέλος, έγινε ξήρανση του

πηκτώµατος και αυτοραδιογραφία. Η ενζυµική ενεργότητα του υποδοχέα

αναγνωρίστηκε ως αµαύρωση της φωτογραφικής πλάκας στην περιοχή που υπήρχε ο

υποδοχέας γεγονός που σήµαινε ότι είχε πραγµατοποιηθεί πρόσδεση ραδιενεργού

φωσφόρου στις τυροσίνες του υποδοχέα µέσω αυτοφωσφορυλίωσής του.

54

Πριν την πραγµατοποίηση της δοκιµασίας της κινάσης γινόταν αφαίρεση ενός

µικρού και ίσου ποσού από κάθε δείγµα, ώστε να επιβεβαιωθεί µε τη µέθοδο της

ανοσοαποτύπωσης το ισόποσο του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα καθώς και η

ειδικότητα του αντισώµατος κατά την ανοσοκατακρήµνιση.

2.1.9. Ανοσοκατακρήµνιση της PI3K και δοκιµασία ενεργότητας της

λιπιδιακής κινάσης

Κύτταρα τα οποία δεν είχαν πλήρως καλύψει την επιφάνεια του τριβλίου

υποβλήθηκαν σε στέρηση ορρού( Μ199 µε 0.01% FCS) για 12hr και στη συνέχεια

ενεργοποιήθηκαν µε 30 ng/ml VEGF µε ή χωρίς λουτεολίνη για 5min.

Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν µε παγωµένο PBS το οποίο περιείχε

100nM βαναδιούχο νάτριο-sodium vanadate ( γνωστός αναστολέας των τυροσινικών

φωσφατασών) και επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα λύσης (1% NP-40, 50mM Tris, pH 7.5

και 150mM NaCl) εµπλουτισµένο µε αναστολείς πρωτεσών και φωσφατασών (PMSF,

Απροτινίνη, Λευκοπεπτίνη, Πεψτατίνη, ΝαF). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης των

δειγµάτων προσδιορίστηκε µε τη µέθοδο Bradford.

Για την ανοσκατακρήµνιση της PI3K ίσα ποσά πρωτεΐνης από τα δείγµατα

επαναιωρήθηκαν αρχικά µε σφαιρίδια σεφαρόζης- πρωτεΐνης Α και IgG (η τελευταία

προερχόµενη από µη ανοσοποιηµένους κονίκλους) στους 40C για 1hr. Στη συνέχεια

πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντρηση των δειγµάτων στα 10000g από όπου συλλέχθηκε το

υπερκείµενο (το ίζηµα περιείχε τα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α, την IgG που συνδέεται

µε την πρωτεΐνη Α, και µόρια ή συµπλοκα µορίων των κυττάρων που δέθηκαν µη

ειδικά µαζί τους). Τα «καθαρά» πλέον υπερκείµενα των δειγµάτων εναιωρήθηκαν µε

ειδικό πολυκλωνικό αντίσωµα κονίκλου έναντι της ρυθµιστικής υποµονάδας p85 της

PI3K στους 40C για 5hr προκειµένου να σχηµατιστεί το σύµπλεγµα αντιγόνου p85–

ειδικού αντισώµατος. Σε όλα τα πειράµατα υπήρχε και ένα επιπλέον δείγµα το οποίο

επωάστηκε πάλι µε τη µη ειδική ανοσοσφαιρίνη κονίκλου προκειµένου να

αποκλείσουµε µη ειδική ανοσοκατακρήµνιση του αντιγόνου.

Με το πέρας της επώασης προστέθηκαν σε όλα τα δείγµατα ίσα ποσά

σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και ακολούθησε νέα επαναιώρηση των δειγµάτων στους 40C

για άλλες 2hr προκειµένου το αντίσωµα όπως είναι συνδεδεµένο µε το αντιγόνο να

προσδεθεί στην πρωτεΐνη Α. Στη συνέχεια τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν στις

3500rpm για 3min και το ίζηµα (πρωτεΐνη-Α, αντι-p85, p85) από κάθε δείγµα πλύθηκε

55

δύο φορές µε ∆ιάλυµα Α (20mM Tris, pΗ 7.4, 137mM NaCl, 1mM MgCl2 1%NP-40),

δύο φορές µε 5mM Li Cl σε 0.1M Tris, pH 7.4 και δύο φορές µε ΤΝΕ (10mM Tris PH

7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, και 0.1mM Na3VO4). Όλα τα διαλύµατα ήταν

εµπλουτισµένα µε τους αναστολείς των πρωτεασών και φωσφατασών όπως αυτά

προαναφέρθηκαν.

Τέλος, για να πραγµατοποιηθεί η δοκιµασία ενεργότητας της λιπιδιακής

κινάσης της PI3K το ίζηµα από το κάθε δείγµα που αποτελούσε τα

ανοσοκατακρηµνίσµατα επαναιωρηθήκαν σε 25µl ΤΝΕ και προστέθηκε υπόστρωµα

0.2mg/ml φωσφατιδυλ-ινοσιτολ-4,5-διφωσφιδίου (PI-4,5-P2) (SIGMA) παρουσία

58µM ΑΤP, 10µCi [γ-32P]ATP (5mCi/mmol) και 14mM MgCl2 για 10min στου 370C.

H αντίδραση σταµάτησε µε την προσθήκη 100µl 1Μ HCl και 160µl

µεθανόλης:χλωροφόρµιου (1:1 κατά όγκο). Στη συνέχεια, έγινε διαχωρισµός της

οργανικής από την υδάτινη φάση µε φυγοκέντρηση και συλλέχθηκε η κατώτερη

οργανική φάση η οποία χρωµατογραφήθηκε σε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας

(Thin Layer Chromatography ΤLC) σε πήκτωµα οξαλικού πυριτίου 60 (Merck). Τα

λιπίδια των χρωµατογραφηµένων δειγµάτων έγιναν ορατά µε χρώση ιωδίου και

συγκρίθηκαν ως προς την απόσταση που διήνυσαν µε το PI-4,5-P2 που λειτούργησε ως

πρότυπο. Τέλος, πραγµατοποιήθηκε αυτοραδιογραφία µε την εφαρµογή φωτογραφικής

πλάκας στο χρωµατογράφηµα και αναγνώριση του προϊόντος PI3,4,5P3 που λόγω της

προσθήκης ραδιενεργού φωσφόρου προκάλεσε αµαύρωση στη φωτογραφική πλάκα.

Προκειµένου να ελεγχθεί η πιθανή επαγόµενη από το VEGF τυροσινική

φωσφορυλίωση της p85 υποµονάδας, αφού έγινε η επώαση των κυττάρων και η

κατακρήµνιση της p85 όπως περιγράφεται παραπάνω, τα κατακρηµνίσµατα από το

κάθε δείγµα επαναιωρήθηκαν σε τελικό όγκο 25µl σε διάλυµα ΤΝΕ 50 mM HEPES

pH7.4, 10mM MnCl2, 1mM DTT και 5µCi [γ-32P]ATP για 10min RT. Μετά τα

δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν στις 3000rpm για 4min και το ίζηµα πλύθηκε µε διάλυµα

λύσης µε αυτή τη διαδικασία τρεις φορες. Μετά την τελευταία φυγοκέντρηση το ίζηµα

από το κάθε δείγµα επαναιωρήθηκε σε ρυθµιστικό διάλυµα Laemli και

ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (8%). Στη συνέχεια η πηκτή

επωάστηκε µε 2.5% γλουταραλδεύδης για 30min, πλύθηκε δύο φορές µε διάλυµα 10%

οξικού οξέως/40% µεθανόλης, επωάστηκε για 1hr µε 1Μ ΚΟΗ προκειµένου να φύγει ο

φωσφόρος που ήταν συνδεδεµένος µε τις σερίνες, πλύθηκε πάλι µε διάλυµα 10%

οξικού οξέως/40% µεθανόλης και βάφτηκε µε Coomassie blue. Τέλος έγινε ξήρανση

της πηκτής και αυτοραδιογραφία.

56

Όταν γινόταν η εναιώρηση των ανοσοκατακρηµνισµάτων στο διάλυµα ΤΝΕ,

ένα ίσο ποσό από κάθε δείγµα αφαιρέθηκε και φυλάχτηκε προκειµένου αργότερα µε τη

µέθοδο της ανοσοαποτύπωσης. να επιβεβαιωθεί η παρουσία ίσης ποσότητας p85 σε

όλα τα δείγµατα και η απουσία p85 στο δείγµα που χρησιµοποιήθηκε η µη ειδική

ανοσοσφαιρίνη. Τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου

(10%), µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, οι µη ειδικές θέσεις καλύφθηκαν

µε 5% άπαχο γάλα και η ανοσοαποτύπωση πραγµατοποιήθηκε µε 1ο αντίσωµα ένα

πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το p85 ((διαλυµένο σε αναλογία 1/1000 σε

5%άπαχο γάλα για 15hrs στους 4C)) και 2ο ένα αντι-κονίκλου αντίσωµα σηµασµένο µε

υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr σε RT).

2.1.10. Έλεγχος της φωσφορυλίωσης των Akt, ERK1/2, p70 S6, p65 και

p38 και της έκφρασης των ΙκΒα και β

Κύτταρα υποβλήθηκαν σε στέρηση ορρού (Μ199 µε 5% FCS) για 12hr και στη

συνέχεια ενεργοποιήθηκαν µε 50ng/ml VEGF µε ή χωρίς λουτεολίνη ή ραπαµυκίνη για

15min. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν µε παγωµένο PBS και επαναιωρήθηκαν σε

ψυχρό διάλυµα λύσης (1% SDS εµπλουτισµένο µε αναστολείς πρωτεασών και

φωσφατασών). Η µέτρηση της πρωτεΐνης πραγµατοποιήθηκε µε BCA και ίσα ποσά

πρωτεΐνης από κάθε δείγµα διαχωρίστηκαν σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (12%) και

µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης.

Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση ειδικών

αντισωµάτων κονίκλου έναντι των φωσφορυλιωµένων µορφών των πρωτεϊνών Akt

(διαλυµένο 1/1000 σε 5% άπαχο γάλα), ERK1/2 (διαλυµένο 1/1000 σε 5% άπαχο

γάλα), p70 S6 κινάσης (διαλυµένο 1/500 σε 5% άπαχο γάλα), p38(διαλυµένο 1/200 σε

5% άπαχο γάλα), p65 (διαλυµένο 1/1000 σε 5% άπαχο γάλα), και αντίσωµα αντι-

κονίκλου σηµασµένο µε υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr

σε θερµοκρασία δωµατίου). Προκειµένου να επιβεβαιωθεί το ισόποσο των παραπάνω

πρωτεϊνών (φωσφορυλιωµένης και µη µορφής) πραγµατοποιούνταν αποµάκρυνση των

αντιδραστηρίων από τη µεµβράνη και επανανοσοαποτύπωση µε τη χρήση ειδικών

αντισωµάτων έναντι των πρωτεϊνών Akt, ERK1/2, p65 και p38 ( όλα διαλυµένα

1/1000 σε 5% άπαχο γάλα), και αντισωµάτων αντι-κονίκλου ή αντι-αιγός

σηµασµένων µε υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr σε

θερµοκρασία δωµατίου). Στην περίπτωση της p70 S6 κινάσης το ισόποσο της

57

πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε µε ανοσοαποτύπωση ειδικό αντίσωµα αίγας έναντι της

ακτίνης ( διαλυµένο 1/500 σε 5% άπαχο γάλα), και αντισώµατος αντι-αίγας

σηµασµένου µε υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για 1hr σε RT).

Τέλος, για τον έλεγχο της έκφρασης των ΙκΒα και ΙκΒβ χρησιµοποιήθηκαν τα

αντίστοιχα ειδικά αντισώµατα (διαλυµένα 1/500 σε 5% άπαχο γάλα), και αντίσωµα

αντι-κονίκλου σηµασµένο µε υπεροξειδάση (διαλυµένο 1/3000 σε 5% άπαχο γάλα για

1hr σε RT).

2.1.11. Tιτλοποίηση των ανασυνδυασµένων αδενοιών και µόλυνση των

κυττάρων

Οι αδενοιοί που χρησιµοποιήθηκαν έκφραζαν είτε µια µόνιµα ενεργή µορφή

της Akt (myristoylated-Akt), η οποία εντοπιζόταν µόνιµα στη µεµβράνη του κυττάρου

και η οποία διέθετε σήµανση µε ΗΑ, είτε µε β-γαλακτοσιδάση. Όλοι οι ιοί

πολλαπλασιάστηκαν σε 293 κύτταρα και ο ιικός τίτλος προσδιορίστηκε µε τη

δοκιµασία ιικής πλάκας. 293 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τριβλια έξι φρεατίων µέχρι

να καλύψουν το 80-90% της επιφάνειας του τάπητα. Στη συνέχεια γινόταν µόλυνση

των κυττάρων µε διαφορετικές αραιώσεις του κάθε ιού (εύρος από 10-2-10-6) για 4hr.

Ακολούθως γινόταν αφαίρεση του θρεπτικού υλικού από τα κύτταρα, και προσθήκη

4ml διαλύµατος αγαρόζης (20mM HEPES, 12.5mM MgCl2, 1% αγαρόζη σε πλήρες

θρεπτικό υλικό RPMI 1640) στο κάθε φρεάτιο και αφηνόταν 20min σε θερµοκρασία

δωµατίου µέχρι να πήξει. Τέλος, γινόταν προσθήκη PBS στα µεσοδιαστήµατα των

φρεατίων (προκειµένου να µην ξεραθεί η παγωµένη αγαρόζη και σπάσει), το τριβλίο

σφραγιζόταν µε parafilm και ακολουθούσε επώαση (συνθήκες). Οι ιικές πλάκες

αναπτύσσονταν µετά από µια εβδοµάδα περίπου και αναγνωρίζονταν ως µεµονωµένες

εστίες λύσης των κυττάρων. Από τον αριθµό των ιικών πλακών που αναπτύσσονταν

στα διαφορετικά φρεάτια και τα οποία αντιστοιχούσαν σε διαφορετικές αραιώσεις του

ιού υπολογιζόταν ο ιικός τίτλος (ιικά σωµάτια/µl).

Προκειµένου να µολυνθούν και να εκφράσουν την myrAkt, τα HUVE κύτταρα,

για τα διάφορα πειράµατα, καλλιεργήθηκαν σε τριβλία των έξι φρεατίων ή σε τριβλία

24 φρεατίων µε καλυπτρίδες (όταν γινόταν ανοσοφθορισµός) και επωάζονταν µε τον

ανασυνδυασµένο ιό σε αναλογία (ιικά σωµάτια/ αριθµός κυττάρων) 25 για 2hr. Μετά

τα κύτταρα πλένονταν και αφήνονταν στον επωαστηρα σε πλήρες θρεπτικό υλικό για

άλλες 30hr µέχρι να πραγµατοποιηθεί το εκάστοτε πείραµα. Η έκφραση της myrAkt

58

από τα κύτταρα ήταν σε όλα τα πειράµατα περίπου 90%, όπως αυτό φαινόταν µε

έµµεσο ανοσοφθορισµό (βλέπε παρακάτω). Για την ανίχνευση της β-γαλακτοσιδάσης,

τα µολυσµένα κύτταρα πλένονταν σε PBS, γινόταν µονιµοποίηση µε µε 3.7%

παραφορµαλδεύδη για 10min σε θερµοκρασία δωµατίου, πλύση µε PBS και επώαση

στους 370C µε ένα διάλυµα που περιείχε 5mM σιδηρικυανούχου καλίου, 1mM MgCl2,

0.002%NP40, 0.01% δεοξυχολικού νατρίου-sodium deoxycholate και 1mg/ml X-Gal

µέχρι να αναπτυχθεί το χρώµα. Έτσι τα µολυσµένα κύτταρα τα οποία εκφράζαν β-

γαλακτοσιδάση χρωµατίζονταν µπλε και αναγνωρίζονταν κάτω από το οπτικό

µικροσκόπιο.

2.1.12. Έµµεσος ανοσοφθορισµός

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες που είχαν προκαλυφθεί µε

κολλαγόνο τύπου 1 και στη συνέχεια επωάζονταν στις διάφορες συνθήκες ανάλογα µε

το σχεδιασµό του πειράµατος. Με το πέρας της επώασης γινόταν πλύση των κυττάρων

µια φορά µε PBS και στη συνέχεια µονιµοποίηση σε διάλυµα παραφορµαλδεύδης 3.7%

για 15min. Ακολουθούσε επώαση µε 50mM ΝΗ4Cl (σε PBS) για 15min για να

µειωθεί ο αυτοφθορισµος και ακολουθούσε επώαση µε Triton 0.1% (σε PBS) για 4min

προκειµένου να αυξηθεί η διαπερατότητα της µεµβράνης. Ακολούθως, γινόταν πλύση

µε PBS και επώαση µε 10% FCS (που είχε πριν υπερφυγοκεντρηθεί) για 20min

προκειµένου να καλυφθούν οι µη ειδικές αντιγονικές θέσεις. Στη συνέχεια γινόταν

επώαση των κυττάρων µε το διάλυµα του πρώτου αντισώµατος (το αντι-ki67

χρησιµοποιήθηκε µε αραίωση 1:20 σε 10%FCS, ενώ το αντι-ΗΑ χρησιµοποιήθηκε µε

αραίωση 1:100 σε 10% FCS) για 1hr. Με το πέρας της επώασης, εφόσον γινόταν

πλύση των κυττάρων µία φορά µε PBS γινόταν επώαση µε το διάλυµα του 2ου

αντισώµατος ( αντι-ποντικίσιο FITC sε αραίωση 1:200 σε διάλυµα 10%FCS) για 1hr

και ακολουθούσε πλύσιµο των κυττάρων µε PBS. Εάν σύµφωνα µε το σχεδιασµό του

πειράµατος απαιτούνταν χρώση του πυρήνα µε Hoechst τα κύτταρα επωάζονταν µε ένα

διάλυµα Hoechst 33342 (σε PBS) για 10min. Tέλος, τα κύτταρα αφού πλένονταν πάλι

µε PBS µονιµοποιούνταν µε mowiol πάνω σε αντικειµενοφόρες πλάκες. Η

µικροσκόπηση γινόταν κάτω από µικροσκόπιο φθορισµού Zeiss.

59

2.1.13. Προετοιµασία των δειγµάτων για την ανάλυση της γονιδιακής

έκφρασης µε τη χρήση της τεχνολογίας των µικροσυστοιχιών και µε

Real Time PCR

2.1.13.1. Αποµόνωση συνολικού RNA από τα HUVE κύτταρα

HUVE κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τριβλία, τα οποία είχαν επικαλυφθεί µε

κολλαγόνο τύπου Ι. Όταν τα κύτταρα κάλυπταν το 70-80% της επιφάνειας του

τριβλίου, επωάζονταν για 6hr σε θρεπτικό υλικό µειωµένου ορρού (Μ199

εµπλουτισµένο µε 5% FCS). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάζονταν για άλλες 12hr µε

VEGF (50ng/ml) µε ή χωρίς λουτεολίνη (10µΜ). Ακολούθως, τα κύτταρα συλλέγονταν

µε τρυψινοποίηση και αποµονώνονταν το συνολικό RNA από το κάθε δείγµα µε τη

βοήθεια του εµπορικού προϊόντος Rneasy Midi kit (QIAGEN). Σύµφωνα µε αυτό,

αρχικά τα κύτταρα υπέστησαν λύση σε ένα διάλυµα που περιείχε ισοθειοκυανικό

γουανίδιο (guanidine isothiocyanate, GITC) το οποίο απενεργοποιεί τις RNασες και

στη συνέχεια έγινε οµογενοποίηση µε δίοδό τους από βελόνα 18 ½ gauge. Στη

συνέχεια προστέθηκε αιθανόλη και το δείγµα τοποθετήθηκε σε µια µεµβράνη

σιλικόνης, ώστε το RNA να συνδεθεί σε αυτή. Ένα υψηλού άλατος διάλυµα επιτρέπει

µέχρι και 1mg RNA>200bp να συνδεθεί στη µεµβράνη. Τελικά το προσδεµένο RNA

απελευθερωνόταν από τη µεµβράνη µε 100µl νερό, το οποίο στερούνταν RNασών. To

κάθε δείγµα διαχωρίστηκε σε ίσους όγκους που διατηρήθηκαν στους -800C µέχρι την

χρήση τους. Προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η ανάλυση της γονιδιακη τους έκφραση

µε την τεχνολογία των DNA µικροσυστοιχιων, τα δείγµατα στάλθηκαν στο maf VIB

MicroArray Facility στο Βέλγιο.

2.1.13.2. Έλεγχος της ποσότητας και της ποιότητας του RNA

Προκειµένου αρχικά να υπολογίσουµε την ποσότητα του RNA, ίσοι όγκοι από

κάθε δείγµα φωτοµετρήθηκαν στα 260nm. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε

από τον τύπο: Συγκέντρωση RNA=40x A260xΣυντελεστή αραίωσης όπου Α260 είναι

η απορρόφηση του δείγµατος στα 260nm και συντελεστής αραίωσης είναι η αραίωση

του δείγµατος σε 1ml νερού στην γυάλινη κυβέτα φωτοµέτρησης.

60

Ως προς την αξιολόγηση της ποιότητας του RNA το κάθε δείγµα

φωτοµετρήθηκε στα 260nm και 280nm και υπολογίστηκε ο λόγος Α260/Α280, ο

οποίος έπρεπε να είναι 1.8-2.1, ώστε να θεωρηθεί το αποµονωµένο RNA υψηλής

ποιότητας.

Τέλος, πραγµατοποιήθηκε και ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων σε πηκτή

αγαρόζης (1.2% αγαρόζη, 0.02Μ ΜΟΡS, 6% Φορµαλδεύδη) και σε διάλυµα

ηλεκτροφόρησης (0.02M MOPS, 6%Φορµαλδεύδη). 5µg RNA από κάθε δείγµα

ηλεκτροφορήθηκαν αφού προετοιµάστηκαν σε διάλυµα (44% Φορµαµίδιο, 5.8%

φορµαλδεΰδη, 0.025 Μ MOPS, Bromo Phenol Blue) και θερµάνθηκαν στους 650C για

5min. Φωτογραφία των RNA ελήφθηκε κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία.

2.1.13.3. Ποσοτική αντίδραση πολυµεράσης PCR

Η µέθοδος της PCR ανάστροφης µεταγραφάσης πραγµατικού χρόνου (Real

Time Reverse Transcriptase PCR) επιτυγχάνει υπολογισµό της συγκέντρωσης του

RNA ενός συγκεκριµένου γονιδίου σε ένα δείγµα. Ουσιαστικά περιλαµβάνει τα

ακόλουθα στάδια τα οποία µπορούν να πραγµατοποιηθούν σε ένα βήµα:

Α.Μετατροπή του RNA του δείγµατος σε cDNA µε τη βοήθεια µιας ειδικής

ανάστροφης µεταγραφάσης, η οποία έχει και δράση DNA πολυµεράσης (Tth DNA

polymerase).

Β. Πολλαπλασιασµός του τµήµατος του DNA που αντιστοιχεί στο συγκεκριµένο

γονίδιο µε τη χρήση α) των κατάλληλων εκκινητών σύµφωνα µε τις αρχές της απλής

αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (polymerase chain reaction PCR) και β) της

χρωστικής SyBR Green I προκειµένου να επιτευχθεί ποσοτικοποίηση (Εικ8).

Σύµφωνα µε την αλληλουχία του DNA που αντιστοιχεί στο τµήµα που θέλουµε

να πολλαπλασιαστεί, γίνεται ο σχεδιασµός δυο συνθετικών DNA ολιγονουκλεοτιδιων,

το καθένα από τα οποία είναι συµπληρωµατικό µε την αλληλουχία ενός κλώνου της

δίκλωνης έλικας του DNA στα δύο αντίθετα άκρα της επιλεγµένης περιοχής. Τα

συγκεκριµένα ολιγονουκλεοτίδια λειτουργούν ως εκκινητές για in vitro σύνθεση του

DNA (που διεκπεραιώνεται από µία DNA πολυµεράση) και καθορίζουν το τµήµα του

DNA που θα πολλαπλασιαστεί. Η PCR ξεκινά µε ένα δίκλωνο µόριο DNA και κάθε

κύκλος της αντίδρασης αρχίζει µε µια βραχεία θέρµανση, ώστε να διαχωριστούν οι δύο

κλώνοι (στάδιο 1-στάδιο αποδιάταξης-denaturation). Μετά το διαχωρισµό των κλώνων,

η θερµοκρασία του µείγµατος της αντίδρασης ελαττώνεται, οπότε οι εκκινητές που

61

βρίσκονται σε µεγάλη περίσσεια µπορεί να υβριδιστούν µε τις συµπληρωµατικές προς

αυτούς αλληλουχίες στους δύο κλώνους του DNA (στάδιο 2-στάδιο πρόσδεσης-

annealing). Στη συνέχεια το µείγµα επωάζεται µε τη DNA πολυµεράση και τα τέσσερα

τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια, οπότε συντίθεται DNA αρχίζοντας από τους

δύο εκκινητές (στάδιο 3- στάδιο επιµήκυνσης-elongation). Κατόπιν ο κύκλος ξεκινά

πάλι από το στάδιο 1 και τα νεοσυντεθειµένα κλάσµατα λειτουργούν µε τη σειρά τους

ως εκµαγεία. Για µια επιτυχή ποσοτική αύξηση του DNA απαιτούνται 20-30 κύκλοι.

Προκειµένου να πραγµατοποιηθεί ποσοτικοποίηση του πολλαπλασιαζόµενου

τµήµατος του cDNA που αντιστοιχεί στο αρχικό RNA και αφορά το συγκεκριµένο

γονίδιο χρησιµοποιείται η χρωστική SyBR Green I, η οποία έχει την ιδιότητα να

συνδέεται µόνο στο δίκλωνο DNA (dsDNA), οπότε και φθoρίζει. Κατά το πρώτο

στάδιο της PCR επειδή το DNA είναι µονόκλωνο, η χρωστική δεν δένεται µε το DNA

και έτσι ο φθορισµός είναι χαµηλός. Κατά τη διάρκεια της πρόσδεσης των εκκινητών

στο DNA υπάρχουν µικρά τµήµατα δίκλωνου DNA στα οποία συνδέεται η SyBR

Green I και καθώς αυξάνεται το δίκλωνο DNA κατά το στάδιο της επιµήκυνσης

αυξάνεται και το ποσό πρόσδεσής της και κατ΄αυτό τον τρόπο και ο φθορισµός. Κατά

το τέλος δε αυτού του σταδίου το ποσό του δίκλωνου DNA είναι το µέγιστο το ίδιο και

ο φθορισµός. Γι’αυτό το λόγο η καταγραφή του γίνεται κάθε φορά στο τέλος του

σταδίου επιµήκυνσης και αυξανόµενα ποσά PCR προϊόντος µπορούν να

καταγράφονται από κύκλο σε κύκλο. Ο κύκλος στον οποίο παρατηρείται έναρξη της

αύξησης του φθορισµού εξαρτάται από την αρχική συγκέντρωση της αλληλουχίας

στόχου. Χρησιµοποιώντας λοιπόν κάποιος γνωστές συγκεντρώσεις αρχικού RNA

µπορεί να σχεδιάσει µια πρότυπη καµπύλη φθορισµός = α Χ log(συγκέντρωσης) και

από αυτή την καµπύλη να υπολογιστεί και η συγκέντρωση του συγκεκριµένου RNA

στο προς εξέταση δείγµα. Στο τέλος της αντίδρασης καταγράφεται η µείωση του

φθορισµού καθώς το δείγµα θερµαίνεται και οι έλικες του DNA ανοίγουν. Με αυτό τον

τρόπο σχεδιάζεται η καµπύλη τήξης η οποία είναι χαρακτηριστική για το κάθε προϊόν.

Με αυτό τον τρόπο καθορίζεται η ειδικότητα του προϊόντος.

62

Εικόνα 8

Η µέθοδος της PCR ανάστροφης µεταγραφάσης πραγµατικού χρόνου(www.roche-

applied-science.com/lightcycler) Η εφαρµογή της χρωστικής SyBR Green I (αριστερά) και η ποσοτικοποίηση του αποτελέσµατος (δεξιά)

Με βάση την ανωτέρω διαδικασία ελέγχθηκε η έκφραση των γονιδίων σε RNA

που αποµονώθηκε από κύτταρα που επωάστηκαν µε τις συνθήκες που αναφέρονται

παραπάνω (βλέπε DNA µικροσυστοιχίες). Συγκεκριµένα, αρχικά σχεδιάστηκαν οι

εκκινητές µε τη βοήθεια του λογισµικού DnaStar και η σύνθεσή τους έγινε στην MWG

(Γερµανια). Αντιπροσωπευτικά φαίνονται πιο κάτω οι εκκινητές όπως σχεδιάστηκαν

για δύο γονίδια την ORP150 και την α2-µακροσφαιρίνη. Στη συνέχεια προκειµένου να

πραγµατοποιηθεί η Real Time-RT PCR χρησιµοποιήθηκε το εµπορικό προϊόν

LightCycler-RNA Master SYBR Green I kit (Roche). Έτσι, σε έναν τελικό όγκο 20µl

υπήρχαν 100 ή 50ng RNA από το υπό εξέταση δείγµα, 0.3µΜ από τον κάθε εκκινητή,

Τth DNA πολυµεράση (η οποία έχει δράση ανάστροφης µεταγραφάσης και DNA

πολυµεράσης), µείγµα δεοξυριβονουκλεοτίδιων, SyBR Green I, 3.75mM Mn(OAc)2.

