Silvana Andri i Tatjana Kosti

Mehanizmi elijskekomunikacije

Skripta za sve zainteresovane studente

WUS Austria – Daniel Print

Silvana Andri , PhDvanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinjaDepartman za biologiju i ekologijuPrirodno-matemati ki fakultetUniverzitet u Novom SaduE-mail: silvana@ib.ns.ac.yu

Tatjana Kosti , PhDvanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinjaDepartman za biologiju i ekologijuPrirodno-matemati ki fakultetUniverzitet u Novom SaduE-mail: tanjak@ib.ns.ac.yu

Naslovnu stranu osmislili:NINI i TEJ

Grafi ko oblikovanje korica:Predrag Nikoli

The publishing of this script is part of the project CDP+ 118/2006 financed by AustrianCooperation through WUS Austria

This copy is not for sale

Ova skripta je objavljena u okviru projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog odstrane Austrian Cooperation

Besplatan primerak

Predgovor

Ova skripta je rezultat realizacije projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog od strane AustrianCooperation, za uvodjenje novog predmeta Mehanizmi elijske komunikacije, namenjenog studentimaosnovnih, Master i PhD studija na Prirodno-matemati kom fakultetu, Univerziteta u Novom Sadu.

Namera autora je bila da studentima pruže pisane informacije o glavnim komponentama medju elijske iunutar elijske komunikacije, po evši od procesa nastajanja signalnih molekula, do krajnjeg odgovora elije.Osnovna ideja kursa, pa i skripte, je da postupno „korak po korak“ uvede studente u „svet“ velikog brojareceptora i signalnih molekula, koji grade mrežu signalnih puteva uklju enih u regulaciju specifi nihfunkcija elije.

Tekst skripte je organizovan tako da prati predavanja iz kursa Mehanizmi elijske komunikacije, koji se poprvi put izvodi na Depatmanu za biologiju i ekologiju, PMF u Novom Sadu. S’ obzirom da je tekst skriptepokušaj formiranja prvog pisanog materijala, iz kursa koji nastaje, sve kritike, sugestije i komentari su višenego dobrodošli.

Veliko hvala Mariji Janji i Nataši Stojkov, saradnicama na grupi predmeta Fiziologija životinja, na pomo ioko korekture teksta, kao i Predragu Nikoli u za tehni ko i grafi ko oblikovanje korica.

Na kraju, jedno jednostavno i ogromno hvala organizaciji WUS Austrija, Pokrajinskom sekretarijatu zaobrazovanje i kulturu, kao i gospodinu Gezi Danijelu (štamparija Danijel Print) na ogromnom razumevanju ifinansijskoj podrsci u nameri da našim studentima obezbedimo skriptu koja e im, nadamo se, bar donekleolakšati savla ivanje predvi enog programa kursa.

Autori

S A D R Ž A J

01. OSNOVNI PRINCIPI ELIJSKE KOMUNIKACIJE 11.1. OSNOVNI PRINCIPI I MODELI ELIJSKE KOMUNIKACIJE 21.1.1. Hemijska komunikacija kao na in regulacije fizioloških procesa 31.1.2. Osnovni pojmovi i karakteristike signalnih molekula 41.1.2.1. Sinteza, skladištenje i sekrecija signalnih molekula 41.1.2.2. Koncentracija signalnih molekula u okruženju elije varira 91.1.3. Ekstracelularni signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptore 91.1.3.1. Signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptorske molekule koje ekspresuju ciljne elije 101.1.3.2. Pojam, osobine i klasifikacija receptora 111.1.4. Ekstracelularni signalni molekuli mogu da deluju i na maloj i na velikoj distanci 121.1.4.1. Autokrina komunikacija može da koordiniše odluke grupe identi nih elija 151.1.4.2. Prozne ili pukotinaste veze (gap-junctions) dozvoljavaju da se signalne informacije dele izmedju susednihelija

161.1.5. Svaka elija je programirana da odgovara na specifi nu kombinaciju ekstracelularnih signalnih molekula 171.1.5.1. Razli ite elije mogu da odgovaraju razli ito na isti signalni molekul 181.2. VEZIVANJE ZA RECEPTORE AKTIVIRA RAZLI ITE SIGNALNE PUTEVE 191.2.1. Tri klase receptornih proteina na površini elije koji su vezani za jonske kanale, vezani za G proteine ivezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnost

19

1.2.1.1. Ve ina aktiviranih receptora sa površine elije aktivira signaling preko malih molekula i mrežeintracelularnih signalnih proteina

21

1.2.2. NO aktivira signalne puteve vezuju i se direktno za enzim u unutrašnjosti ciljne elije 231.2.3. Nuklearni receptori su proteini koji aktivirani ligandom regulišu transkripciju gena 251.2.4. Neki intracelularni signalni proteini imaju ulogu molekularnih prekida a 281.2.5. Intracelularni signalni kompleksi poja avaju brzinu, efikasnost i specifi nost odgovora 301.2.6. Interakcija izmedju intracelularnih signalnih proteina je posredovana modularnim vezuju im domenima 321.2.7. elija može da odgovori naglo na graduisano pove enje koncentracije ekstracelularnog signala 341.2.8. elija može da zapamti/memoriše efekat nekih signala 371.2.9. elija može da podesi svoju senzitivnost na neki signal 371.3. MEHANIZMI ELIJSKE KOMUNIKACIJE I SIGNALNI PUTEVI KOD BILJAKA 391.3.1. Više elijska organizacija i elijska komunikacija su evoluirali nezavisno kod biljaka i životinja 391.3.2. Receptori serin/treonin kinze funkcionišu kao receptori na površini biljne elije 401.3.3. Etilen aktivira dvo-komponentni signalni put 421.3.4. Fitohromi detektuju crveno svetlo, a kriptohromi detektuju plavo svetlo 4402. PRENOŠENJE SIGNALA SA POVRŠINE ELIJE 472.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ELIJE 482.1.1. Receptori aktiviraju limitiraju i broj signalnih puteva 492.1.2. Receptorni proteini ispoljavaju specifi nost prema vezivanju liganda i efektorima 50

2.1.3. Maksimalni odgovor elije na signalnu molekulu ne mora zahtevati aktivaciju svih receptora 512.1.4. Eseji za vezivanje se koriste za detekciju receptora i odredjivanje Kd vrednosti 522.2. INTRACELULARNA TRANSDUKCIJA SIGNALA – PRENOS SIGNALA UNUTAR ELIJE 552.2.1. Drugi glasnici nose signale od mnogih receptora 552.2.2. Mnogi konzervisani intracelularni proteini imaju funkciju u transdukciji signala 562.2.2.1. GTPazni proteinski prekida i 562.2.2.2. Protein kinaze i protein fosfataze 602.2.3. Neki receptori i proteini signalne transdukcije su lokalizovani 622.2.3.1. Grupisanje/ „clustering“ membranskih proteina posredovano adapternim domenima 632.2.3.2. Grupisanje/ „clustering“ proteina u lipidne agregate 642.2.4. Razvijanje odgovaraju ih elijskih odgovora zavisi od interakcije i regulacije signalnih puteva 6503. SIGNALNI PUTEVI PREKO MEMBRANSKIH RECEPTORA VEZANIH ZA G-PROTEINE 673.1. GPCR-zavisna AKTIVACIJA/INHIBICIJA ADENILIL CIKLAZE (AC) 673.1.1. G subjedinica G proteina ciklira izmedju aktivne / on i inaktivne / off forme 693.1.2. Epinefrin se vezuje za nekoliko razli itih GPCR 713.1.3. Identifikovani su kriti ni funkcionalni domeni receptora i vezanog G-proteina 733.1.4. Adenilil ciklaza je stimulisana / inhibisana razli itim ligand-receptor kompleksima 753.1.5. cAMP-zavisna aktivacija PKA posreduje raznolike odgovore u razli itim elijama 763.1.6. Hormonom indukovana aktivacija PKA reguliše metabolkizam glikogena 773.1.7. Amplifikacija signala se uglavnom dešava u donjem delu signalnog puta 803.1.8. Nekoliko mehanizama reguliše signaling od GPCRs 823.1.9. Proteini za „usidravanje“ lokalizuju efekat cAMP na specifi ne subcelularne regione 853.2. GPCR-zavisna REGULACIJA JONSKIH KANALA 873.2.1. Muskarinski receptor u srcu aktivira G protein koji otvara kanal za K+ 873.2.2. Gt-zavisni receptori koje aktivira svetlost 883.2.2.1. Aktivacija rodopsina izaziva zatvaranje cGMP-zavisnog kanala za katjone 893.2.2.2. Adaptacija štapi a na razli ite nivoe osvetljenja 903.3. GPCR-zavisni RECEPTORI KOJI AKTIVIRAJI FOSFOLIPAZU C 933.3.1. Inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) izaziva oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog retikuluma 943.3.2. Diacilglicerol (DAG) aktivira protein kinazu C (PKC) koja reguliše mnoge druge proteine 963.3.3. Ca++/ kalmodulin kompleks posreduje u odgovoru elija na spoljašnje signale 963.3.3.1. Frekvenca oscilacija Ca++ uti e na odgovor elije 973.3.3.2. Ca++/ kalmodulin-zavisna protein kinaza (CaM-kinaza) posreduje u mnogim efektima Ca++u eliji 983.3.3.3. Ca++/ kalmodulin-zavisna aktivacija drugih efektornih proteina 993.3.3.4. cGMP aktivira protein kinazu G i izaziva relaksaciju elija glatke muskulature 1003.4. GPCR-zavisni AKTIVACIJA TRANSKRIPCIJE GENA 1023.4.1. Membranski-lokalizovan „tubby“ transkripcioni faktor se otpušta aktivacijom PKC 1023.4.2. CREB vezuje cAMP signale za transkripciju 103

3.4.3. GPCR-vezani arestin aktivira nekoliko kinaznih kaskada koje kontrolišu ekspresiju gena 10404. SIGNALNI PUTEVI OD RECEPTOR-ENZIMA I OD RECEPTORA VEZANIH ZA ENZIM 1074.1. SIGNALING PREKO TGF RECEPTORA I DIREKTNA AKTIVACIJA Smad PROTEINA 1124.1.1. TGF se formira cepanjem sekretovanog inaktivnog prekursora 1134.1.2. Receptori za TGF signaling imaju aktivnost serin/treonin kinaza 1144.1.3. Aktivirani tip I TGF receptori fosforilišu Smad transkripcione faktore 1144.1.4. Onkoproteini i I-Smad proteini regulišu Smad-signaling preko negativne povratne sprege 1184.1.5. Gubitak TGF signalinga u estvuje u indukciji abnormalne proliferacije elija i malignim transformacijamaelija

119

4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI 1224.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedni ke karakteristike signalinga 1224.2.2. Citokini uti u na razvoj mnogih tipova elija 1254.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sli nu strukturu i aktiviraju sli ne puteve signalne transdukcije 1274.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore 1324.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifi nu sekvencu koja okružuje fosfoserinske ostatke 1354.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulisan negativnim signalima 1364.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazama 1364.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinima 1384.2.7. Mutant receptora za eritropoetin koji ne može biti down-regulisan, prouzrokuje pove enje hematokrita 1394.3. RECEPTORI KOJI IMAJU FUNKCIJU TIROZIN KINAZA (RTKs) I AKTIVACIJA Ras PROTEINA 1414.3.1. Vezivanje liganda dovodi do transfosforilacije RTK 1414.3.2. Aktivacija/inaktivacija Ras proteina 1424.3.3. RTKse povezuje sa Ras-om preko adapternog proteina i faktora razmene guaninskih nukleotida 1434.3.4. Vezivanje Sos proteina za neaktivni Ras izaziva promenu konformacije koja ga aktivira 1444.4. SIGNALNI PUT MAP KINAZE 1464.4.1. Signal se prenosi od aktiviranog Ras-a do kaskade protein kinaza 1464.4.1.1. Aktivacija Raf kinaze 1484.4.1.2. Aktivacija MAP kinaze 1484.4.2. MAP kinaze regulišu aktivnost mnogih transkripcionih faktora koji kontrolišu gene rane faze 1494.4.3. G protein-zavisni receptori prenose signale do MAP kinaze 1504.4.4. „Scaffold“ proteini izoluju multiple puteve Map kinaza u elijama eukariota 1524.5. FOSFOINOZITIDI KAO TRANSDUKTORI SIGNALA – SIGNALNI PUT PI3 KINAZE 1544.5.1. Neki RTKs i receptori za citokine aktiviraju fosfolipazu C 1544.5.2. Regrutovanje PI-3 kinaze dovodi do aktivacije protein kinaze B 1544.5.3. Receptor za insulin deluje preko signalnog puta PI-3 kinaze 1564.5.4. Aktivirana protein kinaza B omogu ava preživljavanje elija aktivacijom nekoliko puteva 1574.5.5. PTEN fosfataza je uklju ena u prekid PI-3 signalnog puta 1584.5.6. Receptor za odredjeni faktor rasta je povezan sa multiplim signalnim putevima 158

4.6. RECEPTORI POVEZANI SA CITOPLAZMATI NIM TIROZIN KINAZAMA 1594.7. SIGNALING PREKO GUANILIL CIKLAZA I cGMP-a 1614.7.1. Receptori guanilil ciklaze generišu cGMP direktno 1624.7.1.1. Molekularna biologija guanilil ciklaza 1624.7.2. Membranski vezani receptori guanilil ciklaze 1634.7.2.1. Izotipovi membranske/partikularne guanilil ciklaze 1644.7.2.2. Struktura membranske/partikularne guanilil ciklaze 1654.7.2.3. Receptor-efektor povezanost i funkcija membranske/partikularne guanilil ciklaze 1664.7.3. Solubilna guanilil ciklaze 1674.7.3.1. Struktura subjedinica i izotipova/izoforme solubilne guanilil ciklaze 1674.7.3.2. Struktura domena solubilne guanilil ciklaze 1674.7.3.3. Regulacija solubilne guanilil ciklaze ligandima 1684.7.4. cGMP i elijski signaling 1704.7.4.1. Elementi cGMP signalnog puta 1704.7.4.2. cGMP i elijski signaling preko protein kinaza 1714.7.4.3. cGMP i jonski kanali regulisani cikli nim nukleotidima 1744.7.4.4. cGMP-reguliše fosfodiesteraze, a fosfodiesteraze razgradjuju cGMP 1754.7.4.5. cGMP i elijska fiziologija 1764.8. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO RECEPTORA TIROZIN FOSFATAZA 1834.9. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO TCR KOMPLEKSA 1854.9.1. Struktura TCR 1864.9.2. CD3 i proteini 1874.9.2.1. Struktura CD3 i proteina 1874.9.2.2. Funkcija CD3 i proteina 1884.9.3. CD4 i CD8 koreceptori uklju eni u aktivaciju T limfocita 1884.9.3.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora 1884.9.3.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora 1894.9.4. Aktivacija TCR kompleksa 1894.9.4.1. Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacija protein kinaza i adaptrnih proteina 1904.9.5. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima 1934.9.6. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovani signalni put u T limfocitima 1944.9.7. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitim 19505. SIGNALING KOJI UKLJU UJE SIGNALOM REGULISANU PROTEOLIZU 1975.1. NF- SIGNALNI PUT 1985.1.1. Signalom-indukovana degradacija citosolnog inhibitornog proteina aktivira NF- transkripcioni faktor 1985.2. NOTCH/DELTA SIGNALNI PUT 2025.2.1. Regulisana intramembranska proteoliza katalisana preselinom 1 aktivra Notch receptor 2035.3. WNT SIGNALNI PUT 208

5.3.1. Wnt proteini se vezuju za Fizzled receptore i inhibišu degradaciju -katenina 2085.4. HEDGEHOG SIGNALNI PUT 2115.4.1. Hedgehog proteini deluju preko receptornog kompleksa „Patched“ i „Smoothened“ 21106. SIGNALNI PUTEVI OD NUKLEARNIH RECEPTORA 2156.1. SIGNALING PREKO NUKLEARNIH RECEPTORA 2156.1.1. Ligandi za nuklearne receptore 2156.1.2. Osnovni principi prenosa signala preko nuklarnih receptora 2166.1.3. Klasifikacija i struktura nuklearnih receptora 2186.1.3.1. DNA elementi koji se vezuju za nuklearne receptore (HREs) 2196.1.3.2. DNA vezuju i domen nuklearnog receptora 2216.1.3.3. Lignad vezuju i domen nuklearnog receptora 2226.1.3.4. Elementi transaktivacije nuklearnog receptora 2226.1.4. Nehanizmi preko kojih nukearni receptori regulišu transkripciju 2236.1.5. Regulacija signalinga preko nuklearnog receptora 2246.1.6. Signaling preko nuklearnih receptora za steroidne hormone 2276.1.6.1. Aktivacija citoplazmati nog aporeceptornog kompleksa 22707. REGULACIJA RECEPTORA 2317.1. ENDOCITOZA MEMBRANSKIH RECEPTORA 2317.2. SEKRETOVANI PROTEINI MOGU DA VEŽU HORMONE I NA TAJ NA IN SPRE E AKTIVACIJU

RECEPTORA233

1

OSNOVNI PRINCIPI

ELIJSKE KOMUNIKACIJE 01Prema fosilnim nalazima sofisticirani jedno elijski organizmi sli ni današnjim bakterijama bili suprisutni na Zemlji oko 2.5 biliona godina pre nego što su se pojavili prvi više elijski orgnizmi.Smatra se da je jedan od mogu ih razloga ovako spore evolucije bilo nepostojanje dovoljno dobrihmehanizama komunikacije koji su neophodni više elijskim organizmima. Njihove elije moraju bitiveoma kompleksne i precizno koordinisane mehanizme medjusobne komunikacije kako bi bilesposobne da održavaju svoje ponašanje/funkciju u korist homeostaze organizma kao celine.

Ovi mehanizmi komunikacije su esencijalno zavisni od signalnih molekula van elije –ekstracelularnih signalnih molekula koje produkuju elije (tzv. signalne elije) kao signalsvojim susednim elijama ili udaljenijim elijama. Pored toga, mehanizmi komunikacije zavise i odta no odredjenog sistema proteina koji omogu ava svakoj eliji da odgovori na specifi negrupe/podgrupe signala na svoj specifilan na in. Ovi proteini podrazumevaju: receptorne proteinena površini elije koji vezuju signalne molekule; raznovrsne intracelularne signalne proteine kojiu estvuju u prenosu/transdukciji signala u eliju, ali i distribuiraju signal do odgovaraju ihdelova elije. Intracelularni proteini uklju uju razne kinaze, fosfataze, GTP-vezuju e proteine, kaoi mnoge druge sa kojima, ovi navedeni, ali i drugi, interaguju. Na kraju svakog signalnog puta, ilikraj svakog signalnog puta, su ciljni/targetni proteini koji su afektirani aktivacijom puta, te takopromenom svoga stanja/aktivnosti menjaju ponašanje elije formiraju i elijski/biološki odgovor.U zavisnosti od signala ciljni proteini mogu biti regulatori proteini, jonski kanali, komponenetemetaboli kih puteva, delovi citoskeleta, a ponekada i drugi proteini u nizu elemenata signalnogputa (Slika. 1.1.). Na ovaj na in elija, a time i organizam, ima sposobnost ispoljavanja enormnovelikog broja razli itih odgovora u smislu koordinisanog funkcionisanja i o uvanja homeostaze.

2

U ovom poglavlju e biti opisani osnovniprincipi i modeli elijske komunikacije, glavnefamilije receptora na površini i u unutrašnjostielije, kao i osnovni intracelularni putevi koji

se uklju uju aktvacijom ovih receptora.Osnovni fokus teksta skripte je na animalnojeliji, ali e na kraju ovog prvog poglavlja biti

opisane i osnovne karakteristike mehanizamaelijske komunikacije kod biljaka.

Slika 1.1. Jednostavni intracelularni signalni put aktiviranekstracelularnim signalnim molekulom.Estracelularni signalni molekul se vezuje za receptorni protein na površinielijske membrane i aktivira intracelularni signalni put posredovan serijom

signalnih proteina. Na kraju, jedan od njih ili više njih interaguje sa ciljnimproteinom, što rezultira promenom strukture/funkcije ciljnog proteina iomogu ava promenu ponašanja elije.

1.1. OSNOVNI PRINCIPI I MODELI ELIJSKE KOMUNIKACIJE

Mehanizmi koji omogu avaju jednoj eliji da uti e na ponašanje druge, skoro pa na odredjenna in, postojali su, u nekom smislu, i u svetu jedno elijskih organizama još mnogo pre nego što

su se više elijski organizmi pojavili na Zemlji. Dokazi o ovome sudobijeni savremenim istraživanjima jedno elijskih eukariota kakvi sukvasci. Iako ove elije nezavisno žive, mogu da komuniciraju u dobaseksualnog parenja (npr. Saccharomyces cerevisae). Kada je haploidnaindividua spremna za parenje sekretuje peptid, faktor parenja, kojidaje signale elije suprotnog tipa parenja da prestanu da proliferišu i dase pripreme za parenje (Slika 1.2.). Posledi na fuzija haploidnih elijasuprotnog tipa parenja produkuje diploidnu eliju koja prolazi mejozu isporulaciju generišu i haploidne elije sa novim asortimanom gena.

Slika 1.2. elije pivskog kvasca (Saccharomyces cerevisae) odgovaraju na faktor parenja.A – Uobi ajeno, u normalnim uslovima, elije su sferi ne. B – Kao odgovor na faktor parenja sekretovan od strane

susednih elija, one isturaju protruzije prema izvoru faktora parenja kao pripremu za parenje.

3

Istraživanja na mutiranim elijama kvasca, koje su izgubile sposobnost parenja omogu ila suidentifikaciju proteina koji su neophodni za procese prenosa signala, a time i komunikaciju. Oviproteini formiraju signalnu mrežu koja uklju uje: receptorne proteine na površini elije, GTP-vezuju e proteine i druge transduktore signala, kao i protein kinaze, od kojih je svaka veomablisko povezana sa proteinima koji omogu avaju signaling u životinjskoj eliji. Kroz duplikaciju idivergenciju gena svakako je sistem/mreža signalnih puteva kod životinja mnogo uredjenija ikomplikovanija nego kod kvasaca.

1.1.1. Hemijska komunikacija kao na in regulacije fizioloških procesa

Hemijska komunikacija medju elijama neophodna je za regulaciju razvi a, diferencijaciju elija,organizaciju elija u tkiva, kao i za koordinaciju svih aktivnosti organizma. Prenos informacija odjedne do druge elije odvija se pomo u hemijskih glasnika (signalnih molekula) koji se vezuju zaspecifi ne receptore (proteinske prirode) na/u ciljnoj eliji. Ekstracelularni signal (informacija

iz spoljašnje sredine elije) dospevapreko hemijskih medijatora do ciljneelije koja poseduje mehanizme kojim e

signal biti prepoznat i mehanizme prekokojih e on biti preveden i preko kojih ese indukovati neki biološki odgovor ciljneelije. Postoji nekoliko tipova komuni-

kacije posredovane hemijskim medijato-rima (Slika 1.3.):Autokrina komunikacija - elijeoslobadjaju signalne molekule koji sevezuju za receptore na membrani isteelije koja ih je i produkovala.

Slika 1.3. Razli iti tipovi komunikacije

Parakrina komunikacija - signalne molekule se oslobadjaju iz odredjenih signalnih elija, adeluju na susedne ciljne elije.

4

Kriptokrina komunikacija - specifi an vid parakrine komunikacije. Jedan tip ove komunikacijeje da se signalne molekule oslobadjaju u neki zatvoren prostor izmedju elija. Ovaj vidkomunikacije zahteva obavezno prisustvo veoma specifi nih kontakata (veza) izmedju elija (npr.veza izmedju Sertolijevih elija i spermatida). Drugi tip kriptokrine komunikacije je prenossekundarnog glasnika (cAMP ili IP3) kroz porozne veze (tzv. gap-junction) u susednu eliju.Jukstakrina komunikacija - je takodje tip parakrine komunikacije. Difuzija signalne molekuleograni ava se na taj na in što se signalna molekula sintetiše kao membranski-vezan prekursor ideluje (ne odvajaju i se od elije) na elije u neposrednoj okolini (npr. razni faktori rasta).Intrakrina komunikacija - signalna molekula se sintetiše u samoj eliji u kojoj se nalazi njenintracelularni receptor (npr. faktori rasta, dihidrotesteosteron-DHT, azot oksid-NO, ugljenmonoksid-CO).Nervna komunikacija - neurotransmiteri se oslobadjaju u sinapti ku pukotinu i deluju napostsinapti ku eliju.Endokrina komunikacija - produkti lu enja endokrinih elija oslobadjaju se direktno u opštucirkulaciju i deluju na udaljene elije.

Važno je naglasiti da u razli itim delovima organizma, ista signalna molekula može da deluje i kaoneurotransmiter, i kao parakrini posrednik, ali i kao hormon.

1.1.2. Osnovni pojmovi i karkateristike signalnih molekula

1.1.2.1. Sinteza, skladištenje i sekrecija signalnih molekulaU ovom odeljku se opisuju elijski mehanizmi sinteze, skladištenja (magacioniranja) i sekrecijedve najve e i najkompleksnije klase signalnih molekula: peptida i steroida.

Peptidni singalni molekuli se sintetišu u ribozomima, skladište u vezikulama,sekretuju u zavisnosti od potrebe i cirkulišu slobodni tj. rastvoreni u telesnoj te nosti. Onošto je zajedni ko za sve signalne molekule sa polipeptidnom strukturom je da se nakontranskripcije i translacije dobije specifi na pre-pro-signalna molekula koja se potom u procesuposttranslacijske modifikacije «obradjuje» da bi se dobila karakteristi na biološki aktivna signalnamolekula. Informacije koje determinišu sekvencu aminokiselina u polipeptidnom lancu kodiranesu jedarnom DNK. Sekvenca DNK koja kodira odredjeni polipeptidni lanac se prepisuje usekvencu nukleotida iRNK koja napušta jedro i interaguje sa ribozomima na grubomendoplazmatskom retikulumu (ER). Sekvenca nukleotida iRNK e u ribozomima u procesu

5

translacije (prevodjenja) dati specifi nu aminokiselinsku sekvencu pre-pro-signalne molekule.Inaktivna pre-pro-signalna molekula e u procesu posttranslacijske modifikacije u ER i Goldžiaparatu dati biološki aktivnu signalnu molekulu. Uopšteno posmatrano, redosled dogadjaja usintezi pre-pro-singalnog molekula i posttranslacijskom procesovanju je veoma sli an za svepeptidne signalne molekule, ak šta više, za sve peptide koji se sekretuju iz elije.Najkarakteristi niji primeri pre-pro-signalnih molekula su pro-insulin i pro-opio-melano-kortin(POMC). Dok se pro-insulin proizvodi i procesuje u jednom tipu elija (B elijama Langerhansovih

ostrvaca endokrinog pankreasa), POMC sesintetiše u razli itim tipovima elija(adenohipofiza, mozak, placenta i koža).

Slika 1.4. Struktura molekule POMC i produkti koji se dobijajudelovanjem razli itih enzimskih garnitura

Ovi razli iti tipovi elija poseduju razli iteenzime za proces posttranslacijske modifikacije, te stoga i proizvode i sekretuju razli ite produktetj. hemijske medijatore. Neki tipovi elija sekretuju više od jednog produkta. Primer za to suadrenokortikotropni hormon (ACTH) i melano-stimuliraju i hormon (MSH) koji se produkuju urazli itim elijama anteriornog dela hipofize, a usled prisustva razli itih enzimskih garnitura kojevrše hidrolizu molekule POMC na razli itim mestima, daju razli ite produkte (Slika 1.4.). Enzimikoji se nalaze u ACTH-sekretuju im elijama hidroliti ki razlažu POMC molekulu tako da se poredACTH sekretuje i -endorfin (ima veomavažnu ulogu u kontroli bola). elijehipotalamusa takodje procesuju POMC iprodukuju zna ajne koli ine -endorfina.Novosintetisani peptidi se skladište uvezikulama a izbacuju se iz elija procesomCa2+-zavisne egzocitoze (Slika 1.5.).

Slika 1.5. Sekrecija molekula insulina iz B elijaLanagerhansovih ostrvaca endokrinog pankreasa – primer zaCa2+-zavisnu-egzocitozom-posredovanu sekreciju svihpeptidnih i proteinskih signalnih molekula.(Preuzeto uz modifikacije iz Hill, Wyse i Anderson: Animal Physiology ( 2004)

6

Uopšteno, kada odredjeni stimulus depolariše membranu endokrine elije, otvaraju se voltažno-zavisni kanali za Ca2+ i struja Ca2+ ulazi u eliju, što pokre e itav niz dogadjaja koji dovode dointerakcije proteina na membrani vezikula v-SNARE (v-ozna ava vezikularni protein; engl.Soluble N-ethylmalemite-sensitive factor Attachment REceptor) sa proteinima na membraniendokrinih elija (t-SNARE) i do izbacivanja sadržaja vezikula u krv (Slika 1.5.).

Slika 1.6. Pregled glavnihputeva za sortiranjeproteina u eliji.Translacija svih mRNK koje sukodirane u nukleusu se odvijau citosolnim ribozomima. Levo(sekretorni put): Ribozomisintetišu nascentni protein usekretornom putu koji je usme-ren ka grubom ER preko ERsignalne ekvence (1, 2). Nakonzavšene translacije u ER oviproteini mogu da se transpo-rtuju preko vezikula do Goldžikompleksa (3). Dalje se sortira-ju razli iti proteini ili do plazmamembrane ili do lizozoma (4a,4b). Desno (nesekretorni put):Sinteza proteina koji nemaju ERsignalnu sekvencu se odvija naslobodnim ribozomima (1). Oviproteini koji nemaju targetnusekvencu se oslobadjaju u cito-sol i tu ostaju (2). Proteini kojiimaju targetnu sekvencu speci-fi nu za neku organelu prvo seoslobadjaju u citosol (2) apotom se importuju u organele(3-6). Mitohondrijalni i hloropla-stni proteini obi no prodju krozspoljašnju i unutrašnju membra-nu da bi ušli u matriks ili prostorstrome. Drugi proteini se daljesortiraju unutar organela.

Nivo i profil sekrecije je regulisan na razli ite na ine, a u zavisnosti od tipa peptida i vrsteendokrine elije koja ga sintetiše i sekretuje, kao i fiziološkog stanja u kome se organizamtrenutno nalazi. S obzirom da su svi peptidi hidrofilne (lipofobne) signalne molekule, mnogi odnjih cirkulišu slobodno, odnosno rastvoreni u telesnim te nostima. Pored toga, peptidi zbog svojelipofobne prirode ne mogu da prodju lipofilni dvosloj elijske membrane, te svoje efekte ostvarujuisklju ivo vezuju i se za specifi ne receptorne proteine na plazma membrani ciljne elije.

7

Slika 1.7. Sinteza sekretornih proteina injihova kotranslaciona translokacija dužmembrane endoplazmatskog retikuluma.1, 2 - Kada ER signalna sekvenca izadje izribozomoa veže se za partikulu koja prepoznajesignal (engl. Signal Recognition Particle – SRP).3 – SRP ispou uje kompleks ribozom /nascentrnipolipeptid SRP receptoru na membrani ER. Ovareakcija je poja ana vezivanjem GTP i za SRP iza SRP receptor. 4 – Transfer kompleksaribozom/nascentni polipeptid translokonu vodi kaotvaranju kanala translokona i umetanju signalnesekvence i pripojenog rastu eg polipeptida ucentralnu poru. I SRP i SRP receptor kada sedisociraju od translokona hidrolišu svoje vezaneGTP i onda su spremni za umetanjedrugog/novog polipeptidnog lanca. 5 – Kako sepolipeptidni lanac izdužuje i prolazi kroz kanaltranslokona u lumen ER u kome se signalnasekvenca se e signalnim peptidazama i rapidnodegradira. 6 – Peptidni lanac nastavlja da raste.7, 8 – Kada je translacija gotova otpušta seribozom, zaostali protein se pomera u lumen ER,a translokon se zatvara.

Slika 1.8. Post-translacionatranslokacija kroz membranuendoplazmatskog retikuluma.Ovaj mehanizam je veoma uobi ajen kodkvasaca, a dešava se povremeno i uelijama viših eukariota. Male strelice unutar

translokona predstavljaju randomnopresecanje translociranog peptidanapred/nazad. Sukcesivno vezivanjekompleksa BiP (engl. Binding Peptide)aperona i ADP za otvorene segmente

polipeptida prevenira lanac da “sklizne“prema citosolu

8

Steroidni signalni molekuli se sintetišu od holesterola, ne skladište se, sekretuju se difuzijomi cirkulišu vezani za specifi ne proteinske nosa e. Prekursor u sintezi svih steroidnih signalnihmolekula je holesterol. Kod ki menjaka, on se delom dobija ishranom, iz životinjske masti, adelom se sintetiše u elijama koje produkuju steroide. S obzirom da holesterol nije rastvorljiv uvodi, u cirkulaciji se nalazi vezan za lipoproteinske transportne komplekse. Kompleks lipoproteinamale molekulske gustine (engl. Low-Density Lipoproteins - LDL) transportuje holesterol do tkiva.Jetra i mnoga ekstrahepati na tkiva, medju kojima i steroidogene elije ekspresuju LDL receptorena svojim membranama. Kada se LDL kompleks veže za membranski receptor, elija endocitozom«uvu e» kompleks u eliju i na taj na in dobija holesterol. Kompleks lipoproteina velikemolekulske gustine (engl. Hhigh-Density Lipoproteins - HDL) transportuje holesterol do elijajetre, gde ulazi u sastav žu i i ekskretuje se. Na taj na in se smanjuje nivo holesterola u plazmi.Kod ki menjaka, endokrine elije gonada i kore nadbubrežne žlezde, kao i placenta gravidnihsisara, produkuju steroidne signalne molekule, koje naj eš e imaju funkciju hormona, ali mogudelovati i lokalno, u autokrinom i/ili parakrinom maniru. Kada steroidogenoj eliji holesterolpostane dostupan (bilo iz sopstvenog pula ili je poreklom iz cirkulacije) enzimatskom razgradnjomse cepa bo ni lanac od 6 ugljenikovih atoma (izo-kapro-aldehid) i nastaje pregnenolon.Pregnenolon dalje može da bude transformisan preko nekoliko biohemijskih puteva, u zavisnostiod enzimske garniture koja je prisutna u steroidogenoj eliji, daju i razli ite produktekarakteristi ne za odredjeni tip steroidogenih elija. Enzimi koji su neophodni za processteroidogeneze nalaze se rasporedjeni u razli itim intra elijskim kompartmentima: oni kojikatališu konverziju holesterola u pregnenolon su locirani na mitohondrijama, a ve ina drugihenzima je locirana na glatkom endoplazmatskom retikulumu.

Na suprot peptidnim signalnim molekulima, steroidni signalni molekuli se ne skladište uvezikulama sekretornih elija, nego se po potrebi sintetišu i odmah sekretuju procesom difuzije.Shodno tome, koncentracija steroidnih signalnih molekula u cirkulaciji je determinisana odnosomsinteza - trenutna sekrecija hormona, dok je koncentracija peptidnih signalnih molekuladeterminisana sekrecijom ve postoje ih, skladištenih signalnih molekula.

9

1.1.2.2. Koncentracija signalnih molekula u okruženju elije variraDa bi razli ite signalne molekule mogle da igraju ulogu fizioloških regulatora, odnos njihovesinteze i sekrecije mora biti kontrolisan. Veoma esto se ova kontrola ostvarujeneurotransmiterima i/ili drugim signalnim molekulima. Odredjen broj signalnih elija sintetiše isekretuje signalne molekule stalno, ali veli ina sekrecije varira u zavisnosti od delovanjakontrolnog mehanizma, dok drugi tipovi signalnih elija produkuju signalne molekule u zavisnostiod potrebe organizma. Generalno, ve a sekrecija uslovi e ve u koncentraciju datog signalnogmolekula u cirkulaciji, pa i ve i odgovor ciljne elije. Ovaj proces nije beskrajan jer se signalnemolekule enzimskom degradacijom metabolišu u ciljnim tkivima ili u nekim drugim organima(jetra i bubrezi kod ki menjaka). Koncentracija signalne molekule u cirkulaciji ili drugojekstracelularnoj te nosti predstavlja odnos izmedju stepena i brzine “dodavanja” signalnemolekule u estracelularnu te nost procesom sekrecije, kao i stepena i brzine “uklanjanja”

signalne molekule procesima metaboli ke destrukcije i/ili ekskrecije.Prakti no i primarno, koncentracija signalne molekule zavisi od procesa“dodavanja” signalne molekule zato što je proces “uklanjanja” relativnostalan. Vreme koje je potrebno da bi se koncentracija signalne molekulesmanjila na polovinu prvobitne naziva se polu-život i ukazuje na stepeni brzinu “uklanjanja” signalne molekule iz ekstracelularne te nosti, pasamim tim dužinu njegove aktivnosti. Neki signalni molekuli mogu biti

konvertovani u aktivnije forme (potentnije u pogledu izazvanjabiološkog efekta) procesom tzv. periferne aktivacije. Primeri zaperifernu aktivaciju su konverzija tiroidnog hormona tetrajod-tiroinina(T4) u trijod-tironin (T3), kao i testosterona (T) u dihidrotestosteron(DHT).

Slika 1.9. Biološki odgovor zavisi od koncentracije slobodnih hormonskih molekula u cirkulaciji,kao i prisutnosti specifi nih receptora.T4 je tiroidni hormon koji se dominantno sekretuje iz tiroidne žlezde, ali se na periferiji, u ciljnim i drugim elijama,enzimatskim delovanjem konvertuje u T3 koji je fiziološki aktivniji od T4. Sli no tome, T , polni hormon mužjka (androgen),

se delovanjem enzima 5 -reduktaze prevodi u mnogo potentniji hormon DHT, prema kome receptori za androgene hormone ispoljavaju ve i afinitet.

1.1.3. Ekstracelularni signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptore

elije kvasca komuniciraju medjusobno u svrhu parenja sekretuju i nekoliko vrsta malihpeptida. Suprotno tome, elije viših životinja komuniciraju koriste i hiljade razli itih signalnih

10

molekula i još više razli itih kombinacija signalnih puteva. Ove signalne molekule su po hemijskojprirodi aminokiseline, nukleotidi, retinoidi, mali peptidi, derivati masnih kiselina, pa ak i gasovikoji su rastvorljivi u vodi kao što su azot oksid (engl. Nitric Oxide - NO) ili ugljen monoksid (engl.

Carbon Monoxide - CO). Neki od ovih signalnih molekula seoslobadjaju difuzijom kroz plazmalemu, neki su iskazani premaekstracelularnom prostoru, ali ostaju vrsto vezani na površinielije koja ih produkuje, dok se neki procesom egzocitoze sekretuju

iz tzv. signaling elije. Bez obzira na prirodu signala, ciljna elijaodgovara tako što vezuje signalnu molekulu specifi nimreceptorom, što za posledicu ima promenu ponašanja ciljne elije ibiološki odgovor.

Slika 1.10. Vezivanje ekstracelularnih signalnih molekula ili za receptor na površini elije iliza intracelularni receptor.Ve ina signalnih molekula su hidrofilne i zbog toga ne mogu da prodju plazmalemu direktno, te je zbog togaesencijalno postojanje receptornih proteina na površini elije. Vezivanje specifinih liganda za ove receptore,prouzrokuje njjihovu aktivaciju i generiše jedan ili više signala unutar ciljne elije. Nasuprot tome, neke malesignalne molekule difunduju kroz plazma membranu i vezuju se za receptore unutar ciljne elije bilo da sureceptori u citosolu ili nukleusu. Mnogi od ovih signalnih molekula su hidrofobni i prakti no nerastvorljivi uvodenim rastvorima, te se stoga transportuju u krvi i drugim ekstracelularnim fluidima vezani za proteinskenosa e od kojih disosuju pre nego što udju u ciljnu eliju.

Ekstracelularne signalne molekule vrlo esto ispoljavaju aktivnost i pri vrlo niskimkoncentracijama (uobi ajeno je 10-8 M) a receptori koji ih prepoznaju obi no ih vezuju sa velikimafinitetom (konstanta afiniteta K 10-8 M litara/molu). U najve em broju slu ajeva ovi receptori sutransmembranski proteini na površini ciljne elije. Kada receptori vežu ekstracelularne signalnemolekule tzv. ligande, aktiviraju se i generišu kaskadu intracelularnih signala koji uslovljavajuponašanje elije. Pored transmembranskih receptora, postoje i receptori u unutrašnjosti ciljneelije tzv. Intracelularni receptori, koji se aktiviraju vezivanjem signalnih molekula (male molekule

i hidrofobne molekule) koje su bile sposobne da udju u eliju (Slika 1.10.).

1.1.3.1. Signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptorske molekule koje ekspresujuciljne elije

Iako cirkulišu i signalni molekuli dospevaju do velikog broja elija, interaguju i ispoljavaju svojefekat jedino na ciljne elije tj. elije koje ekspresuju specifi ne receptorne proteine koji e biti“prepoznati” od strane ekstracelularnog signalnog molekula i za koje e se on vezati. Npr. tiroidnihormoni se sekretuju od strane elija tiroidne žlezde i ispoljavaju široki spektar metaboli kih,strukturalnih i razvojnih efekata u razli itim tkivima, upravo zbog toga što veliki broj razli itihelija ekspresuje receptore za te hormone. Tipi na ciljna elija ekspresuje hiljade receptornih

11

molekula za odredjeni signalni molekul. Pored toga, veliki broj elija poseduje i razli ite tipovereceptora i to ih ini sposobnim da odgovore na ve i broj signalnih molekula. Senzitivnost ciljneelije za odredjeni signalni molekul zavisi od broja funkcionalnih receptornih molekula za dati

signal koje ekspresuje ciljna elija. Senzitivnost ciljne elije zaodredjeni signal može se promeniti prisustvom razli itih drugihhemijskih medijatora/signala i/ili u razli itim fiziološkim uslovima, jerbroj receptora za dati hormon može da se pove a procesom “regulacijena gore” (engl. up-regulation) ili da se smanji procesom “regulacije nadole” (engl. down-regulation). Ove varijacije u tipovima i brojureceptorskih molekula ekspresovanih od strane ciljnih elija imajuvelikog udela i zna aja u beskrajnoj raznovrsnosti hemijske regulacijeu životinjskom svetu.

Slika 1.11. Regulacija broja receptora

Da bi inicirali promenu u ciljnoj eliji, signalne molekule se prvo vezuju za specifi ne receptorskemolekule koje se nalaze ili na membrani ili unutar elije. Molekule kao što su hormoni,neurotransmiteri i drugi signalni molekuli koji donose informaciju do elijske membrane nazivajuse primarni glasnici, dok se molekule koje se formiraju u unutrašnjosti elije kao posledicavezivanja primarnog glasnika za receptor i koje prenose informacije dalje u unutrašnjost elije,nazivaju sekundarni glasnici. Hidrofilni signalni molekuli koji se vezuju za receptore na plazmamembrani svoj efekat ispoljavaju preko sekundarnih glasnika (cikli ni adenozin monofosfat –cAMP; cikli ni guanozin monofosfat – cGMP; Ca2+ joni; inozitol-3-fosfat – IP3; diacil-glicerol –DAG). Hidrofobne signalne molekule koje se vezuju za intracelularne receptore moguprouzrokovati brze efekte (ukoliko aktiviraju neki protein/enzim, npr. vezivanje NO za njegovreceptor/enzim solubilnu guanil ciklazu) ili mogu prouzrokovati regulaciju transkripcije razli itihgena (tzv. genomski efekti). Ranije se smatralo da se aktiviranjem membranskih receptora biološkiodgovor brže ispoljava, dok se biološki odgovor dobijen aktivacijom intracelularnih receptoramanifestuje sporije. Danas je se zna za veliki broj signalnih molekula da mogu da ispoljavaju ibrze (negenomske) i sporije (genomske efekte; regulacija transkripcije gena) efekte bilo vezivanjemza receptorne proteine na plazma membrani ciljne elije ili za receptore unutar elije.

1.1.3.2. Pojam, osobine i klasifikacija receptoraEkstracelularne signalne molekule ispoljavaju svoj efekat samo na one elije koje posedujureceptore (specifi ne proteine) za dati signalni molekul. Prvi korak u mehanizmu delovanja

12

signalnih molekula je njihovo vezivanje za specifi ne vezuju e proteine – receptore, na ili u eliji.Molekula koja se specifi no i nekovalentno veže za receptor naziva se ligand za dati receptor.Vezivanje liganda dovodi do promena u molekularnoj konformaciji receptorskog proteina što edalje izazvati niz uzro no-posledi nih reakcija koje e rezultirati biološkim odgovorom elije.

Iako je receptorska populacija veoma brojna i raznovrsna, mogu se izdvojiti osnovnekarakteristike koje su zajedni ke svim tipovima receptora. Receptori ispoljavaju veliki afinitet(jer je koncentracija signalnog molekula obi no vrlo mala) i visoku specifi nost za odredjenisignalni molekul. Receptor esto pokazuje mali afinitet i za nespecifi an signalni molekul tj. ligandi to je tzv. kros vezivanje (engl. cross coupling), ali to ne predstavlja problem u normalnimfiziološkim uslovima. Receptori mogu biti saturisani u uslovima koncentracije liganda kojaokupira sva receptorska mesta. Interakcija ligand-receptor je reverzibilan proces, a distribucijareceptora u ciljnom tkivu treba da odgovara aktivnosti liganda (da su prisutni u ciljnim tkivimaza taj signalni molekul). Na kraju, vezivanje za receptor treba da je u korelaciji sa biološkimodgovorom.

Receptori se mogu podeliti u etiri osnovne funkcionalne klase: (1) ligand-zavisni (ligand-vezuju i) jonski kanali; (2) G-protein – zavisni receptori tj. receptori povezani sa G-proteinima (tzv. engl. G-Protein Coupled Receptors - GPCR); (3) receptor-enzim/receptori-vezani za enzime; (4) intracelularni receptori. Detaljniji opis tipova receptora i osnovnihmehanizama koji se „uklju uju” aktivacijom receptora dat je kasnije u tekstu.

1.1.4. Ekstracelularni signalni molekuli mogu da deluju i na maloj i na velikoj distanciMnoge signalne molekule ostaju vezane za površinu signalne elije i uti u jedino na ciljne elije sakojima su u kontaktu ostvaruju i tzv. kontakt-zavisni signaling (Slika 1.12A.). Ovaj vidkomunikacije je veoma važan tokom razvoja, kao i imunog odgovora. Ipak, naj eš e se signalnemolekule sekretuju i one mogu cirkulacijom dospeti do ciljnih elija razli ito udaljenih od signalneelije koja ih je sekretovala. Na osnovu udaljenosti ciljnih elija za koje se vežu signalne molekule

i ispoljavaju svoj efekat, razlikuju se lokalni medijatori koji deluju ili na samu eliju koja ih jesekretovala te se tako ostvaruje autokrini signaling ili autokrina komunikacija, ili na ciljneelije u neposrednom okruženju što je parakrini singaling ili parakrina komunikacija (Slika

1.12B). Da bi neka signalna molekula mogla da ispolji ovakav vid komunikakcije neophodno je dajoj se ne dozvoli da difunduje daleko, te se zbog toga one veoma esto preuzimaju od stranesusednih elija, ili razlažu ekstracelularnim enzimima, ili imobilišu ekstracelularnim matriksom.Za velike, više elijske ogranizme, signaling na kratkim udaljenostima ne zadovoljava njihove

13

potrebe za komunikacijom niti je dovoljan da koordiniše ponašanje svih elija. Kod ovihorganizama se u toku evolucije razvio set specijalizovanih elija sa specifi nom funkcijom ukomunikaciji izmedju udaljenih i odvojenih delova organizma. Najsofisticiranije su neuroni koji susposobni da preko svojih dugih izraštaja, aksona, ostvaruju komunikaciju sa udaljenim ciljnimelijama. Aktivacija nervne elije spoljašnjim signalim ili drugim nervnim elijama podrazumeva

genezu elektri nog signala, akcionog potencijala, i njegovo prostiranje duž membrane aksona. Nakraju aksona, u zoni terminalnih završetaka, akcioni potencijal e prouzrokovati egzocitozuhemijskih medijatora koji se zovu neurotransmiteri zbog toga što u estvuju uprenosu/transmisiji signala sa jedne nervne elije na drugu nervnu eliju ili neku druge elije(detaljniji opis je mogu e na i u skripti Opšta fiziologija životinja, Kova evi i saradnici, 2005).Neurotransmiteri se sekretuju u »pukotinu« izmedju elija koja se zove hemijska sinapsa ipredstavlja funkcionalni spoj dve elije, a dizajniran je tako da osigura dostavu neurotransmitera

do postsinapti ke elije (Slika1.12C). Na ovaj na in se ostvarujenervna komunikacija, odnosnonervna regulacija funkcijecelokupnog organizma.

Slika 1.12. Forme medju elijske komunikacije ilisignalinga. A – Kontakt-zavisni vid komunikacije zahteva da elije buduu direktom membrana-membrana kontaktu. B – parakrinakomunikacija zavisi od signalnih molekula oslobodjenih uekstracelularni prostor, a koje deluju lokalno na susedneelije. C – sinapti ka komunikacija se ostvaruje neuronima

koji transmituju elektri ne signale duž svojih aksona i kaoposledicu toga oslobadjaju neurotransmitere u sinapsu koja jeveoma esto locirana veoma daleko od tela neurona. D –endokrina komunikacija zavisi od endokrinih elija kojesekretuju hormone u cirkulaciju kojom se transportuju do svihelija organizma. Mnoge signalne molekule mogu da

posreduju i u parakrinom, sinapti kom i endokrinom vidukomunikacije. Krucijalne razlike se odnose na brzinu islelektivnost kojom su signalne molekule dopremljene dociljne elije.

Drugi na in specijalizovane komunikacije/signalinga koji u estvuje u regulacija fukcije iponašanja celog organizma su endokrine elije. Ove elije svoje aktivne principe, hormone,sekretuju u cirkulaciju, te na taj na in hromoni, kao signalne molekule, stižu i prenose signal i donajudaljenijih ciljnih elija organizma. Dakle, endokrini sistem svoju regulatornu funkciju obavljaputem hormona. Hormoni su specifi ne hemijski aktivne materije produkti lu enja endokrinih

14

žlezda koji se izlu uju direktno u krv i putem krvi stižu do efektora. Endokrini sistem zajedno sanervnim ima veliku ulogu u obezbedjenju homeostaze organizma i njihove aktivnosti semedjusobno dopunjuju. Postoje suprotonosti i razli itosti u pogledu funkcionisanja nervne i

endokrine komunikacije (Slika 1.13.). S obzirom da se endokrinisignaling oslanja na difuziju i protok krvi, ovaj na in komunikacijeje relativno spor. Na suprot tome, sinapti ki signaling je veoma brz imnogo precizniji. Nervne elije mogu da prenose informacije navelike razdaljine posredstvom elektri nih impulisa koji putujubrzinom od 100 metara u sekundi. Kada se neurotransmiteroslobodi iz treminalnih završetaka nerva može da difunduje jedino100 nm do ciljne elije, a ovaj proces traje manje od jednemilisekunde. Druga razlika izmedju endokrinog i sinapti kogsignalinga je u pogledu efikasnih koncentracija signalnih molekula.U endokrinom sistemu su hormoni jako razblaženi u cirkulaciji, testoga moraju biti sposobni da deluju i pri veoma malimkoncentracijama (uobi ajeno je <10-8 M), dok su neurotransmiterimnogo manje razblaženi i deluju u mnogo ve im koncentracijama(npr. koncentracija acetil-holina u sinapti koj pukotini je 5x10-4 M).Shodno ovome, receptori za neurotransmitere su malog afiniteta zasvoje ligande, te neurotransmiteri mogu vrlo lako da se disocirajuod receptora da bi završili odgovor. Pored toga, nakon oslobadjanjaneurotransmitera, on se veoma brzo uklanja iz sinapti ke pukotine,ili specifi niim hidroliti kim enzimima koji ga uništavaju ili sepreuzima od strane specifi nih membranskih transportnih proteinakoji ga pumpaju nazad ili u terminalne završetke nerve elije ili ususedne glijalne elije. Prema tome, sinapti ki signaling je mnogoprecizniji od endokrinog i u vremenskom i u prostornom smislu.

Slika 1.13. Suprotnosti izmedju endokrine i sinapti ke komunikacije.Kod kompleksnih životinjskih organizama nervne i endokrine elije rade zajedno u koordinaciji razli itih aktivnostibiliona elija organizma. Dok razli ite endokrine elije moraju da koriste razli ite hormone kako bi specifi nokomunicirale sa ciljnim elijama, razli iti neuroni mogu da koriste isti neurotransmiter i pri tome da ostvarujukomunikaciju u visoko specifi nom maniru.A – Endokirne elije sekretuju hormone u cirkulaciju, a hormoni e aktivirati signaling samo one ciljne elije koja ihspecifi no prepozna preko svojih receptora.B – U sinapti kom signalingu, suprotno od endokrinog, specifi nost je rezultat sinapti kog kontakta nervne elije ispecifi ne ciljne elije. Obi no samo ciljna elija koja je u komunikaciji sa nervnom elijom biva izložena delovanjuneurotransmitera oslobodjenog iz terminalnih završetaka presinapti ke nervne elije (mada neki neurotransmiterideluju i u parakrinom maniru i imaju ulogu lokalnog medijatora koji uti e na veliki broj ciljnih elija u okolnoj zoni).

15

Medjuzavisnost nervnog i endokrinog sistema omogu ava integraciju i interakciju razli itih uticajaiz spoljašnje i unutrašnje sredine organizma. Primer nervno-endokrine regulacije efektora jeinervacija i regulacija srži nadbubrežne žlezde preganglijskim vlaknima simpati ke komponentevegetativnog nervnog sistema, ime se omogu ava oslobadjanje adrenalina i noradrenalina ucirkulaciju. Pored toga, specifi nom funkcionalno-organizacionom vezom izmedju hipotalamusa ihipofize o ituje se jedinstven i sihronizovan, harmoni an odnos nervnog i endokrinog sistema, a ucilju o uvanja homeostaze organizma.

Brzina odgovora na ekstracelularni signal zavisi ne samo do mehanizma isporu ivanja signala,nego i od prirode odgovora u ciljnoj eliji. Ukoliko odgovor podrazumeva promenu u proteinimave prisutnim u ciljnoj eliji može se odvijati u sekundama ili milisekundama. Kada odgovoruklju uje promene u ekspresiji gena i/ili sintezu novih proteina, obi no zahteva sate, bez obzirana tip isporu ivanja signala.

1.1.4.1. Autokrina komunikacija može da koordiniše odluke grupe identi nih elijaSve do sada opisane forme komunikacije se odnose na efekat jedne elije na druge, u smislu dasu signalna i ciljna elija razli ite. Pored toga, elije mogu da šalju signale i susednim elijamaistog tipa, kao i sebi samim (signalna elija je ujedno i ciljna) i tako se ostvaruje autokrinakomunikacija. Ovaj vid komunikacije koriste elije imunog sistema, a posebno je zna ajantokom razvoja, jer kada se usmeri jedna elija ka za nju odredjenom putu diferencijacije,ona može da po ne da sekretuje autokrine signale sebi samoj koji obnavljaju i dodatno poja avajurazvojnu odluku. Autokirini signaling je najefektivniji kada se ostvaruje simultano u grupisusednih elija istog tipa, i važan je da podstakne i »ohrabri« grupu identi nih elija da »odlu e« oistom tipu razvoja. Prema tome, autokirni signaling je jedan od mogu ih mehanizama kojinaglašava »efekat komune« koji je prime en u ranim fazama razvoja. Ovaj efekat podrazumeva dagrupe identi nih elija mogu da odgovaraju na signal koji indukuje diferencijaciju, dok jedna

izolovana elija istog tipa ne može (Slika 1.14.).

Slika 1.14. Autokrina komunikacija.Jedna signalna elija dobija veoma slab autokrini signal, dok grupe identi nih signalnih elijadobijaju jak autokrini signal. Grupa identi nih elija produkuje ve u koncentraciju sekretovanihsignalnih molekula. Kada se signal potom veže za receptor na istoj eliji koja ga je iprodukovala »ohrabruje« elije da odgovaraju koordinisano kao grupa.

16

Na žalost, elije kancera veoma esto koriste autokirni signaling da prevazidju normalnu kontroluelijske proliferacije i preživljavanja. Sekretuju i signalne molekule koje se potom vežu za istueliju koja ih je sekretovala, elije kancera mogu da stimulišu svoje spostveno preživljavanje i

proliferaciju, te da veoma efikasno preživljavaju i proliferišu na mestima gde normalne elije istogtipa ne mogu.

1.1.4.2. Porozne ili pukotinaste veze (engl. gap-junctions) dozvoljavaju da se signalneinformacije dele izmedju susednih elija

Još jedan na in koordinisane aktivnosti susednih elija su tzv. porozne ili pukotinaste veze(engl. gap-junctions). To su specijalizovane elija- elija porozne veze koje mogu da se formirajuizmedju dve elije kojima se membrane veoma blisko su eljavaju. Ovim tipom veze se prekoravnih kanala ispunjenih vodom ostvaruje direktna veza izmedju citoplazmi dve udružene elije.Ovi kanali dozvoljavaju razmenu malih intracelularnih signalnih molekula tzv. intracelularnihmedijatora, kao što su Na+, K+, Ca2+, cAMP, ali ne i makromolekula kao što su proteini ilinukleinske kiseline. Prema tome, elije povezane preko gap-junctions veza mogu komuniciratimedjusobno direktno, zaobilaze i barijeru koju predstavlja plazma membrana (Slika. 1.15.).

Slika 1.15. Komunikacija preko poroznih ili pukotinastih veza tj. tzv. gap-junctios.elije povezane poroznim/pukotinastim vezama tj. preko gap-junctions veza dele male molekule, kao što su intracelularne

signalne molekule i zbog toga mogu da odgovore na ekstracelularne signale u koordinisanom maniru.

