1

Η πολυπλοκότητα των σταδίων σταµονοπάτια µεταγωγής σήµατος έχουν δύοσηµαντικά οφέλη:1. Ενίσχυση του αρχικού σήµατος

2. Εξειδίκευση της απόκρισης

Light activation of rod photoreceptor cell and the amplification obtained in the signalling cascade

Second messenger

ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ “ΑΝΑΜΕΤΑ∆ΟΤΕΣ”RELAY PROTEINS

H µεταβίβαση σήµατος µέσα στακύτταρα βασίζεται σε ένα αριθµόπρωτεϊνών που λειτουργούν ως“αναµεταδότες”

Ο τυπικός µηχανισµός µε τον οποίοµεταβιβάζεται η πληροφορία είναιφωσφορυλίωση πρωτεϊνικώνκινασών

Οι πρωτεϊνες αναµεταδότες είναικινάσες πρωτεϊνών και καταλύουντη φωσφορυλίωση δύο αµινοξέων, θρεονίνη και σερίνη, σταυποστρώµατα τους τα οποία είναι οιεπόµενες πρωτεϊνες αναµεταδότεςστο µονοπάτι.

Scaffolding proteins:Eνας τύπος µεγάλων πρωτεϊνών “αναµεταδοτών” στιςοποίες είναι ταυτόχρονα δεσµευµένες άλλες πρωτεϊνεςαναµεταδότες για να τις κρατήσουν σε µιασυγκεκριµένη θέση

• Adaptor proteins

•Bifurcation proteins

•Amplifier proteins

•Transducer proteins

•Integrator proteins

•Anchoring proteins

•Modulator proteins

•Messenger proteins

2

Η πολυπλοκότητα των σταδίων σταµονοπάτια µεταγωγής σήµατος έχουν δύοσηµαντικά οφέλη:1. Ενίσχυση του αρχικού σήµατος

2. Εξειδίκευση της απόκρισηςΗ τελική κυτταρική απόκριση καθορίζεται από ταειδικά µόρια υποδοχέων και τις πρωτεϊνες«αναµεταδότες» µέσα στο κυτταρόπλασµα

Οι υποδοχείς καθορίζουν ποιά γονίδια θαεκφραστούν σε ένα κυτταρικό τύπο και αν το σήµαπυροδοτήσει ενεργοποίηση ή παρεµπόδιση µιαςλειτουργίας

ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ

•Ενα σήµα µπορεί να προσδεθεί σε έναυποδοχέα που πυροδοτεί ένα µονοπάτιπου καταλήγει σε µία απόκριση

•Ενα σήµα µπορεί να προσδεθεί σε έναυποδοχέα που ξεκινά ένα µονοπάτι πουδιακλαδίζεται σε πολλά τα οποίαοδηγούν σε πολλές αποκρίσεις

•Το ίδιο σήµα µπορεί ναενεργοποιήσει διαφορετικέςαποκρίσεις σε διαφορετικά κύτταραµε πρόσδεση σε διαφορετικούςυποδοχείς καθένας από τουςοποίους ενεργοποιεί διαφορετικάδευτερογενή µηνύµατα καιµονοπάτια

•∆ύο διαφορετικά σήµατα µπορούννα ενεργοποιήσουν µονοπάτια πουαλληλεπιδρούν το ένα µε το άλλο, είτε ενισχύοντας ή αναστέλλονταςµία απόκριση

∆ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟΚΡΙΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ∆ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΥΣΤΡΟΠΟΥΣ ΣΤΟ Ι∆ΙΟ ΧΗΜΙΚΟ ΣΗΜΑ

Η διαφοροποίηση στην απόκριση οφείλεται :1. Είτε οι υποδοχείς του σήµατος είναι διαφορετικοί σε διαφορους τύπους κυττάρων, ή2. Στην «εσωτερική µηχανή» µε την οποία είναι συζευγµένος ο υποδοχέας

Η ακετυλχολίνη διεγείρει στη συστολή των σκελετικών µυικών κυττάρων, αλλά ελαττώνει τη συστολή των καρδιακών µυικών κυττάρων

SIGNAL INTEGRATIONH “κατάλληλη” απόκριση ενός κυττάρου καθορίζεταισυνήθως από πολλά σήµατα παρά από έναΗ “ενσωµάτωση” της πληροφορίας από διαφορετικάσήµατα εξαρτάται από τις integrator proteins

ΕΞΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣΜΕΣΩ ΜΗΝΥΜΑΤΟΦΟΡΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ

Scaffold proteins αλληλεπιδρούν µε άλλες µηνυµατοφόρεςπρωτεϊνες και οργανώνουν µηνυµατοφόρα σύµπλοκα:ακρίβεια, ταχύτητα, αποτελεσµατικότητα κυτταρικής απόκρισης

3

Η εξέλιξη πολύπλοκων δικτύων µεταγωγής σήµατος διευκολύνθηκεµε δηµιουργία πρωτεϊνών που φέρουν διαφορετικές domains (modular proteins)

Μεταγωγή σήµατος από το σύµπλοκο ορµόνης-υποδοχέαστην αδενυλική κυκλάση

Η αδενυλική κυκλάση αλληλεπιδρά µε το σύµπλοκο ορµόνης-υποδοχέα µέσω µιας τρίτης πρωτεϊνης:

G-protein: GTP-binding regulatory protein

∆ιεγερτική πρωτεϊνη G (Gs: stimulatory G protein):H G πρωτεϊνη πουενεργοποιεί την αδενυλικήκυκλάση

G-proteins- ∆εσµεύουν και υδρολύουν GTP• Ετεροτριµερείς περιφερικές µεµβρανικές πρωτεϊνες

α (~45 kDa) , β (35 kDa) και γ (8 kDa) υποµονάδες; a δεσµεύει GTP

• ∆εσµεύονται σε µεµβρανικούς υποδοχείς• Μοριακοί διακόπτες

Ανταλλαγή και υδρόλυση GTP/GDP για µεταβίβασησήµατος από µεµβρανικούς υποδοχείς σεενδοκυττάριους στόχους

• Μικρές (~21 kD)° Π.χ. ras, rac, rho

©2002 Lee Bardwell

∆οµή G πρωτεϊνώνΗ λειτουργία των G πρωτεϊνών υπαγορεύεται από τη δοµή τους:

Η Gs αποτελείται από 3 πολυπεπτίδια:

Η α υποµονάδα (Gsa) δεσµεύει καιυδρολύει GTP (GTPάση)

Oι β και γ υποµονάδες σχηµατίζουνένα ισχυρό σύµπλοκο (Gβγ) πουαγκυροβολεί την Gs στηνκυτοπλασµική πλευρά τηςκυτταρικής µεµβράνης

Λιπιδιακές τροποποιήσεις τωνυποµονάδων:Η α-υποµονάδα περιέχει µια palmitoyl και µιαmyristoyl οµάδα. Η γ-υποµονάδα περιέχει µία geranylgeranyl isoprenoid οµάδαΠρόσθετες µεµβρανικές πρωτεϊνες µπορεί νασυµµετέχουν στη δέσµευση της G πρωτεϊνηςστη µεµβράνη.

Ενδογενής µηχανισµός ρύθµισης

GEF (ligand-bound

receptor)

GAP (RGS)“ON”“OFF”

βγ

βγ

αα

βγ

©2002 Lee BardwellGEF: Guanine Nucleotide Exchange FactorGAP: GTPase Activating Proteins

4

Οµως, RGS proteins (Regulators of G protein signaling), οι οποίες είναι αρνητικοί ρυθµιστές των G πρωτεϊνών, λειτουργούν ως GAPs για να διεγείρουντην υδρόλυση GTP από Gα.

Οι περισσότερες G-πρωτεϊνες εξαρτώνταιαπό βοηθητικέςπρωτεϊνες : GAPs, GTPase Activating Proteins, προωθούν υδρόλυσηGTP.

protein-GTP (active) GDP GEF GAP GTP Pi protein-GDP (inactive)

Ga µιας ετεροτριµερούς πρωτεϊνης G έχει ενδογενήικανότητα υδρόλυσης GTP. GEFs, Guanine Nucleotide Exchange Factors,

προωθούν την ανταλλαγή GDP/GTP.Ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας (GPCR) δρα ωςGEF για µια ετεροτριµερή πρωτεϊνη G.

protein-GTP (active) GDP GEF GAP GTP Pi protein-GDP (inactive)

Modified from Figure 15-15, Page 494 from: Essential Cell Biology by Alberts et al. 1997, Garland Publishing Inc. New York, NY

The G-Proteins

• Activation

The G-Proteins

• Signalling• Inactivation

Activity of βγ subunits

• Activation of K+ channels

Enzymes activated by G-proteins catalyze the synthesis of second messengers

5

ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ

Η ενίσχυση του σήµατος είναι απαραίτητη γιατί τα ορµονικά ερεθίσµατα είναιασθενή

Η συγκέντρωση πολλών ορµονών στο αίµα είναι 10-10Μ

Η ενίσχυση περιλαµβάνει τρίαστάδια:

1. Κάθε σύµπλοκο ορµόνης-υποδοχέα καταλύει τοσχηµατισµό πολλών Ga-GTP

2. Mία ενεργοποιηµένη αδενυλικήκυκλάση σχηµατίζει πολλάµόρια cAMP

3. Kάθε πρωτεϊνική κινάση, ενεργοποιηµένη από cAMP,µπορεί να αλλάξει τηδραστικότητα πολλών µορίων

Oικογένεια G πρωτεϊνών

Η πρωτεϊνη Gs είναι µέλος µιας οικογένειας G πρωτεϊνών

Μέλη της οικογένειας έχουν διαφορετική επίδραση

Π.χ. Η αδενυλική κυκλάση αναστέλεται από µια διαφορετική πρωτεϊνη G:

Giα : inhibitory G proteinΑνασταλτική πρωτεϊνη G

Οι υποµονάδες β και γ είναι όµοιες όπωςκαι στην Gs

H υποµονάδα α διαφέρει (Gia)

O α2-αδρενεργικός υποδοχέας αναστέλλει την αδενυλική κυκλάσηµέσω Giα πρωτεϊνης

(νορεπινεφρίνη, αγγειοτενσίνη)

O β-αδρενεργικός υποδοχέας διεγείρει την αδενυλική κυκλάσηµέσω Gsα πρωτεϊνης

(επινεφρίνη, γλυκαγόνη, βασοπρεσσίνη, και άλλες ορµόνες της υπόφυσης (π.χΩχρινοτρόπος ορµόνη) και των επινεφριδίων

Τι κάνουν οι τριµερείς πρωτεϊνες G?Ενεργοποίηση ενζύµων:

Eνεργοποίηση αδενυλικής κυκλάσης (Gs)Eνεργοποίηση φωσφολιπάσης C-β (Gq)

Αναστολή ενζύµων:Αναστολή αδενυλικής κυκλάσης (Gi),

Ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση καναλιών ιόντων-αντίληψη του φωτός στον αµφιβληστροειδή χιτώνα (Gt, Μεταγωγίνη-transducin)

-αίσθηση της όσφρησης στους οσφρητικούς νευρώνες (Golf)

Αλλες πρωτεϊνες G ενεργοποιούν µονοµερείς GTPάσεςγια να ρυθµίσουν ενδοκυττάριες διαδικασίες

6

G-Protein-Activated Enzymes

Eτερογένεια Gα υποµονάδωνC. elegans: 20 Gα, 2 Gβ και 2 GγΘηλαστικά: 16 Gα, 6 Gβ και 12 GγΗ ετερογένεια των Gα υποµονάδων δηµιουργείται µε alternative splicing τωνGα mRNAs

PDE6 onRhodopsinGtPLC-β onPTHGq

Calcium channel closed

Adenylate cyclase off

GABA-bGo

Potassium channel open

Adenylate cyclase off

Muscarinic (acetylcholine)

Gi

Calcium channel open

Adenylate cyclase on

Adrenergic (epinephrine)

Gs

Mηχανισµός δράσης των υποµονάδων

Οι υποµονάδες Gα και Gβγ συµµετέχουν στη µεταγωγή σήµατος µέσω:-αλληλεπίδρασης µε downstream effectors ή-ανεξάρτητης δράσης των υποµονάδων ή-συνεργιστικής δράσηςή

-ανταγωνιστικής δράσης

Π.χ. ΚΑΡ∆ΙΑΟ β-αδρενεργικός υποδοχέας ενεργοποιεί την αποσυσχέτιση Gsα και GβγΚαι οι δύο υποµονάδες δεσµεύονται σε downstream effectors :

Η Gsα ενεργοποεί αδενυλική κυκλάση και παραγωγή cAMP

H Gβγ συµµετέχει στην απενεργοποίηση του υποδοχέα µε δέσµευση στηνβ-ARK (β-adrenergic receptor kinase), την κινάση που φωσφορυλιώνεικαι εµποδίζει τον υποδοχέα να ανταλλαξει GDP, τερµατίζοντας έτσι τοσήµα

Κοινά δοµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των G πρωτεϊνών

1. Αποτελούν ενδιάµεσα ενεργοποιηµένων υποδοχέων2. Είναι ετεροτριµερείς (α, β, γ υποµονάδες).3. Αλληλοµετατρέπονται µεταξύ µιας ενεργούς µορφής (GTP) και µιαςανενεργούς (GDP)4. Ενεργοποιούνται συνεχώς από ανάλογα του GTP που δεν υδρολύονται:

O

OHOH

HH

H

CH2

H

OPOPOP-O

S

O- O-

O O

O-

NH2

NH

NN

N

OGTPγS

5. Ολες σχεδόν ριβοζυλιώνονται από ADP µε δράση της τοξίνης τηςχολέρας ή του κοκκύτη6. Ενεργοποιούνται από υποδοχείς που είναι ενδοµεµβρανικές πρωτεϊνεςµε ένα µοτίβο επτά ελίκων

Inhibitory Gα GTPγS

PDB 1GIA

7

Μικρές G πρωτεϊνες περιλαµβάνουν:initiation & elongation factors (protein synthesis).Ras (growth factor signal cascades).Rab (vesicle targeting and fusion).ARF (forming vesicle coatomer coats).Ran (transport of proteins into & out of the nucleus).Rho (regulation of actin cytoskeleton)

All GTP-binding proteins differ in conformation depending on whether GDP or GTP is present at their nucleotide binding site.

Generally, GTP binding induces the active state.

Ras πρωτεϊνες•Συµµετέχουν σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος πουαπαιτούνται κατά την κυτταρική διαίρεση και τηδιαφοροποίηση

•Μοριακοί διακόπτες που ενεργοποιούνται απόυποδοχείς τυροσυλο-κινάσης

•Παρόµοιες σε λειτουργία και δοµή µε την υποµονάδα Gα

•∆εσµεύουν GTP, αλλά ∆ΕΝ υδρολύουν GTP

•H ανενεργή µορφή δεσµεύει GDP, ενώ η ενεργή δεσµεύειGTP

•Απαιτείται η δράση GAP πρωτεϊνών (GTPase activating protein) για να γίνουν ενεργές

The small G-protein molecular switch

GAP

GEFGTP GDP

Ras-GDP RAS-GTP

signal 1

signal 2

signal 3Pi

GEF= GTP exchange factorGAP= GTPase activating protein

“OFF”“ON”

Ser/thr Kinase

Cascade activated by Ras

and PKC

ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΚΑΙΚΑΡΚΙΝΟΣ

Οι RAS είναι ενδοκυττάριες πρωτεϊνεςπου ενεργοποιούνται από υποδοχείςσυζευγµένους µε ένζυµα

Οι ενεργοποιηµένες RAS ξεκινούν ένακαταρράκτη αντιδράσεων που αλλάζουνενζυµικές ενεργότητες και γονιδιακήέκφραση

30% των ανθρώπινων καρκίνων έχουνµεταλλαγές σε γονίδια RAS (ογκογονίδια)

8

H ρύθµιση της G πρωτεϊνης είναι σηµαντική γιαφυσιολογική λειτουργία

Η τοξίνη της χολέρας (Vibrio cholerae) προκαλεί σοβαρή διάρροια πουοδηγεί σε σοκ και θάνατο αν ο οργανισµός δεν αναπληρώσει τα υγράπου έχασε

H πρωτεϊνη G βρίσκεται συνεχώς σε ενεργό µορφή

Η τοξίνη της χολέρας τροποποιείοµοιοπολικά την Gs:

ADP-ριβόζη µεταφέρεται από το NAD σε ένα κατάλοιπο αργινίνης τηςGa, αναστέλλοντας την ικανότητατης να υδρολύει το GTP

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:Η πρωτεϊνη G είναι συνεχώς σε ενεργή µορφήH αδενυλική κυκλάση παραµένει συνεχώς

ενεργοποιηµένηΤα επίπεδα cAMP αυξάνονται υπερβολικάΕνεργοποίηση µεταφοράς ιόντων που οδηγεί σε

απώλεια Na+ και Η2Ο προς το έντερο

Cholera Toxin: Mechanism of ActionCholera Toxin: Mechanism of Action

Nicotinic Acid-ADP-Ribose = NAD

Nicotinic Acid

Nicotinic Acid

Ribose

ADP

α−GTPArg

α−GTPArgADP-Ribose-N-

InactiveA. Cyclase

ActiveA. Cyclase

ATP

cAMP

Η τοξίνη του κοκκύτη (Bordetella pertussis) παρεµποδίζει την αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης

Η τοξίνη προκαλεί οµοιοπολικήπροσθήκη ADP-ριβόζης σε ένακατάλοιπο κυστεϊνης στηνανασταλτική πρωτεϊνη G (Giα) και έτσιεµποδίζει την απενεργοποίηση τηςαδενυλικής κυκλάσης

Υψηλά επίπεδα cAMP

Σηµ. Η ADP-ριβοζυλίωση είναι ένας γενικός µηχανισµός ρύθµισης τηςενεργότητας πολλών πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά κύτταρα