Για την παρασκευή της πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικές

συγκεντρώσεις RNA (από 50-600ng) προερχόµενο από µη ενεργοποιηµένα HUVE

κύτταρα. Οι συνθήκες θερµοκρασίας και χρόνου για το κάθε στάδιο για τα δύο γονίδια

σχεδιάστηκαν όπως φαίνονται στον πίνακα και η αντίδραση πραγµατοποιήθηκε στο

LightCycler (Roche). Με το πέρας της αντίδρασης γινόταν ηλεκτροφόρηση του

63

προϊόντος σε πηχτή αγαρόζης µε πρότυπα µεγέθη DNA ώστε να επιβεβαιωθεί το

µέγεθος.

Oι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για τον ποσοτικό έλεγχο

της έκφρασης της ΟRP150 και της α2-µακροσφαιρίνης:

ORP150 (Oxygen regulated protein)

1. 5’-TCT CCT CCC CAG CCC CAC TCC-3’

2. 5’-ACT CCC CGG CAA CCT GAT ACC C-3’

Α2-µακροσφαιρίνη (alpha2-macroglobulin)

1. 5’-TCA ACA ATG CCA TAA AGG GAG GAG-3’

2. 5’-TGC GGA CAA CAG GGT GAG TGA-3’

Συνθήκες της αντίδρασης ΟRP150 α2-µακροσφαιρίνη

1o στάδιο (άνοιγµα της

διπλής έλικας) 950C για 5sec 950C για 5sec

2ο στάδιο (πρόσδεσης των

εκκινητών) 610C για 5sec 550C για 5sec

2ο στάδιο (επιµήκυνσης του

προϊόντος) 720C για 8sec 720C για 5sec

Η αντίδραση της Real Time RT PCR πραγµατοποιήθηκε και στις δυο περιπτώσεις

σε 35 κύκλους ενώ η θερµοκρασία τήξης προκειµένου να ελέγξουµε την ειδικότητα

του προϊόντος τέθηκε στους 650C για την περίπτωση της α2-µακροσφαιρίνης και 710C

για την ORP150.

2.1.13.4. H τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιων

H τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιων κάνει εφικτό τον έλεγχο της

διαφορικής γονιδιακής έκφρασης σε δύο δείγµατα RNA ανάµεσα σε έναν µεγάλο

αριθµό γονιδίων µε ένα και µόνο πείραµα.

64

Εικόνα 9

H τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιων

(www.fao.org/DOCREP/003/ X6884E/x6884e03.htm) Η διαδικασία ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης των δειγµάτων RNA µε την τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιών.

Συνοπτικά η τεχνολογία συνίσταται στην ακινητοποίηση ενός µεγάλου αριθµού

τµηµάτων DNA (της τάξης των χιλιάδων) κάθε ένα από τα οποία αντιστοιχεί σε ένα

συγκεκριµένο γονίδιο σε µια µικρή επιφάνεια το ένα δίπλα στο άλλο µε τη βοήθεια της

ροµποτικής. Τα δύο δείγµατα RNA. των οποίων η γονιδιακή έκφραση θα συγκριθεί,

αφού µετατραπούν µε την ανάστροφη µεταγραφάση σε cDNA, σηµαίνονται µε τα

φλουροχρώµατα Cye3 (πράσινο) το ένα και Cye5 (κόκκινο) το άλλο αντίστοιχα. Στη

συνέχεια ίσες ποσότητες από το κάθε ένα, αφήνονται κάτω από κατάλληλες συνθήκες

να υβριδοποιηθούν πάνω στην επιφάνεια µε τα ακινητοποιηµένα τµήµατα DNA.

Κατ’αυτό τον τρόπο ανάλογα µε την ποσοτική σχέση της έκφρασης ενός γονιδίου στα

65

δύο δείγµατα, στο σηµείο της επιφάνειας που αντιστοιχεί σε αυτό το γονίδιο, η

υβριδοποίηση θα προκαλέσει έκλυση φωτός συγκεκριµένου φάσµατος, το οποίο στη

συνέχεια ανιχνεύεται, καταγράφεται και µε τις κατάλληλες οµαλοποιήσεις

υπολογίζεται ο λόγος της συγκέντρωσης του RNA για το κάθε γονίδιο στο ένα δείγµα

σε σχέση µε το άλλο (Εικ9).

66

2.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF

νεοαγγείωση στον κερατοειδή κονίκλου

Σε προηγούµενη µελέτη είχε δειχθεί ότι η λουτεολίνη αναστέλλει τον

πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αγγειογένεση in vitro (Fotsis et

al., 1997).

Εικόνα 10

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF νεοαγγείωση στον κερατοειδή κονίκλου Α-Β. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες εµφυτευµάτων (σηµειώνονται µε βέλη) τοποθετηµένων στον κερατοειδή κονίκλου (7Η ηµέρα παρατήρησης) Α. 200ng VEGF B. 200ng VEGF και 0.5µg λουτεολίνης. Γ. Η αγγειογενετική απόκριση για κάθε συνθήκη απεικονίζεται σε σχέση µε το χρόνο (ηµέρες). VEGF ( ), VEGF µε λουτεολίνη ( ), λουτεολίνη ( ). Αγγειογενετική απόκριση=αριθµός των αγγείων x απόσταση των αγγείων από το limbus. p<0.05 σε σχέση µε την επαγόµενη από το VEGF αγγειογενετική απόκριση (U Mann Whitney test).

Προκειµένου να διερευνήσουµε την πιθανότητα η λουτεολίνη να αναστέλλει

την αγγειογένεση in vivo, χρησιµοποιήσαµε το µοντέλο αγγειογένεσης σε κερατοειδή

67

κονίκλου. Αρχικά χρησιµοποιήθηκαν εµφυτεύµατα, τα οποία περιείχαν 1µg

λουτεολίνης και δεν παρατηρήθηκε στον κερατοειδή µακροσκοπικά κάποια φλεγµονή

ή νεοαγγείωση. Στη συνέχεια χρησιµοποιήθηκαν εµφυτεύµατα που περιείχαν VEGF

(200ng), τα οποία προκάλεσαν ισχυρή αγγειογενετική αντίδραση (Εικ 10Α), ενώ

εµφυτεύµατα, τα οποία συµπεριείχαν VEGF (200ng) µε 0.5µg λουτεολίνης,

προκάλεσαν καταστολή της αγγειογενετικής απόκρισης (Εικ 10Β). Η αναστολή της

αγγειογένεσης στον κερατοειδή από τη λουτεολίνη ήταν στατιστικώς σηµαντική για

όλα τα χρονικά σηµεία. που ελέγχθηκαν (Εικ 10Γ ).

2.2.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει τις επαγόµενες από το VEGF

αγγειογενετικές αποκρίσεις του ενδοθηλιακού κυττάρου (επιβίωση,

πολλαπλασιασµός)

2.2.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF

επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων

Αρχικά θελήσαµε να διερευνήσουµε την πιθανή ανασταλτική δράση της

λουτεολίνης στην επαγόµενη από το VEGF επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων.

Απώλεια ορού είναι γνωστό, ότι προκαλεί απόπτωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, η

οποία αναστέλλεται, όταν αυτά ενεργοποιηθούν µε VEGF.

Όταν HUVE κύτταρα στερήθηκαν ορού (5%FCS ) για 15hr, αρκετά από αυτά

εισήλθαν σε διαδικασία απόπτωσης όπως φάνηκε από την χαρακτηριστική τους

µορφολογία κάτω από το µικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως και τη χρώση των πυρήνων

τους µε TUNEL κάτω από το µικροσκόπιο φθορισµού (Εικ11Α). Ενεργοποίηση των

κυττάρων µε VEGF προκάλεσε µείωση των αποπτωτικών κυττάρων, ενώ συνεπώαση

των κυττάρων µε VEGF και λουτεολίνη 50µΜ επανέφερε την εικόνα των αποπτωτικών

κυττάρων (Εικ 11Β).

Το ίδιο αποτέλεσµα προέκυψε όταν χρησιµοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα

προερχόµενα από αµφιβληστροειδή βοός (BRECs) (Εικ 12) Από τα ανωτέρω

αποτελέσµατα φαίνεται ότι η λουτεολίνη αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη

επιβίωση στους δυο διαφορετικούς τύπους ενδοθηλιακών κύτταρων που ελέγχθηκαν.

68

Εικόνα 11

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF επιβίωση στα HUVE κύτταρα Α-Β. Αντιπροσωπευτικές εικόνες από κύτταρα που υπέστησαν στέρηση ορού χωρίς ενεργοποίηση (Α) ή επωάστηκαν µε VEGF και λουτεολίνη (Β). Οι Αi και Βi αποτελούν φωτογραφίες που ελήφθησαν από µικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως. Οι Αii και Βii είναι οι ίδιες περιοχές όπως φαίνονται µε τη χρώση TUNEL από το µικροσκόπιο φθορισµού (οι αποπτωτικοί πυρήνες διακρίνονται πράσινοι). Οι Αiii και Βiii αποτελούν επιπροβολή των i και ii αντίστοιχα.

Εικόνα 12

Η λουτεολίνη αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη επιβίωση στα BRE κύτταρα Α-Γ Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες ληφθείσες µε µικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως από BRE κύτταρα τα οποία υπό στέρηση ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι λουτεολίνης 50µΜ όπως αναγράφεται πάνω στις αντίστοιχες εικόνες. (τα αποπτωτικά κύτταρα δείχνονται µε λευκά βέλη)

Προκειµένου να ποσοτικοποιηθεί το αντιεπιβιωτικό αποτέλεσµα της

λουτεολίνης, κύτταρα που στερήθηκαν ορού (5%FCS), επωάστηκαν µε VEGF

69

παρουσία ή όχι 10µΜ λουτεολίνης και αναλύθηκαν µε κυτταροµετρία ροής (Εικ13). Η

στέρηση ορού προκάλεσε απόπτωση στα κύτταρα, τα οποία διακρίνονται ως

υποδιπλοειδικός πληθυσµός που αντιστοιχεί στην υπο-G1 φάση στην κυτταροµετρία

ροής (Εικ13 Α). Επώαση µε VEGF για 15hr µείωσε τα αποπτωτικά κύτταρα κατά 50%

(Εικ13 Β), ενώ συνεπώαση µε 10µΜ λουτεολίνης ανέστειλε κατά 100% την

προστατευτική δράση του VEGF, φέρνοντας το ποσοστό των νεκρών κυττάρων σε

επίπεδα περίπου ίδια µε το αρχικό (Εικ13 Γ). Επώαση των κυττάρων µόνο µε

λουτεολίνη δεν προκάλεσε καµιά αλλαγή στο αρχικό ποσοστό του αποπτωτικού

πληθυσµού (Εικ13 ∆), αποκλείοντας έτσι την πιθανότητα τοξικής δράσης της

λουτεολίνης per se.

Εικόνα 13

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων Α-∆. HUVE κύτταρα επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι λουτεολίνης 10µΜ (όπως αναγράφεται πάνω στις εικόνες) για 15hr και στη συνέχεια έγινε χρώση µε ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση µε κυτταροµετρία ροής. Ο υποπλοιδικός–αποπτωτικος πληθυσµός σηµειώνεται µε Μ1. Οι εικόνες Α-∆ είναι αντιπροσωπευτικό αποτέλεσµα του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε πέντε ανεξάρτητες φορές. PI: ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodine).

Προκειµένου επίσης να διερευνήσουµε τη σχέση της συγκέντρωσης της

λουτεολίνης µε το ανασταλτικό αποτέλεσµα στην επαγόµενη από το VEGF επιβίωση,

επαναλάβαµε την ίδια πειραµατική διαδικασία χρησιµοποιώντας διαφορετικές

70

συγκεντρώσεις λουτεολίνης και όπως φαίνεται στην Εικ14, η δράση της είναι

δοσοεξαρτώµενη. Έτσι παρουσία 50µΜ και 10µΜ λουτεολίνης υπήρχε αναστολή

περίπου κατά 100% της VEGF επαγόµενης επιβίωσης, η οποία είχε δοσοεξαρτώµενο

χαρακτήρα.

Εικόνα 14

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF επιβίωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα µε δοσοεξαρτώµενο τρόπο. Το ποσοστό των κύτταρων που επιβίωσε λόγω του VEGF παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης υπολογίστηκε σύµφωνα µε τον τύπο (α-β/β)x100 (α=το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης, β=το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων παρουσία VEGF και των αντιστοίχων συγκεντρώσεων λουτεολίνης). Η Εικ14 αποτελεί αντιπροσωπευτικό αποτέλεσµα του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές. *p<0.001 σε σχέση µε τον µάρτυρα (κύτταρα ενεργοποιηµένα µόνο µε VEGF).

2.2.2.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει τον επαγόµενο από το VEGF

πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων

Προκειµένου να διερευνήσουµε την πιθανή ανασταλτική δράση της

λουτεολίνης στον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό, ενδοθηλιακά κύτταρα

στερήθηκαν ορού (5%FCS) και στη συνέχεια επωάστηκαν µε VEGF για 6hr παρουσία

ή όχι διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης. Τα κύτταρα που πολλαπλασιαζόταν

αναγνωρίστηκαν ως θετικά στην παρουσία του αντιγόνου ki67, το οποίο είναι γνωστό

ότι εκφράζεται µόνο στα κύτταρα που βρίσκονται στις ενεργείς φάσεις του κυτταρικού

κύκλου και όχι στη Go. Κατ’ αυτό τον τρόπο το ποσοστό των κυττάρων που βρισκόταν

σε διαδικασία πολλαπλασιασµού υπολογίστηκε από τον αριθµό των πυρήνων που ήταν

θετικοί στο ki67 σε σχέση µε το συνολικό αριθµό τους (όπως αυτοί φαινόταν από τη

71

χρώση Hoechst). Πυρήνες που φαινόταν αποπτωτικοί µε τη χρώση Hoechst,

εξαιρέθηκαν από την αρίθµηση.

Όπως λοιπόν φαίνεται στη Εικ15, ο VEGF διπλασίασε το ποσοστό των

πολλαπλαζόµενων κυττάρων σε σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα. Συνεπώαση

των κυττάρων µε VEGF και διάφορες συγκεντρώσεις λουτεολίνης οδήγησε σε

αναστολή του πολλαπλασιασµού των κυττάρων, η οποία ήταν δοσοεξαρτώµενη. Έτσι

10µΜ και 50 µΜ λουτεολίνης ήταν ικανά να αναστείλουν κατά 100% τον από το

VEGF προκαλούµενο πολλαπλασιασµό ενώ το 1µΜ δεν είχε καµία δράση.

Εικόνα 15

Η λουτεολίνη αναστέλλει τον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων Κύτταρα HUVE που είχαν υποστεί στέρηση ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης για 6 hr και τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονταν, αναγνωρίστηκαν από την έκφραση του ki67. Οι πυρήνες χρωµατίστηκαν µε Hoechst και καταµετρήθηκαν. Το ποσοστό των πολλαπλασιαζόµενων κυττάρων υπολογίστηκε ως: (αριθµός των kid67 θετικών κυττάρων/αριθµό των κυττάρων µε µη αποπτωτικό πυρήνα) x 100. Οι τιµές αφορούν το µέσο όρο (+/- σταθερά απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. *p<0.001 2.2.3. Η επίδραση της λουτεολίνης στην επαγόµενη από το VEGF

µεταγωγή του σήµατος στα ενδοθηλιακά κύτταρα

72

2.2.3.1. Η επίδραση της λουτεολίνης στους επαγόµενους από το VEGF

µοριακούς µηχανισµούς µεταγωγής του σήµατος που σχετίζονται µε

την επιβίωση 2.2.3.1.1. Η επίδραση της λουτεολίνης στην ενεργοποίηση του VEGFR2 2.2.3.1.1.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF

τυροσινική φωσφορυλίωση του VEGFR2

Προκειµένου να αναγνωρίσουµε το ακριβές µοριακό επίπεδο στο οποίο η

λουτεολίνη αναστέλλει τη µεταγωγή του σήµατος από το VEGF, ελέγξαµε την πιθανή

ανασταλτική της δράση στην επαγόµενη από το VEGF τυροσινική φωσφορυλίωση του

VEGFR2. Ο VEGFR2 παίζει ουσιαστικό ρόλο στη µεταγωγή του σήµατος του VEGF

που αφορά την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων (βλέπε

εισαγωγή).

Ενεργοποίηση των κυττάρων που πριν είχαν υποστεί στέρηση ορού µε VEGF

για 5min, αύξησε την τυροσινική φωσφορυλίωση του VEGFR2 όπως αυτό φάνηκε

µετά από ανοσοκατακατακρήµνιση του υποδοχέα και ανοσοαποτύπωση µε ειδικό

αντιφωσφοτυροσινικό αντίσωµα (Εικ16α 2η ζώνη). Συνεπώαση µε VEGF και

λουτεολίνη (50µΜ) έδειξε µόνο µερική αναστολή (Εικ16α 3η ζώνη), ενώ επώαση µόνο

µε λουτεολίνη δεν επέφερε καµία αλλαγή στην τυροσινική φωσφορυλίωση του

υποδοχέα σε σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα. (Εικ16α 4η ζώνη).

Προκειµένου τέλος να ποσοτικοποιηθεί αυτό το αποτέλεσµα, έγινε

πυκνοµέτρηση της ζώνης του φωσφορυλιωµένου υποδοχέα για το κάθε δείγµα

(Εικ16α) µε το πρόγραµµα Gel Analyzer1. H εκάστοτε τιµή οµαλοποιήθηκε µε την

τιµή που προέκυπτε από την πυκνοµέτρηση της αντίστοιχης µε το ποσό του

ανοσοκαταβυθισµένου VEGFR2 ζώνης, στην κάθε περίπτωση (Εικ 16β). Οι

οµαλοποιηµένες τιµές φαίνονται σε ιστόγραµµα (Εικ16).

73

Εικόνα 16

Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF τυροσινική φωσφορυλίωση του VEGFR2 Κύτταρα HUVE που είχαν υποστεί στέρηση ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι λουτεολίνης για 5min. Ο VEGFR-2 ανοσοκατακρηµνίστηκε και το επίπεδο της τυροσινικής φωσφορυλίωσης ελέγχθηκε µε ειδικό αντιφωσφοτυροσινικό αντίσωµα (α). Το ίσο ποσό του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα σε όλα τα δείγµατα επιβεβαιώθηκε µε ανάλυση κατά Western και τη χρήση ειδικού αντι-VEGFR-2 αντισώµατος.(β) Το αποτέλεσµα της Εικ16 είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε 4 ανεξάρτητες φορές. Στο ιστόγραµµα φαίνονται οι τιµές πυκνοµετρησης της ζώνης του φωσφορυλιωµένου υποδοχέα για το κάθε δείγµα οµαλοποιηµένες µε τις τιµές πυκνοµέτρησης της αντίστοιχης ζώνης του ανοσοκαταβυθισµένου υποδοχέα.

2.2.3.1.1.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF

ενεργοποίηση του VEGFR2

Όταν ο VEGFR2 προσδένεται µε τον VEGF διµερίζεται και πραγµατοποιείται

αυτοφωσφορυλίωση του.(βλέπε εισαγωγή). Προκειµένου λοιπόν να ελέγξουµε µια

πιθανή ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην ενζυµατική ενεργότητα του

VEGFR2, HUVE κύτταρα που είχαν υποστεί στέρηση ορού, ενεργοποιήθηκαν µε

VEGF για 5min µε ή χωρίς λουτεολίνη (50µΜ και 10µΜ). Στη συνέχεια ο υποδοχέας

ανοσοκατακρηµνίστηκε µε τη χρήση ειδικού αντισώµατος και ελέγχθηκε η ικανότητά

74

του να αυτοφωσφορυλιώνεται µε µια δοκιµασία in vitro κινάσης, µετά την προσθήκη 32P.

Oπως λοιπόν φαίνεται στην Εικ17Α 2η ζώνη και στην Εικ17Β 2η ζώνη, η

επώαση µε VEGF οδήγησε σε αύξηση της αυτοφωσφορυλίωσης µιας ζώνης µεγέθους

230kDa που αντιστοιχεί στον υποδοχέα και εκφράζει την ενζυµατική του ενεργότητα.

Συνεπώαση µε VEGF και 50µΜ και 10µΜ λουτεολίνης οδήγησε σε µια µερική

αναστολή της αυτοφωσφορυλίωσης του VEGFR2 στην πρώτη περίπτωση (Εικ17Α 3η

ζώνη) και καµία αναστολή στη δεύτερη περίπτωση (Εικ17Β 3η ζώνη). Επίσης, επώαση

µόνο µε 50µΜ λουτεολίνη δεν είχε καµία επίδραση στην ενζυµατική ενεργότητα του

VEGFR2 (Εικ17Β ζώνη 4η). Το ποσό του VEGFR2 που αντιστοιχούσε στην κάθε

ανοσοκατακρήµνιση φαίνεται µε ζώνες Εικ17.

Για να ποσοτικοποιηθούν τα παραπάνω αποτελέσµατα έγινε πυκνοµέτρηση της

αυτοφωσφορυλιωµένης ζώνης του υποδοχέα για το κάθε δείγµα µε τη βοήθεια του

προγράµµατος Gel Analyzer1. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε οµαλοποίηση της µε

την τιµή που προέκυπτε από την πυκνοµέτρηση της αντίστοιχης σε κάθε περίπτωση

ζώνης του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα. Οι οµαλοποιηµένες τιµές που

προέκυψαν φαίνονται στο ιστόγραµµα της Εικ17.

75

Εικόνα 17

Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF ενεργοποίηση του VEGFR2 Α-Β.HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι λουτεολίνης 50µΜ (Α) και 10µΜ (Β) για 5min. Ο VEGFR-2 ανοσοκατακρηµνίστηκε και η ενεργότητα της τυροσινικής κινάσης που διαθέτει, ελέγχθηκε µε δοκιµασία in vitro κινάσης (Αα,Βα). Το ισόποσο του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα σε όλα τα δείγµατα επιβεβαιώθηκε µε ανάλυση κατά Western και τη χρήση ειδικού αντι-VEGFR-2 αντισώµατος(Αβ, Ββ). Το αποτέλεσµα της Εικ17 είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε 4 ανεξάρτητες φορές. Σε ιστόγραµµα φαίνονται οι τιµές πυκνοµέτρησης της κάθε ζώνης του φωσφορυλιωµένου υποδοχέα οµαλοποιηµένες µε τις τιµές πυκνοµετρησης της αντίστοιχης ζώνης του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα.

Επειδή όµως υπήρχε περίπτωση η λουτεολίνη να µην κατακρηµνίζεται κατά τη

διάρκεια της ανοσοκατακρήµνισης και έτσι η τελική συγκέντρωσή της να είναι µικρή

στην δοκιµασία της in vitro κινάσης, επαναλάβαµε την ίδια διαδικασία αφού την

τροποποιήσαµε. Σε αυτή την περίπτωση η λουτεολίνη δεν επωάστηκε µε τα κύτταρα,

αλλά προστέθηκε στον ενεργοποιηµένο από το VEGF ανοσοκατακρηµνισµένο

υποδοχέα αµέσως πριν λάβει χώρα η δοκιµασία της in vitro κινάσης. Όπως λοιπόν

φαίνεται στη Εικ18, η λουτεολίνη στα 50µΜ ανέστειλε ισχυρότερα την ενζυµατική

ενεργότητα του υποδοχέα (Εικ18 ζώνη 3η). Παρ’όλα αυτά η λουτεολίνη στα 10µΜ

εξακολουθούσε να µην έχει δράση. (Εικ18 ζώνη 4η). Οι τιµές από την πυκνοµέτρηση

της κάθε ζώνης εκφράστηκαν σε σχέση µε την τιµή της ζώνης στα µη ενεργοποιηµένα

κύτταρα (µάρτυρας) µε τη µορφή ιστογράµµατος Εικ18.

Από τα παραπάνω αποτελέσµατα γίνεται εµφανές πως η λουτεολίνη µπορεί να

αναστείλει µερικώς την ενεργοποίηση του υποδοχέα στα 50µΜ, ενώ δεν παρουσιάζει

ανασταλτική δράση στα 10µΜ. Η τελευταία συγκέντρωση όµως είναι ικανή να

αναστείλει κατά 100% τις επαγόµενες από το VEGF βιολογικές δράσεις στα

ενδοθηλιακά κύτταρα (επιβίωση και πολλαπλασιασµός) (βλέπε παραπάνω).

76

Εικόνα 18

Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF ενεργοποίηση του VEGFR2 HUVE κύτταρα που είχαν υποστεί στέρηση ορού, επωάστηκαν µε VEGF για 5min. Ο VEGFR-2 ανοσοκατακρηµνίστηκε, όπως περιγράφτηκε προηγουµένως. Το ποσό του ανοσοκατακρηµνισµένου υποδοχέα από τα ενεργοποιηµένα µε VEGF κύτταρα µοιράστηκε σε τρία ισόποσα τµήµατα και στο κάθε ένα προστέθηκε 10µΜ, 50µΜ λουτεολίνης και DEMOS/EtΟΗ (ο διαλύτης για τη λουτεολίνη) αντίστοιχα. Ακολούθως πραγµατοποιήθηκε δοκιµασία in vitro κινάσης. Στην εικόνα φαίνεται µια αντιπροσωπευτική αυτοραδιογραφία και οι τιµές πυκνοµέτρησης της κάθε ζώνης του φωσφορυλιωµένου υποδοχέα σε σχέση µε το µάρτυρα. 2.2.3.1.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει την µεταγωγή του σήµατος του VEGF

στην PI3K/Akt οδό 2.2.3.1.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη φωσφορυλίωση

της Akt

77

Από τη στιγµή που η λουτεολίνη µπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση

του VEGFR2 σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από αυτές που ανέστειλαν την επαγόµενη

από το VEGF επιβίωση και πολλαπλασιασµό, αναζητήσαµε άλλα µόρια στόχους στη

µεταγωγή του σήµατος από το VEGF που θα µπορούσαν να ερµηνεύσουν την

ανασταλτική της δράση στην επιβίωση.

Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία (βλέπε εισαγωγή) ότι ο VEGF επάγει την

επιβίωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα κυρίως µέσω ενεργοποίησης της Akt. Για να

ελέγξουµε τη δράση της λουτεολίνης στην ενεργοποίηση της Akt, τα κύτταρα, αφού

πρώτα υπέστησαν στέρηση ορού, ενεργοποιήθηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι

λουτεολίνης (50µΜ και 10µΜ) για 15min. Όπως φαίνεται στη Εικ19, ο VEGF

προκάλεσε αύξηση του ποσού της φωσφορυλιωµένης Akt (S473) (Εικ19 ζώνη 2η και

6η). Συνεπώαση µε 50µΜ ή 10µΜ λουτεολίνης οδήγησε σε πλήρη αναστολή της

φωσφορυλίωσης της Akt που είναι σηµαντική για την ενεργότητά της (Εικ19 ζώνη 7η

και ζώνη 3η αντίστοιχα). Στην Εικ19 φαίνεται επίσης το συνολικό ποσό της Akt για την

κάθε περίπτωση.

Εικόνα 19

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση της Akt HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι 50µΜ και 10µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-φωσφοAkt και αντιAkt αντισώµατα. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

2.2.3.1.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF ενεργοποίηση της

PI3-κινάσης

Από τη στιγµή που η λουτεολίνη ανέστειλε τη φωσφορυλίωση της Akt,

ερευνήσαµε τη δράση της στην επαγόµενη από το VEGF ενεργοποίηση της PI3-

78

κινάσης (ΡΙ3Κ). Η PI3Κ είναι µια λιπιδική κινάση, η οποία προκαλεί τη µεταφορά της

Akt στην κυτταρική µεµβράνη και την ενεργοποίησή της (Chan et al., 1999).

Εικόνα 20

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF ενεργοποίηση της PI3-κινάσης

HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι 50 και 10µΜ λουτεολίνης για 5min .Στη συνέχεια η PI3Κ ανοσοκατακρηµνίστηκε µε ένα πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της ρυθµιστικής υποµονάδας p85 και ελέγχθηκε ως προς την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει το 4,5 φωσφατιδυλινοσιτολικό φωσφολιπίδιο. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε τρεις ανεξάρτητες φορές. Σε ιστογράµµατα φαίνονται οι τιµές πυκνοµέτρησης του λιπιδικού προϊόντος οµαλοποιηµένες µε τις τιµές πυκνοµετρησης της ζώνης του p85 για το κάθε δείγµα.