Tip i obrazac gap-junctions veza u tkivu može da se utvrdi ili elektrofiziološkim metodama,aplikacijom intracelularnih elektroda, ili vizuelno, nakon mikroinekcije u vodi solubilne boje malihmolekula. Istraživanja ovakve prirode sugerišu da elije embriona u razvoju prave i raskidaju gap-junction veze po specifi nom i veoma interesantnom obrazcu, što ukazuje da ove veze imajuveoma važnu ulogu u signalnim procesima koji se odvijaju izmedju embrionalnih elija u razvoju.Miševi i ljudi koji imaju deficit za jedan odredjen gap-junction protein (npr. koneksin 43) imajuvelikih nedostataka u razvoju srca. Kao i autokrina komunikacija, gap-junction signalingomogu ava elijama istog tipa koje se nalaze u bliskom okruženju, da koordinišu svoje ponašanje.Medjutim, još uvek se ne zna koji su to sve mali molekuli preko kojih se ostvaruje gap-junctionsignaling.

17

1.1.5. Svaka elija je programirana da odgovara na specifi nu kombinaciju ekstracelularnihsignalnih molekula

Tipi na elija više elijskog organizma je izložena delovanju stotina i hiljada razli itih signala iznjenog okruženja. Ovi signali mogu biti solubilni molekuli, ili vezani za ekstracelularni matriks, iliza površinu susednih elija i mogu delovati u milion razli itih kombinacija. elije moraju da

odgovore na »šumu« signala selektivno, shodnosvom specifi nom karakteru koji su stekle uprocesu progresivne specijalizacije tokomrazvoja. elija može biti programirana tako dana jednu kombinaciju signala odgovaradiferencijacijom, na drugu kombinaciju signalaumnožavanjem, ili na neku drugu kombinacijuostvaruju i specifi ne funkcije, kao što susekrecija ili kontrakcija.

Slika 1.16. Animalna elija zavisi od brojnih ekstracelularnihsignala.Svaki elijski tip ekspresuje i izlaže set receptora koji im omogu ava da odgovarajuna set signalnih molekula produkovan od strane drugih elija, a koji korespondirasetu receptora. Ovi signalni molekuli deluju u kombinaciji u nameri da regulišuponašanje elije. Kao što je prikazano na slici, pojedina na elija zahteva velikibroj signala da bi preživela, i dodatne signale kako bi se delila ili diferencirala.Ukoliko nedostaje odgovaraju i signal za preživljavanje elija e prolaziti krozproces »samoubistva« koji se naziva programirana elijska smrt ili apoptoza.

Ve ina elija u kompleksnom živom organizmu je takodje programirana da u zavisnosti odspecifi ne kombinacije signala ima sposobnost da preživi. U nedostatku ovih signala (npr. uelijskoj kulturi) elija aktivira tzv. suicidni program i sama sebe ubija u procesu koji se naziva

programirana elijska smrt ili apoptoza. Sposobnost da prolaze proces apoptoze je fundamentalnakarakteristika animalnih elija. S obzirom da razli iti tipovi elija zahtevaju razli ite kombinacijesignala za preživljavanja, svaki tip elije ima specifi no topološko mesto u organizmu i ograni enje razli itim okruženjem.

U principu, stotine i hiljade signalnih molekula koje životinje stvaraju može biti koriš eno da sekreira skoro neograni en broj razli itih signalnih kombinacija. Koriš enje ovih kombinacija u

18

kontroli ponašanja elije omogu ava životinji da kontroliše svoje elije na veoma specifi an na inkoriš enjem limitirane raznolikosti signalnih molekula.

1.1.5.1. Razli ite elije mogu da odgovaraju razli ito na isti signalni molekulSpecifi an na in na koji elije reaguju na svoju okolinu veoma varira. Ovo variranje zavisi od setareceptornih proteina koje elija poseduje, a koji determiniše specifi nu i odredjenu grupu signalana koju elja može da odgovori, a takodje varira u odnosu na intracelularnu mašineriju kojomelija integriše i intepretira signale koje dobija (Slika 1.1.). Prema tome, jedan signalni molekul

veoma esto ima razli ite efekte na razli ite tipove ciljnih elija. Na primer, neurotransmiteracetil-holin stimuliše kontrakciju skeletnih miši nih elija, ali smanjuje brzinu i snagukontrakcija miši nih elja srca. Ovo se dešava zbog toga što su acetil-holinski receptori namiši nim elijama skeletne i sr ane muskulature razli iti. Medjutim, nije uvek razlika u strukturireceptora objašnjenje za razli iti efekat. U velikom broju slu ajeva ista signalna molekula sevezuje za iste receptore, a opet produkuje veoma razli ite odgovore u razli itim tipovima ciljnihelija reflektuju i time razliku u unutrašnjoj, intracelularnoj mašineriji za koju su receptori

povezani/kaplovani.

Slika 1.17. Razli iti odgovori elije indukovani neurotransmiterom acetil-holinom.Razli iti elijski tipovi su specijalizovani da odgovaraju na prisustvo acetil-holina na razli ite na ine. A i B – za ova dva elijska tipa acetil-holin se vezuje za istereceptorne proteine, ali se intracelularni signali koji se produkuju inetrpretiraju na razli ite na ine kod elija specijalizovanih za razli ite funkcije. C – miši na elijaprodukuje specifi an/odredjeni tip receptornog proteina za acetil-holin koji generiše intracelularne signale razli ite od onih koji nastaju aktivacijom receptora naelijama A i B, što i rezultira razli itim efektom.

19

1.2. VEZIVANJE ZA RECEPTORE AKTIVIRA RAZLI ITE SIGNALNE PUTEVE

S obzirom na hemijsku prirodu signalinih molekula, odnosno njihovu rastvorljivost/solubilnost(hidrofilne-lipofobne i hidrofobne-lipofilne signalne molekule), razlikuju se mehanizmi kojima ovihemijski medijatori ispoljavaju svoje efekate. Iako ve ina ekstracelularnih signala pripada grupihidrofilinih molekula koji se vezuju za receptore na površini elije, neki signalni molekuli sudovoljno hidrofobni i/ili mali da prodju lako kroz plazma membranu ciljne elije i da se uunutrašnjosti elije vezuju ili za specifi ne receptore ili da pak direktno aktiviraju enzime, koji suujedno i receptori za dati signalni molekul. U daljem tekstu e ukratko biti prikazaninajmarkantniji primeri receptora i za jedan i za drugi tip ekstracelularnih signalnih molekula.

1.2.1. Tri velike klase receptornih proteina na površini elije koji su vezani za jonskekanale, vezani za G proteini i vezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnostHidrofilini signalni molekuli, uklju uju i neurotransmitere i signalne proteine, vezuju se zaspecifi ne receptorne proteine na površini ciljne elije na koju deluju. Ovi receptorni proteiniimaju funkciji prenosnika, tzv. transduktora signala (signalnih transduktora). Oniprevode/konvertuju ekstracelularne ligad-vezuju e dogadjaje (promene nastale vezivanjemliganda) u intracelularne signale koji menjaju ponašanje ciljne elije.

Ve ina receptornih proteina na površni elije pripada jednoj od tri klase koje su definisane naosnovu mehanizama transdukcije koje receptori koriste.

(1) Receptori vezani za jonske kanale se još nazivaju transmiterima-regulisani jonskikanali ili jonotrponi receptori koji su uklju eni u veoma brz signaling izmedju elektri no-aktivnihekscitabilnih elija (Slika 1.18A). Ovaj tip signalinga je posredovan malim brojemneurotransmitera koji tranzijentno (prolazno) otvaraju ili zatvaraju jonski kanal formiran odproteina za koji se signalni molekul vezuje, te na taj na in menjaju permeabilitet plazmamembrane, a time i ekscitabilnost postsinapti ke elije. Receptori ove klase pripadaju velikojfamiliji holmologih proteina koji nekoliko puta prolaze/presecaju elijsku membranu (engl.multipass transmembrane proteins).

(2) Receptori vezani za G-proteine (engl. G Protein Coupled Receptors - GPCR)indirektno regulišu neki ciljni protein koji je odvojen od receptora i nalazi se na drugom mestu uplazma membrani ciljne elije, a može biti enzim ili jonski kanal. Regulacija, odnosno interakcijaizmedju receptora i ciljnog proteina se ostvaruje preko »tre eg« proteina-posrednika, koji se zove

20

trimerni GTP-vezuju i protein ili G-protein (Slika 1.18B). Aktivacija ciljnog proteina može dapromeni koncentraciju jednog ili više intracelularnih medijatora (ukoliko je ciljni protein enzim) ilimože da promeni permeabilitet plazma membrane ciljne elije (ukoliko je ciljni protein jonskikanal). Svi receptori iz ove klase pripadaju velikoj familiji homologih proteina koji sedam putaprolaze/presecaju elijsku membranu (engl. seven-pass transmembrane proteins).

(3) Receptori koji su vezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnost,odnosno, ili funkcionišu direktno/sami kao enzimi ili su direktno vezani sa enzimima koje moguda aktiviraju kada se za receptor veže ligand (Slika 1.18C). Ovu grupu receptora formirajutransmembranski proteini koji samo jednom prolaze/presecaju elijsku membranu (engl. signle-pass transmembrane proteins), a ligand-vezuju e mesto receptora je izvan elije, dok je kataliti kideo receptora ili deo koji je vezan za enzim u unutrašnjosti ciljne elije. Receptori ove klase suheterogeni u strukturi u poredjenu sa prethodne dve klase receptora. Najve u podklasu ineprotein kinaze ili receptori asocirani sa protein kinazama, te vezivanje liganda, odnosno aktivacijareceptora prouzrokuje fosforilaciju specifi nog seta proteina u ciljnoj eliji.

Postoje i neke receptorne molekule na površini ciljne elije koje ne spadaju ni u jednu odtri navedene klase. Neki od njih su tzv. receptori zavisni od proteoliti kih dogadjaja/procesa u

ciljnoj eliji, te se na tajna in inicira signaling. I oovom na inu signalinga, kao io signalingu preko triosnovne klase receptora, bi eviše prezentovano u narednimpoglavljima.

Slika 1.18. Tri klase receptora na površinielije.

A – Receptori vezani za jonske kanale. B –Receptori vezani za G-proteine. C – receptorivezani za enzime ili receptori koji imaju»unutrašnju« enzimsku aktivnosti, tj. sam receptorima enzimsku aktivnost (iako veliki broj enzimski-vezanih receptora ispoljava u jednom delu svojemolekule enzimsku aktivnost, kao što je prikazanona levoj strani slike, mnogi drugi se »oslanjaju« izavisni su od enzima sa kojim su vezani, kao štoje prikazano na desnoj strani slike).

21

1.2.1.1. Ve ina aktiviranih receptora sa površine elije aktivira signaling preko malihmolekula i mreže intracelularnih signalnih proteina

Ve ina signala koji se primaju na površini elije preko pomenutih klasa receptora se »uvodi« uunutrašnjost elije kombinacijom malih i/ili velikih intracelularnih signalnih molekula. Na tajna in se formira lanac tzv. intracelularni signalni put koji »na kraju« aktivira ciljni protein kojidalje afektuje druge proteine i/ili molekule odgovorne za ponašanje ciljne elije (Slika 1.1.).

Mali intracelularni signalni molekuli se nazivaju mali intracelularni medijatori ilisekundarni glasnici (prvi glasnici su ekstracelularni signalni molekuli). Ovi molekuli segenerišu u velikom brooju kao odgovor na aktivaciju receptora i difunduju rapidno udaljavaju i seod izvora koji ih generiše, te na taj na in šire signal u druge delove elije, afektuju i ponašanjespecifi nih signalnih ili ciljnih proteina. Neki od sekundarnih glasnika su hidrofilni (cAMP, cGMP,Ca2+), a neki su hidrofobni (diacil glicerol – DAG; inozitol trifosfat – IP3).

Veliki intracelularni signalni molekuli su intracelularni signalni proteini. Mnogi odnjih prenose signale tako što ili aktiviraju naredne u nizu intracelularne signalne proteine i/iliiniciraju produkciju sekundarnih glasnika. Veliki intracelularni signalni molekuli mogu bitiklasifikovani na osnovu svoje specifi ne i odredjene funkcije, mada mnogi od njih mogu dazadovoljavaju karakteristike nekoliko kategorija (Slika 1.19.). Po funkciji, razlikuju se: (1) Relejniproteini tj. proteini koji samo vode/nose signal do naredne komponente u lancu. (2) Mesengerniproteini koji prenose signal iz jednog dela elije u drugi (npr. iz citosola u nukleus). (3) Adapterniproteini (proteini adapteri) koji su »izgubili unutrašnju enzimsku aktivnost« i imaju funkcijuadaptera povezuju i jednu signalnu molekulu sa drugom bez u eš a u prenosu signala. (4)Amplifikatorni proteini (proteini amplifikatori) mnogo puta pove avaju signal koji su primili i toili produkcijom velike koli ine malih intracelularnih signalnih medijatora (sekundadrnihglasnika), ili aktivacijom velikog broja intracelularnih signalnih proteina koji su naredni u nizu kaunutrašnjosti elije (engl. down-stream intracellular signaling proteins). Amplifikatorni proteini sunaj eše enzimi ili jonski kanali, a ukolko je uklju eno nekoliko amplifikacionih koraka/faza urelejnom lancu/nizu, onda se takav signalni put/niz naziva signalna kaskada. (5) Transduktorniproteini (proteini transduktori) prevode signal u druga iju formu (npr. enzim koji produkujecAMP, mada je on i transduktor i amplifikator). (6) Bifurkacioni proteini šire signal sa jednogsignalnog puta na drugi. (7) Integratorni proteini primaju signal od jednog ili više signalnihputeva i integrišu ga pre nego što ga prenesu dalje. (8) Regulatorni proteini latentnih gena seaktiviraju na površini elije aktiviranim receptorima, a potom migriraju u nukleus gde stimulišutranskripciju gena. Pored navedenih postoje i drugi tipovi intracelularnih proteina sa važnimulogama u intracelularnom signalingu (Slika 1.19).

22

Slika 1.19. Razli ite vrsteintracelularnih signalnihproteina nalazi se dužsignalnog puta od receptorana površini elije do nukelusa.U primeru prikazanom na slici, serijesignalnih proteina i malihintracelularnih medijatora sprovodeekstracelularni signal u unutrašnjostciljne elije prouzrokuju i regulacijugenske ekspresije. Ekstracelularnisignal se amplifikuje, transdukuje iliprevodi i distribuira/usmereva na »n«razli itih pravaca. Mnogi od ovihkoraka i faza mogu biti modulisaniraznim drugim ekstracelularnim iintracelularnim signalima, tako dafinalni rezultat zavisi i od drugihfaktora koji afektuju eliju (videti sliku1.16.). U zavisnosti od tipa signala iuslova u ciljnoj elije, signalni putmože da aktivira/inhibira ciljneproteine koji remete ponašanjeelija. U primeru prikazanom na slici

target/cilj je protein koji regulišegensku ekspresiju.

23

Modulatorni proteini modifikuju aktivnost intracelularnih proteina i zna ajno regulišu ja inusignalinga duž puta. Proteini za »usidravanje« (engl. anchoring proteins) održavaju specifi nisignalni protein na preciznoj lokaciji u ciljnoj eliji drže i ga vezanim za membranu ili elementecitoskeleta. Proteini koji imaju ulogu »postolja/skela« (engl. scaffold proteins) su adapteri i/iliproteini za »usidravanje« koji vezuju ve i broj signalnih proteina zajedno u funkcionalankompleks i veoma esto ga »drže« na specifi nim lokacijama.

1.2.2. NO aktivira signalne puteve vezuju i se direktno za enzim u unutrašnjosti ciljneelije

Gas azot oksid (engl. Nitric Oxide – NO) je markantan i veoma važan predstavnik grupe malihmolekula koji mogu nesmetano da prodju plazma membranu i da u unurašnjosti ciljne elijeaktiviraju intracelularne proteine, a u ovom slu aju to je receptor koji ima enzimsku aktivnost(tzv. receptor-enzim). NO funkcioniše kao signalni molekul i u biljnim i u životinjskim elijama.Zahvaljuju i svojoj lipofilnoj prirodi, NO može da difunduje kroz elijske membrane bezspecifi nih membranskih transportera, i funkcioniše kao intra- i inter-celularni glasnik. NO selako vezuje za enzime/proteine koji sadrže hem ili Fe-S aktivna mesta i izaziva stimulaciju iliinhibiciju njihove aktivnosti, a može da uti e i na transkripciju gena. Ovaj gas je i slobodanradikal, relativno nestabilan i potencijalno toksi an, a u estvuje u brojnim fiziološkim procesimau organizmu (neurotransmisija u centralnom i perifernom nervnom sistemu; relaksacija glatkihmiši a; sekreciji hormona; liza tumorskih i bakterijskih elija; erekcija penisa; agregacijatrombocita; modulacija imunih funkcija; itd).

NO nastaje deaminacijom prilikom transforamcije aminokiseline L-arginina u L-citrulin, a uzkataliti ko delovanje enzima azot oksid sintaza (engl. Nitric Oxide Synthase - NOS). S obzirom daveoma lako prolazi kroz memebranu, rastvoreni NO brzo difunduje iz signalne elije i brzodifuzijom ulazi u okolne-ciljne elije. Deluje samo kao lokalni medijator jer ima veoma kratakpoluživot (5-10 sekundi) i u kontaktu sa kiseonikom NO oksidiše u manje aktivne nitrate i nitrite,a formira i nitrosotiole (RSNO). U reakciji sa superoksidnim anjonom (SO2-) nastaje visokoreaktivan peroksinitrit (ONOO-), odnosno radikali ·OH i NO2·, koji mogu narušiti aktivnost velikogbroja elijskih konstituenata, pa i trajno inaktivisati mitohondrijalne enzime. Mehanizamdelovanja NO se ostvaruje vezivanjem za njegov receptor koji se zove solubilna guanil ciklaza(sGC), receptor sa enzimskom aktivnoš u koji katalizuje konverziju GTP u cGMP (Slika 1.20.).

24

Ovaj mali molekul ima funkciju sekundarnog glasnika i može da aktivira brojne efektorne proteine(bi e opisano u nekom od narednih odeljaka skripte). Efekat NO se ispoljava u roku od nekolikosekundi zbog toga što je normalna brzina „turnover”-a cGMP-a veoma velika i ona se veoma brzorazgradjuje fosfodiesterazama koje konstantno balansiraju produkciju cGMP-a. Farmaceutskipreparat Vijagra inhibiše aktivnost cGMP fosfodiesteraza u penisu, te time inhibiše i razgradnjucGMP, odnosno, doprinosi akumulaciji cGMP, što rezultira produženom vazodilatacijom krvnihsudova i kulminira produženom erekcijom penisa.

Slika 1.20. Uloga azot oksida (NO) u relaksaciji glatke muskulature zidova krvnih sudova.Acetil-holin oslobodjen iz terminalnih zaršetaka nerava vezuju i se za svoje receptore aktivira signalne puteve koji podsti u NO sintaze u endotelijalnim elijama (kojeoblažu zid krvnog suda) da produkuju NO. NO difunduje iz endotelijalnih elija u subendotelijalne miši ne elije glatke muskulature u kojima se vezuje za sGC iaktivira je da produkuje cGMP. Ovaj sekundarni glasnik aktivira druge proteine, što rezultira odgovorom koji omogu ava relaksaciju glatko-miši nih elija i na krajukulminira poja anim protokom krvi kroz dati krvni sud.

Ugljen monoksid (engl. Carbon Monoxide - CO) je drugi gas koji elije koriste kao medju elijskisignalni molekul. Može da deluje na isti ili sli an na in kao i NO, stimulacijom sGC. Ovi gasovinisu jedini signalni molekuli koji mogu da prodju direktno kroz plazma membranu ciljne elije.Grupa hidrofobnih signalnih molekula (derivati holesterola, derivati tirozina, derivati retinoi nekiseline i sl.) takodje može da prodje kroz memebranu ciljne elije, ali se umesto vezivanja zareceptore tj. aktiviranja receptora koji imaju funkciju enzima, vezuju za specifi ne receptorneproteine u citoplazmi i/ili jedru.

25

1.2.3. Nuklearni receptori su proteini koji aktivirani ligandom regulišu transkripciju gena

Veliki broj malih hidrofobnih molekula može neometeno da prodje plazmalemu ciljne elije i da seveže za intracelularne receptorne proteine. U ove signalne molekule spadaju steroidni hormoni,tiroidni hormoni, retinoidi i vitamin D. Iako se veoma razlikuju i po hemijskoj strukturi (Slika1.21.), kao i po funkciji, mehanizam kojim oni ispoljavaju svoj biološki efekat je veoma sli an.Kada se ovi signalni molekuli vežu za svoj intracelularni receptorni protein, receptor menjakonformaciju, aktivira se, a potom se kompleks hormon receptor veže za specifi na mesta na DNK(engl. Hormone Responsive Element - HRE) i tako reguliše transkripciju specifi nih gena. Ovagrupa receptora je veoma sli na po strukturi i pripada tzv. superfamiliji nuklearnih receptora.Ova superfamilija je veoma velika i uklju uje takodje i neke receptorne proteine koji se aktivirajuintracelularnim metabolitima pre nego sekretovanim signalnim molekulima. Mnogi lanovi familijesu identifikovani jedino preko sekvence DNK, dok su njihovi ligandi još uvek nepoznati, te sestoga receptorni proteini iz ove grupe zovu orfanski nuklearni receptori. Važnost ovakvihnuklearnih receptora kod nekih životinja ilustrovana je time da je ak 1-2% gena kod nematodeC.elegans za orfanske receptore, dok je kod oveka nešto manje od 50-tak gena za ove receptore.

Hidrofobne signalne molekule (steroidni hormoni kore nadbubrežne žlezde, seksualni steroidi,vitamin D, tiroidni hormoni, retinoidi, ekdison-hormon presvla enja kod insekata i sl.) se ucirkulaciji i drugim ekstracelularnim fluidima transportuju vezani za specifi ne proteinske nosa eod kojih se disociraju pre nego što udju u eliju (Slika 1.10.). Pored fundamentalne razlike usignalingu u ciljnoj eliji, hidroforbni signalni molekuli se razlikuju od hidrofilnih i po dužiniperzistentnosti u cirkulaciji i tkivnim fluidima. Veliki broj hidrofilnih signalnih molekula koji su

Slika 1.21. Neki signalni molekuli koji se vezuju za nuklearne receptore.Uo iti da su svi signalni molekuli koji se vezuju za nukelarne receptore mali i hidrofobni. Prikazana je aktivna, hidroksilna forma vitamina D3.

26

hormoni, ukloni se ili razgradi u roku od nekoliko minuta nakon ulaska u cirkulaciju, dok selokalni hidrofilni medijatori i neurotransmiteri uklanjaju iz ekstracelularnog prostora ak i mnogobrže, u roku od nekoliko sekundi ili ak i milisekundi. Na suprot tome, hidrofobni signalnimolekuli kakvi su steroidni hormoni opstaju u cirkulaciji satima, a tiroidni hormoni ak i danima.Uporedo sa poluživotom u ekstracelularnim te nostima i prostorima, hidrofilni signalni molekuliobi no posreduju efekte koji kratko traju, dok hidrofobni signalni molekuli posreduju efekte kojiduže traju. Mada ima i izuzetaka, pa tako npr. hidrofilni signalni molekuli koji se vežu zareceptorne proteine na membrani ciljne elije mogu da regulišu transkripciju gena tj. posredujuefekte koji duže traju, ili pak steroidni hormoni, kao hidrofobne signalne molekule mogu da sevežu za membranske receptore i prozrokuju tzv. brze efekte. Intracelularni receptori za steroidne itiroidne hormone, retinoide i vitamin D se vezuju za specifi nu HRE sekvencu DNK upromotornom regionu gena koji ligad reguliše. Neki od receptora (npr. za kortizol) su lokalizovani

primarno u citosolu i vezivanjemliganda menjaju konformaciju,pa se potom kompleks ligand-receptor translocira u jedro.Drugi recepori (npr. receptori zatiroidne hormone i retinoide) suvezani za specifi ne regione naDNK u nukleusu ak i uodsustvu liganda. U oba slu ajainaktivni receptor je vezan zaspecifi an inhibitorni kompleksproteina (tzv. kompleks proteinatoplotnog šoka; engl. Heat ShockProtein – HSP complex).Vezivanje liganda prouzrokujekonformacione promenereceptorne molekule što rezultiradisocijacijom/uklanjanjeminhibitornog proteinskogkompleksa. Vezivanje liganda

prozuzrokuje takodje da receptor veže koaktivatorne proteine koji indukuju transkripciju gena(Slika 1.22.).

Slika 1.22. Superfamilija nuklearnih receptora.A – Svi receptori imaju sli nu strukturu. Nazna ene je kratki DNK-vezuju i domen.B – receptorni protein je u inaktivnom stanju vezan za inhibitorni proteinski kompleks.C – vezivanje liganda za receptor prouzrokuje konformacione promene receptornemolekule, te se ligand-vezuju i domen receptora »nadvije/obavije« receptor,inhibitorni proteini disociraju, a koantivatorni proteini se vezuju za trans-aktivacionidomen receptora, zna ajno pove avaju i transkripciju gena. D – trodimenzionalnastruktura ligan-vezuju eg domena bez (levo) i sa (desno) vezanim ligandom.Uo iti da -helix (tamnije sivi, sa karboksi terminalnim krajem) ima ulogu poklopcakoji se nadvije/preklopi preko vezanog ligada i tako »zarobi« ligand naligan-vezuju em domenu receptorne molekule.

27

Transkripcioni odgovor ciljne elije je uglavnom vremenski graduisan i odvija se kroz nekolikouspešnih faza: po inje direktnom aktivacijom malog broja specifi nih gena koja se dešava za oko30 minuta i konstituiše se tzv. rani, primarni odgovor; proteinski produkti gena primarnogodgovora dalje aktiviraju druge gene i konstituiše se tzv. odgodjeni, sekundarni odgovor. Na ovajna in jednostavni »hormonski okida « prouzrokuje veoma kompleksne promene u obrazcu genskeekspresije (Slika 1.23.).

Slika 1.23. Odgovori indukovani aktivacijom nuklearnih receptora za hormone.A – Rani primarni odgovor (engl. early primary response) i B – Odgodjeni sekundarni odgovor (engl. delayed secondary response). Slike prikazuju odgovore ciljneelije na steroidne hormone, ali se isti pincipi mogu primeniti za sve ligande koji aktiviraju superfamiliju nuklearnih receptornih proteina. Neki od proteina primarnog

odgovora mogu aktivirati gene sekundarnog odgovora (engl. turn on secondary-response genes), dok drugi mogu inaktivirati gene primarnog odgovora (engl. turnoff primary-response genes). Stvaran broj gena primarnog i sekundarnog odgovora je mnogo ve i nego što je predstavljeno.

Odgovor na steroidne i tiroidne hormone, vitamin D i retinoide, kao i odgovor na sveekstracelularne signale generalno je prili no determinisan prirodom ciljne elije kao i prirodomsignalnog molekula. Mnogi tipovi elija imaju identi ne intracelularne receptore, ali je set genaregulisan aktivacijom receptora razli it kod razli itih tipova elija. Ovo se dešava zbog toga što jegeneralno za regulaciju transkripcije gena u eukariotskoj eliji potrebno više od jednogregulatornog proteina, a mnogi od ovih regulatornih proteina su specifi ni za tip elije. Prematome, svaki od hormona koji se vezuje za superfamiliju nuklearnih receptora indukujekarakteristi an set odgovora iz dva razloga: (1) jedino ta no odredjeni tip elija ima receptor

28

specifi an za odredjeni hormon; (2) svaki od ovih tipova elija sadrži razli ite kombinacije drugihspecifi nih regulatornih proteina specifi nih za ta no odredjeni tip elije i oni kolaboriraju saaktiviranim receptorom u smislu uticaja na regulaciju transkripcije specifi nog seta gena.

1.2.4. Neki intracelularni signalni proteini imaju ulogu molekularnih prekida a

Mnogi intracelularni signalni proteini se ponašaju kao molekularni prekida i/izmenjiva i: poprimanju signala oni prelaze iz inaktivnog u aktivno stanje (engl. switch on) i u njemu ostajusve dok ih neki drugi proces opet ne »prebaci« u inaktivno stanje tj. »ne ugasi« u smislu aktivnosti(engl. switch off). Inaktivacija (engl. switch off) intracelularnihg signalnih proteina je jednakovažan proces kao i aktivacija (engl. switch on). Kako bi se signalni put »oporavio i povratio« odtransmisije signala, i bio spreman da izvrši transmisiju drugog signala, neophodno je da se sveaktivirane molekule signalnog puta »vrate« u prvobitno/originalno inaktivisano stanje.

Postoje dve glavne klase molekularnih prekida a koje koriste razli ite mehanizme da bi prešli izjednog u drugo stanje, iako i kod jedne i kod druge grupe dobijanje ili gubitak fosfatne grupedeterminiše da li je protein aktivan ili inaktivan. Najve a klasa se sastoji od proteina koji seaktiviraju ili inhibišu fosforilacijom. Ovi proteini se »uklju uju« (engl. switch on) u jednom smerufosforilacijom katalisanom protein kinazama koje dodaju jednu ili više fosfatnih grupa u signalniput u jednom smeru, a u drugom smeru se inaktivišu (engl. switch on) defosforilacijom uzkataliti ko delovanje protein fosfataza koje uklanjaju fosfatne grupe sa proteina (Slika 1.24.).

Procenjeno je da je jedna tre inaproteina u eukariotskoj elijifosforilisana u odredjeno vreme.

Slika 1.24. Dva tipa intracelularnih signalnih proteinakoji deluju kao molekularni prekida i/izmenjiva i.U oba slu aja, signalni protein se aktivira dodavanjem fosfatnegrupe, a inhibiše ukanjanjem fosfata.A – Fosfatna grupa se »dodaje« kovalentno signalnom proteinukataliti kim delovanjem protein kinaza.B – Signalni protein je indukovan/nateran da promeni vezaniGDP za GTP.Da bi se naglasila sli nost ova dva mehanizma, ATP je prikazankao APPP, ADP kao APP, GTP kao GPPP i GDP kao GPP

29

Mnogi od ovih signalnih proteina koji su kontrolisani fosforilacijom su i sami protein kinaze tj.sposobni da kontrolišu fosforilacije, te su oni veoma esto organizovani u tzv. kaskadefosforilacija (kaskadne fosforilacije). Jednom aktivirana protein kinaza, fosforiliše narednuprotein kinazu u nizu kaskade, a ova narednu, te se tako prenosi signal, a ujedno se i amplifikuje,a ponekada se širi i na druge signalne puteve. Dva glavna tipa protein kinaza su operativna kaointracelularni signalni proteini: serin/treonin kinaze (najbrojnije; fosforilišu proteine naj eš e namestu gde se u sekvenci nalazi aminokiselina serin, ali i gde se nalazi treonin, samo redje) itirozin kinaze (manje brojne; fosforilišu proteine na mestu gde se u sekvenci nalaziaminokiselina tirozin). Sekvenciranjem humanog genoma utvrdjeno je da oko 2 % naših genakodira protein kinaze, a smatra se da je stotine, pa i više, razli itih protein kinaza prisutno utipi noj sisarskoj eliji.

Druga veoma velika klasa molekularnih izmenjiva a/prekida a uklju enih u intracelularnisignaling su GTP-vezuju i proteini. Oni prelaze iz aktivnog stanja u kome vezuju GTP uinaktivno stanje u kome je vezan GDP. Kada se jednom aktiviraju, imaju unutrašnju GTPaznuaktivnost i sami sebe »isklju uju«/inaktivišu tako što hidrolizuju molekule GTP koje su vezale uGDP (Slika 1.24B.). Razlikuju se dva osnovna tipa GTP-vezuju ih proteina: (1) veliki trimerniGTP-vezuju i proteini (G-proteini) koji su funkcionalno vezani tj. prenose signale od receptorakoji su vezani za njih (Slika 1.18B.); (2) male monomerne GTPaze (monomerni GTP-vezuju iproteini) koje provode intracelularne signale, ali su pored toga uklju ene i u kretanje vezikula tj.vezikularni saobra aj (engl. vesicular traffic), kao i mnoge druge procese u eukariotskoj eliji.

Slika 1.25. Integracija signala.A – Ekstracelularni signali A i B i jedan i drugi aktiviraju razli iteserije proteinske fosforilacije, a svaka vodi fosforilaciji proteina Y,ali na razli itim mestima na proteinu. Protein Y je aktiviranisklju ivo ako su oba mesta fosforilisana, te prema tome postajeaktivan jedino kada su signali A i B simultano prisutni. Zbog ovograzloga integratorni proteini se nekada nazivaju detektorikoincidence.B – Ekstracelularni signali A i B vode ka fosforilaciji dva proteinaa i b koji se tek tako fosforilisani medjusobno vezuju grade iaktivni proteinski kompleks.U oba prikazana primera proteini se autofosforilišu tj. sami sebefosforilišu. Takodje, ekvivalentna forma intracelularne kontrolemože se odvijati ukoliko se menja GTP za GDP na GTP-vezuju im proteinima (Slika 1.24.).

30

Kako je ranije napomenuto, kompleksni elijski odgovori i ponašanje ciljne elije, kao što jepreživljvanje, ili elijska proliferacija, generalno su stimulisani kompleksnom i specifi nomkombinacijom ekstracelularnih signala pre nego delovanjem jednog jedinog signala samostalno(videti sliku 1.16.). Zbog svega toga elija mora da integriše informacije koje dolaze od razli itihsignala, kao i da napravi/pripremi odgovaraju i odgovor – da živi ili da umre, da se deli ili ne itd.Ove integracije su obi no zavisne od integratornih proteina (videti sliku 1.19.) koji su ekvivalentnimikroprocesorima u kompjuteru: oni zahtevaju veliki broj signalnih ulaza/inputa da biprodukovali izlaz/output koji prouzrokuje potreban biološki efekat. Dva kompleksa koja pokazujukako ovakvi integratorni proteini operišu ilustrovana su na slici 1. 25.

1.2.5. Intracelularni signalni kompleksi poja avaju brzinu, efikasnost i specifi nostodgovora

ak i jedan tip ekstracelulrnog signala koji deluje preko jednog tipa GPCR receptora ili receptoravezanih za enzime obi no paralelno aktivira mulitiple signalne puteve i može zna ajno da uti e navišestruke aspekte ponašanja ciljne elije (oblik, pokretljivost, metabolizam, ekspresiju gena itd). Ine samo to, ove dve glavne klase receptora na površini ciljne elije veoma esto aktiviraju neke odistih signalnih puteva i obi no ne postoji objektivan razlog zbog kojeg odredjeni signal koristijednu klasu receptora radije nego neku drugu.

Kompleksnost ovih sistema koji odgovaraju na signal, zajedno sa svim multiplim relejnim lancimasignalnih proteina, zastrašuje. Nije jasno kako jedna jedina elija uspeva da razvije specifi neodgovore na toliko veliki broj razli itih ekstracelularnih signala, od kojih se veliki broj njih veže zaistu klasu receptora i aktivira brojne signalne puteve. Jedna od strategija koju elija koristi da bipostigla specifi nost uklju uje tzv. scaffold proteine tj. proteine koji imaju funkcijupostolja/skela (videti sliku 1.19.) i koji organizuju grupu signalnih proteina u signalnekomplekse (Slika 1.26A.). Zbog toga što »scaffold« navodi na interakcije izmedju uspešnihkomponenti signaling kompleksa, signal može biti sproveden sa preciznoš u, brzinom iefikasnoš u, a istovremeno je izbegnuta i neželjena medjusobna komunikacija (engl. cross-talk)izmedju pojedinih signalnih puteva. Pored toga, da bi se obezbedila amplifikacija signala i njegovoširenje u druge delove ciljne elije, bar neke komponenete u ve ini signalnih puteva imajusposobnost slobodne difuzije.

31

U drugim slu ajevima signalingkompleksi se formirajutranzijentno (prolazno), kada seokupe kao ansambl signalnihproteina oko receptora nakonšto je on aktiviranekstracelularnim signalnimmolekulom. U nekim odovakvih slu ajeva citoplazma-tski kraj aktiviranog receptorase fosforiliše tokom procesaaktivacije i fosforilisana amino-kiselina ima ulogu mesta zavezivanje/pristajanje (engl. do-cking site) i okupljanjeansambla drugih signalnihproteina u tranzijentni ko-mpleks (Slika 1.26B.).

Slika 1.26. Dva tipa intracelularnih signalnihkompleksa.A – Receptor i neki od intracelularnih signalnihproteina koje aktivacija receptora sekvencionalnoaktivira su okupljeni u signalni kompleks velikim»scaffold« proteinom (protein koji služi kao postolje).B – Veliki signalni kompleks je sklopljen nakon što jereceptor aktiviran ekstracelularnim signalnimmolekulom. U ovom slu aju aktivirani receptorautofosforilacijom fosforiliše samog sebe na nekolikomesta koja potom imaju ulogu »docking« mesta zaintracelularne signalne proteine.

Takodje, u nekim drugim slu ajevima aktivacija receptora vodi ka produkciji modifikovanihfosfolipidnih molekula koji su vezani za plazma membranu i ovi lipidi potom regrutuju specifi neintracelularne signalne proteine u ovaj region membrane. Svi ovi signalni kompleksi se formirajusamo tranzijentno i rasformiraju se veoma brzo nakon disocijacije ekstracelularnog liganda sareceptora.

32

1.2.6. Interakcija izmedju intracelularnih signalnih proteina je posredovana modularnimvezuju im domenima

Sklapanje i stabilnih i tranzijentnih signalnih kompleksa zavisi od razli itih, visokokonzervisanih,malih vezuju ih domena koji su pronadjeni na intracelularnim signalnim proteinima. Svaki odovih kompaktnih proteinskih modula se vezuje za odredjeni strukturalni motiv na molekuliproteina (ili lipida) sa kojom signalni protein interaguje. Zbog ovih modularnih domena signalniproteini se vezuju medjusobno u multiplim kombinacijama, kao Lego kocke, sa proteinima kojiesto formiraju trodimenzionalne mreže interakcija koje determinišu rutu koju prati signalni put.

Pridruživanje postoje ih domena zajedno u nove kombinacije koriš enjem ovih modularnihvezuju ih domena facilitira evoluciju novih signalnih puteva.

Na primer, Src homologi 2 (engl. Src Homology 2 – SH2) domeni i fosfotirozin-vezuju i (engl.Phospho Thyrosine Binding -PTB) domeni se vezuju za fosforilisani tirozin na odredjenoj sekvencipeptida aktiviranog receptora ili intracelularnog signalnog peptida. Adapterni protein sa SH2-domenom je GRB7 (engl. Growth factor Receptor-Bound protein 7 – GRB7) koji se vezuje zareceptore-tirozin kinazne aktivnosti i omogu ava direktnu intracelularnu vezu za Ras proto-onkogen. Src homologi 3 (SH3) domeni se vezuju za prolinima bogate aminokiselinske sekvence.Plekstrin homologi (engl. Pleckstrin homology - PH) domeni (prvi put su opisani kod proteinaPlekstrina u krvnim plo icama/trombocitima) se vezuju za naelektrisanu vode u grupuspecifi nih fosforilisanih inozitol fosfolipida koji se produkuju u plazma membrani kao odgovor naekstracelularni signal, te oni omogu avaju proteinu iji su deo da se približi/pristane namembranu i da intereaguje sa drugim regrutovanim signalnim proteinima. Neki signalni proteinifunkcionišu jedino kao adapteri i vezuju dva druga proteina zajedno u signalnom putu, te stogaimaju dva ili više vezuju ih domena (Slika 1.27.).

Još jedna vrsta domena koji su veoma zastupljeni kod „scaffold“ proteina je tzv. multipli PDZdomeni (PDZ je skra enica koja je nastala kombinovanjem prvih slova tri proteina za koje je prvootkriveno da imaju isti domen: PSD-95 (engl. Post Synaptic Density protein 95), DlgA (engl.Drosophila disc large tumor suppressor A ) i Zo-1 protein. Svaki od ovih domena se vezuje zaspecifi an motiv na receptoru ili signalnom proteinu. Veoma dobar primer za ovo je InaD„scaffold“ protein na fotoreceptornim elijama Drosophile. Ovaj protein sadrži pet PDZ domena, priemu jedan od njih vezuje jonski kanal koji se aktiviše svetlom, dok se svaki od ostalih vezuje za

razli iti signalni protein uklju en u odgovor elije na svetlo. Ukoliko bilo koji od ovih pet PDZ

33

domena nedostaje, singalni protein koji mu korespondira ne e biti sklopljen u kompleks, što eporemetiti transdukciju signala i rezultirati defektima u procesu vidjenja.

Slika 1.27. Hipoteti ki signa-lni put koji koristi modularnevezuju e domene.Signalni protein 1 ima tri razli itavezuju a domena, a i kataliti kidomen sa aktivnoš u proteinkinaze. Ovaj signalni protein setranslocira na plazma membranuonda kada ekstracelularni signaldovede do formiranja /kreiranjarazli itih mesta pogodnih za»pristajanje« (engl. docking sites)na citosolnoj strani membrane.Njegov SH2 domen se vezuje zafosforilisane tirozine nareceptornom proteinu, a njegov PHdomen se vezuje za fosforilisaneinozitol fosfolipide unutrašnjegsloja fosfo-lipidne dvoslojnemembrane. Nakon toga, signalniprotein 1 fosforiliše signalni protein2 na mestima gde se nalazi tirozin,a na taj na in se dozvoljavavezivanje proteina 2 za PTBdomen na proteinu 1 i za SH2domen adapternog proteina.Nakon toga, adapterni proteinpovezuje signalni protein 2 sasignalnim proteinom 3. Adapterniprotein se sastovoji od dvamodularna vezuju a domena SH2 iSH3, te ima sposobnost da sepreko SH2 domena vezuje zafosfotirozin na signalnom proteinu2, a preko SH3 se vezuje zaprolinima-bogat motiv nasignalnom proteinu 3.

Neki receptori na površini ciljne elije i neki intracelularni signalni proteini mogu da budutranzijentno »sakupljeni« zajedno fromiraju i skupinu u obliku grozda (engl. cluster) koja jemikrodomenima vezana u lipidni dvosloj plazma membrane koji je oboga en holesterolom iglikolipidima. Neki od proteina se usmeravaju u ovakve tzv. »lipidne krševe« (engl. lipid rafts)preko kovalentno vezanih lipidnih molekula. Kao i »scaffold« proteini, ovi »scaffold« lipidipromovišu brzinu i efikasnost signalnog procesa tako što preuzimaju ulogu mesta ili postolja nakojima signalni molekuli mogu da se sklope, uklope i interaguju.

34

1.2.7. elija može da odgovori naglo na graduisano pove anje koncentracijeekstracelularnog signala

Neki elijski odgovori na ekstracelularne signalne molekule su ravnomerno i polako graduisani ujednostavnoj proporciji u odnosu na koncentraciju signalne ekstracelularne molekule. Primarniodgovor na steroidne hormone (videti sliku 1.23.) veoma esto prati ovakav obrazac, prvenstvenozbog toga što nuklearni hormonski receptor vezuje jednu molekulu hormona, a svaki specifi nideo DNK sekvence (HRE region; odgovoran za vezivanje kompleksa hormon-receptor u promotorugena koji odgovaraju na steroidne hormone), deluje nezavisno. Sa pove avanjem koncentracijehormona, proporcionalno se pove ava i koli ina hormon-receptor kompleksa, a time i koli inakompleksa vezanog za HRE u promotoru gena koji odgovara na dati ligand, te je i odgovor elijegraduisan i linearno proporcionalan.

Mnogi odgovori na ekstracelularne signalne molekule po inju naglo i neo ekivano sapove avanjem koncentracije ekstracelularne molekule. Neki odgovori mogu da se odvijaju umaniru sve-ili-ništa, odnosno, nemogu e ih je detektovati ukoliko je koncentracija ekstracelularnesignalne molekule ispod pragovnog nivoa, a dostizanjem pragovnog nivoa koncentracije detektujese maksimalni odgovor ciljne elije. Šta je molekularna osnova ovakvog »strmog« odgovora (kojinekada ak li i i na odgovor tipa uklju ivanje/isklju ivanje) na graduisani ekstracelularni signal?Jedan od mehanizama »zaoštravanja« odgovora je zahtev da se više od jedne intracelularneefektorne molekule ili više od jednog signalnog kompleksa vezuju za neke ciljne makromolekule ucilju indukovanja odgovora. Na primer, u nekim steroidima-indukovanim-odgovorima izgleda dase više od jednog kompleksa hormon-aktivirani receptor vezuje simultano za HRE i aktiviraodredjeni gen. Kao rezultat, kako raste koncentracija hormona, aktivacija gena postaje sve više

nagla i neo ekivana nego kada bi jedan vezani kompleks biodovoljan za aktivaciju (Slika 1.28.).

Slika 1.28. Primarni odgovor elija ovidukta (jajovoda) pileta na steroidni seksualnihormon estradiol.Kada su aktivirani, receptori za estradiol ulju uju/aktiviraju transkripciju nekoliko gena. Prikazana je dozno-zavisna kriva dva ovakva gena, pri emu jedan od ovih gena kodira protein jajeta koji se naziva konalbumin(engl. conalbumin), a drugi kodira protein jajeta koji se naziva ovalbumin (engl. ovalbumin). Linearna krivaodgovora za konalbumin ukazuje da svaki aktivirani receptorni molekul koji se vezuje za conalbumin-genpove ava aktivnost gena u istoj koli ini tj. postoji linearna zavisnost. Na suprot tome, kriva odgovora zaovalbumin je na po etku spora, a potom strma, sugerišu i da mora biti više od jednog aktiviranog receptora(u ovom slu aju su dva) koji su se simultano vezali za ovalbumin-gen da bi inicirali njegovu transkripciju.

35

Sli an kooperativni mehanizam je veoma esto operativan i u signalnoj kaskadi koja ide odreceptornih proteina na površini plazma membrane ciljne elije. Na primer, etiri molekula malog

intracelularnog medijatora (sekundarnog glasnika) cAMPmora da se veže za svaki molekul cAMP zavisne proteinkinaze (PKA) da bi se ona aktivirala. Ovakav odgovor postajeoštriji/strmiji kako se broj kooperativnih molekulapove ava, a kada je broj dovoljno veliki, može se dosti iodgovor koji li i na sve-ili-ništa tip odgovora (Slike 1.29. i1.30.).

Slika 1.29. Aktivacione krive kao funkcije koncentracije signalne molekule.Krive pokazuju kako se oštrina/strmina odgovora pove ava sa pove anjem broja efektornih molekulakoje se moraju vezivati simultano da bi aktivirale targetne makromolekule. Prikazane krive suo ekivane ukoliko aktivacija zahteva 1, 2, 8 ili 16 efektornih molekula.

Takodje, odgovori se zaoštravaju ukoliko intracelularna signalna molekula aktivira jedan enzim iistovremeno inhibiše drugi enzim koji katališe suprotnu reakciju. Dobroprou en primer ovakvog tipa regulacije je adrenalinom (epinefrinom)indukovana stimulacija razgradnje glikogena u elijama skeletnih miši a.Vezivanje adrenalina za GPCR receptore na površini elija skeletnogmiši a vodi ka pove anju koncentracije intracelularnog cAMP, a rezultatoba procesa je stimulacija enzima koji favorizuje razgradnju glikogena iinhibicija enzima koji favorizuje singezu glikogena.

Slika 1.30. Jedan tip signalnog mehanizma za koji se o ekuje da pokaže strm-pragovni tip odgovora.Simultano vezivanje osam molekula signalnog liganda za set od osam proteinskih subjedinica je neophodno da bi se formiraoaktivni proteinski kompleks. Sposobnost subjedinica da se sklope u aktivni kompleks zavisi od alsoternih konformacionihpromena kroz koje subjedinice prolaze tokom vezivanja svojih liganda. Vezivanje liganda u formi ovakvog kompleksa jegeneralno kooperativan proces. Pri niskoj koncentraciji liganda broj aktivnih kompleksa se pove ava, grubo procenjeno, uproporciji otprilike osam puta snažnijoj nego što je koncentracija liganda.

36

Svi pomenuti primeri mogu produkovati odgovore koji su veoma strmi, ali koji su graduisani uodnosu na koncentraciju ekstracelularnog signalnog molekula. Drugi mehanizmi mogu daprodukuju tipi an sve-ili-ništa odgovor, kada se ekstracelularni signal pove a iznad kriti nognivoa praga, pa se aktivira nagli odgovor ciljne elije. Sve-ili-ništa pragovni odgovori ovog tipa sugeneralno zavisni od pozitivne povratne sprege. Ovim mehanizmom nervne i miši ne elijegenerišu akcione potencijale kao odgovore tipa sve-ili-ništa na neurotransmitere. Aktivacija acetil-holinskih receptora koji su vezani za jonske kanale u neuromuskularnoj vezi rezultira u netoinfluksu Na+ koji lokalno depolariše membranu motorne plo e miši ne elije. Ova depolarizacijaprouzrokuje otvaranje voltažno-zavisnih Na+ kanala u istom regionu membrane, pa se opet daljeinicira influks Na+, što opet dodatno depolariše membranu motorne plo e i otvara još više Na+

kanala. Ukoliko inicijalna depolarizacija premaši odredjeni pragovni nivo, ova pozitivna povratnasprega ima »eksplozivni« efekat i neumitno produkuje prostiru u depolarizaciju u formi akcionog

potencijala koji se propagira duž membrane miši ne elije.Mehanizam akcelerativne (ubrzavaju e) pozitivne povratne spregemože takodje da bude operativan i kod signalnih proteina koji suenzimi. Na primer, ukoliko odredjeni intracelularni signalni ligandaktivira enzim koji je lociran u donjem delu/toku (engl. down-stream) signalnog puta i dva ili više molekula koji su produktiaktivnosti tog enzima mogu da se vežu za enzim koji ih jeprodukovao i da ga povratnom spregom aktiviraju (Slika 1.31.).Posledica je veoma nizak nivo sinteze produkta u odsustvu liganda.Brzina sinteze se pove ava sporo sa pove anjem koncentracijelignada sve dok, pri nekoj pragovnoj vrednosti koncentracijeliganda, dovoljno produkta bude sintetisano da sam produktaktivira enzim u samo-akcelerativnom, ubrzanom maniru.Koncentracija produkta se zbog toga odjednom naglo pove a

Slika 1.31. Mehanizam akcelerativne (ubrzavaju e) pozitivne povratne sprege.U ovom primeru inicijalno vezivanje signalnog liganda aktivira enzim da generiše produkt koji se vezuje za isti tajenzim koji ga je produkovao/stvorio i time pove ava aktivnost enzima tj. sopstvenu produkciju.

37

1.2.8. elija može da zapamti/memoriše efekat nekih signala

Efekat nekog ekstracelularnog signalnog molekula na ciljnu eliju, u nekim slu ajevima, može sezadržati dosta dugo, iako je ekstracelularni signal disocirao i nestao. Jedan od mehanizama kojiomogu ava ovakav vid perzistentnosti signala je sistem enzimatske akcelerativne pozitivnepovratne sprege. Ukoliko se ovakav sistem »uklju i« (pove avanjem koncentracije intracelularnogliganda iznad pragovnog nivoa) on e ostati »uklju en« iako je ekstracelularni signal nestao, teumesto da odano reflektuje postoje i nivo signala, sistem koji odgovara ispoljava svojsvopam enja/memorisanja. Primer koji e i kasnije biti diskutovan je protein kinaza koja se aktiviraCa2+ jonima da fosforiliše samu-sebe (autofosforilacija), kao i druge proteine, pri emuautofosforilacija održava kinazu aktivnom dosta dugo i nakon što se nivo Ca2+ vrati na normalu.Time se omogu avaju memorijski tragovi/zapisi inicijalnog signala. Tranzijentni ekstracelularnisignali veoma esto indukuju mnogo duže promene u eliji tokom razvoja više elijskog organizma.Neke od ovih promena mogu biti perzistentne tokom celog života organizma. One su obi nozavisne od samo-aktiviraju ih memorijskih mehanizama koji su operativni u donjim tokovimasignalnih puteva, na nivou transkripcije gena. Na primer, signal može da inicira determinacijuelija miši a tako što e »uklju iti« miši nih-gena-specifi ne regulatorne proteine tj. aktivirati ih

da stimulišu transkripciju svojih sopstvenih gena, kao i gena koji produkuju druge proteinemiši ne elije. Na ovaj na in »odluka« o opstanku miši ne elije postaje stalna.

1.2.9. elija može da podesi svoju senzitivnost na neki signal

U odgovoru na mnoge tipove stimulusa, elije i organizmi su sposobni da detektuju isti procenatpromene signala u okviru veoma velikog raspona intenziteta stimulusa. Ovo zahteva da ciljnaelija prolazi kroz reverzibilni proces adaptacije ili desenzitizacije zk. neosetljivosti, u kome

produženo izlaganje stimulusu smanjuje elijski odgovor karakteristi an za taj nivo izlaganja unormalnim uslovima. U hemijskom signalingu adaptacija omogu ava eliji da odgovara napromene u koncentraciji signalnog liganda (pre nego na apsolutnu koncentraciju liganda) u okviruvrlo širokog ranga koncentracije liganda. Osnovni princip je jedna od negativnih povratnih spregakoja je operativna sa zadrškom/zakašnjenjem. Snažan odgovor modifikuje mašineriju zapravljenje tog odgovora, tako da mašinerija resetuje sebe u »off« poziciju, tj. isklju uje sama sebe.

38

Desenzitivizacija ili neosetljivost prema signalnom molekulu može se desiti na nekoliko na ina. Naprimer, vezivanje ekstracelularnih signalnih liganda za receptorne molekule na površini plazmamembrane ciljne elije može indukovati njihovu endocitozu i prolaznu zarobljenost u endozomu.Ovakva ligandom-indukovana endocitoza receptora može dovesti do destrukcije receptorasadržajem lizozoma, a ovaj proces se naziva tzv. »regulacija receptora na dole« ili down-regulacijareceptora (engl. receptors down-regulation). U drugim slu ajevima, desenzitivizacija može bitirezultat rapidne inaktivacije receptora kao rezultat fosforilacije koja prati aktivaciju, ali sazadrškom/kašnjenjem i to je tzv. odgodjena desenzitivizacija fosforilacijom. Takodje,neosetljivost može biti rezultat promene u proteinu uklju enom u transdukciju signala iliprodukcije inhibitora koji blokiraju proces transdukcije signala (Slika 1.32.).

Slika 1.32. Pet na ina na koje ciljna elija može postati neosetljiva na signalnu molekulu.Inaktivacioni mehanizmi koji su prikazani i za receptor i za intracelularni signalni protein veoma esto uklju uju fosforilaciju proteina koji se inaktiviše, iako se zna dase i ostali tipovi modifikacije mogu odvijati. Kod bakterijske hemotaksije desenzitivizacija zavisi od metilacije receptornog proteina.

39

1.3. MEHANIZMI ELIJSKE KOMUNIKACIJE I SIGNALNI PUTEVI KOD BILJAKA

I kod biljaka, kao i kod životinja elije su u stalnoj medjusobnoj komunikaciji. elije biljakakomuniciraju kako bi koordinisale svoju aktivnost u zajedni kom odgovoru na konstante promeneuslova svetla/tame, vlažnosti i temperature koji vode biljni ciklus rasta, cvetanja i plodonošenja.Takodje, elija biljaka medjusobno komuniciraju da bi koordinisale dešavanja u njihovom korenu,stablu, listovima, cvetovima, plodovima i semenu. U ovom delu e biti ukratko dat pregled i opismedjusobne komunikacije i signalinga biljnih elija, kao i signalinga koji se aktivira u odgovoruna svetlosni režim kojem su biljke izložene. injenica je da se mnogo manje zna o receptorima imehanizmima elijskog signalinga i komunikacije koji se odvijaju u svetu biljnih elija, nego što sezna o istim ovim pojmovima i fenomenima u svetu životinjskih elija. Ima i nekih sli nosti, a ovdee opis biti fokusiran na ono što je razli ito u mehanizmima elijske komunikacije i signalinga

biljnih elija.

1.3.1. Više elijska organizacija i elijska komunikacija su evoluirali nezavisno kod biljakai životinja

Iako su i biljke i životinje eukarioti, oni imaju na neki na in odvojenu evolutivnu istoriju više odbilion godina. Njihov zadnji zajedni ki predak je bio jedno elijski eukaritski organizam koji je imaomitohondrije ali nije imao hloroplast. Biljkama su neophodni holoroplasti, te se izdvojila tokomevolucije linija eukariotskih elija sa hloroplastima kao prete a više elijskih biljnih organizama.Najraniji fosili više elijskih organizama datiraju pre oko 600 miliona godina i smatra se da subiljke i životinje evoluirale u više elijske organizme nezavisno, svaki po evši od jedno elijskog

eukariota negdeizmedju 1.6 i0.6 bilionagodina ranije(Slika 1.33.).

Slika 1.33. Predposta-vljena divergencija bi-ljnog i životinjskogstabla od zajedni kogjedn elijskog eukario-tskog pretka.

40

Ukoliko se evolucija više elijskih biljaka i životinja odvijala nezavisno, molekuli i mehanizmi kojise koriste u elijskoj komunikaciji su takodje evoluirali odvojeno i za o ekivati je da su razli iti, aliima i nekih koji su isti. Gasovi NO i CO, kao i joni Ca2+, su veoma rasprostranjeni signalnimolekuli i u biljnim i u životinjskim elijama. S'obzirom da je genom biljke Arabidopsis thalianakomplentno sekvencioniran, danas se zna da kod ovog organizma nema homologa receptornimklasama Wnt, Hedgehog, Notch, JAK/STAT, TGF- , Ras ili nukelarnoj familiji receptora. Takodje,nije jasno pokazano da cAMP uzima u eš a u intracelularnoj transdukciji signala u biljnoj eliji,dok za cGMP ima mnogo više podataka koji ukazuju na to da je cGMP mogu i sekundarni glasniki/ili signalni molekul u medju elijskoj komunikaciji biljaka. Najve i broj informacija omolekularnim mehanizmima uklju enim u signaling biljne elije dolazi iz molekularnihistraživanja na Arabidopsisu.