HUVE κύτταρα λοιπόν που είχαν υποστεί στέρηση ορού, ενεργοποιήθηκαν µε

VEGF παρουσία ή όχι λουτεολίνης για 5min. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε

ανοσοκατακρήµνιση της λιπιδικής κινάσης PI3K µε ένα αντίσωµα ειδικό για τη

ρυθµιστική υποµονάδα p85. Η δοκιµασία της in vitro λιπιδικής κινάσης έλαβε χώρα µε

προσθήκη 32P και PI4,5P2 ως υπόστρωµα.

Επώαση των κυττάρων µε VEGF οδήγησε σε ενεργοποίηση της PI3Κ, όπως

αυτό φάνηκε από την παραγωγή του ραδιενεργού προϊόντος PI3,4,5P3 (Εικ20 Α

κουκίδα 2η και κουκίδα 6η). Συνεπώαση των κυττάρων µε VEGF και λουτεολίνη σε

συγκεντρώσεις 50µΜ και 10µΜ οδήγησε σε ισχυρή αναστολή της ενεργοποίησης της

79

PI3Κ (Εικ20 A κουκίδα 3η και 7η αντίστοιχα). Η λουτεολίνη στα 50µΜ ήταν ικανή να

αναστείλει την επαγόµενη και βασική ενεργότητα της PIΚ (Εικ20 κουκίδα 4η).

Πραγµατοποιήθηκε επίσης ποσοτικοποίηση του αποτελέσµατος µε

πυκνοµέτρηση των κουκίδων που αντιστοιχούν στο προϊόν και αντιπροσωπεύουν την

ενεργότητα της PI3Κ. Η οµαλοποίηση αυτών των τιµών µε τις τιµές της κάθε ζώνης

που αντιστοιχεί στο ποσό του ανοσοκατακατακρηµνισµένου p85 για την κάθε

περίπτωση, απεικονίζονται σε ιστόγραµµα.

Αντίστοιχα αποτελέσµατα λάβαµε και όταν η λουτεολίνη δεν προστέθηκε στα

κύτταρα, αλλά στην ήδη ανοσοκατακρηµνισµένη και ενεργοποιηµένη PI3Κ αµέσως

πριν λάβει χώρα η in vitro δοκιµασία λιπιδικής κινάσης. Οι συγκεντρώσεις που

ελέγχθηκαν ήταν 10µΜ και 50µΜ. Η λουτεολίνη ήταν ικανή να αναστείλει την PI3Κ

και στις δύο προαναφερθείσες συγκεντρώσεις (Εικ21 κουκίδα 4η και 3η αντίστοιχα).

Ποσοτικοποίηση του αποτελέσµατος πραγµατοποιήθηκε µε πυκνοµέτρηση των

κουκίδων που αντιστοιχούν στο προϊόν και απεικόνιση των τιµών σε ιστόγραµµα.

Από τα παραπάνω αποτελέσµατα γίνεται εµφανές ότι η PI3Κ αποτελεί στόχο

της λουτεολίνης που θα µπορούσε να ερµηνεύσει την ανασταλτική της δράση στην

επιβίωση.

80

Εικόνα 21

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF ενεργοποίηση της PI3-κινάσης HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF και η PI3Κ ανοσοκατακρηµνίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Το ποσό της ανοσοκατακρηµνισµένης PI3Κ από τα ενεργοποιηµένα µε VEGF κύτταρα µοιράστηκε σε τρία ισόποσα τµήµατα και στο κάθε ένα προστέθηκε 10µΜ, 50µΜ λουτεολίνη και DMSO/EtOH (ο διαλύτης για τη λουτεολίνη) αντίστοιχα. Ακολούθως, πραγµατοποιήθηκε δοκιµασία in vitro λιπιδικής κινάσης. Η Εικ21 αποτελεί µια αντιπροσωπευτική αυτοραδιογραφία και οι τιµές πυκνοµέτρησης των κουκίδων του φωσφορυλιωµένου προϊόντος φαίνονται σε ιστόγραµµα.

2.2.3.1.2.3. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του p85 δεν επηρεάζεται από το VEGF

και τη λουτεολίνη

Επειδή από τα βιβλιογραφικά δεδοµένα υπήρχε µια σύγχυση για το εάν η

ρυθµιστική υποµονάδα της PI3Κ p85 φωσφορυλιώνεται κατά την ενεργοποίηση της

από το VEGF, θελήσαµε να διερευνήσουµε την πιθανότητα η ανασταλτική δράση της

λουτεολίνης να εντοπίζεται στην αναστολή της τυχόν επαγόµενης φωσφορυλίωσης του

p85.

Κύτταρα λοιπόν που είχαν στερηθεί ορού, επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η

όχι λουτεολίνης για 5min. Στη συνέχεια το p85 ανοσοκατακρηµνίστηκε µε τη χρήση

81

ειδικού αντισώµατος και ακολούθως έλαβε χώρα δοκιµασία in vitro κινάσης. Όπως

φαίνεται στη Εικ 22 το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του p85 δεν αυξήθηκε µετά την

ενεργοποίηση µε το VEGF και η συνεπώαση µε λουτεολίνη δεν είχε καµία επίδραση.

Το ίσο ποσό του p85 στις διάφορες συνθήκες επιβεβαιώθηκε µε ανοσοαποτύπωση µε

τη χρήση ειδικού αντισώµατος.

Εικόνα 22

Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του p85 δεν επηρεάζεται από το VEGF και τη λουτεολίνη HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι λουτεολίνης. Η p85 ανοσοκατακρηµνίστηκε και ακολούθησε in vitro δοκιµασία κινάσης. Το ποσό του ανοσοκαταβυθισµένου p85 στις διάφορες συνθήκες φαίνεται µε ζώνες. 2.2.3.1.2.4. Υπερέκφραση της myrAkt στα ενδοθηλιακά κύτταρα καταργεί την

ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση

Προκειµένου να επιβεβαιώσουµε τον κεντρικό ρόλο της οδού PI3Κ/Akt ως

στόχου για την αποπτωτική δράση της λουτεολίνης αποκλείοντας ταυτόχρονα τη

δράση της και σε κάποια άλλη ανεξάρτητη οδό επιβίωσης/απόπτωσης, µολύναµε τα

ενδοθηλιακά κύτταρα µε αδενοιούς που υπερεκφράζαν myrAkt ή β-γαλακτοσιδάση.

Η myrAkt (µυριστιλιοµένη µορφή της Akt), λόγω της προσθήκης στο µόριο

ενός λιπιδίου, υποχρεώνεται να είναι µόνιµα εντοπισµένη στην κυτταρική µεµβράνη

και άρα µόνιµα ενεργή.

Στη συνέχεια τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού, ενεργοποιήθηκαν µε VEGF

παρουσία ή όχι λουτεολίνης για 15hr και τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν από

82

τον πυκνωτικό τους πυρήνα µε τη χρώση Hoechst. Αντιπροσωπευτικές εικόνες

φαίνονται στη Εικ23. Έτσι, στα κύτταρα που υπερεκφράζαν β-γαλακτοσιδάση (Εικ23

α-δ), η στέρηση ορού προκάλεσε απόπτωση (Εικ23 εικόνα α). Επώαση µε VEGF

ανέστειλε τον κυτταρικό θάνατο (Εικ23 εικόνα β), ενώ συνεπώαση µε VEGF και

λουτεολίνη είχε πάλι ως αποτέλεσµα απόπτωση των κυττάρων (Εικ23 εικόνα γ). Τέλος,

επώαση των κυττάρων µόνο µε λουτεολίνη (Εικ23 εικόνα δ) επέφερε το ίδιο

αποτέλεσµα µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα (Εικ23 εικόνα α). Όλα αυτά τα

αποτελέσµατα είναι αντίστοιχα µε αυτά της Εικ13. Όταν όµως κύτταρα που

υπερέκφραζαν myrAkt (Εικ23 εικόνες ε-η) στερήθηκαν ορού δεν παρατηρήθηκε

απόπτωση (Εικ23 εικόνα ε). Επιπλέον συνεπώαση µε VEGF ή λουτεολίνη 50µΜ

(Εικ23 εικόνα ζ) ή επώαση µόνο µε λουτεολίνη 50µΜ (Εικ23 εικόνα η) δεν είχε κανένα

αποπτωτικό αποτέλεσµα. Τα κύτταρα που υπερέκφραζαν myrAkt φαίνονται πράσινα

(Εικ23 εικόνες ε-η). Από τα παραπάνω γίνεται εµφανές πως παρουσία της myrAkt όχι

µόνο αναστέλλεται η απόπτωση λόγω στέρησης ορού, (γεγονός που επιβεβαιώνεται και

από τα βιβλιογραφικά δεδοµένα), αλλά και καταστέλλεται η αποπτωτική δράση της

λουτεολίνης.

Για να ποσοτικοποιήσουµε το αποτέλεσµα, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία

µόλυνσης και επώασης των κυττάρων, αλλά σε αυτή την περίπτωση ο αποπτωτικός

πληθυσµός καθορίστηκε µε κυτταροµετρία ροής και εκφράστηκε ως ποσοστό του

συνολικού αριθµού κυττάρων που αναλύθηκαν. Έτσι όπως φαίνεται στη Εικ24, τα

κύτταρα που υπερεκφράζαν myrAkt (Εικ24 στήλες 5-8) ήταν πιο ανθεκτικά στην

απόπτωση σε συνθήκες στέρησης ορού σε σχέση µε αυτά που υπερεκφράζαν β-

γαλακτοσιδάση όπως περιγράφτηκε και παραπάνω (Εικ24 στήλη 5 σε σχέση µε στήλη

1 p<0.001). Η παρουσία της λουτεολίνης στα κύτταρα που υπερεκφράζαν myrAkt, δεν

ανέστειλε την επιβίωση σε σχέση µε τη δράση της στα κύτταρα που υπερεκφράζαν β-

γαλακτοσιδάση (Εικ24 στήλη 7 σε σχέση µε στήλη 3 p<0.001).

Συµπερασµατικά λοιπόν µπορούµε να συµπεράνουµε ότι η ανασταλτική δράση

της λουτεολίνης στην επιβίωση πραγµατοποιείται µέσω αναστολής της οδού PI3Κ/Akt.

83

Εικόνα 23

Υπερέκφραση της myrAkt στα ενδοθηλιακά κύτταρα καταργεί την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε αδενοιους που υπερέκφραζαν HA-myrAkt (Ad-myrAkt) η β-γαλακτοσιδάση (Ad-CTL) για 2 hr. Μετά από 30 hr σε πλήρες θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 50µΜ λουτεολίνης για 15 hr. Τα κύτταρα µονιµοποιήθηκαν και πραγµατοποιήθηκε έµµεσος ανοσοφθορισµός µε τη χρήση ενός ειδικού αντι-ΗΑ-myrAkt αντισώµατος για την αναγνώριση των κυττάρων που υπερέκφραζαν myrAkt (κύτταρα που φαίνονται πράσινα στις φωτογραφίες). Οι πυρήνες χρωµατίστηκαν µε Hoechst (κόκκινοι στις φωτογραφίες). Τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν από τον κατακερµατισµένο πυρήνα τους (σηµειώνονται µε βέλη). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

84

Εικόνα 24

Υπερέκφραση της myrAkt στα ενδοθηλιακά κύτταρα καταργεί την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση. HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε αδενοιούς που υπερεκφράζαν HA-myrAkt (Ad-myrAkt) η β-γαλακτοσιδάση (Ad-CTL) για 2 hr. Μετά από 30 hr σε πλήρες θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι 50µΜ λουτεολίνης για 15 hrs. Tο ποσοστό των κυττάρων µε υποπλοειδικό (αποπτωτικό) χαρακτήρα προσδιορίσθηκε µε χρώση µε ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση µε κυτταροµετρία ροής. Το πείραµα πραγµατοποιήθηκε δυο φορές και η κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το µέσο όρο. Επίσης σηµειώνονται οι τυπικές αποκλίσεις. *p<0.001

2.2.3.1.3. Ο ρόλος της φωσφορυλίωσης της p38 MAPK στην αντιεπιβιωτική

δράση της λουτεολίνης

2.3.1.3.1. Η λουτεολίνη αυξάνει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK

Από τη στιγµή που είδαµε ότι η λουτεολίνη µπορούσε να αναστείλει τη

φωσφορυλίωση της Akt, ελέγξαµε τη δράση της στη φωσφορυλίωση της p38. Είχε ήδη

περιγραφεί πως ο VEGF µπορεί να ενεργοποιήσει την Akt και την οδό

MKK3/MKK6/p38, οι οποίες συνδέονται µε την επιβίωση και την απόπτωση στα

ενδοθηλιακά κύτταρα (βλέπε εισαγωγή). Επιπλέον υπήρχε µια µελέτη πού είχε δείξει

85

ότι η Akt καταστέλλει την ενεργοποίηση του p38 και επιπλέον ότι αναστολή της Akt

οδηγεί σε ενισχυµένη ενεργοποίηση του p38 (παρουσία ή όχι VEGF) µε τελικό

αποτέλεσµα την απόπτωση (Gratton et al., 2001).

Όταν λοιπόν κύτταρα στερηµένα από ορό επωάστηκαν µε VEGF για 15min, η

φωσφορυλίωση του p38 αυξήθηκε όπως φαίνεται από την ανοσοαποτύπωση µε τη

χρήση ειδικού p-p38 αντισώµατος (Εικ25 ζώνη 2η). Συνεπώαση µε λουτεολίνη 50µΜ

και 10µΜ οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της φωσφορυλίωσης του p38 και µάλιστα µε

δοσοεξαρτώµενο τρόπο(Εικ25 ζώνη 5η και 3η αντίστοιχα). Επιπλέον επώαση µόνο µε

λουτεολίνη στις προαναφερθείσες συγκεντρώσεις προκάλεσε αύξηση της

φωσφορυλίωσης του p38 σε σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα (Εικ25 ζώνη 4η

και 6η σε σχέση µε ζώνη 1η). Τέλος, το ποσό του συνολικού p38 για την κάθε

περίπτωση φαίνεται µε ζώνες στην Εικ25 και επιβεβαιώνει ότι το αποτέλεσµα δεν είναι

προϊόν άνισης ποσότητας p38 κατά τη διάρκεια της ανοσοαποτύπωσης.

Από το παραπάνω αποτέλεσµα φαίνεται ότι η λουτεολίνη αναστέλλει την από

το VEGF επαγόµενη επιβίωση µέσω πιθανότατα ενός µηχανισµού που περιλαµβάνει

την αναστολή της Akt και την ενεργοποίηση του p38.

Εικόνα 25

Η λουτεολίνη αυξάνει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 50µΜ και 10µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικό αντι-p-p38 και αντι-p38 αντίσωµα. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

86

2.3.1.3.2. H υπερέκφραση της myrAkt αναστέλλει τη δράση της λουτεολίνης στη

φωσφορυλίωση του p38

Προκειµένου να αποδείξουµε, ότι η ευωδοτική δράση της λουτεολίνης στη

φωσφορυλίωση του p38 γίνεται µέσω µιας οδού εξαρτώµενης από την Akt,

υπερεκφράσαµε στα κύτταρα µε τη βοήθεια αδενοιών myrAkt ή β-γαλακτοσιδάση. Στη

συνέχεια πραγµατοποιήθηκε στέρηση ορού και ενεργοποίηση µε VEGF.

Παρατηρήσαµε λοιπόν πως η επαγόµενη φωσφορυλίωση του p38 (όπως αυτή φαινόταν

κατά την ανοσοαποτύπωση µε ειδικό αντι p-p38 αντίσωµα) ήταν µικρότερη στα

κύτταρα που υπερέκφραζαν myrAkt σε σχέση µε τα κύτταρα που υπερέκφραζαν β-

γαλακτοσιδάση (Εικ26 ζώνη 6η σε σχέση µε τη ζώνη 2η) γεγονός σύµφωνο µε τα

βιβλιογραφικά δεδοµένα. Συνεπώαση µε VEGF και 50µΜ λουτεολίνηs στα κύτταρα

που υπερέκφραζαν β-γαλακτοσιδάση έδειξε ότι η φωσφορυλίωση του p38 ήταν

αυξηµένη σε σχέση µε την περίπτωση που η ενεργοποίηση γινόταν µόνο µε VEGF

(Εικ26 ζώνη 3η σε σχέση µε ζώνη 2η) αποτέλεσµα σύµφωνο µε το πείραµα της Εικ25.

Όταν όµως η συνεπώαση της λουτεολίνης µε το VEGF γινόταν στα κύτταρα που

υπερέκφραζαν myrAkt, η λουτεολίνη δεν ήταν ικανή πλέον να αυξήσει περαιτέρω τη

φωσφορυλίωση του p38 που ήταν ήδη µειωµένο (Εικ26 ζώνη 7η σε σχέση µε ζώνη 6η).

Αυτό σηµαίνει ότι η επαγόµενη φωσφορυλίωση του p38 από τη λουτεολίνη

πραγµατοποιείται µέσω της αναστολής της Akt και κατά συνέπεια η παρουσία µιας

µόνιµα ενεργής Akt καταργεί την ευωδοτική δράση της λουτεολίνης στη

φωσφορυλίωση του p38. Το ποσό του p38 φαίνεται µε ζώνες Εικ26 και επιβεβαιώνει

ότι το αποτέλεσµα δεν είναι προϊόν διαφορετικού ποσού p38. Επίσης, έγινε

πυκνοµέτρηση της κάθε ζώνης που αντιστοιχεί στο p-p38 και η κάθε τιµή

οµαλοποιήθηκε µε την τιµή πυκνοµέτρησης της αντίστοιχης ζώνης που αφορά το p38.

Οι τιµές που προέκυψαν φαίνονται µε ιστόγραµµα. Τέλος, η έκφραση της myrAkt

φαίνεται σε όλες τις συνθήκες και είναι οµοιόµορφη Εικ26.

87

Εικόνα 26

Υπερέκφραση myrAkt αναστέλλει τη δράση της λουτεολίνης στη φωσφορυλίωση του p38 HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε αδενοιούς που υπερεκφράζαν HA-myrAkt (Ad-myrAkt) ή β-γαλακτοσιδαση (Ad-CTL) για 2 hr. Μετά από 30 hr σε πλήρες θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 12 hr και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 50µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-p-p38, αντι-p38 και αντι- HA-myrAkt αντισώµατα. Στο ιστόγραµµα φαίνονται οι τιµές πυκνοµέτρησης της κάθε ζώνης του φωσφορυλιωµένου p38 οµαλοποιηµένες µε τις τιµές πυκνοµέτρησης της αντίστοιχης ζώνης του p38. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

2.2.3.1.4. O ρόλος του ΝFkappaB στην επαγόµενη από το VEGF επιβίωση

Ένας παράγοντας που ενεργοποιείται από την Akt και παίζει ουσιαστικό ρόλο

στην επιβίωση, µέσω επαγωγής της µεταγραφής γονιδίων επιβίωσης, είναι ο

µεταγραφικός παράγοντας ΝFkappaB (Opipari et al., 1992; Zong et al., 1999).

88

Θελήσαµε λοιπόν να διερευνήσουµε την ενεργοποίηση του ΝFkappaB και την πιθανή

αναστολή της ενεργοποίησης του από τη λουτεολίνη στο σύστηµα µας.

Ο ΝFkappaB είναι γνωστό ότι στα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα βρίσκεται

ανενεργής στο κυτταρόπλασµα συνδεδεµένος µε τους αναστολείς του (ΙκΒα και ΙκΒβ).

Όταν γίνεται ενεργοποίηση του κυττάρου από συγκεκριµένα µόρια, πραγµατοποιείται

φωσφορυλίωση των ΙκΒα και β από τις ΙΚΚ (κινάσες του Ικβ) στο κυτταρόπλασµα και

αποδόµησή τους γεγονός που οδηγεί σε απελευθέρωση του ΝFkappaB και την είσοδό

του στον πυρήνα (Traenckner et al., 1995). Η p65 υποµονάδα του ΝFkappaB ευθύνεται

για τη µεταγραφική δράση του ΝFkappaB και η φωσφορυλιώση της από τις ΙΚΚ στη

Ser 536 αναφέρεται ότι είναι σηµαντική για την µεταγραφική της ικανότητα.(Sakurai et

al., 1999) Έχει αναφερθεί επίσης σε προηγούµενες µελέτες ότι η Akt µπορεί να

ενεργοποιήσει τον ΝFkappaB µέσω ενεργοποίησης των ΙΚΚ, (Madrid et al., 2001;

Ozes et al., 1999; Romashkova and Makarov, 1999) ενώ ο ρόλος του VEGF στην

ενεργοποίηση του ΝFkappaB αµφισβητείται.

HUVE κύτταρα λοιπόν, αφού υπέστησαν στέρηση ορού, επωάστηκαν µε VEGF

παρουσία η όχι 50µΜ λουτεολίνης για 20min. Όπως φαίνεται στην Εικ27Α ζώνη 2η, ο

VEGF δεν ήταν ικανός να επάγει τη αποδόµηση των αναστολέων ΙκΒα και ΙκΒβ και

άρα την απελευθέρωση του ΝFkappaB. Επίσης, η λουτεολίνη δεν είχε καµία επίδραση

στα επίπεδα των δυο πρωτεϊνών (Εικ27Α ζώνη 3η και 4η ) όπως φαίνεται από την

ανοσοαποτυπωση µε τη χρήση ειδικών αντι-ΙκΒα και αντι-ΙκΒβ αντισωµάτων.

Επιπλέον ο VEGF δεν ήταν ικανός να επάγει τη φωσφορυλιωση του p65 όπως

αυτό φαινόταν µε την χρήση ειδικού αντι-p(Ser536)-p65 αντισώµατος (Εικ27Β ζώνη

2η) και η λουτεολίνη δεν είχε καµία δράση στα επίπεδα της φωσφορυλιωσης του p65

στη Ser536 (Εικ27Β ζώνη 3η και 4η ). Το συνολικό ποσό του p65 στις αντίστοιχες

περιπτώσεις φαίνεται στην Εικ27.

Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται πως η ενεργοποίηση του ΝFkappaB

από την Akt µέσω των ΙΚΚ δεν φαίνεται να είναι σηµαντική στο σύστηµα µας παρ’όλη

την ενεργοποίηση της Akt από το VEGF. Επιπλέον, η λουτεολίνη δεν φαίνεται να έχει

κάποια επίδραση στην εξαρτώµενη από τις ΙΚΚ ενεργοποίηση του ΝFkappaB.

89

Εικόνα 28

Ο ΝFkappaB δεν φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή του σήµατος του VEGF Α-Β HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 50µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-ΙκΒα A (α) αντι-ΙκΒβ A (β), anti-p(Ser536)-p65 και αντι- p65 Β αντισώµατα αντίστοιχα.

90

2.2.3.2. Η επίδραση της λουτεολίνης στους επαγόµενους από το VEGF

µοριακούς µηχανισµούς µεταγωγής του σήµατος που σχετίζονται µε

τον πολλαπλασιασµό 2.2.3.2.1. Η λουτεολίνη δεν αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF

φωσφορυλίωση των ERK1/2

Ως προς την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στον επαγόµενο από το

VEGF πολλαπλασιασµό διερευνήσαµε τη δράση της λουτεολίνης στην προκαλούµενη

από το VEGF φωσφορυλίωση των ERK1/2. Ήταν γνωστό από τη βιβλιογραφία πως ο

VEGF επάγει τον πολλαπλασιασµό στα ενδοθηλιακά κύτταρα κυρίως µέσω

ενεργοποίησης των ERK1/2 (βλέπε εισαγωγή).

Εικονα 28

Η λουτεολίνη δεν αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη φωσφορυλίωση των ERK1/2 HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 50µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-p-ERK1/2 και αντι-ERK1/2 αντισώµατα. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

Όταν λοιπόν HUVE κύτταρα που είχαν στερηθεί ορού επωάστηκαν µε VEGF

για 15min, η φωσφορυλίωση των ERK1/2 αυξήθηκε όπως φάνηκε από την

ανοσοαποτύπωση µε ειδικό αντι-p-ERK1/2 αντίσωµα (Εικ28 ζώνη 2η σε σχέση µε

ζώνη 1η). Συνεπώαση της λουτεολίνης µε το VEGF δεν είχε καµία δράση στην

επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση των ERK1/2 (Εικ28 ζώνη 4η σε σχέση µε

91

ζώνη 2η). Ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση ειδικού αντισώµατος έναντι των ERK1/2

έδειξε ότι οι ERK1/2 ήταν ισόποσες σε όλες τις συνθήκες.(Εικ28). Άρα είναι φανερό

ότι το αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσµα της λουτεολίνης γίνεται µέσω µιας οδού

ανεξάρτητης των ERK1/2.

2.2.3.2.2 Υπερέκφραση της myrAkt δεν αναστέλλει την

αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης

Επειδή είχε δειχθεί σε προηγούµενες µελέτες ότι η Akt µπορεί να παίζει

σηµαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, θελήσαµε να διερευνήσουµε αν η

υπερέκφραση της myrAkt µπορούσε να αναστείλει την αντιπολλαπλασιαστική

ικανότητα της λουτεολίνης, όπως έγινε µε την αποπτωτική. Eτσι, HUVE κύτταρα, τα

οποία υπερεκφράζαν myrAkt ή β-γαλακτοσιδάση, υπέστησαν στέρηση ορού και

επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι διαφορετικών συγκεντρώσεων λουτεολίνης. Το

ποσό της ραδιενεργής θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε στα κύτταρα τις τελευταίες 6hr

της επώασης, αντιπροσώπευε το ποσοστό των πολλαπλασιαζόµενων κυττάρων. Όπως

φαίνεται στη Εικ29Α η παρουσία της λουτεολίνης στα κύτταρα που υπερεκφράζαν β-

γαλακτοσιδάση προκάλεσε αναστολή του πολλαπλασιασµού µε έναν δοσοεξαρτώµενο

τρόπο.

Η αναστολή αυτή εκφράστηκε σαν το ποσό της θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε

στο DNA παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης και VEGF σε σχέση µε την

ενσωµάτωση θυµιδίνης στα κύτταρα που έγινε επώαση µόνο µε VEGF.(Εικ29Α στήλες

1,2,3). Η υπερέκφραση myrAkt ήταν ικανή να αναστείλει ασθενώς την

αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης, αλλά αυτή η αναστολή ήταν

στατιστικώς µη σηµαντική (Εικ29Α στήλες 2,3,5,6). Η σχετικά οµοιόµορφη έκφραση

της myrAkt φαίνεται µε ανοσοαποτύπωση και τη χρήση ειδικού αντισώµατος που

αναγνώριζε µόνο τη myrAkt (Εικ29Β).

Από το παραπάνω αποτέλεσµα φαίνεται ότι η συµµετοχή της Akt στην

αντιπολλαπλασιαστική ικανότητα της λουτεολίνης είναι ασθενής.

92

Εικόνα 29

Υπερέκφραση της myrAkt δεν αναστέλλει την αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε αδενοϊούς που υπερέκφραζαν HA-myrAkt (Ad-myrAkt) ή β-γαλακτοσιδαση (Ad-CTL) για 2 hr. Μετά από 30 hr σε πλήρες θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού για 12 hr και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι διαφόρων συγκεντρώσεων λουτεολίνης για 24 hr. Τις τελευταίες 6 hr της επώασης προστέθηκε 3Η-θυµιδινη και η µετρούµενη ραδιενέργεια οµαλοποιήθηκε µε τον αριθµό των ζωντανών κυττάρων σε κάθε συνθήκη. Οι τιµές που φαίνονται υπολογίστηκαν ως το ποσό της θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε λόγω του VEGF στα κύτταρα που επωάστηκαν µε VEGF και διάφορες συγκεντρώσεις λουτεολίνης σε σχέση µε το ποσό της θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε λόγω του VEGF στα κύτταρα που επωάστηκαν µόνο µε VEGF. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε σε τριπλέτες τρεις ανεξάρτητες φορές. (Α). Ίσα ποσά πρωτεΐνης από την κάθε συνθήκη ελέγχθηκαν κατά Western ως προς την έκφραση της myrAkt µε και τη χρήση ειδικού αντισώµατος (Β). NS µη στατιστικώς σηµαντικό (non statistical significant).

93

2.2.3.2.3. Ο VEGF επάγει τη φωσφορυλίωση της p70 S6 κινάσης

Από τη στιγµή που η Akt παίζει µικρό ρόλο στην αντιπολλαπλασιαστική

ικανότητα της λουτεολίνης και οι ERK1/2 δεν φαίνεται να αποτελούν στόχο της,

θελήσαµε να διερευνήσουµε τη δράση της λουτεολίνης στην ενεργοποίηση µιας άλλης

κινάσης που βρίσκεται κάτω από τη ρύθµιση της PI3Κ, την p70 S6 κινάση. Είχε

περιγραφεί σε µία µελέτη, ότι η p70 S6 κινάση (p70 S6K) παίζει θετικό ρόλο στον

πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων συµπεριλαµβανοµένου και του

επαγόµενου από το VEGF. Αρχικά λοιπόν ελέγξαµε την ικανότητα του VEGF να

επάγει τη φωσφορυλίωση της p70 S6K στη Τhr389 που θεωρείται κρίσιµη για την

ενεργότητά της.