1.3.2. Receptor serin/treonin kinaze funkcionišu kao receptori na površini biljne elije

Kao i životinje, i biljke u veoma velikom stepenu koriste receptore na površini elije. Dok je kodživotinjske elije ve ina receptora na površini elije vezana za G-proteina, ve ina do sadadetektovanih i definisanih receptora na površini biljne elije su receptori vezani sa enzimom.Pored toga, dok su kod životinjskih elije ve ina receptora vezanih za enzime zapravo receptori saaktivnosti tirozin kinaze, ovaj tip receptora je ekstremno redak kod biljnih elija iako one imajuveliki broj citplazmati nih tirozin kinaza. Tirozin kinaze, kao i fosforilacija i defosforilacija tirozinaimaju veoma važnu ulogu u signalingu biljne elije. Umesto tirozin kinaze izgleda da se biljnaelija »oslanja« na ogroman diverzitet transmembranskih receptora serin/treonin kinazne

aktivnosti, a koje su razli ite od ovakovg tipa kinaza u animalnoj eliji. Medjutim, kao i receptoriu animalnoj eliji, serin/treonin kinaze u biljnoj eliji imaju tipi ni citoplazmati ni domen saserin/treonin kinaznom aktivnosti, kao i ekstracelularni ligand-vezuju i domen. Najprominentnijitip identifikovan do danas ima tandem ekstracelularnih zona gradjen od ponovljenih regiona koji

su bogati leucinima (Slika 1.34.) te se ovaj tip serin/treoninkinaza još zove proteini sa ponovljenim motivima koji subogati leucinima (engl. Leucine-Rich Repeat – LRR proteins).

Slika 1.34. Trodimenzionalna struktura leucinima-bogatih ponovljenih motiva koji su sli nimotivima nadjenim na LRR serin/treonin receptor kinazama.

41

Postoji oko 80 razli itih LRR-receptor kinaza kodiranih u genomu Arabidopsisa. Jedan odnajbolje prou enih primera je CLAVATA 1 –CLV1. Mutacije koje inaktivišu protein prouzrokujuprodukciju cvetova sa ekstra floralnim organima, kao i progresivno uve avanje floralnihmeristemskih tkiva, koja su grupe tzv. samoobnavljaju ih stem elija koje produkuju elije naosnovu kojih raste stablo, listovi i cvetovi. Ekstracelulani signalni molekul za CLV1 receptor jemali protein koji se zove CLV3 protein, a koga sekretuju susedne elije. Vezivanje CLV3 proteinaza njegov CLV1 receptor supresuje rast meristema, ili inhibicijom deobe elija koje su tu prisutne,ili, što je verovatnije, stimulacijom elijske diferencijacije (Slika 1.35A.). Najve i deointracelularnog signalnog puta od CLV1 receptora do elijskog odgovora je uglavnom nepoznat, alise zna da uklju uje serin/treonin protein fosfataze koje inhibišu CLV1 signaling. Pored toga,smatra se da GTP-vezuju i preoteini Rho klase imaju ulogu u signalingu, kao i nuklearni genskiregulatorni proteini koji su razli ito povezani sa homeodomanskim proteinima. Mutacije kojeinaktivišu ove genske regulatorne proteine imaju suprotne efekte od mutacija koje inaktivišuCLV1 receptor, odnosno, deoba elija meristema je jako smanjena, a biljka produkuje cvetove satek nekoliko organa. Prema tome, smatra se da intracelularni signalni put aktiviran preko CLV1receptora normalno stimuliše diferencijaciju elija inhbicijom genskih regulatornih proteina kojinormalno inhibišu elijsku diferencijaciju (Slika 1.35B.).

Slika 1.35. Hipoteti ki model za CLV1receptor-serin/treonin kinaznuregulaciju elijske proliferacije i/ilidiferencijacije u meristemu.A – elije u spoljašnjem sloju meristemasekretuju CLV3 protein koji se vezuje zaCLV1 receptorne proteine targetne elije udodatom, više centralnom regionu meristema,uglavnom stimuliraju i diferencijaciju ciljnihelija. B – Neki delovi intracelularnog

signalnog puta aktiviranog vezivanjem CLV3.Smatra se da je CLV receptorni proteinhomodimer ili heterodimer koji imasposobnost autofosforilacije (fosforiliše samogsebe) na serinima i treoninima, te na taj na inaktivira receptor i vodi ka aktivaciji Rho-sli nihGTPaza. Precizni dalji tok signalnog putanakon ove ta ke je nepoznat, ali je pokazanoda vodi inhibiciji proteina koji regulišu gene unukleusu, što dalje blokira transkripciju genakoji bi ina e mogli da inhibišu diferencijaciju.Fosfataze defosforilišu receptor, te stoganegativno regulišu signalni put.

Jedan tip LRR-receptor kinaza koji je nazvan BRI1 ima funkciju elijskog-površinskog receptoraza steroide kod Arabidopsisa. Biljke sintetišu klasu steroida koja je nazvana brasinosteroidi

42

(engl. brassinosteroids) zbog toga što je originalno identifikovana u familiji Brassicaceae kojauklju uje i Arabidopsis. Tokom razvoja biljke, faktori rasta stimulišu elijsku ekspanziju i pomažuposredovanje odgovora na tmu. Mutantne biljke kojima nedostaje BRI1 receptor kinaza suinsenzitivne na brasinosteroide. Uobi ajeno je da su Arabidopsis biljke koje su uzgajane u mrakubele i da imaju izražene ganglije kao rezultat aktivacije brasinosteroidnog signalinga. U odsustvuovog signalnog puta, biljke postaju zelene, kao da rastu u uslovima svetla, a odrasla biljka jezna ajno patuljasta. Kao i za druge LRR receptor kinaze kod biljaka, priroda puta transdukcijesignala koja vodi od aktivacije receptora do fiziološkog odgovora ostaje misterija do daljnjeg.

LRR-receptor kinaze su samo jedna od mnogih klasa transmembranskih- receptor-serin/treoninkinaza kod biljaka. Postoji bar još šest dodatnih familija, od kojih svaka ima svoj karakteristi anset ekstracelularnih domena. Na primer, lektin-receptor kinaze imaju ekstracelularni domenkoji vezuje ugljeno-hidratne signalne molekule. U genomu Arabidopsisa je kodirano više od 300receptor-serin/treonin kinaza, što ini ovu familiju receptora najve om, trenutno poznatom, kodbiljaka. Mnoge od ovih kinaza su uklju ene u mehanizme odbranih odgovora uperene protivraznih vrsta patogena.

1.3.3. Etilen aktivira dvo-komponentni signalni put

Razli iti regulatori rasta, koji se još nazivaju hormoni biljaka/biljni hormoni, zn ajno pomažukoordinaciji razvoja biljaka. Ova grupa aktivnih materija uklju uje etilen, auksin, citokine,gibereline i abcisinsku kiselinu. Svi regulatori rasta su mali molekuli koje sintetiše ve inabiljnih elija. Ovi molekuli difunduju kroz elijski zid biljne elije i mogu delovati lokalno ili pakmogu biti transportovani i uticati na fiziološke procese na drugim, udaljenijim mestima odsignalne elije koja ih je sintetisala i sekretovala. Svaki regulator rasta može da imamultiple/višestruke efekte. Specifi an efekat zavisi od toga: da li i koji još drugi faktori rastadeluju; od uslova u okruženju; od nutritivnog stanja/statusa biljke, kao i od sposobnosti ciljneelije da odgovori.

Veoma važan primer je etilen. Ovaj mali molekul gasa može uticati na razvoj biljke na razli itena ine, uklju uju i promociju stvaranja ploda, abcisiju listova itd. Pored toga, deluje kao stressignal u odgovoru na ozledu, infekciju, izmenjen režim svetlosti/tame, vlage itd. Biljke imaju velikibroj razli itih receptora za etilen (etilenskih receptora) koji su strukturno povezani i sli ni. Ovi

43

receptori su dimerni transmembranski proteini za koje se smatra da funkcionišu kao histidinkinaze. Etilenski receptori imaju ekstracelularni domen koji sadrži atom bakra koji vezuje etilen,kao i intracelularni histidin-kinazi-sli an domen koji ispoljava histidin-kinaznu aktivnost. Umaniru kao i dvo-komponentni signalni put uklju en u bakterijsku hemotaksiju, kada je aktivankinazni domen on autofosforilacijom fosforiliše sam sebe na histidinskom ostatku i veruje se daon potom vrši transfer fosfata do aspartatne kiseline drugog domena receptora. Kod bakterijskehemotaksije vezivanje atraktanta inaktivira receptor. Sli no tome vezivanje etilena inaktivišeetilenski receptor, inhibišu i kinazni domen, a time »down-stream« singalni put koji je vezan sanjim. Kada za receptor nije vezan ligand tj. kada je on u aktivnom stanju prouzrokova e aktivacijuprve komponente MAP-kinaznog signalnog modula. Aktivacija ove MAP-kinazne kaskade vodi kainaktivaciji genskih regulatornih proteina u nukleusu koji su odgovorni za stimulaciju gena ija jetranskripcija regulisana etilenom (engl. ethylene-responsive genes). Vezivanje etilena za receptor

inaktiviše ovaj signalni put, teprema tome uklju ujetranskripciju ovih gena (Slika1.36A.,B.). Dvokomponentnisistem signalinga je operativani kod bakterija i gljiva, kao ikod biljaka, ali ne i kodživotinja. Zbog ega su životinje»odustale« od ovakvog vidasignalinga ostaje misterija.

Slika 1.36. Trenutno postoje a šemaetilensko dvo-komponenetnog signalnogputa.A – U odsustvu etilena, receptori i MAP-kinaznimodul su aktivni, što dovodi do inhibicije genskihregulatornih proteina u nukleusu koji su odgovorni zatranskripciju gena koji odgovaraju na etilen (engl.ethylene-responsive genes). B – U prisustvu etilena,receptori i MAP-kinazni modul su inaktivni , pa jedozvoljena transkripcija etilen-responsive gena.

Razvoj biljaka je pod veoma velikim uticajem uslova spoljašnje sredine. Biljke ne mogu kaoživotinje da se kre u kada uslovi postanu nekonformni i nepovoljni, nego moraju da odlu e da seadaptiraju ili da umru. Veoma važan spoljašnji uticaj na biljke ima svetlo, koje je njihov izvor

44

energije i ima klju nu ulogu kroz celokupan svetlosni ciklus biljke: od germinacije, razvoja klice,organogeneze, do cvetanja i iznošenja ploda. Biljke su u toku evolucije razvile veoma veliki setproteina koji su osetljivi na svetlo (engl. light-sensitive proteins) kako bi mogle da uspešno vršemonitoring kvantiteta, kvaliteta, usmerenja i toka svetlosti, kao i dužine trajanja svetlosti.

1.3.4. Fitohromi detektuju crveno svetlo, a kriptohromi detektuju plavo svetlo

I biljke i životinje su u toku evolucije razvile i koriste raznovrsnu paletu svetlosno-senzitivnihproteina kako bi osetili/prepoznali svetlost razli itih talasnih dužina. Kod biljaka se ovakav tipproteina obi no nazva fotoreceptori, ali s obzirom da se termin fotoreceptori takodje koristi kodsvetlosno-senzitivnih elija u retini životinja (videti poglavlje 3), u ovom tekstu e za svetlosno-senzitivne proteine kod biljaka, prema literaturi, biti koriš en termin fotoproteini. Svifotoproteini registruju svetlo preko kovalentno vezanih hromofora koje absorbuju svetlost i kojemenjaju svoj oblik u odgovoru na svetlo, a time indukuju promenu u konformaciji fotoproteina.Životinje takodje koriste neke od fotoproteina koje koriste i biljke. Najekskluzivnije istraživanianimalni fotoproteini su rodopsini, koji su membranski-vezani, za G-proteine-linkovanifotoproteini koji regulišu jonske kanale u svetlosno-senzitivnim elijama retine oka (videtipoglavlje 3).

Najpoznatiji biljni fotoproteini su fitohromi koji su prisutni kod svih biljaka i nekih algi. Oni sudimerne, citoplazmatske serin/treonin kinaze koje razli ito i reverzibilno odgovaraju na crvenosvetlo i svetlo koje je udaljeno od crvenog (engl. far-red light): dok crveno svetlo obi no aktivirakinaznu aktivnost fitohroma, druga vrsta svetla je inaktiviše. Smatra se da kada su fitohromeaktivirane crvenim svetlom inicira se autofosforilaciona aktivnost, te one fosforilišu same sebe, apotom i fosforilišu jedan ili više drugih signalnih proteina u eliji. U nekim odgovorima na svetlo,aktivirana fitohroma migrira u nukleus i tamo stupa u interakciju sa regulatornim proteinimagena te tako uti e na transkripciju gena (Slika 1.37.). U drugim slu ajevima, aktivirana fitohromaaktivira regulatorne proteine gena koji se nalaze u citoplazmi, a oni potom migriraju u nukleusgde regulišu transkripciju gena. Pored toga, u nekim slu ajevima, fotoprotein može da »uklju i«signalni put u citosolu, a što e kulminirati promenom ponašanja elije i bez u eš a nukleusa.

Iako fitohrome imaju serin/treonin kinaznu aktivnost, deo njihove strukture jako podse a nastrukturu histidin kinaza uklju enih u bakterijsku hemotaksiju. Ovaj pronalazak sugeriše da su

45

biljne fitohrome originalno proizašle od bakterijskihhistidin kinaza, a da su kasnije u evolucijipromenile specifi nost prema supstratu od histidinaprema serinu i treoninu.

Slika 1.37. Trenutno postoje a šema jednog na ina preko koga fitohromposreduje odgovor na svetlo u biljnoj eliji.Kada se aktivira svetlom, fitohrom koji je dimer fosforiliše samog sebe (autofosforilacija) itranslocira se u nukleus gde aktivira genske regulatorne proteina da stimulišutranskripciju specifi nih gena.

Biljke prepoznaju i odgovaraju na plavu svetlost koriš enjem dva tipa fotoproteina: fototropina ikriptohroma. Fototropin je asociran za plazma membranu i delimi no je odgovoran zafototropizam (fenomen koji podrazumeva tendenciju biljaka da rastu prema svetlosti).Fototropizam se odvija na osnovu dirigovane i usmerene elongacije elija koja je stimulisanaregulatorom rasta auksinom, ali je veza izmedju fototropina i auksina nepoznata. Kriptohromesu flavoproteini senzitivni na plavu svetlost. Oni su strukturno sli ni sa fotoliazama, enzimimasenzitivnim na plavu svetlost koji su uklju eni u reparaciju ošte enja DNK koja su prozrokovanaultraviolentnom svetlosti kod svih organizama, izuzev velike ve ine sisara. Za razliku odfitohroma, kriptohromi su takodje pronadjeni i kod životinja, gde igraju veoma važnu ulogu ucirkadijalnom ritmu/satu koji je operativan u ve ini elija sa 24- asovnim ritmom. Kriptohromenemaju sposobnost reparacije DNK, ali se smatra da su evoluirale od fotoliaza.

46

47

PRENOŠENJE SIGNALA SA

POVRŠINE ELIJE 02Kao što je ranije naglašeno, ne postoji živa elija koja živi u izolaciji. Ekstracelularne signalnemolekule se sintetišu i oslobadjaju iz signalnih elija, a produkuju specifi ne odgovore jedino uciljnim (targetnim) elijama koje poseduju specifi ne receptorne proteine za razli ite signalnemolekule. Ovaj deo teksta skripte je fokusiran na signaling koji ide od razli itih grupa receptornihproteina koji su locirani u plazma membrani, odnosno, na površini ciljne elije (Slika 2.1.).

Prenošenje signala sa površine elije ili signaling sa površine elije podrazumeva sve kompleksnemehanizme koji se dešavaju od momenta vezivanja ekstracelularnog signala za receptorneproteine u plazma membrani pa do krajnjeg cilja, specifi nog odgovora ili grupe odgovora ciljneelije koja se ogleda u promeni ponašanja ciljne elije. Ekstracelularna signalna molekula deluje

kao ligand i vezuje se za strukturalno komplementarno mesto na ekstracelularnom domenureceptora ili domenu receptora koji preseca membranu. Vezivanje liganda za njegov receptorprouzrokuje konformacione promene u citosolnom domenu ili domenu receptora koji uslovnoindukuje specifi ne elijske odgovore. Celokupan proces konvertovanja signala u elijski odgovor,kao i individualni koraci/faze u ovom procesu naziva se transdukcija signala ili signalnatransdukcija. U ovom poglavlju se kroz dve sekcije opisuju osnovni principi prenošenja signala sapovršine ciljne elije pa sve do elijskog odgovora. Posebna poglavlja su posve ena signalingu kojise uklju uje aktiviranjem pojedinih tipova receptornih proteina na površini ili u unutrašnjosticiljne elije.

48

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na površini elije.U mnogim signalnim putevima vezivanje ligand za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu, dozvoljavaju i im da se translociraju u nukleus i daregulišu ( eš e stimulišu, a redje inhibišu) transkripciju njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora može da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza kojese potom translociraju u nukleus i regulišu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori, prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnostipostoje ih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Bivanlou & Darnell (2002), Science295:813.).

2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ELIJE

Kao što je ranije naglašeno, ekstracelularni signali uklju uju membranski vezane i sekretovaneproteine i peptide, male lipofilne molekule (npr. steroidne hormone, tiroidne hormone, retinoide,

49

itd.), male hidrofilne molekule derivate aminokiselina (npr. epinefrin, dopamin), gasove (npr. NO iCO), kao i fizi ke stimuluse (npr. mehani ke/dodir/pritisak, svetlo, zvuk, itd).Komunikacija preko ekstracelularnih signalnih molekula obi no uklju uje slede e korake (svi onisu bili diskutovani u prethodnom poglavlju): (1) sintezu i (2) sekreciju signalne molekule odstrane signalne elije; (3) transport signalne molekule do ciljne elije; (4) vezivanje signalnemolekule za specifi ni receptorni protein vodi aktivaciji receptora; (5) inicijiju jednog ili višeintracelularnog signalnog-transdukcionog puta; (6) specifi an odgovor ciljne elije u smisluspecifi nih promena funkcije, metabolizma ili razvoja; (7) uklanjanje signala što esto završava ielijski odgovor (videti sliku 2.1.). Kao što je ranije naglašeno, ve ina receptora se aktivira

vezivanjem sekretovanih ili za membranu vezanih molekula (hormoni, feromoni, faktori rasta,citokini, neurotransmiteri, itd.). Neki receptori se aktiviraju i promenama u koncentracijimetbolita (npr. kiseonik, nutritijenti, itd.), ili fizi kim sitmulusima (npr. svetlo, dodir,temperatura, itd.).

2.1.1. Receptori aktiviraju limitiraju i broj signalnih puteva

Broj receptora i signalnih puteva koji se pominje u ovoj skripti može na prvi pogled delovatipreteran, medjutim svaki dan se otkriva sve ve i broj receptora i njihovih signalnih puteva, takoda je deo koji je ovde opisan samo pokušaj prezentovanja osnovnih receptornih proteina ielemenata njihovih signalnih puteva. Takodje, terminologija dizajniranih signalnih puteva koja sekoristi, a koja je preuzeta iz svetske literature iz ove oblasti, je možda konfuzna, zbog toga što nepostoji sistematizovana nomenklatura. Najve i broj signalnih puteva je imenovan na osnovuglavne klase receptora koja ga aktivira (npr. GPCRs, receptori tirozin kinaze), ili tipa liganda(npr. TGF , Wnt, Hedgehog), ili pak klju ne intracelularne signal-transdukcione komponente(NF- B). U nekim slu ajevima ak i isti put može da referira razli itim imenima. Na sre u, sobzirom da su otkiriveni i prou eni molekularni detalji velikog broja receptora i njihovih putevasignalne transdukciije, neki principi i mehanizmi su po eli da se preklapaju i ujedna avaju. Ovezajedni e osobine pomažu da se napravi smisao bogatstva novih informacija koje se odnose namehanizme elijske komunikacije.

Prvo, eksternalni signali idukuju dva osnovna tipa elijskog odgovora: (1) promene u aktivnostii/ili funkciji ve postoje ih proteina; (2) promene u koli ini specifi nih proteina koje produkujeelija, naj eš e kao rezultat modifikacije transkripcionih faktora koji vodi aktivaciji ili represiji

transkripcije gena. Generalno, prvi tip se odvija mnogo brže nego drugi. Signaling preko G-

50

protein-vezanih receptora veoma esto rezultira promenom aktivnosti ve postoje ih proteina, iakoakivacija ovih receptora u nekim elijama može takodje da indukuje promene u ekspresiji gena.Druge klase receptora primarno su operativne u smislu modulacije genske ekspresije. U nekimslu ajevima, aktivacija receptora direktno aktivira transkripcioni faktor u citosolu (npr. TGF isignalni putevi od citokinskog receptora) ili direktno sklapa intracelularni signalni kompleks kojiaktivira citosolni transkripcioni faktor (npr. Wnt signalni putevi). Pored toga, u nekim drugimputevima transdukcije signala, specifi no proteoliti ko razlaganje/cepanje aktiviranog receptorana površini elije ili intracelularnog signalnog proteina otpušta transkripcioni faktor (npr.Hedgehog, Notch i NF- B signalni putevi). Transkripcioni faktori aktivirani ovim signalnimputevima u citosolu, translociraju se u nukleus i regulišu aktivnost nuklearnih transkripcionihfaktora. O ovim signalnim putevima koji regulišu transkripciju mnogih gena esencijlnih za rast,diferencijaciju, deobu i druge funkcije elija, bi e diskutovano u odvojenim poglavljima.

Drugo, neke klase receptornih proteina mogu inicirati singaling preko više od jednogintracelularnog signal-transdukcionog puta, prouzrokuju i tako razli ite elijske odgovore. Ovakomplikacija je tipi na za G-protein-vezane receptore, receptore tirozin kinaze, kao i citokinskereceptore.

Tre e, bez obzira na ogroman broj razli itih liganda i njihovih specifi nih receptora, relativno malibroj mehanizama transdukcije signala i veoma visoko konzervisani intracelularni proteini igrajuglavnu i veoma važnu ulogu u transdukciji signala intracelularnim signalnim putevima. Bezobzira na ogromnu kompleksnost, postoji ogromna akumulacija dovoljne koli ine znanja iz oveoblasti tako da je mogu e trasirati i pratiti ceo signalni put od momenta vezivanja ligand zareceptore nekoliko klasa, pa duž/preko puteva transdukcije signala, sve do finalnih odgovoraelije.

2.1.2. Receptorni proteini ispoljavaju specifi nost prema vezivanju liganda i efektorima

Odgovor elije ili tkiva na specifi ne eksternalne signale je diktiran odredjenim i specifi nimreceptorima koje poseduju, putevima transdukcije signala koji se aktiviraju, kao iintracelularnim procesima koji se eventualno afektuju. Svaki receptor generalno vezuje samojedan jedini signalni molekul ili grupu strukturno-veoma blisko povezanih molekula. Receptorivezuju ligande sa odgovaraju om specifi noš u koja je determinisana nekovalentnim

51

interakcijama izmedju liganda i specifi nih aminokiselina receptornog proteina. Na suprot tome,mnoge signalne molekule se vezuju za multiple tipove receptora, od kojih svaki može da aktivirarazli iti signlni put i prema tome da indukuje razli ite elijske odgovore. Na primer, razli iti tipoviacetilholinskih receptora su pronadjeni na površini skeletnih miši nih elija, sr anih miši nihelija i pankreasnih acinusnih elija. Sekrecija acetilholina iz neurona funkcionalno povezanog

(neuromuskularna veza) sa elijom skeletne muskulature inicira kontrakciju aktivacijom ligand-zavisnih jonskih kanala, dok sekrecija vezana za elije sr ane muskulature smanjuje brzinu radasrca preko aktivacije GPCR. Sekrecija vezana za pankreasne acinusne elije inicira egzocitozusekretornih grnula koje sadrže enzime. Sli no acetil-holinu, epinefrin se vezuje za razli ite G-protein-vezane receptore od kojih svaki indukuje raznovrsne odgovore elije. Prema tome, svakireceptorni protein se karakteriše veznom specifi noš u za ta no odredjen ligand, a nastalireceptor-ligand kompleks ispoljava efektornu specifi nost (posreduje specifi an elijskiodgovor).

Sa druge strane, razli iti receptori iste klase koji vezuju razli ite ligande veoma esto indukuju istibiološki odgovor u eliji. Na primer, u elijama jetre hormoni epinefrin, glukagon i ACTH seveuzuju za razli ite lanove GPCR familije recepora, ali svi oni aktiviraju iste puteve transdukcijesignala (one koji uklju uju cAMP), što reguliše razli ite metaboli ke funkcije, uklju uju i irazgradnju glikogena. Sumirano, tri razli ita signala imaju isti efekat na metabolizam elija jetre.

2.1.3. Maksimalni odgovor elije na signalnu molekulu ne mora zahtevatiaktivaciju svih receptora

Kao što je navedeno, aktivacija receptornih proteina na površini ciljne elije i regrutovanjespecifi nih puteva transdukcije signala se inicira vezivanjem signalne molekule (liganda) zareceptor. Vezivanje zavisi od slabih, nekovalentnih sila (npr. jonskih, van der Walsovih ihidrofobnih interakcija) i molekularne komplementarnosti izmedju površina koje interaguju nareceptoru i ligandu. Specifi nost receptora se ogleda u sposobnosti da razlikuje strukturno vrlosli ne supstance/molekule (npr. insulinski receptor vezuje insulin i insulinu sli an faktor rasta 1,ali ne i druge peptidne hormone ili molekule). Mera afiniteta receptora za ligand je konstantadisocijacije, Kd, tj. ona koncentracija liganda pri kojoj je polovina od maksimalnog brojareceptora okupirana ligandom. U velikom broju slu ajeva maksimalan odgovor elije na datiligand obi no se dešava pri koncentraciji liganda pri kojoj ve ina receptora još uvek nije

52

okupirana ligandom. Ovaj fenomen se može uo iti ukoliko se prati odgovor elije i vezivanjelignada za receptor pri rastu im koncentracijama liganda (Slika 2.2.).

Slika 2.2. Maksimalni fiziološki odgovor na mnoge eksternalne signaledešava se kada je samo frakcija receptornih molekula okupirana ligandom.U ovom slu aju su plot koji prikazuje vezivanje liganda i fiziološki odgovor, pri rastu imkoncentracijama liganda, razli iti. U prikazanom primeru 50% od maksimalnog fiziološkogodgovora se dobija ukoliko je samo 18% od ukupnog broja receptornih mesta zauzeto, a80% od maksimalnog fiziološkog odgovora se dobija kada je koncentracija liganda jednakaKd, odnosno kada je samo 50% od ukupnog broja receptorskih mesta okupirano.

Senzitivnost elije prema spoljašnjim signalima je determinisana brojem receptoraZbog toga što elijski odgovor na odredjeni signalni molekul zavisi od broja ligand-receptorkompleksa, logi no je da e mali broj receptora prisutnih na površini elije usloviti da je elijaslabo senzitivna na dati ligand. Kao posledica, potrebna je mnogo ve a koncentracija liganda daprouzrokuje uobi ajeni fiziološki odgovor koji bi se dobijo da je više receptora prisutno. Regulacijabroja ekspresovanih receptora za dati signalni molekul, a samim tim i senzitivnost ciljne elije zadati signal ima veoma važnu, klju nu ulogu u usmerenoj fiziologiji i razvojnim procesima.Alternativno, endocitoza receptora na površini elije može dovoljno redukovati broj prisutnihreceptora i tako završiti uobi ajeni elijski odgovor na datu koncentraciju signalnog molekula.

2.1.4. Eseji za vezivanje se koriste za detekciju receptora i odredjivanje Kd vrednosti

Receptorne proteine na površini elijske membrane ( elijske-površinske receptore) je veoma teškoidentifikovati i purifikovati (izdvojiti i pre istiti iz frakcije) uglavnom zbog toga što su prisutni urelativno maloj koli ini. Receptor za odredjeni signalni molekul uglavnom ini samo oko 10-6

ukupnih proteina elije ili oko 10-4 proteina plazma membrane elije. Purifikacija je takodje veomateška zbog toga što su receptori integralni membranski proteini, te ih prvo treba solubilizovatinejonskim deterdžentima kako bi mogli biti separatisani od drugih proteina. Kao što jenapomenuto, koncentracija liganda pri kojoj je polovina od maksimalnog broja receptoraokupirana naziva se konstanta disocijacije i obeležava se sa Kd. Može biti determinisanaeksperimentalno i ona je mera afiniteta receptora za ligand. Obi no se receptori detektuju i

53

determinišu na osnovu njihove sposobnosti da vežu radioaktivni ligand za elije ili njihovefragmente u tzv. esejima za vezivanje (engl. binding assays) ili bajnding esejima (Slika 2.3.).

Slika 2.3. »Binding« esej za receptore na površini elije možedeterminisati Kd za ligande visokog afiniteta, kao i broj receptora poeliji.

Ovde su prikazani rezultati za receptor specifi an za insulin na površini hepatocita( elija jetre). Suspenzija elija je inkubirana 1 sat na 4oC sa rastu im koncentracijama125I-obeleženim-insulinom. Niska temperatura je neophodna kako bi se spre ilaendocitoza elijskih-površinskih receptora. elije se odvajaju od slobodnog/nevezanoginsulina obi no centrifugiranjem, a koli ina radioaktivnosti koja je prisutna u elijamase potom odredjuje. Kriva totalnog vezivanja (A) predstavlja insulin koji je specifi novezan za receptore visokog afiniteta kao i insulin koji je nespecifi no vezan za drugemolekule malog afiniteta na površini elije. Udeo nespecifi nog vezivanja u totalnomvezivanju se determiniše paralelnim ponavljanjem eseja u prisustvu 100 puta ve ekoncentracije neobeleženog insulina nego što je potrebno da bi se saturisala svavezna mesta visokog afiniteta za insulin. U ovom slu aju sav obleženi insulin se vežeza nespecifi na vezna mesta, te se dobijaju podaci za krivu C. Kriva specifi nogvezivanja (B) se dobija prera unavanjem razlika izmedju krive A (ukupno vezivanje) ikrive C (nespecifi no vezivanje). Sa krive B se može prera unati Kd vezivanja insulina(oko 1.4x10-8 M ili oko 14 nM ) kao i broj receptora po eliji (oko 33000).

Ipak, mnogi ligandi se vezuju za svoje receptore sa mnogo manjim afinitetom. Ukoliko je Kd ve aod 1x10-7 M, svaki ligand vezan za receptor se disocira za nekoliko sekundi koliko je potrebno dase centrifugiranjem odvoji ligand vezan za elijske-površinske receptore i od slobodnog liganda,kako bi se determinisao procenat vezivanja. Da bi se ovo prevazišlo, jedan od na ina kojima sedetektuje slabo vezivanje liganda za receptor su kompetitivni eseji u kojima se koristi i drugiligand sa ve im afinitetom za isti receptor (ima manju vrednost Kd). U ovim tipovima eseja rastu ekoncentracije neobeleženog liganda malog afiniteta, tzv. kompetitora, se dodaje u uzorak elija sa

konstantnom koncentracijom radio-aktvino obeleženog liganda velikog afi-niteta (Slika 2.4).

Slika 2.4. Vezivanje liganda malog afiniteta zareceptore na površini elije može biti detektovanakompetitivnim esejima.U ovom primeru je za detekciju vezivanja dva liganda malogafiniteta za epinefrinske receptore, prirodni hormon epinefrin (EP)i sinteti ki ligand izoproterenol (IP), koriš en sinteti ki ligandaloprenolol koji se vezuje sa velikim afinitetom (Kd je oko 3 nM)za epinefrinske receptore na hepatocitima. Esej je izveden kao štoje opisano u legendi za sliku 2.3., samo što je koriš enakonstantna koncentracija radioaktivnog [3H]aloprenolola, adodavane su rastu e koncentracije neobeleženog epinefrina ilineobeleženog izoproterenola.

54

Vezivanje neobeleženog kompetitora blokira vezivanje radioaktivno obeleženog liganda za receptor,te se preko smanjivanja radioaktivnosti koja poti e od kompleksa radioaktivno obeleženog ligandai receptora, sudi o koncentraciji neobeleženog kompetitora. Koncentracija kompetitora koja jeneophodna da inhibiše vezivanje polovine radioaktivno obeleženog liganda predstavljaaproksimativnu vrednost Kd za vezivanje kompetitora za receptor.

55

2.2. INTRACELULARNA TRANSDUKCIJA SIGNALA - PRENOS SIGNALA UNUTAR ELIJE

Razli iti intracelularni putevi koji transdukuju signal odaktiviranog receptora na površini ciljne elije u „donjetokove/delove” (engl. down-stream) signalnog puta serazikuju po svojoj kompleksnosti i po na inu na koji vršetransdukciju signala. Ovde e biti opisane komponenteneki generalni principi transdukcije signala koji se mogubiti primenjeni na razli ite signalne puteve. Komponente ioperativnost individualnih puteva signalne transdukcijebi e opisana u odvojenim poglavljima i sekcijama.

2.2.1. Drugi glasnici nose signale od mnogihreceptoraVezivanje liganda, tzv. prvog glasnika, za mnogereceptore na površini ciljne elije vodi ka kratkotrajnompove anju (ili smanjenju) kratkožive ih intracelularnihsignalnih molekula male molekulske mase koji se zovusekundarni glasnici. Ovi molekuli uklju uju 3’,5’-cikli niAMP (cAMP); 3’,5’-cikli ni GMP (cGMP); 1,2-diacilglicerol(DAG) i inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3)(Slika 2.5.). Porednavedenih, veoma važni sekundarni glasnici su i joniCa2+, kao i inozitol fosfolipidi koji se nazivajufosfoinozitidi.

Slika 2.5. Sekundarni glasnici.Osnovni direktni efekat ili efekti svakog sekundarnog glasnika su nazna eni ispod njegovestrukturne formule. Jon Ca2+ i nekoliko membranski-vezanih fosfoinozitida takodje imaju funkcijusekundarnih glasnika.

Pove ana intracelularna koncentracija jednog ili više sekundarnih glasnika koja prati vezivanjeeksternalne signalne molekule okida rapidnu promenu u aktivnosti jednog ili više enzima ilineenzimskih proteina. Sli nosti u porastu koncentracije nekog sekundarnog glasnika (npr. cAMP)indukuje razli ite promene u elijskom metabolizmu koje se razlikuju u razli itim tipovima elija.

56

2.2.2. Mnogi konzervisani intracelularni proteini imaju funkciju u transdukciji signala

Pored receptora na površini elije i sekundarnih glasika, još dve grupe evolutivno visokokonzervisanih protiena imaju funkcije u putevima signalne transdukcije aktiviranim od stranekstracelularnog signala. Ovde su samo ukratko opisani, a njihova specifi na funkcija u svakomindividualnom i odredjenom putu transdukcije signala je opisna kasnije.

2.2.2.1. GTPazni proteinski izmenjiva i/prekida iOvo je prili no velika grupa intracelularnih prekida a koja formira tzv. GTPaznu superfamiliju.Ovi proteini koji vezuju guaninske nukleotide se aktiviraju ili „uklju uju” (engl. turned „on”) kadavežu GTP, a inaktivišu se ili „isklju uju” (engl. turned „off”) kada je vezan GDP. Signalomindukovana konverzija iz inaktivnog/off u aktivno/on stanje je posredovana sa faktorom zaizmenu guanin nukleotida (engl. Guanine nucleotide Exchange Factor - GEF) koji prouzrokujeotpuštanje GTP sa proteina-prekida a. Posledi no vezivanje GTP (favorizovano je njegovomvisokom intracelularnom koncentracijom) indukuje konformacione promene proteina u dvasegmenta, te se to naziva prekida I i prekida II (engl. switch I, switch II), a one dozvoljvajuproteinu da se dalje vezuje i aktivira druge signalne proteine u donjem toku (engl. „down-stream”)signalnog puta (Slika 2.6.). Unutrašnja GTPazna aktivnost proteina hidrolizuje vezani GTP u GDPi Pi, pa se zbog toga menja konformaciono stanje prekida a I i prekida a II od aktivne formenatrag u inaktivnu formu. Brzina hidrolize GTP je vrlo esto poja ana sa proteinima kojiubrzavaju GTPaznu aktivnost tj. GTPaza-akceleratornim proteinima (engl. GTPase-AcceleratingProteins - GAPs) ija aktivnost može biti kontrolisana ekstracelularnim signalima. Brzina GTPhidrolize odredjuje kolliko dugo e protein-prekida ostati u aktivnoj konformaciji i biti sposobanda transdukuje signal dalje. Postoje dve klase prekida kih proteina: (1) Trimerni ili veliki Gproteini koji se vezuju direktno za neke receptore i aktivirani su direktno od strane nekihreceptora. (2) Monomerni ili mali G proteini (Ras ili razli iti Ras-sli ni proteini) su vezaniindirektno za receptor preko adapternih proteina i GEF proteina. Svi G proteini sadrže regione kaošto su izmenjiva /prekida I i izmenjiva /prekida II da bi mogli da modulišu aktivnostspecifi nih efektornih proteina preko direktne protein-protein interakcije koja se ostvaruje kada jeG protein vezan za GTP. Bez obzira na sli nost, ove dve klase GTP-vezuju ih proteina suregulisane na veoma razli ite na ine.

57

Slika 2.6. Izmenjiva ki/«switching« mehanizam zamonomerne i trimerne G proteine.Sposobnost G proteina da interaguju sa drugim proteinima i na taj na invrše transdukciju signala se razlikuje u GTP-vezanom »on« stanju i GDP-vezanom »of« stanju. A – U aktivnom »on« stanju, dva domena koja senazivaju prekida I i prekida II su vezani za terminalni fosfat GTP prekointerakcija sa zadnjom amidnom grupom konzervisane treoninske iglicinske rezidue. B – Otpuštanje fosfata hidrolizom, katalizovanomGTPazama, prouzrokuje relaksaciju prekida a I i prekida a II u druga ijekonformaciono stanje, »off« stanje. Ovde su prikazani tzv. »ribon« modelioba konformaciona stanja (»on« i »off«) monomernog G proteina koji sezove Ras. Sli an mehanizam izmenjuje -subjedinicu trimernog Gproteina izmedju aktivne (»on«) i inaktivne (»off«) konformaicije. (Preuzetoiz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman andCompany; adaptirano od Vetter & Wittnighofer (2001), Science294:1299.).

G proteini su zaka eni za citoplazmati no lice plazma membrane gde imaju ulogu relejnihmolekula funkcionalno prenose i signal sa receptora za enzime ili jonske kanale u toj membrani.Postoji veliki broj G proteina koji su specifi ni za odredjene setove serpentinskih receptora i zaodredjeni set »down-stream« targetnih proteina u plazma membrani. Svi oni imaju sli nustrukturu i operativni su na sli an na in, ali regulacija njihove aktivnosti može biti razli ita. Gproteini su gradjeni od tri proteinske subjedinice: , i . U nestimulisanom stanju, subjedinicaima vezan GDP i tada je G protein je inaktivan (Slika 2.7.).

Slika 2.7. Struktura inaktivnog trimernog G proteina.A – Uo iti da i i subjedinica imaju kovalentno vezane lipidnemolekule koje im pomažu da se vežu za plazma membranu, a -subjedinica ima vezan i GDP.B – Trodimenzionalna struktura inaktivnog G proteina bazirana natransducinu, G proteinu važnom za vizuelnu transdukciju (videtikasnije). -subjedinica ima GTPazni domen i vezuje se za jednustranu -subjedinice što zaklju ava GTPazni domen u inaktivnukonformaciju kada je vezan GDP. -subedinica se veže za stranusuprotnu od mesta vezivanja -subjedinice.

58

Kada je stimulisana aktiviranim receptorom subjedinica otpušta njen vezani GDP,dozvoljavaju i da se veže GTP. Ova izmena inicira disocijaciju trimernog G proteina u dve aktivnekompnenete: subjedinicu i kompleks (Slika 2.8.). Disocijacija trimernog G proteina aktivira

njegove dve komenente na razli it na in.GTP vezivanje prouzrokuje konformacionepromene koje afektuju površinu -subjedinice koja je asocirana sa -kompleksom u trimer, te dolazi dootpuštanja -kompleksa, a -subjedinicase adaptira u novi oblik koji joj dozvoljavada interaguje sa svojim ciljnim proteinima.

-kompleks ne menja svoju konformaciju,ali je površina koja je ranije bila maskirana-subjedinicom sada dostupna za

interakciju sa drugim setom targetnihproteina. Ciljni proteini disociranihkomponeneti G-proteina su ili enzimi ilijonski kanali u plazma mebrani koji daljeprenose signal.

Slika 2.8. Disocijacija/rasklapanje aktiviranog trimernog Gproteina .A – U nestimulisanom stanju i receptor i G protein su inaktivni. Iako suovde prikazani odvojeno, oni su, bar u nekim slu ajevima, asocirani ukompleks. B –vezivanje ekstracelularnog liganda za receptor menjakonformaciju receptora, što dovodi do promene konformacije G proteinavezanog za receptor. C – Promena konformaiconog stanja -subjediniceG proteina dozvoljava zamenu njenog GDP za GTP. Vezivanje GTPprouzrokuje disocijaciju G proteina na dve aktivne komponenete: -subjdeinicu i -kompleks, i obe mogu da regulišu akativnost ciljnihproteina u plazma membrani.

-subjdeinica G proteina je GTPaza i kada jednom hidrolizuje njen vezani GTP u GDP, ona sevra a u inaktivno konformaiciono stanje koje joj omogu ava da se ponovo reasocira sa -kompleksom i re-formira inaktivni G protein (Slika 2.9.). Vreme tokom koga su -subjedinica i -kompleks razdvojeni i aktivni je obi no relativno kratko i zavisi od toga koliko e brzo -subjedinca hidrolizovati njen vezani GTP. Izolovana -subjedinica je neefikasna GTPaza i«ostavljena« tako sa samo svojom »opremljnoš u« bez uticaja drugih signalnih molekula

59

inaktivisa e se za nekoliko minuta. Njenainaktivacija se u eliji obnavalja veomabrzo zato što je GTPazna aktivnost -subjedinice veoma mnogo poja anavezivanjem drugog proteina koji može bitiili njen targetni protein ili specifi nimodulator poznat kao regulator G proteinsignalinga (engl. Regulator of G proteinSignaling - RGS). RGS proteini deluju kao-subjedinice specifi ni GTPaze

aktiviraju i proteini, tj. ranije pomenutiGAPs i imaju krucijalnu ulogu u »off«regulaciji G proteinima-posredovanihodgovora u svim eukariotskim elijama.Detektovano je i definisano oko 25razli itih RGS proteina kodiranih uhumanom genomu, a smatra se da svakiod njih interaguje sa odredjenim setomGproteina.

Slika 2.9. Inaktivacija/«switching off« -subjedinice Gproteina njenom GTPaznom aktivnosti tj. hidrolizom za njuvezanog GTP .A – Nakon što -subjeidnica G proteina aktivira njen targetni protein,ona sama sebe inaktiviše tj. prebacuje u »off« stanje tako štoGTPaznom aktivnosti hidrolizuje GTP koji je vezan za nju u GDP. Ovoinaktiviše -subjedinicu koja se disocira od targetnog proteina ireasocira se sa -kompleksom re-formiraju i inaktivni trimerni Gprotein. Vezivanje za targetni protein ili za membranski vezani RGSprotein (nije prikazan na slici) obi no stimuliše GTPaznu aktivnost -subjedinice, a ova stimulacija veoma mnogo ubrzava proces inaktivacije

-subjedinice.

60

2.2.2.2. Protein kinaze i protein fosfatazeAktivacija receptora na površini ciljne elije vodi direktno ili indirektno preko aktivacije proteinkinaza ili protein fosfataza ka promenama u fosforilaciji proteina. Prema tome, ovi enzimi suodgovorni za održavanje stanja fosforilacije/defosforilacije mnogih proteina koje doprinosiaktivaciji/inaktivaciji datog proteina, a samim tim ima uticaja na fiziološke procese i odgovorelije. Animalna elija sadrži dva tipa protein kinaza: (1) one koje dodaju fosfat hidroksilnoj

grupi tirozinskih rezidua i (2) one koje dodaju fosfat hidroksilnoj grupi serinskih ilitreoninskih rezidua ili obema aminokiselinama. Fosfataze koje uklanjaju fosfatnu grupu mogudelovati u koncernu sa kinazama u smislu da »uklju uju« ili »isklju uju« aktivnost nekogproteina. Prema poslednjim prera unima humani genom kodira oko 500 protein kinaza i 100razli itih fosfataza. U nekim signalnim putevima receptor sam po sebi poseduje unutrašnjukinaznu ili fosfataznu aktivnost, dok u drugim putevima transdukcije signala receptor interagujesa citosolnim ili membranski vezanim kinazama. Generalno, protein kinaze fosforilišu specifi nerezidue u setu ciljnih proteina iji je obrazac ekspresije generalno razli it u razli itim tipovimaelija. Mnogi proteini su supstrati za nekoliko tipova kinaza, a svaki proces fosforilacije na

razli itoj aminokiselini modifikuje aktivnost odredjenog ciljnog proteina u razli itom pravcu tj.nekada ga aktivira, a nekada ga inhibiše. Kataliti ka aktivnost same protein kinaze je veomaesto modifikovana ili drugim kinazama, ili direktnim vezivanjem signalnih proteina, ili pak

promenama nivoa razli itih sekundarnih glasnika. Aktivnosti svih protein kinaza sesuprotstavljaju protein fosfataze, od kojih su neke regulisane ekstracelularnim signalima. Prematome, aktivnost proteina u eliji može biti kompleksna funkcija višestruke aktivnosti raznihkinaza i fosfataza koje deluju na dati protein.

Iako cAMP može direktno da aktivira odredjene tipove jonskih kanala u plazma membraninekih visoko-specijalizovanih elija, u ve ini elija svoj efekat ostvaruje aktivacijom cAMP-zavisneprotein kinaze A, PKA. Ovaj enzim katalizuje transfer terminalne fosfatne grupe od ATP dospecifi nih serina ili treonina selektovanih ciljnih proteina i u tom maniru reguliše njihovuaktivnost. PKA je pronadjena u ve ini životinjskih elija i odgovorna je za efekat cAMP u ve inielija. Supstrat za PKA je razli it u razli itim elijskim tipovima, što objšnjava zbog ega su efekti

cAMP toliko razli iti u zavisnosti od tipa elija. U inaktivnom stanju PKA se sastoji od kompleksadve kataliti ke i dve regulatorne subjedinice. Vezivanje cAMP za regulatornu subjedinice PKAmenja njihovu konformaciju i prouzrokuje da one disociraju od kompleksa. Oslobodjenekataliti ke subjedinice su zbog toga aktivirane/slobodne da fosforilišu proteinske molekulespecifi nih substrata. Regulatorna subjedinica je takodje važna za lokalizaciju kinaze unutarelije. Poseban protein, tzv. PKA protein za „usidravanje“ (engl. PKA anchoring protein) vrši

61

„usidravanje“ i vezuje obe regulatorne subjedinice, a vezuje se i za membranu ili komponentecitoskeleta, te na taj na in drži enzimski kompleks u odredjenom subcelularnom kompartmentu.

Neki od ovih proteina zausidravanje vezuju i drugekinaze i neke fosfataze i takoine signalni kompleks.

Slika 2.10. Aktivacija cAMP – zavisne proteinkinaze (PKA) .Vezivanje cAMP za regulatorne subjedinice indukujekonformacione promene i prozrokuje disocijaciju ovihsubjedinica od kataliti kih, što aktivira kataliti kesubjedinice. Otpuštanje kataliti ih subjedinica zatevavezivanje više od dva molekula cAMP za regulatornusubjedinicu i formiranje tetramera. Ovaj zahtevomogu ava da odgovor PKA na pove anjekoncentracije cAMP bude veoma oštar.

elije sisara imaju bar dva tipa PKA: tip I (uglavnom u citosolu) i tip II (vezana je preko svojihregulatornih subjedinica i specijalnog anchoring proteina za plazma membranu, nuklearnumembranu, spoljašnju membranu mitohondrija i mikrotubule). Bez obzira na tim, u svimslu ajevima aktivacije, jednom kada su kataliti ke subjedinice slobodne i aktivne, one migriraju unukleus (gde mogu da fosforilišu genske regulatorne proteine), dok regulatorne subjedinice ostajuu citoplazmi. Neki odgovori cAMP su rapidni, dok su neki drugi spori. Na primer, u elijama kojesekretuju polipeptidni hormon somatostatin, cAMP aktivira gene koji kodiraju sintezu ovoghormona. Regulatorni region somatostatinskog gena sadrži kratku sekvencu DNK koja jeodgovorna za vezivanja cAMP tj. element odgovoran za cAMP (engl. Cyclic AMP ResponsiveElement – CRE) i koji je pronadjen u regulatornom regionu mnogih gena koje aktivira cAMP.Specifi an genski regulatorni protein koji se zove, CRE-vezuju i protein (engl. CRE-Bindingprotein - CREB). Kada je CREB fosforilisan na jednom jedinom serinu od strane PKA regrutujetranskripcioni koaktivator koji se zove CREB-vezuju i potein (engl. CREB-Binding Protein - CBP)što stimuliše transkripciju gena za pomenuti hormon (Slika 2.11.). Ukoliko je serin koga fosforilišePKA mutiran, CREB ne može da regrutuje CBP, te ne može više da stimuliše transkripciju genakao odgovor na pove anje nivoa intracelularnog cAMP.

Fosfataze ine efeakt PKA, kao i drugih kinaza tranzijentnim. I ovo je veoma dobraevolutivna adaptacija zbog toga što je neophodno prvo »vratiti« protein u inaktivno stanjedefosforilacijom kako bi on mogao biti ponovo aktiviran fosforilacijom. Defosforilacijufosforilisanih serina i treonina katalizuje etiri osnovna tipa serin/treonin protein fosfataza:

62

protein fosfataze I, IIA, IIB i IIC. Izuzev protein fosfataze IIC ( ija je fosfatazna aktivnostminorna u poredjenju sa drugima) sve ostale fosfataze su gradjene od homologih kataliti kihsubjedinica koje su u kompleksu sa jednim ili više velikih setova regulatornih subjedinica.

Regulatorne subjedinice pomažu u kontrolifosfatazne aktivnosti i omogu avaju enzimuda selektuje specifi an ciljni molekul. Proteinfosfataza I je odgovorna za defosforilacijumnogih proteina fosforilisanih od strane PKA.Na primer, inaktiviše CREB uklanjaju injegov aktivni fosfat, te time isklju ujetranskripcioni odgovor prouzrokovanporastom nivoa cAMP. Protein fosfataza IIAima veoma široku specifi nost i smatra se daje glavna fosfataza odgovorna zareverzibilnost mnogih efekata fosforilacijekatalisanih serin/treonin kinazama. Proteinfosfataza IIB se još naziva i kalcineurin.Aktivira se jonima Ca2+ i posebno jedominantna u mozgu.

Slika 2.11. Kako se aktivira transkripcija gena porastomkoncentracije cAMP.Vezivanje ekstracelularne molekule za njen G-protein vezani receptor vodiaktivaciji adenilil ciklaze i pove anju koncentracije cAMP. Ovo pove anjekoncentracije cAMP aktivira PKA u citosolu i oslobodjene kataliti kesubjedinice se translociraju u nuklesu gde fosforilišu CREB-regualtorne gene.Jednom fosforilisan CREB e regrutovati koaktivator CRB što dovodi dotranskripcije gena. Ovaj signalni put kontroliše mnoge procese u eliji,po evši od sinteze hormona u endokrinim elijama, pa do produkcije proteinaneophodnih za proces dugotrajnog pam enja u mozgu. Pored PKA, postoje iCa2+-zavisne protein kinaze koje mogu fosforilisati,a time i aktivirati CREB.

2.2.3. Neki receptori i proteini signalne transdukcije su lokalizovani

Iako je epinefrinski receptor ekspresovan na adipocitima ( elijama masnog tkiva kojemagacioniraju lipide) uniformno distribuiran na površini ovih sfernih elija, ovakav na in

63

uniformne distribucije receptora je veoma redak. Mnogo eš i na in distribucije je tzv. grupisanjereceptora u grozdove/skupine (engl. clustering of receptors), a i ne samo receptora nego i drugihproteina asociranih za membranu elije. Ovo »grupisanje« receptora i membranski-asociranihproteina se odvija u ta no odredjenom regionu površine elije. U ovoj sekciji bi e opisano kakomultipla protein-protein i protein-lipid interakcija može da »grupiše« signalne proteine na plazmamembranu i kakve su prednosti od ovog grupisanja /«clustering«-a.

2.2.3.1. Grupisanje/«clustering« membranskih proteina posredovano adapternimdomenima

Verovatno najbolji primer grupisanja receptora i proteina na membrani su hemijske sinapse.Poznato je da su sinapti ke veze veoma visoko specijalizovane strukture i specifi ni funkcionalnispojevi izmedju dve ekscitabilne elije. Ovakav vid komunikacije se ostvaruje neurotransmiterimakoji se egzocitozom sekretuju iz presinapti ke elije i vezuju za specifi ne receptore na membranipostsinapti ke elije. Grupisanje/«clustering« receptora za neurotransmitere u regionu membranepostsinapti ke elije koji se su eljava sa presinapit kom elijom favorizuje rapidnu i efikasnutransmisiju signala. Drugi proteini na membrani postsinapti ke elije interaguju sa proteinimaekstracelularnog matriksa u cilju da »zarobe«/«zaklju aju« eliju u sinapsu.

Proteini koji sadrže ve pomenuti PDZ domen (videti poglavlje 1) imaju fundamentalnuulogu u organizovanju plazma membrane postsinapti ke elije. PDZ domen je identifikovan kaozajedni ki element koji ima nekoliko citosolnih proteina koji se vezuju za integralne proteineplazma membrane, a svaki od ovih domena se vezuje za specifi an motiv na receptoru ilisignalnom proteinu. PDZ je skra enica koja je nastala kombinovanjem prvih slova tri proteina zakoje je prvo otkriveno da imaju isti domen: PSD-95 (engl. Post Synaptic Density protein 95), DlgA(engl. Drosophila disc large tumor suppressor A ) i Zo-1 protein. PDZ domen je relativno malidomen (sadrži oko 90 aminokiselinskih ostataka) koje se vezuje za sekvencu od tri rezidue C-terminalnog domena ciljnog proteina (Slika 2.11A.). Neki PDZ domeni se vezuju za sekvencumotiva serin/treonin-X- (Ser/Thr-X- ), gde X ozna ava bilo koju aminokiselinu, a ozna avahidrofobnu aminokiselinu, dok se drugi PDZ domeni vezuju za sekvencu motiva -X- . Ve inaelijskih, površinskih receptora i transportera sadrži ve i broj subjedinica od kojih svaka može da

se veže za PDZ domen. Pored toga, mnogi citosolni proteini sadrže multiple PDZ domene kao idruge tipove modularnih domena koji participiraju u protein-protein interakcijama, pa prematome. mogu da se vezuju za nekoliko membranskih proteina istovremeno. Ovaj vid interakcijadozvoljava grupisanje/«clustering« razli itih membranskih proteina u velike komplekse (Slika2.11B.). Druge protein-protein interakcije dozvoljavaju ovim kompleksima da se vežu za aktinske

64

filamente koji leže ispod plazma membrane. S obzirom da jedan aktinski filament može da veževe i broj klastera, na ovaj na in još ve i broj molekula plazma membrane može biti dodatnoklasterovan/grupisan zajedno i specifi no. Ovo je jedan od mehanizama kojim su mnogi receptorikoji vezuju isti ili razli iti ligand lokalizovani u specifinom regionu postisinapti kih i drugih elija.

Slika 2.11. Grupisanje/«clustering« membranskih proteina je posredovano citosolnim adapternim proteinima koji imaju višestruke tj.multiple protein-vezuju e domene.

PDZ domen (vezuje odredjene C-terminalne sekvence) i SH3 domen (vezuje prolinima-bogate sekvence) su dva od nekoliko veoma konzervisanih modularnihdomena koji participiraju u interakcijama izmedju proteina tj. protein-protein interakcijama. A – trodimenzionalna struktura PDZ domena. B – Šematski dijagramprotein-protein interakcije koja grupiše nekoliko razli itih membranskih proteina u postsinapti ki segment nervne elije i »usidruje« dobijeni kompleks za aktinskifilament citoskeleta. U okviru adapternog proteina PSD-95 prikazana su dva od tri PDZ, kao i jedan SH3 domen koji vezuju tri razli ita membranska proteina ukompleks. Guanilar kinazni (GuK) domen PSD-95 proteina povezuje kompleks preko nekoliko interventnih adapternih proteina (uklju uju i jedan koji takodje sadržiPDZ i SH3 domene) za aktinsku nit podvu enu ispod plazma membrane. Neuroglin je adhezivni protein koji interaguje sa komponenetama ekstracelularnog matriksa,a ankirinski ponovci (Ank) su drugi multi-vezuju i adapterni proteini koji lokalizuju i grupišu razli ite receptore u sinapti kom regionu plazma membrane.

2.2.3.2. Grupisanje/”clustering” proteina u lipidne agregatePojedini lipidi u plazma membrani, posebno holesterol i sfingolipidi su organizovani u agregatekoji se nazivaju lipidni agregati/skupine/gužve ili tzv. lipidni krševi (engl. lipid rafts) koji takodjesadrže i specifi ne proteine (Slika 2.12.). U sisarskim elijama, specifi ni lipidni agregati senazivaju kalveole (engl. caveolae) koji su od veoma posebnog interesa zbog toga što je pronadjenoda one sadrže nekoliko razli itih receptora i drugih proteina sposobnih da transdukuju signal.Ove nakupine su markirane prisustvom specifi nih proteinina, kaveolina, (engl. caveolin) familijeod oko 25 kDa proteina. Kaveolinski proteini imaju centralni hidrofobni segment za koji se smatrada preseca dva puta membranu, a oba kraja, i N-terminalni i C-treminalni kraj kaveolina su u

65

citosolu. Veliki oligomeri kaveolina formiraju proteinizirani prekriva na citosolnoj površni kaveolavidljiv elektronskim mikroskopom. Nije sasvim precizno pokazano kako pojedini signalni molekulimogu biti zaka eni za kaveole. Proksimalni signalni molekuli u okviru kaveole mogu da facilitirajumedjusobne interakcije, te da na taj na in promovišu odredjene signalne puteve koji bi ina e bilineefikasno operativni.

Slika 2.12. Neki membranski lipidi iproteini su koloklizovani u lipidnimnakupinama/krševima.Rezultati biohemijskih istraživanja sugerišuda GM1, glikosfingolipid, i placentalnaalkalna fosfataza (engl. PLacental AlkalinePhosphatase – PLAP), lipida-usidravaju i(engl. lipid-anchored) membranski protein,su agregirani u lipidne krševe, doktransferinski receptor (TfR) koji prolaziskroz kroz membranu nije. Za lokalizacijuovih komponeneti u plazma membranielije su tretirane sa fluorescentno-zeleno-

obeleženim kolera toksinom, koji uporedo-vezuje GM1 molekule koji su približeni, i safluorescentno-crveno-obeleženim antiteli-ma specifi nim ili za PLAP ili zaTfR. Svakoantitelo može da unakrsno vezuje bliskemolekule proteina koje prepoznaje.Unakrsno vezivanje prouzrokuje daproteini ili lipidi formiraju velike obojene»zakrpe« koje mogu biti detektovanefluorescentnim mikroskopom.

2.2.4. Razvijanje odgovaraju ih elijskih odgovora zavisi od interakcije i regulacijesignalnih puteva

U ovom i narednom poglavlju tekst je fokusiran primarno na vrlo jednostavnim putevimatransdukcije signala koji se »uklju uju« jednostavnim vezivanjem jednog liganda za jedan tipreceptora. Medjutim, esto aktivacija jednog tipa receptora vodi ka produkciji nekoliko razli itihsekundrnih galsnika koji imaju razli ite efekte. Pored toga, isti elijski odgovor (npr. razgradnjaglikogena) može biti indukovana multiplim signalnim putevima.Ovakva interakcija razli itihsignalnih puteva dozvoljava veoma fino podešavanje elijskih aktivnosti koje su neophodne daobezbede kompleksne razvojne i fiziološke procese. Sposobnost elija da odgovaraju naodgovaraju i na in na ekstracelularne signale takodje zavisi i od sopstvene regulacije signalnihputeva. Na primer, kada koncentracija eksternalnog signala opadne, signaling preko nekih

66

intracelularnih puteva se završava degradacijom sekundarnih glasnika, dok se kod drugihsignalnih puteva signaling završava deaktivacijom proteina koji vrše transdukciju signala. Jošjedan veoma važan mehanizam koji osigurava odgovaraju i elijski odgovor je, ve pominjana(videti poglavlje 1), desenzitivizacija receptora pri visokoj koncentraciji signala ili nakonproduženog izlaganja istom signalu. Senzitivnost elije prema odredjenom signalnom molekulumože biti regulisana »na dole« (engl. down-regulated) endocitozom receptora, ime se smanjujebroj receptora na površini, ili modifikacijom aktivnosti receptora, te receptori ili ne mogu da vežuligand ili formirani kompleks receptor-ligand ne može da indukuje normalni odgovor elije.Ovakva modifikacija receptora je esto posledica fosforilacije receptora, ili vezivanja drugihproteina, ili i jednog i drugog. Razli iti mehanizmi kojima se regulišu signalni putevi bi e detaljnijeopisani prilikom predstavljanja individualnih signalnih puteva.

67

SIGNALNI PUTEVI PREKO MEMBRANSKIH

RECEPTORA VEZANIH ZA G-PROTEINE 033.1. GPCR-zavisna AKTIVACIJA/INHIBICIJA ADENILIL CIKLAZE (AC)

Kao što je napomenuto ranije, adenilil ciklaza (AC) je enzim koji katališe formiranje sekundarnogglasnika cAMP-a od ATP-a kao prekursora. Jedan od na ina kojim aktivirani recepor indukujeaktivaciju adenilil ciklaze je preko G proteina. Svi receptori kojima G proteini prevode signalodnosno koji su G proteinima „kaplovani” (engl. G Protein-Coupled Receptors - GPCRs) imajusedam transmembranskih regiona tj. sedam puta presecaju plazma membranu, pri emu im se

N-terminalni segment nalazi na ekstracelularnoj strani plazmamembrane. C-terminalni segment se nalazi na citosolnoj straniplazma membrane ciljne elije (Slika 3.1.)

Slika 3.1. Šematski dijagram generalne strukture G protein-vezanih receptora.Svi receptori ovog tipa imaju istu orjentaciju na membrani i sadrže sedam transmembranskih -heliksa (H1-H7), etiri ekstracelularna segmenta (E1-E4) i etiri citotosolna segmenta (C1-C4). Karboksil-terminalnisegment (C4), C3 petlja, a kod nekih receptora, takodje C2 petlja, su uklju eni u interakciju sa povezanim

trimernim G proteinom.

GPCR familija je veoma brojana i ulju uje receptore za veliki broj hormona i neurotransmitera,receptore koji se aktiviraju svetlom (rodopsini), i doslovno na hiljade receptora za miris u nosu sisara.

Heterotrimerni G proteini koji transdukuju signal su gradjeni od tri subjedinice obeležene kao ,i . Tokom intracelularnog signalinga i subjedinice ostaju vezane i uobi ajeno je da seobeležavaju sa G subjeidnica. G subjedinica je tzv. GTPazni izmenjiva ki protein (engl. GTPase

68

switch protein) koji se menja izmedju aktivnog (on) stanja sa vezanim GTP i inaktivnog (off)stanja sa vezanim GDP. Stimulacija receptora povezanih sa G proteinom prouzrokuje aktivacijuG proteina, koji potom modifikuje aktivnost odredjenog, na bilo koji na in asociranog, efektornogproteina. Iako je u najve em broju slu ajeva efektroni protein aktiviran sa G GTP, u nekimslu ajevima je inhibisan. Takodje, u zavisnosti od elije i lignada, G subjedinica e pre nego Gtransdukovati signal efektornom proteinu. Pored toga, aktivnost nekoliko razli itih efektornihproteina je kontrolisana preko nekoliko razli itih GPCR-ligand kompleksa. Svi efektorni proteini sumembranski–vezani jonski kanali ili enzimi koji katališu formiranje sekundarnih grlasnika (npr.cAMP, DAG, IP3). Ove varijacije na temu GPCR signalinga postoje zbog toga što su multiple forme Gproteina kodirane genomom eukariotske elije. Na primer, humani genom kodira 27 razli itih G ,5 G i 13 G subjedinica. Koliko je poznatno do danas, izgleda da sve G funkcionišu sli no, dokse funkcije G razlikuju (Tabela 3.1.).

Tabela 3.1. Glavne klase sisarskih trimernih proteina i njihovih efektora

G klasa UDRUŽENI EFEKTOR SEKUNDARNI GLASNIK PRIMER RECEPTORA

Gs Adenilil ciklaza cAMP (porast) -Adrenergi ki (epinefrinski) receptor; receptor za glukagon,serotonin, vazopresin

Gi Adenilil ciklazaK+ kanal (G aktivira efektor)

cAMP (smanjenje)Promena membranskog potencijala

1-Adrenergi ki receptorMuskarinski acetilholinski receptor

Golf Adenilil ciklaza cAMP (porast) Mirisni receptori u nosu

Gq Fosfolipaza C IP3, DAG (porast)2-Adrenergi ki receptori

Go Fosfolipaza C IP3, DAG (porast) Acetilholinski receptori endotelijalnih elija

Gt cGMP fosfodiesteraza cGMP (smanjenje) Rodopsin (receptor za svetlost u štapi ima retine)

Prikazane G podklase mogu biti udružene sa više efektornih proteina. Do danas je samo jedan glavni Gs identifikovan ali multipli Gq i Gi su opisani. Efektorni proteini su naj eš eregulisani sa G , ali u nekim slu ajevima sa G ili kombinovanim delovanjem G i G . IP3= inozitol 1,4,5-trifosfat; DAG= 1,2- diacilglicerol.

Pored hetrotrimernih G proteina, velika grupa heterogenih G proteina takodje uklju uje velikufamiliju tzv. malih GTP-vezuju ih izmenjiva kih proteina (engl. small GTP-binding proteins)koja uklju uje faktore za inicijaciju i elongaciju (u estvuju u sintezi proteina); Ras (uklju enisu u signalnu kaskadu aktiviranu faktorima rasta); Rab (u estvuju u izboru, sortiranju i fuzijimembranskih vezikula); ARF (uklju eni su u formiranje vezikularnih koatomernih omota a); Ran(u estvuju u transportu proteina u nukleus i iz njega); Rho (regulišu funkciju aktinskogcitoskeleta). Sve razli itosti u konformaciji GTP-vezuju ih proteina zavise od toga da li je GDP ili

69

GTP prisutan na njihovom nukleotid-vezuju em mestu. U ovoj sekciji e prvo biti opisan procestransdukcije signala od GPCR, a to je proces koji je isti za sve receptore koji su GPCR tipa.

3.1.1. G subjedinica G proteina ciklira izmedju aktivne/on i inaktivne/off forme

Kao što je ranije napomenuto, GTP vezivanje indukuje aktivnu konformaciju ili tzv. „on” stanje, dokprisustvo GDP indukuje inaktivnu konformaciju tj. tzv. “off” stanje.Ve ina GTP-vezuju ih proteinazavisi od svojih tzv. pomaga kih proteina (engl. helper proteins). Kao što je ranije napomenuto,GTPaze aktiviraju i proteini (engl. GTPase Activating Proteins – GAPs) favorizuju hidrolizu GTP-a(Slika 3.2.). GAP može da obezbedi esencijalno aktivno mesto rezidui favorizuju i korektnupoziciju glutamatnog ostatka na izmenjiva kom domenu II (engl. swich II domain). Veoma esto sepozitivno naelektrisani ostatak arginina od GAP polekule ubacuje u aktivno mesto i tokomhidrolize pomaže stabilizaciji tranzicionog stanja tako što interaguje sa negativno naelektrisanimatomom kiseonika terminalnog fosfata GTP molekule. G heterotrimernog G proteina inicirasposobnost hidrolize i ima esencijalni argininski ostatak koju za male GTP-vezuju e proteineobi no obezbedjuje GAP. Stimulaciju G -zavisne GTP hidrolize vrše proteini regulatori G proteinsignalinga (engl. Regulators of G protein Signaling - RGS) i oni zapravo vrše funkciju negativnihregulatora G protein signalinga zato što ubrzavaju i hidrolizu GTP-a redukuju vreme tokom kogefektor ostaje aktivan. Pored toga, guanin nukleotida izmenjiva ki factori (engl. Guaninenucleotide Exchange Factors - GEFs) favorizuju izmenu GDP/GTP. Aktivirani GPCR normalno

ima funkciju GEF za heterotrimerni G protein, zato što aktivacija GPCRzapravo promoviše izmenu GDP/GTP nukleotida. Alternativno, proteiniaktivatori G protein signalinga (engl. Activator of G protein Signaling -AGS) mogu aktivirati neke heterotrimerne G proteine nezavisno odreceptora, a neki AGS mogu imati GEF aktivnost.

Slika 3.2. Šematski dijagram funkcije GAP i GEF proteina.

Kao što je napomenuto, svi receptori koji preko G proteina transdukuju ekstracelularni signal doefektronih molekula na sli an na ina aktiviraju trimerne G proteine (Slika 3.3.). I G i Gsubjedinice su vezane za membranu preko kovalentno zaka enih lipida. U stanju mirovanja, tj.kada receptor nije aktiviran vezivanjem liganda, G je vezana za GDP i u kompleksu je sa G .Vezivanje normalnog hormonalnog liganda (npr. epinefrina) ili njegovog agoniste (npr.izoprotenerola) za receptor menja konformaciju receptora, prouzrokuju i njegovo vezivanje za G ,u takvom maniru, da se odvaja GDP od G a vezuje se GTP. Prema tome, aktivirani ligand-

70

vezuju i receptor funkcioniše kao GEF za G subjedinicu. Nakon izmene nukleotida, odnosnovezivanja GTP, G GTP kompleks se disociraod G subjedinice, ali i kompleks i subjedinicaostaju zaka eni/„usidreni” za membranu. Unajve em broju slu ajeva G GTP komplekspotom interaguje sa asociranim efektorinimproteinom i aktivira ga (Slika 3.3). Ovaaktivacija je kratkog veka ili tzv. kratko-žive aaktivacija, zbog toga što se GTP vezan za Gveoma brzo (za nekoliko sekundi) hidrolizuje uGDP. Ova hidroliza je katalizovana enzimskommolekulom koja je unutrašnji deoG subjedinice, pa se zato kaže da Gsubjedinica heterotrimernog G proteina imaunutrašnju GTPaznu aktivnost. Na taj na innastaje G GDP kompleks koji se veoma brzore-asocira sa G subjedinicom reforimraju iheterotrimerni G protein, te se na taj na inprekida/završava aktivacija efektora. Umnogim slu ajevima RGS ubrzavaju G -zavisnu GTP hidrolizu redukuju i time vremetokom koga efektor ostaje aktivan.

Slika 3.3. Operativni model ligand-indukovane ativacije efekto-rnih proteina asociranih sa GPCR.

G i G subjedinice heterotirmernog G proteina su pri vrš ene za membranupreko kovalentno zaka enih lipidnih molekula (izreckane crne linije). Vezivanjeliganda (1), pra eno disocijacijom G proteina (2), a potom izmenom GDP zaGTP (3), prouzrokuje da se slobodna G GTP vezuje i aktivira efektorniprotein (4). Hidroliza GTP-a vrši terminaciju signalinga i vodi ka ponovnomsklapanju/asocijaciji heterotrimerne forme, vra aju i time sistem u stanjemirovanja koje je bilo pre vezivanja liganda za receptor. Vezivanje drugogmolekula liganda prouzrokuje ponavljanje ciklusa. U nekim signalnim putevimaefekorni protein se aktivira slobodnom G subjedinicom.

71

U novije vreme je detektovana in vivo (u živim elijama) GPCR-posredovana disocijacijaheterotrimernog G proteina. U ovim istraživanjima je eksploatisan fenomen transferafluorescentne rezonantne energije (engl. Fluorescent Resonance Energy Transfer – FRET) kojimenja talasnu dužinu emitovane fluorescencije kada dva fluorescentna proteina interaguju.Ovakvim eksperimentalnim pristupom je mogu e demonstrirati i registrovati disocijaciju G Gheterotrimernog kompleksa tokom nekoliko sekundi nakon dodavanja liganda, a podaci dobijeni uovom in vivo modelu (živim i funkcionalnim elijama) dodatno potvrdjuju model G proteincikliranja izmedju aktivnog/on i inaktivnog/off stanja (Slika 3.4.). Ovakav generalniekspreimentalni protokol može biti koriš en za pra enje procesa formiranja i disocijacije i drugihprotein-protein kompleksa u živim elijama.

Slika 3.4. Receptorom-posredovana aktivacija G-proteina u živim elijama se dešava u toku nekoliko sekundi nakon vezivanja ligada.Ameba Dictyostelium discoideum je transfekovana genima koji kodiraju dva fuzionisana proteina: G je fuzionisan sa cijan fluorescentnim proteinom (engl. CianFluorescent Protein - CFP), mutantom zelenog fluorescentnog proteina (engl. Green Fluorescent Protein - GFP), dok je Gb subjeidnica fuzionisana sa drugomvarijantom GFP, žutim fluorescentnim proteinom (engl. Yellow Fluorescent Protein – YFP). CFP normalno fluorescira na 490-nm svetlosti; dok YFP normalnofluorecira na 527-nm svetlosti. A – kada su CFP i YFP blizu (kao u slu aju mirovanja tj. kada receptor nije okupiran ligandom i kada su G G u kompleksu) odigravase transfer fluorescentne energije izmedju CFP i YFP (levo). Kao posledica toga, iradijacija elija u stanju mirovanja sa 440-nm svetlosti (koja direktno ekscitira CFP,ali ne i YFP) prouzrokuje emisiju od 527-nm žute svetlosti koja je karakteristi na za YFP. Medjutim, ako vezivanje liganda pruzrokuje disocijaciju G G kompleksa iodvajanje G G subjedinica, ne dolazi do transfera fluorescentne energije. U ovom slu aju irradijacija elija sa 440-nm svetlosti prouzrokuje emisiju od 490-nmcrvene svetlosti karakteristi nu za CFP (desno). B - Plot emisije žute svetlosti (527 nm) od jedne transfekovane elije amebe pre i nakon dodavanja cAMP (strelicaozna ava momenat kada je cAMP dodat u sistem) koji je ekstracelularni ligand za GPCR u ovim elijama. Pad flurescencije koji je rezultat disocijacije G -CFPfuzionog proteina od G -YFP fuzinog proteina dešava se u toku nekoliko sekundi nakon dodavanja cAMP-a. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular CellBiology. WH Freeman and Company, gde je adaptirano od Janetopoulos i sar. (2001), Science 291:2408.).

3.1.2. Epinefrin se vezuje za nekoliko razli itih GPCR

Epinefrin je neobi no važan u posredovanju odgovora organizma na stresnu situaciju, kao što jestrah ili naporno vežbanje, kada sva tkiva imaju pove anu potrebu da katabolšu glukozu i masnekiseline i da produkuju ATP. Ovaj osnovni metaboli ki pokreta i osnovno »gorivo« organizma,može se dostaviti u cirkulaciju za par sekundi preko rapidne glikogenolize (razgradnje glikogena u

72

glukozu) u jetri, a takodje i brzom lipolizom (razgradnjom triglicerida do masnih kiselina uadipocitima tj. masnim elijama). Kod sisara je oslobadjanje glukoze i masnih kiselina aktiviranovezivanjem epinefrina (ili norepinefrina) za -adrenergi ne receptore na površini hepatocita iadipocita. Epinefrin vezan za -adrenegi ne receptore na miši nim elijama srca pove ava i brzinui snagu kontrakcije ovih elija, što doprinosi pove anju dopremanja krvi do tkiva. Suprotnoovome, vezivanje epinefrina za -adrenergi ne receptore eliija glatkih miši a intestinuma dovodido relaksacije glatke muskulature digestivnog trakta. Drugi tip epinefrinskih receptora, -arenergi ni receptori pronadjen je na elijama glatkih miši a koji obavijaju krvne sudovedigestivnog trakta, kože i bubrega. Vezivanjem epinefrina za ove receptore aktiviraju se signalniputevi koji prouzrokuju konstrikciju arterija, te na taj na in prekidaju cirkulaciju u ovimperifernim organima. Ovako razli iti efekti epinefrina su usmereni i vode ka zajedni kom cilju:obezbedjivanju i dopremanju energije za rapidne pokrete glavnih lokomotornih miši a kao odgovor nastres organizma.Iako su svi epinefrinski receptori GPCR tipa, signal od razlii itih tipova epinefrinskih receptorase prevodi preko razli itih G proteina. Prema tome, pored veoma zna ajnog fiziološkog

efekta/udela epinefrinskih receptora, oni su veomainteresantni i zbog toga što iniciraju veliki broj razli itihintracelularnih puteva transdukcije signala. Oba subtipa -adrenergi nih receptora, 1 i 2, su »kaplovani« (prevodesignal) preko stimulatornih G proteina (Gs) koji aktivirajumembranski-vezan enzim adenilil ciklazu (AC), koja kada jeaktivirana katalizuje sintezu sekundarnog glasnika cAMP.Dokaz da vezivanje epinefrina za -adrenergi ne receptoreindukuje porast cAMP može se dobiti u eseju safunkcionalnom ekspresijom cDNK koja kodira -adrenergi nirecepor (Slika 3.5.). Ukoliko se klonirana cDNK koja kodiragen za -adrenergi ni receptor transfekuje u receptor-negativne elije ( elije koje ne poseduju receptor),transfekovane elije e akumulirati cAMP kao odgovor nastimulaciju epinefrinom. Sli ni eksperimenti u kojima sumutantni receptori ekspresovani pomogli su da se definišefunkcija specifi nih aminokiselina u vezivanju i aktivacijirazli itih G proteina.

Slika 3.5. Esej funkcionalne ekspresije receptora na površni elije.

73

Dva subtipa -adrenergi nih receptora, 1 i 2, koriste za prenos signala razli ite G proteine. 1-adrenergi ni receptor je »kaplovan« sa Gi proteinom koji inhibiše aktivnost AC, dok je istiefektnorni enzim asociran i kao efektor za -adrenergi ni receptor, ali ga aktivacija -adrenergi nog receptora aktivira. Suprotno 1-adrenergi nom receptoru ijom aktivacijom seinhibiše efektorni protein (AC), aktivacija -adrenergi nog receptora i prenošenje signala prekoGq proteina prozrokuje aktivaciju razli itih efektornih enzima koji generišu razli itesekundrne glasnika, a koji potom aktiviraju razne druge puteve transdukcije signala.

Neki bakterijski toksini imaju subjedinice koje penetriraju kroz plazma membranu elija ikatališu hemijsku modifikaciju Gs GTP kompleksa koja prevenira hidrolizu vezanog GTP-a u GDP.Kao posledica spre avanja hidrolize, Gs ostaje u aktivnom stanju, te kontinualno aktivira AC i uodsustvu hormonske stimulacije. Kolera toksin koji je produkt aktivnosti bacila Vibrium cholera ienterotoksini produkovani od strane odredjenih posebnih sojeva E.coli imaju sposobnost dakatališu hemijsku modifikaciju Gs GTP kompleksa i time inhibišu hidrolizu GTP u intestinalnimepitelijalnim elijama. Posledi no veoma veliko i brzo pove aje intracelularnog nivoa cAMP vodi kagubitku elektrolita i vode u intestinalni lumen i rezultira vodenom dijarejom karakteristi nom zainfekciju ovim bakterijama. Bordela pertussis, bakterija koja obi no inficira respiratorni trakt,produkuje pertusis toksin koji katalizuje modifikaicju Gi koja prevenira otpuštanje vezanogGDP-a, te prema tome zaklju ava/blokira Gi u inaktivnom stanju. Ova inaktivacija Gi vodipove anju koncnetracije cAMP u epitelijalnim elijama vazdušnih puteva, što promoviše gubitakfluida i elektrolita i mukoznu sekreciju.

3.1.3. Identifikovani su kriti ni funkcionalni domeni receptora i vezanog G-proteina

Kao što je napomenuto ranije, svi GPCR sadrže sedam transmembranskih heliksa kojinajverovatnije imaju sli nu trodimenzionalnu strukturu. Istraživanja sa himernim adrenergi nimreceptorima (Slika 3.6.) sugerišu da je duga ka C3 petlja izmedju heliksa 5 i 6 veoma važna zainterakciju izmedju receptora i njegovog G proteina »prenosnika«, odnosno G proteina za koji jeGPCR kuplovan. Smatra se da vezivanje liganda prouzrokuje da se ovi heliksi pomeraju bližejedan prema drugome, što rezultira da C3 petlja, koja povezuje ova dva heliksa, promenikonformaciju u smislu da je omogu eno petlji da vezuje i aktivira transdukuju u G subjedinicu.Smatralo se da specifi ni regioni u okviru C3 petlje konzervišu unikatnu tro-dimenzionalnustrukturu karakteristi nu za sve receptore koji vezuju isti G protein (npr. Gs ili Gi). Neki drugi

74

rezultati ukazuju da C2 petlja koja povezuje helikse 3 i 4takodje ima udela u interakciji nekih receptora sa Gproteinima i da rezidue sa bar etiri transmembranskaheliksa participiraju u vezivanju liganda.

Slika 3.6. Istraživanja u kojima su koriš eni himerni adrenergi ni receptoriidentifikovala su da je duga ka C3 petlja kriti na za interakciju sa G proteinima.U oocite Xenopusa je mikroinekcijom uba ena mRNA koj kodira divlji/normalni tip (engl. wild type) 2-adreneri nog, 2-adrenergi nog, ili himernog - receptora. Iako oociti Xenopusa normalno neekspresuju adrenergi ne receptore, oni ekspresuju G proteine koji mogu da prenose signal sa stranihreceptora ekspresovanih na površni oocite koja je primila mikroinekciju. Determinisana je aktivnostadenilil ciklaze u eliji koja je dobila mikroinekciju, a u uslovima kada je bio prisutan agonistaepinefrinskih receptora, što je ukazivalo na to da li je adrenergi ni receptor vezan za stimulatorni (Gs) iliinhibtorni (Gi) tip G proteina oocite. Poredjenje himernog receptora 1 koji interaguje sa Gs, sa himernimreceptorom 2 koji interaguje sa Gi, pokazalo je da je specifi nost G proteina determinisana prvenstvenoizvorom citosolu-okrenute C3 petlje izmedju -heliksa 5 i 6. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Kobilka i sar. (1988), Science278:1907.).

X-»ray« kristalografska analiza (engl. X-ray crystallographic analysis) je precizirala regione uGs GTP kompleksu koji interaguju sa AC. Adenilil ciklaza jeprotein iji domeni nekoliko puta prolaze kroz plazmamembranu te se zato naziva »multipassing«transmembranski protein sa dva velika citosolna segmentakoja sadrže kataliti ke domene (Slika 3.7A.).

Slika 3.7. Strukutra sisarskih adenilil ciklaza (ACs) i njihova interakcija sa Gs GTP.A – Šematski dijagram sisarskih ACs. Membranski-vezani enzim sadrži dva ista kaltaliti ka domena nacitosolu-okrenutoj strani membrane, kao i dva integralna domena, za koje se smatra da svaki od njihsadrži šest transmembranskih heliksa. B – Trodimenzionalna struktura Gs GTP kompleksovanogsa dva fragmenta koja okružuju kataliti ki domen AC determinisan x-ray kristalografijom. 3- 5 petlja iheliks u izmenjiva kom regionu II Gs GTP kompleksa interaguju simulatano sa specifi nim regionimaAC. Tamnije obojeni deo Gs je GTPazni domen koji je sli ne strukture kao kod Ras-a (videti sliku2.6.), dok je svetliji deo heli ni domen tj. domen sa heliksima. Forskolin zaklju ava/imobiliše/drži dvafragmenta AC u njihovoj aktivnoj konformaciji. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular CellBiology. WH Freeman and Company; A – videti Tang & Gilman (1992), Cell 70:869; B –adaptirano od Tesmer i sar (1997), Science 278:1907.).

75

S obzirom da je membranske proteine kakva je AC veoma teško, skoro nemogu e kristalisati ucelosti, nau nici su pripremili dva proteinska fragmenta koja okružuju kataliti ke domene AC idozvoljavaju im da se asociraju u prisustvu Gs GTP i forskolina, što stabiliše kataliti kefragmente AC u njihovoj aktivnoj konformaciji. Formirani kompleks je kataliti ki aktivan ipokazuje farmakološke i biohemijske karakteristike sli ne onima koje ima intaktna AC potpunedužine. U ovom kompleksu, dva regiona Gs GTP, izmenjiva II heliks i 3- 5 petlja, stupaju ukontakt sa fragmentima AC (Slika 3.7B.). Kao što je ranije napomenuto (videti prethodnopoglavlje), izmenjiva II je jedan od segmenata G proteina ija se konformacija menjaizmenjivanjem GDP/GTP nukleotida, tj. izmenjiva II segment ima jednu konformaciju kada jevezan GDP,a drugu kada je vezan GTP (videti sliku 2.6.). GTP-indukovana konformacija Gs kojafavorizuje njenu disocijaciju od G je zpravo i preciznije konformacija Gs koja je esencijalna zavezivanja Gs za AC. Neka istraživanja ukazuju da se Gi vezuje za neki drugi region AC koji jeodgovoran za njegov razli iti efekat na efektore.

Da bi razumeli kako vezivanje Gs GTP kompleksa promoviše aktivnost AC, nau nici e prvomorati da reše strukturu kataliti kih domena AC u njihovom inaktivnom stanju (u odsustvuvezanog Gs GTP kompleksa). Jedna od hipoteza je da vezivanje heliksa izmenjiva a II u pukotinujednog kataliti kog domena AC prouzrokuje rotaciji drugog kataliti kog domena. Hipotetiše se daova rotacija vodi stabilizaciji tranzicionog stanja, a posledica je stimulacija kataliti ke aktivnost.

3.1.4. Adenilil ciklaza je simulisana/ inhibisana razli itim ligand-receptor kompleksima

Raznovrsni G proteini omogu avaju razliitim ligand-receptor kompleksima da modulišu aktivnostistog efektora. Na primer, u jetri se glukagon i epinefrin vezuju za razli ite receptore, ali obareceptora interaguju i aktiviraju isti Gs protein, što aktivira AC, a potom kao posledicu ima iaktivaciju istog metaboli kog odgovora. Aktivacija AC, pa prema tome i nivo cAMP, suproporcionalni totalnoj koncentraciji Gs GTP kompleksa koji nastaje kao rezultat vezivanja obahormona za njihove odgovaraju e receptore.

Pozitivna i negativna regulacija aktivnosti AC se dešava u nekim tipovima elija, a time seobezbedjuje fino podešavanje kontrole nivoa cAMP-a. Na primer, stimulacija adipocita epinefrinomili glukagonom ili sa ACTH, aktivira AC, dok prisustvo prostaglandina PGE1 ili adenozina inhibišeAC (Slika 3.8.). Receptori za prostaglandin PGE1 i adenozin interaguju sa inhibitornim Gi

76

heterotrimernim proteinom koji ima iste i subjedinice kao i stimulatorni Gs heterotrimerniproteina, ali razli itu subjedinicu (Gi ). Kao odgovor na vezivanje inhibitornog liganda za njegovreceptor, asocirani Gi protein otpušta svoj vezani GDP i vezuje GTP, što prouzrokuje da aktivniGi GTP kompleks potom disocira od G subjedinice i inhibiše (radije nego što stimuliše) AC.

Slika 3.8. Ligandima-indukovana aktivacijai inhibicija AC u adipocitima.

Vezivanje liganda za Gs-»kaplovane« receptoreprouzrokuje aktivaciju AC, dok vezivanje liganda zaGi-»kaplovane« receptore prozrokuje inhibiciju AC.G subjedinica kod oba heterotrimerna G proteina,i kod stimulatornog (Gs) i kod inhibitornog (Gi) jeidenti na, ali su njihove G subjedinice razli ite,kao i njen korespondiraju i receptor. Ligandom-stimulisano formiranje G GTP kompleksa sedešava istim mehanizmima u oba heterotrimerna Gproteina, i Gs i Gi proteinu (videti sliku 3.6.).Medjutim, nakon formiranja G GTP kompleksa,Gs GTP kompleks i Gi GTP kompleks razli itointeraguju sa AC, te tako jedan stimuiše, a drugiinhibiše kataliti ku aktivnost AC. (Preuzeto iz Lodishi sar. (2004): Molecular Cell Biology. WHFreeman and Company; videti Gilman(1984), Cell 36:577.).

3.1.5. cAMP-zavisna aktivacija PKA posreduje raznolike odgovore u razli itim elijama

Kod više elijskih životinja skoro svi raznovrsni efekti cAMP-a su posredovani preko proteinkinaze A (PKA) koja se još naziva i cAMP-zavisna protein kinaza. Kao što je ranije napomenuto(videti u poglavlju 2, sekciju 2.2.2.2.), inaktivna PKA je tetramer koji se sastoji od dve regulatornei dve kataliti ke subjedinice. Svaka regulatorna subjedinica ima dva odvojena cAMP-vezuju amesta. Vezivanje cAMP za oba mesta u regulatornoj subjedinici vodi ka otpuštanju asociranekataliti ke subjedinice, što ini dostupnim tj. razotkriva kataliti ko mesto i aktivira njegovukinaznu aktivnost (videti sliku 2.11). Vezivanje cAMP za regulatornu subjedinicu se dešava ukooperativnom maniru, pri emu vezivanje prvog molekula cAMP smanjuje Kd za vezivanje drugog.Zbog toga male promene u nivou citosolnog cAMP-a mogu prouzrokovati proporcionalno velikepromene u koli ini disociranih kataliti kih subjedinica, a time i u njihovoj kinaznoj aktivnosti.Rapidna aktivacija enzima preko hormonom-indukovane disocijacije inhibitora je uobi ajenakarakteristika razli itih puteva intracelularne transdukcije signala.

77

Ve ina sisarskih elija ekspresuje GPCR tip recepora. Stimulacija ovih receptora razli itimhormonima, ali i drugim ligandima, vodi aktivaciji PKA, ali rezultiraju i odgovor elije zavisi odta no odredjene PKA izoforme, kao i od PKA supstrata/efektora koji su ekspresovani u eliji. Naprimer, efekti epinefrina na metabolizam glikogena koji su posredovani preko cAMP i PKA sulocirani uglavnom u elijama jetre i miši a koje ekspresuju enzime za stvaranje i degradacijuglikogena. U adipocitima epinefrinom-indukovana aktivacija PKA promoviše fosforilaciju iatkivaciju fosfolipaze koja katališe hidrolizu deponovanih triglicerida, što doprinosi stvaranjuslobodnih masnih kiseina i glicerola. Ove slobodne masne kiseline se otpuštaju u cirkulaciju ipreuzimaju i koriste kao izvor energije u elijama drugih tkiva kao što je bubreg, srce i miši i.Sli no, gonadotropinima-indukovana stimulacija GPCR u elijama ovarijuma vodi aktivaciji PKA,što kao posledicu ima promovisanje sinteze dva steroidna hormona, estrogena i progesterona, kojisu krucijalni za razvoj ženskih seksualnih karakteristika.

Kao što je i ranije napomenuto (videti u poglavlju 2, sekciju 2.2.2.2.), iako PKA deluje na razli itesubstrate u razli itim tipovima elija, ovaj enzim uvek fosforiliše serinski (Ser) ili treoninski (Thr)ostatak u okviru iste sekvence motiva: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)- , gde X ozna ava bilo kojuaminokiselinu, a ozna ava hidrofobnu aminokiselinu.

3.1.6. Hormonom-indukovana aktivacija PKA reguliše metabolizam glikogena

Prvi elijski odgovor posredovan preko cAMP koji je otkriven je bio oslobadjanje glukoze odglikogena koje se dešava u miši nim elijama i u elijama jetre koje su stimulisane epinefrinom ilinekim drugim hormonom/ligandom iji receptori prevode signal preko Gs proteina. Ovaj odgovordaje primer kako aktivacija PKA može da koordiniše grupu intracelularnih enzima da obavljajufunkciju koja ima zajedni ku svrhu i vodi prema zajedni kom cilju.

Glikogen, veliki polimer glukoze, je glavni depo glukoze u animalnim elijama. Kao i svibiopolimeri, glikogen se sintetiše kataliti kim delovanjem jednog seta enzima, a razgradjuje sekataliti kim delovanjem drugog seta enzima. Tri enzima konvertuju glikogen u uridindifosfoglukozu (UDP-glukoza), primarni intermedijer sinteze glikogena. Glukozna rezidua UDP-glukoze se premešta glikogen sintazom na slobodnu hidroksilnu grupu ugljenika 4 glukoznerezidue na kraju rastu eg lanca glikogena. Degradacija glikogena uklju uje postepeno (ukoracima) uklanjanje rezidua glukoze, od istog kraja, reakcijom fosforolize katalizovane glikogen

78

fosforilazom, pri emu sedobija glukoza 1-fosfat (Slika3.9.). I u elijama miši a i uelijama jetre (hepatocitima),

glukoza 1-fosfat produkovanarazgradnjom glikogena, sekonvertuje u glukozu 6-fosfat.

Slika 3.9. Sinteza i degradacija glikogena.Inkorporacija glukoze od UDP-glukoze u glikogenje katalisana glikogen sintazom. Uklanjanjeglukoznih jedinica iz glikogena je katalisanoglikogen fosforilazom. Zbog toga što dva razli itaenzima katališu formiranje i degradaciju glikogena,ove dve reakcije mogu biti nezavisno regulisane.

U miši nim elijama ovaj metabolit ulazi u glikoliti ki put i metabolizira se da bi generisao ATPneophodan za procese miši ne kontrakcije i relaksacije. Za razliku od miši nih elija, hepatocitiimaju fosfatazu koja hidrolizuje glukozu 6-fosfat u glukozu koja se eksportuje iz heptocita delomtransporterom glukoze (GLUT2) u plazma membrani. Prema tome, depoi glikogena u jetri seprvenstveno razgradjuju u glukozu, koja se odmah otpušta u cirkulaciju i transportuje u drugatkiva, prvenstveno u miši no i nervno tivo.

Epinefrinom-stimulisano pove anje cAMP-a i posledi na aktivacija PKA poja ava konverzijuglikogena u glukozu 1-fosfat na dva na ina: inhibicijom sinteze glikogena i stimulacijomdegradacije glikogena (Slika 3.10A). PKA fosforiliše, a time i inaktiviše glikogen sintazu, enzimkoji sintetiše glikogen. Pored toga, PKA promoviše degradaciju glikogena indirektno,fosforilacijom, a time i aktivacijom intermedijerne kinaze, tzv. glikogen fosforilaze kinaze (engl.Glicogen Phosphorylase Kinase - GPK), koja potom fosforiliše i aktivira glikogen fosforilazu (engl.Glicogen Phosphorylase - GP), enzim koji razgradjuje glikogen. Ceo proces se »obrne« u drugomsmeru kada se epinefrin ukloni i kada nivo cAMP-a padne. Ovaj obrnuti proces je posredovan

79

fosfoprotein fosfatazom (engl. Phosphoprotein Phosphatase - PP), koja uklanja fosfatne reziduesa inaktivne forme glikogen sintaze, te je na taj na in aktivira, a istovremeno uklanja ostatkefosfata i sa glikogen fosforilaze kinaze i glikogen fosforilaze, te ih na taj na in inaktiviše (Slika3.10B.).

Slika 3.10. cAMP-zavisna regulacija metabolizma glikogena u elijama jetre i miši a .Inaktivni enzimi su u svetlijim poljima, a aktivni enzimi su u tamnijim poljima. A – Pove anje nivoa citosolnog cAMP-a aktivira PKA koja direktno inhibiše sintezuglikogena i istovremeno, indirektno, promoviše razgradnju glikogena preko kaskade protein kinaza. Pri viskom nivou cAMP-a, PKA takodje fosforiliše inhibitor PP.Vezivanje fosforilisanog inhibitora za PP spre ava ovu fosfatazu da defosforiliše enzime aktivirane u kaskadi protein kinaza ili inaktivnu glikogen sintazu. B –Smanjenje nivoa cAMP inaktivira PKA, što prouzrokuje oslobadjanje aktivne forme PP, a aktivnost ovog enzima promoviše sintezu glikogena i inhibiše razgradnjuglikogena u obrnutoj reakciji od one koja je opisana za porast nivoa citosolnog cAMP-a.

Fosfoprotein fosfataza je takodje regulisana preko PKA. Pri viskom nivou cAMP-a, PKA takodjefosforiliše inhibitor fosfoprotein fosfataze. Vezivanje fosforilisanog inhibitora za PP spre ava ovufosfatazu da defosforiliše enzime aktivirane u kaskadi protein kinaza ili inaktivnu glikogensintazu. Pri niskom nivou cAMP-a, kada je PKA inaktivna, inhibitor fosforprotein fosfataze nijefosforilisan te ne inhibiše kinaznu aktivnost fosfoprotein fosfataze i ona je aktivna tj. sposobna jeda uklanja fosfatne ostatke sa enzima aktiviranih u kaskadi protein kinaza (time ih inhibiše, štoprouzrokuje inhibiciju razgradnje glikogena), ali i sa inaktivne glikogen sintaze (time je aktivira,

80

što prouzrokuje stimulaciju sinteze glikogena). Kao rezultat, sinteza glikogena katalisana glikogensintazom je poja ana, a razgradnja glikogena katalisana glikogen fosforilazom je inhibisana.

Prema tome, epinefrinom-indukovana glikogenoliza ispoljava dvostruku regulaciju: aktivacijuenzima koji katališu degradaciju glikogena i inhibiciju enzima koji favorizuju sintezu glikogena.Ovakva koordinisana regulacija stimulatornih i inhibitornih puteva transdukcije signalaobezbedjuje efikasan mehanizam za dostizanje odredjenih elijskih odgovora i uobi ajeni jefenomen u biologiji regulacije fizioloških procesa.

3.1.7. Amplifikacija signala se uglavnom dešava u donjem delu signalnog puta

elijski odgovor indukovan GPCR-zavisnom aktivacijom AC može zahtevati desetine, stotine,hiljade, pa i milione cAMP molekula po eliji. Stoga je neophodno da eksternalni signal budeamplifikovan u cilju generisanja dovoljnog broja molekula sekundarnog glasnika od nekolikohiljada receptora za odredjeni hormon prisutnih na eliji. Amplifikacija signala je mogu a zbogtoga što i receptor i G protein mogu da difunduju rapidno u membrani. Jedan kompleks receptor-hormon prouzrokuje konverziju preko 100 inaktivnih molekula Gs u aktivnu formu. Svakaaktivna forma Gs GTP potom aktivira verovatno jedan molekul AC, ali koji potom katališe sintezui produkciju velikog broja cAMP molekula tokom vremena u kome je Gs GTP vezana za molekulAC. Iako je veoma teško izmeriti ta no pove anje amplifikacije, vezivanje jednog molekula ligandaza jedan molekul GPCR može rezultirati sintezom bar nekoliko stotina cAMP molekula pre negošto se kompleks receptor-ligand disocira i prekine se aktivacija AC. Verovatno se sli naamplifikacija odvija i u signalingu vezanom za druge heterotrimerne G proteine, ali i druge tipove

receptora ija aktivacija prouzrokuje sintezusekundarnog glasnika (prvi nivo amplifikacije). Druginivo amplifikacije je ilustrovan cAMP-posredovanomsitmulacijom glikogenolize (Slika 3.11. i Slika 3.12.).

Slika 3.11. Amplifikacija eksternalnog signala u donjim delovima (»down- stream«) signalnog puta od receptora na površini elije.

A – Šematski prikaz amplifikacije prilikom vezivanja jednog molekula epinefrina. Vezivanjejednog molekula epinefrina za jedan GPCR indukuje sintezu velikog broja cAMP molekula ito je prvi nivo amplifikacije (nivo sekundarnog glasnika). etiri molekula cAMP-a aktivirajudva molekula PKA, ali svaki aktivirani molekul PKA fosforiliše i aktivira veliki broj molekula.Ovaj drugi nivo amplifikacije može da uklju uje nekoliko povezanih reakcija u kojima produktjedne reakcije aktivira enzim koji katalizuje slede u reakciju. Što je više koraka/faza uovakvoj signalnoj kaskadi, ve a je mogu nost amplifikacije signala.

81

Kao što je napomenuto cAMP promoviše degradaciju glikogena preko tri-nivoa kaskada koje suserije reakcija u kojima je enzim koji katališe jedan korak (jednu reakciju) aktiviran ili inibisanproduktom prethodnog koraka (prethodne reakcije). Amplifikacija koja se odvija u ovakvoj kaskadizavisi od broja koraka (kaskadnih) reakcija u njoj. Na primer, nivo epinefrina u cirkulaciji oko 10-

11 M može stimulisati glikogenolizu i oslobadjanje glukoze u jetri. Epinefrinski stimulus ovakvemagnitude generiše intracelularni cAMP koncentracije 10-6 M, što je amplifikacija od 104. Zbog

toga što moraju pro i trinaredna koraka do otpu-štanja glukoze, može sedogoditi još jedna doda-tna amplifikacija od 104

M. U popre no-prugastojmuskulaturi su konce-ntracije tri sukcesivnaenzima u glikogenoliti-koj kaskadi (PKA – gli-

kogen fosforilaze kinaze –glikogen fosforilaze) uodnosu 1:10:240, štodramati no ilustrujeamplifikacione efekte epi-nefrina i cAMP-a (Slika3.11. i Slika 3.12.).

Slika 3.12. Šematski prikazamplifikacije na primeruepinefrinom-regulisane razgradnjeglikogena.

Iako ovakve kaskade mogu izgledati previše komplikovane one ne samo da u velikoj meriamplifikuju eksternalni signal, nego takodje, dozvoljavaju celoj grupi enzimski-katalisanihreakcija da budu koordinisano regulisane preko jednog tipa singalnog molekula. Pored toga, velikibroj koraka/reakcija izmedju stimulusa i finalnog odgovora pruža mogu nost za regulaciju prekodrugih signalnih puteva, te time omogu ava precizno regulisanje, kao i fino podešavanje elijskogodgovora. Drugi primeri kaskada signalnih puteva bi e predstavljeni u drugim sekcijama.

82

3.1.8. Nekoliko mehanizama reguliše signalning od GPCRs

Kao što je ranije napomenuto (videti u poglavlju 1, sekciju 1.2.9.) ciljne elije koriste razli itemehanizme da postanu neosetljive ili manje osetljive (da se desenzitivišu), odnosno da seadaptiraju kada su izložene velikoj koncetraciji stimulišu eg liganda duži period (videti sliku 1.31.u poglavlju 1). Ovde e biti diskutovani samo oni mehanizmi koji su uklju eni u promenu funkcijereceptora koji su vezani za G proteine. GPCRs se desenzitivišu na tri generalna na ina: (1)Inaktivacijom receptora – promena receptorne molekule u smislu da ne može više da interagujesa G proteinima. (2) Odvajanjem/”seqvestracijom” receptora – receptori mogu da buduprivremeno uklonjeni internalizacijom te tako više nisu dostupni ligandima. (3) Down-regulacijom receptora - receptori mogu da budu uništeni u lizozomima nakon internalizacije. Usvim slu ajevima proces desenzitivizacije zavisi od fosforilacije receptora preko PKA, PKC ililanova familije kinaza receptora vezanih za G proteine (engl. G Protein-linked Receptor Kinases -

GRKs). GRKs fosforilišu ve i broj serina i treonina na receptoru, ali samo kada je receptor veokupiran ligandom. GRKs uklju uju i rodopsin-specifi ne kinaze uklju ene u desenzitivzacijurod-fotoreceptora. Kao i kod rodopsina, kada je receptor jednom fosforilisan na ovaj na in vezujese sa velikim afinitetom za protein koji je lan arestinske familije proteina (Slika 3.13.). Vezaniarestin može da doprinosi procesu desenzitivizacije na bar dva na ina: (1) Inaktivišereceptor i spre ava njegovo vezivanje za G protein, ime je onemogu ena uloga G proteina kaoprenosnika signala sa receptora (engl. receptor uncupling). (2) Može da ima ulogu adapternogproteina i vezivati receptor za klatrinom-obložene jamice, indukuju i na taj na in receptorom-posredovanu endocitozu. Endocitoza rezultira ili odvajanjem (engl. sequestration) ilidegradacijom/”down”-regulacijom receptora, a što zavisi od specifi nosti receptora i tipa elije,koncentracije stimulišu eg liganda, kao i dužine trajanja prisustva liganda.

Slika 3.13. Uloga GRKs i arestina u desenzitivizaciji receptora.Vezivanje arestina za fosforilisani receptor spre avavezivanje receptora za njegov G protein i može daga usmerava u pravcu receptorom-posredovaneendocitoze. Miševi koji su deficitarni u jednoj formiarestina nemaju sposobnost desenzitivizacije kaoodgovor na prolongiranu stimulaciju morfinom, štopotvrdjuje zna ajnu ulogu arestina u procesimadesenzitivizacije.

83

Nekoliko faktora uzima u eš e u prekidu (terminaciji) odgovora na ligande koji su prepoznati -adrenergi nim receptorima, kao i drugim GPCR vezanim za Gs. Prvo, afinitet receptora za ligandopada kada se GDP vezan za Gs zameni sa GTP, a što prati vezivanje liganda. Ovo pove anje Kd

receptor-ligand kompleksa poja ava disocijaciju liganda od receptora. Drugo, GTP vezan za Gs seveoma brzo hidrolizuje, te se ukida stimulus za aktivaciju AC, a time i produkciju cAMP-a.Tre e, cAMP-zavisne fosfodiesteraze (engl. PhosphoDiEsterases - PDEs) katališu hidrolizu cAMPna 5’-cAMP, te na taj na in iniciraju terminaciju elijskog odgovora. Prema tome, kontinualnoprisustvo liganda/hormona u koncentraciji dovoljno visokoj je neophodno ua kontinualnuaktivaciju AC i održavanje pove anog nivoa cAMP-a. Ako koncentracija liganda dovoljno opadne,elijski odogovor se veoma brzo prekida.

Kao što je napomenuto, kada je Gs GPCR izložen stimulaciji ligandom/hormonom nekolikoasova, nekoliko rezidua serina i treonina u citosolnom domenu receptora biva fosforilisano od

strane PKA. Fosforilisani receptor može da veže svoj ligand, ali vezivanje liganda vodi redukovanojaktivaciji AC, odnosno receptor je manje osetljiv ili ak neosetljiv tj. desenzitivisan. Ovo je tipi anprimer povratne supresije u kojoj jedan od krajnjih produkata signalnog puta (u ovom slu ajuPKA) blokira rani korak u signalnom putu (u ovom slu aju aktivaciju receptora). Zbog toga što jeaktivnost PKA poja ana visokim koncentracijama cAMP-a koje su indukovane svakim ligandomkoji može da aktivira Gs, produženo izlaganje ovakvim ligandima, recimo epinefrinu, prouzrokujedesenzitizaciju ne samo -adrenergi nih receptora, nego i GsPCRs koji vezuju druge ligande (npr.glukagon). Ovakva unakrsna regulacija (engl. kross-regulation) se zove heterolognadesenzitivizacija.

Pored navedenih, dodatne rezidue u citosolnom domenu -adrenergi nog receptora se fosforilišukataliti kim delovanjem receptor-specifi nog enzima koji se zove kinaza -adrenergi nogreceptora (engl. Beta-Adrenergic Receptor Kinase - BARK), ali ova fosforilacija je mogu a jedinoukoliko je epinefrin ili agonista vezan za receptor tj. jedino ukoliko je receptor okupiran ligandom.S obzirom da BARK fosforiliše jedino aktivirani -adrenergi ni receptor ovaj proces se zovehomologna desenzitivizacija. Prolongiran tretman elija epinefrinom prouzrokuje ekstenziranufosforilaciju a time i desenzitivizaciju -adrenergi nih receptora i preko PKA i preko BARK.

Fosforilisani (desenzitivisani) receptori se konstantno ponovo senzitivišu (resenzitivišu se),odnosno vra aju se u provobitno stanje osetljivosti, zahvaljuju i defosforilaciji katalisanojkonstitutivno aktivnim fosfatazama. Prema tome, broj fosfata po receptornom molekulu reflektuje

84

koliko dugo je ligand vezan za receptor u bliskoj prošlosti (npr. 1-10 minuta). Ovo zna i da ako jeelija konstantno izložena odredjenoj koncentraciji hemijskog medijatora (npr. hormona), ta

koncentracija bi eventualno prekinula da stimuliše receptor. Ukoliko se koncentracija horomonapotom pove a na novu vrednost, receptor e aktivirati dalje signalne puteve, ali mnogo manje negou slu aju da je elija bila u medijumu bez hormon i da je ovaj medijum bez hormona zamenjen samedijumom koji sadrži ovu odredjenu koncentraciju hormona. Ukoliko se hormon kompletnoukloni, receptor postaje kompletno defosforilisan i vra a se (»resetuje se«) u stanje maksimalneosetljivosti u kojem može da odgovara na veoma niske nivoe liganda. Prema tome, povratna spregakoja uklju uje fosforilaciju i defosforilaciju receptora moduliše aktivnost -adrenergi nih i drugihsli nih receptora tipa GPCRs, dozvoljavaju i time eliji da podesi senzitivnost receptora premanivou liganda kojim je stimulisana.

Kao što je napomenuto, klju ni u esnik u regulaciji GPCRs su proteini iz familije arestina. Jedanod lanova ove familije, -arestin je uklju en u regulaciju -adrenegri nih receptora. -arestin jecitosolni protein koji se vezuje za receptore koji su produženo fosforlisani BARK i kompletnoinhibiše interakciju receptora sa Gs, odnosno njihovu sposobnost da aktiviraju Gs. Pokazano jeda overekspresija BARK i -arestina prouzrokuje gubitak -adrenegri nih receptora sa površineelije, što dodatno ukazuje na važnost funkcije -arestina u regulaciji receptora sa površine elije.

Potvrdjeno je da se -arestin ne veže samo za fosforilisane receptore, nego i za klatrin, kao i zaasocirani protein koji se zove AP2, a oba su esencijalne komponente obloženih vezikula koje suomogu avaju jedan tip endocitoze. Ova interakcija -arestina sa receptorom, ali i sa klatrinom iAP2 promoviše formiranje tzv. obloženih jamica (engl. coated pits) i endocitozu asociranogreceptora, te na taj na in smanjuje broj receptora izloženih na površini elije (Slika 3.14.).

Slika 3.14. Uloga -arestina u GPCR desenzitivizaciji i signalnojtransdukcije.

-arestin se vezuje za fosforilisane serinske i treoninske ostake C-terminalnogsegmenta GPCRs. Klatrin i AP2, dva druga proteina koja su vezana -arestinom,favorizuju endocitozu receptora. Pored toga, -arestin ima funkciju u transdukcijisignala od aktiviranog receptora zbog toga što se vezuje za nekoliko citosolnih proteinkinaza i aktivira ih. c-Src aktivira signalnu transdukciju preko MAP kinaze signalnogputa, što vodi fosforilaciji klju nih transkripcionih faktora. Interakcija -arestina sa tridruga proteina koja uklju uju JNK-1 (engl. Jun N-terminal Kinse) rezultira fosforilacijomi aktivacijom c-Jun transkripcionog faktora. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptirano od Miller &Lefkowitz (2001), Curr Opin Cell Biol 13:139 and Pierce i sar. (2002), NatureRev Mol cell Biol 3:639.).

85

U nekim slu ajevima, eventualno, internalizovani receptori postaju defosforilisani u endozomima,-arestin se disocira, i receptor se ponovo senzitiviše (resenzitiviše) tj. ponovo postaje osetljiv i

reciklira se na površinu elije. Smatra se da regulacija drugih GPCRs takodje uklju ujeendocitozu ligadom-okupiranog receptora i njegovo odvajanje unutar elije.

Kao što e kasnije biti opisano detaljnije, -arestin takodje funkcioniše i kao adapterni protein utransdukciji signala od GsPCRs u nukleus. Višestruka funkcija -arestina ilustruje važnostadapternih proteina i u transdukciji signala od receptora sa površine elije, ali i u regulacijisignalne transdukcije od receptora sa površine elije.

3.1.9. Proteini za „usidravanje“ lokalizuju efekat cAMP na specifi ne subcelularne regione

U mnogim tipovima elija, pove anje nivoa cAMP-a može da produkuje odgovor koji je potreban ujednom delu elije, ali je istovremeno, nepotreban, ili ak remeti fiziološke procese u drugom deluelije. Familija proteina za „usidravanje” lokalizuje PKA izoforme na specifi ne subcelularne

lokalizacije, te time ograni ava cAMP-zavisne odgovore na ove lokacije. Ovi proteini koji lokalizujuPKA se nazivaju proteini povezani sa A kinazom (engl. A Kinase-Associated Proteins – AKAPs).AKAPs imaju dva domena, od kojih je jedan odgovoran za specifi nost subcelularne lokalizacije, adrugi za vezivanje sa regulatornom subjedinicom PKA.

Jedan od proteina za „usidravanje” (AKAP15) je zaka en/sputan za citosolu-okrenutu stranuplazma membrane nekih elija sr anog miši a, i to pored ta no odredjenog tipa Ca2+ kanala ijeje otvaranje regulisano. Epinefrinom-indukovana aktivacija -adrenergi nih receptora u srcu (kaodeo odgovora „borba-ili-beg”; engl. „fight-or-flight”)vodi ka PKA-katalizovanoj fosforilaciji ovih Ca2+

kanala, prouzrokuju i njihovo otvaranje, a posledica toga je influks Ca2+ koji pove ava brzinu isnagu kontrakcije sr anog miši a. Interakcija AKAP15 sa PKA lokalizuje PKA veoma blizu ovihCa2+ kanala, te time redukuje vreme koje bi ina e bilo potrebno da za difuziju katalitit kihsubjedinica PKA sa mesta gde se one generišu do mesta gde se nalazi njihov supstrat tj. Ca2+

kanala u ovom slu aju.

Još jedan protein koji je u elijama sr anog miši a asociran sa A kinazom je mAKAP, kojika i/„usidrava” i PKA i cAMP-zavisnu fosfordiesterazu (engl. PhosphoDiEsterase - PDE) zaspoljašnju membranu nukleusa. Zbog bliskog su eljavanja PDE i PKA, negativna povratna sprega

86

obezbedjuje blisku lokalnu kontrolu nivoa cAMP-a, a time i regualciju aktivnost PKA (Slika 3.15).Pored toga, lokalizacija PKA blizu nuklearne membrane facilitira ulazak kataliti kih subjedinica unukleus gde one fosforilišu i aktiviraju odredjene transkripcione faktore (videti u sekciji 3.5.).