Εικόνα 30

Ο VEGF επάγει τη φωσφορυλίωση της p70 S6Κ HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι 10nM ραπαµυκινης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-p-p70 S6Κ (α) και αντι-ακτινη αντισώµατα.(β). Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

Όταν κύτταρα που είχαν υποστεί στέρηση ορού ενεργοποιήθηκαν µε VEGF για

15min παρουσίασαν αυξηµένα επίπεδα φωσφορυλίωσης της p70 S6K σε σχέση µε τα

µη ενεργοποιηµένα κύτταρα (Εικ30α ζώνη 1η και 2η). Στη συνέχεια χρησιµοποιήσαµε

τη ραπαµυκίνη, µία ουσία που αναστέλλει την FKBP 12-rapamycin-associated protein

(FRAP), η οποία είναι ένα ενεργοποιητής της p70 S6K. Συνεπώαση των κυττάρων µε

ραπαµυκίνη (10nM) και VEGF προκάλεσε καταστολή της επαγόµενης και της βασικής

φωσφορυλίωσης της p70 S6K(Εικ30α ζώνη 3η και 4η), γεγονός που επιβεβαιώνεται από

τα βιβλιογραφικά δεδοµένα. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία ισόποσης πρωτεΐνης στα

94

ελεγχόµενα δείγµατα, έγινε ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση ειδικού αντισώµατος έναντι

της ακτίνης, της οποίας οι ζώνες απεικονίζονται στη Εικ 30β.

Από το παραπάνω αποτέλεσµα λοιπόν γίνεται σαφές ότι ο VEGF είναι ικανός να

ενεργοποιήσει την p70 S6K και ότι η ραπαµυκίνη λειτουργεί ως ένας αναστολέας της

p70 S6K και στο δικό µας σύστηµα.

2.2.3.2.4. Η p70 S6 κινάση είναι σηµαντική για τον επαγόµενο από το

VEGF πολλαπλασιασµό

Προκειµένου να διερευνήσουµε τη σηµασία της φωσφορυλίωσης και

ενεργοποίησης της p70 S6K στον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό των

ενδοθηλιακών κυττάρων, HUVE κύτταρα, τα οποία υπερεκφράζαν myrAkt ή β-

γαλακτοσιδάση, υπέστησαν στέρηση ορού και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι

ραπαµυκίνης. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω η ραπαµυκίνη αποτελεί τον πιο ειδικό

φαρκευτικό αναστολέα της ενεργοποίησης της p70 S6K. Το ποσό της ραδιενεργής

θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε στα κύτταρα τις τελευταίες 6hr της επώασης,

αντιπροσώπευσε το ποσοστό των πολλαπλασιαζόµενων κυττάρων. Όπως φαίνεται στη

Εικ31Α, η παρουσία της ραπαµυκίνης προκάλεσε αναστολή του πολλαπλασιασµού σε

κύτταρα που υπερεκφράζαν β-γαλακτοσιδάση. Το αποτέλεσµα αυτό εκφράστηκε ως το

ποσό της θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε στο DNA των κυττάρων παρουσία

ραπαµυκίνης και VEGF σε σχέση µε το ποσό που ενσωµατώθηκε, όταν έγινε επώαση

µόνο µε VEGF (Εικ31Α στήλες 1,2).

Η υπερέκφραση myrAkt δεν ήταν ικανή να αναστείλει την

αντιπολλαπλασιαστική δράση της ραπαµυκίνης (Εικ31Α στήλες 3, 4). Η σχετικά

οµοιόµορφη έκφραση της myrAkt στις διάφορες συνθήκες φαίνεται (Εικ31Β).

Τέλος για να αποκλείσουµε ότι η αντιπολλαπλασιαστική δράση της

ραπαµυκίνης οφείλεται σε µια πιθανώς παράπλευρη αναστολή των ERK1/2, ελέγξαµε

τη δράση της ραπαµυκίνης στην επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση των

ERK1/2. HUVE κύτταρα λοιπόν, τα οποία είχαν υποστεί στέρηση ορού,

ενεργοποιήθηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι ραπαµυκίνης για 15min. Όπως φαίνεται

στη Εικ32 η ραπαµυκίνη δεν ήταν ικανή να αναστείλει τη φωσφορυλίωση των

ERK1/2. Επιπλέον το συνολικό ποσό των ERK1/2 εµφανίζεται ισόποσο σε όλες τις

συνθήκες.

95

Εικόνα 31

Η p70 S6K είναι σηµαντική για τον από το VEGF επαγόµενο πολλαπλασιασµό Α-Β. HUVE κύτταρα µολύνθηκαν µε αδενοιούς που υπερέκφραζαν HA-myrAkt (Ad-myrAkt) η β-γαλακτοσιδάση (Ad-CTL) για 2 hr. Μετά από 30 hr σε πλήρες θρεπτικό υλικό, τα κύτταρα υπέστησαν στέρηση ορού για 12 hr και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι ραπαµυκίνης για 24 hr. Τις τελευταίες 6 hr της επώασης προστέθηκε 3 Η-θυµιδίνη και η µετρούµενη ραδιενέργεια οµαλοποιήθηκε µε τον αριθµό των ζωντανών κυττάρων σε κάθε συνθήκη. Οι τιµές που φαίνονται υπολογίστηκαν ως το πόσο της θυµιδίνης που ενσωµατώθηκε λόγω του VEGF στα κύτταρα που επωάστηκαν µε VEGF και ραπαµυκίνη σε σχέση µε το ποσό που ενσωµατώθηκε λόγω του VEGF στα κύτταρα που επωάστηκαν µόνο µε VEGF. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε σε τριπλέτες δυο ανεξάρτητες φορές (Α) *p<0.001. Η έκφραση της myrAkt ελέγχθηκε µε western για να δειχθεί η οµοιοµορφία της στις διάφορες συνθήκες (Β).

Από τα παραπάνω αποτελέσµατα γίνεται σαφές ότι η ραπαµυκίνη είναι ικανή

να αναστείλει τον από το VEGF επαγόµενο πολλαπλασιασµό ανεξάρτητα από την Akt

96

και τις ERK1/2. Επειδή η ραπαµυκίνη αποτελεί αναστολέα της ενεργοποίησης της p70

S6K, δείχνουµε µε έµµεσο τρόπο ότι η p70 S6K είναι σηµαντική για τη

πολλαπλασιαστική δραστικότητα του VEGF.

Εικόνα 32

H ραπαµυκίνη δεν αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη φωσφορυλίωση των ERK1/2 HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 10nM ραπαµυκίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά αντι-p-ERK1/2 και αντι-ERK1/2 αντισώµατα.

2.2.3.2.5. Η p70 S6 κινάση δεν φαίνεται να ενέχεται στην επιβίωση των

ενδοθηλιακών κυττάρων

Για να διερευνήσουµε αν η p70 S6K ενέχεται και στην επιβίωση των

ενδοθηλιακών κυττάρων στο σύστηµά µας, χρησιµοποιήσαµε πάλι τη ραπαµυκίνη ως

αναστολέα της p70 S6Κ. HUVE κύτταρα λοιπόν υπέστησαν στέρηση ορού και

ενεργοποιήθηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι ραπαµυκίνης για 15hr. Με το πέρας της

επώασης τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν από τους πυκνωτικούς πυρήνες,

όπως αυτοί φαινόταν µε τη χρώση Hoechst και καταµετρήθηκαν κάτω από το

µικροσκόπιο. Όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω, η στέρηση ορού προκάλεσε

κυτταρικό θάνατο (Εικ33 στήλη 1η), ο οποίος µειώθηκε, όταν τα κύτταρα επωάστηκαν

µε VEGF (Εικ33 στήλη 2η). Η παρουσία της ραπαµυκίνης δεν επηρέασε τη

αντιαποπτωτική δράση του VEGF (Εικ33 στήλη 3η) υποδεικνύοντας ότι η

97

ενεργοποίηση της p70 S6K δεν φαίνεται να είναι σηµαντική για την επαγόµενη από το

VEGF επιβίωση.

Εικόνα 33

Η p70 S6 κινάση δεν φαίνεται να ενέχεται στην επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVE κύτταρα που µεγάλωσαν σε καλυπτρίδες, στερήθηκαν ορού και επωάστηκαν µε VEGF παρουσία η όχι 10nM ραπαµυκινης για 15hr. To ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε από τους πυκνωτικούς πυρήνες όπως αυτοί φάνηκαν µε τη χρώση Hoechst για την κάθε συνθήκη. Το πείραµα πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

2.2.3.2.6. H λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF

φωσφορυλίωση της p70 S6 κινάσης

Αφού λοιπόν δείξαµε ότι η p70 S6Κ είναι σηµαντική για τον επαγόµενο από το

VEGF πολλαπλασιασµό και επιπλέον αποτελεί ένα ένζυµο που εξαρτάται από την

ενεργοποίηση και τη δραστικότητα της PI3Κ, ήταν λογικό να εξετάσουµε τη δράση της

λουτεολίνης στην επαγόµενη φωσφορυλίωση της p70 S6K.

Έτσι, HUVE κύτταρα που είχαν υποστεί στέρηση ορού, ενεργοποιήθηκαν µε

VEGF παρουσία ή όχι διάφορων συγκεντρώσεων λουτεολίνης για 15min. Όπως

φαίνεται στη Εικ34α, ο VEGF αύξησε το επίπεδο φωσφορυλίωσης της p70 S6K

(Εικ34α ζώνη 2η), ενώ η παρουσία λουτεολίνης κατέστειλε την επαγόµενη και βασική

φωσφορυλίωση της p70 S6K και στις δύο συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν (10µΜ και

98

50µΜ) (Εικ34α ζώνη 3η,4η,5η). Αυτό το αποτέλεσµα ήταν αναµενόµενο δεδοµένης της

ανασταλτικής δράσης της λουτεολίνης στην ενεργότητα της PI3Κ και µπορεί πλέον να

ερµηνεύσει κάλλιστα την αντιµιτωτική δράση της λουτεολίνης κατά την ενεργοποίηση

των κυττάρων µε VEGF. Για να επιβεβαιωθεί τέλος η παρουσία ισόποσης πρωτεΐνης

στα ελεγχόµενα δείγµατα, έγινε ανοσοαποτύπωση µε τη χρήση ειδικού αντισώµατος

έναντι της ακτίνης όπως απεικονίζεται στη Εικ34β.

Εικόνα 34

H λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση της p70 S6Κ HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι 10µΜ ή 50µΜ λουτεολίνης για 15min. Ίσα ποσά πρωτεΐνης αναλύθηκαν κατά western µε ειδικά (α) αντι-p-p70S6Κ και (β) αντι-ακτίνης αντισώµατα. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό του πειράµατος που πραγµατοποιήθηκε δυο ανεξάρτητες φορές.

2.2.4. Η λουτεολίνη ανατρέπει την επαγόµενη από το VEGF γονιδιακή

έκφραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Προκειµένου να διερευνηθεί η επίδραση της λουτεολίνης στην από το VEGF

επαγόµενη γονιδιακή έκφραση, έγινε επώαση των κυττάρων που είχαν υποστεί

στέρηση ορού, µε VEGF παρουσία ή όχι 10µΜ λουτεολίνης για 12hr. Στη συνέχεια το

RNA που αποµονώθηκε και αναλύθηκε µε την τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιών

ως προς την αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση περίπου 17000 γονιδίων. Όπως φαίνεται

στη Εικ35, ο VEGF προκάλεσε αλλαγή στην έκφραση 123 γονιδίων, τα οποία ανάλογα

µε το ρόλο που επιτελούν σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία κατανεµήθηκαν σε κατηγόριες.

Ο αριθµός των γονιδίων από την κάθε κατηγορία στα οποία έγινε επαγωγή ή

καταστολή της έκφρασης τους σηµειώνονται µε βέλη. Συνεπώαση του VEGF µε τη

99

λουτεολίνη προκάλεσε αλλαγή στην έκφραση 16 γονιδίων (Εικ36). Στη δεύτερη στήλη

σηµειώνεται ο λόγος της έκφρασης του συγκεκριµένου γονιδίου παρουσία VEGF σε

σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα, ενώ στην τρίτη στήλη σηµειώνεται ο λόγος

της έκφρασης του συγκεκριµένου γονιδίου παρουσία VEGF και λουτεολίνης σε σχέση

µε τα κύτταρα που επωάστηκαν µόνο µε VEGF.

Τέλος, προκειµένου να γίνει επιβεβαίωση των διαφορικά εκφραζόµενων

γονιδίων, πραγµατοποιήθηκε Real Time RT PCR χρησιµοποιώντας RNA από δυο

ανεξάρτητα πειράµατα. Στην Εικ37i και ii φαίνεται αντιπροσωπευτικά η αύξηση της

έκφρασης δυο γονιδίων της ORP150 και της α2-µακροσφαιρίνης παρουσία VEGF σε

σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα (Εικ37i στήλη 1η και Εικ37ii στήλη 1).

Παρουσία όµως 10µΜ λουτεολίνης, η επαγωγική δράση του VEGF ήταν σαφώς

κατασταλµένη (Εικ 37i στήλη 2η και Εικ37ii στήλη 2η ).

Εικόνα 35

Ο VEGF ρυθµίζει τη γονιδιακή έκφραση σε 123 γονίδια στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι λουτεολίνης (10µΜ) για 12hr. TοRNA που αποµονώθηκε αναλύθηκε ως προς τη γονιδιακή έκφραση µε την τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιών. Ο VEGF τροποποίησε την έκφραση 123 γονιδίων σε σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα, τα οποία οµαδοποιήθηκαν.

100

Εικόνα 36

Η λουτεολίνη ανέστρεψε τηδράση του VEGF στη µεταγραφή 16 γονίδιων στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι λουτεολίνης (10µΜ) για 12hr. Tο RNA που αποµονώθηκε αναλύθηκε ως προς τη γονιδιακή έκφραση µε την τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιών και µε Real Time RT PCR. Η λουτεολίνη ανέστρεψε το µεταγραφικό αποτέλεσµα του VEGF σε 16 γονίδια. Η πρώτη στήλη δείχνει τα ονόµατα των 16 γονιδίων, η δεύτερη στήλη την έκφρασή τους παρουσία VEGF σε σχέση µε τα µη ενεργοποιηµένα κύτταρα και η τρίτη στήλη την έκφρασή τους παρουσία VEGF και λουτεολίνης σε σχέση µε την παρουσία µόνο VEGF.

101

Εικόνα 37

Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF µεταγραφή της ORP150 και της α2-µακροσφαιρίνης HUVE κύτταρα στερηµένα ορού επωάστηκαν µε VEGF παρουσία ή όχι λουτεολίνης (10µΜ) για 12hr και το RNA που αποµονώθηκε αναλύθηκε µε Real Time RT PCR. Η επαγωγή της έκφρασης της ORP150 και της α2- µακροσφαιρίνης από το VEGF απουσία λουτεολίνης φαίνεται µε τις µαύρες στήλες, ενώ η σαφώς κατασταλµένη µεταγραφή τους παρουσία VEGF και λουτεολίνης φαίνεται µε τις κόκκινες στήλες. Το αποτέλεσµα είναι αντιπροσωπευτικό δύο ανεξάρτητων πειραµάτων. *p<0.001

102

2.3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

2.3.1. Η λουτεολινη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF

αγγειογένεση στον κερατοειδή κονίκλου

Σε µια προσπάθεια να αναγνωριστούν ουσίες, οι οποίες συµµετέχουν στην καλά

αποδεδειγµένη προστατευτική δράση της δίαιτας πλούσιας σε φυτικές τροφές σε

διάφορες παθολογικές καταστάσεις µε προεξάρχοντα τον καρκίνο (Adlercreutz, 1990;

Miller, 1990), µια προηγούµενη µελέτη είχε δείξει ότι συγκεκριµένα φλαβονοειδή και

ισοφλαβονοειδή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών και καρκινικών

κυττάρων καθώς και την in vitro αγγειογένεση (Fotsis et al., 1997). Σε συµφωνία µε

αυτά τα αποτελέσµατα, το ισοφλαβονοειδές γενιστείνη, όπως και δυο φλαβονοειδή, η

φισετίνη και λουτεολίνη, ανέστειλαν την αγγειογένεση σε ένα in vivo µοντέλο

αγγειογένεσης σε κερατοειδή κονίκλου (Joussen et al., 2000). Σε όλες αυτές τις

µελέτες, ο FGF-2 είχε χρησιµοποιηθεί αποκλειστικά για την επαγωγή της in vitro και in

vivo αγγειογένεσης. Από τη στιγµή όµως που ο VEGF είναι ο κυριότερος διεγέρτης της

αγγειογένεσης στις αγγειογενετικές παθήσεις του οφθαλµού και τους περισσότερους

όγκους, θελήσαµε να διερευνήσουµε την πιθανή ανασταλτική δράση των

φλαβονοειδών στην από το VEGF επαγόµενη αγγειογένεση. Έτσι, αρχικά δείξαµε πως

η λουτεολίνη ανέστειλε τον επαγόµενο από το VEGF σχηµατισµό τριχοειδικών

αγγείων, όταν συγχορηγήθηκε µε VEGF σε εµφυτεύµατα βραδείας αποδέσµευσης

τοποθετηµένα σε κερατοειδή κονίκλου. Αυτή είναι και η πρώτη φορά που δείχνεται σε

µια µελέτη ότι ένα φλαβονοειδές µπορεί να αναστείλει την επαγόµενη από το VEGF in

vivo αγγειογένεση.

2.3.2. H λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από τον VEGF επιβίωση

και πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων.

Το προαναφερθέν αποτέλεσµα ήταν πολύ ενδιαφέρον, ώστε να µας ωθήσει να

διερευνήσουµε τους µοριακούς µηχανισµούς µε τους οποίους επιτυγχάνεται η

ανασταλτική δράση της λουτεολίνης. Κατά τη διαδικασία της αγγειογένεσης, τα

ενδοθηλιακά κύτταρα διασπούν τη βασική µεµβράνη µέσω παραγωγής πρωτεολυτικών

103

ένζυµων και έτσι εισχωρούν στο γύρω συνδετικό ιστό, µεταναστεύουν,

πολλαπλασιάζονται και τέλος διαφοροποιούνται, ώστε να σχηµατίσουν το τελικό

αγγείο. Ο VEGF όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, αποτελεί ρυθµιστή όλων αυτών των

σταδίων και επιπλέον προσφέρει επιβιωτικά σήµατα στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όµως,

λίγα είναι γνωστά για τη δράση των φλαβονοειδων στις ρυθµιζόµενες από το VEGF

αποκρίσεις των ενδοθηλιακών κύτταρων. Μόνο πρόσφατα περιγράφτηκε ότι η

απιγενίνη και η 3-υδροξυφλαβόνη ανέστειλαν την από το VEGF επαγόµενη παραγωγή

πρωτεασών που διασπούν την εξωκυττάρια ουσία, όπως η MMP-1 και ο uPA, και

τροποποίησαν την έκφραση αναστολέων των πρωτεασών όπως οι TIMP-1/-2 και PAI-1

(Kim, 2003).

Στην παρούσα µελέτη η λουτεολίνη ανέστειλε την επαγόµενη από το VEGF

επιβίωση των ενδοθηλιακών κύτταρων µε δοσοεξαρτώµενο τρόπο και µε µια

συγκέντρωση ικανή να αναστείλει κατά το ήµισυ τη δράση του VEGF ίση µε 4µΜ.

Επιπλέον, δείξαµε ότι παράλληλα η λουτεολίνη ανέστειλε τον επαγόµενο από το VEGF

πολλαπλασιασµό στα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως φάνηκε από την έκφραση του

πολλαπλασιαστικού δείκτη ki67 στα ενδοθηλιακά κύτταρα µε µη αποπτωτικό πυρήνα,

διαχωρίζοντας έτσι την αντιµιτωτική από την αποπτωτική δράση. Όλα αυτά τα

αποτελέσµατα υποδεικνύουν ότι τα φλαβονοειδή είναι ικανά να αναστείλουν τις

επαγόµενες από το VEGF αγγειογενετικές αποκρίσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων

επιβεβαιώνοντας την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στο πειραµατικό µοντέλο

νεοαγγείωσης σε κερατοειδή κονίκλου.

2.3.3. H λουτεολίνη αναστέλλει την από τον VEGF επαγόµενη επιβίωση

των ενδοθηλιακών κυττάρων αναστέλλοντας την PI3K/Akt οδό Τα φλαβονοειδή εµφανίζουν αρκετές ενδιαφέρουσες βιοχηµικές δράσεις (Havsteen, 1983). Έχει λοιπόν δειχθεί ότι µπορούν να αναστείλουν κινάσες των τυροσινών (Cunningham et al., 1992; Graziani et al., 1983) και των σερινών πιθανώς λόγω ανταγωνιστικής αναστολής της πρόσδεσης του ATP στη ειδική θέση δέσµευσης του στις κινάσες, µια περιοχή η οποία έχει σηµαντική οµοιότητα σε όλα τα µέλη της οικογένειας των κινασών (Graziani et al., 1983). Αφού λοιπόν ο VEGF πραγµατοποιεί τις βιολογικές του δράσεις µέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων του (VEGFR-1, -2 και –3) που διαθέτουν δράση τυροσινικής κινάσης (Dougher-Vermazen et al., 1994) και επειδή ο VEGFR-2 θεωρείται ότι παίζει τον κυριότερο ρόλο στη ρύθµιση της αγγειογένεσης (Keyt et al., 1996), υποθέσαµε αρχικά ότι η ενεργότητα της τυροσινικής κινάσης του VEGFR-2 µπορεί να αποτελεί έναν πιθανό στόχο της λουτεολίνης. Επιπλέον αυτός ο υποδοχέας έχει δειχθεί ότι είναι στόχος αρκετών επιτυχηµένων αναστολέων της αγγειογένεσης, οι οποίοι φέρουν φαινολικούς δακτυλίους στο µόριο

104

τους (Laird et al., 2002; Laird et al., 2000; Sun et al., 2003). Η λουτεολίνη όµως ανέστειλε µόνο µερικώς την επαγόµενη από το VEGF ενεργότητα του VEGFR-2 στα 50 µΜ, ενώ δεν ήταν καθόλου δραστική στα 10µΜ. Από τη στιγµή όµως που µπορούσε να αναστείλει τις επαγόµενες από το VEGF βιολογικές δράσεις (πολλαπλασιασµό και επιβίωση) σε συγκεντρώσεις µικρότερες των 10µΜ, φαίνεται απίθανο ο VEGFR-2 να αποτελεί το στόχο της. Αυτή η διαπίστωση µας κατεύθυνε στη διερεύνηση οδών µεταγωγής του σήµατος του VEGF πιο κάτω από τον υποδοχέα, η αναστολή των οποίων θα µπορούσε να ευθύνεται για την τελική δράση της λουτεολίνης. Η οδός της PI3K/Akt φαίνεται να παίζει κεντρικό ρόλο στην αναστολή του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου και τη διατήρηση σηµάτων επιβίωσης από τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες (Datta et al., 1999) συµπεριλαµβανοµένου του VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Gerber et al., 1998b). Έτσι στην παρούσα µελέτη αρχικά δείξαµε ότι η λουτεολίνη αναστέλλει πλήρως την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση της Akt ακόµα και στα 10µΜ και ότι υπερέκφραση µιας µόνιµα ενεργής µορφής της Akt (myrAkt) ανέστρεψε την αντι-επιβιωτική δράση της λουτεολίνης. Όπως είναι αναµενόµενο, η αναστολή από τη λουτεολίνη της φωσφορυλίωσης της Akt που είναι κρίσιµη για την ενεργότητά της, έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή και άλλων µορίων, των οποίων η ενεργότητα εξαρτάται από την Akt και τα οποία ρυθµίζουν την απόπτωση και την επιβίωση των κυττάρων όπως η BAD, η κασπάση 9, οι µεταγραφικοί παράγοντες FKH κτλ. (Datta et al., 1999). Ένας τέτοιος παράγοντας που ενεργοποιείται από την Akt είναι και η FRAP (12 rapamycin –associated protein ο στόχος της ραπαµυκίνης στα θηλαστικά mTOR), η οποία παίζει ρόλο στην επιβίωση έµµεσα µέσω ρύθµισης φορέων της κυτταρικής µεµβράνης που είναι υπεύθυνοι για τη µεταφορά εξωκυττάριων θρεπτικών ουσιών (Edinger and Thompson, 2002). Παρ’όλα αυτά η FRAP δεν φάνηκε να παίζει ρόλο στην επαγόµενη από το VEGF επιβίωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα δεδοµένου ότι η ραπαµυκίνη, η οποία αναφέρεται ως ένας ειδικός αναστολέας της FRAP δεν είχε κάποια αποπτωτική δράση. Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η Akt ενεργοποιεί την RelA/p65 υποµονάδα του µεταγραφικού παράγοντα NFkappaB µέσω µιας οδού εξαρτώµενης από τις κινάσες του ΙκΒ (IKKs) (Madrid et al., 2001; Ozes et al., 1999; Romashkova and Makarov, 1999) που έχει ως αποτέλεσµα τη µεταγραφή γονιδίων επιβίωσης (Opipari et al., 1992; Zong et al., 1999). Αποκλείσαµε όµως, ότι ο NFkappaB ενέχεται στην ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, µιας και δεν παρατηρήσαµε ενεργοποίηση του NFkappaB από το VEGF ή καταστολή της από τη λουτεολίνη. Βρήκαµε όµως ότι η επώαση των κυττάρων µε λουτεολίνη είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της βασικής και της επαγόµενης από το VEGF φωσφορυλίωσης του p38, το οποίο είναι γνωστό ότι προκαλεί απόπτωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Matsumoto et al., 2002; Yue et al., 1999). Επειδή λοιπόν η Akt καταστέλλει τη φωσφορυλίωση του p38 (Gratton et al., 2001), η αναστολή της Akt από τη λουτεολινη είναι λογικό να οδηγεί σε έντονη από το VEGF φωσφορυλίωση του p38. Σε συµφωνία µε αυτό το γεγονός, η υπερέκφραση της myrAkt στα κύτταρα κατέστειλε τόσο την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση του p38 όσο και την ενισχυτική δράση της λουτεολίνης σε αυτή. Κατά συνέπεια αποκλείεται η πιθανότητα, η λουτεολίνη να επιδρά στο p38 µε έναν µηχανισµό ανεξάρτητο της Akt. Συµπερασµατικά λοιπόν, η λουτεολίνη µέσω αναστολής της Akt όχι µόνο αναστέλλει επιβιωτικά µηνύµατα εξαρτώµενα από αυτήν, αλλά και ενισχύει την προαποπτωτική οδό του MKK3/MKK6/p38 µε τελικό αποτέλεσµα µια ισχυρή αποπτωτική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ενεργοποίηση της Akt απαιτεί τη µετακίνηση της από το κυτταρόπλασµα στην