Slika 3.15. Lokalizacija protein kinaze A (PKA) u nuklearnoj membrani elija sr anog miši a.mAKAP ka i/ »usidrava« i PKA i cAMP-zavisnu PDE za membranu nukleusa, održavaju i ih u negativnoj povratnoj sprezi koja obezbedjuje blisku lokalnu kontrolunivoa cAMP-a.1 – Bazalni nivo aktivnosti PDE u odsustvu hormona (stanje mirovanja) održava cAMP nivo ispod onoga koji je neophodan za aktivaciju PKA. 2 – Aktivacija -adrenergi nih receptora prouzrokuje pove anje nivoa cAMP-a koje premašuje nivo koji je PDE u mogu nosti da degradira, što prozrokuje vezivanje cAMP-a zaregulatornu (R) subjedinicu PKA i posledi no oslobadjanje aktivne kataliti ke (C) subjedinice. 3 – Posledi na fosforilacija PDE od strane PKA stimuliše kataliti kuaktivnost PDE, te time smanjuje nivo cAMP-a i vodi ga »nazad« ka bazalnom nivou što prouzrokuje reformiranje inaktivne PKA. 4 – Posledi na defosforilacija PDEvra a kompleks u stanje mirovanja. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;adaptirano od Dodge i sar.(2001), EMBO J 20:1921.).

87

3.2. GPCR-zavisna REGULACIJA JONSKIH KANALA

Dobro je poznato da su receptori za neurotransmitere (glutamate, serotonin, kao i nikotinskireceptori za acetilholin), ligand-zavisni jonski kanali. Ipak, mnogi receptori za neurotransmiteresu G protein-zavisni receptori, za koje je efektorni protein jonski kanal. Neurotransmiter se vezujeza receptore što izaziva otvaranje ili zatvaranje jonskih kanala povezanih sa receptorom i dovodido promene potencijala na membrani. Drugi receptori za neurotransmitere kao i receptori za mirisi fotoreceptori u oku, su G protein-zavisni receptori koji indirektno modulišu aktivnost jonskihkanala preko aktivacije sekundarnih glasnika. U daljem tekstu e biti opisani G protein-zavisnireceptori koji direktno ili indirektno modulišu jonske kanale: muskarinski i Gt-zavisni receptori.

3.2.1. Muskarinski receptor u srcu aktivira G protein koji otvara kanal za K+

Vezivanje acetilholina za nikotinski receptor u skeletnoj muskulaturi, generiše akcioni potencijalkoji dovodi do miši ne kontrakcije. Nasuprot ovom, muskarinski receptori za acetilholin u srcudovode do inhibitorne reakcije. Vezivanje acetilholina za ove receptore usporava rad srca tj. izazivadugotrajnu hiperpolarizaciju (traje nekoliko sekundi) membrane sr ano miši nih elija. Aktivacijamuskarinskih receptora, zavisnih od Gi proteina, dovodi do otvaranja kanala za K+, a izlaznastruja K+ hiperpolariše elijsku membranu. Kao što je prikazano na slici 3. 16. signal se odaktiviranog receptora, disocijacijom G subjedinice, prenosi na efektorni protein. Ova direktna

aktivacija kanala za K+, preko G subjedinice,se može demonstrirati “patch clamp” ogledima(merenjem jonske struje kroz jedan kanal) ukojima se u citoplazmu elija miokarda dodajepurifikovani G protein. Neposredno pododavanju G proteina, K+ kanali se otvaraju,iako elije nisu stimulisane acetilholinom ilinekim drugim neurotransmiterom.

Slika 3.16. Model muskarinskog receptora na membrani elijamiokarda. Receptori su preko trimernog G proteina povezani sakanalom za K+. Vezivanje acetilholina za receptor aktivira Gisubjedinicu i njenu disocijaciju od G proteina. Disocirana Gsubjedinica se vezuje za K+ kanal i otvara ga. Izlazna struja K+,hiperpolariše membranu, što dovodi do usporavanja ritma sr anihkontrakcija.

88

3.2.2. Gt-zavisni receptori koje aktivira svetlost

Retina oka sadrži dva tipa fotoreceptora tzv. štapi i i epi i. epi i su uklju eni u prepoznavanjeboja, dok štapi e može stimulisati svetlost malog intenziteta (kao što je svetlost meseca).

Rodopsin je receptor zavisan od G proteina, koga aktivira svetlost, a lokalizovan je namembranskim diskovima spoljašnjeg segmenta štapi a (Slika 3.17.). Za rodopsin je vezan trimerniG protein tzv. transducin (Gt), koji se ekspresuje samo u štapi ima. Štapi i sadrže oko 4 x 107

molekula rodopsina. Molekul rodopsina se sastoji od proteina opsina koji ima sedamtransmembranskih regiona, i koji je kovalentno vezan sa pigmentom 11-cis-retinalom. Nakonabsorpcije fotona svetlosti dolazi do konverzije pigmenta u all-trans izomer i konformacionepromene opsina koja ga aktivra. Forma u kojoj je opsin vezan za all-trans-retinal se nazivametarodopsin II ili aktivirani opsin. Ovakva, svetlom aktivirana forma rodopsina, reaguje sa Gt.Aktivni opsin je nestabilan i lako disocira na opsin i all-trans-retinal, što dovodi do završavanja

vizuelnog signala. U mraku se slobodniall-trans-retinal konvertuje u 11-cis-retinal, koji može ponovo sa opsinom daformira rodopsin.U mraku, membranski potencijal štapi aje zna ajno manji od MPM karakteri-sti nog za neurone (-60 mV do -90 mV) iiznosi oko -30 mV. Posledica ove depo-larizacije membrane štapi a, je kon-stantna sekrecija neurotransmitera i kon-stantna stimulacija bipolarnih inter-neurona, sa kojima su štapi i u sina-pti kom kontaktu. Membrana štapi a umraku, poseduje veliki broj otvorenih,neselektivnih kanala koji propuštaju Na+ iCa++ kao i K+. Absorpcija svetlosti dovodido zatvaranja ovih kanala i porasta me-mbranskog potencijala tj. membranskipotencijal postaje “negativniji”.Slika 3.17. Štapi .

89

Što je ve i broj fotona koji se absorbuje rodopsinom, više je zatvorenih kanala tj. manja je ulaznastruja Na+, ve i je membranski potencijal koji dovodi do manje sekrecije neurotransmitera. Ovapromena tj. informacija se prenosi u vizuelni korteks gde se obradjuje i predstavlja informaciju osvetlosti.

3.2.2.1. Aktivacija rodopsina izaziva zatvaranje cGMP-zavisnog kanala za katjoneMolekul koji ima klju nu funkciju u povezivanju aktiviranog opsina i kanala za katjone umembrani spoljašnjeg segmenta štapi a, je sekundarni glasnik, cGMP. Spoljašnji segment štapi asadrži neobi no visoku koncentraciju cGMP-a ( 0.07 mM), nastalog od GTP-a u reakciji koja jekatalisana guanilat ciklazom. Apsorpcija svetlosti indukuje aktivaciju fosfodiesteraza za cGMP,koje vrše hidrolizu cGMP do 5’-GMP-a. Drugim re ima, visoka koncentracija cGMP-a u mraku,održava otvorene cGMP-zavisne katjonske kanale, a svetlost dovodi do razlaganja cGMP tj. padanjegove koncentracije, zatvaranja kanala, hiperpolarizacije membrane i smanjenog oslobadjanjaneurotransmitera.

Slika 3. 18. Rodopsinom-indukovano zatvaranje katjonskih kanala u štapi ima.U mraku visoka koncentracija cGMP-a održava katjonske kanale otvorenim. Absorpcijasvetlosti generiše aktivirani opsonin (O*; 1) koji se vezuje za neaktivni Gt protein –razmenjuje se GDP sa GTP-om (2). Slobodni Gt GTP aktivira fosfodiesteraze za cGMP(PDE) tako što se veže za inhibitornu subjedinicu (3) što dovodi do oslobadjanjakataliti ke i subjedinice (4). Aktivirane kataliti ke subjedinice konvertuju cGMP uGMP (5) a smanjenje koncentracije cGMP-a izaziva odvajanje cGMP-a od cGMP-zavisnih kanala, njihovo zatvaranje (6) i hiperpolarizaciju membrane.

90

Kao što je prikazano na slici 3.18. fosfodiesteraze koje razlažu cGMP su efektorni proteini za Gt.Slobodni Gt GTP kompleks, nastao nakon absorpcije svetlosti, se vezuje za dve inhibitornesubjedinice fosfodiesteraze, što dovodi do njihovog odvajanja od i kataliti kih subjedinica ikonverzije cGMP-a u GMP. Jedan molekul aktivnog opsina, u membrani diska spoljašnjegsegmenta štapi a, može da aktivira 500 Gt molekula, a svaki od njih aktivira fosfodiesterazu. Ovoje primarna faza amplifikacije signalne transdukcije u vizuelnom sistemu.

Konverzija aktivnog kompleksa Gt GTP u neaktivni Gt GDP je ubrzana aktiviraju im proteinomGTP-ase (GAP; engl. GTP-ase activating protein) koji je specifi an za Gt GTP kompleks. Kodsisara je Gt aktivan (tj. u GTP vezanom stanju) samo nekoliko deli a sekunde, što ograni avaaktivnost fosfodiesteraza tj. i one se brzo inhibišu, što u uslovima ukidanja svetlosti, dovodi doporasta koncentracije cGMP-a i vra anja potencijala membrane na po etne vrednosti. Ovakvabrza inaktivacija Gt GTP kompleksa omogu ava brz odgovor oka na promenu objekta npr.prilikom kretanja.

“Patch-clamp” analize na izolovanim deli ima membrane spoljašnjeg segmenta štapi a, suobezbedile direktne dokaze o ulozi cGMP-a u regulaciji katjonskih kanala. Naime, kada se cGMPdoda na citosolnu površinu membrane dolazi do brzog otvaranja katjonskih kanala, što se dešavau odsustvu protein kinaza ili fosfataza i ukazuje da cGMP direktno deluje na jonske kanale iodržava ih otvorenim. Kao i potencijal-zavisni jonski kanali, cGMP-zavisni jonski kanali sadrže 4subjedinice od kojih svaka vezuje po jedan molekul cGMP-a. Da bi kanal bio otvoren, potrebno jeda se za njega vežu bar 3 molekula cGMP-a. Ovakva alosterna interakcija, ini otvaranje kanalavrlo osetljivim na malo variranje koncentracije cGMP-a.

3.2.2.2. Adaptacija štapi a na razli ite nivoe osvetljenjaepi i su neosetljivi na nizak nivo svetlosti, dok su štapi i inhibisani u uslovima velikog

intenziteta svetla. Funkcionalne karakteristike epi a i štapi a ilustruje primer zaslepljenosti,koja nastaje ukoliko neko vreme boravimo na dnevnoj svetlosti, a zatim udjemo u slabo osvetljenusobu. Posle nekog vremena, kada se štapi i adaptiraju na uslove slabe svetlosti (polako postajusenzitivni na slabu svetlost), postajemo sposobni da razlikujemo objekte. Ovakav proces vizuelneadaptacije omogu ava štapi ima da razlikuju kontraste širokog dijapazona (preko 100 000 x) kojinastaju kao rezultat razli itih nivoa svetlosti.

91

Proces koji doprinosi vizuelnoj adaptaciji uklju uje fosforilaciju aktiviranog opsina (O*),aktivacijom rodopsin kinaze (enzim sli an kinazi adrenergi nih receptora, BARK, opisanojranije). Svaki molekul opsina poseduje 3 serinska ostatka, koja mogu biti fosforilisana. Brojfosforilisanih serina je u obrnutom odnosu sa sposobnosti ove molekule da interaguje sa Gt.Drugim re ima, što je ve i broj fosforilisanih serina, manja je sposobnost akivnog opsina daaktivira Gt i dovede do zatvaranja cGMP-zavisnih katjonskih kanala. Zna aj fosforilacije aktivnogopsina, je ilustrovana ogledom na štapi ima koji ekspresuju mutirane molekule rodopsina, ukome su serini zamenjeni nekim drugim aminokiselinama (npr. alaninom). Ovakvi rodopsinipokazuju mnogo sporiju deaktivaciju prilikom delovanja svetlosti ve eg intenziteta. U timuslovima, aktivni opsin je fosforilisan a aktivacija Gt je redukovana, tako da je neophodan ve iporast intenziteta svetlosti za generisanje vizuelnog signala. U uslovima smanjenog intenzitetasvetlosti, opsin je defosforilisan i njegova sposobnost za aktivaciju Gt raste. Drugim re ima samonekoliko dodatnih fotona je potrebno za nastajanje vizuelnog signala.

Slika 3. 19. Uloga fosforilacije opsina u adaptaciji štapi a na promene nivoa svetlosti.

U uslovima visokog nivoa svetlosti (kakva je npr. dnevna svetlost u podne), fosforilacija opsina jevelika (sva 3 mesta su fosforilisana), tako da C-terminalni region molekule postaje vezno mesto za-arestin. Vezivanje -arestina spre ava interakciju aktiviranog opsina sa Gt i potpuno blokira

nastajanje Gt GTP kompleksa, što dovodi do inaktivacije štapi a. Mehanizam kontrole aktivnostištapi a preko uklju ivanja rodopsin kinaze je sli an adaptaciji ili desenzitizaciji drugih G-proteinzavisnih receptora u uslovima visoke koncentracije liganda tj. predstavlja opšti mehanizamadaptacije.

Drugi mehanizam vizuelne adaptacije štapi a je jedinstven za ove elijske forme. U mraku, elijese adaptiraju tako što se skoro sve Gt i G subjedinice nalaze u spoljašnjem segmentu.

92

Medjutim, izlaganje štapi a svetlosti umerenog intenziteta u trajanju npr. od 10 minuta, dovodido translokacije Gt i G subjedinica iz spoljašnjeg segmenta u elijske kompartmane. Iakomehanizam translokacije Gt i G subjedinaica još uvek nije poznat, jasno je da uklanjanje Gt

proteina iz spoljašnjeg segmenta onemogu ava njegovu interakciju sa aktivnim opsinom tj.predstavlja jedan vid adaptacije. Kao i u slu aju drugih signalnih puteva, i tokom vizuelneadaptacije, koriste se multipli mehanizmi inaktivacije prenosa signala što omogu ava boljuregulaciju aktivacije signalnog puta u razli itim uslovima osvetljavanja.

93

3.3. GPCR-zavisni RECEPTORI KOJI AKTIVIRAJU FOSFOLIPAZU C

U tekstu koji sledi e biti opisani signalni putevi aktivirani GPCR-om, koji angažuju neke drugesekundarne glasnike, kao i mehanizmi preko kojih oni regulišu razli ite funkcije elija.Sekundarni glasnici koji e biti opisani, mogu nastati od membranskog fosfolipidnog molekulatzv. fosfatidilinozitola (PI). Inozitolna grupa ovog fosfolipidnog molekula, koja se projektuje ucitosol, može biti fosforilisana i defosforilisana na nekoliko pozicija, kombinovanim delovanjemrazli itih kinaza i fosfataza. Drugim re ima, razli ita fosforilacija omogu ava nastajanje razli itihfosfoinozitida vezanih za membranu.

Slika 3. 20. Sinteza DAG i IP3 od PI vezanog za membranu. Forme PI kinaza vezanih za membranu (PI-4 i PI-5 kinaza) fosforilišu specifi nuhidroksilnu grupu u inozitolnom prstenu, produkuju i fosfoinozitide PIP i PIP2. Razlaganje PIP2 delovanjem PLC generiše nastajanje dvasekundarna glasnika DAG i IP3.

Nivo mnogih fosfoinozitida u eliji je dinami ki regulisan ekstracelularnim signalima, naro itoonim koji se vezuju za receptor tirozin kinazu ili citokinski receptor. Fosfoinozitid PIP2 (PI 4,5-bifosfat) može da veže mnoge citosolne proteine za plazma membranu. Neki od tih proteina suneophodni za formiranje i remodelovanje aktinskog citoskeleta, drugi su neophodni za vezivanjeproteina zna ajnih u procesu endocitoze i formiranju vezikula.

94

Fosfolipaza C je enzim koji je povezan sa elijskom membranom, i koji je odgovoran za razlaganjePIP2 i nastajanje dva sekundarana glasnika: 1,2-diacilglicerol (DAG), lipofilne molekule kojaostaje povezana sa elijskom membranom, i inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3), molekule kojadifunduje u citosol. Signalni putevi koji uklju uju angažovanje ova dva sekundarna glasnika sejednim imenom nazivaju IP3/DAG signalni put. Vezivanje hormona za receptore koji su povezanisa Go ili Gq proteinom (Tabela 3.1.) dovodi do aktivacije izoforme fosfolipaze C (PLC ).

3.3.1. Inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) izaziva oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog retikuluma

Ca++ se u eliji uglavnom nalazi uskladišten u tzv. intracelularnim depoima kao što sumitohondrije, endoplazmatski retikulum (ER), ili se nalazi u sastavu nekih vezikula. elije koristerazli ite mehanizme za regulaciju koncentracije citosolnog Ca++, tako da se njegova koncentracijau citosolu održava ispod 0.2 M1. Vrlo je važna kontrola koncentacije citosolnog Ca++, zato štomali porast nivoa Ca++ izaziva razli ite elijske odgovore.

Vezivanje mnogih hormona za svoje membranske receptore (npr. u jetri, masnim ili nekim drugimelijama) dovodi do porasta citosolnog Ca++, koji se oslobadja aktivacijom IP3-zavisnih Ca++

kanala u membrani ER. Kanal se sastoji od etiri identi ne subjedinice, od kojih svaka, na N-terminalnom citosolnom domenu poseduje vezno mesto za IP3. Kanal se otvara kada se za njegaveže IP3, a kroz otvoreni kanal u citosol difunduje Ca++. Ova tvrdnja tj. specifi nost IP3 efekta naCa++ kanale, se može ilustrovati jednostavnim ogledom u kome se preparatu ER vezikula dodajurazli iti fosforilisani inozitoli od kojih samo IP3 izaziva oslobadjanje Ca++ u citosol.

Porast nivoa Ca++ u citoplazmi je kratkotrajan tj. prolazan, zbog toga što se aktiviraju pumpe zaCa++, locirane u elijskoj membrani ili membrani ER, a koje aktivno transportuju Ca++ uekstracelularni fluid ili nazad u lumen ER. Takodje, u toku jedne sekunde od nastajanja IP3

molekula, dolazi do hidrolize jednog fosfata i nastajanja inozitol 1,4-bifosfata, koji ne može daaktivira kanale za Ca++ u membrani ER.

1 Na primer, razli ite ATP-azne pumpe transportuju Ca++ kroz plazma membranu ili kroz memembranu elijskih organela koja skladišteintracelularni Ca++.

95

Slika 3. 21. Porast nivoa citosolnog Ca++ regulisanogaktivacijom IP3/DAG signalnog puta. Ovaj put može biti stimulisanaktivacijom nekog G protein-zavisnog receptora, kao i nekolikodrugih receptora koji dovode do aktivacije PLC. Razlaganje PIP2dovodi do nastajanja DAG i IP3 (1). IP3 difunduje u citosol, vezuje seza kanale za Ca++ i otvara ih (2), dozvoljavajuci difuziju Ca++ ucitosol (3). Jedan od razli itih odgovora elije izazvanih porastomcitosolnog Ca++ je i regrutovanje protein kinaze C (PKC) koja uplazma membrani (4) biva aktivirana DAG-om (5). Aktivirana PKCmože da fosforiliše razli ite elijske enzime i receptore menjaju injihovu aktivnost (6). Kada se intracelularni depo isprazni, IP3 –zavisni kanali se vezuju sa TRP kanalima za Ca++ u plazmamembrani tj. otvaranjem TRP kanala dolazi do influksaekstracelularnog Ca++ (7).

Bez na ina za ponovno punjenje intracelularnih depoa, elija bi brzo bila nesposobna da naponovljenu IP3 stimulaciju odgovori pove anjem citosolnog Ca++. Utvrdjeno je da se nakonpražnjenja depoa za Ca++ u ER, otvaraju plazma-membranski kanali za Ca++ tzv. TRP kanali. Najoš neobjašnjen na in, smanjenje Ca++ u lumenu ER, dovodi do konformacione promene IP3–zavisnih kanala za Ca++, koja omogu ava njegovo vezivanje za TRP kanale u elijskoj membrani.Ovakva interakcija dva kanala za Ca++, dovodi do otvaranja TRP kanala i influksa ekstracelularnogCa++ u eliju.

Otvaranje IP3–zavisnih kanala za Ca++ je regulisano citosolnim jonima Ca++. Na primer, povišenakoncentacija Ca++ u citosolu smanjuje afinitet kanala za IP3, ime se smanjuje oslobadjanje Ca++ izlumena ER. Kompleksna regulacija IP3–zavisnih kanala za Ca++ vodi ka brzim oscilacijama nivoacitosolnog Ca++, u slu aju stimulacije IP3 signalnog puta. Tako na primer, stimulacijagonadotropnih elija adenohipofize sa LHRH, izaziva brze ponovljene oscilacije nivoa citosolnogCa++ (engl. “spikes in cytosolic Ca++ level”) koji je povezan sa epizodi nom sekrecijom LH. Zna ajovakve fluktuacije citosolnog Ca++ još uvek nije objašnjen. Jedno od mogu ih objašnjena je daspori porast nivoa Ca++ može biti toksi an za eliju.

96

3.3.2. Diacilglicerol (DAG) aktivira protein kinazu C (PKC) koja reguliše mnoge drugeproteine

Nakon formiranja DAG ostaje povezan sa elijskom membranom. Njegova osnovna funkcija je daaktivira familiju protein kinaza tzv. protein kinaza C (PKC). U uslovima kada elija nijestimulisana hormonima, PKC je kataliti ki neaktivan solubilni citosolni protein. Porast citosolnogCa++ dovodi do regrutovanja PKC, i njenog približavanja plazma membrani, gde može da budeaktivirana u reakciji sa DAG-om (koji je vezan za elijsku membranu). Može se re i da, aktivacijaPKC zavisi od porasta koncentracije Ca++ u citosolu, kao i od interakcije sa DAG-om, štopredstavlja primer interakcije dve grane IP3/DAG signalnog puta.

Aktivacija PKC u razli itim elijama aktivira razli ite odgovore i ima važnu ulogu u mnogimaspektima rasta i metabolizma elija. Na primer, u elijama jetre, PKC pomaže u regulacijimetabolizma glikogena tako što fosforilacijom odredjenih proteina inhibiše sintezu glikogena.Takodje, PKC u zavisnosti od tipa elije, može da fosforiliše razli ite transkripcione faktore i takoindukuje sintezu mRNA koja e npr. dovesti do proliferacije elija.

3.3.3. Ca++/kalmodulin kompleks posreduje u odgovoru elija na spoljašnje signale

Pored vezivanja za GPCR, i vezivanje liganda za nekoliko drugih tipova receptora, može da aktiviraPLC, što dovodi do IP3-posredovanog pove anja nivoa slobodnog Ca++ u citosolu. Ovakvolokalizovano pove anje koncentracije slobodnog Ca++ je kriti no za njegovu funkciju sekundarnogglasnika2. Na primer stimulacija GPCR-a, acetilholinom u sekretornim elijama pankreasa iparotidne žlezde indukuje IP3-posredovan porast nivoa citosolnog Ca++, koji izaziva fuzijusekretorne vezikule sa elijskom membranom i oslobadjanje njenog sadržaja u ekstracelularniprostor. U trombocitima, porast citosolnog Ca++, nakon stimulacije trombinom, izazivakonformacionu promenu koja vodi ka agregaciji trombocita, vrlo zna ajnoj fazi u procesuhemostaze. Sekrecija insulina iz elija pankreasa, je takodje, izazvana porastom Ca++ u citosolu,ali je mehanizam njegovog oslobadjanja druga iji.

2 Koncentracija Ca++ u citosolu je kod elija u miru niska ( 10-7M) dok je u ekstracelularnom fluidu ( 10-3M) i ER visoka. Kada signal otvori kanaleza Ca++ on difunduje, pove avaju i njegovu koncentraciju u citosolu 10-20x. Glavni tipovi Ca++ kanala preko kojih se ostvaruje ovaj efekat su:voltažno zavisni Ca++kanali u plazma membrani, IP3-zavisni Ca++ kanali u membrane ER, i rijanodinski receptori. Detaljnije o funkciji ovih kanala Imehanizmima pumpanja Ca++ u ER i/ili mitohondrije, kao i u ekstracelularni fluid pro itati u skripti “Opšta fiziologija životinja”, Kova evi R i sar.

97

3.3.3.1. Frekvenca oscilacija Ca++ uti e na odgovor elijeCa++-senzitivni fluorescentni indikatori, npr. fura-2, se esto koriste u merenju promene nivoacitosolnog Ca++ u individualnim elijama, nakon aktivacije inozitol fosfolipidnog signalnog puta.Ovako posmatran signal kalcijuma, je mali i lokalizovan na diskretne regione u eliji. Ovi signali,koji se esto nazivaju “šiljci”, predstavljaju osnovne jedinice Ca++ signalinga. Smatra se, da oninastaju usled otvaranja individualnog (ili male grupe) kanala za Ca++ u membrani ER. Obi no jeCa++ signal (šiljak), pra en serijom signala, koja obi no traje nekoliko sekundi. Oscilacije Ca++

traju toliko dugo, koliko traje aktivacija receptora na površini elije. Takodje, oscilacije bardelimi no zavise i od kombinacije pozitivne i negativne povratne sprege na IP3-zavisan kanal zaCa++ (oslobodjeni Ca++ inicijalno stimuliše dalje oslobadjanje Ca++ iz intracelularnog depoa, a kadnjegova koncentracija dovoljno poraste, Ca++ inhibiše dalje oslobadjanje).

Frekvenca oscilacija Ca++ signala, izražava intenzitet ekstracelularnog stimulusa. Fiziološkiodgovor elije zavisi od frekvence tih oscilacija, i esto i sam odgovor elije predstavlja oscilatornu

funkciju. Na primer, u slu aju hormonske stimulacijeelija adenohipofize, ekstracelularni signal izaziva

oscilatorni odgovor Ca++ (ponavljanje šiljaka Ca++), ukome je svaki “šiljak” povezan sa sekrecijom hormona.Takodje, elijski odgovor koji zavisi od frekvenceoscilacija Ca++, ne mora da bude oscilatoran. Kod nekihtipova elija, odredjena frekvenca Ca++ oscilacija,aktivira transkripciju jednog seta gena, dok druga, višafrekvenca, aktivira transkripciju drugih gena u eliji.Mehanizam preko koga elija dobija informacije opromeni nivoa Ca++, uklju uje angažovanje Ca++ -senzitivnih proteina, koji menjaju svoju aktivnost uzavisnosti od frekvence oscilacija Ca++ u citosolu.

Slika 3. 22. Vazopresinom indukovane oscilacije Ca++ u elijama jetre.

98

3.3.3.2. Ca++/kalmodulin-zavisna protein kinaza (CaM-kinaza) posreduje u mnogim efektima Ca++ u eliji

Mali citosolni protein, kalmodulin, koji je karakteristi an za sve eukariotske elije, funkcionišekao protein koji je uklju en u mnoge efekte jona Ca++ u eliji. Vezivanje jona Ca++ za etiri veznamesta na molekulu kalmodulina, dovodi do formiranja kompleksa koji interaguje i modulišeaktivnost mnogih enzima i proteina u eliji. Ca++ se vezuje za kalmodulin u kooperativnommaniru, što zna i da male promene nivoa citosolnog Ca++ vode ka velikim promenama nivoaaktivnog kalmodulina.

Mnogi efekti Ca++/kalmodulin kompleksa su posredovani fosforilacijom proteina, koja jekatalisana kinazama iz familije Ca++/kalmodulin-zavisnih protein kinaza (CaM-kinaze).Pripadnici ove familije, fosforilišu ostatke serina i/ili treonina u sastavu proteina, iju aktivnostregulišu. Prva otkrivena CaM-kinaza, je kinaza lakog lanca miozina, koja reguliše aktivnostmiozina u elijama glatke muskulature. Kinaza lakog lanca miozina ispoljava visoku specifi nostza odredjeni supstrat tj. fosforiliše lake lance miozina. Brojne druge CaM-kinaze imaju mnogo širuspecifi nost, i odgovorne su za mnoge efekte Ca++ u životinjskim elijama. Neke od CaM-kinaza,mogu da fosforilišu regulatorne proteine gena, kao sto je CREB protein, i na taj na in da inhibišu

ili aktiviraju transkripciju specifi nihgena.

Slika 3. 23. Aktivacija CaM-kinaze II. CaM-kinaza II jeveliki proteinski kompleks koji se sastoji od 12subjedinica, a na slici je zbog jednostavnosti, prikazanasamo jedna subjedinica. Razli iti tipovi subjedinica ( , ,, i ) su zastupljeni u razli itim elijama. U odsustvu

Ca++/kalmodulin kompleksa, enzim je neaktivan, što jerezultat interakcije izmedju inhibitornog i kataliti kogdomena. Vezivanje Ca++/kalmodulin kompleksa menjakonformaciju proteina, što omogu ava da kataliti kidomen fosforiliše inhibitorni domen susedne subjediniceu kompleksu (kao i druge proteine u eliji).Autofosforilacija enzimskog kompleksa (uzajamnomfosforilacijom subjedinica) produžava aktivnost enzimana dva na ina. Prvo, zadržava vezani Ca++/kalmodulin,tako da ne dozvoljava njegovu disocijaciju od enzimskogkompleksa i nakon povratka nivoa citosolnog Ca++ nabazalne vrednosti, za bar 10 sekundi. Konvertuje enzimu formu koja postaje nezavisna od Ca++, tako da enzimostaje aktivan i kada dodje do disocijacije od

Ca++/kalmodulin kompleksa. Enzim ostaje aktivan sve dok protein fosfataze (koje defosforilišu enzim), ne prevladaju proces autofosforilacije.

99

Najbolje izu en primer, je primer multifunkcionalne CaM-kinaze, CaM-kinaze II, koja je prisutnau svim životinjskim elijama, a posebno je dobro zastupljena u nervnim elijama. U nekimregionima mozga, zastupljenost ove kinaze iznosi ak 2% od ukupnih proteina, a podru je sinapsije naro ito bogato CaM-kinazom II. CaM-kinaza II poseduje dve važne karakteristike koje sumedjusobno povezane. Prva je da funkcioniše kao “molekularna memorijska sprava” tj. aktivira seCa++/kalmodulinskim kompleksom, i ostaje aktivna ak i kad signal Ca++ prestane da postoji. Ovose objašnjava njenom sposobnos u autofosforilacije, tj. ona pored fosforilacije ciljnih proteinaima sposobnost da sama sebe fosforiliše, i da na taj na in ostane aktivna i kada signal koji jeaktivirao više ne postoji. Aktivnost CaM-kinaze II se održava, sve dok fosfataze ne prevladajuautofosforilaciju ovog enzima. Druga, zna ajna karakteristika ovog enzima je da može da koristisvoj mehanizam memorije i funkcioniše kao “dekoder frekvence oscilacija Ca++”. Smatra se da jeova osobina naro ito važna u sinapsama, gde promene u nivou intracelularnog Ca++ vode kadugotrajnim promenama. Kada je u in vitro ogledu CaM-kinaza II imobilisana na vrstoj površini iizložena delovanju protein fosfataze, kao i ponavljanim pulsevima Ca++/kalmodulin kompleksa,razli ite frekvence (kombinaciji onih faktora koji imitiraju situaciju u stimulisanim elijama),enzimska aktivnost graduisano raste, u funkciji frekvence Ca++/kalmodulin kompleksa.

3.3.3.3. Ca++/kalmodulin-zavisna aktivacija drugih efektornih proteinaCa++/kalmodulin kompleks može da aktivira cAMP fosfodiesterazu, enzim koji degradira cAMP u5`-AMP i time se uklju uje u inhibicuju signalnog puta cAMP-a. Ovakva interakcija dva signalnaputa, je jedan od mnogih primera interakcije dva sekudarna glasnika, koja su uklju ena u finuregulaciju odredjenih aspekata funkcije elija.

U nekim elijama aktivacija receptora i signalnog puta preko PLC i IP3 dovodi do aktivacijespecifi nih transkripcionih faktora. U nekim slu ajevima Ca++/kalmodulin aktivira protein kinazukoja fosforiliše transkripcione faktore, a modifikacijom njihove aktivnosti reguliše ekspresiju gena.U drugim slu ajevima, Ca++/kalmodulin aktivira fosfatazu, koja defosforiliše transkripcionefaktore. Zna ajan primer uklju ivanja ovakvog mehanizma u regulaciju funkcije elije je aktivacijaT limfocita, u kojima joni Ca++ stimulišu aktivnost transkripcionog faktora NFAT (engl. nuclearfactor of activated T cells). U nestimulisanim elijama NFAT je fosforilisan i lociran u citosolu.Nakon stimulacije receptora i pove avanja nivoa citosolnog Ca++, Ca++/kalmodulin kompleks seveže i aktivira kalcineurin. Kalcineurin je serin-fosfataza, koja u aktivnoj formi uklanja klju nufosfatnu reziduu (defosforiliše) na citosolnom NFAT-u, i time omogu ava njegovu translokaciju unukleus i stimulaciju ekspresije gena važnih za aktivaciju T limfocita.

100

Ca++/kalmodulin kompleks, takodje ima važnu ulogu u kontroli dijametra krvnih sudova. Ovajsignalni put angažuje NO, kao signalnu molekulu, i ilustruje primer funkcije cGMP-a kaosekundarnog glasnika.

3.3.3.4. cGMP aktivira protein kinazu G i izaziva relaksaciju elija glatke muskulatureNitroglicerin, se duže od jednog veka, koristi u le enju intenzivnog bola u grudima kod anginepektoris. Poznato je da nitroglicerin u telu polako otpušta azot oksid (NO), koji dovodi dorelaksacije glatke muskulature krvnih sudova, ime se pove ava dijametar krvnih sudova i protokkrvi koja snabdeva organ (u ovom slu aju miokard) sa O2. Jedno od intrigantnih otkri a modernemedicine, je funkcija NO, toksi nog gasa, kao signalne molekule.

Definitivni dokazi za funkciju NO u relaksaciji glatke muskulature su dobijeni iz seta ogleda ukojima je preparatima elija glatke muskulature, dodavan acetilholin. Direktno dodavanjeacetilholina na ove elije je dovelo, do o ekivanog rezultata tj. do njihove kontrakcije (dobro jepoznato da Ach izaziva kontrakciju glatke muskulature). Medjutim, dodavanje acetilholina ulumen malih izolovanih krvnih sudova, je dovelo do relaksacije zida krvnog suda. Analize supokazale, da acetilholin deluje na endotel krvnih sudova, izazivaju i oslobadjanje supstance kojastimuliše relaksaciju glatko-mišicnih elija. Ispostavilo se da je ova supstanca NO.

Danas se zna da endotelne elijeposeduju receptore za acetilholin,koji su Go protein-zavisni receptori.Vezivanje acetilholina za overeceptore aktivira fosfolipazu C,koja preko IP3 dovodi do porastanivoa citosolnog Ca++. Ca++/ka-lmodulin kompleks stimuliše akti-vnost NO sintaza, enzima koji ka-tališu formiranje NO, od O2 iaminokiseline arginina.

Slika 3. 24. Regulacija kontraktilnosti glatkemuskulature krvnih sudova preko NO i cGMP.

101

NO ima kratak poluživot (svega nekoliko sekundi) što ograni ava njegovu difuziju, tako da NOmože da difunduje samo lokalno tj. do susednih elija. U slu aju regulacije funkcije glatkemuskulature krvnih sudova, on difunduje iz endotelnih elija do susednih elija glatkemuskulature, i izaziva njihovu relaksaciju.

Efekat NO na elije glatke muskulature se ispoljava aktivacijom sekundarnog glasnika, cGMP-a.Naime, NO se u eliji vezuje za svoj intracelularni receptor tj. citosolni enzim tzv. solubilnugualinat ciklazu. Vezivanje NO za hem, koji se nalazi u sastavu ovog enzima, dovodi dokonformacione promene koja stimuliše guanilat-ciklaznu aktivnost enzima tj. produkciju cGMP-a.Ve ina intacelularnih efekata cGMP-a je posredovana protein kinazom G (PKG). U glatkojmuskulaturi krvnih sudova, PKG aktivira signalni put koji dovodi do inhibicije formiranja aktin-miozin kompleksa, relaksacije elija tj. do vazodilatacije. U ovom slu aju cGMP deluje indirektnopreko aktivacije PKG, dok u ranije spomenutom primeru regulacije funkcije štapi a, cGMP reagujedirektno sa katjonskim kanalima u plazma membrani.

Relaksacija glatke muskulature, takodje, može biti izazvana, vezivanjem atrijalnog natrureti nogpeptida (ANP) i nekih drugih peptdida za svoje receptore na membrani glatko-miši nih elija.Citoplazmati ni domen ovih membranskih receptora, poseduje enzimsku aktivnost, sposobnostprodukuje cGMP. Kada pove an volimen krvi, istegne elije miokarda pretkomore, one sekretujuANP. ANP, cirkulacijom dospeva do receptora za ANP tzv. membranske guanil ciklaze, koja senalazi na membrani glatke muskulature susednih krvnih sudova, veže se za nju i stimulišeprodukciju cGMP-a. Aktivacija PKG izaziva dilataciju krvnih sudova, koja smanjuje krvni pritisaki tako smanjuje pokreta ki stimulus koji je doveo do sekrecije ANP.

102

3.4. GPCR-zavisna AKTIVACIJA TRANSKRIPCIJE GENA

Kao što je ranije napomenuto, intracelularni putevi transdukcije signala mogu da imajukratkotrajni ili dugotrjni efekat na eliju. Kratkotrajni efekti koji se mere sekundama ili minutimasu rezultat modulacije enzima ili drugih proteina koji ve postoje u eliji, prouzrokuju i timepromene u elijskom metabolizmu i/ili funkcijama. Ve ina puteva stimulisanih aktivacijomGPCRs prouzrokuje kratkotrajne efekte. Pored toga, GPCRs-signalni putevi mogu imati idugotrajne efekte koji traju satima ili danima zahvaljuju i aktivaciji ili represiji transkripcije gena,što vodi, u nekim slu ajevima ka proliferaciji elija, ili diferencijaciji u razli ite tipove elija. Ranijeje diskutovano (videti sekciju) kako signal koji indukuje pove anje nivoa citosolnog Ca2+ vodi kaaktivaciji transkripcionih faktora. U ovoj sekciji e biti razmatrani drugi mehanizmi kojima nekiGPCRs regulišu transkripciju i/ili ekspresiju gena.

3.4.1. Membranski-lokalizovan „tubby” transkripcioni faktor se otpušta aktivacijom PKC

S obzirom na veliku ekspanziju bolesti vezanih za ishranu interesovanje za tzv. tubby gen jezna ajno poraslo kada je identifikovano da se ovaj gen ekspresuje prvenstveno u odredjenimregionima mozga uklju enim u kontrolu ponašanja u ishrani. Još ve a pažnja nau ne javnosti jeusmerena na ovaj gen kada je otkriveno da je tubby gen uklju en u kontrolu i/ili regulacijugojaznosti. Miševi koji nose mutacije na tubby genu razvijaju gojaznost i odredjeni aspektinjihovog metabolizma pode aju na one kod gojaznih ljudi. Sekvencioniranje kloniranog tubbygena pokazalo je da kodirani protein ima i DNK-vezuju i domen, kao i transkripcioni-aktivacioni

domen. Medjutim, detektovan Tubby protein je lokalizovanblizu plazma membrane, što ga ne ini mogu im kandidatonza transkripcioni faktor. Pokazano je da Tubby protein vrstoveže PIP2 koji „usidrava” protein u plazma memebranu (Slika3.25.).

Slika 3.25. Vezivanje liganda za receptore koji transdukuju signal preko Go ili Gqproteina prati aktivacija Tubby transkripcionog faktora.U stanju mirovanja tj. kada GPCR nije okupiran ligandom, Tubby je vrsto vezan sa PIP2 u plazmamebrani. Stimulacija receptora aktivira PLC, što vodi hidrolizi PIP2 i oslobadja Tubby u citosol (1).Vodjen sa dve funkcionalne NLS na svom N-terminalnom domenu, Tubby se translocira u nukleus (2) iaktivira transkripciju ciljnih gena (3). Nije poznato da li IP3 ostaje zaka en za Tubby nakon odvajanjaPIP2. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;adaptirano od Santagata i sar. (2001), Science 292:2041.).

103

Hormoni koji se vezuju za receptore koji transdukuju signal preko Go ili Gq proteina, indukujuaktivaciju fosfolipaze C (engl. PhosphoLipase C – PLC) što prouzrokuje hirolizu PIP2 i oslobadjaTubby u citosol3. Nakon toga se Tubby translocira u nukleus vodjen sa dve funkcionalne sekvenceza nuklearnu lokalizaciju (engl. Nuclear Localisation Sequences - NLS) koje se nalaze nanjegovnom N-terminalnom domenu. U nukleusu, Tubby aktivira transkripciju, još uvek,nepoznatih/nedefinisanih gena. Identifikacija i karakterizacija ovih gena bi trebala da omogu ibolje razumevanje uloge proteina koje oni kodiraju u gojaznosti.

3.4.2. CREB vezuje cAMP signale za transkripciju

Pove anje nivoa citosolnog cAMP-a u elijama sisara stimuliše eksrpesiju mnogih gena. Naprimer, pove anje niova cAMP-a u odredjenim endokrinim elijama indukuje produkcijusomatosterina, peptida koji inhibiše oslobadjanje razli itih hormona. Takodje, u elijama jetre,cAMP indukuje sintezu nekoliko enzima koji su uklju eni u konverziju tro-ugljeni nihkomponeneti u glukozu.

Svi geni koji su regulisani sa cAMP sadrže cis-aktivnu DNK sekvencu koja ima funkciju elementakoji odgovara na cAMP (engl. Cyclic AMP-Response Element – CRE). CRE vezuje fosforilisanitranskripcioni faktor koji se zove CRE-vezuju i protein (engl. CRE-Binding – CREB protein), akoji je detektovan jedino u nukleusu. Kao što je ranije diskutovano, vezivanje ligada za receptorekoji transdukuju signal preko Gs proteina, aktivira AC, što pove ava nivo intracelularnog cAMP-akoji aktivira PKA i inicira oslobadjanje kataliti kih subjedinica PKA. Neke kataliti kesubjedinice PKA se translociraju u nukleus i tamo fosforilišu serin-133 na CREB proteinu.Fosforilisani CREB protein se vezuje za gene koji u svom promotoru imaju CRE, a istovremeno iinteraguje sa koaktivatorom CBP/P300 koji vezuje CREB protein za bazalnu transkripcionumašineriju, te time omogu ava CREB proteinu da stimuliše transkripciju gena za iji CRE regionse vezao (Slika 3.26.). Ranije studije su sugerisale da fosforilacija prozrokuje konformacionepromene CREB proteina, ali se danas zna da se CBP/P300 vezuje specifi no za fosforilisani serin-133 (fosfoserin-133) aktiviranog CREB proteina. Drugi transkripcioni faktori se takodje „oslanjaju”i prevode signale preko CBP/P300 kako bi aktivirali transkripciju gena. Prema tome, ovajkoaktivator ima veoma važnu ulogu u integraciji signala koji poti u od brojnih intracelularnihputeva transdukcije signala, a koji kuliminiraju regulacijom transkripcije gena.

3 Nije poznato da li IP3 ostaje vezan za Tubby

104

Slika 3.26. Vezivanje liganda za receptore kojitransdukuju signal preko Gs proteina prati aktivacijaekspresije gena.Stimulacija receptora (1) vodi aktivaciji PKA (2). Kataliti kesubjedinice PKA se translociraju u nukleus (3) I tamo fosforilišu iatkiviraju transkripcioni faktor CREB (4). Fosforilisani CREB seasocira sa koaktivatorom CBP/P300 (5) da bi stimulisao razli iteciljne gene ija je ekspresija kontrolisana preko CREregulatornog elementa.(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.WH Freeman and Company; videti Parker i sar. (1996),Mol Cell biol 16 (2):694.).

3.4.3. GPCR-vezani arestin aktivira nekoliko kinaznih kaskada kojekontrolišu ekspresiju gena

Kao što je prikazano ranije (videti slike 3.13. i 3.14), vezivanje arestina za fosforilisane serine ucitosolnom domenu receptora koji transdukuju signal preko G proteina, blokira aktivaciju Gsubjedinice i posreduje endocitozu GPCR-arestin kompleksa. Pored toga, verovatnoiznenadjuju e, ali GPCR-arestin kompleks deluje i kao postolje/skela (engl. scaffold protein) zavezivanje nekoliko kinaza (videti slike 3.13. i 3.14.). Ova aktivacija uklju uje c-Src4, koja aktivira

4c-Src kinaza je lan familije Src kinaza, tirozin kinaza koje se ne aktiviraju direktno receptorom, a pripadaju velikoj familiji blisko povezanih tirozin-specifi nih protein kinaza koje su uklju ene u regulaciju elijske deobe, elijske diferencijacije i elijske agregacije. Bar devet identifikovanih proteinkinaza je u okviru familije Src kinaza. Prva identifikovana tirozin kinaza je zapravo viralni onkogeni produkt v-Src kinaza. U poredjenju sa svojomelijskom „kopijom“, c-Src kinazom, v-Src nema inhibitorne elemente koji kontrolišu aktivnost protein kinaze. Posledica gubitka inhibitornih

elemenata je da je v-Src kinaza konsititutivno aktivna, te je stoga veoma potentan faktor/protein koji indukuje transformaciju.

105

MAP kinazni signalni put, ali i druge puteve transdukcije signala koji vode aktivaciji transkripcijegena neophodnih za deobu elije. Kompleks od tri proteina vezana za arestin, uklju uju i JNK1(Jun N-terminal Kinase), inicira kaskadnu aktivaciju kinaza koja na kraju aktivira c-Juntranskripcioni faktor. Aktivirani c-Jun favorizuje ekpresiju gena za odredjene enzime kojistimulišu rast, kao i gena za neke proteine koji pomažu elijama da odgovre na stresne situacije.

Kao što je napomenuto, vezivanje epinefrina za -adrenergi ni receptor u elijama sr anog miši astimuliše glikogenolizu, te time ubrzava rad srca i poja ava snagu kontrakcije sr anog miši a.Medjutim, produženi tretman sa epinefrinom indukuje proliferaciju ovih sr ano-miši nih elija,što u ekstremnim slu ajevima prouzrokuje kardia nu hipertrofiju koja ošte uje sr ani miši ionemogu ava mu normalan rad. Ova epinefrinom-indukovana proliferacija elija je delomposledica aktivacije kaskade MAP kinaza koja može biti indukovana GPCR-arestinkompleksom. Drugi, verovatno važniji put, preko koga aktivacija -adrenegi nog receptorafavorizuje kardia nu hipertrofiju uklju uje drugi tip receptora. Gs protein koji je aktiviran -adrenergi nim receptorom može nekako da prouzrokuje aktivaciju specifi nih ekstracelularnihproteaza koje sadrže metal u aktivnom centru, a koje tako aktivirane cepaju transmembranskiprekursor epidermalnog faktora rasta (engl. Epidermal Growth Factor – EGF). Solubilni EGF seotpušta u ekstracelularni prostor i vezuje se za receptore na membrani iste elije koja ga jeotpustila, aktivira receptore i deluje na tu eliju u autorkinom maniru. Kako e biti pokazano uslede em poglavlju, EGF receptor pripada receptorima sa aktivnoš u tirozin kinaze (engl. ReceptorTyrosine Kinase - RTK), a to je klasa receptora za koju je uobi ajeno da „uklju uje” kaskadu MAPkinaza koja na kraju rezultira proliferacijom elija. Sli na unakrsna-komunikacija (engl. cross-talk) izmedju dva tipa receptora se dešava u mnogim drugim putevima signalne transdukcije. Kaošto ne postoji elija koja živi u izolaciji, takodje nema receptora niti puta transdukcije signala kojifunkcioniše samostalno.

106

107

SIGNALNI PUTEVI OD RECEPTOR-ENZIMA I OD

RECEPTORA VEZANIH ZA ENZIM 04Razvoj svih organizama zahteva izvršavanje kompleksnih programa u kojima se specifi ni geniaktiviraju i ekspresuju u specifi nim setovima elija i u precizno odredjeno vreme. Veliki brojrazvojnih promena je generisan kao rezultat delovanja ekstracelularnih signalnih molekula nanjihove receptore koji se nalaze na površini ciljne elije. Ve ina ovih signala su solubilni,sekretovani fakori koji deluju u autokrinom i/ili parakrinom maniru. Neki od signalnih molekulavezivanjem za receptore na površini elije aktiviraju puteve transdukcije signala koji na krajuprouzrokuju promenu obrazca ekspresije gena.

ak i zrele elije koje su deo diferenciranog tkiva konstatno menjaju njihove obrazce genskeekspresije. U najve em broju slu ajeva ovo se dešava zbog toga što brojni receptori na površnielije kontinuirano primaju informacije od ekstracelularnih signala i transdukuju ove informacije,

preko elemenata signalne transdukcije, u aktivaciju specifi nih transkripcionih faktora kojistimulišu ili spre avaju ekspresiju specifi nih ciljnih gena. Mnogi ovakvi signalni putevi vode kapromeni metaboli ke aktivnosti elije, dok drugi uti u na nivo proteina koji remete sposobnostelije da napreduje u elijskom ciklusu i da se deli.

Tipi na elija sisara obi no ekspresuje elijske-površinske receptore za više od 100 razli itihtipova ekstracelulanih signalnih molekula koje funkcionišu prvenstveno u smislu regulacijeaktivnosti transkripcionih faktora (videti sliku 3.1., na po etku poglavlja 3.). Signalom-indukovana aktivacija transkripcionih faktora se dešava na nekoliko na ina, odnosno aktivacijomnekoliko razli tiih tipova receptora, što za posledicu ima aktivaciju razli ih tipova intracelularnetransdukcije signala. U prethodnom poglavlju, u zadnjoj sekciji (3.5.) je opisano kako stimulacija

108

nekih GPCRs preko cAMP-PKA-signalnog puta aktivira CREB transkripcioni faktor i regulišeekspresiju gena. U ovom poglavlju e biti opisane druge klase elijskih, površinskih, receptorakoje ilustruju dodatne signalnom-indukovane mehanizme aktivacije transkripcionih faktora.

Pored GPCRs, druga velika grupa ili drugi veliki tip receptora na površini elije su tzv. receptorivezani za enzim (engl. enzyme-linked receptors). Ovaj tip receptora je karakteristi an po svojojulozi da prepozna i odgovori na specifi ne ekstracelularne signalne proteine u smislufavorizovanja rasta, proliferacije ili preživljavanja elija u animalnom tkivu. Ovi signalni proteinise veoma esto zajedni ki zovu faktori rasta (engl. Growth Factors - GFs) i oni obi no deluju kaolokalni medijatori u veoma maloj koncentraciji (10-9 do 10-11 M). Odgovor na ovakveekstracelularne signalne molekule je obi no spor (meri se satima ili ak danima) i obi no zahtevaveliki broj intracelularnih signalnih koraka/faza koje e eventualno voditi ka promeni u obrazcuekspresije gena (Tabela 4.1.). Pored toga, neki receptori vezani za enzim posreduju i direktne ibrze efekte na citoskelet, kontrolišu i na taj na in vrstu kretanja elije i promenu njenog oblika.Ekstracelularni signali koji indukuju ove rapidne odgovore vrlo esto nisu difuzibilni, nego sevezuju za površinu elije. Poreme aji u elijskoj proliferaciji, diferencijaciji, preživljavanju imigraciji su fundamentalni dogadjaji koji mogu prouzrokovati kancer, a abnormalnosti usignalingu preko receptora vezanih za enzim i/ili receptora koji sami imaju unutrašnju enzimskuaktivnost imaju veliku ulogu u nastanku i razvoju malignih transformacija i kancera.

Kao i GPCRs, receptori vezani za enzim su transmembranski proteini sa svojim ligand-vezuju imdomenom na spoljašnjoj površini plazma membrane. Umesto da, kao GPCRs, imaju citosolnidomen koji je asociran sa heterotrimernim G proteinima, ovaj tip površinskih receptora imacitosolni domen koji ili sam po sebi ima unutrašnju enzimsku aktivnost ili je direktno asociran saenzimom. Dok GPCRs imaju sedam transmembranskih domena, svaka subjedinica receptoravezanog za enzima obi no ima samo jedan. Do sada je identifikovana šest klasa receptora vezanihza enzim:(1) Receptori sa aktivnoš u tirozin kinaza (engl. Receptor Tyrosine Kinases – RTKs) koji

fosforilišu specifi ne tirozine na malom setu intracelularnih signalnih proteina.(2) Receptori asocirani sa tirozin kinazom (engl. Tyrosine-Kinase-Associated-Receptors –

TKARs) koji su asocirani sa intracelularnim proteinom koji ima aktivnost tirozin kinaze.(3) Receptorima-sli ne tirozin fosfataze (engl. Receptor-Like Tyrosine Phosphatases - RLTPs)

koje uklanjaju fosfatne grupe sa tirozina na specifi nim intracelularnim signalnim

109

proteinima. Zovu se “receptorima-sli ne” zbog toga što njihov verovatni ligand još uvek nijeidentifikovan, te njihova receptorna funkcija nije direktno i precizno demonstrirana.

(4) Receptori serin/treonin kinaze fosforilišu specifi ne serine ili treonine na asociranimlatentnim/pritajenim genskim regulatornim proteinima.

(5) Receptori guanilil ciklaze (engl. Guanylyl Cyclases – GCs) direktno katalizuju produkcijucGMP-a od prekursora GTP-a u citosolu.

(6) Receptori asocirani sa histidin kinazom (engl. Histidin-Kinase-Associated Receptors -HKARs) aktiviraju tzv. “dvo-komponentni” signalni put u kome kinaza autofosforilacijomfosforiliše samu-sebe a onda odmah prenosi fosfat na drugi intracelularni signalni protein.

Stimulacija receptora za faktor transformišu eg rasta ili transformišu i faktor rasta beta (engl.Transforming Growth Factor - TGF ), kao i citokinskih receptora vodi direktno aktivacijicitosolnih transkripcionih faktora, a kao rezultat fosforilacije kinazom koja je deo citosolnogdomena receptora ili je asocirana sa receptorom sa citosolne strane. Fosforilisani i aktiviranicitosolni transkripcioni faktori se potom translociraju u nukleus i deluju na specifi ne ciljne geneu smislu regulacije njihove transkripcije. U slu aju receptora sa aktivnoš u tirozin kinaza,RTKs, vezivanje liganda za receptor inicira seriju pokretnih kaskadnih dogadjaja koji vodeaktivaciji citosolne kinaze koja se translocira u nukleus, gde fosforilacijom aktivira jedan ili višetranskripcionih faktora. Signaling od receptora za faktor nekroze tumora (engl. TumorNecrosis Factor –TNF- ) generiše aktivni NF-kappaB, NF- B, transkripcioni faktor proteoliti kimcepanjem proteina citosolnog inhibotora. Proteoliti ko cepanja Notch receptora oslobadjacitosolni domen receptora koji funkcioniše kao koaktivator za transkripcione faktore u nukleusu.Proteoliza takodje ima klju nu ulogu u signalnim putevima aktiviranim vezivanjem proteinskihliganda koji se zovu Wnt i Hedgehog (Hh) za njihove receptore, a signalni putevi aktivirani ovimligandima imaju vode u ulogu tokom razvoja i diferencijacije.

Zbog jednostavnosti, vrlo esto se opisuju razli ite receptorne klase nezavisno sa fokusom naglavni put signalne transdukcije iniciran svakom klasom receptora. Medjutim, nekoliko klasareceptora može da transdukuje signal preko više od jednog puta (Tabela 4.1.). Pored toga, mnogigeni su regulisani sa brojnim transkripcionim faktorima, od kojih svaki može biti aktiviran sajednim ekstracelularnim signalom ili sa više ekstracelularnih signala. Ovakva unakrsna-komunikacija (engl. cross-talk) izmedju signalnih puteva i njima aktivirana promena u obrazcugenske ekspresije evantualno može biti toliko produžena da elija može predpostaviti razli iturazvojnu sudbinu, što je posebno izraženo tokom ranih faza razvoja.