105

κυτταρική µεµβράνη, η οποία ακολουθείται από φωσφορυλίωση στη Thr308 και τη Ser473 από την PDK1 και µια άγνωστη κινάση αντίστοιχα (Alessi et al., 1997; Scheid et al., 2002; Vanhaesebroeck and Alessi, 2000). Όλα αυτά τα σταδία ενεργοποίησης της Akt εξαρτώνται από την καταλυτική δράση της PI3K, η οποία έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή φωσφολιπιδίων, τα οποία αναγνωρίζονται από τις περιοχές οµολογίας µε πλεκστρίνη (pleckstrin homology domain, PH) της Akt (Chan et al., 1999) και της PDK1 και αυτή η αλληλεπίδραση ευθύνεται για τη µεταφορά των Akt και PDK1 στην κυτταρική µεµβράνη. Στην παρούσα µελέτη δείξαµε ότι η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF ενεργότητα της PI3K σε συγκεντρώσεις ανάλογες µε αυτές που παρουσιάζει την ισχυρή αντι-επιβιωτική και αντι-πολλαπλασιαστική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επειδή έχει ήδη αναφερθεί ότι συγκεκριµένα φλαβονοειδή αναστέλλουν την ενεργότητα της PI3K in vitro µέσω ανταγωνισµού στην περιοχή σύνδεσης του ΑΤΡ (Agullo et al., 1997; Gamet-Payrastre et al., 1999; Walker et al., 2000), είναι πιθανότατο να υπάρχει µια απευθείας δράση της λουτεολίνης στην καταλυτική υποµονάδα της PI3K. Εναλλακτικά η λουτεολινη θα µπορούσε να αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της p85 ρυθµιστικής υποµονάδας. Υπάρχουν όµως αντικρουόµενες απόψεις για το αν πραγµατοποιείται φωσφορυλίωση του p85 κατά την ενεργοποίηση µε VEGF και για το κατά πόσο αυτή η φωσφορυλίωση παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση της καταλυτικής υποµονάδας p110 (Abedi and Zachary, 1997; Gille et al., 2001; Takahashi and Shibuya, 1997; Thakker et al., 1999; Waltenberger et al., 1994). Εµείς δεν παρατηρήσαµε στο σύστηµα µας κάποια επαγωγή της φωσφορυλίωσης του p85 από το VEGF ή αναστολή της από τη λουτεολίνη. 2.3.4. H λουτεολίνη αναστέλλει τον επαγόµενο από τον VEGF πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων αναστέλλοντας την PI3K/p70 S6K οδό Όσον αφορά τον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό, παρ’όλο που η οδός των ERK1/2 θεωρείται ότι παίζει κεντρικό ρόλο, (Kroll and Waltenberger, 1997) (Parenti et al., 1998) (Rousseau et al., 1997) υπάρχουν τελευταίες αναφορές που εµπλέκουν την οδό της PI3K/p70 S6Κ στα HUVE κύτταρα (Vinals et al., 1999; Yu and Sato, 1999). Στην παρούσα µελέτη είδαµε ότι η λουτεολίνη δεν ήταν ικανή να αναστείλει την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση των ERK1/2 υποδεικνύοντας έτσι ότι η αναστολή της PI3K από την λουτεολίνη µπορεί να ευθύνεται και για την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό. Η p70 S6Κ είναι µια κινάση των σερινών /θρεονινών, η οποία φωσφορυλιώνει την 40S ριβοσωµική πρωτεΐνη S6 και µε αυτόν τον τρόπο τροποποιεί την µετάφραση µιας οµάδας mRNA που κωδικοποιούν ριβοσωµικές πρωτεΐνες και παράγοντες επιµήκυνσης της διαδικασίας της µετάφρασης (Jefferies et al., 1997). Μιτογόνα ερεθίσµατα ενεργοποιούν την p70 S6Κ, η οποία απαιτείται για την είσοδο µέσω της G1 φάσης στον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (Thomas, 2000). Η ενεργοποίηση της p70 S6Κ ρυθµίζεται µε την φωσφορυλίωση της σε εφτά διαφορετικά αµινοξέα του µορίου της. Συγκεκριµένα η κατάσταση φωσφορυλίωσης των θρεονινών 229 και 389 σχετίζονται µε την ενεργότητα της PI3K (Chung et al., 1994; Reif et al., 1997) και είναι σηµαντικές για την ενζυµατική ενεργότητα της p70 S6Κ. Αυτές οι θέσεις είναι επίσης ευαίσθητες στη δράση της FRAP (FKBP 12-rapamycin associated protein). Κατ’αυτό τον τρόπο η ραπαµυκίνη (ο πιο ευρέως και ειδικός µέχρι τώρα αναστολέας της FRAP) αναστέλλει την ενεργότητα της p70 S6Κ και επιπλέον αναστέλλει την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο µέσω της G1 φάσης (Chung et al., 1992; Lane et al., 1993). Ο VEGF λοιπόν όχι µόνο επήγαγε τη φωσφορυλίωση της p70 S6Κ στη Θρεονίνη 389, αλλά και

106

η επακόλουθη αύξηση του πολλαπλασιασµού ήταν ευαίσθητη στη ραπαµυκίνη. Επιπλέον η λουτεολίνη στα 10µΜ ανέστειλε πλήρως την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση του p70 S6 K στη θρεονίνη 389. Ο µηχανισµός µε τον οποίο οι PI3K και FRAP συνεργάζονται προκειµένου να ενεργοποιήσουν την p70 S6K δεν είναι πλήρως κατανοητός. Καθώς η Akt έχει δειχθεί να φωσφορυλιώνει τη FRAP (Nave et al., 1999) και η FRAP είναι ικανή να φωσφορυλιώνει την p70 S6K στη θρεονίνη 389 (Burnett et al., 1998; Isotani et al., 1999), η ενεργοποίηση της p70 S6K φαίνεται να είναι τουλάχιστον εν µέρει εξαρτώµενη από την Akt. Παρ΄όλα αυτά µεταλλαγµένες µορφές της Akt, οι οποίες δεν έχουν ενζυµατική ενεργότητα, δεν είναι ικανές να αναστείλουν την εξαρτώµενη από τη FRAP ενεργοποίηση της p70 S6K από αυξητικούς παράγοντες (Burgering and Coffer, 1995; Dufner et al., 1999) θέτοντας σε αµφισβήτηση τη βαρύτητα της Akt σε αυτή τη διαδικασία. Στο δικό µας σύστηµα η υπερέκφραση µιας µόνιµα ενεργής µορφής της Akt ανέστειλε ασθενώς την αντιµιτωτική δράση της λουτεολίνης, υποδεικνύοντας έτσι ότι η εξαρτώµενη από την PI3K ενεργοποίηση της p70 S6K λαµβάνει χώρα στα HUVE κύτταρα µέσω µηχανισµών βασικά ανεξάρτητων της Akt. Πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι και η ρυθµιστική υποµονάδα της PI3K p85 επίσης ρυθµίζει την ενεργοποίηση της p70 S6K µέσω της διατήρησης ενός προσωρινού συµπλόκου που περιλαµβάνει και την p70 SK µε τη FRAP (Gonzalez-Garcia et al., 2002). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η φωσφατάση PP2A συνδέεται µε το σύµπλοκο PI3K/FRAP/p70 S6K και αποφωσφορυλιώνει την p70 S6K, ενώ η FRAP αναστέλλει αυτή την αποφωσφορυλίωση της p70 S6K στη θρεονίνη 389 από την PP2A διατηρώντας την έτσι στην ενεργή φωσφορυλιωµένη µορφή (Peterson et al., 1999). Κατά αυτόν τον τρόπο λοιπόν η καταλυτική υποµονάδα της PI3K p110 είναι υπεύθυνη για την παραγωγή 3-φωσφατιδυλοινισιτολικών λιπιδίων που προσελκύουν την PDK1 (Anderson et al., 1998). Αυτή µε τη σειρά της εκτός από την φωσφορυλίωση της Akt που ήδη αναφέρθηκε, φωσφορυλιώνει και την p70 S6K στις θρεονίνες 229 (Alessi et al., 1998; Balendran et al., 1999; Pullen et al., 1998) και 389 µε τη βοήθεια της PKCζ και αυτοφωσφορυλίωσης της ίδιας της p70 S6K (Romanelli et al., 2002). Η ρυθµιστική υποµονάδα της PI3K p85 φαίνεται να παίζει ρόλο στη διατήρηση αυτών των φωσφορυλιώσεων. Επιπλέον έχει δειχθεί ότι οι PDK1, PKCζ και p70 S6K συνυπάρχουν σε ένα σύµπλοκο (Romanelli et al., 1999) στο οποίο η PDK1 φωσφορυλιώνει την PKCζ. (Le Good et al., 1998) (Chou et al., 1998) Αυτή µε τη σειρά της σταθεροποιεί την ενεργή µορφή της διάταξης του µορίου της PDK1, µέσω του υδροφοβικού µοτίβου, το οποίο µοιάζει µε εκείνο της PIF (protein kinase C related kinase 2,) (Romanelli et al., 2002) (Biondi et al., 2000). Σε συµφωνία µε τα ανωτέρω η PKCζ και οι άλλες ισοµορφές των PKC έχουν δειχθεί να ενεργοποιούνται από το VEGF µέσω ενός µηχανισµού ανεξάρτητου της PLCγ (Wu et al., 2000) αλλά εξαρτηµένου από την PI3K (Wu et al., 2000) και να επηρεάζουν τον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό εν µέρει ανεξάρτητα των ERK1/2 ADDIN EN.CITE <EndNote><Cite><Author>Wu</Author><Year>2000</Year><RecNum>197</RecNum><MDL><REFERENCE_TYPE>0</REFERENCE_TYPE><AUTHORS><AUTHOR>Wu, LW </AUTHOR><AUTHOR>Mayo, LD </AUTHOR><AUTHOR>Dunbar, JD </AUTHOR><AUTHOR>Kessler, KM </AUTHOR><AUTHOR>Baerwald, MR </AUTHOR><AUTHOR>Jaffe, EA </AUTHOR><AUTHOR>Wang, D </AUTHOR><AUTHOR>Warren, RS </AUTHOR><AUTHOR>Donner, DB</AUTHOR></AUTHORS><YEAR>2000</YEAR><TITLE>Utilization of distinct signaling pathways by receptors for vascular endothelial cell growth factor and other mitogens in the induction of endothelial cell

107

proliferation.</TITLE><SECONDARY_TITLE>J Biol Chem</SECONDARY_TITLE><VOLUME>275</VOLUME><NUMBER>7</NUMBER><PAGES>5096-103</PAGES></MDL></Cite></EndNote>(Wu et al., 2000). Συνολικά µπορεί κάποιος από τις µέχρι τώρα αναφορές και τα δικά µας αποτελέσµατα να συνάγει το συµπέρασµα ότι η καταλυτική δράση της PI3K είναι απαραίτητη προκειµένου να σχηµατιστεί ένα σύµπλοκο VEGF/VEGFR-2/PI3K/FRAP/PDK1/PKCζ/p70 S6K, το οποίο ρυθµίζει την ενεργότητα της p70 S6K (Εικονα21). Η Αkt µπορεί επίσης να συµµετέχει σε αυτό το σύµπλοκο αλλά πιθανώς δεν έχει κεντρικό ρόλο στον εξαρτώµενο από την p70 SK πολλαπλασιασµό στα HUVE κύτταρα. Ο σχηµατισµός ενός τέτοιου συµπλόκου θα ερχόταν σε συµφωνία µε τις παρατηρήσεις µας ότι α) ο VEGF επάγει τον πολλαπλασιασµό στα HUVE κύτταρα και αυτή η δράση αναστέλλεται από τη λουτεολίνη και τη ραπαµυκίνη β) η επαγόµενη από το VEGF επιβίωση των κυττάρων αναστέλλεται από τη λουτεολίνη αλλά όχι από τη ραπαµυκίνη γ) η υπερέκφραση µιας µόνιµα ενεργής µορφής της Akt ενώ ανέστειλε ισχυρά την αντιεπιβιωτική δράση, ανέστειλε ασθενώς την αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης. δ) η λουτεολίνη και η ραπαµυκίνη αναστέλλουν την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση της p70 S6K στη θρεονίνη 389. Εικόνα 21 Σχηµατική παράσταση των συνεπειών της αναστολής της PI3K από τη λουτεολίνη στη µεταγωγή του σήµατος από το VEGF που σχετίζεται µε τον πολλαπλασιασµό και την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων Η πρόσδεση του VEGF στον VEGFR-2 προσελκύει την PI3K µέσω της ρυθµιστικής της υποµονάδας p85 και ενεργοποιεί την καταλυτική της υποµονάδα, η οποία µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει τα φωσφατιδυλοινισιτολικά λιπίδια στη θέση 3. Τα φωσφολιπίδια αυτά αναγνωρίζονται από τις PH περιοχές της PDK1 και Akt, οι οποίες µε αυτό τον τρόπο προσελκύονται στην κυτταρική µεµβράνη όπου η PDK1 φωσφορυλιώνει την Akt. Επιπλέον η PDK1 φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την p70 S6K µε τη βοήθεια της PKCζ καθώς βρίσκονται και οι τρεις µαζί σε ένα σύµπλεγµα. Η p85 υποµονάδα διατηρεί τη φωσφορυλίωση της p70 S6K στη θρεονίνη 389 µε το να προσελκύει τη FRAP, η οποία αναστέλλει την PP2A, µια φωσφατάση που αποφωσφορυλιώνει την p70S6K στη θρεονίνη 389. Η λουτεολίνη αναστέλλει την καταλυτική δράση της PI3K και έτσι καταστέλλει την φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση της Akt και της p70 S6K. H Αkt είναι γνωστό ότι µεταβιβάζει σήµατα επιβίωσης και πολλαπλασιασµού, ενώ η p70S6K είναι σηµαντική για την είσοδο στη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Υπερέκφραση µιας µόνιµα ενεργής µορφής της Akt ανέστρεψε µόνο το αντιεπιβιωτικό αποτέλεσµα της λουτεολίνης υποδεικνύοντας ότι τα µιτογόνα ερεθίσµατα από την Akt, συµπεριλαµβανοµένης της φωσφορυλίωσης της p70 S6K στη θρεονίνη 389 από την ενεργοποιηµένη FRAP, δεν είναι σηµαντικά για την επαγόµενη από το VEGF µιτογένεση στα ενδοθηλιακά κύτταρα που χρησιµοποιήσαµε Έτσι φαίνεται ότι η επαγόµενη από το VEGF επιβίωση στα HUVE κύτταρα πραγµατοποιείται µέσω ενός µηχανισµού εξαρτώµενου από την PI3K και την Akt, ενώ ο επαγόµενος από το VEGF πολλαπλασιασµός φαίνεται να είναι εξαρτώµενος από την PI3K αλλά ανεξάρτητος από την Akt. Επιπλέον, ο επαγόµενος από το VEGF πολλαπλασιασµός στο σύστηµά µας ήταν ευαίσθητος στη δράση της λουτεολίνης και της ραπαµυκίνης. Ταυτόχρονα η λουτεολίνη δεν ανέστειλε την επαγόµενη ενεργοποίηση των ERK1/2 υποδεικνύοντας έτσι ότι το αντιµιτωτικό αποτέλεσµα προκύπτει σχεδόν αποκλειστικά από την αναστολή της PI3K. Τέλος, η φωσφορυλίωση του p38 ενισχύθηκε από τη λουτεολίνη ως αποτέλεσµα της κατασταλτικής της δράσης στην Αkt µε αποτέλεσµα την ισχυροποίηση του αποπτωτικού αποτελέσµατος της λουτεολίνης.

108

2.3.5. H λουτεολινη αναστέλλει την επαγοµένη από το VEGF µεταγραφή

στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Επειδή η κατάσταση στην οποία βρίσκεται ένα κύτταρο και κατά επέκταση το

αγγείο είναι δυναµική, η ενεργοποίηση του µε κάποιον παράγοντα όπως ο VEGF έχει

ως αποτέλεσµα έναν καταρράκτη αντιδράσεων που ουσιαστικά µεταβιβάζουν το σήµα

από τον υποδοχέα στον πυρήνα, αφού πρώτα αλληλεπιδράσουν µε αλλά σήµατα που

εισέρχονται ταυτόχρονα στο κύτταρο ή δηµιουργούνται µέσα σε αυτά. Ο τελικός

συνυπολογισµός της βαρύτητας των σηµάτων έχει ως αποτέλεσµα την αυξοµείωση της

έκφρασης συγκεκριµένων οµάδων γονιδίων που η τελική τους µετάφραση θα είναι

υπεύθυνη για την βιολογική απόκριση του κυττάρου. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο

θελήσαµε να αναγνωρίσουµε την µεταγραφική απόκριση των HUVE κυττάρων στον

προεξάρχοντα αγγειογενετικό παράγοντα VEGF και την επίδραση της λουτολίνης σε

αυτή. Κατ’αυτό τον τρόπο χρησιµοποιώντας την τεχνολογία των cDNA

µικροσυστοιχιών µπορέσαµε να ελέγξουµε ανάµεσα σε 17000 γονίδια, τα γονίδια που

εκφραζόταν διαφορικά λόγω του VEGF και την επίδραση της λουτεολίνης σε αυτά.

Αρχικά λοιπόν βρήκαµε πως επώαση των κυττάρων για 12hr µε το VEGF έχει ως

αποτέλεσµα την τροποποίηση της µεταγραφής σε 123 γονίδια, τα οποία είναι

σηµαντικά για τις βιολογικές δράσεις του VEGF όπως ο πολλαπλασιασµός, η επιβίωση

κτλ. Υπήρχαν όµως και γονίδια που δεν έχουν συσχετιστεί µε την αγγειογένεση ή δεν

έχουν ταυτοποιηθεί ακόµα. Η λουτεολίνη ανέστρεψε τη µεταγραφική δράση του VEGF

σε 16 γονίδια, τα οποία πιθανώς συµµετέχουν στην αντιαγγειογενετική δράση της

λουτεολίνης, ανάµεσα των οποίων είναι η ORP150 (oxygen regulated protein) και η

α2-µακροσφαιρίνη (alpha2-macroglobulin).

H ανθρώπινη α2-µακροσφαιρίνη είναι ένας αναστολέας πρωτεινασών (Barrett

and Starkey, 1973). Πρόσφατες µελέτες έδειξαν επίσης και άλλες σηµαντικές

βιολογικές δράσεις που περιλαµβάνουν ενίσχυση της αντιγονοπαρουσίασης (Chu and

Pizzo, 1993; Osada et al., 1987), προώθηση των καρκινοκτόνων ιδιοτήτων των

µακροφάγων (Ades et al., 1982), και τη σύνδεση και πιθανή ρύθµιση κυτταροκινών και

αυξητικών παραγόντων (Crookston et al., 1994) όπως ο TGFβ (O'Connor-McCourt and

Wakefield, 1987; Webb et al., 1998), ο PDGF (Gonias et al., 2000; Huang et al., 1984;

Raines et al., 1984), ο NGF (Gonias et al., 2000; Ronne et al., 1979), ο TNFα

(Wollenberg et al., 1991), ο FGF-2 (Dennis et al., 1989), η IL-6 (Matsuda et al., 1989)

και ο VEGF (Soker et al., 1993). Eιδικά ο VEGF έχει δειχθεί ότι συνδέεται µε την α2-

109

µακροσφαιρίνη σε περιοχές διαφορετικές από άλλους αυξητικούς παράγοντες

(Bhattacharjee et al., 2000). Θεωρείται µάλιστα ότι η α2-µακροσφαιρίνη µπορεί να

παίζει το ρόλο της παρακαταθήκης για διάφορους παράγοντες στο πλάσµα. Η σύνδεση

των αυξητικών παραγόντων µε την α2-µακροσφαιρίνη συνήθως αναστέλλει τη

βιολογική τους δράση in vitro, παρ’ολο που αυτή η σύνδεση µπορεί να αυξήσει τη

δραστικότητα του PDGF (Bonner et al., 1990) (Waltenberger et al., 1994). Στην

παρούσα µελέτη ο VEGF προκάλεσε επαγωγή της έκφρασης της α2-µακροσφαιρίνης, η

οποία καταστάλθηκε όταν τα κύτταρα συνεπωάστηκαν µε VEGF και λουτεολίνη. ∆εν

είναι γνωστό εάν η σύνδεση του VEGF µε την α2-µακροσφαιρίνη αναστέλλει την

δραστικότητα του VEGF. Eαν αυτό αληθεύει, τότε η αναστολή αυτή µπορεί να

συνεισφέρει στην αντιαγγειογενετική δράση της λουτεολίνης. Aυτό είναι ένα σηµείο

παραπέρα µελέτης.

Aναφορικά µε την OR150, πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι απαιτείται για

την ενδοκυττάρια µετακίνηση της πρωτεΐνης του VEGF από το ενδοπλασµατικό δίκτυο

στη συσκευή Golgi και την επακόλουθη έκκριση (Ozawa et al., 2001a). Η ORP150

αναγνωρίστηκε αρχικά ως µια πρωτεΐνη που εκφράζεται σε καλλιέργειες

αστροκυττάρων κάτω από συνθήκες υποξίας (Kuwabara et al., 1996) ως αποτέλεσµα

της επαγωγής της έκφρασης του mRNA της (Ozawa et al., 1999). Η έκφραση της

OPR150 στα καλλιεργούµενα ανθρώπινα κύτταρα έχει δειχθεί ότι είναι σηµαντική για

την επιβίωση τους στην παρατεταµένη υποξία (Ozawa et al., 1999). Επιπλέον

χορήγηση αδενοϊών που εκφράζουν ORP150 σε πληγές διαβητικών ποντικιών (Ozawa

et al., 2001a) αύξησε την νεοαγγείωση. H υπερέκφραση της ORP150 αύξησε την

έκκριση της πρωτεΐνης του VEGF σε κύτταρα υποξικού ιστού, ενώ η καταστολή της

είχε ως αποτέλεσµα την ακινητοποίηση του VEGF στο ενδοπλασµατικο δίκτυο. Αυτά

τα δεδοµένα δείχνουν πως η ORP150 απαιτείται για την έκκριση του VEGF και ότι στα

υποξικά κύτταρα το αυξηµένο πόσο του VEGF απαιτεί µια αντίστοιχη αύξηση της

έκφρασης της ORP150.

Η συσχέτιση ανάµεσα στην ανάπτυξη των όγκων και της OPR150 προέκυψε

από την πρόσφατη παρατήρηση ότι η OPR150 είναι αυξηµένη στους κακοήθεις όγκους

(Tsukamoto et al., 1998). Άλλη µελέτη έδειξε ότι η OR150 και ο VEGF

συνεκφράζονταν σε ανθρώπινο γλιοβλάστωµα και αυξηµένη έκφραση της OPR150

επήγαγε την ανάπτυξη του όγκου. Το τελευταίο µάλιστα συσχετιζόταν µε αύξηση της

έκφρασης του VEGF. Καταστολή δε της OPR150 προκάλεσε υποστροφή του όγκου, η

οποία σχετιζόταν µε µια αντίστοιχη µείωση του VEGF (Ozawa et al., 2001b).

110

Στην παρούσα µελέτη δείχνουµε πως ο VEGF επάγει την έκφραση της

ORP150, η οποία µε αυτό τον τρόπο αυξάνει την έκκριση του από τα ενδοθηλιακά

κύτταρα και άρα την αγγειογενετική του δράση. Αυτό ερµηνεύει επιπλέον τη

συνύπαρξη της ORP150 και του VEGF στις αγγειογενετικές περιοχές. H λουτεολίνη

µπορεί και καταστείλει την επαγόµενη αυτή έκφραση της ORP150 αναστέλλοντας

προφανώς µε αυτό τον τρόπο και την έκκριση και συνεπακόλουθη αγγειογενετική

δράση του VEGF.

Τόσο ο ρόλος των γονιδίων, τα οποία ρυθµίζονται από τον VEGF και η

έκφρασή τους τροποποιείται από την λουτεολίνη, όσο και η συσχέτιση της µεταγραφής

τους µε τις µοριακές οδούς στις οποίες επιδρά η λουτεολίνη, αποτελεί αντικείµενο

περαιτέρω έρευνας.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑTA Συµπερασµατικά λοιπόν στην παρούσα µελέτη δείχνουµε ότι το φλαβονοειδές

λουτεολίνη:

1.Αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF αγγειογένεση στον κερατοειδή κονίκλου.

2.Αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF επιβίωση και πολλαπλασιασµό στα

ενδοθηλιακά κύτταρα.

3.Καταργεί την ενζυµική δράση της PI3K µε δόσεις αντίστοιχες µε αυτές που

παρουσιάζει το αντιεπιβιωτικό και αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσµα στα

ενδοθηλιακά κύτταρα.

4.Πραγµατοποιεί την αποπτωτική της δράση µέσω της αναστολής της PI3K/Akt οδού.

5.Πραγµατοποιεί την αντιπολλαπλασιαστική της δράση µέσω αναστολής της PI3K/p70

S6K οδού.

6.Αναστρέφει την επαγόµενη από το VEGF µεταγραφή 16 γονιδίων.

111

3. ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ

3.1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΤΑ ΕΛΛΗΝΙΚΑ

ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΥΡΟΣΙΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ:

ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ∆ΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥΣ ΣΤΟΝ

ΚΕΡΑΤΟΕΙ∆Η (ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ)

Η αγγειογένεση του οφθαλµού µέσα στο πλαίσιο µιας πλειάδας

οφθαλµιατρικών νοσηµάτων αποτελεί την πρώτη αιτία τύφλωσης στον κόσµο και

προβάλλει την άµεση ανάγκη διερεύνησης των µοριακών µηχανισµών και ανάπτυξης

αποτελεσµατικών αναστολέων της. Ο VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

αποτελεί προεξάρχοντα αγγειογενετικό παράγοντα στην αγγειογένεση του οφθαλµού.

Σε προηγούµενη µελέτη µέσα στο πλαίσιο διερεύνησης της προστατευτικής δράσης της

δίαιτας πλούσιας σε φυτικά στον καρκίνο, είχε δειχθεί ,ότι µέλη της οικογένειας των

φλαβονοειδών µπορούν να αναστείλουν την αγγειογένεση σε ένα in vitro πειραµατικό

µοντέλο.

Στην παρούσα µελέτη δείχνουµε για πρώτη φορά πως ένα φλαβονοειδές, η

λουτεολίνη, είναι ικανή να αναστείλει την επαγόµενη από το VEGF αγγειογένεση στον

κερατοειδή κονίκλου. Επιπλέον, η λουτεολίνη αναστέλλει την προκαλούµενη από το

VEGF επιβίωση και πολλαπλασιασµό στα ενδοθηλιακά κύτταρα µε ηµιµέγιστη

συγκέντρωση ίση µε 5µΜ. H δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση και τον

πολλαπλασιασµό, σχετίστηκε µε την ικανότητά της να αναστέλλει της ενεργότητα της

3-φωσφατιδυλινοσιτόλικής κινάσης (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K), ενώ

αναστολή της ενεργοποίησης του υποδοχέα VEGFR-2 παρατηρήθηκε σε υψηλότερες

συγκεντρώσεις. Η αναστολή της PI3K από τη λουτεολίνη οδήγησε αφενός µεν σε

αναστολή της επαγόµενης φωσφορυλίωσης της Akt, η οποία ενεργοποιείται από την

PI3K και µεταβιβάζει σήµατα επιβίωσης για το κύτταρο, αφετέρου σε ενίσχυση της

επαγόµενης από το VEGF φωσφορυλίωσης του p38 µιας οδού που καταστέλλεται από

την Akt και που είναι γνωστή για την αποπτωτική της δράση στα ενδοθηλιακά

κύτταρα. Υπερέκφραση µιας µόνιµα ενεργής µεταλλαγµένης µορφής της Akt, ενώ

κατήργησε το αντιεπιβιωτικό αποτέλεσµα της λουτεολίνης, είχε µικρή µόνο επίδραση

στην αντιπολλαπλασιαστική της δράση.

112

Aναφορικά µε τον πολλαπλασιασµό, η λουτεολίνη δεν είχε δράση στην

επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση των ERK1/2, αλλά ανέστειλε την από το

VEGF προκαλούµενη φωσφορυλίωση της p70 S6 κινάσης (p70 S6K), η οποία

ενεργοποιείται από την PI3K και παίζει σηµαντικό ρόλο κατά την είσοδο του κυττάρου

στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Πράγµατι, ο επαγόµενος από το VEGF

πολλαπλασιασµός ήταν ευαίσθητος στη ραπαµυκίνη, έναν αναστολέα της

ενεργοποίησης της p70 S6K. Συµπερασµατικά, λοιπόν η αναστολή της PI3K από τη

λουτεολίνη φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αντιεπιβιωτική και την

αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το

αντιεπιβιωτικό της αποτέλεσµα φαίνεται να πραγµατοποιείται µέσω της PI3K/Akt

οδού, ενώ το αντιπολλαπλασιαστικό µέσω της PI3K/p70 S6K οδού.

Τέλος, µέσα στο πλαίσιο διερεύνησης των µοριακών µηχανισµών που είναι

υπεύθυνοι για την αντιαγγειογενετική δράση της λουτεολίνης, µελετήσαµε την

επίδρασή της στην επαγόµενη από το VEGF µεταγραφή στα ενδοθηλιακά κύτταρα µε

τη χρήση της τεχνολογίας των DNA µικροσυστοιχιών. (cDNA microarrays). Από τα

17000 γονίδια που ελέγχθηκαν, ο VEGF προκάλεσε αλλαγή στην έκφραση 123

γονιδίων, ενώ η λουτεολίνη ανέστρεψε τη δράση του VEGF σε 16 γονίδια. Ανάµεσα

στα τελευταία ανήκουν η α2-µακροσφαιρίνη (α2-macroglobulin) και η ORP150

(oxygen regulated protein), οι οποίες επάγονται µεταγραφικά από το VEGF και

καταστέλλονται από την λουτεολίνη. Ο ρόλος των διαφορικά εκφραζόµενων γονιδίων

στην αγγειογένεση και η συσχέτισή της επαγωγής τους µε τις µοριακές οδούς στις

οποίες επιδρά η λουτεολίνη, αποτελεί έδαφος περαιτέρω έρευνας.

113

3.2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΤΑ ΑΓΓΛΙΚΑ (SUMMARY)

TYROSINE KINASE INHIBITORS AND ANGIOGENESIS: MOLECULAR MECHANISM OF ACTION AND IN VIVO EFFECT IN THE RABBIT

CORNEAL NEOVASCULARISATION ASSAY

DOCTORATE THESIS

Eleni Bagkli

Neovascularisation in the eye is associated with various disorders, and is the

leading cause of blindness in the world. Thus, the identification of the molecular

mechanisms of angiogenesis and the development of sufficient anti-angiogenic

treatment is very critical. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) is considered

the main angiogenic factor in the ocular angiogenesis.

In an attempt to identify phytochemicals contributing to the well-documented

preventive effect of plant-based diets on cancer incidence and mortality, we have

previously shown that certain flavonoids inhibit in vitro angiogenesis. Here, we show

that the flavonoid, luteolin, inhibited VEGF-induced in vivo angiogenesis in the rabbit

cornea assay. In agreement, luteolin inhibited both VEGF-induced survival and

proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with a half

maximum concentration of 5 µM. The effect of luteolin on survival and proliferation

correlated with inhibition of VEGF-induced phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)

activity, whereas inhibition of VEGFR-2 phosphorylation was observed at higher

concentrations. Luteolin inhibited VEGF-induced phosphorylation of Akt, a

downstream target of PI3K that mediates survival and proliferative signals, and

enhanced VEGF-induced phosphorylation of p38, a pathway that is suppressed by Akt

and is known to cause apoptosis in endothelial cells (ECs). Overexpression of a

constitutively active form of Akt rescued HUVECs from luteolin-induced apoptosis,

but had a minimal effect in reversing the inhibition of VEGF-induced proliferation.

Regarding the anti-mitotic activity, luteolin did not inhibit VEGF-induced ERK1/2

phosphorylation, but inhibited VEGF-induced phosphorylation of p70 S6K, a

downstream effector of PI3K responsible for G1 progression Indeed, VEGF-induced

proliferation of HUVECs was sensitive to rapamycin, an inhibitor of p70 S6K

activation. Thus, inhibition of PI3K by luteolin mediates the inhibitory effects of

luteolin on VEGF-induced survival and proliferation of HUVECs. The anti-survival

114

effects are mediated via PI3K/Akt-dependent pathways, whereas the anti-mitotic effects

via PI3K/p70 S6K-dependent pathways.

Finally in order to determine the molecular mechanism underlying the anti

angiogenic effect of luteolin, we tested the effect of luteolin on VEGF-induced

transcription genes in endothelial cells using cDNA microarrays technology. From the

17000 genes tested, VEGF regulated the expression of 123 genes and luteolin reversed

VEGF effect in 16 genes. A2-macroglobulin and ORP150 (Oxygen Regulated Protein)

are both induced by VEGF and downregulated by luteolin. The role of the differently

regulated genes in angiogenesis and the molecular mechanism underlying the effect of

luteolin on their regulation is yet to be defined.

115

4. BIBΛIOΓPAΦIA

Abedi, H., and Zachary, I. (1995). Signalling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasc Res 30, 544-556. Abedi, H., and Zachary, I. (1997). Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin in endothelial cells. J Biol Chem 272, 15442-15451. Achen, M. G., Jeltsch, M., Kukk, E., Makinen, T., Vitali, A., Wilks, A. F., Alitalo, K., and Stacker, S. A. (1998). Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci U S A 95, 548-553. Adamis, A. P., Miller, J. W., Bernal, M. T., D'Amico, D. J., Folkman, J., Yeo, T. K., and Yeo, K. T. (1994). Increased vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of eyes with proliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 118, 445-450. Adamis, A. P., Shima, D. T., Tolentino, M. J., Gragoudas, E. S., Ferrara, N., Folkman, J., D'Amore, P. A., and Miller, J. W. (1996). Inhibition of vascular endothelial growth factor prevents retinal ischemia-associated iris neovascularization in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol 114, 66-71. Ades, E. W., Hinson, A., Chapuis-Cellier, C., and Arnaud, P. (1982). Modulation of the immune response by plasma protease inhibitors. I. Alpha 2-macroglobulin and alpha 1-antitrypsin inhibit natural killing and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. Scand J Immunol 15, 109-113. Adlercreutz, H. (1990). Western diet and Western diseases: some hormonal and biochemical mechanisms and associations. Scand J Clin Lab Invest Suppl 201, 3-23. Agullo, G., Gamet-Payrastre, L., Manenti, S., Viala, C., Remesy, C., Chap, H., and Payrastre, B. (1997). Relationship between flavonoid structure and inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase: a comparisonwith tyrosine kinase and protein kinase C inhibition. Biochem Pharmacol 53, 1649-1657. Aiello, L. P., Avery, R. L., Arrigg, P. G., Keyt, B. A., Jampel, H. D., Shah, S. T., Pasquale, L. R., Thieme, H., Iwamoto, M. A., Park, J. E., and et al. (1994a). Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. N Engl J Med 331, 1480-1487. Aiello, L. P., Bursell, S. E., Clermont, A., Duh, E., Ishii, H., Takagi, C., Mori, F., Ciulla, T. A., Ways, K., Jirousek, M., et al. (1997). Vascular endothelial growth factor-induced retinal permeability is mediated by protein kinase C in vivo and suppressed by an orally effective beta-isoform-selective inhibitor. Diabetes 46, 1473-1480. Aiello, L. P., Pierce, E. A., Foley, E. D., Takagi, H., Chen, H., Riddle, L., Ferrara, N., King, G. L., and Smith, L. E. (1995). Suppression of retinal neovascularization in vivo by inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using soluble VEGF-receptor chimeric proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10457-10461.

116

Aiello, L. P., Robinson, G. S., Lin, Y. W., Nishio, Y., and King, G. L. (1994b). Identification of multiple genes in bovine retinal pericytes altered by exposure to elevated levels of glucose by using mRNA differential display. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 6231-6235. Alessi, D., Kozlowski, M., Weng, Q., Morrice, N., and Avruch, J. (1998). 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) phosphorylates and activates the p70 S6 kinase in vivo and in vitro. Curr Biol 8, 69-81. Alessi, D. R., James, S. R., Downes, C. P., Holmes, A. B., Gaffney, P. R., Reese, C. B., and Cohen, P. (1997). Characterization of a 3-phosphoinositide-dependent protein kinase which phosphorylates and activates protein kinase Balpha. Curr Biol 7, 261-269. Alon, T., Hemo, I., Itin, A., Pe'er, J., Stone, J., and Keshet, E. (1995). Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat Med 1, 1024-1028. Amin, R. H., Frank, R. N., Kennedy, A., Eliott, D., Puklin, J. E., and Abrams, G. W. (1997). Vascular endothelial growth factor is present in glial cells of the retina and optic nerve of human subjects with nonproliferative diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci 38, 36-47. Anderson, K., Coadwell, J, LR, S., and Hawkins, P. (1998). Translocation of PDK-1 to the plasma membrane is important in allowing PDK-1 to activate protein kinase B. Curr Biol 8, 684-691. Anderson, S., Jung, F. F., and Ingelfinger, J. R. (1993). Renal renin-angiotensin system in diabetes: functional, immunohistochemical, and molecular biological correlations. Am J Physiol 265, F477-486. Arden, G. B. (2001). The absence of diabetic retinopathy in patients with retinitis pigmentosa: implications for pathophysiology and possible treatment. Br J Ophthalmol 85, 366-370. Asahara, T., Takahashi, T., Masuda, H., Kalka, C., Chen, D., Iwaguro, H., Inai, Y., Silver, M., and Isner, J. M. (1999). VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Embo J 18, 3964-3972. Aymerich, M. S., Alberdi, E. M., Martinez, A., and Becerra, S. P. (2001). Evidence for pigment epithelium-derived factor receptors in the neural retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 3287-3293. Baish, J. W., and Jain, R. K. (2000). Fractals and cancer. Cancer Res 60, 3683-3688. Bajou, K., Noel, A., Gerard, R. D., Masson, V., Brunner, N., Holst-Hansen, C., Skobe, M., Fusenig, N. E., Carmeliet, P., Collen, D., and Foidart, J. M. (1998). Absence of host plasminogen activator inhibitor 1 prevents cancer invasion and vascularization. Nat Med 4, 923-928. Balendran, A., Currie, R., Armstrong, C. G., Avruch, J., and Alessi, D. R. (1999). Evidence that 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 mediates phosphorylation of p70 S6 kinase in vivo at Thr-412 as well as Thr-252. J Biol Chem 274, 37400-37406. Barleon, B., Sozzani, S., Zhou, D., Weich, H. A., Mantovani, A., and Marme, D. (1996). Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood 87, 3336-3343.

117

Barrett, A. J., and Starkey, P. M. (1973). The interaction of alpha 2-macroglobulin with proteinases. Characteristics and specificity of the reaction, and a hypothesis concerning its molecular mechanism. Biochem J 133, 709-724. Basile, A., Giordano, S., Lopez-Saez, J. A., and Cobianchi, R. C. (1999). Antibacterial activity of pure flavonoids isolated from mosses. Phytochemistry 52, 1479-1482. Bayless, K. J., Salazar, R., and Davis, G. E. (2000). RGD-dependent vacuolation and lumen formation observed during endothelial cell morphogenesis in three-dimensional fibrin matrices involves the alpha(v)beta(3) and alpha(5)beta(1) integrins. Am J Pathol 156, 1673-1683. Bazzoni, G., Martinez Estrada, O., and Dejana, E. (1999). Molecular structure and functional role of vascular tight junctions. Trends Cardiovasc Med 9, 147-152. Bellomo, D., Headrick, J. P., Silins, G. U., Paterson, C. A., Thomas, P. S., Gartside, M., Mould, A., Cahill, M. M., Tonks, I. D., Grimmond, S. M., et al. (2000). Mice lacking the vascular endothelial growth factor-B gene (Vegfb) have smaller hearts, dysfunctional coronary vasculature, and impaired recovery from cardiac ischemia. Circ Res 86, E29-35. Belotti, D., Clausse, N., Flagiello, D., Alami, Y., Daukandt, M., Deroanne, C., Malfoy, B., Boncinelli, E., Faiella, A., and Castronovo, V. (1998). Expression and modulation of homeobox genes from cluster B in endothelial cells. Lab Invest 78, 1291-1299. Belperio, J. A., Keane, M. P., Arenberg, D. A., Addison, C. L., Ehlert, J. E., Burdick, M. D., and Strieter, R. M. (2000). CXC chemokines in angiogenesis. J Leukoc Biol 68, 1-8. Benjamin, L. E., Hemo, I., and Keshet, E. (1998). A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development 125, 1591-1598. Bhattacharjee, G., Asplin, I. R., Wu, S. M., Gawdi, G., and Pizzo, S. V. (2000). The conformation-dependent interaction of alpha 2-macroglobulin with vascular endothelial growth factor. A novel mechanism of alpha 2-macroglobulin/growth factor binding. J Biol Chem 275, 26806-26811. Biondi, R., Cheung, P., Casamayor, A., Deak, M., Currie, R., and Alessi, D. (2000). Identification of a pocket in the PDK1 kinase domain that interacts with PIF and the C-terminal residues of PKA. EMBO J 19, 979-988. Blaauwgeers, H. G., Holtkamp, G. M., Rutten, H., Witmer, A. N., Koolwijk, P., Partanen, T. A., Alitalo, K., Kroon, M. E., Kijlstra, A., van Hinsbergh, V. W., and Schlingemann, R. O. (1999). Polarized vascular endothelial growth factor secretion by human retinal pigment epithelium and localization of vascular endothelial growth factor receptors on the inner choriocapillaris. Evidence for a trophic paracrine relation. Am J Pathol 155, 421-428. Bonner, J. C., Badgett, A., Osornio-Vargas, A. R., Hoffman, M., and Brody, A. R. (1990). PDGF-stimulated fibroblast proliferation is enhanced synergistically by receptor-recognized alpha 2-macroglobulin. J Cell Physiol 145, 1-8. Boudreau, N., Andrews, C., Srebrow, A., Ravanpay, A., and Cheresh, D. A. (1997). Induction of the angiogenic phenotype by Hox D3. J Cell Biol 139, 257-264. Brew, K., Dinakarpandian, D., and Nagase, H. (2000). Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta 1477, 267-283.

118

Brogi, E., Wu, T., Namiki, A., and Isner, J. M. (1994). Indirect angiogenic cytokines upregulate VEGF and bFGF gene expression in vascular smooth muscle cells, whereas hypoxia upregulates VEGF expression only. Circulation 90, 649-652. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G., and Cheresh, D. A. (1994). Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79, 1157-1164. Bucki, R., Pastore, J. J., Giraud, F., Sulpice, J. C., and Janmey, P. A. (2003). Flavonoid inhibition of platelet procoagulant activity and phosphoinositide synthesis. J Thromb Haemost 1, 1820-1828. Burgering, B. M., and Coffer, P. J. (1995). Protein kinase B (c-Akt) in phosphatidylinositol-3-OH kinase signal transduction. Nature 376, 599-602. Burnett, P. E., Barrow, R. K., Cohen, N. A., Snyder, S. H., and Sabatini, D. M. (1998). RAFT1 phosphorylation of the translational regulators p70 S6 kinase and 4E-BP1. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1432-1437. Campochiaro, P. A. (2000). Retinal and choroidal neovascularization. J Cell Physiol 184, 301-310. Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., and Folkman, J. (1996). In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. J Clin Invest 98, 2507-2511. Carmeliet, P. (1999). Developmental biology. Controlling the cellular brakes. Nature 401, 657-658. Carmeliet, P. (2000a). Developmental biology. One cell, two fates. Nature 408, 43, 45. Carmeliet, P. (2000b). Fibroblast growth factor-1 stimulates branching and survival of myocardial arteries: a goal for therapeutic angiogenesis? Circ Res 87, 176-178. Carmeliet, P. (2000c). Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6, 389-395. Carmeliet, P., Dor, Y., Herbert, J. M., Fukumura, D., Brusselmans, K., Dewerchin, M., Neeman, M., Bono, F., Abramovitch, R., Maxwell, P., et al. (1998). Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature 394, 485-490. Carmeliet, P., Ferreira, V., Breier, G., Pollefeyt, S., Kieckens, L., Gertsenstein, M., Fahrig, M., Vandenhoeck, A., Harpal, K., Eberhardt, C., et al. (1996). Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature 380, 435-439. Carmeliet, P., Lampugnani, M. G., Moons, L., Breviario, F., Compernolle, V., Bono, F., Balconi, G., Spagnuolo, R., Oostuyse, B., Dewerchin, M., et al. (1999a). Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis. Cell 98, 147-157. Carmeliet, P., Ng, Y. S., Nuyens, D., Theilmeier, G., Brusselmans, K., Cornelissen, I., Ehler, E., Kakkar, V. V., Stalmans, I., Mattot, V., et al. (1999b). Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188. Nat Med 5, 495-502. Chader, G. J. (2001). PEDF: Raising both hopes and questions in controlling angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 2122-2124.

119

Chan, T. O., Rittenhouse, S. E., and Tsichlis, P. N. (1999). AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annu Rev Biochem 68, 965-1014. Charnock-Jones, D. S., Sharkey, A. M., Rajput-Williams, J., Burch, D., Schofield, J. P., Fountain, S. A., Boocock, C. A., and Smith, S. K. (1993). Identification and localization of alternately spliced mRNAs for vascular endothelial growth factor in human uterus and estrogen regulation in endometrial carcinoma cell lines. Biol Reprod 48, 1120-1128. Choi, K. (1998). Hemangioblast development and regulation. Biochem Cell Biol 76, 947-956. Chou, M. M., Hou, W., Johnson, J., Graham, L. K., Lee, M. H., Chen, C. S., Newton, A. C., Schaffhausen, B. S., and Toker, A. (1998). Regulation of protein kinase C zeta by PI 3-kinase and PDK-1. Curr Biol 8, 1069-1077. Chu, C. T., and Pizzo, S. V. (1993). Receptor-mediated antigen delivery into macrophages. Complexing antigen to alpha 2-macroglobulin enhances presentation to T cells. J Immunol 150, 48-58. Chung, J., Grammer, T. C., Lemon, K. P., Kazlauskas, A., and Blenis, J. (1994). PDGF- and insulin-dependent pp70S6k activation mediated by phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature 370, 71-75. Chung, J., Kuo, C. J., Crabtree, G. R., and Blenis, J. (1992). Rapamycin-FKBP specifically blocks growth-dependent activation of and signaling by the 70 kd S6 protein kinases. Cell 69, 1227-1236. Clauss, M., Gerlach, M., Gerlach, H., Brett, J., Wang, F., Familletti, P. C., Pan, Y. C., Olander, J. V., Connolly, D. T., and Stern, D. (1990). Vascular permeability factor: a tumor-derived polypeptide that induces endothelial cell and monocyte procoagulant activity, and promotes monocyte migration. J Exp Med 172, 1535-1545. Clauss, M., Weich, H., Breier, G., Knies, U., Rockl, W., Waltenberger, J., and Risau, W. (1996). The vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 mediates biological activities. Implications for a functional role of placenta growth factor in monocyte activation and chemotaxis. J Biol Chem 271, 17629-17634. Connolly, D. T., Olander, J. V., Heuvelman, D., Nelson, R., Monsell, R., Siegel, N., Haymore, B. L., Leimgruber, R., and Feder, J. (1989). Human vascular permeability factor. Isolation from U937 cells. J Biol Chem 264, 20017-20024. Critchfield, J. W., Coligan, J. E., Folks, T. M., and Butera, S. T. (1997). Casein kinase II is a selective target of HIV-1 transcriptional inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 6110-6115. Crookston, K. P., Webb, D. J., Wolf, B. B., and Gonias, S. L. (1994). Classification of alpha 2-macroglobulin-cytokine interactions based on affinity of noncovalent association in solution under apparent equilibrium conditions. J Biol Chem 269, 1533-1540. Cunningham, B. D., Threadgill, M. D., Groundwater, P. W., Dale, I. L., and Hickman, J. A. (1992). Synthesis and biological evaluation of a series of flavones designed as inhibitors of protein tyrosine kinases. Anticancer Drug Des 7, 365-384.

120

Cunningham, S. A., Waxham, M. N., Arrate, P. M., and Brock, T. A. (1995). Interaction of the Flt-1 tyrosine kinase receptor with the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase. Mapping of a novel site involved in binding. J Biol Chem 270, 20254-20257. D'Amore, P. A. (1994). Mechanisms of retinal and choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 3974-3979. Danser, A. H., Derkx, F. H., Admiraal, P. J., Deinum, J., de Jong, P. T., and Schalekamp, M. A. (1994). Angiotensin levels in the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 1008-1018. Datta, S. R., Brunet, A., and Greenberg, M. E. (1999). Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev 13, 2905-2927. Dawson, D. W., Volpert, O. V., Gillis, P., Crawford, S. E., Xu, H., Benedict, W., and Bouck, N. P. (1999). Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science 285, 245-248. Dennis, P. A., Saksela, O., Harpel, P., and Rifkin, D. B. (1989). Alpha 2-macroglobulin is a binding protein for basic fibroblast growth factor. J Biol Chem 264, 7210-7216. Dimmeler, S., Dernbach, E., and Zeiher, A. M. (2000). Phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase at ser-1177 is required for VEGF-induced endothelial cell migration. FEBS Lett 477, 258-262. Dimmeler, S., Haendeler, J., Rippmann, V., Nehls, M., and Zeiher, A. M. (1996). Shear stress inhibits apoptosis of human endothelial cells. FEBS Lett 399, 71-74. Doanes, A. M., Hegland, D. D., Sethi, R., Kovesdi, I., Bruder, J. T., and Finkel, T. (1999). VEGF stimulates MAPK through a pathway that is unique for receptor tyrosine kinases. Biochem Biophys Res Commun 255, 545-548. Dougher-Vermazen, M., Hulmes, J. D., Bohlen, P., and Terman, B. I. (1994). Biological activity and phosphorylation sites of the bacterially expressed cytosolic domain of the KDR VEGF-receptor. Biochem Biophys Res Commun 205, 728-738. Dufner, A., Andjelkovic, M., Burgering, B. M., Hemmings, B. A., and Thomas, G. (1999). Protein kinase B localization and activation differentially affect S6 kinase 1 activity and eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 phosphorylation. Mol Cell Biol 19, 4525-4534. Edinger, A., and Thompson, C. (2002). Akt maintains cell size and survival by increasing mTOR-dependent nutrient uptake. Mol Biol Cell 13, 2276-2288. Eliceiri, B. P., Paul, R., Schwartzberg, P. L., Hood, J. D., Leng, J., and Cheresh, D. A. (1999). Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Mol Cell 4, 915-924. Eriksson, U., and Alitalo, K. (1999). Structure, expression and receptor-binding properties of novel vascular endothelial growth factors. Curr Top Microbiol Immunol 237, 41-57. Fernandez, B., Buehler, A., Wolfram, S., Kostin, S., Espanion, G., Franz, W. M., Niemann, H., Doevendans, P. A., Schaper, W., and Zimmermann, R. (2000). Transgenic myocardial overexpression of fibroblast growth factor-1 increases coronary artery density and branching. Circ Res 87, 207-213.

121

Ferrara, N. (1999). Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 56, 794-814. Ferrara, N. (2001). Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 280, C1358-1366. Ferrara, N., Carver-Moore, K., Chen, H., Dowd, M., Lu, L., O'Shea, K. S., Powell-Braxton, L., Hillan, K. J., and Moore, M. W. (1996). Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature 380, 439-442. Fong, G. H., Rossant, J., Gertsenstein, M., and Breitman, M. L. (1995). Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature 376, 66-70. Fong, G. H., Zhang, L., Bryce, D. M., and Peng, J. (1999). Increased hemangioblast commitment, not vascular disorganization, is the primary defect in flt-1 knock-out mice. Development 126, 3015-3025. Fotsis, T., Pepper, M., Adlercreutz, H., Hase, T., Montesano, R., and Schweigerer, L. (1995). Genistein, a dietary ingested isoflavonoid, inhibits cell proliferation and in vitro angiogenesis. J Nutr 125, 790S-797S. Fotsis, T., Pepper, M. S., Aktas, E., Breit, S., Rasku, S., Adlercreutz, H., Wahala, K., Montesano, R., and Schweigerer, L. (1997). Flavonoids, dietary-derived inhibitors of cell proliferation and in vitro angiogenesis. Cancer Res 57, 2916-2921. Fuh, G., Li, B., Crowley, C., Cunningham, B., and Wells, J. A. (1998). Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 273, 11197-11204. Gale, N. W., Baluk, P., Pan, L., Kwan, M., Holash, J., DeChiara, T. M., McDonald, D. M., and Yancopoulos, G. D. (2001). Ephrin-B2 selectively marks arterial vessels and neovascularization sites in the adult, with expression in both endothelial and smooth-muscle cells. Dev Biol 230, 151-160. Gale, N. W., and Yancopoulos, G. D. (1999). Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases: VEGFs, angiopoietins, and ephrins in vascular development. Genes Dev 13, 1055-1066. Gamet-Payrastre, L., Manenti, S., Gratacap, M. P., Tulliez, J., Chap, H., and Payrastre, B. (1999). Flavonoids and the inhibition of PKC and PI 3-kinase. Gen Pharmacol 32, 279-286. Gendron, R. L., Adams, L. C., and Paradis, H. (2000). Tubedown-1, a novel acetyltransferase associated with blood vessel development. Dev Dyn 218, 300-315. Gerber, H. P., Dixit, V., and Ferrara, N. (1998a). Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J Biol Chem 273, 13313-13316. Gerber, H. P., McMurtrey, A., Kowalski, J., Yan, M., Keyt, B. A., Dixit, V., and Ferrara, N. (1998b). Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol Chem 273, 30336-30343. Gerhardinger, C., Brown, L. F., Roy, S., Mizutani, M., Zucker, C. L., and Lorenzi, M. (1998). Expression of vascular endothelial growth factor in the human retina and in nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Pathol 152, 1453-1462.

122

Gilbert, R. E., Vranes, D., Berka, J. L., Kelly, D. J., Cox, A., Wu, L. L., Stacker, S. A., and Cooper, M. E. (1998). Vascular endothelial growth factor and its receptors in control and diabetic rat eyes. Lab Invest 78, 1017-1027. Gille, H., Kowalski, J., Li, B., LeCouter, J., Moffat, B., Zioncheck, T. F., Pelletier, N., and Ferrara, N. (2001). Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1 (VEGFR-1) and KDR (VEGFR-2). A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants. J Biol Chem 276, 3222-3230. Gohongi, T., Fukumura, D., Boucher, Y., Yun, C. O., Soff, G. A., Compton, C., Todoroki, T., and Jain, R. K. (1999). Tumor-host interactions in the gallbladder suppress distal angiogenesis and tumor growth: involvement of transforming growth factor beta1. Nat Med 5, 1203-1208. Goligorsky, M. S., Abedi, H., Noiri, E., Takhtajan, A., Lense, S., Romanov, V., and Zachary, I. (1999). Nitric oxide modulation of focal adhesions in endothelial cells. Am J Physiol 276, C1271-1281. Gomez, R. A. (1998). Role of angiotensin in renal vascular development. Kidney Int Suppl 67, S12-16. Gonias, S. L., Carmichael, A., Mettenburg, J. M., Roadcap, D. W., Irvin, W. P., and Webb, D. J. (2000). Identical or overlapping sequences in the primary structure of human alpha(2)-macroglobulin are responsible for the binding of nerve growth factor-beta, platelet-derived growth factor-BB, and transforming growth factor-beta. J Biol Chem 275, 5826-5831. Gonzalez-Garcia, A., Garrido, E., Hernandez, C., Alvarez, B., Jimenez, C., Cantrell, D. A., Pullen, N., and Carrera, A. C. (2002). A new role for the p85-phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit linking FRAP to p70 S6 kinase activation. J Biol Chem 277, 1500-1508. Gratton, J. P., Morales-Ruiz, M., Kureishi, Y., Fulton, D., Walsh, K., and Sessa, W. C. (2001). Akt down-regulation of p38 signaling provides a novel mechanism of vascular endothelial growth factor-mediated cytoprotection in endothelial cells. J Biol Chem 276, 30359-30365. Graziani, Y., Erikson, E., and Erikson, R. L. (1983). The effect of quercetin on the phosphorylation activity of the Rous sarcoma virus transforming gene product in vitro and in vivo. Eur J Biochem 135, 583-589. Grierson, I., Heathcote, L., Hiscott, P., Hogg, P., Briggs, M., and Hagan, S. (2000). Hepatocyte growth factor/scatter factor in the eye. Prog Retin Eye Res 19, 779-802. Guo, D., Jia, Q., Song, H. Y., Warren, R. S., and Donner, D. B. (1995). Vascular endothelial cell growth factor promotes tyrosine phosphorylation of mediators of signal transduction that contain SH2 domains. Association with endothelial cell proliferation. J Biol Chem 270, 6729-6733. Guo, D. Q., Wu, L. W., Dunbar, J. D., Ozes, O. N., Mayo, L. D., Kessler, K. M., Gustin, J. A., Baerwald, M. R., Jaffe, E. A., Warren, R. S., and Donner, D. B. (2000). Tumor necrosis factor employs a protein-tyrosine phosphatase to inhibit activation of KDR and vascular endothelial cell growth factor-induced endothelial cell proliferation. J Biol Chem 275, 11216-11221. Hammes, H. P., Lin, J., Bretzel, R. G., Brownlee, M., and Breier, G. (1998). Upregulation of the vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor system in experimental background diabetic retinopathy of the rat. Diabetes 47, 401-406. Hanahan, D. (1997). Signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science 277, 48-50.

123

Harrington, E. O., Loffler, J., Nelson, P. R., Kent, K. C., Simons, M., and Ware, J. A. (1997). Enhancement of migration by protein kinase Calpha and inhibition of proliferation and cell cycle progression by protein kinase Cdelta in capillary endothelial cells. J Biol Chem 272, 7390-7397. Havsteen, B. (1983). Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem Pharmacol 32, 1141-1148. He, H., Venema, V. J., Gu, X., Venema, R. C., Marrero, M. B., and Caldwell, R. B. (1999). Vascular endothelial growth factor signals endothelial cell production of nitric oxide and prostacyclin through flk-1/KDR activation of c-Src. J Biol Chem 274, 25130-25135. Hellstrom, A., Perruzzi, C., Ju, M., Engstrom, E., Hard, A. L., Liu, J. L., Albertsson-Wikland, K., Carlsson, B., Niklasson, A., Sjodell, L., et al. (2001a). Low IGF-I suppresses VEGF-survival signaling in retinal endothelial cells: direct correlation with clinical retinopathy of prematurity. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 5804-5808. Hellstrom, M., Gerhardt, H., Kalen, M., Li, X., Eriksson, U., Wolburg, H., and Betsholtz, C. (2001b). Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J Cell Biol 153, 543-553. Hertog, M. G., Hollman, P. C., Katan, M. B., and Kromhout, D. (1993). Intake of potentially anticarcinogenic flavonoids and their determinants in adults in The Netherlands. Nutr Cancer 20, 21-29. Higaki, T., Sawada, S., Kono, Y., Imamura, H., Tada, Y., Yamasaki, S., Toratani, A., Sato, T., Komatsu, S., Akamatsu, N., et al. (1999). A role of protein kinase C in the regulation of cytosolic phospholipase A(2) in bradykinin-induced PGI(2) synthesis by human vascular endothelial cells. Microvasc Res 58, 144-155. Hiratsuka, S., Minowa, O., Kuno, J., Noda, T., and Shibuya, M. (1998). Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 9349-9354. Hirschi, K. K., and D'Amore, P. A. (1996). Pericytes in the microvasculature. Cardiovasc Res 32, 687-698. Hofman, P., Blaauwgeers, H. G., Tolentino, M. J., Adamis, A. P., Nunes Cardozo, B. J., Vrensen, G. F., and Schlingemann, R. O. (2000). VEGF-A induced hyperpermeability of blood-retinal barrier endothelium in vivo is predominantly associated with pinocytotic vesicular transport and not with formation of fenestrations. Vascular endothelial growth factor-A. Curr Eye Res 21, 637-645. Hofman, P., Blaauwgeers, H. G., Vrensen, G. F., and Schlingemann, R. O. (2001). Role of VEGF-A in endothelial phenotypic shift in human diabetic retinopathy and VEGF-A-induced retinopathy in monkeys. Ophthalmic Res 33, 156-162. Holash, J., Maisonpierre, P. C., Compton, D., Boland, P., Alexander, C. R., Zagzag, D., Yancopoulos, G. D., and Wiegand, S. J. (1999). Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science 284, 1994-1998. Holz, F. G., Sheraidah, G., Pauleikhoff, D., and Bird, A. C. (1994). Analysis of lipid deposits extracted from human macular and peripheral Bruch's membrane. Arch Ophthalmol 112, 402-406.