110

Tabela 4.1. Pregled glavnih klasa receptora i signalnih putevaKLASA RECEPTORA / SIGNALNI PUT * KARAKTERISTIKE PO KOJIMA SE RAZLIKUJU

RECEPTORI VEZANI ZA HETERO-TRIMERNE G PROTEINE

GPCR

Ligandi: Epinefrin, glukagon, serotonin, vazopresin, ACTH, adenozin i mnogi drugi (kodsisara); mirisni molekuli, svetlost; faktori parenja/sparivanja kod kvasacaReceptori: sedam transmembranskih heliksa; citosolni domen udružen sa membranskimlancem trimernog G proteinaSignalna transdukcija: (1) putevi sekundarnih glasnika koji uklju uju cAMP ili IP3/DAG; (2)jonski kanali; (3) put MAP kinaza

RECEPTORI SA UNUTRAŠNJOM ILI UDRUŽENOM ENZIMSKOM AKTIVNOŠ U

TGF receptori

Ligandi: Transformišu i faktor rasta superfamilija (TGF , BMPs), aktivin, inhibini (kodsisara); Dpp (Drosophila)Receptori: unutrašnji protein sa serin/treonin kinaznom aktivnoš u u citosolnom domenu(tip I i II)Signalna transdukcija: direktna aktivacija citosolnih Smad transkripcionih faktora

Citokinski receptori

Ligandi: Interferoni, eritropoetin, hormon rasta, neki interleukini (IL-2, IL-4) i drugi citokiniReceptori: jedinstveni transmembranski heliks; konzervirani multi- lanac nabran uekstracelularnom domenu; JAK kinaza udružena sa intracelularnim domenomSignalna transdukcija: (1) direktna aktivacija citosolnih STAT transkripcionih faktora; (2)put PI-3 kinaza; (3) IP3/ DAG put; (4) put Ras-MAP kinaza

Tirozin kinazni receptori

Ligandi: insulin, epidermalni faktor rasta (EGF), fibroblastni faktor rasta (FGF),neurotrofini, drugi faktori rastaReceptori: jedinstveni transmembranski heliks; unutrašnji protein sa tirozin-kinaznomaktivnoš u u citosolnom domenuSignalna transdukcija: (1) put Ras-MAP kinaza; (2) IP3/ DAG put; (3) put PI-3 kinaza

Receptori guanilil ciklaza

Ligandi: Atrijalni natriureti ki faktor i srodni peptidni hormoniReceptori: jedinstveni transmembranski heliks; unutrašnja guanil ciklazna aktivnost ucitosolnom domenuSignalna transdukcija: stvaranje cGMP-a

Receptori fosfotirozin fosfataza

Ligandi: Plejotriofini i drugi proteinski hormoniReceptori: unutrašnja fosfotirozin fosfatazna aktivnost u citosolnom domenu, inhibisanavezivanjem ligandaSignalna transdukcija: hidroliza aktiviranog fosfotirozinskog ostatka citosolnog proteinatirozin kinaze

T- elijski receptori - TCR

Ligandi: mali peptidi udruženi sa glavnim histokompatibilnim (MHC) proteinima u plazmamembrani makrofaga i drugih antigen prezentuju ih elijaReceptori: jedinstveni transmembranski heliks; nekoliko protein kinaza udruženih sacitosolnim domenom; prona eni jedino u T limfocitimaSignalna transdukcija: (1) aktivacija citosolnih protein tirozin kinaza; (2) put PI-3 kinaza; (3)IP3/ DAG put; (4) put Ras-MAP kinaza

RECEPTORI KOJI SU JONSKI KANALI

Jonski kanali za koje se vezujuligandi

Ligandi: neurotransmiteri (acetilholin, glutamat), cGMP, fizi ki stimulusi ( dodir, istezanje),IP3 (receptori u membrani ER)Receptori: etiri od pet subjedinica sa homologim segmentom u svakoj subjedinici, kojeoblažu jonski kanalSignalna transdukcija: (1) lokalne promene membrabnskog potencijala usled influksa jona;(2) porast koncentracije Ca2+ u citosolu

* Ukoliko nije druga ije nazna eno, svi receptori su locirani na plazma membrani

111

Tabela 4.1. Pregled glavnih klasa receptora i signalnih puteva (nastavak)KLASA RECEPTORA / SIGNALNI PUT * KARAKTERISTIKE PO KOJIMA SE RAZLIKUJU

PUTEVI KOJI UKLJU UJU PROTEOLIZU

Wnt put

Ligandi: sekretovani Wnt (kod sisara); Wg (kod Drozofile)Receptori: Frizzled (Fz) sa sedam transmembranskih heliksa; udruženi-membranskivezani-LDL-receptoru-sli ni protein (Lrp) neophodan za receptorsku aktivnostSignalna transdukcija: skup multiproteinskih kompleksa na membrani koji inhibišuproteazomom-posredovanu proteolizu citosolnog -katenin transkripcionog faktora,rezultiraju i njegovom akumulacijom

Hedgehog (Hh) put

Ligandi: elijski vezani HedgehogReceptori: Vezivanje Hh za Patched (Ptc), koji ima 12 transmembranskih heliksa;aktivacija signalinga od Smoothened (Smo), sa 7 transmembranskih heliksaSignalna transdukcija: Proteoliti ko osloba anje transkripcionog aktivatora odmultiproteinskog kompleksa u citosolu

Notch/Delta put

Ligandi: membranski vezani Delta ili Serrate proteinReceptori: Ekstracelularna subjedinica Notch receptora nekovalentno udružena satransmembranskom citosolnom subjedinicomSignalna transdukcija: Intramembransko proteoliti ko cepanje transmembranskog domenareceptora, sa osloba anjem citosolnog segmenta koji funkcioniše kao koaktivator jedarnihtranskripcionih faktora

NF- B putLigandi: faktor nekroze tumora (TNF- ), interleukin 1 (kod sisara); Spätzle (DrozophilaReceptori: razli iti su kod sisara; Toll i Toll- sli ni receptori kod DrosophileSignalna transdukcija: Fosforilacijom- zavisna degradacija inhibitornog proteina saosloba anjem aktivnog NF- B transkripcionog faktora u citosolu

PUTEVI INTRACELULARNIH RECEPTORA

Azot oksid putLigandi: Azot oksid (NO)Receptori: solubilna guanil ciklazaSignalna transdukcija: stvaranje cgMP-a

Putevi nukearnih receptora

Ligandi: Lipofilni molekuli, uklju uju i steroidne hormone, tiroksin, retinoide i masnekiseline kod sisara i ekdizon kod DrosophileReceptori: visoko konzervirani DNK-vezuju i domen, konzervirani hormon vezuju i domeni varijabilni domen; lociran unutar jedra ili citosolaSignalna transdukcija: Aktivacija receptornih transkripcionih faktora vezivanjem liganda

* Ukoliko nije druga ije nazna eno, svi receptori su locirani na plazma membrani

(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptirano od Brivanlou &Darnel. (2002), Science 295:813.)

Nau nici primenjuju razli ite vrste eksperimentalnih pristupa i model-sistema da biidentifikovali i prou avali funkciju ekstracelularnih signalnih molekula, receptora, kao iintracelularnih puteva transdukcije signalna preko signal-transdukcionih proteina. Na primer,sekretovani signalni protein Hedgehog (Hh) i njegov receptor su prvo identifikovani kod mutantaDrosophile melanogaster koji ima poreme aj u razvoju. Nakon toga su klonirani humani imišiji homologi ovog proteina, a potom je pokazano da oni participiraju u brojnim i veomavažnim signalnim dogadjajima tokom diferencijacije. Neki proteini signalne transdukcije su prvoidentifikovani prilikom fukcionalnih mutacija u genu koji ga kodira ili overekspresije normalnogproteina, što je prouzrokovalo abnormalnu proliferaciju elija koja je vodila ka malignitetu. Na

112

ovaj na in je identifikovan mutantni Ras protein koji ispoljava aktivnost koja nije podložnaregulaciji tj. tzv. neregulisanu ili konstitutivnu aktivnost. Normalan, tzv. divlji tip (engl. wildtype), Ras je kasnije identifikovan kao klju ni u esnik u mnogim signalnim putevima. Veliki brojekstracelularnih signalnih molekula inicijalno je bio izdvojen i pre iš en (purifikovan) iz elijskihekstrakata, a na osnovu njihove sposobnosti da stimulišu rast i proliferaciju specifi nih tipoveelija. Ovih nekoliko primera ilustruje neophodnost multidisciplinarnog pristupa izu avanju

signalnih puteva što podrazumeva i uklju uje biohemijske, geneti ke (kvasci, crvi, mušice, miševii drugi organizmi) i fiziološke eksperimentalne pristupe, kao i multidisciplinarni pristupanaliziranju rezultata.

4.1. SIGNALING PREKO TGF RECEPTORA I DIREKTNA AKTIVACIJA Smad PROTEINA

Veliku broj faktora koji regulišu promene u razvoja ini superfamiliju faktora transformacije rastaili superfamiliju transformišu eg faktora rasta beta beta (engl. Transforming Growth Factor -TGF ). Ovu superfamiliju zapravo ini veliki broj sli nih ekstracelularnih signalnih molekula kojiimaju široki spektar funkcija u regulciji razvoja i kod beski menjaka i kod ki menjaka. Jedanlan ove superfamilije, morfogeni protein kosti (engl. Bone Morphogenic Protein - BMP) je

prvobitno bio identifikovan zbog svoje sposobnosti da indukuje formiranje kosti u kulturi elija.Danas se jedan tip ovog proteina, BMP7, koristi u klinici za oja avanje kosti nakon ozbiljnihpreloma. Otkriveni su i drugi BMP proteini sa brojnim funkcijama u indukovanju klju nih fazarazvoja, uklju uju i formiranje mezoderma i najranijih fromi elija hematopoeze.

Drugi lan superfamilije TGF , TGF -1, je identifikovan na osnovu svoje sposobnosti da indukujetransformaciju fenotipa odredjenih elija u kulturi. Pored toga, sve tri humane isoforme TGF -1koje su do sada poznate imaju antiproliferativni efekat na mnoge tipove sisarskih elija.Gubitak receptora za TGF -1 ili nekih intracelularnih signalnih proteina koji u estvuju utransdukciji signala od TGF -1 receptora oslobadja elije antiproliferativnog delovanja TGF -1, štose esto dešava kod humanih tumora. Takodje, TGF -1 proteini favorizuju ekspresiju elijskihadhezionih molekula i molekula ekstracelularnog matriksa. TGF -1 stimuliše neke elije dasintetišu i sekretuju faktore rasta koji mogu da balansiraju, ili nekada ak i prevazidju,normalnu TGF -1-indukovanu inhibiciju rasta. Homolog TGF -1 proteina kod Drosophilemelanogaster se zove Dpp proteini i kontroliše dorzoventralni obrazac razvoja embriona mušice.

113

Drugi lanovi sisarske TGF -1 superfamilije, aktini i inhibini, deluju na rani razvoj genitalnogtrakta.

Pored veoma brojnih i kompleksnih elijskih efekata indukovanih raznovrsnim lanovima TGF -1superfamilije, signal-transdukcioni put je u osnovi jednostavan. Jednom aktivirani, receptori zaove ligande direktno fosforilišu i aktiviraju odredjeni tip transkripcionog faktora. Odgovordate elije na taj aktivirani transkripcioni faktor zavisi i od konstelacije i stanja ostalihtranskripcionih faktora koje elija ve sadrži.

4.1.1. TGF se formira cepanjem skeretovanog inaktivnog prekursora

Kod ljudi se TGF sre u u tri izofrome ovog proteina TGF TGF i TGF , od kojih je svakikodiran unikatnim genom i ekspresovan u tkivno-specifi nom i razvojno-regulatornom maniru. Svakaizoforma TGF je sintetisana kao deo ve eg prekursora kojisadrži pro-domen. Ovaj domen se cepa, ali ostajenekovalentno asociran sa zrelim/kona nim proteinomnakon njegove sekrecije. Ve ina sekretovanih TGFproteina se magacionira u ekstracelularnom matriksu kaolatentan, inaktivni kompleks koji sadrži „pocepani”prekursor TGF i kovalentno vezani TGF -vezuju i proteinkoji se zove Latentni TGF vezuju i protein (Latent TGFBinding Protein - LTBP). Vezivanje LTBP za matriksniprotein trombospondin ili za odredjene tipove elijskih-površinskih integrina indukuje konformacione promeneLTBP i prouzrokuje otpuštanje zrelog, dimernog TGF .Alternativno, digestija vezanog proteina kataliti kimdelovanjem matriksnih metaloproteaza može rezultiratiaktivacijom TGF (Slika 4.1A.). Monomerna forma TGFfaktora rasta sadrži 110-140 aminokiselina i imakompaktnu strukturu sa etiri antiparalelna lanca i trikonzervisana intracelularna disulfidna mosta (Slika 4.1B.).

Slika 4.1. Formiranje i struktura TGF superfamilije signalnih molekula.

114

Ovo formira strukturu poznatu kao cisteinski motiv/mustra i koja je relativno rezistentnaprema denaturaciji. Ve ina varijacija u sekvenci izmedju razli itih TGF proteina vezana je za N-terminalni region, petlju koja je priklju ena lancima i -heliks. Razli ite heterodimernekombinacije ovih proteina mogu da pove avaju funkcionalnu raznolikost ovih proteina mnogoviše nego što je generisano razlikama u primarnoj sekvenci monomera.

4.1.2. Receptori za TGF signaling imaju aktivnost serin/treonin kinazna

Da bi identifikovali receptore za TGF na površini elije istraživa i su prvo pomešali i obeležilipurifikovani TGF protein sa radioizotopom-I125 (125I) u uslovima u kojima se ovaj radioizotopkonvalentno vezuje za tirozinske ostatke koji su izloženi na molekulu proteina. Ovakav, 125I-obeleženi, TGF je inkubiran sa elijama u kulturi, a potom je inkubaciona smeša tretirana sahemijskim agensima koji se „cross”-reaguju (unakrsno se vezuju) sa obeleženim TGF , odnosno,kompetituju za TGF receptorna mesta na površini elija u kulturi. Purifikacija obeleženihreceptora pokazala je postojanje tri razli ita polipeptida sa molekulskom težinom od oko 55, 85 i280 kDa, a koji se obeležavaju kao RI, RII i RIII receptori za TGF .

Najizraženiji TGF receptor, RIII, je proteoglikan na površini elije, te se RIII receptor za TGF jošnaziva i -glikan. Ovaj tip receptora vezuje i koncentriše TGF veoma blizu površine elije. Tip I itip II receptori su dimerni transmembranski proteini sa serin/treonin kinazom kao delomnjihovog citosolnog domena. RII je konstitutivno aktivna kinaza koja, u odsustvu TGF , fosforilišesamu sebe procesom autofosforilacije. Vezivanje TGF indukuje formiranje kompleksa koji sadržepo dve kopije od svakog RI i RII. Nakon toga, RII fosforiliše serinske i treoninske ostatke navisoko-konzervisanoj sekvenci RI subjedinice pridodate citosolu-okrenutoj strani plazmamembrane, te na taj na in aktivira kinaznu aktivnost RI.

4.1.3. Aktivirani Tip I TGF receptori fosforilišu Smad transkripcione faktore

Geneti kim studijama, sli nim onima koje su koriš ene za disekciju i analizu signalnih puteva odreceptora sa aktivnoš u tirozin kinaze (videti sekciju 4.3. u ovom poglavlju), nau nici su otkrilitranskripcione faktore koji se aktiviraju vezivanjem signalnih molekula za TGF receptoreDrosophile melanogaster. Ovi transkripcioni faktori kod Drosophile, ali i sli ni proteini ki menjaka

115

se nazivaju Smad proteini (engl. Smads). Familija Smad proteina su proteini ki menjakahomologi i sa specifi nim proteinom Drosophile melanogaster koji se zove MAD (engl. MothersAgainst Decapentaplegic - MAD), kao i sa specifi nim proteinom Caenorhabditis elegans koji sezove SMA. Ime Smad je kombinacija ova dva. Istraživanja na larvama Drosophile melanogasterpokazala su da mutacija MAD gena kod majki, represuje dekapentaplegi ni gen u embironu.Fraza “majke protiv dekapentaplegije engl. Mothers Against Decapentaplegic - MAD) je pridodatazbog toga što majke esto formiraju organizacije koje se protive i suprotstavljaju razli itimproblemima (npr. “majke protiv pijanih voza a”; engl. Mothers Against Drunk Drivers - MADD)(engl. mothers against decapentaplegic). Tri tipa receptora za Smad proteine funkcionišu u TGFsignalinom putu: (1) receptorom-regulisani Smad proteini (R-Smads) koji uklju uju Smad1,Smad2, Smad3, Smad5 i Smad9; (2) co-Smad proteini (co-Smads) koji uklju uje Smad4; (3)inhibitorni ili antagonisti ki Smad proteini (I-Smads) koji uklju uju Smad6 i Smad7. VezivanjeTGF za svoje receptore aktivira signalne puteve transdukcije signala koji prozrokujuoligomerizaciju i fosforilaciju Smad1 proteina . Smad1 je receptorom-regulisani Smad protein iaktivira se preko BMP tip I receptora-kinaze.

R-Smads imaju dva domena, MH1 i MH2, koji su odvojeni fleksibilnim vezivnim regionom (Slika4.2.). N-terminalni MH1 domen sadrži specifi an DNK-vezuju i segment, kao i sekvencu koja sezove signal za nuklearnu lokalizaciju (engl. Nuclear Localization Signal - NLS) i koja jeneophodna za transport proteina u nukleus. Kada je R-Smad u nefosforilisanom stanju, NLS jemaskirana, a MH1 i MH2 domeni su asocirani u takvom maniru da ne mogu da se vežu za DNKniti za co-Smad. Fosforilacija tri serinska ostatka blizu C-treminusa R-Smada (Smad2 i Smad3)aktiviranim TGF receptorom tipa I razdvaja domene i dozvoljava vezivanje importina za NLS.Nakon toga se u citosolu simultano formira kompleks od dve Smad3 molekule (ili Smad2molekule) i jedne co-Smad (Smad4) molekule. Kompleks se stabilizuje vezivanjem fosforilisanihserina na svakom Smad3 za fosfoserin-vezuju a mesta na MH2 domenima i Smad3 i Smad4molekula. Vezani importin onda posreduje translokaciju heteromernih R-Smad/co-Smadkompleksa u nukleus. Nakon što se importin disocira unutar nukleusa, Smad2/Smad4 iliSmad3/Smad4 kompleksi kooperišu sa drugim transkripcionim faktorima u cilju aktivacijetranskriptcije specifi nih gena.

U nukleusu se R-Smads kontinuirano defosforiliše, što rezultira disocijacijom R-Smad/co-Smadkompleksa i eksportovanjem ovih Smad proteina iz nukleusa. Zbog kontinuiranog

116

nukleocitoplazmati nog kretanja tamo-ovamo, koncentracija aktivnih Smad proteina u nukleusublisko reflektuje nivo aktiviranog TGF receptora na površini elije.

Skoro sve elije sisara sekretuju makar jedanizoformu TGF i ve ina elija ima TGF receptorna svojoj površini. Medjutim, s obzirom da razli ititipovi elija imaju razli ite setove transkripcionihfaktora sa kojima aktivirani Smad proteini moguda se vežu, intracelularni odgovori indukovanivezivanjem TGF se razlikuju izmedju tipovaelija. Na primer, u epitelijalnim elijama i

fibroblastima TGF ne indukuje samo ekspresijuproteina ekstracelularnog matriksa (kolagena)nego i proteina koji inhibišu serumske proteazekoje bi u protivnom degradirale ekstracelularnimatriks. Jedna od serumskih proteaza je iinhibitor aktivatora plazminogena 1, PAI-1 (engl.Plazminogena Activator Inhibitor 1 – PAI-1).Transkripcija PAI-1 gena zahteva formiranjekompleksa transkripcionoog faktora TFE3 saSmad3/Smad4 kompleksom i vezivanje svih ovihproteina za specifi nu sekvencu u okviruregulatornog regiona PAI-1 gena (Slika 4.2.).

Slika 4.2. TGF -Smad singalni put.1A – U nekim elijama se TGF veže za tip III TGF recpetora (RIII) koji gaprezentuje receptoru tipa II (RII). 1B – U drugim elijama se TGF veže direktno zaRII koji je konstitutivno fosforilisana i aktivna kinaza. 2 – Ligand-RII regrutuje ifosforiliše jukstamembranske segmente receptora tipa I (RI), koji ne veže direktnoTGF . Ovo oslobadja inhibicije RI kinaznu aktivnost koja je ina e zatvorena izmedjuRI segmenata izmedju membrane i kinaznog domena. 3 – Aktivirani RI potomfosforiliše Smad3 (prikazano na slici) ili neki druigi R-Smad protein, prouzrokuju ikonformacione promene koje omogu avaju dostupnost skevence za nuklearnulokalizaciju (NLS). 4 – Dve fosforilisane Smad3 molekule interaguju sa co-Smad(Smad4) proteinom koji nije fosforilisan i sa importinom (Imp- ) i formiraju velikicitoslolni kompleks. 5 i 6 – nakon translociranja celokupnog citosolnog kompleksa unukleus Ran-GTP prouzrokuje disocijaciju Imp- . 7 – Nuklearni transkripcioni faktor(npr. TFE3) se asocira sa Smad3/Smad4 kompleksom formiraju i aktivacionikompleks koji se kooperativno veže sa preciznom geometrijom za regulatornusekvencu ciljnog gena. U donjem delu slike je prikazan aktivacioni kompleks za genkoji kodira inhibitor aktivatora plazminogena 1 (PAI-1).

117

Pridruživanjem sa ostalim transkripcionim faktorima, kompleksi Smad2/Smad4 i Smad3/Smad4indukuju ekspresiju proteina kao što je p15 koji „zarobljava”/zaustavlja elijski ciklus u G1 fazi itime blokira proliferaciju. Ovi Smad kompleksi takodje vrše represiju transkripcije myc gena, tetime redukuju ekspresiju mnogih gena koji favorizuju rast, a ija je transkripcija normalnoaktivirana Myc proteinom. Razli iti faktori rasta u TGF superfamiliji se vezuju za svoje sopstvenereceptore i aktiviraju razli ite setove Smad proteina, te time aktiviraju razli ite elijske odgovore.Specifi nost koja se ispoljava medju ovim sli nim receptorima je uobi ajeni fenomen uintracelularnoj signalnoj transdukciji, a TGF je izvanredan primer jedne strategije u ostvarivanjutakve specifi nosti odgovora. Na primer, vezivanje bilo koje izoforme TGF za specifi ni receptorvodi fosforilaciji Smad2 ili Smad3 proteina, formiranju Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4kompleksa i eventualno aktivaciji transkripcije specifi nih ciljnih gena (npr. PAI-1). Sa drugestrane, BMP protein, koji takodje pripada TGF superfamiliji, se vezuje i aktivira razli ite setovereceptora, što prouzrokuje fosforilaciju Smad1 proteina, njegovu dimerizaciju sa Smad4 iaktivaciju specifi nih transkripcionih odgovora preko Smad1/Smad4 kompleksa. Ovi mehanizmi

aktivacije transkripcije se razlikujuod mehanizama preko kojihSmad2/Smad4 i Smad3/Smad4aktiviraju transkripciju.

Slika 4.3. Model Smad-zavisnog signalnog putaaktiviranog preko TGF .Uo iti da je TGF dimer i da se Smad otvara da biispoljio površinu za dimerizaciju kada su fosforilisane.Nekoliko karakteristika puta nije prikazano radijednostavnosti: (1) RI i RII su dimeri. (2) RI jenormalno asociran sa inhibitornim proteinom koji sedisocira od RI kada je on fosforilisan od strane RII. (3)Individualni Smad proteini su trimeri. (4) Protein zausidravanje koji se naziva SARA (engl. Smad Anchorfor Receptor Activation) pomaže pri regrutovanjuSmad2 ili Smad3 za aktivaciju RI, i to tako što se vežeza RI, za Smad proteine i za inozitol fosfolipidnemolekule u plazma membrani. (5) funkcija odredjenihSmad proteina je regulisana enzimima koji poja avajuubikvinaciju, a time i njihovu degradaciju.

118

4.1.4. Onkoproteini i I-Smad proteini regulišu Smad-signaling preko negative povatnesprege

TGF -4 je negativni regulator proliferacije epitelijalnih elija mle nih žlezda. Reguliše normalanrazvoj duktusa i alveoa u mle noj žlezdi i uklju en je u postlaktacionu involuciju. Visok nivoekspresije TFG in vivo spre ava formiranje tumora mle nih žlezda, sugerišu i time veomazna ajnu ulogu ovog faktora rasta u formiranju, razvoju i funkciji mle nih žlezda. Kao što jenavedeno, TGF signali se transdukuju preko RI i RII tipa receptora do intracelularnih signalnihmedijatora Smad2 i Smad3 proteina. Pored navedenih puteva regulacije, Smad signaling jedodatno regulisan intracelularnim proteinima, uklju uju i citosolne proteine koji se zovu SnoN iSki (Ski ozna ava „Sloan-Kettering Cancer Institute) i koji su negativni regulatori TGFsignalinga. Ovi proteini su originalno identifikovani kao onkoproteini zbog toga što prouzrokujuabnormalnu proliferaciju elija kada su overekspresovani u kulturi fibroblasta. Ski je prvobitnootkriven kao onkogen prisutan u Sloan-Kettering virusu. Potom su otkriveni Sno i njegoveizoforme SnoN, SnoA i SnoI. SnoN i Ski su strukturalno i funkcionalno visoko homologi proteini.Oni su sposobni da indukuju transformaciju fibroblasta i diferencijaciju miši a pile eg embriona.Pored toga, snoN+/- ili ski+/- heterozigotni miševi ispoljavaju pove anu osetljivost katumorogenezi, što ukazuje da ovi proteini imaju tumor-supresorsku funkciju. Razli iti efekti SnoNi/ili Ski mogu biti povezani sa njihovom sposobnoš u da regulišu transkripciju. Oni se vezujudirektno za korepresor nuklearnih hormonskih receptora (engl. nuclear hormone receptorcorepressor), ili korepresor SMRT (engl. Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid receptors),kao i mSin3A korepresor, te na taj na in formiraju komplekse sa histon deacetilazom (engl.Histone DeACetylase - HDAC) što im omogu ava da deluju kao represori transkripcije. Prematome, overekspresija ili alternativno odsustvo SnoN i/ili Ski može poremetiti brojne transkripcioneregulacione puteve u eliji.

SnoN i Ski se vezuju za Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4 signalne komplekse formiranenakog TGF stimulacije. SnoN i Ski ne remete sposobnost vezivanja Smad kompleksa zaregulatorni region DNK, nego blokiraju Smad kompleksima indukovanu aktivaciju transkripcije,te na taj na in ine elije rezistentnim na delovanje TGF , odnosno TGF -indukovanu inhibicijurasta (Slika 4.4.). Prema tome, SnoN/Ski fukcionišu kao izmenjiva i/prekida i u TGFsignalnoj transdukciji zbog toga što u odsustvu TGF interaguje sa Smad2/Smad4 iliSmad3/Smad4 signalnim kompleksima i regrutuje kompleks korepresor nuklearnihreceptora/mSin3A/HDAC prema Smad proteinima, te tako inhibiše njihovu transaktivacionu

119

sposobnost i represuje TGF signalnu transdukciju. Nakon TGF stimulacije, SnoN se veoma brzodegradira u ubikvitin-proteazomnom putu posredovanom kompleksom koji favorizuje anafazu uelijskom ciklusu (engl. Anaphase-Promoting Complex - APC) ili Smurf2 E3 ligazama. Ovo vodi

ka disocijaciji SnoN od Smads proteina i dozvoljava TFG signalu da bude transdukovan sapovršine elije u njenu unutrašnjost. Intersantno je da, iako TGF stimulacija prouzrokuje veomabrzu degradaciju Sno i/ili Ski proteina, nakon nekoliko asova ekspresija oba proteina postajeveoma snažno indukuje, te se smatra da je ovaj fenomen odgovoran za indukcije mRNK SnoN/Skinakod produženog tretmana sa TGF . Ovo može formirati negativnu povratnu spregu i limitiratiTGF efekte. Važno je napomenuti da overekspresija SnoN i/ili Ski rezultira gubitkom TGF -indukovanih efekata, što vodi poreme aju u rastu elija i sugeriše o potencijalnim mehanizmimaSnoN/Ski-posredovane onkogeneze. Prema tome, regulacija SnoN/Ski proteina ima veoma važnu

ulogu u kontroli TGF aktivnosti u odnosu nazahteve okruženja elija.

Slika 4.4. Šematski model Ski-posredovane down-regulacije odgovorana TGF sitmulaciju.Ski se vezuje za Smad4 u Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4 signalnim kompleksima(nije prikazano) i može parcijalno da poremeti interakciju izmedju Smad proteina. Skitakodje regrutuje protein koji se zove N-CoR i koji se veže direktno za mSin3A, kojipotom interaguje sa histon deacetilazom (engl. Histone DeACetilase - HDAC),enzimom koji favorizuje deacetilaciju histona. Kao rezutat ovoga, isklju uje seaktivacija transkripcije indukovana preko TGF , a posredovana Smad signalnimkompleksima. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WHFreeman and Company;videti Stroschein i sar. (1999), Science 286:771.).

Pored aktivacije navedenih Smad proteina, TGF stimuliše i indukcju I-Smad proteina, a posebnoSmad7 proteina. Smad7 blokira sposobnost aktiviranog RI receptora da fosforiliše R-Smadproteine. Na ovaj na in se Smad7, kao i Ski i SnoN, uklju uje u negativnu povratnu spregu, priemu njegova indukcija, prilikom produžene stimulacije sa TGF inhibiše intracelularni TGF -

signaling, a time i elijske odgovore/efekte koje on pokre e.

4.1.5. Gubitak TGF signalinga u estvuje u indukciji abnormalne proliferacije elija imalignim transformacijama elija

Mnogi humani tumori imaju inaktivne mutacije ili TGF receptora ili Smad proteina , te su prematome rezistentni na inhibiciju rasta prouzrokovanu sa aktivacijom TGF signalinga (Slika 4.5.).

120

Na primer, ve ina pankreasnih kancera ima deleciju gena koji kodira Smad45, tj. tzv. DPC gen, teprema tome nije sposobno da inhibiše p15 ilidruge inhibitore elijskog ciklusa kao odgovorna TGF . Mutacije koje prouzrokuju gubitakfunkcija ili TGF receptora ili Smad proteinafavorizuju proliferaciju i u estvuju uinvazijama i metastazama tumorskih elija(Slika 4.5.). Retionoblastomi, gastri ni kanceri,kanceri kolona, kao i neke malignacije T i Belija takodje nemaju sposobnost da odgovore

na TGF signale. Ovaj gubitak sposobnostiodgovora koreliše sa gubitkom ekspresije TGFreceptora tipa I i II, a ponekada se moženadomestiti overekspresijom proteina koji»nedostaje«, tj. nije ekspresovan. Pored toga,mutacija Smad2 proteina se esto dešava uhumanim kancerima. Nije samo TGFsignaling neophodan za kontrolu proliferacijeelija, nego njegova koordinisana

komunikacija sa drugim signalnim putevima,što prouzrokuje da se neke elije usmeravajuka diferencijaciji na specifi an na in. Prematome, aktivacija TGF signalnog putageneralno inhibiše proliferaciju elija, agubitak/nedostatak razli itih komponenti ovogputa u estvuje u indukciji abnormalneproliferacije elija i malignimtransformacijama.

Slika 4.5. Efekat gubitka TGF signalinga.Vezivanje TGF , fakora koji inhibiše rast, prouzokuje aktivaciju Smadtranskripcionih faktora. U odsustvu TGF signalinga ili zbog mutacije receptoraili mutacija Smad proteina, pove ava se elijska proliferativnost i invazivnost.

5 Gen koji nosi deleciju za Smad4 i definiše mutaciju je nazvan DPC gen, tj. gen izbrisan/ise en u pankreasnom kanceru (engl. Deleted inPancreatic Cancer – DPC).

121

Tabela 4.2. Faktori rasta i inhibitori faktora rasta kod ki menjaka

HORMON IZVOR DEJSTVO

EGF familija: Jedan peptidni lanacEGF Pljuva ne žlezde Proliferacija epitela; nezavisno usidrenje; neovaskularizacija

TGF Više izvora Kao prethodnoNDF Više izvora Epitelijalna proliferacija kod sisara

Epiregulin Više izvora Proliferacija fibroblastaARIA Švanove elije Indukcija Ach receptora

TGF familija: Identi ni ili homologi dimeri

TGF s Svuda prisutanInhibiše proliferaciju epitelijalnih i imunih elija; indukuje

mezodermMüller-ova inhibitorna supstanca Testisi sisara Regresija Müller-ovih kanala kod muškog pola

Inhibin / aktivin Gonade i hipotalamus Inhibicija FSH sekrecije; spermatogeneza

Koštani morfogenetski protein Više izvoraOsteogeneza; koštana reparacija; formiranje embrionalne ose;

gradijenti nervnog sistema

PDGF familija: Identi ni ili homologi dimeriPDGF Trombociti Proliferacija vezivnog tkiva; tkivna reparacija

VEGFNervna tkiva i vaskularna

glatka muskulaturaVaskularni endotelijalni mitogen;

pove ava vaskularnu permeabilnostInsulinska familija: Intaktni ili prese enipeptidni lanci

IGF-I Više izvora GH-zavisni rast hrskavice; parakrini faktor rastaIGF-II Više izvora Rast fetusa

Relaksin Ovarijum Inhibicija uterusnih kontrakcija; izduživanje interpubi nogligamenta i smekšavanje cerviksa

INSL3 Testis Spuštanje testisa u skrotum

FGF familija: Jedan peptidni lanac

FGF Više izvoraRazvoj nervnog, skeletno-miši nog, integumentnog,

kardiovaskularnog i respiratornog sistemaKGF(FGF-7) Stroma epitela Mitogen epitelijalnih elija

NGF familija: Peptidi

NGF Mozak, srce, slezinaOpstanak, uve anje i diferencijacija nervnog sistema;

prvenstveno dorzalnog korena i paravertebralnih ganglijaBDNF Mozak, srce Kao prethodno; prvenstveno dorzalnog korena i nodalnih ganglijaNT-3 Mozak, srce, bubrezi, jetra i timus Kao prethodno; uklju uju i sve tri ganglije

Hematopoetski faktori rasta: Glikoproteinieritropoetin bubrezi Proliferacija progenitorne elije eritrocitaCSFs Endotel, T elije, fibroblasti i

makrofagi Proliferacija progenitorne elije leukocitaIL-3 T elije pomo nice Proliferacija multilinijskih kolonija

SCF Više izvoraProliferacija hematopoetskih elija(prvenstveno mastocita),

germinativnih elija i melanoblastaTrombopoetin Proliferacija progenitorne elije etrombocitaMešoviti faktorRetinoi na kiselina U jetri Epitelijalna diferencijacija

(Preuzeto iz Bolander F.F. (2005): Molecular Endocrinology. Elsevier Academic Press.)

122

4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI

Pord GPCR klase receptora, druga velika klasa receptora na površini elije su citokinskireceptori iji je citosolni domen veoma blisko asociran sa jednim lanom familije citosolnihtirosin kinaza, JAK kinazom (engl. JAnus Kinase). Tre a klasa receptora su receptori tirozinkinaze (engl. Receptor Tyrosine Kinases - RTKs) iji citosolni domen ima aktivnost tirozin kinaza,te se stoga ovi receptori zovu tzv. receptori sa „unutrašnjom” enzimskom aktivnosti. Mehanizmikojima se ligandom aktiviraju citokinski receptori i receptori tirozin kinaze su veoma sli ni ipostoji zna ajno preklapanje u intracelularnim putevima transdukcije signala koji se uklju ujuaktivacijom receptor obe klase. U narednoj sekciji e biti opisane neke sli nosti u signalnimputevima koji se aktiviraju ukoliko su ligandi vezani za receptore ove dve klase.

4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedni kekarakteristike signalinga

Vezivanje liganda za citokinske receptore, kao i RTKs inicira formiranje fukcionalnog dimernogreceptora. U nekim slu ajevima, ligand indukujeasocijaciju dve monomerne subjedinice receptora kojedifunduju jedna prema drugoj u ravni plazmamembrane (Slika 4.6.).

Slika 4.6. Dimerizacija receptora za EGF, receptora satirozin kinaznom aktivnosti.

A – Šematski prikaz položaja ekstracelularnih i transmembranskih domena EGFreceptora. Vezivanje jedne EGF molekule za monomerni receptor prouzrokujeizmenu strukture petlje loicirane izmedju dva EGF-vezuju a domenamonomernog receptora. Dimerizacija dva identi na monomerna receptora kojasu prethodno vezala ligand se odvija u ravni membrane i to interakcijomprvenstveno dva „aktivirana” segmenta sa petljama. B – Strukturaekstracelularnih domena dimernog EGF receptora koji su vezali TGF , homologEGF . Uo iti interakciju izmedju dva „aktivirana” segmenta sa petljama.

123

U nekim drugim slu ajevima, receptor je dimer i u odsustvu liganda, a vezivanje liganda menjakonformaciju ekstracelularnih domena obe subjedinice. Bez obzira da li je monomer ili dimer, usvakom slu aju, formacija funkcionalnog dimernog receptora prouzrokuje da jedna slabo aktivnacitosolna kinaza fosforiliše ta no odredjene tirozinske ostatke na delu molekule druge kinaze kojise zove aktivaciona usna. Fosforilacija tirozina u aktivacionoj usni, aktivira kinaznu aktivnostpomenute kinaze i vodi aktivaciji druge kinaze u dimeru, kao i nekoliko tirozin kinaznih ostatakau citosolnom domenu receptora (Slika 4.7.). Kao što e biti opisano i kasnije, fosforilacija ostatakau aktivacionoj petlji je generalni mehanizam kojim se aktiviraju mnoge kinaze.

Slika 4.7. Generalna strukturaligandom-indukovane aktiva-cije RTKs i citokinskih rece-ptora.1 – Citosolni domen RTKs imakataliti ko mesto proteina tirozinkinaze, dok je citosolni domencitokinskih receptora asociran saodvojenom JAK kinazom. 2 – Uoba tipa receptora, vezivanjeliganda prouzrokuje konformaci-one promene koje favorizujuformiranje funkcionalnog dime-rnog receptora, približavaju i ilidva domena koja imajukataliti ku atkivnost tirozin ki-naze (RTKs) ili dva citosolnadomena koja su asocirana saJAK kinazama (citokinski rece-ptori). Ovi približeni domeni po-tom fosforilišu jedan drugi namestima tirozinskih ostataka naaktivacionoj usni. 3 – Fosforilaci-ja prouzrokuje da se usna po-mera iz kataliti kog mesta kina-ze, te to dozvoljava da se ATP iliproteinski supstrat vežu. Aktivi-rana kinaza potom fosforilišedruge tirozinske ostake u citoso-lnom domenu receptora. Dobije-ni fosforilisani tirozini funkcionišukao mesta za pristajanje (engl.docking sites) razli itih proteinakoji u estuvuju u transdukcijisignala.

124

Odredjeni fosfo-tirozinski ostaci formirani u aktiviranim citokinskim receptorima ili RTKs imajufunkciju mesta za vezivanje, ili za „pristajanje” (engl. docking sites), SH2 domena (engl. SrcHomology 2 domains) ili PTB domena (engl. PhosphoTyrosine Binding domains), koji su prisutniu širokom spektru intracelularnih signal-transdukcionih proteina. Vezivanje ovih domena zafosfotirozine specifi ne sekvence aktiviranih receptora prouzrokuje fosforilaciju nekih proteina kojiu estvuju u transdukciji signala. Ova fosforilacije se ostvaruje ili citosolnim delom molekulereceptora koji ima tirozin kinaznu kataliti ku aktivnost (RTKs) ili citosolnim delom molekulereceptora koji je asociran sa kinazom (citokinski receptori). Fosforilacija signal-transdukcionihproteina prouzrokuje njihovu aktivaciju i vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina koji suprisutni u citosolu nestimulisane elije, te ih tako pozicionira blizu njihovih supstrata koji sulokalizovani u plazma membrani ili aktivira dalje puteve transdukcije signala.

Neki citokinski receptori (npr. IL-4 receptor), kao i neki RTKs (npr. insulinski receptor) vezujuIRS-16 ili neki drugi protein koji ima više „mesta za pristajanje „ (engl. multidocking protein)preko PTB domena „docking” proteina. Aktivirani receptor potom fosforiliše vezani “docking”protein formiraju i na taj na in puno fosforilisanih tirozinskih ostataka na “docking” proteinu, teovi fosforilisani tirozini sada sami po sebi funkcionišu kao “docking” mesta za SH2, tj. signal-

transdukcione proteine koji imaju SH2domene (Slika 4.8.).

Slika 4.8. Regrutovanje signal-transdukcionih proteinaprema elijskoj membrani preko vezivanja za fosfo-tirozinske ostatke aktviranog receptora.Citosolni proteini sa SH2 ili PTB domenima se mogu vezivati zaspecifi ne fosfotirozinske ostatke aktiviranog RTKs (prikazano na slici) ilicitokinskog receptora. U nekim slu ajevima su signal-transdukcioniproteini fosforilisani ili sa receptorskom-unutrašnjom ili sa receptorom-asociranom tirozin kinazom, te se time poja ava njihova aktivnost. NekiRTKs i citokinski receptori koriste “multidocking” proteine kao što je IRS-1 da bi pove ali broj signal-transdukcionih proteina koji se regrutuju iaktiviraju. Posledi na receptor- kinazna fosforilacija IRS-1 kreira fosfo-tirozinske ostatke koji funkcionišu kao dodatna “docking” mesta za SH2domene signal-trandukcionih proteina.

6 IRS (engl. Insulin Receptor Substrate - IRS) molekul ima funkciju “docking” proteina izmedju insulinskog receptora i kompleksne mrežeintracelulanih molekula za transdukciju signala koji sadrže SH2 domene (engl. Src Homology 2 domains).

125

4.2.2. Citokini uti u na razvoj mnogih tipova elija

Citokini su familija relativno malih, sekretornih proteina (generalno sadrže oko 160aminokiselina) koji kontrolišu mnoge aspekte rasta i diferencijacije u specifi nim tipovima elija(Tabela 4.3.). Na primer, prolaktin tokom trudno e stimuliše epitelijale elije koje oblažu nezreleduktuse mle nih žlezda da se diferenciraju u acinarne elije koje e produkovati proteine mleka isekretovati ih u kanale mle ne žlezde. Drugi citokin, interleukin 2 (IL-2) je esencijalan zaproliferaciju i funkcionisanje T elija (T limofocita) imunog sistema, dok je njemu blizak i srodnicitokin, IL-4, esencijalan za formiranje i funkcionisanje efektornih B elija (B limfocita) kojeprodukuju antitela. Neki citokini, kao što je interferon , se produkuju i sekretuju od stranevelikog broja razli itih tipova elija, a kao odgovor na virusnu infekciju. Sekretovani interferonideluju na susedne elije u parakrinom maniru i indukuju enzime koji ine ove elije rezistentnijimna virusnu infekciju. Veliki broj citokina u estvuje u aktivaciji, kao i efektornimmehanizmima imunog sistema (detaljniji opis je mogu e na i u skripti Molekularna i elijska

imunologija, Kosti i Andri , 2007). Pored toga, velikibroj citokina u estvuje i u hematopoezi, procesustvaranja uobli enih elemenata krvi (detaljniji opis jemogu e na i u skripti Uporedna fiziologija životinja,Andri i saradnici, 2005). Eritropoetin (Epo) jecitokin (može delovati i u endokrinom maniru, pa seesto naziva i hormonom) koji indukuje produkciju

eritrocita stimulacijom indukcije proliferacije idiferencijacije eritroidne progenitorne elije ukoštanoj srži (Slika 4.9.).

Slika 4.9. Uloga eritropetina u formiranju eritrocita.Eritroidne progenitorne elije koje se nazivaju eritroidne kolonija-formiraju e jedinice(engl. Colony Forming Units Erythroid – CFU-E) su derivati hematopoetskih pluripotentnihstem elija koje takodje daju progenitorne elije i za druge tipove elija krvi. U odsustvueritropoetina CFU-E elije ulaze u apoptozu tj. proces programirane elijske smrti.Vezivanje eritropetina za njegov receptor na CFU-E indukuje transkripciju nekoliko genakoji kodiraju proteine koji spre avaju apoptozu, dozvoljavaju i CFU-E elijama da preživei da prolaze kroz program od tri do pet završnih deoba elije. Eritropoetin takodjeindukuje ekspresiju proteina specifi nih za eritrocite kao što je globin koji potom formirahemoglobin, kao i membranski protein glikoforin i jono-izmenjiva ki protein. Receptori zaeritropoetin, kao i drugi membranski proteini se gube sa površine CFU-E elija kada oneulaze u proces diferencijacije. Ukoliko se CFU-E elije gaje u kulturi sa eritropoetinom upolu vrstom medijumu (npr. sadrži metilcelulozu), elije koje su potomci ne mogu da seudaljavaju, te svaka CFU-E elija produkuje koloniju od 30-100 eritroidnih elija.)

126

Eritropoetin se sintetiše u elijama bubrega koje su monitori, tj. prate koncentraciju kiseonika ukrvi. Hipoksija ili pad koncentracije kiseonika u krvi ispod normalnog nivoa, može da buderezultat smanjenja broja eritrocita ispod optimalnog nivoa, imaju i u vidu da je njihova osnovnafunkcija transport gasova, a prvenstveno kiseonika vezanog za hemoglobin. elije bubrega kojepreko tzv. kiseoni nog senzora (hem protein) registruju pad kiseonika u krvi odgovaraju tako štoindukuju aktivaciju kiseonik-senzitivnog transkripcionog faktora ili hipoksijom-indukovanogfaktora, HIF-1 (engl. Hypoxia Induced Factor 1). Nedostatak kiseonika na senzoru aktiviraintermedijere (X) koji potom stimulišu pove anu produkciju obe subjedinice HIF-1transkripcionog faktora. HIF-1 aktivira transkripciju gena koji kodiraju proteine koji posredujukratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficit kiseonika. HIF-1 aktivira razli ite ciljne gene urazli itim elijama ukazuju i time da verovatno deluje u kombinaciji sa drugim proteinima kojiregulišu transkripciju gena (Slika 4.10).

Slika 4.10. Model signalnih putevakoji se uklju uju kao odgovor nahipoksiju, a posredovani su HIF-1.Lokalna koncentracija kiseonika seregistruje verovatno „kiseoni nim senzorom”koji zahteva hem-asocirane proteine (S-heme). Nedostatak kiseonika na senzoruaktivira intermedijere (X) koji potomstimulišu pove anu produkciju obesubjedinice HIF-1 (engl. Hypoxia InducedFactor 1). HIF-1 aktivira transkripciju genakoji kodiraju proteine koji posredujukratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficitkiseonika. HIF-1 aktivira razli ite ciljne geneu razli itim elijama ukazuju i time daverovatno deluje u kombinaciji sa drugimproteinima koji regulišu transkripciju gena.VEGF (engl. Vascular Endothelial GrowthFactor) – vaskularni endotelijalni faktorrasta; iNOS (engl. inducible Nitric OxideSynthase) – inducibilna azot oksid sintaza;HO-1 (engl. Heme Oxygenase 1) – hemoksigenaza ; EPO (engl. ErythroPOietin) -eritropoetin. (Preuzeto iz Lodish i sar.(2004): Molecular Cell Biology. WHFreeman and Company; adaptioranood Zhu i Bunn (2001), Science292:449.).

Kako nivo eritropoetina raste, tako je sve više i više CFU-E progenitornih elija spašeno smrti, štoim dozvoljava da produkuju oko 50 ili više eritrocita u periodu od samo dva dana. Na ovaj na inorganizam može da odgovara na gubitak krvi ubrzanom produkcijom eritrocita.

127

4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sli nu strukturu i aktiviraju sli ne putevesignalne transdukcije

Svi citokini imaju sli nu tercijarnu strukturu koju grade etiri duga konzervisana heliksa ( -helikoidna struktura) grupisana zajedno u specifi noj orjentaciji. Sli no, struktura svihcitokinskih receptora je ista. Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili višetransmembranskih proteina iji je ekstracelularni deo odgovoran za vezivanje citokina, acitoplazmatski deo je odgovoran za iniciranje signalnih puteva. Ekstracelularni domen je gradjenod dva subdomena, od kojih svaki ima sedam konzervisanih lanaca grupisanih zajedno uspecifi nom maniru. Tipi ni putevi signalne transdukcije se aktiviraju ligand-indukovanomaktivacijom receptora, približavaju i citoplazmatske delove jedne ili više receptornih molekula uprocesu analognom signalingu preko T i B receptora (detaljniji opis je mogu e na i u skriptiMolekularna i elijska imunologija, Kosti i Andri , 2007).

Citokini svoj efekat ispoljavaju vezuju i se sa velikim afinitetom za svoje receptore koji pripadajuodredjenim strukturnim familijama (Slika 4.11.). Aktivacija receptora stimuliše specijalizovanesignalne puteve kao što je npr. JAK-STAT signalni put (Janus tirozin Kinaze u citoplazmi kojefosforilišu STAT-engl. Signal Transducer and Activator of Transcription). Svi citokinski receptorisu vezani sa jednom ili više JAKs. Postoje etiri identifikovane JAKs sa definisanom strukturom:JAK1, JAK2, JAK3 i Tyr2). Na primer, receptori za -interferon su socirani sa JAK1 i Tyr2, doksu receptori za -interferon asocirani za JAK1 i JAK2 (Tabela 4.3.).

Tabela 4.3. Neki signalni proteini koji deluju preko citokinskih receptora i JAK-STAT signalnog puta

LIGANDI JAKs UDRuŽENE sa RECEPTOROM AKTIVIRANI STATS NEKI ODGOVORI

-interferon Jak1 i Jak2 STAT1 Aktivira makrofage; pove ava ekspresiju MHC proteina

-interferon Tyr2 i Jak2 STAT1 i STAT2 Pove ava otpornost elije na viralne infekcije

Eritropoetin Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju eritrocita

Prolaktin Jak1 i Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju mleka

Hormon rasta Jak2 STAT1 i STAT5 Stimuliše rast indukuju i produkciju IGF-1

GM-CSF Jak2 STAT5 Stimuliše produkciju granulocita i makrofaga

IL-3 Jak2 STAT5 Stimuliše ranu produkciju uobli enih elemenata krvi(Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.

Miševi kojima nedostaje JAK1 ne mogu da odgovaraju na stimulaciju sa interferonima. Receptorza eritropoetin (stimuliše progenitorne elije eritrocita da prežive, proliferišu i diferenciraju se) je

128

asociran jedino sa JAK2. Kod miševa kojima nedostaje JAK2 (JAK2-deficitarni miševi) ili jenjegova funkcija poreme ena, nema razvoja eritrocita i oni veoma rano umiru (Slika 4.15.).

Najrasprostranjenija klasifikacija citokinskih receptora zasniva se na strukturalnoj homologijiekstracelularnih citokin-vezuju ih domena. Prema ovoj klasifikaciji citokinski receptori supodeljeni u pet familija (Slika 4.11.).

Tip I citokinski receptori (hemopoetinski receptori), sadrže jednu ili više kopijadomena sa dve konzervisane cisteinske rezdue i membransku proksimalnu sekvencu triptofan-serin-X-triptofan-serin (WSXWS), gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu. Ovi receptori vezujucitokine koji nose 4 lanca heliksa. Konzervirana struktura receptora je deo koji veže citokine sa4 lanca heliksa, dok se specifi nost prema svakom tipu citokina determiniše amino kiselinskimostacima koji se razlikuju od jednog do drugog receptora. Ovi receptori sadrže unikatni lanacligand-vezuju eg domena i jedan ili više tzv. signal-tansducing lanaca (deo molekule receptoraodgovoran za transdukciju/prenos signala) koji je esto isti kod receptora za razli ite citokine(Slika 4.11A.).

Tip II citokinski receptori su sli ni tip I receptorima u organizaciji ekstracelularnihdomena sa konze-rvisanim cisteinima,ali ne sadrže WSXWS.Ovi receptori imajujedan ligand vezuju ipolipeptidni lanac ijedan lanac zasignalnu transdu-kciju.

Slika 4.11. Strukture citoki-nskih receptora.A – Receptori za razli ite citokineklasifikovani su u familije na osnovukonzervisane strukture ekstracelula-rnog domena (WSXWS: triptofan-serin-X-triptofan-serin); B - Razli iticitokinski receptori izgra eni su odspecifi nog ligand-vezuju eg lancakoji se nekovalentno asocira sasignalnom subjedinicom koja jezajedni ka za receptore razli itihcitokina.

129

Citokinski receptori koji pripadaju Ig superfamiliji imaju ekstracelularniimunoglobulinski (Ig) domen. Ovi receptori vezuju raznolike tipove citokina ime se aktivirajurazli iti mehanizmi signalne transdukcije.

TNF receptori pripadaju familiji receptora (u kojoj neki lanovi nisu citokini) saekstracelularnim domenima bogatim cisteinima. Vezivanje liganda uslovljava da receptor aktiviraintracelularne proteine sa kojima je asociran, a koji indukuju apoptozu i/ili stimulišu ekspresiju.

GPCR (engl. G-Protein Coupled Receptors) ili receptori koji -heliksom sedam putaprolaze/presecaju (engl. seven-transmembrane -helical receptors) elijsku membranu se jošnazivaju i serpentinski receptori izbog toga što njihov transmembranski domen ima oblik zmije isedam puta prolazi napred, nazad od spoljašnje do unutrašnje strane membrane i obratno. NazivGPCR poti e od toga što njihov signalni put uklju uje vezivanje GTP-vezuju ih proteina tzv. G-proteina. Genom sisara kodira veliki broj ovakvih receptora koji su uklju eni u prenošenju signalaiz elijskog okruženja. U imunom sistemu pripadnici ove klase receptora posreduju brze i prolazne(tranzijentne) odgovore na citokine iz familije hemokina.

Citokinski receptori takodje mogu biti grupisani prema putevima signalne transdukcije kojeaktiviraju (Tabela 4.4.). Ovakvo grupisanje esto korelira sa strukturnom homologijim ucitoplazmatskom domenu signalnog lanca receptora. Drugim re ima, lanovi familije definisaniprema ekstracelularnom domenu, aktiviraju sli ne puteve transdukcije signala u eliji.

Tabela 4.4. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptoraPUTEVI SIGNALNE

TRANSDUKCIJECITOKINSKI RECEPTOR KOJIKORISTI DATI SIGNALNI PUT SIGNALNI MEHANIZAM

JAK/STAT put Tip I i tip II citokinskih receptora JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT transkripcionih faktora

Signaling TNF receptorapreko TRAF

TNF familija receptora:TNR-RII, CD40

Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija transkripcionih faktora

Signaling TNF receptorapreko tzv. »death« domena

TNF familija receptora:TNR-RI, Fas

Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze

Tirozin kinaze povezane sareceptorima

M-CSF receptorReceptor faktora stem elija (SCF)

Unutrašnja aktivnost tirozin kinaze u receptoru

G protein signaling Hemokinski receptoriGTP zamena i disocijacija G :GTP od G , G :GTP aktivira razli iteelijske enzime, ali i neke druge proteine

(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Strukurna homologija izmedju razli itih citokinskih receptora ukazuje da su svi evoluirali odistog preda kog proteina. Da li elija odgovara ili ne na odredjeni citokin zavisi jednostavno odtoga da li ona ekspresuje ili ne ekspresuje odgovaraju i receptor (engl. cognate receptor). Iako svicitokinski receptori aktiviraju sli ne signalne puteve, odgovor odredjene elije na citokinski signal

130

zavisi od celokupne konstelacije transkripcionih faktora elije, strukture hromatina, kao i drugihproteina vezanih za razvojnu istoriju elije. Interakcija eritropetina sa njegovim dimernim

eritropoetinskim receptorom (engl. – Erythropoietin Receptor -EpoR) je primer vezivanja citokina za njihove receptore (Slika4.12.).

Slika 4.12. Struktura eritropoetina vezanog za ekstracelularne domene dimernog eritropoetinskog receptora.

Eritropoetin sadrži etiri konzervisana duga heliksa koja su grupisana u odredjeni aranžman.Ekstracelularni domen eritropoetinskog monomera je gradjen od dva subdomena, od kojih svaki sadržisedam konzervisanih lanaca grupisanih u karakteristi nom maniru. Ostaci bo nih lanaca dva heliksaeritropoetina stupaju u kontakt sa petljom na jednom monomeru eritropoetinskog receptora, dok se ostacina druga dva heliksa eritropoetina vezuju u istom maniru za petlju na drugom monomerueritropoetinskog receptora, te na taj na in stabilizuju dimernu strukturu receptora. Struktura interakcijedrugih citokina i njihovih receptora je sli na strukturi eritropoetina i njegovog receptora. (Preuzeto izLodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptiorano odSyed i sar. (1998), Nature 39:511.).

Vezivanje citokina ili indukuje receptorne lance da se oligomerizuju ili da se reorijentišu iformiraju oligomer. I jedno i drugo dovodi do približavanja asociranih JAKs dovoljno blizu da bimogle da se unakrsno/medjusobno fosforilišu, te time pove avaju aktivnost tirozin-kinaznihodmena. JAK potom fosforiliše tirozine na citokinskom receptoru formiraju i tako fosfo-tirozinskeostatke koji imaju funkciju „docking“ mesta za STATs i druge signal-transdukcione proteine.

Postoji sedam poznatih STATs (STAT1,STAT2, STAT3, STAT4, STAT5, STAT6 i STAT7), asvaki od njih ima SH2 domen koji ima dve funkcije. (1) Posreduje vezivanje STAT proteina zafosfo-tirozinska „docking“ mesta na atkiviranom citokinskom receptoru (ili RTKs). Kada se STATveže biva fosforilisan od strane JAK na tirozinskim ostacima, što prouzrokuje njegovu disocijacijuod receptora. (2) SH2 domeni na oslobodjenom STAT molekulu sada posreduju vezivanje STATmolkula za fosfo-tirozine drugih STAT molekula, formiraju i tako ili STAT homodimer iliheterodimer. Potom se STAT dimer translocira u nukleus u kome se, u kombinaciji sa drugimgenskim regulatornim proteinima, vezuje za specifi an region na DNK molekuli, tzv. „DNK elementkoji odgovara“ (engl. DNA Response Element - DRE), razli itih gena i stimuliše njihovu transkri-pciju (Slika 4.13.). Na primer, kao odgovor na hormon prolaktin koji stimuliše elije mle ne žlezdeda produkuju mleko, STAT5 stimuliše transkripciju gena koji kodira proteine mleka.

Citokinski receptori aktiviraju odgovaraju e STAT proteine zbog toga što SH2 domeni ovih STATproteina prepoznaju jedino specifi ne sekvence fosfotirozinskih „docking“ mesta. Na primer,aktivirani receptor za -interferon regrutuje i STAT1 i STAT2, dok aktivirani receptor za -

131

interferon regrutuje jedino STAT1. Ukoliko bi se SH2 domen -interferonskog receptora zamenioSH2 domenom -interferonskog receptora, aktivirani hibridni receptor bi regrutovao i STAT1 iSTAT2, kao i -interferonski receptor sam po sebi.

Slika 4.13. JAK-STATsignalni put aktiviranvezivanjem -interferonaza svoje receptore.Vezivanje interferona prouzroku-je ili dimerizaciju dva odvojenapolipeptidna lanca (kao što jeprikazano) ili reorjentiše recepto-rne lance da formiraju dimer. Usvakom slu aju, asocirani JAKmolekuli se približavaju jedandrugom tako da mogu da semedjusobno unakrsno fosforilišuna mestima gde su tirozinskiostaci, što pokre e procestransdukcije signala, odnosnoaktivira signalni(e) put(eve). Dvarazli ita receptorna lanca suasocirana sa razli itim JAKs(Tyr2 i JAK1) te tako regrutujurazli ite STAT molekule (STAT1 iSTAT2). Aktivirani fosforilacijomSTATs se disociraju od receptorai formiraju heterodimere koji setranslociraju u nukleus gde sevežu za specifi na mesta naDNK sekvenci (engl. DNA respo-nse elements) i zajedno sa dru-gim genskim regulatornim protei-nima indukuju transkripciju gena.

Odgovori posredovani STAT proteinima su esto regulisani negativnom povratnom spregom.Pored aktivacije gena koji kodiraju proteine koji posreduju citokinima-indukovani odgovor elije,STAT dimeri mogu takdoje da aktiviraju gene koji kodiraju inhibitorne proteine. U nekimslu ajevima, inhibitorni protein se vezuje i za aktivirani citokinski receptor i za STATproteine, što blokira dalju aktivaciju STAT proteina, i pomaže gašenju/prekidu odgovora. Poredtoga, u nekim drugim slu ajevima inhibitorni protein postiže isti rezultat blokiranjem funkcijeJAK. Ovi negativni mehanizmi nisu dovoljni sami po sebi da ugase odgovor. Aktivirani JAKs iSTATa se takodje inaktivišu defosforilacijom njihovih fosfo-tirozinskih ostataka. Kao i u svimdrugim putevima signalne transdukcije u kojima se za transdukciju signala koristi fosforilacijatirozina tirozin kinazama, defosforilacija se ostavuje kataliti kim delovanjem proteina tirozin

132

fosfataza (engl. Protein Tyrosine Phosphatases - PTPs), koje su veoma važne u signalnimprocesima kao i proteini tirozin kinaze koje vrše fosforilaciju tirozina.

Kao što je napomenuto, stimulacija citokinskih receptora njihovim specifi nim ligandima aktivirabrojne intracelularne puteve transdukcije signala i svi oni vode ka aktivaciji specifi nihtranskripcionih faktora, prouzrokuju i stimulaciju ili inhibiciju ekspresije odredjenih ciljnih gena.Na primer, vezivanje eritropoetina za njegov receptor, osnosno aktivacije eritropoetinskogreceptora aktivira brojne intracelularne puteve transdukcije signala koji su sli ni za sve citokine(Slika 4.14.).

Slika 4.14. Pregled intracelularnih puteva transdukcije signala koji se aktiviraju vezivanjem liganda za eritropetinski receptor (EpoR),tipi ni citokinski receptor.

etiri velika signalna puta mogu da transdukuju signal od aktiviranog EpoR-JAK (videti donji deo slike 4.7.). Svaki signal-transdukcioni put reguliše transkripcijurazli itih setova gena. A – U najdirektnijem putu, transkripcioni faktor STAT5 se fosforiliše i aktivira direktno u citosolu. B – Vezivanje tzv. »linker« proteina, Grb27 iliShc8 za aktivirani EpoR prouzrokuje aktivaciju Ras-MAP kinaznog puta. C i D – Aktivaciju EpoR prati idukcija dva fosfoinozitidna puta koja se aktviraju regrutovanjemfosfolipaze C i PI3 kinaze na membranu. Pove an nivo Ca2+ i aktivirana protein kinaza B (PKB) takodje modulišu aktivnost citosolnih proteina koji nisu uklju eni uregulaciju transkripcije, nego imaju druge funkcije u procesima transdukcije signala ili drugim procesima u eliji.

4.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Ubrzo nakon otkri a i kloniranja citokina, izlovana je i ve ina njihovih receptora razli itimeksperimentalnim tehnikama. Geneti kim analizama je potvrdjeno da se vezivanjem liganda za

7 Grb2 protein (engl. Growth factor receptor-bound protein 2) je adapterni protein uklju en u signalnu transdukciju i elijsku komunikaciju. Široko jeekspresovan i neophodan je za brojne elijske funkcije. Najpoznatiji je po sposobnosti da vezuje epidermalnog faktora rasta tirozin kinazu da bi bilaaktivirana Ras proteinom. Grb2 se sastoji od SH2 domena koji su sa svake strane vezani saSH3 domenima. Grb2 SH2 domeni se vezuju fosfo-tirozine peptida receptora ili „scaffold“ proteina, i to najpre za pY-X-N-X (X je hidrofobni ostatak kao što je valin). Grb2 N-terminalni SH3 domen sevezuje za prolinom-bogate peptide i može da veže Ras-guanin izmenjiva ki faktor SOS (engl. Son Of Sevenless). Grb2 C-terminalni SH3 domen sevezuje za peptide sa konformacijom motiva P-X-I/L/V-D/N-R-X-X-K-P motiva koja im omogu ava da se specifi no vežu sa „docking“ proteine kaošto je Gab-1 (engl. Grb2-associated binder - 1).8 Shc protein (engl. Src homology and collagen protein) je “docking” protein koji se fosforiliše aktivacijom insulinskog ili sli nih receptora, a potomvezuje proteine koji imaju SH2 domene, uklju uju i i adapterni protein Grb2.

133

citokinske receptore aktiviraju dva klju na signal-transdukciona proteina: JAK kinaza i STATtranskripcioni faktor. Pokazano je da su jedan (ponekada i dva) od etiri humana JAK proteina imakar jedan od nekoliko STAT proteina uklju eni u signaling u donjem toku signalnog puta svihcitokinskih receptora. Za razumevanje fukcionisanja JAK i STAT proteina uvek se kao primerprezentuje, najbolje prou en i razjašnjen citokinski signalni put, a to je signalni put koji seuklju uje nakon aktivacije eritropoetinskog receptora (engl. Erythropoietin Receptor – EpoR). Ovajsignalni put je veoma važan za formiranje zrelih, funkcionalnih eritrocita, a time i za transportgasova, odnosno opitmalno snabdevanje svih elija i tkiva kiseonikom. Svi po etni elementi EpoR-signalnog puta (eritropoetin, EpoR, kao i JAK2) su neophodni za formiranje adultnog-tipaeritrocita koje normalno po inje dvanaestog dana embrionalnog razvi a kod miša. Embrioni mišakojima nedostaju funkcionalni geni koji kodiraju ili EpoR ili JAK2 (Slika 4.15) ne mogu formiratiadultni-tip eritrocita i esto umiru zbog nesposobnosti da obezbedjuju potrebne i dovoljne koli inekiseonika fetalnim organima.

Slika 4.15. Studije sa mutantnim miševima su pokazale da su i eritropoetinski receptor (EpoR) i JAK2 esencijani za razvoj eritrocita.Miševi kod kojih su oba alela za EpoR i JAK2 gene uklonjena (engl. »knocked out«) razvijaju se normalno do trinaestog embrionalnog dana, a potom po inju da

umiru zbog anemije uzrokovane nedostakomeritrocitima-posredovanog transportakiseonika do fetalnih organa. Zatamnjeni deokod normalnog tipa embriona (+/+) je fetalnajetra koja je glavno mesto produkcije eritrocitau ovoj razvojnoj fazi. Nedostatakboje/zatamnjenja kod mutantnih embirona (-/-)ukazuje na odsustvo eritrocita koji sadržehemoglobin. Sem toga, mutantni embrioniizgledaju normalno, što ukazuje da je glavnafunkcija EpoR i JAK2 u ranom razvoju kodmiša da stimulišu produkciju eritrocita.(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): MolecularCell Biology. WH Freeman andCompany; EpoR slike su od Wu i sar.(1995), Cell 83:59. JAK2 slike su odNeubauer i sar. (1998), Cell 93:307.).

Kao što je ranije napomenuto, eritropoetin se vezuje simultano za ekstracelularne domene dvaEpoR mononomera (videti sliku 4.12.). Aktivacija EpoR rezultira približavanjem JAKs molekuladovoljno blizu da bi mogle medjusobno da se fosforilišu unakrsnom fosforilacijom na kriti nimtirozinima aktivacione usne (videti sliku 4.7). Kao i kod drugih kinaza, fosforilacija aktivacionihusana prouzrokuje konformacione promene koje smanjuju Km za ATP ili supstrat koji trebada bude fosforlisan, te time pove avaju kinaznu aktivnost. Jedan deo informacija za ovajmehanizam aktivacije dobijen je u studijama sa JAK2 mutantima kod kojih su kriti ni tirozini naaktivacionim usnama mutirani u fenilalanin. JAK2 mutant se normalno vezuje za RpoR, ali ne

134

može da bude fosforilisan. Ekspresija ovog JAK2 mutanta u eritroidnim elijama u koli inamave im nego što je uobi ajeno potpuno blokira EpoR signaling, zbog toga što JAK2 mutant blokirafunkciju normalnog/divljeg-tipa (engl. wild-type) proteina. Ovakav tip mutacije se nazivadominantna negativna mutacija i prouzrokuje gubitak funkcije ak i u elijama koje nose kopijenormalnog gena (engl. wild-type gene).

Kao što je napomenuto, aktivirane JAK kinaze fosforilišu nekoliko tirozinskih ostataka nacitosolnom domenu receptora. Neki od ovih fosfo-tirozina potom imaju funkciju veznih mesta zagrupu STAT transkripcionh faktora. Svi STAT proteini imaju: (1) N-terminalni SH2 domen kojimse vezuju za fosfo-tirozine receptornog citosolnog domena; (2) centralni DNK-vezuju i domen; (3)C-terminalni domen sa kriti nim tirozinskim ostacima. Kada se STAT protein veže za aktivirani

receptor, C-terminalni tirozini se fosforilišu sa asociranomJAK kinazom. Ovakav aranžman osigurava da se uodredjenim elijama aktiviraju samo oni STAT proteini saSH2 domenima koji mogu da se vežu za odredjenireceptorni protein. Fosforilisani STAT disocira spontano odreceptora, a dva fosforilisana STAT proteina medjusobnoformiraju dimere tako što se SH2 domeni svakog od njihvezuju za fosfo-tirozine drugog STAT proteina. Zbogdimerizacije se izlaže signal za nuklearnu lokalizaciju ilinuklearni lokalizacioni signal (engl. Nuclear LocalisationSignal - NLS) (Slika 14.16.), te se STAT dimer translocira unukleus, gde se vezuje za specifi ne poja iva ke sekvence(engl. enhancer sequences) koje kontrolišu ciljne gene.

Slika 4.16. JAK-STAT singalni put.Prate i vezivanje liganda za citokinski receptor i aktivaciju asocirane JAK kinaze, JAK fosforilišenekoliko tirozinskih ostataka na receptornom citosolnom domenu (videti sliku 4.7.). Nakon što seinaktivni monomerni STAT protein veže za receptor, fosforiliše se aktivnom JAK kinazom.Fosforilisani STATs spontano disociraju od receptora i spontano se dimerišu. S obzirom da STAThomodimer ostvaruje dve interakcje izmedju fosfo-tirozina i SH2 domena, iako je za stabilizacijureceptor-STAT kompleksa dovoljna samo jedna ovakva interakcija, fosforilisani STAT nematendenciju da ponovo veže za receptor. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular CellBiology. WH Freeman and Company.).

Razli iti STAT proteini aktirivaraju razli ite gene u razli itim elijama. Na primer, u eritroidnimprogenitornim elijama stimulacija eritropetinom dovodi do aktivacije STAT5, a ovaj aktiviranitranskripcioni faktor indukuje pove anu eskpresiju proteina Bcl-xL, koji spre ava programiranu

135

elijsku smrt tj. apoptozu ovih progenitornih elija, te im time dozvoljava da proliferišu idiferenciraju se u eritroidne elije (videti sliku 4.9.). I ne samo to, miševi kojima nedostaje STAT5su veoma anemi ni zbog toga što veliki broj progenitornih elija ulazi u apoptozu, ak i uprisustvu velikih koncentracija eritropoetina. Ovakvi mutantni miševi ipak produkuju maloeritrocita i preživljavaju jer je eritropoetinski receptor vezan i za druge anti-apoptoti ke puteve kojine uklju uju STAT5 (videti sliku 4.14.).

4.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifi nu sekvencu koja okružuje fosfoserinskeostatke

Kao što je ranije napomenuto, mnogi intracelularni signal-transdukcioni proteini imaju SH2 iliPTB domene kojima se vežu za aktivirani receptor ili neku drugu komponenetu signalinga(adapterni protein, „linker” protein, „scaffold” protein, „docking” protein itd) koja ima fosforilisanetirozinske ostatke (videti sliku 4.8.). SH2 domen je dobio svoje puno ime, Src homology 2doman, zbog svoje homologije sa regionom u prototipu citosolne tirozin kinaze kodirane srcgenom. Trodimenzionalne strukture SH2 domena razli itih proteina su vrlo sli ne, ali se svakivezuje za odredjenu i preciznu sekvencu aminokiselina koje okružuju fosfo-tirozinske ostatke.Unikatna sekvenca svakog SH2 domena determiniše specifi ne fosfo-tirozinske rezidue koje veže.

Na primer, SH2 domen Src tirozin kinaze se snažno vezuje za bilo koji peptid koji sadrži etirikriti na ostatka osnovne sekvence: pTyr-Glu-Glu–Ile. Ove etiri aminokiseline ostvaruju intimni

kontakt sa peptid-vezuju im mestom u Src SH2 domenu.Vezivanje li i na umetanje dvokrakog „zatvara a” (pTyr i Ilebo ni lanci peptida) u dvokraku „duplju” u SH2 domenu. Dva Gluostatka se veoma tesno fituju i priljubljuju se u i na površinuSH2 domena izmedju fosfo-tirozinske duplje i hidrofobnog džepakoji prihvata ostatak Ile (Slika 4.16.).

Slika 4.16. Površinski model SH2 domena Src kinaze vezanog za peptid koji ima fosfo-tirozine.Fosfo-tirozin (Tyr0 i OPO3-) i izoleucin (Ile3) ostaci se uklapaju u dvokraku duplju na površini SH2 domena. Dvaglutamatna ostatka (Glu1 i Glu2) su vezani za mesta na površini SH2 domena koja su izmedju dve duplje.(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;videtiWaksman i sar. (1993), Cell 72:779.).

136

Variranje u hidrofobnoj duplji u SH2 domenima razli itih STAT proteina, kao i drugih signal-transdukcionih proteina, dozvoljava im da se vežu za fosfo-tirozine vezane za razli ite sekvence,ra unaju i na razliku u njihovim vezuju im parametrima. Vezuju a specifi nost razli itih SH2domena je u velikoj meri determinisana C-terminalnim aminokiselinskim ostacima u odnosu nafosfo-tirozine ciljnog peptida. Suprotno tome, vezuju a specifi nost razli ith PTB domena jederminisana specifi nim N-terminalnim aminokiselinskim reziduama, i to pet do osamaminokiselinskih ostataka, u odnosu na fosfo-tirozine ciljnog peptida. Ponekada se PTB domenivezuju za ciljni peptid ak iako tirozin nije fosforilisan.

4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Signalom-indukovana aktivacija transkripcije ciljnih gena na neki duži period može biti jednakoopasna za eliju kao i jako mala indukcija. Prema tome, elije moraju biti sposobne i osposobljeneda prekinu signal-transdukcioni put veoma brzo ukoliko i iako ekstracelularni signal ostajekonstantno prisutan. Intracelularnu transdukciju signala od razli itih citokinskih receptora prekoJAK/STAT signal-transdukcionog puta negativno regulišu tri familije proteina: (1) Fosfataze kojesadrže SH2 domene (engl. SH2-containing Phosphatases – SHP) (2) Supresori citokinskogsignalinga (engl. Suppressors Of Cytokine Signaling - SOCS) (3) Proteini inhibitori aktiviranihSTAT proteina (engl. Protein Inhibitors of Activated STATs – PIAS). U razli itim progenitornimelijama odredjene klase proteina imaju ulogu da prekinu signalnu transdukciju citokinskih

receptora, jedni u kratkom periodu (meri se minutama), a drugi u dužim periodima i trajno.

4.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazamaSHP1 protein, lan SHP familije proteina, je citoplazmati ni protein tirozin fosfataza (engl. ProteinTyrosine Phosphatase – PTP). SH1 protein ima 2 tandema SH2 domena, kataliti ki domenfosfataze, kao i C-terminalni rep od oko 100 aminokiselinskih ostataka. Suprotno strukturalnosli nom SHP2 genu koji je eskpresovan u svim elijama, SHP19 gen je primarno i uglavnomekspresovan u hematopeti nim elijama i smatra se da je potencijalni tumor-supresorski gen ulimfomima i leukemijama, zbog toga što antagonizira favorizovanje rasta i onkogeni potencijalproteina tirozin kinaze. Mutantni miševi kojima nedostaje SHP1 fosfataza umiru zbog preterane

9 Humani SHP1 gen se sastoji od 17 egzona, a DNK je dužine oko 17 kb. Ima dva tandema SH2 domena, kataliti ki domen i C-terminalni rep saoko 100 aminokiselinskih ostataka.

137

produkcije eritrocita i nekih drugih tipova elija krvi. Analizom ovih mutantnih miševa su prvi putponudjene sugestije da SHP1, protein fosfo-tirozin fosfataza, negativo reguliše intracelularnutransdukciju signala od nekoliko tipova citokinskih receptora u nekoliko razi itih tipovaprogenitornih elija.

U elijama koje nisu stimulisane citokinima tj. koje se nalaze u stanju mirovanja, SHP1protein tirozin fosfataza je prisutna u neaktivnoj formi (jedan njen SH2 domen je fizi ki vezan imaskira, a time i onemogu ava aktivaciju kataliti kog mesta SHP1 fosfataze). Prilikom stimulacijecitokinima, ovaj SH2 domen, koji blokira fosfataznu aktivnost SHP1 proteina, se vezuje zaodredjene i specifi ne fosfo-tirozinske rezidue aktiviranog receptora. Na ovaj na in se iniciraju

konformacione promene koje prouzrokuju da SH2domen, koji je ranije blokirao i maskirao fosfataznomesto SHP1, „razmaskirava” tj. otkriva fosftaznokataliti ko mesto SHP1 i pozicionira ga dovoljnoblizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacioneusne JAK koja je asocirana sa receptorom. Ovoomogu ava da SHP1 defosforiliše tirozin naaktivacionoj usni JAK kinaze, a uklanjanje fosfatasa ovog tirozina inaktiviše JAK kinaznu aktivnost.Na ovaj na in JAK kinaza ne može više dafosforiliše receptor ili druge signal-transdukcionesupstrate (npr. STAT proteine), sve dok se dodatnicitokinski molekuli ne vežu za receptor na površinielije i iniciraju novu rundu transdukcije signala

(Slika 4.17A.).

Slika 4.17. Dva mehanizma za prekidanje transdukcije signala odreceptora za eritropoetin (EpoR).A – SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna u neaktivnoj formi u nestimulisanimelijama. Vezivanje SH2 domena SHP1 proteina za odredjeni fosfo-tirozin aktiviranog

receptora „razmaskirava” tj. otkriva fosfatazno kataliti ko mesto SHP1 i pozicionira gadovoljno blizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacione usne JAK2, što omogu avaSHP1 da defosforiliše tirozin na aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa ovog tirozinainaktiviše JAK kinaznu aktivnost. B – SOCS proteini, ija je ekspresija indukovana uertropoetinom-stimulisanim eritroidnim elijama, inhibišu ili trajno prekidaju sinaling naduži period. Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokiravezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (levo). SOCS boksevi mogu takodje„naciljati” i delovati na proteine kao što je JAK2 preko ubiquitin-proteazomnog puta(desno). Sli ni mehanizmi regulišu intracelularnu transdukciju signala i od drugihcitokinskih receptora. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.WH Freeman and Company.).

138

4.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinimaFamiliju SOCS proteina ini bar 8 lanova koje karakteriše prisustvo centralnog SH2

domena i konzervisane C-terminalne strukture koja je nazvana „SOCS kutija“ ili „SOCS boks“(engl. SOCS box). lanovi SOCS familje deluju kao citokinima-indukovani negativni regulatoricitokinskog signalinga. Ovi negativni regulatori se još nazivaju i CIS proteini (engl. Cytokine-Induced Suppressors proteins). Pored drugih gena ija transkripcija je indukovana STATproteinima, ovi transkirpcioni faktori mogu da indukuju i eksprsiju SOCS/CIS gena. SOCS/CISproteini su tzv. „immediate-early gene products“ koji mogu biti indukovani razli itimcitokinima, a preko STAT transkripcionih faktora koji indukuju aktivaciju transkripcije.Pojedina ne SOCS/CIS mRNK ispoljavaju unikatne tkivno-specifi ne i vremenski-zavisneodgovore na široki spektar citokina. Veoma važan lan SOCS/CIS familije proteina je SOCS-1protein, jer njegov gen, SOCS-1 gen10, može biti indukovan razli itim citokinima uklju uju i:eritropetin, GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-6 i IFN- . Ekspresija SOCS1 remeti elijski odgovor na IL-6preko direktne interakcije i blokiranja JH1 domena aktivirane JAK2 kinaze. Sa druge strane,CIS protein, lan iste familije inhibitora citokina, je STAT5-indukovani negativni regulator jeruspostavlja negativnu povratnu spregu vezuju i se za fosfo-tirozine na receptorima za eritropoetini IL-3. Na taj na in je onemogu ena i blokirana fosforilacija STAT5, a time i njegova aktivacija, patako i dalji signal-transdukcioni mehanizmi i odgovori koji su indukovani i zavisni od STAT5transkripcionog faktora.

Generalno, negativni regulatori citokina deluju na dva na ina:. (1) SH2 domeninekoliko SOCS proteina se vezuju za fosfo-tirozine aktiviranog receptora spre avaju i takovezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (npr. STAT transkripcionih faktora) i daljutransdukciju signala. SOCS1 protein, ija je ekspresija indukovana u eritropoetinom-stimulisanimeritroidnim elijama, inhibišu ili trajno prekidaju signaling na dugi period. SOCS1 se vezuje zakriti ne fosfo-tirozine na aktivacionoj usni aktivirane JAK2 kinaze, te tako inhibiše njenu kinaznuaktivnost. Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokira vezivanje drugihsignal-transdukcionih proteina (vidti sliku 4.17B. levo) (2) Svi SOCS proteini imaju domen koji sezove SOCS boks mogu takodje „naciljati” i delovati na proteine kao što je JAK2 prekoubiquitin-proteazomnog puta (videti sliku 4.17B. desno). SOCS boks domeni SOCS proteinaregrutuje kompnenete E3 ubiquitin ligaze (Slika 4.18). Kao rezultat vezivanja SOCS1, JAK2postaje poliubiquitiran, a potom se degradira u proteazomima (engl. proteasomes), te se na taj

10 Humani SOCS-1 gen je gen od jednog egzona (engl. signle-exon gene) koji kodira 211 aminokiselina i nalazi se izmedju CpG ostrvaca veli ine2.5 kb (engl. kilobase).

139

na in trajno gase svi signal-transdukcioni putevi posredovani JAK2 kinazom. Ovaj mehanizam jepotvrdjen i eksperimentima u kojima su primenjeni inhibitori proteazoma, a koji su produžiliJAK2-posredovanu transdukciju signala.

Istraživanja u kojima su koriš ene elijske kuture sisarskih elija pokazala su da jereceptor za hormon rasta (engl. Growth Hormone – GH), koji pripada superfamiliji citokinskih

receptora inhibisan tj. „down“-regulisan SOCS-2proteinom. Miševi kojima nedostaje SOCS-2 proteinrastu zna ajno više nego njihovi normalni, „wild-type“ srodnici, i imaju duga ke kosti iproporcionalno uve anje skoro svih unutrašnjihorgana, kao i ekstremiteta. Prema tome, SOCSproteini imaju esencijalnu ulogu negativnogmodulatora u regulaciji intracelularne transdukcijesignala od receptora za eritropetin, receptora zahormon rasta, kao i receptora za druge citokine.

Slika 4.18. Ubikvitinom-posredovani proteoliti ki put.A – 1 – Enzim E1 se aktivira ka enjem molekula ubiquitina (Ub). 2 – Aktivirani E1 zakoga je zaka ena molekula Ub prenosi vezani Ub molekul do E2. 3 – Ubiquitin ligaza (E3)vrši transfer Ub molekule vezane za E2 na bo ni lanac sa ostakom koji ima amino grupu(-NH2). Dodatne molekule se dodaju na ciljni protein ponavljanjem koraka 1,2 i 3., te setako formira poliubiquitirani lanac koji usmerava ciljni protein prema proteozomu (4). 5 – Uokviru ovog velikog kompleksa, ciljni protein se cepa na veliki broj malih peptidnihfragmenata. B – Kompjuterom-generisana slika otkriva da proteazom ima cilindri nustrukturu sa poklopcima na svakom kraju središnjeg dela ili jezgra. Poroteolizaubiquitinima-etiketiranim proteinima se odvija duž unutrašnjeg zida jezgra.

4.2.7. Mutant receptora za eritropoetin koji ne može biti down-regulisan, prouzrokujepove anje hematokrita

Kod normalnih žena i muškaraca procentualni udeo uobli enih elemenata krvi, od kojih je najvišeeritrocita (hematokrit) se održava veoma blizu 45-47 procenata. Pad hematokrita rezultirapove anom produkcijom eritropetina u bubrezima. Pove ani nivo cirkulišu eg eritropetinaprouzrokuje da više eritroidnih progenitornih elija prolaze kroz terminalnu proliferaciju idiferencijaciju do zrelih eritrocita, te se veoma brzo uspostavlja normalan nivo hematokrita. Uuslovima napornog vežbanja (kao što su sportovi izdržljivosti; npr. maratoni, cross-country

140

skijanje, itd.) kada transport kiseonika do miši a i opskrbljenost miši a dovoljnim koli inamakiseonika mogu biti limitirani, pove anje u broju eritrocita može biti dobro rešenje, jer omogu avabolje snabdevanje kiseonikom. Zbog ovog razloga, koriš enje suplemenata eritropoetina zapove anje hematokrita iznad normalnog nivoa je zabranjeno na mnogim atletskim takmi enjima iatleti ari se obavezno i regularno testiraju na prisustvo komercijalnog rekombinantogeritropetina (npr. epoetin ) u njihovim telesnim te nostima (naj eš e krvi i urinu). Suplementeritropoetina ne nudi samo mogu e kompetitivne pogodnosti, nego može biti veoma opasan.Previše eritrocita može prouzrokovati da krv postane troma i inertna i da se zgrušava u malimkrvnim sudovima, posebno u mozgu. Nekoliko atleti ara koji su se dopingovali rekombinantnimeritropoetinom su umrli od moždanog udara tokom vežbanja.

Otkri e mutanta eritropoetinskog receptora (EpoR) tj. neregulisanog EpoR razjasnilo je sumnjivusituaciju kada je registrovano da osvaja tri zlatne medalje na Olimpijadi u cross-country skijanjuima hematokrit preko 60 procenata, iako je testiranje nivoa eritropoetina u njegovoj krvi i urinupokazalo manje vrednosti nivoa eritropetina nego što je uobi ajeno. Posledi na analiza DNKpokazala je da je taj atleti ar heterozigotan za mutaciju na genu koji kodira eritropoetinskireceptor. Mutantni alel kodira receptor koji tzv. okrnjeni receptor (engl. truncated receptor) komenedostaje nekoliko tirozina koji se u normalnim uslovima fosforilišu nakon stimulacije saeritropoetinom. Kao posledica toga, mutantni receptor je sposoban da aktivira STAT5, kao idruge signal-transdukcione proteine, ali nije sposoban da veže SHP1 fosfatazu, koja obi noprekida transdukciju signala (videti sliku 4.17A.). Prema tome, veoma mali nivo eritropoetina, kojije produkovao pomenuti atleti ar, je indukovao produženu intracelularnu transdukciju signala unjegovim eritroidnim progenitornim elijama, što je rezultiralo pove anom produkcijom eritrocitau broju ve em od normalnog. Ovaj in vivo primer zaista uživo ilustruje fino podešavanje nivoakontrole i regulacije signalne transdukcije od eritropoetinskog receptora u humanom telu.

141

4.3. RECEPTORI KOJI IMAJU FUNKCIJU TIROZIN KINAZA (RTKs) I AKTIVACIJA Ras PROTEINA

Receptor-tirozin kinaza (RTK) je protein koji ima ekstracelularni domen, za koji se vezuje ligand icitoplazmati ni domen koji ima aktivnost tirozin kinaze. Ligand za RTK je peptid ili protein usolubilnoj ili u formi vezanoj za membranu. Ligandi za RTK su npr. faktori rasta (nervni faktorrasta, NGF; faktor rasta poreklom iz trombocita, PDGF, faktor rasta fibroblasta, FGF, epidermalnifaktor rasta, EGF) kao i insulin. Vezivanje liganda za receptor stimuliše tirozin kinaznu aktivnostmolekule, koja dovodi do aktivacije signalnog puta Ras-MAP kinaze, kao i nekoliko drugihsignalnih puteva. Signalni putevi koji se aktiviraju vezivanjem liganda za RTK su uklju eni uregulaciju širokog spektra razli itih funkcija, uklju uju i regulaciju elijske proliferacije idiferencijacije, kao i promovisanje preživljavanja elija, i modulaciju elijskog metabolizma11.

U ovom delu teksta e biti opisano kako vezivanje liganda dovodi do aktivacije RTKs, i kakoaktivirani receptor prenosi signale do Ras proteina.

4.3.1. Vezivanje liganda dovodi do transfosforilacije RTK

Svi RTKs se sastoje iz ekstracelularnog domena, koji sadrži ligand-vezuju i domen, hidrofobnogtransmembranskog heliksa, i citoplazmati nog domena u okviru koga se nalazi region koji imaaktivnost tirozin kinaze. Vezivanje liganda za monomerne RTKs, indukuje dimerizaciju receptora.Neki monomerni ligandi, npr. FGF, se vezuju za heparin-sulfat, negativno naelektrisanupolisaharidnu komponentu ekstracelularnog matriksa, što stimuliše vezivanje za monomernireceptor i formiranje dimernog ligand-receptor kompleksa. Ligandi za neke RTKs su dimeri, kojivezivanjem za receptor, dovode u vezu dve monomerne molekule RTK. Nasuprot ovim primerima,neki RTKs, kao što je receptor za insulin, su u nestimulisanom stanju dimeri povezanidisulfidnom vezom. Vezivanje liganda za ove RTKs, izaziva konformacionu promenu koja aktivirareceptor.

Kinazna aktivnost nestimulisanog receptora je vrlo mala. Aktivacija receptora i formiranje dimeraomogu ava, da jedna subjedinica fosforiliše jedan ili više tirozinskih ostataka, u blizinikataliti kog mesta susedne subjedinice. Ova transfosforilacija dovodi do konformacione promene

11 Neki RTKs su identifikovani u ogledima na elijama kancera koje su imale mutiranu formu receptora za faktore rasta. Ovakve elije suproliferisale i u odsustvu faktora rasta. Na primer konstitutivno aktivni mutant Her2, receptor za EGF-sli ne proteine omogu ava nekontrolisanuproliferaciju elija kancera i u odsustvu EGF-a (koji je neophodan za proliferaciju normalnih elija).

142

koja stimuliše vezivanje ATP-a (npr. u slu aju insulinskog receptora) ili vezivanje proteinskihsubstrata (kao kod FGF receptora), a uve ana kinazna aktivnost dovodi do fosforilacije i drugihmesta u citosolnom kataliti kom domenu RTK. Vezivanje liganda za RTK aktivira kinaznuaktivnost receptora, u maniru, sli nom aktivaciji JAK kinaza povezanih sa receptorima za citokine(razlika je u lokaciji kataliti kog mesta koje je u slu aju RTK citosolni domen iste molecule, a JAKkinaze su molekuli odvojeni od citokinskog receptora).

Fosforilisani ostatak tirozina u aktiviranom RTK, postaje vezno mesto za proteine uklju ene u“downstream” prenos signala. Mnogi fosfotirozinski ostaci aktiviranog RTK interaguju saadapternim proteinima. To su mali proteini koji poseduju SH2, PTB ili SH3 domene, ali nemajuenzimatsku ili signalnu aktivnost. Ovi proteini povezuju aktivirani RTK sa drugim komponentamau signalnom putu, npr. sa Ras proteinom.

4.3.2. Aktivacija/inaktivacija Ras proteina

Ras je monomerni protein koji veže GTP, i koji kao i G subjedinica trimernog G proteina, možebiti u aktivnoj formi, kada vezuje GTP, i neaktivnoj formi vezanoj za GDP.

Aktivacija Ras-a je ubrzana vezivanjem sa GEF (engl. guanine nucleotide exchange factor), kojise vezuje za Ras GDP kompleks, i izaziva disocijaciju Ras-a od GDP. GTP, koji je u eliji prisutanu mnogo ve oj koncentraciji nego GDP, se spontano veže za upražnjeno mesto, što dovodi doodvajanja GEF molekule i formiranja aktivnog Ras GTP kompleksa. Hidroliza GTP-a u GDPdeaktivira Ras. Kao i u slu aju G GTP kompleksa, deaktivacija Ras GTP kompleksa zahtevaprisustvo drugog proteina tzv. GAP (engl. GTP-ase-activating protein). GAP se vezuje za Ras GTPkompleks i više od 100x ubrzava GTP-aznu aktivnost Ras-a12. U elijama se GAP vezuje zaspecifi ne fosfotirozinske ostatke u aktiviranom RTK, dovode i ga blizu Ras GTP kompleksapovezanog sa membranom. Hidroliza GTP-a je katalisana aminokiselinama iz Ras-a i GAP-a.

Ras, kao i trimerni G proteini, pripadaju familiji intracelularnih proteina koji vezuju GTP tzv.superfamiliji GTP-aza. Mnoge sli nosti u strukturi i funkciji G i Ras-a, kao i njihovo prisustvo usvim eukariotskim elijama, ukazuje na pojavu jedne GTP-aze ukju ene u signalnu transdukciju,vrlo rano u toku evolucije. Takodje, struktura G i Ras-a, je vrlo sli na GTP-vezuju im faktorima,uklju enim u sintezu proteina, koji se ekspresuju u svim prokariotskim i eukariotskim elijama.

12 Prose an životni vek Ras GTP kompleksa je oko 1 minut, što je mnogo duže nego trajanje G GTP kompleksa

143

Gen koji je kodirao ovog predka GTP-aza, se u toku evolucije umnožio i evuluirao, tako da humanigenom kodira superfamiliju GTP-aza, koja se sastoji odstotine razli itih intracelularnih proteina, uklju enih uregulaciju mnogih aspekata rasta i metabolizma elija.

Funkcija Ras proteina koji se ekspresuje u sisarskimelijama je vrlo dobro izu ena. Mutirani Ras proteini su

povezani sa mnogim tipovima humanih kancera. Smatrase da mutirani Ras, koji može da veže GTP, ali ne možeda izazove njegovu hidrolizu tj. protein koji je stalnoaktivan, doprinosi neoplasti noj transformaciji. Analizatrodimenzionalne strukture Ras-GAP kompleksa, jedovela do otkri a da onkogeni, konstitutivno aktivni Rasproteini (RasD), sadrže mutaciju13 koja onemogu avanjegovu interakciju sa GAP-om. Nemogu nost vezivanjaGAP-a, održava Ras u aktivnom stanju vezanom za GTP.

4.3.3. RTK se povezuje sa Ras-om preko adapternogproteina i faktora razmene guaninskihnukleotida

Prvi eksperimentalni rezultati koji su ukazali da Rasfunkcioniše iza RTK, u zajedni kom signalnom putu, sudobijeni u ogledima na kulturi fibroblasta, koji sustimulisani na proliferaciju tretmanom sa PDGF i EGF.Iniciranje anti-Ras antitela u fibroblaste je blokiraloproliferaciju, a iniciranje konstitutivno aktivnog Rasmutanta, RasD mutanta, je izazvalo proliferaciju elija i uodsustvu stimulacije sa faktorima rasta. Takodje,stimulacija fibroblasta sa FGF, je dovela do formiranjaaktivnog Ras GTP kompleksa.Slika 4.19. Aktivacija Ras-a nakon vezivanja liganda za RTKs.

13 RasD sadrži mutaciju u poziciji 12. Zamena glicina, koji se normalno nalazi na ovoj poziciji, sa bilo kojom drugom aminokiselinom (izuzev prolina)blokira vezivanje sa GAP-om, što ini Ras konstitutivno aktivnim tj. vezanim za GTP.

144

Kako stimulacija elija sa faktorima rasta, dovodi do aktivacije Ras-a? Dva citosolna proteina,GRB2 (engl. growth factor receptor-bound protein 2) i Sos (engl. son sevenless) su klju niproteini uklju eni u aktivaciju Ras-a. GRB2 se preko SH2 domena vezuje za specifi nefosfotirozinske ostatke na aktiviranom receptoru. GRB2, takodje, poseduje dva SH3 domena,preko kojih se vezuje za Sos protein, i aktivira ga. Drugim re ima, GRB2 funkcioniše kaoadapterni protein za EGF receptore. Sos je protein koji vrši zamenu guanin nukleotida (GDP-a saGTP-om), tzv. GEF (engl. guanine nucleotide-exchange factor).

4.3.4. Vezivanje Sos proteina za neaktivni Ras izaziva promenu konformacije koja gaaktivira

Kao što je ve spomenuto, adapterni protein, GRB2, sadrži dva SH3 domena preko kojih se vezujeza Sos (faktor koji ima funkciju izmenjiva a guanin nukleotida), kao i SH2 domen preko kogaostvaruje vezu sa fosfotirozinskim ostacima RTK molekula. SH3 domeni GRB2 proteina,selektivno vezuju sekvencu aminokiselina u Sos proteinu, koja sadrži veliki broj prolina.

Prolinski ostaci imaju važnu ulogu u interakciji sa SH3 domenom adapternog proteina. Sekvencaaminokiselina koja je bogata u prolinskim ostacima, omogu ava nastajanje takve konformacije

koja dozvoljava kontakt sa SH3 domenom. Ostaci prolina seidealno poklapaju (“fituju”) sa vezuju im džepovima napovršini SH3 domena, i na taj na in stimulišu interakciju.Nekoliko neprolinskih ostataka, takodje, reaguje sa SH3domenom. Ostaci ovih aminokiselina su odgovorni zaspecifi nost vezivanja. Drugim re ima strategija vezivanja zaSH3 domene je takva da odredjeni ostaci aminokiselinaobezbedjuju strukturni “motiv” neophodan za vezivanje, arezidue susednih aminokiselina odredjuju specifi nostvezivanja.

Slika 4.20. Model SH3 domena vezanog za peptid koji je bogat prolinom.

145

Nakon aktivacije RTK, formira se kompleks proteina, koji sadrži aktivirani receptor, GRB2 i Sosprotein. Aktivacija receptora dovodi do angažovanja Sos-a iz citosola dovode i ga do membrane, tj.u neposrenu blizinu supstrata (Ras GDP-a vezanog za membranu). Smatra se da C-terminalniregion Sos molekule, inhibiše nukleotid-izmenjiva ku aktivnost, i da interakcija sa GRB2proteinom uklanja tu inhibiciju.

Vezivanje Sos proteina za Ras GDP kompleks, dovodi do konformacione promene naodgovaraju im segmentima Ras proteina (“Switch I” i “Switch II”), koja otvara džep za GDP, idozvoljava njegovu difuziju iz džepa. S’ obzirom da je intracelularna koncentracija GTP-a, 10Xve a od koncentracije GDP-a, GTP e zameniti GDP, i tako aktivirati Ras protein. Vezivanje GTP-aza Ras, indukuje specifi nu konformaciju “Switch I” i “Switch II” segmenata, koja aktivira“downstream” efektorne molekule u signalnom putu.

Slika 4.21. Struktura Ras proteina vezanog za GDP, Sos protein i GTP. (a) Switch I i Switch II ne reaguju direktno sa GTP-om u Ras GDPkompleksu. (b) Jedan heliks Sos proteina se vezuje za oba Switch regiona, izazivaju i masovnu konformacionu promenu Ras proteina. Ovainterakcija pomera Switch I region, što dozvoljava GDP-u da difunduje iz džepa. (c) GTP se vezuje za Ras-Sos kompleks i dovodi do promenekonformacije Switch I i Switch II regiona Ras proteina, koja omogu ava vezivanje fosfata GTP-a i pomera Sos, što stimuliše interakciju Ras GTPkompleksa sa efektornim molekulama.

146

4.4. SIGNALNI PUT MAP KINAZE

U sisarskim elijama svi receptori koji imaju funkciju tirozin kinaze (RTKs), kao i ve ina receptoraza citokine koriste visoko konzervisani signalni put, u kome se signal indukovan vezivanjemliganda, prenosi preko GRB2 i Sos do Ras proteina. Aktivirani Ras, stimuliše formiranje signalnogkompleksa u membrani, koji se sastoji od tri protein kinaze koje su povezane “scaffold” proteinom.Ova kaskada kinaza, kulminira aktivacijom MAP kinaze (engl. mitogen activated proteinkinase), serin/treonin kinaze, esto nazivane i ERK (engl. extracellar regulated kinase). Nakontranslokacije u nukleus, MAP kinaza, može da fosforiliše mnoge proteine, uklju uju i itranskripcione faktore koji regulišu ekspresiju proteina zna ajnih u elijskom ciklusu i u procesudiferencijacije. Aktivacija MAP kinaze u dve razli ite elije može da izazove sli ne ili razli iteelijske odgovore. Takodje, njena aktivacija razli itim hormonima, koji deluju na istu eliju, može

da dovede do stimulacije istih ili razli itih odgovora.

U ovom delu e prvo biti opisani elementi kaskade kinaza “downstream” od Ras-a, u RTK-Rassignalnom putu koji funkcioniše u sisarskim elijama, kao i povezivanje drugih signalnih putevaza sli ne kinazne kaskade.

4.4.1. Signal se prenosi od aktiviranog Ras-a do kaskade protein kinaza

Mnoge analize izvedene na kvascima, kod C. elegans, Drosophila, kao i na elijama sisara supokazale postojanje visoko konzervisane kaskade protein kinaza koje se aktiviraju, aktivacijomRas-a (slika 4.22.). Aktivni Ras GTP kompleks se vezuje za N-terminalni regulatorni region Raf-a(serin/treonin kinaza), koju aktivira. Hidroliza Ras GTP-a u Ras GDP, oslobadja aktivni Raf, kojifosforiliše i aktivira MEK (engl. MAP kinase kinase). Aktivni MEK, fosforiliše i aktivira MAPkinazu, takodje serin/treonin kinazu. MEK je kinaza za koju je karakteristi na “dvojnaspecifi nost” tj. ona može da fosforiliše tirozinski ostatak, kao i serinski ili treoninski ostatakciljnog proteina tj. MAP kinaze. Aktivirana MAP kinaza fosforiliše razli ite proteine, uklju uju i itranskripcione faktore koji posreduju u razli itim elijskim odgovorima.

Nekoliko tipova eksperimenata je ukazalo da se Raf, MEK i MAP kinaza nalaze “iza” (downstream)Ras-a, u signalnom putu. Na primer, mutirani Raf proteini koji nemaju N-terminalni regulatornidomen, su konstitutivno aktivni, i izazivaju proliferaciju kulture elija u odsustvu stimulacije safaktorima rasta. Ovakvi mutanti Raf proteina, su nadjeni u tumorskim elijama, i smatra se da su

147

kodirani onkogenima. Nasuprot ovom, elije koje ekspresuju nefunkcionalan mutant Rafproteina, ne mogu biti stimulisane na proliferaciju. Takodje, “in vitro” analize vezivanja supokazale da se Ras GTP kompleks veže direktno za N-terminalni regulatorni domen Raf proteina,aktiviraju i njegovu kataliti ku aktivnost.

Aktivacija MAP kinaze u zavisnosti od aktivacije Ras proteina je pokazana u kulturi elija kojeekspresuju konstitutivno aktivan RasD protein. Kod ovih elija, MAP kinaza je aktivna, u odsustvubilo kakve stimulacije sa faktorima rasta. Biohemijske studije su pokazale da Ras ne možedirektno da fosforiliše, ili da na neki drugi na in aktivira, MAP kinazu. U potrazi za kinazom kojabi mogla da aktivira MAP kinazu, samo u uslovima stimulacije faktorima rasta, a ne dok su elije“u miru”, vršeno je frakcionisanje ekstrakta kulture elija. Ovi ogledi su doveli do otkri a MEK–a14, kinaze koja specifi no fosforiliše jedan treoninski i jedan tirozinski ostatak MAP kinaze, kojadovodi do njene aktivacije. Kasnije studije su pokazale da Raf fosforiliše serin/treoninski ostatakMEK-a (na C-terminalnom kataliti kom domenu), izazivaju i njenu aktivaciju. Tako, aktivniRas GTP kompleks indukuje kaskadu kinaza, koja uklju uje Raf, MEK i MAP kinazu: aktivacijaRTK Ras Raf MEK MAP kinaza.

14 Akronim MEK poti e od MAP i ERK kinaze.

Slika 4.22. Kinazna kaskada koja prenosisignale “downstream” od aktiviranog Rasproteina do MAP kinaze.

148

4.4.1.1. Aktivacija Raf kinazeMehanizam aktivacije Raf proteina se razlikuje od mehanizma aktivacije MEK i MAP kinaza. Unestimulisanim elijama, Raf se nalazi u citosolu, u konformaciji u kojoj je N-terminalniregulatorni domen vezan za kinazni domen. Interakcija izmedju regulatornog i kinaznog domenainhibiše kinaznu aktivnost molekule. Ova inaktivna konformacija je stabilisana dimerom 14-3-3proteina, koji vezuje fosfoserinske ostatke mnogih signalnih molekula. Dimerni 14-3-3 protein sevezuje za fosfoserine u Raf proteinu, i to tako što je jedan monomer vezan za fosfoserin N-terminalnog domena (fosfoserin 259), a drugi se vezuje u kataliti kom domenu (fosfoserin 621).Smatra se da je interakcija sa 14-3-3 proteinom klju na za dostizanje konformacionog stanja zakoje može da se veže aktivni Ras.

Vezivanje Ras GTP kompleksa (vezanog za membranu), za N-terminalni domen Raf-a, uklanjainhibitornu subjedinicu i izaziva konformacionu promenu, koja dovodi do disocijacije 14-3-3proteina.

4.4.1.2. Aktivacija MAP kinazeKao i u slu aju aktivacije JAK kinaza, i RTK,kataliti ko mesto inaktivne, nefosforilisane MAPkinaze je blokirano nizom aminokiselina (tzv.aktivacione usne; engl. activation lip), koje seprotežu tako da ine nepristupa nim tirozin (tyr-185), koji bi trebalo da bude fosforilisan.Vezivanje MEK kinaze za MAP kinazu, destabilišeovakvu konformaciju, što dovodi do promene kojaini tirozin 185 pristupa an delovanju MEK

kinaze (u inaktivnom stanju ovaj tirozin jezaklonjen u molekulu MAP kinaze).

Slika 4.23. Molekularna struktura MAP kinaze u neaktivoj (nefosforilisanoj) formi (a) i aktivnoj (fosforilisanoj) formi (b).

Dakle, MEK fosforiliše tirozin 185, a zatim i susedni treonin 183. Fosforilisani tirozinski ifosforilisani treoninski ostaci MAP kinaze, dodatno interaguju sa susednim aminokiselinamamenjaju i konformaciju regiona, koja omogu ava vezivanje ATP-a za kataliti ko mesto kinaze.

149

Fosforilacija ostatka tirozina ima klju nu ulogu ne samo u vezivanju za specifi an proteinskisubstrat, nego i za dimerizaciju molekula MAP kinaze, koja je zna ajna za njenu translokaciju unukleus. Naime, smatra se da samo dimeri MAP kinaze mogu da se translociraju u nukleus, gderegulišu aktivnost transkripcionih faktora.

4.4.2. MAP kinaze regulišu aktivnost mnogih transkripcionih faktora koji kontrolišu generane faze

Dodavanje faktora rasta (EGF ili PDGF) u kulturu elijakoje se nalaze u Go fazi, izaziva brzo pove anje ekspresijevelikog broja gena (oko 100 razli itih gena). Ovi geni senazivaju geni rane faze (primarni geni), zato što seindukuju pre nego što elije udju u S fazu elijskogciklusa, i replikuju svoju DNA. Jedan od zna ajnih genarane faze, kodira transkripcioni factor c-Fos. c-Foszajedno sa drugim transkripcionim faktorima kao što jec-Jun, indukuje ekspresiju mnogih gena koji kodirajuproteine neophodne za razvoj elije u toku elijskogciklusa. Ve ina RTKs koji vezuju faktore rasta, koristesignalni put MAP kinaze za aktivaciju gena, koji kodirajuproteine kao što su c-Fos.

Regulacija c-Fos gena uklju uje aktivaciju “poja iva a”tzv. SRE (engl. serum response element15). Komplekspoja iva a sadrži DNA sekvencu, koja može da vežemultiple transkripcione faktore.

Slika 4.24. Indukcija transkripcije gena aktivirane MAP kinazom.

Neki od njih su aktivirani MAP kinzom, a drugi drugim protein kinazama koje funkcionišu udrugim signalnim putevima (npr. PKA u signalnom putu cAMP-a ili PKC u PIP2 signalnom putu).

15 Naziv SRF (serum response element) poti e od injenice da se aktivira mnogim faktorima rasta iz seruma.

150

Kao što je prikazano na slici 4.24. aktivirana (fosforilisana) dimerna MAP kinaza indukujetranskripciju c-Fos gena, tako što modifikuje dva transkripciona faktora, TCF (engl. ternarycomplex factor) i SRF (engl. serum response factor). U citosolu MAP kinaza fosforiliše i aktivirakinazu tzv. p90RSK, koja se translocira u nukleus, gde fosforiliše specifi ne serine u SRF proteinu.Sama MAP kinaza se ,takodje, translocira u nukleus, gde fosforiliše specifi ne serine u sastavuTCF proteina. Fosforilisani TCF, se povezuje sa dva molekula fosforilisanog SRF, i nastajetrimerna forma, koja se vezuje za SRE segment na DNA. Eksperimentalne dokaze za ovaj modelsu obezbedili ogledi na elijama koje ekspresuju negativni dominantni TCF protein (mutiranimolekul kome nedostaje serin koji bi trebalo da bude fosforilisan MAP kinazom). Nedostatakklju nog ostatka serina, blokira aktivnost MAP kinaze i spre ava ekspresiju gena. Takodje,biohemijske analize su pokazale da fosforilacija SRF angažovanjem p90RSK, stimuliše vezivanje ipove ava afinitet vezivanja za SRE sekvencu na DNA. Dakle, oba transkripciona faktora suneophodna za maksimalnu stimulaciju ekspresije gena, nastalu usled delovanja faktora rasta,preko signalnog puta MAP kinaze.

4.4.3. G protein-zavisni receptori prenose signale do MAP kinaze

Iako se ve ina signalnih puteva MAP kinaze aktivrira preko RTKs ili citokinskog receptora,signalni putevi koji poti u od drugih receptora, takodje, mogu aktivirati MAP kinazu. Kvasci ilijedno elijski eukarioti, koji nemaju RTKs ili receptore za citokine, poseduju nekoliko signalnihputeva MAP kinaze. U daljem tekstu e biti opisan signalni put sparivanja (engl. mating pathway)zastupljen kod kvasca (S. cerevisiae), koji predstavlja dobro prou en primer povezivanja G protein-zavisnih receptora (GPCR za sekretovane feromone, a i faktore) sa signalnom kaskadom MAPkinaze. Feromoni kontrolišu sparivanje izmedju haploidnih elija kvasca razli itih tipova (a i ). Ahaploidne elije, sekretuju, a faktor parenja, dok na svojoj membrani imaju receptore za factor. elije sekretuju faktor, a na svojoj membrani ekspresuju receptore za a faktor. Na taj na in

svaki tip elija, prepoznaje faktor parenja produkovan iz elija suprotnog tipa. Aktivacija MAPkinaza preko a ili receptora indukuje transkripciju gena, koji inhibišu elijski ciklus, štoonemogu ava sparivanje sa suprotnim elijskim tipom, i formiranje diploidne elije.

Vezivanje liganda za neki od ovih receptora za feromone, dovodi do stimulacije GPCR-a tj.stimuliše reazmenu GDP-a za GTP na G subjedinici, i disocijaciju G GTP od G kompleksa.Disocirani G kompleks je nosilac fiziološkog odgovora, nastalog usled delovanja feromona naGPCR-a kvasaca. Ovo je potvrdjeno ogledima na elijama kvasca koje nemaju G subjedinicu, i

151

imaju uvek slobodan G kompleks. Ovakve elije mogu da se pare i u odsustvu faktora zaparenje, tj. proces sparivanja je konstitutivno aktivan. elije koje imaju defektnu, ili uopštenemaju G ili G subjedinicu, ne mogu da aktivraju signalni put sparivanja.

Disociran G kompleksaktivira kaskadu kinaza,sli nu onoj kod eukariotskihelija, “downstream” od Ras

proteina. G kompleks jevezan za membranu prekosubjedinice, a vezuje iaktivira Ste20, proteinkinazu koja fosforiliše iaktivira Ste11, serin/tre-onin kinazu koja je analognaRaf i drugim sisa-rskimMEKK proteinima. Aktivi-rana Ste11, fosforiliše Ste7,kinazu dvojne specifi nosti(sli nu MEK) koja fosforiliše iaktivira Fus3, serin/treoninkinazu koja je ekvivalentMAP kinazi. Nakon trans-lokacije u nukleus Fus3,fosforiliše transkripcione fa-ktore, koji kontrolišu ekspre-siju proteina uklju enih uspecifi ne funkcije elija ve-zane za sparivanje.

Slika 4.25. Kinazna kaskada koja prenosi signale od receptora za faktore sparivanja kod S. cerevisiae.

152

4.4.4. “Scaffold” proteini izoluju multiple puteve Map kinaza u elijama eukariota

Pored opisanih MAP kinaza, kvasci kao i elije sisara, sadrže i druge predstavnike superfamilijeMAP kinaza. To su na primer, sisarska JNKs (engl. Jun N-terminal kinases) i p38 kinaza, kojepostaju aktivne u uslovima stresa, kao i šest kinaza koje se ekspresuju u kvascima. Svi ovi enzimisu serin/treonin kinaze, koje se aktiviraju u citosolu, kao odgovor na specifi an ekstracelularnisignal, a zatim se translociraju u nucleus. Imaju kolektivan naziv MAP kinaze. Aktivacija svihpoznatih MAP kinaza zahteva fosforilaciju tirozinskog i treoninskog ostatka u regionu “aktivacioneusne”. Takodje, sve eukariotske elije sadrže nekoliko pripadnika superfamilije MEK kinaza, kojefosforilišu razli ite pripadnike superfamilije MAP kinaza. Vezivanje razli itih ekstracelularnihsignalnih molekula stimuliše, visoko konzervisan sistem kaskade kinaza, koji kulminiraaktivacijom odredjene MAP kinaze. Drugim re ima razli ite MAP kinaze regulišu razli ite odgovoreelije, uklju uju i morfogenezu, smrt elije i odgovore na stres.

Ipak, razli ite kaskade MAP kinaza imaju i neke zajedni ke komponente. Na primer, kod kvasaca,Ste11 je zajedni ki signalni molekul, u putevima koji regulišu sparivanje, rast filamenata iosmoregulaciju, a svaki od ovih puteva aktivira samo jednu efektornu MAP kinazu (na primer,Fus3 funkcioniše kao MAP kinaza u signalnom putu parenja; Kss1 u putu koji reguliše rast

filamenata; Hog1 u regulacijiosmoregulacije. Sli no, usisarskim elijama, zajedni ki“upstream” proteini u estvujuu aktivaciji multiplih JNKkinaza.

Slika 4.26. Razli iti signalni putevi MAPkinaza u S. cerevisiae.

Otkri e zajedni kih elemenata u razli itim signalnim putevima MAP kinaza, je postavilo pitanjekako se ostvaruje specifi nost elijskog odgovora na odredjene ekstracelularne signale. Ogledi nakvascima su obezbedili inicijalne dokaze o postojanju proteina koji su specifi ni za odredjeni puttzv. “scaffold” proteini (u vrlo slobodnom prevodu proteini skele). Ovi proteini spre avajuinterakciju kinaza odredjenog signalnog puta sa kinazama drugog signalnog puta. Na primer,

153

“scaffold” protein Ste5 stabilizuje veliki kompleks koji uklju uje Ste11 i druge kinaze u signalnomputu sparivanja koji na kraju aktivira Fus3 kinazu. Drugi “scaffold” proteini, koji su vezani zazajedni ku komponentu, Ste11, stabilišu kompleks proteina uklju enih u signalni put regulacijefilamentacije, ili osmoregulacije. Drugim re ima, u zavisnosti od specifi nog ekstracelularnogsignala formira se veliki kompleks proteina, u kome je prenos signala iza Ste11 proteina,ograni en na kompleks, koji ograni ava odredjeni “scaffold” protein.

Iako su “scaffold” proteini signalnih puteva MAP kinaza, kvasaca i muva, dobro dokumentovani,postoje poteško e u identifikaciji ovih proteina u sisarskim elijama. Najbolje izu en “scaffold”protein je Ksr (engl. kinase suppressor of Ras), koji vezuje MEK i MAP kinaze u Ras-MAPsignalnom putu. Nadjeni su i drugi proteini koji se vezuju za specifi ne sisarske MAP kinaze, takoda se smatra, da se i u sisarskim elijama specifi nost prenosa signala do odredjenih MAP kinaza,ostvaruje interakcijom sa razli itim “scaffold” proteinima.

154

4.5. FOSFOINOZITIDI KAO TRANSDUKTORI SIGNALA - SIGNALNI PUT PI3 KINAZE

U prethodnom tekstu je objašnjena signalna transdukcija koja poti e od receptora za citokine iRTKs, a koja zapo inje formiranjem multiproteinskog kompleksa povezanog sa plazmamembranom. U ovom delu e biti opisano kako ovi recpetori iniciraju signalne puteve kojiuklju uju fosforilisane inozitol lipide vezane za membranu, kolektivno nazvane fosfoinozitidi.