124

Huang, J. S., Huang, S. S., and Deuel, T. F. (1984). Specific covalent binding of platelet-derived growth factor to human plasma alpha 2-macroglobulin. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 342-346. Hughes, S., Yang, H., and Chan-Ling, T. (2000). Vascularization of the human fetal retina: roles of vasculogenesis and angiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci 41, 1217-1228. Ilic, D., Almeida, E. A., Schlaepfer, D. D., Dazin, P., Aizawa, S., and Damsky, C. H. (1998). Extracellular matrix survival signals transduced by focal adhesion kinase suppress p53-mediated apoptosis. J Cell Biol 143, 547-560. Ishida, S., Shinoda, K., Kawashima, S., Oguchi, Y., Okada, Y., and Ikeda, E. (2000). Coexpression of VEGF receptors VEGF-R2 and neuropilin-1 in proliferative diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci 41, 1649-1656. Ishige, K., Schubert, D., and Sagara, Y. (2001). Flavonoids protect neuronal cells from oxidative stress by three distinct mechanisms. Free Radic Biol Med 30, 433-446. Isotani, S., Hara, K., Tokunaga, C., Inoue, H., Avruch, J., and Yonezawa, K. (1999). Immunopurified mammalian target of rapamycin phosphorylates and activates p70 S6 kinase alpha in vitro. J Biol Chem 274, 34493-34498. Jefferies, H. B., Fumagalli, S., Dennis, P. B., Reinhard, C., Pearson, R. B., and Thomas, G. (1997). Rapamycin suppresses 5'TOP mRNA translation through inhibition of p70s6k. Embo J 16, 3693-3704. Jeltsch, M., Kaipainen, A., Joukov, V., Meng, X., Lakso, M., Rauvala, H., Swartz, M., Fukumura, D., Jain, R. K., and Alitalo, K. (1997). Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice. Science 276, 1423-1425. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., and Semenza, G. L. (1996). Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 271, 17771-17778. Joukov, V., Pajusola, K., Kaipainen, A., Chilov, D., Lahtinen, I., Kukk, E., Saksela, O., Kalkkinen, N., and Alitalo, K. (1996). A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. Embo J 15, 290-298. Joukov, V., Sorsa, T., Kumar, V., Jeltsch, M., Claesson-Welsh, L., Cao, Y., Saksela, O., Kalkkinen, N., and Alitalo, K. (1997). Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C. Embo J 16, 3898-3911. Joussen, A. M., Rohrschneider, K., Reichling, J., Kirchhof, B., and Kruse, F. E. (2000). Treatment of corneal neovascularization with dietary isoflavonoids and flavonoids. Exp Eye Res 71, 483-487. Kalka, C., Masuda, H., Takahashi, T., Gordon, R., Tepper, O., Gravereaux, E., Pieczek, A., Iwaguro, H., Hayashi, S. I., Isner, J. M., and Asahara, T. (2000). Vascular endothelial growth factor(165) gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in human subjects. Circ Res 86, 1198-1202. Kendall, R. L., and Thomas, K. A. (1993). Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 10705-10709.

125

Kerbel, R., and Folkman, J. (2002). Clinical translation of angiogenesis inhibitors. Nat Rev Cancer 2, 727-739. Keyt, B. A., Berleau, L. T., Nguyen, H. V., Chen, H., Heinsohn, H., Vandlen, R., and Ferrara, N. (1996). The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem 271, 7788-7795. Khaliq, A., Foreman, D., Ahmed, A., Weich, H., Gregor, Z., McLeod, D., and Boulton, M. (1998). Increased expression of placenta growth factor in proliferative diabetic retinopathy. Lab Invest 78, 109-116. Kim, I., Ryan, A. M., Rohan, R., Amano, S., Agular, S., Miller, J. W., and Adamis, A. P. (1999). Constitutive expression of VEGF, VEGFR-1, and VEGFR-2 in normal eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 40, 2115-2121. Kim, M. H. (2003). Flavonoids inhibit VEGF/bFGF-induced angiogenesis in vitro by inhibiting the matrix-degrading proteases. J Cell Biochem 89, 529-538. Kimura, H., Weisz, A., Kurashima, Y., Hashimoto, K., Ogura, T., D'Acquisto, F., Addeo, R., Makuuchi, M., and Esumi, H. (2000). Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth factor gene mediates transcriptional regulation by nitric oxide: control of hypoxia-inducible factor-1 activity by nitric oxide. Blood 95, 189-197. Kliffen, M., Sharma, H. S., Mooy, C. M., Kerkvliet, S., and de Jong, P. T. (1997). Increased expression of angiogenic growth factors in age-related maculopathy. Br J Ophthalmol 81, 154-162. Kockx, M. M., and Knaapen, M. W. (2000). The role of apoptosis in vascular disease. J Pathol 190, 267-280. Korte, G. E., Reppucci, V., and Henkind, P. (1984). RPE destruction causes choriocapillary atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci 25, 1135-1145. Krah, K., Mironov, V., Risau, W., and Flamme, I. (1994). Induction of vasculogenesis in quail blastodisc-derived embryoid bodies. Dev Biol 164, 123-132. Krebs, L. T., Xue, Y., Norton, C. R., Shutter, J. R., Maguire, M., Sundberg, J. P., Gallahan, D., Closson, V., Kitajewski, J., Callahan, R., et al. (2000). Notch signaling is essential for vascular morphogenesis in mice. Genes Dev 14, 1343-1352. Kroll, J., and Waltenberger, J. (1997). The vascular endothelial growth factor receptor KDR activates multiple signal transduction pathways in porcine aortic endothelial cells. J Biol Chem 272, 32521-32527. Kroll, J., and Waltenberger, J. (1999). A novel function of VEGF receptor-2 (KDR): rapid release of nitric oxide in response to VEGF-A stimulation in endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 265, 636-639. Kuhnau, J. (1976). The flavonoids. A class of semi-essential food components: their role in human nutrition. World Rev Nutr Diet 24, 117-191. Kukk, E., Lymboussaki, A., Taira, S., Kaipainen, A., Jeltsch, M., Joukov, V., and Alitalo, K. (1996). VEGF-C receptor binding and pattern of expression with VEGFR-3 suggests a role in lymphatic vascular development. Development 122, 3829-3837.

126

Kuwabara, K., Matsumoto, M., Ikeda, J., Hori, O., Ogawa, S., Maeda, Y., Kitagawa, K., Imuta, N., Kinoshita, T., Stern, D. M., et al. (1996). Purification and characterization of a novel stress protein, the 150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150), from cultured rat astrocytes and its expression in ischemic mouse brain. J Biol Chem 271, 5025-5032. Lahdenranta, J., Pasqualini, R., Schlingemann, R. O., Hagedorn, M., Stallcup, W. B., Bucana, C. D., Sidman, R. L., and Arap, W. (2001). An anti-angiogenic state in mice and humans with retinal photoreceptor cell degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 10368-10373. Laird, A., Christensen, J., Li, G., Carver, J., Smith, K., Xin, X., Moss, K., Louie, S., Mendel, D., and Cherrington, J. (2002). SU6668 inhibits Flk-1/KDR and PDGFRbeta in vivo, resulting in rapid apoptosis of tumor vasculature and tumor regression in mice. FASEB J 16, 681-690. Laird, A., Vajkoczy, P., Shawver, L., Thurnhe, r. A., Liang, C., Mohammadi, M., Schlessinge, r. J., Ullrich, A., Hubbard, S., Blake, R., et al. (2000). SU6668 is a potent antiangiogenic and antitumor agent that induces regression of established tumors. Cancer Res 60, 4152-4160. Lamoreaux, W. J., Fitzgerald, M. E., Reiner, A., Hasty, K. A., and Charles, S. T. (1998). Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro. Microvasc Res 55, 29-42. Landgren, E., Schiller, P., Cao, Y., and Claesson-Welsh, L. (1998). Placenta growth factor stimulates MAP kinase and mitogenicity but not phospholipase C-gamma and migration of endothelial cells expressing Flt 1. Oncogene 16, 359-367. Lane, H. A., Fernandez, A., Lamb, N. J., and Thomas, G. (1993). p70s6k function is essential for G1 progression. Nature 363, 170-172. Le Good, J., Ziegler, W., Parekh, D., Alessi, D., Cohen, P., and Parker, P. (1998). Protein kinase C isotypes controlled by phosphoinositide 3-kinase through the protein kinase PDK1. Science 281, 2042-2045. Lee, M. J., Prabhu, S., Meng, X., Li, C., and Yang, C. S. (2000). An improved method for the determination of green and black tea polyphenols in biomatrices by high-performance liquid chromatography with coulometric array detection. Anal Biochem 279, 164-169. Lee, P., Wang, C. C., and Adamis, A. P. (1998). Ocular neovascularization: an epidemiologic review. Surv Ophthalmol 43, 245-269. Levkau, B., Herren, B., Koyama, H., Ross, R., and Raines, E. W. (1998). Caspase-mediated cleavage of focal adhesion kinase pp125FAK and disassembly of focal adhesions in human endothelial cell apoptosis. J Exp Med 187, 579-586. Li, J., Hampton, T., Morgan, J. P., and Simons, M. (1997). Stretch-induced VEGF expression in the heart. J Clin Invest 100, 18-24. Li, J., Perrella, M. A., Tsai, J. C., Yet, S. F., Hsieh, C. M., Yoshizumi, M., Patterson, C., Endege, W. O., Zhou, F., and Lee, M. E. (1995). Induction of vascular endothelial growth factor gene expression by interleukin-1 beta in rat aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 270, 308-312. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., and Hebbel, R. P. (2000). Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 105, 71-77.

127

Lindahl, P., Bostrom, H., Karlsson, L., Hellstrom, M., Kalen, M., and Betsholtz, C. (1999). Role of platelet-derived growth factors in angiogenesis and alveogenesis. Curr Top Pathol 93, 27-33. Lindahl, P., Hellstrom, M., Kalen, M., and Betsholtz, C. (1998). Endothelial-perivascular cell signaling in vascular development: lessons from knockout mice. Curr Opin Lipidol 9, 407-411. Liotta, L. A., Steeg, P. S., and Stetler-Stevenson, W. G. (1991). Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 64, 327-336. Liu, Y., Wada, R., Yamashita, T., Mi, Y., Deng, C. X., Hobson, J. P., Rosenfeldt, H. M., Nava, V. E., Chae, S. S., Lee, M. J., et al. (2000). Edg-1, the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate, is essential for vascular maturation. J Clin Invest 106, 951-961. Liu, Z. Y., Ganju, R. K., Wang, J. F., Schweitzer, K., Weksler, B., Avraham, S., and Groopman, J. E. (1997). Characterization of signal transduction pathways in human bone marrow endothelial cells. Blood 90, 2253-2259. Lopez-Lazaro, M. (2002). Flavonoids as anticancer agents: structure-activity relationship study. Curr Med Chem Anti-Canc Agents 2, 691-714. Lu, M., Kuroki, M., Amano, S., Tolentino, M., Keough, K., Kim, I., Bucala, R., and Adamis, A. P. (1998). Advanced glycation end products increase retinal vascular endothelial growth factor expression. J Clin Invest 101, 1219-1224. Lutty, G. A., McLeod, D. S., Merges, C., Diggs, A., and Plouet, J. (1996). Localization of vascular endothelial growth factor in human retina and choroid. Arch Ophthalmol 114, 971-977. Lyden, D., Young, A. Z., Zagzag, D., Yan, W., Gerald, W., O'Reilly, R., Bader, B. L., Hynes, R. O., Zhuang, Y., Manova, K., and Benezra, R. (1999). Id1 and Id3 are required for neurogenesis, angiogenesis and vascularization of tumour xenografts. Nature 401, 670-677. Madrid, L. V., Mayo, M. W., Reuther, J. Y., and Baldwin, A. S., Jr. (2001). Akt stimulates the transactivation potential of the RelA/p65 Subunit of NF-kappa B through utilization of the Ikappa B kinase and activation of the mitogen-activated protein kinase p38. J Biol Chem 276, 18934-18940. Maisonpierre, P. C., Suri, C., Jones, P. F., Bartunkova, S., Wiegand, S. J., Radziejewski, C., Compton, D., McClain, J., Aldrich, T. H., Papadopoulos, N., et al. (1997). Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277, 55-60. Manach, C., Morand, C., Demigne, C., Texier, O., Regerat, F., and Remesy, C. (1997). Bioavailability of rutin and quercetin in rats. FEBS Lett 409, 12-16. Maniatis, Sambrook, and Fritsch (1989). Molecular Cloning ALaboratory Manual, second edition edn, Cold Spring Harbor Labor. Rress). Marti, H. H., and Risau, W. (1998). Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 15809-15814. Matsuda, T., Hirano, T., Nagasawa, S., and Kishimoto, T. (1989). Identification of alpha 2-macroglobulin as a carrier protein for IL-6. J Immunol 142, 148-152.

128

Matsumoto, T., Turesson, I., Book, M., Gerwins, P., and Claesson-Welsh, L. (2002). p38 MAP kinase negatively regulates endothelial cell survival, proliferation, and differentiation in FGF-2-stimulated angiogenesis. J Cell Biol 156. McBride, J. L., and Ruiz, J. C. (1998). Ephrin-A1 is expressed at sites of vascular development in the mouse. Mech Dev 77, 201-204. Meyer, M., Clauss, M., Lepple-Wienhues, A., Waltenberger, J., Augustin, H. G., Ziche, M., Lanz, C., Buttner, M., Rziha, H. J., and Dehio, C. (1999). A novel vascular endothelial growth factor encoded by Orf virus, VEGF-E, mediates angiogenesis via signalling through VEGFR-2 (KDR) but not VEGFR-1 (Flt-1) receptor tyrosine kinases. Embo J 18, 363-374. Millauer, B., Wizigmann-Voos, S., Schnurch, H., Martinez, R., Moller, N. P., Risau, W., and Ullrich, A. (1993). High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell 72, 835-846. Miller, A. B. (1990). Diet and cancer. A review. Acta Oncol 29, 87-95. Miller, J. W., Adamis, A. P., and Aiello, L. P. (1997). Vascular endothelial growth factor in ocular neovascularization and proliferative diabetic retinopathy. Diabetes Metab Rev 13, 37-50. Moiseeva, E. P. (2001). Adhesion receptors of vascular smooth muscle cells and their functions. Cardiovasc Res 52, 372-386. Mori, K., Gehlbach, P., Yamamoto, S., Duh, E., Zack, D. J., Li, Q., Berns, K. I., Raisler, B. J., Hauswirth, W. W., and Campochiaro, P. A. (2002). AAV-mediated gene transfer of pigment epithelium-derived factor inhibits choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 1994-2000. Murata, T., Ishibashi, T., Khalil, A., Hata, Y., Yoshikawa, H., and Inomata, H. (1995). Vascular endothelial growth factor plays a role in hyperpermeability of diabetic retinal vessels. Ophthalmic Res 27, 48-52. Murata, T., Nakagawa, K., Khalil, A., Ishibashi, T., Inomata, H., and Sueishi, K. (1996). The relation between expression of vascular endothelial growth factor and breakdown of the blood-retinal barrier in diabetic rat retinas. Lab Invest 74, 819-825. Murohara, T., Asahara, T., Silver, M., Bauters, C., Masuda, H., Kalka, C., Kearney, M., Chen, D., Symes, J. F., Fishman, M. C., et al. (1998). Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia. J Clin Invest 101, 2567-2578. Myhrstad, M. C., Carlsen, H., Nordstrom, O., Blomhoff, R., and Moskaug, J. O. (2002). Flavonoids increase the intracellular glutathione level by transactivation of the gamma-glutamylcysteine synthetase catalytical subunit promoter. Free Radic Biol Med 32, 386-393. Nave, B. T., Ouwens, M., Withers, D. J., Alessi, D. R., and Shepherd, P. R. (1999). Mammalian target of rapamycin is a direct target for protein kinase B: identification of a convergence point for opposing effects of insulin and amino-acid deficiency on protein translation. Biochem J 344 Pt 2, 427-431. Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., and Matrisian, L. M. (2000). Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol 18, 1135-1149. Neufeld, G., Cohen, T., Gengrinovitch, S., and Poltorak, Z. (1999). Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. Faseb J 13, 9-22.

129

Ng, T. B., Huang, B., Fong, W. P., and Yeung, H. W. (1997). Anti-human immunodeficiency virus (anti-HIV) natural products with special emphasis on HIV reverse transcriptase inhibitors. Life Sci 61, 933-949. Noiri, E., Hu, Y., Bahou, W. F., Keese, C. R., Giaever, I., and Goligorsky, M. S. (1997). Permissive role of nitric oxide in endothelin-induced migration of endothelial cells. J Biol Chem 272, 1747-1752. O'Connor-McCourt, M. D., and Wakefield, L. M. (1987). Latent transforming growth factor-beta in serum. A specific complex with alpha 2-macroglobulin. J Biol Chem 262, 14090-14099. Ogata, N., Wada, M., Otsuji, T., Jo, N., Tombran-Tink, J., and Matsumura, M. (2002). Expression of pigment epithelium-derived factor in normal adult rat eye and experimental choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 1168-1175. Olivero-Verbel, J., and Pacheco-Londono, L. (2002). Structure-activity relationships for the anti-HIV activity of flavonoids. J Chem Inf Comput Sci 42, 1241-1246. Olofsson, B., Jeltsch, M., Eriksson, U., and Alitalo, K. (1999). Current biology of VEGF-B and VEGF-C. Curr Opin Biotechnol 10, 528-535. Olofsson, B., Korpelainen, E., Pepper, M. S., Mandriota, S. J., Aase, K., Kumar, V., Gunji, Y., Jeltsch, M. M., Shibuya, M., Alitalo, K., and Eriksson, U. (1998). Vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) binds to VEGF receptor-1 and regulates plasminogen activator activity in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 11709-11714. Opipari, A. W., Jr., Hu, H. M., Yabkowitz, R., and Dixit, V. M. (1992). The A20 zinc finger protein protects cells from tumor necrosis factor cytotoxicity. J Biol Chem 267, 12424-12427. O'Reilly, M. S., Boehm, T., Shing, Y., Fukai, N., Vasios, G., Lane, W. S., Flynn, E., Birkhead, J. R., Olsen, B. R., and Folkman, J. (1997). Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 88, 277-285. O'Reilly, M. S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R. A., Cao, Y., Moses, M., Lane, W. S., Sage, E. H., and Folkman, J. (1994). Angiostatin: a circulating endothelial cell inhibitor that suppresses angiogenesis and tumor growth. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59, 471-482. Orlandi, A., Ehrlich, H. P., Ropraz, P., Spagnoli, L. G., and Gabbiani, G. (1994). Rat aortic smooth muscle cells isolated from different layers and at different times after endothelial denudation show distinct biological features in vitro. Arterioscler Thromb 14, 982-989. Osada, T., Noro, N., Kuroda, Y., and Ikai, A. (1987). Murine T cell proliferation can be specifically augmented by macrophages fed with specific antigen: alpha-2-macroglobulin conjugate. Biochem Biophys Res Commun 146, 26-31. Osterud, B., and Bjorklid, E. (2001). The tissue factor pathway in disseminated intravascular coagulation. Semin Thromb Hemost 27, 605-617. Otani, A., Takagi, H., Suzuma, K., and Honda, Y. (1998). Angiotensin II potentiates vascular endothelial growth factor-induced angiogenic activity in retinal microcapillary endothelial cells. Circ Res 82, 619-628. Ozaki, H., Seo, M. S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J. M., and Campochiaro, P. A. (2000). Blockade of vascular endothelial cell growth factor

130

receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization. Am J Pathol 156, 697-707. Ozawa, K., Kondo, T., Hori, O., Kitao, Y., Stern, D. M., Eisenmenger, W., Ogawa, S., and Ohshima, T. (2001a). Expression of the oxygen-regulated protein ORP150 accelerates wound healing by modulating intracellular VEGF transport. J Clin Invest 108, 41-50. Ozawa, K., Kuwabara, K., Tamatani, M., Takatsuji, K., Tsukamoto, Y., Kaneda, S., Yanagi, H., Stern, D. M., Eguchi, Y., Tsujimoto, Y., et al. (1999). 150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150) suppresses hypoxia-induced apoptotic cell death. J Biol Chem 274, 6397-6404. Ozawa, K., Tsukamoto, Y., Hori, O., Kitao, Y., Yanagi, H., Stern, D. M., and Ogawa, S. (2001b). Regulation of tumor angiogenesis by oxygen-regulated protein 150, an inducible endoplasmic reticulum chaperone. Cancer Res 61, 4206-4213. Ozes, O., Mayo, L., Gustin, J., Pfeffer, S., Pfeffer, L., and Donner, D. (1999). NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase. nature 401, 82-85. Papapetropoulos, A., Fulton, D., Mahboubi, K., Kalb, R. G., O'Connor, D. S., Li, F., Altieri, D. C., and Sessa, W. C. (2000). Angiopoietin-1 inhibits endothelial cell apoptosis via the Akt/survivin pathway. J Biol Chem 275, 9102-9105. Paques, M., Massin, P., and Gaudric, A. (1997). Growth factors and diabetic retinopathy. Diabetes Metab 23, 125-130. Parenti, A., Morbidelli, L., Cui, X. L., Douglas, J. G., Hood, J. D., Granger, H. J., Ledda, F., and Ziche, M. (1998). Nitric oxide is an upstream signal of vascular endothelial growth factor-induced extracellular signal-regulated kinase1/2 activation in postcapillary endothelium. J Biol Chem 273, 4220-4226. Pedram, A., Razandi, M., and Levin, E. R. (1998). Extracellular signal-regulated protein kinase/Jun kinase cross-talk underlies vascular endothelial cell growth factor-induced endothelial cell proliferation. J Biol Chem 273, 26722-26728. Pe'er, J., Folberg, R., Itin, A., Gnessin, H., Hemo, I., and Keshet, E. (1996). Upregulated expression of vascular endothelial growth factor in proliferative diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol 80, 241-245. Pepper, M. S. (1997). Transforming growth factor-beta: vasculogenesis, angiogenesis, and vessel wall integrity. Cytokine Growth Factor Rev 8, 21-43. Persico, M. G., Vincenti, V., and DiPalma, T. (1999). Structure, expression and receptor-binding properties of placenta growth factor (PlGF). Curr Top Microbiol Immunol 237, 31-40. Peterson, R. T., Desai, B. N., Hardwick, J. S., and Schreiber, S. L. (1999). Protein phosphatase 2A interacts with the 70-kDa S6 kinase and is activated by inhibition of FKBP12-rapamycinassociated protein. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4438-4442. Pettersson, A., Nagy, J. A., Brown, L. F., Sundberg, C., Morgan, E., Jungles, S., Carter, R., Krieger, J. E., Manseau, E. J., Harvey, V. S., et al. (2000). Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor. Lab Invest 80, 99-115.

131

Pierce, E. A., Avery, R. L., Foley, E. D., Aiello, L. P., and Smith, L. E. (1995). Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 905-909. Plaper, A., Golob, M., Hafner, I., Oblak, M., Solmajer, T., and Jerala, R. (2003). Characterization of quercetin binding site on DNA gyrase. Biochem Biophys Res Commun 306, 530-536. Plate, K. H., Breier, G., Weich, H. A., Mennel, H. D., and Risau, W. (1994). Vascular endothelial growth factor and glioma angiogenesis: coordinate induction of VEGF receptors, distribution of VEGF protein and possible in vivo regulatory mechanisms. Int J Cancer 59, 520-529. Plate, K. H., and Warnke, P. C. (1997). Vascular endothelial growth factor. J Neurooncol 35, 365-372. Provis, J. M. (2001). Development of the primate retinal vasculature. Prog Retin Eye Res 20, 799-821. Provis, J. M., Leech, J., Diaz, C. M., Penfold, P. L., Stone, J., and Keshet, E. (1997). Development of the human retinal vasculature: cellular relations and VEGF expression. Exp Eye Res 65, 555-568. Pullen, N., Dennis, P., Andjelkovic, M., Dufner, A., Kozma, S., Hemmings, B., and Thomas, G. (1998). Phosphorylation and activation of p70s6k by PDK1. Science 279, 673-674. Rafii, S. (2000). Circulating endothelial precursors: mystery, reality, and promise. J Clin Invest 105, 17-19. Raines, E. W., Bowen-Pope, D. F., and Ross, R. (1984). Plasma binding proteins for platelet-derived growth factor that inhibit its binding to cell-surface receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3424-3428. Ramos, M. A., Kuzuya, M., Esaki, T., Miura, S., Satake, S., Asai, T., Kanda, S., Hayashi, T., and Iguchi, A. (1998). Induction of macrophage VEGF in response to oxidized LDL and VEGF accumulation in human atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 18, 1188-1196. Ramrattan, R. S., van der Schaft, T. L., Mooy, C. M., de Bruijn, W. C., Mulder, P. G., and de Jong, P. T. (1994). Morphometric analysis of Bruch's membrane, the choriocapillaris, and the choroid in aging. Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 2857-2864. Reif, K., Burgering, B. M., and Cantrell, D. A. (1997). Phosphatidylinositol 3-kinase links the interleukin-2 receptor to protein kinase B and p70 S6 kinase. J Biol Chem 272, 14426-14433. Reinli, K., and Block, G. (1996). Phytoestrogen content of foods--a compendium of literature values. Nutr Cancer 26, 123-148. Risau, W. (1995). Differentiation of endothelium. Faseb J 9, 926-933. Risau, W. (1998). Development and differentiation of endothelium. Kidney Int Suppl 67, S3-6. Robinson, G. S., Ju, M., Shih, S. C., Xu, X., McMahon, G., Caldwell, R. B., and Smith, L. E. (2001). Nonvascular role for VEGF: VEGFR-1, 2 activity is critical for neural retinal development. Faseb J 15, 1215-1217.

132

Robinson, M. J., and Cobb, M. H. (1997). Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr Opin Cell Biol 9, 180-186. Roeckl, W., Hecht, D., Sztajer, H., Waltenberger, J., Yayon, A., and Weich, H. A. (1998). Differential binding characteristics and cellular inhibition by soluble VEGF receptors 1 and 2. Exp Cell Res 241, 161-170. Romanelli, A., Dreisbach, V., and Blenis, J. (2002). Characterization of phosphatidylinositol 3-kinase-dependent phosphorylation of the hydrophobic motif site Thr(389) in p70 S6 kinase 1. J Biol Chem 277, 40281-40289. Romanelli, A., Martin, K. A., Toker, A., and Blenis, J. (1999). p70 S6 kinase is regulated by protein kinase Czeta and participates in a phosphoinositide 3-kinase-regulated signalling complex. Mol Cell Biol 19, 2921-2928. Romanova, D., Vachalkova, A., Cipak, L., Ovesna, Z., and Rauko, P. (2001). Study of antioxidant effect of apigenin, luteolin and quercetin by DNA protective method. Neoplasma 48, 104-107. Romashkova, J., and Makarov, S. (1999). NF-kappaB is a target of AKT in anti-apoptotic PDGF signalling. nature 401, 33-34. Ronne, H., Anundi, H., Rask, L., and Peterson, P. A. (1979). Nerve growth factor binds to serum alpha-2-macroglobulin. Biochem Biophys Res Commun 87, 330-336. Rotelli, A. E., Guardia, T., Juarez, A. O., de la Rocha, N. E., and Pelzer, L. E. (2003). Comparative study of flavonoids in experimental models of inflammation. Pharmacol Res 48, 601-606. Rousseau, S., Houle, F., Kotanides, H., Witte, L., Waltenberger, J., Landry, J., and Huot, J. (2000). Vascular endothelial growth factor (VEGF)-driven actin-based motility is mediated by VEGFR2 and requires concerted activation of stress-activated protein kinase 2 (SAPK2/p38) and geldanamycin-sensitive phosphorylation of focal adhesion kinase. J Biol Chem 275, 10661-10672. Rousseau, S., Houle, F., Landry, J., and Huot, J. (1997). p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene 15, 2169-2177. Rubin, L. L., and Staddon, J. M. (1999). The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci 22, 11-28. Rucker, H. K., Wynder, H. J., and Thomas, W. E. (2000). Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain Res Bull 51, 363-369. Sackeyfio, A. C., and Lugeleka, O. M. (1986). The anti-inflammatory effect of a crude aqueous extract of the root bark of "Ficus elastica" in the rat. Arch Int Pharmacodyn Ther 281, 169-176. Sakurai, H., Chiba, H., Miyoshi, H., Sugita, T., and Toriumi, W. (1999). IkappaB kinases phosphorylate NF-kappaB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain. J Biol Chem 274, 30353-30356. Scheid, M. P., Huber, M., Damen, J. E., Hughes, M., Kang, V., Neilsen, P., Prestwich, G. D., Krystal, G., and Duronio, V. (2002). Phosphatidylinositol (3,4,5)P3 is essential but not sufficient for protein kinase B (PKB) activation; phosphatidylinositol (3,4)P2 is required for

133

PKB phosphorylation at Ser-473: studies using cells from SH2-containing inositol-5-phosphatase knockout mice. J Biol Chem 277, 9027-9035. Schwesinger, C., Yee, C., Rohan, R. M., Joussen, A. M., Fernandez, A., Meyer, T. N., Poulaki, V., Ma, J. J., Redmond, T. M., Liu, S., et al. (2001). Intrachoroidal neovascularization in transgenic mice overexpressing vascular endothelial growth factor in the retinal pigment epithelium. Am J Pathol 158, 1161-1172. Senger, D. R., Claffey, K. P., Benes, J. E., Perruzzi, C. A., Sergiou, A. P., and Detmar, M. (1997). Angiogenesis promoted by vascular endothelial growth factor: regulation through alpha1beta1 and alpha2beta1 integrins. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13612-13617. Shalaby, F., Ho, J., Stanford, W. L., Fischer, K. D., Schuh, A. C., Schwartz, L., Bernstein, A., and Rossant, J. (1997). A requirement for Flk1 in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis. Cell 89, 981-990. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., Gertsenstein, M., Wu, X. F., Breitman, M. L., and Schuh, A. C. (1995). Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature 376, 62-66. Shen, B. Q., Lee, D. Y., and Zioncheck, T. F. (1999). Vascular endothelial growth factor governs endothelial nitric-oxide synthase expression via a KDR/Flk-1 receptor and a protein kinase C signaling pathway. J Biol Chem 274, 33057-33063. Shibuya, M. (2001). Structure and dual function of vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1). Int J Biochem Cell Biol 33, 409-420. Shin, D., Garcia-Cardena, G., Hayashi, S., Gerety, S., Asahara, T., Stavrakis, G., Isner, J., Folkman, J., Gimbrone, M. A., Jr., and Anderson, D. J. (2001). Expression of ephrinB2 identifies a stable genetic difference between arterial and venous vascular smooth muscle as well as endothelial cells, and marks subsets of microvessels at sites of adult neovascularization. Dev Biol 230, 139-150. Shinoda, K., Ishida, S., Kawashima, S., Wakabayashi, T., Matsuzaki, T., Takayama, M., Shinmura, K., and Yamada, M. (1999). Comparison of the levels of hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor in aqueous fluid and serum with grades of retinopathy in patients with diabetes mellitus. Br J Ophthalmol 83, 834-837. Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., and Keshet, E. (1992). Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 359, 843-845. Shweiki, D., Neeman, M., Itin, A., and Keshet, E. (1995). Induction of vascular endothelial growth factor expression by hypoxia and by glucose deficiency in multicell spheroids: implications for tumor angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 768-772. Smith, G., McLeod, D., Foreman, D., and Boulton, M. (1999). Immunolocalisation of the VEGF receptors FLT-1, KDR, and FLT-4 in diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol 83, 486-494. Smith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp, J., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G., and Schaeffer, J. M. (1997). Essential role of growth hormone in ischemia-induced retinal neovascularization. Science 276, 1706-1709. Soker, S., Svahn, C. M., and Neufeld, G. (1993). Vascular endothelial growth factor is inactivated by binding to alpha 2-macroglobulin and the binding is inhibited by heparin. J Biol Chem 268, 7685-7691.

134

Soldi, R., Mitola, S., Strasly, M., Defilippi, P., Tarone, G., and Bussolino, F. (1999). Role of alphavbeta3 integrin in the activation of vascular endothelial growth factor receptor-2. Embo J 18, 882-892. Sone, H., Kawakami, Y., Okuda, Y., Sekine, Y., Honmura, S., Matsuo, K., Segawa, T., Suzuki, H., and Yamashita, K. (1997). Ocular vascular endothelial growth factor levels in diabetic rats are elevated before observable retinal proliferative changes. Diabetologia 40, 726-730. Spilsbury, K., Garrett, K. L., Shen, W. Y., Constable, I. J., and Rakoczy, P. E. (2000). Overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the retinal pigment epithelium leads to the development of choroidal neovascularization. Am J Pathol 157, 135-144. Spranger, J., Osterhoff, M., Reimann, M., Mohlig, M., Ristow, M., Francis, M. K., Cristofalo, V., Hammes, H. P., Smith, G., Boulton, M., and Pfeiffer, A. F. (2001). Loss of the antiangiogenic pigment epithelium-derived factor in patients with angiogenic eye disease. Diabetes 50, 2641-2645. Stavri, G. T., Hong, Y., Zachary, I. C., Breier, G., Baskerville, P. A., Yla-Herttuala, S., Risau, W., Martin, J. F., and Erusalimsky, J. D. (1995a). Hypoxia and platelet-derived growth factor-BB synergistically upregulate the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 358, 311-315. Stavri, G. T., Zachary, I. C., Baskerville, P. A., Martin, J. F., and Erusalimsky, J. D. (1995b). Basic fibroblast growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia. Circulation 92, 11-14. Stefanec, T. (2000). Endothelial apoptosis: could it have a role in the pathogenesis and treatment of disease? Chest 117, 841-854. Stellmach, V., Crawford, S. E., Zhou, W., and Bouck, N. (2001). Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 2593-2597. Stitt, A. W., Simpson, D. A., Boocock, C., Gardiner, T. A., Murphy, G. M., and Archer, D. B. (1998). Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors is regulated in eyes with intra-ocular tumours. J Pathol 186, 306-312. Stone, J., Chan-Ling, T., Pe'er, J., Itin, A., Gnessin, H., and Keshet, E. (1996). Roles of vascular endothelial growth factor and astrocyte degeneration in the genesis of retinopathy of prematurity. Invest Ophthalmol Vis Sci 37, 290-299. Sun, L., Liang, C., Shirazian, S., Zhou, Y., Miller, T., Cui, J., Fukuda, J., Chu, J., Nematalla, A., Wang, X., et al. (2003). Discovery of 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenemethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (2-diethylaminoethyl)amide, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial and platelet-derived growth factor receptor tyrosine kinase. J Med Chem 46, 1116-1119. Suri, C., Jones, P. F., Patan, S., Bartunkova, S., Maisonpierre, P. C., Davis, S., Sato, T. N., and Yancopoulos, G. D. (1996). Requisite role of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 87, 1171-1180. Suri, C., McClain, J., Thurston, G., McDonald, D. M., Zhou, H., Oldmixon, E. H., Sato, T. N., and Yancopoulos, G. D. (1998). Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1. Science 282, 468-471.

135

Takahashi, T., Kalka, C., Masuda, H., Chen, D., Silver, M., Kearney, M., Magner, M., Isner, J. M., and Asahara, T. (1999a). Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 5, 434-438. Takahashi, T., and Shibuya, M. (1997). The 230 kDa mature form of KDR/Flk-1 (VEGF receptor-2) activates the PLC-gamma pathway and partially induces mitotic signals in NIH3T3 fibroblasts. Oncogene 14, 2079-2089. Takahashi, T., Ueno, H., and Shibuya, M. (1999b). VEGF activates protein kinase C-dependent, but Ras-independent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells. Oncogene 18, 2221-2230. Terman, B. I., Dougher-Vermazen, M., Carrion, M. E., Dimitrov, D., Armellino, D. C., Gospodarowicz, D., and Bohlen, P. (1992). Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor. Biochem Biophys Res Commun 187, 1579-1586. Thakker, G. D., Hajjar, D. P., Muller, W. A., and Rosengart, T. K. (1999). The role of phosphatidylinositol 3-kinase in vascular endothelial growth factor signaling. J Biol Chem 274, 10002-10007. Thieme, H., Aiello, L. P., Takagi, H., Ferrara, N., and King, G. L. (1995). Comparative analysis of vascular endothelial growth factor receptors on retinal and aortic vascular endothelial cells. Diabetes 44, 98-103. Thomas, G. (2000). An encore for ribosome biogenesis in the control of cell proliferation. Nat Cell Biol 2, E71-72. Thomas, P. Q., Brown, A., and Beddington, R. S. (1998). Hex: a homeobox gene revealing peri-implantation asymmetry in the mouse embryo and an early transient marker of endothelial cell precursors. Development 125, 85-94. Thurston, G., Rudge, J. S., Ioffe, E., Zhou, H., Ross, L., Croll, S. D., Glazer, N., Holash, J., McDonald, D. M., and Yancopoulos, G. D. (2000). Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage. Nat Med 6, 460-463. Tolentino, M. J., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Jakobiec, F. A., Flynn, E., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., and Adamis, A. P. (1996). Intravitreous injections of vascular endothelial growth factor produce retinal ischemia and microangiopathy in an adult primate. Ophthalmology 103, 1820-1828. Torry, D. S., Ahn, H., Barnes, E. L., and Torry, R. J. (1999). Placenta growth factor: potential role in pregnancy. Am J Reprod Immunol 41, 79-85. Traenckner, E. B., Pahl, H. L., Henkel, T., Schmidt, K. N., Wilk, S., and Baeuerle, P. A. (1995). Phosphorylation of human I kappa B-alpha on serines 32 and 36 controls I kappa B-alpha proteolysis and NF-kappa B activation in response to diverse stimuli. Embo J 14, 2876-2883. Tran, J., Rak, J., Sheehan, C., Saibil, S. D., LaCasse, E., Korneluk, R. G., and Kerbel, R. S. (1999). Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 264, 781-788. Tsukamoto, Y., Kuwabara, K., Hirota, S., Kawano, K., Yoshikawa, K., Ozawa, K., Kobayashi, T., Yanagi, H., Stern, D. M., Tohyama, M., et al. (1998). Expression of the 150-kd oxygen-regulated protein in human breast cancer. Lab Invest 78, 699-706.

136

Tsukita, S., and Furuse, M. (1999). Occludin and claudins in tight-junction strands: leading or supporting players? Trends Cell Biol 9, 268-273. Tuder, R. M., Flook, B. E., and Voelkel, N. F. (1995). Increased gene expression for VEGF and the VEGF receptors KDR/Flk and Flt in lungs exposed to acute or to chronic hypoxia. Modulation of gene expression by nitric oxide. J Clin Invest 95, 1798-1807. Underwood, P. A., Bean, P. A., and Whitelock, J. M. (1998). Inhibition of endothelial cell adhesion and proliferation by extracellular matrix from vascular smooth muscle cells: role of type V collagen. Atherosclerosis 141, 141-152. Vandenbunder, B., Pardanaud, L., Jaffredo, T., Mirabel, M. A., and Stehelin, D. (1989). Complementary patterns of expression of c-ets 1, c-myb and c-myc in the blood-forming system of the chick embryo. Development 107, 265-274. Vanhaesebroeck, B., and Alessi, D. R. (2000). The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. Biochem J 346 Pt 3, 561-576. Veikkola, T., and Alitalo, K. (1999). VEGFs, receptors and angiogenesis. Semin Cancer Biol 9, 211-220. Veikkola, T., Karkkainen, M., Claesson-Welsh, L., and Alitalo, K. (2000). Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors. Cancer Res 60, 203-212. Vinals, F., Chambard, J., and Pouyssegur, J. (1999). p70 S6 kinase-mediated protein synthesis is a critical step for vascular endothelial cell proliferation. J Biol Chem 274, 26776-26782. Walker, E. H., Pacold, M. E., Perisic, O., Stephens, L., Hawkins, P. T., Wymann, M. P., and Williams, R. L. (2000). Structural determinants of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, LY294002, quercetin, myricetin, and staurosporine. Mol Cell 6, 909-919. Waltenberger, J., Claesson-Welsh, L., Siegbahn, A., Shibuya, M., and Heldin, C. H. (1994). Different signal transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 269, 26988-26995. Wang, H., and Keiser, J. A. (1998). Vascular endothelial growth factor upregulates the expression of matrix metalloproteinases in vascular smooth muscle cells: role of flt-1. Circ Res 83, 832-840. Wattel, A., Kamel, S., Mentaverri, R., Lorget, F., Prouillet, C., Petit, J. P., Fardelonne, P., and Brazier, M. (2003). Potent inhibitory effect of naturally occurring flavonoids quercetin and kaempferol on in vitro osteoclastic bone resorption. Biochem Pharmacol 65, 35-42. Webb, D. J., Wen, J., Karns, L. R., Kurilla, M. G., and Gonias, S. L. (1998). Localization of the binding site for transforming growth factor-beta in human alpha2-macroglobulin to a 20-kDa peptide that also contains the bait region. J Biol Chem 273, 13339-13346. Wellner, M., Maasch, C., Kupprion, C., Lindschau, C., Luft, F. C., and Haller, H. (1999). The proliferative effect of vascular endothelial growth factor requires protein kinase C-alpha and protein kinase C-zeta. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19, 178-185. Wells, J. A., Murthy, R., Chibber, R., Nunn, A., Molinatti, P. A., Kohner, E. M., and Gregor, Z. J. (1996). Levels of vascular endothelial growth factor are elevated in the vitreous of patients with subretinal neovascularisation. Br J Ophthalmol 80, 363-366.

137

Wheeler-Jones, C., Abu-Ghazaleh, R., Cospedal, R., Houliston, R. A., Martin, J., and Zachary, I. (1997). Vascular endothelial growth factor stimulates prostacyclin production and activation of cytosolic phospholipase A2 in endothelial cells via p42/p44 mitogen-activated protein kinase. FEBS Lett 420, 28-32. Wilkinson, D. G. (2000). Eph receptors and ephrins: regulators of guidance and assembly. Int Rev Cytol 196, 177-244. Williams, B., Baker, A. Q., Gallacher, B., and Lodwick, D. (1995). Angiotensin II increases vascular permeability factor gene expression by human vascular smooth muscle cells. Hypertension 25, 913-917. Witmer, A. N., Blaauwgeers, H. G., Weich, H. A., Alitalo, K., Vrensen, G. F., and Schlingemann, R. O. (2002). Altered expression patterns of VEGF receptors in human diabetic retina and in experimental VEGF-induced retinopathy in monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 849-857. Witmer, A. N., Vrensen, G. F., Van Noorden, C. J., and Schlingemann, R. O. (2003). Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Prog Retin Eye Res 22, 1-29. Wollenberg, G. K., LaMarre, J., Rosendal, S., Gonias, S. L., and Hayes, M. A. (1991). Binding of tumor necrosis factor alpha to activated forms of human plasma alpha 2 macroglobulin. Am J Pathol 138, 265-272. Wu, L., Mayo, L., Dunbar, J., Kessler, K., Baerwald, M., Jaffe, E., Wang, D., Warren, R., and Donner, D. (2000). Utilization of distinct signaling pathways by receptors for vascular endothelial cell growth factor and other mitogens in the induction of endothelial cell proliferation. J Biol Chem 275, 5096-5103. Xia, P., Aiello, L. P., Ishii, H., Jiang, Z. Y., Park, D. J., Robinson, G. S., Takagi, H., Newsome, W. P., Jirousek, M. R., and King, G. L. (1996). Characterization of vascular endothelial growth factor's effect on the activation of protein kinase C, its isoforms, and endothelial cell growth. J Clin Invest 98, 2018-2026. Xiong, J. W., Leahy, A., Lee, H. H., and Stuhlmann, H. (1999). Vezf1: A Zn finger transcription factor restricted to endothelial cells and their precursors. Dev Biol 206, 123-141. Xue, Y., Gao, X., Lindsell, C. E., Norton, C. R., Chang, B., Hicks, C., Gendron-Maguire, M., Rand, E. B., Weinmaster, G., and Gridley, T. (1999). Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Hum Mol Genet 8, 723-730. Yamagishi, H., Olson, E. N., and Srivastava, D. (2000). The basic helix-loop-helix transcription factor, dHAND, is required for vascular development. J Clin Invest 105, 261-270. Yamaguchi, T. P., Dumont, D. J., Conlon, R. A., Breitman, M. L., and Rossant, J. (1993). flk-1, an flt-related receptor tyrosine kinase is an early marker for endothelial cell precursors. Development 118, 489-498. Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., and Nakao, K. (2000). Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature 408, 92-96. Yanagisawa, H., Hammer, R. E., Richardson, J. A., Williams, S. C., Clouthier, D. E., and Yanagisawa, M. (1998). Role of Endothelin-1/Endothelin-A receptor-mediated signaling pathway in the aortic arch patterning in mice. J Clin Invest 102, 22-33.

138

Yancopoulos, G. D., Davis, S., Gale, N. W., Rudge, J. S., Wiegand, S. J., and Holash, J. (2000). Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407, 242-248. Yi, X., Mai, L. C., Uyama, M., and Yew, D. T. (1998). Time-course expression of vascular endothelial growth factor as related to the development of the retinochoroidal vasculature in rats. Exp Brain Res 118, 155-160. Yu, Y., and Sato, J. (1999). MAP kinases, phosphatidylinositol 3-kinase, and p70 S6 kinase mediate the mitogenic response of human endothelial cells to vascular endothelial growth factor. J Cell Physiol 178, 235-246. Yue, T., Ni, J., Romanic , A., Gu, J., Keller, P., Wang, C., Kumar, S., Yu , G., Hart , T., Wang , X., et al. (1999). TL1, a novel tumor necrosis factor-like cytokine, induces apoptosis in endothelial cells. Involvement of activation of stress protein kinases (stress-activated protein kinase and p38 mitogen-activated protein kinase) and caspase-3-like protease. J Biol Chem 274, 1479-1486. Zachary, I., and Rozengurt, E. (1992). Focal adhesion kinase (p125FAK): a point of convergence in the action of neuropeptides, integrins, and oncogenes. Cell 71, 891-894. Zong, W. X., Edelstein, L. C., Chen, C., Bash, J., and Gelinas, C. (1999). The prosurvival Bcl-2 homolog Bfl-1/A1 is a direct transcriptional target of NF-kappaB that blocks TNFalpha-induced apoptosis. Genes Dev 13, 382-387.

139

140

ΠEPIEXOMENA 1.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ....................................................................................................... 1

1.1. Η ΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑ∆ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ......................................................... 1 1.1.1. Ορισµοί-γενικά ............................................................................................... 1 1.1.2. Αγγειακή διαφοροποίηση (vasculogenesis) .................................................... 2 1.1.3. Aγγειακή Μυογένεση....................................................................................... 4 1.1.4. Αγγειογένεση................................................................................................... 6

1.1.4.1. Iσορροπία διεγερτών και αναστολέων της αγγειογένεσης ..................... 6 1.1.4.2. Στάδια της αγγειογενετικής εκβλάστησης .............................................. 9 1.1.4.3. Μορφοποίηση, Οργάνωση και Σταθεροποίηση των αγγείων............... 10

1.2. Ο ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝ∆ΟΘΗΛΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR, VEGF) ........................................................................................... 13

1.2.1. Οι µορφές του VEGF.................................................................................... 13 1.2.2. Οι υποδοχείς του VEGF ............................................................................... 15 1.2.3. Mεταγωγή του σήµατος από το VEGF .......................................................... 18

1.2.3.1. Eπιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων ............................................... 19 1.2.3.2. Πολλαπλασιασµός των ενδοθηλιακών κυττάρων................................. 20 1.2.3.3. Mετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ...................................... 21 1.2.3.4. Aύξηση της διαπερατότητας των αγγείων ............................................ 22

1.3. Η ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ VEGF.................................... 24 1.3.1. Η ανατοµία του αγγειακού δικτύου του αµφιβληστροειδούς και η εµβρυϊκή του ανάπτυξη................................................................................................................. 24 1.3.2. Ο VEGF και οι υποδοχείς του στο φυσιολογικό οφθαλµό ............................ 25 1.3.3. Ο VEGF και οι υποδοχείς του στο παθολογικό οφθαλµό ............................. 27

1.3.3.1. Ο ρόλος του VEGF στις µη αγγειογενετικές παθήσεις του οφθαλµού. 27 Mη παραγωγική διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια (ΜΠ∆Α) .................... 27

1.3.3.2. Ο ρόλος του VEGF στις αγγειογενετικές παθήσεις του οφθαλµού ...... 28 1.3.3.2.1. Αγγειογενετικές παθήσεις του αµφιβληστροειδούς .......................... 28

1.3.3.2.1.1. Παραγωγική διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια (Π∆Α) .......... 29 1.3.3.2.1.2. Ισχαιµική αµφιβληστροειδοπάθεια των νεογνών ..................... 31

1.3.3.2.2. Αγγειογενετικές παθήσεις του χοριοειδούς...................................... 32 1.3.3.2.2.1. Ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς ................................................. 33

1.3.3.3. Αγγειογενετικές παθήσεις του κερατοειδούς....................................... 35 1.3.3.4. Αγγειογενετικές παθήσεις της ίριδας .................................................. 36

1.3.4. Θεραπευτική αντιµετώπιση της νεοαγγείωσης του οφθαλµού ....................... 37 1.4. ΦΛΑΒΟΝΟΕΙ∆Η ...................................................................................................... 39

2. ΕΙ∆ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ..................................................................................................... 43 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ∆ΙΑΤΡΙΒΗΣ....................................................................................... 43 2.1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ∆ΟΙ........................................................................................ 44

2.1.2. Υλικά ............................................................................................................ 44 2.1.2. ∆οκιµασία αγγειογένεσης στον κερατοειδή κονίκλου .................................... 44

2.1.2.1. Προετοιµασία του πολυµερούς υλικού που χρησιµοποιείται ως έκδοχο............................................................................................................................ 45 2.1.2.2. Παρασκευή των τελικών εµφυτευµάτων .............................................. 46 2.1.2.3. Χειρουργική τεχνική της εµφύτευσης .................................................. 46 2.1.2.4. Αξιολόγηση της αγγειογενετικής απόκρισης........................................ 47

2.1.3. Κυτταροκαλλιέργειες..................................................................................... 48

141

2.1.4. ∆οκιµασίες απόπτωσης ................................................................................. 49 2.1.4.1. µε µικροσκοπία ..................................................................................... 49 2.1.4.2. µε κυτταροµετρία ροής ......................................................................... 50

2.1.5. ∆οκιµασίες πολλαπλασιασµού ...................................................................... 50 2.1.5.1. µε µικροσκοπία ..................................................................................... 50 2.1.5.2. µε ενσωµάτωση θυµιδίνης [3 Η] ........................................................... 50

2.1.6. Μέτρηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών................................................. 51 2.1.7. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου και ανοσοαποτύπωση κατά WESTERN ........................................................................ 52 2.1.8. Ανσοσοκατακρήµνιση του VEGFR-2, έλεγχος της τυροσινικής του φωσφορυλίωσης και δοκιµασία ενεργότητας κινάσης............................................. 52 2.1.9. Ανοσοκατακρήµνιση της PI3K και δοκιµασία ενεργότητας της λιπιδιακής κινάσης ................................................................................................................... 54 2.1.10. Έλεγχος της φωσφορυλίωσης των Akt, ERK1/2, p70 S6, p65 και p38 και της έκφρασης των ΙκΒα και β ....................................................................................... 56 2.1.11. Tιτλοποίηση των ανασυνδυασµένων αδενοιών και µόλυνση των κυττάρων57 2.1.12. Έµµεσος ανοσοφθορισµός .......................................................................... 58 2.1.13. Προετοιµασία των δειγµάτων για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης µε τη χρήση της τεχνολογίας των µικροσυστοιχιών και µε Real Time PCR ................ 59

2.1.13.1. Αποµόνωση συνολικού RNA από τα HUVE κύτταρα ....................... 59 2.1.13.2. Έλεγχος της ποσότητας και της ποιότητας του RNA ......................... 59 2.1.13.3. Ποσοτική αντίδραση πολυµεράσης PCR............................................ 60 2.1.13.4. H τεχνολογία των cDNA µικροσυστοιχιων ........................................ 63

2.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ .............................................................................................. 66 2.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF νεοαγγείωση στον κερατοειδή κονίκλου............................................................................................... 66 2.2.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει τις επαγόµενες από το VEGF αγγειογενετικές αποκρίσεις του ενδοθηλιακού κυττάρου (επιβίωση, πολλαπλασιασµός) ................. 67

2.2.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων .................................................................................... 67 2.2.2.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει τον επαγόµενο από το VEGF πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων ................................................ 70

2.2.3. Η επίδραση της λουτεολίνης στην επαγόµενη από το VEGF µεταγωγή του σήµατος στα ενδοθηλιακά κύτταρα ......................................................................... 71

2.2.3.1. Η επίδραση της λουτεολίνης στους επαγόµενους από το VEGF µοριακούς µηχανισµούς µεταγωγής του σήµατος που σχετίζονται µε την επιβίωση............................................................................................................. 72

2.2.3.1.1. Η επίδραση της λουτεολίνης στην ενεργοποίηση του VEGFR2....... 72 2.2.3.1.1.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF τυροσινική φωσφορυλίωση του VEGFR2 ................................................... 72 2.2.3.1.1.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει µερικώς την επαγόµενη από τo VEGF ενεργοποίηση του VEGFR2 ........................................................................ 73

2.2.3.1.2. Η λουτεολίνη αναστέλλει την µεταγωγή του σήµατος του VEGF στην PI3K/Akt οδό .................................................................................................. 76

2.2.3.1.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την από το VEGF επαγόµενη φωσφορυλίωση της Akt............................................................................... 76 2.2.3.1.2.1. Η λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF ενεργοποίηση της PI3-κινάσης ................................................................... 77 2.2.3.1.2.3. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του p85 δεν επηρεάζεται από το VEGF και τη λουτεολίνη............................................................................. 80

142

2.2.3.1.2.4. Υπερέκφραση της myrAkt στα ενδοθηλιακά κύτταρα καταργεί την ανασταλτική δράση της λουτεολίνης στην επιβίωση ............................. 81

2.2.3.1.3. Ο ρόλος της φωσφορυλίωσης της p38 MAPK στην αντιεπιβιωτική δράση της λουτεολίνης .................................................................................... 84

2.3.1.3.1. Η λουτεολίνη αυξάνει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK .......... 84 2.3.1.3.2. H υπερέκφραση της myrAkt αναστέλλει τη δράση της λουτεολίνης στη φωσφορυλίωση του p38 ....................................................................... 86

2.2.3.1.4. O ρόλος του ΝFkappaB στην επαγόµενη από το VEGF επιβίωση.. 87 2.2.3.2. Η επίδραση της λουτεολίνης στους επαγόµενους από το VEGF µοριακούς µηχανισµούς µεταγωγής του σήµατος που σχετίζονται µε τον πολλαπλασιασµό ................................................................................................ 90

2.2.3.2.1. Η λουτεολίνη δεν αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση των ERK1/2 .......................................................................... 90 2.2.3.2.2 Υπερέκφραση της myrAkt δεν αναστέλλει την αντιπολλαπλασιαστική δράση της λουτεολίνης .................................................................................... 91 2.2.3.2.3. Ο VEGF επάγει τη φωσφορυλίωση της p70 S6 κινάσης ................. 93 2.2.3.2.5. Η p70 S6 κινάση δεν φαίνεται να ενέχεται στην επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων................................................................................. 96 2.2.3.2.6. H λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF φωσφορυλίωση της p70 S6 κινάσης ............................................................... 97

2.2.4. Η λουτεολίνη ανατρέπει την επαγόµενη από το VEGF γονιδιακή έκφραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα.............................................................................................. 98

2.3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ....................................................................................................... 102 2.3.1. Η λουτεολινη αναστέλλει την επαγόµενη από το VEGF αγγειογένεση στον κερατοειδή κονίκλου............................................................................................. 102 2.3.2. H λουτεολίνη αναστέλλει την επαγόµενη από τον VEGF επιβίωση και πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων. ................................................... 102 2.3.3. H λουτεολίνη αναστέλλει την από τον VEGF επαγόµενη επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων αναστέλλοντας την PI3K/Akt οδό ................................. 103 2.3.4. H λουτεολίνη αναστέλλει τον επαγόµενο από τον VEGF πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων αναστέλλοντας την PI3K/p70 S6K οδό ......................... 105 2.3.5. H λουτεολινη αναστέλλει την επαγοµένη από το VEGF µεταγραφή στα ενδοθηλιακά κύτταρα............................................................................................ 108

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑTA................................................................................................... 110

3. ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ ........................................................................................................ 111 3.1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΤΑ ΕΛΛΗΝΙΚΑ........................................................................... 111 3.2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΤΑ ΑΓΓΛΙΚΑ (SUMMARY) ........................................................ 113

4. BIBΛIOΓPAΦIA ................................................................................................... 115