4.5.1. Neki RTKs i receptori za citokine aktiviraju fosfolipazu C

Kao što je ve opisano ranije, stimulacija nekih G protein-zavisnih receptora, aktivira izoformufosfolipaze C (PLC ). To je enzim povezan sa membranom koji vrši hidrolizu fosfatidilinozitol 4,5-bifosfata (PIP2), i tako generiše dva zna ajna sekundarna glasnika, 1,2-diacilglicerol (DAG) iinozitol 1,4,5-trifosfat (IP3). Prenos signala preko IP3/DAG signalnog puta vodi ka pove anjucitosolnog Ca++ i aktivacije protein kinaze C.

Mnogi RTKs i receptori za citokine, takodje, mogu da iniciraju IP3/DAG signalni put, aktivacijomizoforme PLC. SH2 domeni PLC , se vezuju za specifi ne fosfotirozine aktiviranog receptora,dovode i enzim u neposrednu blizinu PIP2, substrata vezanog za membranu. Sa druge strane,kinazna aktivnost receptora, fosforiliše tirozinske ostatke na vezanoj PLC što pove ava hidrolaznuaktivnost. Drugim re ima, RTKs i citokinski receptori stimulišu aktivnost PLC na dva na ina:lokalizacijom enzima tj. dovode i ga u vezu sa membranom, i fosforilacijom enzima.

4.5.2. Regrutovanje PI-3 kinaze dovodi do aktivacije protein kinaze B

Pored aktivacije IP3/DAG signalnog puta, neki RTKs i receptori za citokine, mogu da iniciraju jošjedan fosfoinozitidni signalni put, tj. put PI-3 kinaze, regrutovanjem enzima, fosfatidilinozitol-3kinaze (PI-3) na membranu. PI-3 kinaza je prvi put identifikovana, tako što je purifikovanazajedno sa nekoliko viralnih onkoproteina. Kada se neaktivna, dominantno negativna, verzija PI-3kinaze, ekspresuje u elijama zaraženim virusom (virus-transformisanim elijama), inhibiše senekontrolisana proliferacija elija, karakteristi na za virus-transformisane elije. Ovaj, kao i druginalazi, sugerišu da je normalna kinaza u odredjenim signalnim putevima zna ajna za proliferacijuelija i za spre avanje apoptoze. Kasniji eksperimentalni rezultati su potvrdili u eš e PI-3 kinaze u

signalnim putevima koji regulišu proliferaciju i apoptozu elija. Humani genom kodira 9

155

homologih PI-3 kinaza, od kojih najbolje izu ena sadrži p110 subjedinicu, koja ima kataliti kuaktivnost i p85 subjedinicu sa SH2 domenom.

SH2 domen PI-3 kinaze, se vezuje zafosfotirozinske ostatke u citosolnom domenumnogih aktiviranih RTKs, i receptora zacitokine. Aktivirani receptor angažuje PI-3kinazu, postavljaju i njen kataliti ki domen ublizinu fosfoinozitidnog supstrata (na citosolnojstrani elijske membrane), što dovodi donastajanja PI 3,4-bifosfata ili PI 3,4,5-trifosfata.Ovi PI-3 fosfati, vezani za plazma membranu,predstavljaju vezno mesto za razli ite signalneproteine, koji prenose signale u okviru nekolikozna ajnih signalnih puteva.

Protein kinaza B (PKB, ili Akt) jeserin/treonin kinaza, koja se vezuje za PI-3fosfate. Pored kinaznog domena, PKB posedujePH domen, preko koga se ostvaruje veza sa 3-fosfatom (može da se veže i za PI 3,4-bifosfat,kao i za PI 3,4,5-trifosfat). U nestimulisanimelijama, nivo PI-3 fosfata je mali, i PKB se

nalazi u citosolu u neaktivnoj formi. Nakonstimulacije receptora, raste koli ina PI-3 fosfatau eliji, PKB se translocira na elijskumembranu i vezuje za fosfate.

Interakcija sa PI-3 fosfatosfatima se odvijapreko PH domena, što dovodi do konformacionepromene molekula, koja oslobadja kataliti komesto neaktivne PKB, od inhibitornog uticajaPH domena. Maksimalna aktivacija PKB, zavisiod angažovanja još jedne kinaze, koja se

Slika 4.27. Nastajanje fosfatidilinozitol 3-fosfata

156

takodje, preko PH domena vezuje za PI-3 fosfate. To je PDK1 kinaza (engl. phosphoinositide-dependent protein kinase 1)16. Obe kinaze (PKB i PDK1), povezane sa membranom prekointerakcije sa PI-3 fosfatima, se difuzijom u ravni membrane, približavaju jedna drugoj, što omo-gu ava njihovu interakciju, tj. PDK1 fosforiliše PKB. PDK1 prvo fosforiliše ostatak serina u okviru“aktivacione usne” PKB.

Za maksimalnu aktivaciju PKB, je potrebna i fosforilacija drugog serina, koji se ne nalazi usegmentu “aktivacione usne”. Drugim re ima, aktivnost PKB je regulisana, inhibitornim PHdomenom, kao i delovanjem druge kinaze tj. fosforilacijom. Jednom aktivirana, PKB, se disociraod plazma membrane i difunduje u citosol gde može da fosforiliše razli ite ciljne proteine.

Slika 4.28. Regrutovanje i aktivacija PKB u signalnom putu PI-3 kinaze.

4.5.3. Receptor za insulin deluje preko signalnog puta PI-3 kinaze

Insulinski receptor je dimerni RTK, koji aktivira Ras-MAP signalni put, koji dovodi do promene uekspresiji gena. Aktivacija receptora za insulin, može, da stimuliše i signalni put PI-3 kinaze. U

16 PDK1 kinaza (engl. phosphoinositide-dependent protein kinase 1) uprkos svom imenu ne zahteva fosfoinozitide za efikasnu in vitro fosforilacijuve ine supstrata.

157

elijama jetre, miši ima i masnim elijama, aktivacija insulinskog receptora, preko aktivacije PKB,dovodi do smanjenja nivoa glukoze u krvi i stimulacije sinteze glikogena.

Osnovni mehanizam preko koga insulin smanjuje nivo glukoze u krvi, je stimulacija transportaglukoze u masne elije i miši ne elije. Ovaj efekat se ostvaruje aktivacijom PKB, koja prekonepotpuno objašnjenog mehanizma, dovodi do premeštanja transportera za glukozu tzv. GLUT4,sa intracelularne membrane na površinu elije. Intenzivniji transport glukoze u eliju, dovodi dosmanjenja njene koncentracije u krvi.

U jetri i miši ima, insulin stimuliše aktivnost glikogen sintaze (GS), koja je odgovorna za sintezuglikogena od UDP-glukoze. Kada su elije u miru (u odsustvu stimulacije sa insulinom), kinazaglikogen sintaze 3 (GSK3) je aktivna tj. fosforiliše glikogen sintazu, blokiraju i njenu aktivnost.Aktivacijom insulinskog receptora, aktivira se PKB koja fosforiliše i time inhibise GSK3. InhibicijaGSK3, aktivira sintezu glikogena.

4.5.4. Aktivirana protein kinaza B omogu ava preživljavanje elija aktivacijom nekolikoputeva

U mnogim elijama aktivirana protein kinaza B, direktno fosforiliše proapoptoti ke proteine, kaošto je, na primer BAD (engl. Bcl-2-associated death promoter), i na taj na in spre ava aktivacijuapoptoti kog signalnog puta, koji dovodi do elijske smrti. Aktivirana PKB je, u elijama mnogihkultura, uklju ena u spre avanje apoptoze, fosforilacijom tri serinska ili treoninska ostatkatranskripcionog faktora “forkhead-1”. Ovaj transkripcioni faktor se u nestimulisanim elijama(bez faktora rasta) nalazi u nefosforilisanom stanju u nukleusu i aktivira transkripciju nekolikogena koji kodiraju proapoptoti ke proteine. Kada se u kulturu elija dodaju faktori rasta, PKBpostaje aktivna i fosforiliše “forkhead-1”. Za fosforilisani “forkhead-1” se veže fosfoserin-vezuju iprotein 14-3-3, i odvaja ga u citosol17. Nestanak faktora rasta iz kulture, dovodi do inaktivacijePKB, i do defosforilacije “forkhead-1” tj. do favorizovanja apoptoze. Konstitutivno aktivni mutant18

“forkhead-1” inicira apoptozu ak i u prisustvu faktora rasta tj. aktivirane PKB.

17 14-3-3 je isti onaj protein koji zadržava fosforilisani Raf u citosolu. 14-3-3 proteini su familija konzervisanih regulatornih molekula koji seekspresuju u svim elijama eukariota. 14-3-3 proteini imaju sposobnost da vezuju razli ite “signalne proteine”, uklju uju i kinaze, fosfataze, itransmembranske receptore. Poznato je da više od 100 signalnih proteina može da reaguje sa 14-3-3 proteinima.18 U konstitutivno aktivnom mutantu “forkhead-1” proteina su 3 serinska ostatka, koja su mesta fosforilacije sa PKB, zamenjena nekim drugimaminokiselinama.

158

4.5.5. PTEN fosfataza je uklju ena u prekid PI-3 signalnog puta

Kao i druga intracelularna dešavanja u procesu prenosa signala, i fosforilacija PI-3 kinazom jereverzibilna. Fosfataza odgovorna za ovaj proces tzv. PTEN fosfataza (engl. phosphatase andtensin homolog (mutated in multiple advanced cancers 1)), ima neobi no široku specifi nost.Iako je PTEN fosfataza uklju ena u defosforilaciju fosfoserinskih, fosfotreoninskih ifosfotirozinskih ostataka mnogih proteina, smatra se da je njena glavna funkcija u elijiuklanjanje 3-fosfata iz PI 3,4,5-trifosfata. “Overekspresija” PTEN fosfataze u eliji promovišeapoptozu, tako što smanjuje nivo PI 3,4,5-trifosfata, a time i antiapoptoti ki efekat aktiviranePKB.

elije mnogih agresivnih kancera nemaju gen koji kodira PTEN. Delecija ovog gena vodi kanekontrolisanom rastu elija, karakteristi nom za ove kancere. Ove elije imaju povišen nivo PI3,4,5-trifosfata i povišenu aktivnost PKB. S`obzirom da aktivirana PKB ima antiapoptoti ki efekat,gubitak PTEN indirekno smanjuje programiranu elijsku smrt. U nekim elijama, kao što su stemelije nervne kreste, nedostatak PTEN-a ne samo što spre ava apoptozu, nego stimuliše elijski

ciklus i dovodi do ubrzane proliferacije. Zna aj PTEN-a u kontroli razvoja nervnog sistema,ilustuje primer, “knockout” miševa, koji ne ekspresuju PTEN, i imaju velike mozgove sa velikimbrojem nervnih elija.

4.5.6. Receptor za odredjeni faktor rasta je povezan sa multiplim signalnim putevima.

Interakcija razli itih signalnih puteva omogu ava finu regulaciju elijskih aktivnosti neophodnihza održavanje kompleksnih fizioloških procesa. Kao što je opisano ranije, RTK i receptori zacitokine mogu da iniciraju Ras-MAP signalni put, DAG/IP3 put, kao i signalni put PI-3 kinaze.Takodje, citokinski receptori mogu da preko JAK kinaze, povezane sa receptorom, direktnoaktiviraju STAT transkripcione faktore.

Aktivacija multiplih signalnih puteva preko mnogih receptora, omogu ava nezavisnu kontrolurazli itih setova gena, aktivacijom istih ili razli itih receptora. Ponekad ovi signalni putevi moguda indukuju suprotne efekte. Na primer, genetska manipulacija Ras-MAP signalnog puta, i putaPI-3 kinaze, u toku diferencijacije miši a je ukazala da ova dva puta imaju suprotne efekte:aktivacija Ras-MAP kinaznog puta inhibiše diferencijaciju miocita u miotubule, dok aktivacijaputa PI-3 kinaze stimuliše diferencijaciju.

159

4.6. RECEPTORI POVEZANI SA CITOPLAZMATI NIM TIROZIN KINAZAMA

Aktivnost mnogih plazma membranskih receptora, koji nemaju domen tirozin kinaze, ipak, zavisiod fosforilacije tirozinskog ostatka. Ovi receptori funkcionišu preko citoplazmati nih tirozinkinaza, koje su povezane sa receptorom, a mogu da fosforilišu razli ite proteine u eliji,uklju uju i i same receptore kada se za njih veže ligand. Funkcionisanje ovih receptora je sli nofunkcionisanju RTKs. Razlika je u tome što su receptor i „njegov” kinazni domen kodiranirazli itim genima, i što je tirozin kinaza nekovalentno povezana sa polipeptidom receptora. Kao iRTKs, i ovi receptori za ispoljavanje svoje funkcije zahtevaju oligomerizaciju.

Mnogi od ovih receptora zavise od aktivnosti pripadnika najve e familije citoplazmati nih tirozinkinaza, tzv. Src familije tirozin kinaza. Src familiji pripadaju i Src, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck iBlk. Sve ove protein kinaze sadrže SH2 i SH3 domene, i nalaze se na citoplazmati noj straniplazma membrane, drže i se za nju delimi no, preko interakcije sa transmembranskimreceptorima a delimi no preko kovalentne veze sa lipidnim lancima. Razli iti pripadnici Srcfamilije su povezani sa razli im receptorima i fosforilišu razli ite setove ciljnih proteina. Naprimer, Lyn, Fyn i Lck su povezani sa razli im receptorima za antigene na limfocitima (Fyn i Lynsa BCR-om, a Lck sa TCR-om). U oba slu aja kinaza se aktivira kada se ekstracelularni ligandveže za odgovaraju i receptorni protein. Src, kao i neki drugi pripadnici Src familije, se takodje,mogu vezati i aktivirati RTK. U ovom slu aju receptor i citoplazmati na tirozin kinaza, uzajamno,stimulišu kataliti ku aktivnost jedna drugoj, i na taj na in poja avaju i produžavaju trajanjesignala.

Slika 4.29. Interakcija receptora za antigenena B limfocitima sa Fyn, Blk i Lyn i aktivacijasignalnog puta.

160

Drugi tip citoplazmati nih tirozin kinaza, je povezan sa integrinima, familijom receptora prekokojih se elija vezuje za ekstracelularni matriks. Vezivanje integrina za komponente matriksa,aktivira intracelularne signalne puteve koji uti u na ponašanje elije. Grupisanje integrina (engl.cluster) na mestima kontakta sa matriksom, pomaže nastajanje fokalno adhezivnih veza, kojeregrutuju mnoge proteine. Citoplazmati na tirozin kinaza tzv. FAK (engl. focal adhesion kinase)se, uz asistenciju drugih citoskeletnih proteina, veže za citoplazmati ni rep jedne subjediniceintegrina. FAK molekuli u formiranim klasterima, se uzajamno fosforilišu, formiraju ifosfotirozinsko vezno mesto na koje e se vezati Src kinaza. Src i FAK, fosforilišu jedan drugog,kao i druge proteine koji grade adhezivnu vezu, uklju uju i i signalne proteine RTK signalnog

puta. Na ovaj na in je omogu ena adhezija elija zaodgovaraju i substrat (podlogu), na kome je mogu e njihovopreživljavanje, rast, deoba elije, kao i migracija. Miševi kojine ekspresuju FAK, umiru u ranim fazama razvoja, anjihove elije ne migriraju normalno u posudama za gajenje(engl. culture dish).

Slika 4.30. Formiranje fokalno adhezivnih veza sa substratumuz angažovanje FAK i Src kinaza. Objašnjenje u tekstu.

Receptori za citokine su subfamilija receptora povezanih sa citoplazmati nim tirozin kinazama. Onjima možete pro itati u predhodnim delovima teksta.

161

4.7. SIGNALING PREKO GUANILIL CIKLAZA I cGMP-a

Guanilil ciklaze (engl. Guanylyl Cyclase – GC) su familija enzima koja katališe konverziju GTP ucGMP. Familiju ine i membranski-vezani/partikularni izotipovi guanilil ciklaze (engl.membrane-bound GCs – mGCs or particulate GCs - pGC) i solubilne izoforme guanilil ciklaze(engl. soluble GCs – sGCs)koje su ekspresovane u skoro svim elijskim tipovima. Ovi receptor-enzimi su regulisani veoma raznovrsnim i raznolikim ekstracelularnim signalnim molekulima kojiuklju uju peptidne hormone (npr. natriureti ne peptide), bakterijske toksine (npr.lipopolisaharide), slobodne radikale (npr. azot oksid), kao i intracelularne molekule kao što suCa2+ i adeninski nukleotidi. Stimulacija guanilil ciklaze prouzrokuje akumulaciju cGMP, a cGMP,kao sekundarni glasnik u maniru sli nom cAMP, aktivira i/ili reguliše kompleksni signal-transdukcioni kaskadni signaling preko intermedijalnih efektora u donjem toku signalnog puta.Ovi cGMP-indukovani efektori ukju uju cGMP-zavisnu protein kinazu (engl. Protein Kinase G -PKG); cGMP-regulisane fosfodiesteraze (engl. PhosphoDiEsterases - PDEs): cikli nimnukleotidima-regulisne jonske kanale (engl. Cyclyc Nucleotide Gated ion channels - CNG) itransportere-pumpe cikli nih nukleotida, ali i nekih drugih molekula (engl. Multi-drug ResistanceProteins - MRPs). Guanilil ciklaze i cGMP-posredovane signalne kaskade imaju centralnu ulogu uregulaciji razli itih fizioloških (ali i patofizioloških) procesa uklju uju i motilitet glatkemuskulature, homeostazu intestinalnog fluida i elektrolita, regulaciju prometa vode i elektrolita,fototransdukciju u retini, kao i modulatornu, autokrinu i/ili parakrinu funkciju u regulacijimedju elijske i intra elijske komunikacije. U ovoj sekciji e ukratko biti opisana opštekarakteristike guanilil ciklaza, struktura i funkcija lanova familije guanilil ciklaza i ukratkomolekularni mehanizmi koji regulišu aktivnost enzima. Pored toga bi e dat kratak pregleddogadjaja u donjem delu signal-transdukcionih puteva koji su kontrolisani GC-cGMP-signalingom, uklju uju i efektore koji transdukuju signal (PKG i CNG kanali), kao i signalneproteine koji prekidaju signaling (PDEs i MRPs).

Veliki broj receptora sa aktivnoš u guanilil ciklaze je otkriven, ali u najve em broju slu ajeva onisu orfanski receptori, za koje nije poznat ligand koji ih aktivira u normalnim/fiziološkim uslovima.Genom nematode Caenohrabditis elegans kodira ak 26 razli itih receptora sa atkivnoš u guanililciklaze. Ve ina onih ispitivanih su ekspresovani u specifi nim podgrupama senzornih neurona,sugerišu i da su možda ovi receptori uklju eni u detektovanju odredjenih i specifi nih molekula uokruženju ovih crva. Pored toga, neki sisarski orfanski receptori sa aktivnoš u guanilil ciklaze supronadjeni u senzorni neuronima, u delu nosa koji je odgovoran za detekciju feromona.

162

4.7.1. Receptori guanilil ciklaze generišu cGMP direktno

Receptori guanilil ciklaze su proteini koji imaju na jednom domenu ligand-vezuju e mesto(ekstracelularno ili intracelularno) za signalni molekul, a na drugom domenu (uvek intracelularno)guanilil-ciklaze-kataliti ki domen. Vezivanje signalnog molekula aktivira ciklazni domen kojikatališe transformaciju GTP u cGMP. Produkovani cGMP se potom vezuje i aktivira cGMP-zavisnu protein kinazu G (engl. Protein Kinase dependent on cGMP - PKG) koja fosforilišespecifi ne serine ili treonine, sli no kao i PKA. Prema tome, receptor GC koristi cGMP kaointracelularni medijator, sekundarni glasnik, u istom maniru kao što neki GPCRs preko adenililciklaze koriste cAMP. Razlika je u tome što je, kod receptora guanilil ciklaze, veza izmedju ligand-vezuju eg domena i ciklazne aktivnosti direktna, dok se kod GPCRs signalinga veza izmedjureceptora i kataliti ke kinazne aktivnosti ostvaruje preko adenilil ciklaze, te je singalni putreceptor G protein adenilil ciklaza cAMP nešto duži od receptor-GC cGMP.

4.7.1.1. Molekularna biologija guanilil ciklazaRazvoj molekularno bioloških metoda, a u prvom redu lan ane reakcije polimeraze (engl.Polymerase Chain Reaction - PCR) olakšale su pretraživanje i otkrivanje novih lanova familijeguanilil ciklaza. Koriš eni su tzv. degenerativni PCR prajmeri bazirani na konzervisanimaminokiselinskim sekvencama kataliti kih domena i sGC i mGCs da bi se amplifikovalo guanililkataliti ko mesto, kao suprotno od adenilil kataliti kog mesta.

Identifikacija lanova familije guanilil ciklaza. Sredinom 70-tih je otkrivena guanililciklazna aktivnost i u solubilnoj i partikularnoj/membranskoj frakciji ve ine elija, ali je tekrazvoj tehnika molekularnog kloniranja doprineo potpunom istraživanju lanova familije guanililciklaza. Purifikacija guanilil ciklaze iz citosolnog kompartmenta plu a pokazala je da je sGCheterodimer gradjen od i subjedinica i da postoji velika homologija izmedju sGC izolovanih izplu a goveda i pacova. Degenerativni prajmeri zasnovani na strukturi purifikovanih subjedinicasu koriš eni za pregled cDNK biblioteke i kloniranje 1 i 1subjedinica, a potom i 2 i 2subjedinica. sGC je receptor za azot oksid, ali se može aktivirati i na drugi na in. IstraživanjamGC sugerisala su novu paradigmu za transdukciju signala, odnosno mogu nost aktiviranjamGC peptidnim ligandima, natriureti nim peptidima (engl. Natiuretic Peptides – NPs). Postojinekoliko tipova natriureti nih peptida: atrialni natriureti ni peptid (engl. Atrial NP - ANP);natriureti ni peptid mozga (engl. Brain NP – BNP) i C natriureti ni peptid (CNP). U po etnimeksprimentima je pokazano da ANP aktivira guanilil ciklaznu aktivnost u membranskoj frakciji, teje na osnovu toga i izolovana prva, gruba forma mGC iz membranske frakcije testisa morskog

163

ježa, a mGC je prvi put klonirana koriš enjem cDNK biblioteke testisa morskog ježa. Ovaj prviklon je obezbedio neophodne probe za izolovanje sisarske cDNK koja kodira mGC, i to prvobitnomGC izoformi A (mGC-A) i B (mGC-B), a potom i C (mGC-C), D (mGC-D), E (mGC-E), F (mGC-F) iG (mGC-G). mGC-A i mGC-B su receptori za natriureti ne peptide, i to u najve oj meri za ANP iBNP, ali mogu da vežu i CNP. mGC-C je receptor za termostabilne bakterijske enterotoksine(engl. heat-STable enterotoxins - STs ), kao i za endogene peptide guanilil i uroguanilil. Ostaleklonirane mGC su orfanski receptori bez poznatog ekstracelularnog liganda. Sekvence na C-terminalnom kataliti kom domenu mGCs su veoma homologe sa i subjedinicama sGC, aimaju limitirani identitet sa dva kataliti ka domena adenilil ciklasa.

Struktura i lokacija gena koji kodiraju guanilil ciklaze. Hromozomski lokusi gena kojikodiraju izoforme guanili ciklaza, njihovi ligandi su mapirani i u humanom i u mišijem genomu ioni nisu povezani, nego su rasuti po genomu. Na primer, geni koji kodiraju natriureti ne peptidekoji su ligandi za mGC-A (ANP i BNP) su organizovani kao tandem. Sli no, guanili i uroguanilil,endogeni aktivatori mGC-C su kodirani sa blisko vezanim genima. Dok je mGC-A ekspresovana urazli itim tipovima elijua, ekspresija mGC-C je ograni ena na intestinalini epitel i primarni imetastazni kolorektalni kancer.

4.7.2. Membranski vezani receptori guanilil ciklaze

Signalni molekuli koji koriste membranski vezane guanilil ciklaze su natriureti ni peptidi (engl.Natiuretic Peptides – NPs), familija strukturno sli nih sekretornih signalnih peptida koji regulišupromet vode i elektrolita i dilatiraju krvne sudove. Postoji nekoliko tipova natriureti nih peptida:atrialni natriureti ni peptid (engl. Atrial NP - ANP); natriureti ni peptid mozga (engl. Brain NP –BNP) i C-tip natriureti nog peptida (CNP). Miši ne elije atriuma (komore) srca sekretuju ANPkada se pove ava krvni pritisak. Sekretovani ANP cirkulacijom dospeva do bubrega i stimulišeekskretovanje Na+ i vode. Pored toga stimuliše relaksaciju glatkih miši a zidova krvnih sudova.Oba ova efekta smanjuju krvni pritisak. Pored toga, u raznim tkivima natriureti ni peptidiu estvuju u autokrinoj i/ili parakrinoj regulaciji i/ili modualciji razli itih fizioloških funkcijarazli itih tipova elija.

Do danas je kod sisara opisano sedam izoformi mGC koji su ozna eni mGC-A, B, C, D, E, F i G.Ovi proteini formiraju familiju elijskih-površinskih receptora i karakterišu se prisustvomekstracelularnog ligand-vezuju eg domena; jednog transmembranskog domena koji jedanput

164

preseca membranu; i citosolnog regiona koji sadrži unikatnu karakteristiku guanilil ciklaza tj. C-terminalni ciklaza karakteristi ni domen i protein-kinazi sli an domen. Kao što je napomenuto,mGC-A i mGC-B funkcionišu kao receptori za natriureti ne peptide, mGC-C je receptor zabakterijski termostabilni enterotoksin i za dva endogena peptida (guanilil i uroguanilil), dok suostale etiri izoforme mGC orfanski receptori. Dok su receptori za natriureti ne peptide koji imajuaktivnost guanilil ciklaze (mGC-A i mGC-B), kao i mGC-G veoma rasprostranjeni u tkivima,mGC-C i guanilil ciklaze senzornih organa (mGC-D, mGC-E i mGC-F) su ekspresovane u tkivnospecifi nom maniru.

4.7.2.1. Izotipovi membranske/partikularne guanilil ciklazeNa osnovu specifi nosti prema ligandu mGC su klasifikovane u tri osnovne klase:

(1) Receptori natriureti nih peptida sa aktivnoš u guanilil ciklaze uklju uju mGC-A imGC-B koje se ekspresuju u bubrezima, adrenalnoj žlezdi, glatkim miši ima krvnih sudova idrugim tkivima, a vezuju natriureti ne peptide ANP, BNP i CNP. Osnovni mehanizam kojimnatriureti ni peptidi ispoljavaju svoj fiziološki efekat uklju uje aktiviranje receptora koji imajugunilil ciklaznu aktivnost i intracelularna akumulacija cGMP-a. Receptor mGC-A ima najve iafinitet za ANP, a oko 10 puta manji za BNP, dok je afinitet za CNP veoma mali. Suprotno, mGC-Bima 50 do 500 puta ve i afinitet za CNP nego za druge natriureti ne peptide.

(2) Intestinalnog peptida-vezuju i receptori sa aktivnoš u guanilil ciklaze uklju ujumGC-C koja je originalno identifikovana i klonirana od mRNK izolovane iz intestinalne mukoze. Zarazliku od receptora za natriureti ne peptide, zna ajna ekspresija mGC-C je limitirana na elijeintestinalne mukoze na putu od duodenuma do rektuma. Iako mGC-C ima konzervisanudomensku strukturu karakteristi nu za familiju guanilil ciklaza, nema ulogu receptora zanatriureti ne peptide. Prvi otkriveni ligand za mGC-C je termolabilni bakterijski endotoksin ST.Kasnije je potvrdjeno da i peptidi koji ispoljavaju veliki stepen homologije sa ST enterotoksinom,kao što su guanilin i uroguanilin (izolovani iz intestinalne mukoze), kao i limfoguanilin(izolovan iz slezine i limfoidnih tkiva), mogu da se vežu za ovaj receptor i da preko njegapove avaju koncentraciju intracelularnog cGMP-a.

(3) Orfanski receptori sa aktivnoš u guanilil ciklaze uklju uju mGC-D, mGC-E, mGC-F imGC-G, izoforme za koje nisu precizno definisani ligandi, ali se zna da ih ne aktiviraju ligandi kojiaktiviraju ostale klase mGCs. Primarna struktura ekstracelularnih domena mGC-D, mGC-E imGC-F ispoljava veliki stepen homologije, a njihova ekspresija je limitirana na senzorna tkiva.Ekstracelularni domen mGC-G veoma podse a na ekstracelularni domen receptora zanatriureti ne peptide, te se sumnja da i ligand za mGC-G možda li i na natriureti ne peptide.

165

4.7.2.2. Struktura membranske/partikularne guanilil ciklazeSve membranski-vezane guanilil ciklaze ispoljavaju veliku konzervisanost strukturnih domena.Noviji rezultati istraživanja u ovoj oblasti su doprineli definisanju i identifikaciji šest odvojenihdomena (Slika 4.31.): (1) Ekstracelularni ligand-vezuju i domena na N-terminalnom kraju kojiponekad, u zavisnosti od strukture ne konzervisanog dela molekule, vezuje razli ite ligande (npr.u slu aju mGC-A, mGC-B i mGC-C). (2) Jedan transmembranski domen koji samo jedan putpreseca elijsku membranu. (3) Citoplazmati ni jukstamembranski domen. (4) Regulatorni domenkoji ima zna ajnu homologiju sa protein kinazama. (5) Region sli an zglobu koji može da sepomera i okre e. (6) C-terminalni kataliti ki domen.

Slika 4.31. Struktura domena gunanilil ciklaza.Prikazani su modeli ANPCRs (engl. ANP Clearance Receptors; tzv. „okrnjena“ forma mGC-A kome nedostaje citoplazmati ni domen ispod jukstaglomerularnogdomena), mGCs i sGCs.

166

4.7.2.3. Receptor-efektor povezanost i funkcija membranske/partikularne guanilil ciklazeMehanizmi kojima se interakcija ligand-receptor prevodi/transducira u kataliti ku aktivaciju ielijski signal, kao i prekidanje tog signala nije precizno definisano kod mGC-signalinga. Receptori

guanilil ciklaze ispoljavaju strukturu sli nu receptorima familije tirozin kinaza. Prihva enimodel aktivacije ovih receptora uklju uje obaveznu ligandom-indukovanu dimerizacijureceptornih monomera. Smatra se da mGC ve postoje u obliku oligomera i da ligand-receptoraktivacija ne menja oligomerno stanje. Adeninski nukleotidi, kao što je ATP, indukuju alosteri kuaktivaciju guanilil ciklaze. Pored efekta na interakciju izmedju receptora i efektora, adeninskinukleotidi takodje alosterno regulišu afinitet receptora za natiureti ne peptide, za ligand.Suprotno ovome, supstituenti adeninskih nukleotida, kao što su 2-hloroATP i 2-metiltioATPinhibišu i bazalnu i indukovanu aktivnost guanilil ciklaza.

Slika 4.32. Regulacija membranske guanilil ciklaze (mGC) i solubilne guanilil ciklaze (sGC) njihovim ligandima.

167

4.7.3. Solubilna guanilil ciklaza

Solubilna guanilil ciklaza, sGC, je ekspresovana u citoplazmi skoro svih sisarskih elija ifunkcioniše kao receptor za azot oksid, a posreduje u ostvarivanju širokog spektra raznovrsnihfizioloških funkcija, kao što je inhibicija agregacije trombocita, relaksacija glatke muskulature,transmisija signala u procesima vidjenja, transdukciji signala u nervnom sistemu,imunomodulaciji itd. Ovaj enzim je heterodimerni protein koga ine i subjedinice, a ekspresijaobe subjedinice je neophodana za kataliti ku aktivnost. Svaka subjedinica se sastoji od N-terminalnog regulatornog domena i C-terminalnog kataliti kog domena i oni imaju veliki stepenhomologije sa domenima membranske guanilil ciklaze, kao i adenilil ciklazama.

4.7.3.1. Struktura subjedinica i izotipovi/izoforme solubilne guanilil ciklazeAnaliza sGC iz razli itih tkiva pokazala je da ovaj enzima ima heterodimernu strukturu koju inikombinacija dve od mogu e etiri subjedinice ( 1, 2, 1, 2). Najzastupljeniji heterodimer jekombinacija 1 i 1 subjedinica i ovaj heterodimer se ekspresuje u mnogim tkivima.Eksperimentalni podaci pokazuju da ekspresija 1 ili 1 subjedinica ponaosob nema udela uformiranju aktivnog enzima, ve je ekspresija obe subjedinice neophodna za kataliti ku aktivnostenzima. Pored toga, pokazano je da i 2 subjedinica može da formira heterodimer 1/ 2 koji jeznatno manje aktivnosti od 1/ 1 homodimera. Smatra se da 2 reguliše aktivnost 1/ 1heterodimera kompeticijom sa 1. Pored 1, i 2 subjedinica može da formira heterodimere i sa1 i sa 2 s tim što ima manji afinitet za vezivanje sa 1. Ovaj 2/ 1 heterodimer je takodje

manje aktivan od 1/ 1, što ukazuje da verovatno i 2 subjedinica ima regulatornu ulogu. Uprkoszahtevu za heterodimernom konformacijom za ekspresiju kataliti ke aktivnosti, dokazano je ipostojanje homodimera 1/ 1 i 1/ 1, ali njihova fiziološka uloga još nije definisana. IzoformasGC koja je skoro otkrivena i izolovana iz nervnog sistema duvanskog rogatog moljca (Manducasexta) ne zahteva heterodimernu formaciju za ekspresovanje kataliti ke aktivnosti. Ova novijaforma sGC je ozna ena kao MsGC- 3 i po strukturi je veoma sli na 1 subjedinici, ali na C-terminalnom završetku ima dodatni peptidni lanac od 315 aminokiselina koji nije homolog ni sajednim poznatim proteinom.

4.7.3.2. Struktura domena solubilne guanilil ciklazeSvaka pojedina na subjedinica solubilne guanilil ciklaze se sastoji od tri funkcionalna domena:hem vezuju eg, dimerizacionog i kataliti kog (Slika 4.31). Hem-vezuju i domen je lociran na N-kraju svake subjedinice, a hem prosteti na grupa je neophodna za aktivaciju enzima sa NO. Hem

168

je prsten od pet atoma azota, od kojih su etiri atoma azota koordinisana centralnim atomomgvož a, dok je peti atom azota vezan za His105 1 subjedinice imidazolnom vezom. Centralni atomgvoždja može biti ili u fero/redukovanoj (Fe2+) ili u feri/oksidovanoj (Fe3+) formi. Peti lan prstenaje imidazolski aksijalni ligand koordinisan sa 1 subjedinicom na His105. Mutacija na ovomhistidinu lociranom blizu N-terminalnog dela 1 subjedinice rezultira nesposobnoš u sGC davezuje hem, te se produkuje enzim koji nije sposoban da odgovara na NO. Mutacije na drugimkonzervisanim histidinima nemaju efekta na sposobnost enzima da vezuje hem. C-kraj i subjedinica je kataliti ki domen enzima i prisustvo C-kraja obe subjedinice je neophodno zavezivanje supstrata. Dimerizacioni domen je mesto povezivanja 1 i 1 subjedinica i ispoljavaveliki stepen homologije sa dimerizacionim domenom mGC.

4.7.3.3. Regulacija solubilne guanilil ciklaze ligandimaRegulaciju aktivnosti sGC mogu da vrše NO, protoporfirin IX, dvovalentni katjoni, a postoji ikataliti ki mehanizam regulacije sGC.

Azot oksid (NO) reguliše solubilnu guanilil ciklazu. NO je slobodni, reaktivni radikal kojiaktivira sGC vezivanjem direktno za hem formiranjem fero-nitrozil-hem kompleks (Slika 4.32.).Poluživot ovog fero-nitrosil hema je izmedju 4 minuta i 3 sata na 20oC. NO se veže za šestupoziciju prstena hema, raskida vezu izme u aksijalnog histidina i gvož a, i formira vezu sagvoždjem koje je tada pomereno iz ravni prstena. Na ovaj na in se frormira peto-koordinidaniprsten u kojem je NO tada na petoj poziciji. Enzim se inaktivira disocijacijom NO i vra anjemgvoždja u ravan prstena. Pored toga, ugljen monoksid (CO), tako e ima sposobnost vezivanja zašestu poziciju prstena hema, ali u tom slu aju ne e do i do disocijacije histidina, i Fe ostaje uravni prstena. Stoga je CO daleko manje efikasan aktivator sGC nego NO i u slu ajupurifikovanog enzima sGC, aktivacija sa NO je 100 do 200 puta, dok je aktivacija sa CO svega4 puta.

Protoporfirin IX reguliše solubilnu guanilil ciklazu. Protoporfirin IX (engl.ProtoPorphyrin IX – PPIX), prekursor hema, je komponenta koja postoji prirodno i koja sesintetiše od glicina. PPIX ima sposobnost aktivacije raznih formi sGC (sGC koja je deficitarna uhemu (engl. heme-deficient sGC); koja nema hem (engl. heme-free sGC) ili koja ima hem(hem-containing sGC) u aktivnom centru i to i u hem-nezavisnom i u NO-nezavisnom maniru. PPIX sevezuje za sGC pri malim koncentracijama (Kd=1.4 nM) i formira stabilan kompleks koji ne disociratokom gel filtracije ili dijalize. Dva dela porfirinskog prstena su veoma važna za vezivanje za hemsGC, a to su dve vinil grupe na pozicijama 2 i 4 (esencijalne su za kreiranje hidrofobneinterakcije izmedju porfirinskog ringa i enzima; supstitucija ovih grupa sa manje hidrofobnim ili

169

polarnim grupama prouzrokuje slabiju interakciju izmedju porfirinskog prstena i sGC i smanjujeaktivnost enzima) i negativno naelektrisane COOH grupe vicinalne propionske kiseline napoziciji 6 i 7 (formiraju elektrostati ke veze sa baznim ostacima (npr. argininskim) u apoproteinusGC).

Kataliti ki mehanizam regulacije solubilne guanilil ciklaze. Kataliti ki domen prisutanna C-terminusu i i subjedinica sGC ispoljava veliki stepen homologije sa C1 i C2 kataliti kimdomenima adenilil ciklaze, kao i kataliti kim domenima mGCs. Kao što je napomenuto ranije, zaispoljavanje enzimske aktivnosti sGC, neophodna je koekspresija i subjeinica koje formirajuheterodimer koji poseduje dva kataliti ka domena. Iako su prisutna dva kataliti ka domena, svakiod njih doprinosi, sa specifi nim ostacima, formiranju jedinstvenog kataliti kog mesta i vezivanjujedinstvenog supstrata. Dimerizacija se ostvaruje specifi nim regionom koji je homologdimerizacionom domenu mGCs i lociran je proksimalno u odnosu na kataliti ke domene isubjedinica (Slika 4.31.)

Dvovalentni katjoni regulišu i solubilnu i membranski vezanu guanilil ciklazu. Zaekspresiju maksimalne kataliti ke aktivnosti mGCs i sGC neophodni su dvovalentni katjoni, i tokao kofaktori za supstrate i alosterni modulatori. Za aktivaciju svih nukleotidnih ciklaza jeneophodno da njihovi purinski nukleotidi formiraju helate sa dvovalentnim katjonima, te se, tekkao tako formirani helati, vezuju za kataliti ki domen i pokre e se enzimska ciklizacija. Mn2+ iMg2+ su optimalni dvovalentni katjoni koji funkcionišu kao kofaktori supstrata. Koriš enjem Mg2+

kao katjonskog kofaktora supstrata, guanilil ciklaze (mGCs i sGCs) ispoljavaju bazalnu kataliti kuaktivnost koja je potpuno senzitivna na aktivaciju ATP i lignadima. I ne samo to, izgleda da jeMg2+ fiziološki dvovalentni katjon koji podržava guanil ciklaznu aktivnost in vivo. Suprotno ovome,koriš enjem Mn2+ kao katjonskog kofaktora supstrata guanilil ciklaze ispoljavaju maksimalnukataliti ku aktivnost, ali nisu senzitivne na aktivaciju nukleotidima i ligandima. Ovo je generalnakarakteristika ciklaza. Adenilil ciklaze se takodje aktiviraju u ligand-nezavisnom maniru ukolikokoriste Mn2+ kao katjonski kofaktor supstrata. Ca2+ katjoni takodje podržavaju kataliti kuaktivnost guanilil ciklaza kao katjonski kofaktori supstrata, ali izgleda da su oni negativnialosterni modulatori sGC. I ne samo to, Ca2+ i cGMP ispoljavaju antagonisti ke funkcije unekoliko fizioloških sistema (u vaskularnim glatkim miši ima Ca2+ indukuje kontrakcju, a cGMPrelaksaciju).

170

4.7.4. cGMP i elijski signaling

Veliki broj endogenih i egzogenih signalnih molekula, uklju uju i lokalno produkovane hemijskemedijatore (citokine i mnoge druge), hormone, neurotransmitere i toksine, indukuju i produkujuelijske odgovore preko cGMP molekula, kao sekundarnog signalnog glasnika.

4.7.4.1. Elementi cGMP signalnog putaBiohemijski mehanizmi i procesi koji omogu avaju biološke odgovore posredovane preko cGMPuklju uju sistem koji sintetiše cGMP (mGC i sGC), sistem efektornih molekula preko kojih setrandukuje signal (cGMP-zavisne protein kinaze ili protein kinaze G (engl. Protein Kinases G -PKG), kanali ije je otvaranje regulisano cikli nim nukleotidima (engl. Cyclyc Nucleotide-Gatedchannels - CNG kanali) i sistem koji uklanja cGMP iz elije i to razgradnjom u citosolu(fosfodiesteraze, engl. PhosphoDiEstreases - PDEs) ili pumpanjem/transportom uekstracelularni prostor (tzv. ABC transporteri, transporteri cikli nih nukleotida, engl. MultidrugResistance Proteins - MRPs). Specifi nost elijskog odgovora je diktirana prisustvom cGMP-vezuju eg motiva na ciljnim proteinima. Dva evolutino daleka alosterna mesta za vezivanje cGMPsu prisutna u eukariotskim elijama. Jedno alosterno vezivanje cGMP, sa velikim stepenomhomologije, se odvija na cGMP-zavisnim i cAMP-zavisnim protein kinazama (PKGs i PKAs) i CNGkanalima, a drugo se dešava na cGMP-zavisnim PDEs. Pored toga, finalni izlazni odgovorpove ane koncentracije intracelularnog cGMP je determinisan tipom i kombinacijom targetnihproteina i supstrata, enzima koji metabolišu cGMP, a ekspresovani su u eliji, kao i njihoveintracelularne kolokalizacije i organizacije u selektivne kompartmente i organele. Na primer,fosfolamban i IP3 receptor su supstrati i za PKA i za PKG, ali obrazac kolokalizacije ovih kinaza injihovih supstrata je razli iti u razli itim tipovima elija. PKG je kolokalizovana sa ova dvasupstrata u elijama glatke muskulature, dok je PKA kolokalizovana sa istim supstratima umiši nim elijama srca. Prema tome, cGMP-PKG-zavisna fosforilacija fosfolambana i IP3 receptorau elijama glatke muskulature ima udela u relaksaciji miši a, dok se, suprotno tome, fosforilacijaistih supstrata u sr ano-miši nim elijama dešava preko cAMP-PKA signalnog puta i favorizujeodvajanje Ca2+, i rezultira skra enjem sistole srca. Na kraju, cGMP može imati razli ite efekte urazli itim fiziološkim ili patofiziološkim uslovima. Na primer, u neutrofilima koji su u stanjumirovanja tj. nisu aktivirani, cGMP analog ne indukuje fosforilaciju intermedijarnog filamentavimetina, dok u aktiviranim neutrofilima, cGMP-PKG fosforiliše vimetin nakon prolaznekolokalizacije enzima na filamentima.

171

U daljem tekstu e biti dat kratak i opšti pregled na ina integracije guanilil ciklaza i cGMP-a utransmembransku signalnu kaskadu, „cross-talk“ sa drugim signalnim putevima, i neki odširokog spektra brojnih dogadjaja u delu signalnog puta nakon guanilil ciklaza i cGMP-a.

4.7.4.2. cGMP i elijski signaling preko protein kinazacGMP i cGMP-zavisne protein kinaze (Protein kinaze G – PKGs)PKGs predstavljaju osnovni intracelularni medijator cGMP-signala. Ligandom-indukovanopove enje koncentracije intracelularnog cGMP-a omogu ava da se cGMP veže i aktivira PKG, štoaktivira kataliti ku kinaznu aktivnost i vodi kataliti kom transferu -fosfata sa ATP na serinski ilitreoninski ostatak ciljnog proteina. Ovaj fosforilisani protein potom posreduje translacijuekstracelularnog sitmulusa u specifi nu biološku funkciju.

Identifikovana su dva razli ita gena za sisarsku PKG. Jedan gen je lociran na humanomhromozomu 10 i kodira dve izoforme, I i I izoforme, PKG I koje nastaju u procesu „alternativesplicing“ N-terminalnog regiona. Drugi gen za PKG je lociran na humanom hromozomu 4 i kodiraPKG II. PKG I je citosolni homodimerni protein (76 kDa) široko ekspresovan u cerebellumu,trombocitima i glatkoj muskulaturi. Razlike u N-terminalnom domenu dve izoforme PKG Iuslovljava razli ite afinitete za vezivanje cGMP-a. PKG I ima vezna mesta velikog i malog afinitetakoja ispoljavaju pozitivnu medjusobnu kooperaciju. PKG I ima dva cGMP-vezuju a mesta samanjim afinitetom i kooperativnoš u. Pored toga, iako je ekspresija ove dve izoforme detektovanau istim humanim tkivima, PKGI je najviše detektovana u vaskularnom sistemu, bubregu iadrenalnoj žlezdi, dok je jedino PKGI detektovana u uterusu. PKG II je membranski-vezanheterodimerni protein (86 kDa) ije prisustvo nije detektovano u kardiovaskularnom sistemu, alije ekspresovan u plu ima, bubregu i kostima, a posebno je dominanatan u mozgu i intestinumu.PKG II se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od PKG I na N-terminalnom kraju, u unikatnom ispecifi nom mestu ovog regiona koje usmerava intracelularnu lokalizaciju ovog enzima. Takodje,PKG II ima miristoilatna mesta koja su neophodna za asocijaciju sa membranom, dok PKG I imaacetilovana mesta. Osnovna razlika izmedju dve PKGs je što cGMP-vezuju a mesta na PKG IIispoljavaju minimalni afinitet i kooperativnost. Pored toga, druga razlika je zna ajna divergencijau specifi nosti za supstrate koja se mnogo više ispoljava u in vivo uslovima.

Sve poznate PKGs su gradjene od N-terminalnog, regulatornog i kataliti kog domena. N-terminalni domen sadrži pet regulatornih mesta: (1) mesto za dimerizaciju subjedinica koje sesastoji od -heliksa sa konzervisanim leucin/izoleucin ponovicma; (2) autoinhibirotno mestouklju eno u inhibiciju kataliti kog domena u odsustvu cGMP-a; (3) autofosforilacijsko mestokoje u prisustvu cGMP-a može da pove a bazalnu kataliti ku aktivnost i afinitet PKGs za cAMP;

172

(4) mesto za regulaciju afiniteta i kooperativnog ponašanja mesta koja vezuju cGMP; (5) mestoza intracelularnu lokalizaciju koje determiniše interakciju enzima sa specifi nim subcelularnimstrukturama. Regulatorni domen sadrži vezna mesta za cikli ne nukleotide (konvencionalnoozna en kao „A“ i „B“) koja dozvoljavaju potpunu aktivaciju enzima nakon specifi nog vezivanjadve molekule cGMP-a. I na kraju, kataliti ki domen, lociran na C-terminalnom kraju PKGs,sadrži vezna mesta za Mg2+-ATP i ciljni protein.

PKGs fosforilišu veliki broj raznovrsnih proteina u in vitro uslovima, ali u in vivo uslovimaje demonstrirano svega nekoliko. Ovo veliko odstupanje može biti objašnjeno injenicom, da poredsekvence za prepoznavanje na supstratu, u fiziološkim uslovima specifi nost supstrata premaPKG je diktirana i intracelularnom kompartmanskom organizacijom i lokalizacijom. Ovo rezultiraformiranjem unikatnih makomolekulskih agregata koji sadrže enzim-ciljni protein kompleks.Trenutna radna hipoteza sugeriše da PKG I deluje kao solubilni intracelularni modulatorkoncentracije intraceluranog Ca2+, dok PKG II reguliše fluidnu homeostazu na elijskojmembrani. Biološki supstrati za PKG I mogu biti konceptualno podeljeni na tri glavne grupe:“klasi ni“, “novi“ i “hipoteti ki“ ciljni proteini. „Klasi ni“ ciljni proteini se jasno prepoznaju kaosupstrati i u in vitro i/ili u in vivo uslovima su fosforilisani sa PKG I i imaju dobro poznate iprou ene funkcije. Ova grupa uklju uje: IP3 receptor i fosfolamban koji su uklju eni u regulacijufunkcije glatke muskulature; vimentin koji je uklju en u aktivaciju neutrofila; G supstrati koji susnažno ekspresovani u Purkinje-ovim elijama gde deluju kao fosfatazni inhibitori; tromboksanA2 receptor ija je aktivacija inhibisana preko PKG-posredovane fosforilacije u trombocitima.„Novi“ ciljni proteini su PKG I supstrati koji su ili skoro opisani ili su podaci vezani zanjjihovu fosforiaciju sa PKG I konfliktni i opre ni. U ovu grupu spadaju L-tip Ca2+ kanala iCa2+-aktivirani K+ kanal koji nakon fosforilacije imaju u eš a u regulaciji tonusa glatkih miši avaskularnih sudova, kao i kontraktilnosti srca; Ca2+-zavisna citosolna fosforilacija fosfolipaze A2uklju ene u relaksaciju tonusa vaskularne glatke muskulature; tirozin hidroksilaza ija seaktivnost pove ava nakon fosforilaicje; miozin-vezuju a subjedinica fosfataze lakih lanaca miozinakoja posreduje u relaksaciji elija glatke muskulature i vazodilataciji. Ve ina, ako ne i svipomenuti supstrati se fosforilišu subtipom I PKG I. „Hipopteti ki“ ciljni proteini su mogu ikandidati za fosforilaciju sa PKG I , ali njihova fosforilacije nije demonstrirana. U ovu grupuspadaju mogu i supstrati predloženi na osnovu eksperimentalne demonstracije cGMP-PKGposredovanih procesa, kao što su na primer, proteini citoskeleta i kontraktilni proteini (npr. Lakilanac miozina, kalponin, dezmin, koneksini itd.). Pored navedenog, cGMP-PKG singnali put jeuklju en u kontrolu ekspresije gena razli itih promotor-odgovornih elementata (npr. engl.„serum-response element“, AP-1 binding site and cAMP-response element). Suprotno od PKG I,

173

jedini klasi ni supstrat koji se prepoznaje sa PKG II je CFTR (engl. Cystic FibrosisTransmembrane conductance Regulator) u elijama intestinalne mukoze.

cGMP i cAMP-zavisne protein kinaze (Protein kinaze A – PKAs)Zbog toga što PKAs sadrže specifi an nukleotid-vezuju i motiv sa zna ajnom homologijom saPKGs, one takodje mogu biti aktivirane sa cGMP-om, iako sa 50 puta manjom selektivnoš u negou slu aju kada su aktivirane cAMP-om. Iako su nukleotid-vezuju a mesta PKAs i PKGs homologa,ipak postoji razlika izumedju ovih mesta, posebno u supstituciji klju nih aminokiselina. Bezobzira što postoje mnogi kontraverzni podaci vezani za „corss-talk“ izmedju cGMP-PKGs i cAMP-PKAs signalnih puteva, interesantno je da su mnogi supstrati za PKGs i supstrati za PKAs. Poredtoga, pokazano je da cGMP deluje sli no kao i cAMP u posredovanju mnogih fizioloških odgovora(npr. PKG and PKA inhibišu IP3-zavisno otpuštanje Ca2+ i indukuju relaksaciju elija gastri nemukoze). Kod ki menjaka, cGMP i cAMP indukuju relaksaciju vaskularne muskulature, inhibišuaktivaciju trombocita i regulišu sekreciju hlorida i vode u intestinumu. Pored toga, cAMPunakrsno aktivira PKG u razli itim tkivima, a i cGMP unakrsno aktivira PKA. Funkcionalnakonvergencija izmedju cGMP-a i cAMP-a takodje može da se dešava na „down-stream“ nivoimasignalnih puteva, kao što je nivo proteina koji su ciljni za kinaze (PKAs i PKGs). Pored identi nostisupstrata koji se fosforilišu sa PKA i PKG, postoji zna ajno preklapanje izmedju dva cikli nanukleotida u njihovoj sposobnosti da regulišu vazodilataciju cerebralnih arterija. PKA i PKG moguda deluju u kooperatvinom maniru u smislu da je fosforilacijska aktivnost jedne kinazeneophodna za potpuni efekat druge kinaze. Na primer, overekspresija NOS prouzrokuje pove anjenivoa NO koji preko cGMP-PKG unakrsno fosforiliše PKA. Iako in vitro istraživanja sugerišu dacGMP može da transdukuje signal preko PKA i in vivo, neki drugi podaci to ne podržavaju, zbogtoga što ne stimulisane elije ispoljavaju visoki stepen subcelularne lokalizacije koji „primorava“sekundarne glasnike, enzime i njihove supstrate da formiraju „radne jedinice“ i predstavljajuprepreku za kross-aktivaciju. Pored toga, i PKA i PKG molekuli moraju biti „usidreni“ (engl.anchor) za specifi ne intracelularne proteine kako bi ove kinaze ispoljavale svoju funkciju. Svezajedno, istraživanja sugerišu da, u in vivo uslovima, cGMP i cAMP signalne kaskade aktivirajurazli ite i veoma važne fiziološke funkcije i to uglavnom nezavisno, a da ni cGMP-zavisnaaktivacija PKA, niti cAMP-zavisna aktivacija PKG ne može kompletno kompenzovati gubitakdrugog nukleotida.

174

Slika 4.33. Neke protein kinaze.Veli ina i lokacija kataliti kih domena (tamno obojeni) protein kinaza nije prikazana. U svakom slu aju, kataliti ki domen svake protein kinaze je dug oko 250aminokiselina, a ovi domeni medjusobno imaju veoma sli nu aminokiselinsku sekvencu, što ukazuje da su evoluirali od istog preda kog proteina tj. primordijalnekinaze. Uo titi da su sve prikazane tirozin kinaze vezane za plazma membranu (JAKs su vezane preko svoje asocijacije za citokinske receptore) dok je ve inaserin/treonik kinaza u citosolu. (Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.

4.7.4.3. cGMP i jonski kanali regulisani cikli nim nukleotidimaCNG kanali su familija voltažno-zavisnih katjonskih kanala ekspresovanih u razli itim elijama.Karakteristike CNG kanala su: (1) prisustvo transmembranskog segmenta (S1-S6); (2) jon-provodna pora izmedju S5 i S6 segmenta; (3) dva interaktivna regulatorna domena na

175

citoplazmati noj strani membrane, predstavljena i sa N-terminusom i sa C-terminusom kanala.Pored toga, CNG kanali koji odgovaraju na specifi ne nukleotide imaju i nukleotid-vezuju i domenna C-terminalnom kraju koji je homolog sa nukleotid-vezuju im domenom nukleotid-zavisnihprotein kinaza. Selektivna senzitivnost CNG kanala prema cikli nim nukleotidima je vezana zaspecifi nost u gradji C-terminusa, kao i kod PKAs i PKGs, te prema tome, iako je aktivacija svihCNG kanala regulisana i sa cGMP i sa cAMP, odredjeni izotipovi su više senzitivni na cGMP negona cAMP, i obrnuto. Pored toga, jedna specifi na subfamilija CNG kanala, koji se zovuhiperpolarizacijom-aktivirani cikli nim nukleotidima-regulisani kanali (engl. Hyperpolarization-activated Cyclc Nucleotide-gated – HCN channels) je senzitivna na cikli ne nukleotide. Ovi kanalisu ekspresovani u mozgu i srcu, a aktivnost im je modulisana i direktnim vezivanjemnukleotida i hiperpolarizacijom plazma membrane. HCN kanali poseduju unikatnestrukturalne karakteristike u regionu njihove pore, kao i u regionu S4 transmembranskogsegmenta koji ispoljava selektivnu jonsku propustljivost i unikatnu voltažnu senzitivnost.

Glavne familije CNG kanala regulišu influks Na+ i Ca2+ u elijama i gradjeni su odtetramernih proteina koji se direktno „otvaraju“ vezivanjem cikli nih nukleotida. Suprotno HCNkanalima, CNG proteini ispoljavaju veoma slabu senzitivnost prema voltaži i gradjeni su odheterotetramernog sklopa i subjedinica. Jedino subjedinica formira funkcionalni monomernikanal ukoliko je ekspresovana u heterologom sistemu. Klonirane su tri subjedinice (CNG1,CNG2, CNG3) koje ispoljavaju visoku homologiju. Ovi CNG kanali su inicijalno klonirani iz trirazli ita tipa neurona (engl. rode, cone and olfactory), pa se nekada tako i zovu, ali se ekspresuju iu pankreasu, slezini, testisu, ovarijumu, bubregu, plu ima, mozgu, srcu, adrenalnim železdama iintestinumu.

4.7.4.4. cGMP-reguliše fosfodiesteraze, a fosfodiesteraze razgradjuju cGMPKarakterizacijom biohemijskih, farmakoloških i strukturalnih profila, identifikovano je bar 10razli itih genskih familija za PDEs kod sisara. Svaki lan ima konzervisani kataliti ki domenod oko 270 aminokiselina na C-terminusu. Ovaj domen cepa fosfodiestarsku vezu, te takohidrolizuje 3', 5' – cikli ne nukleotide do njihovih odgovoraju ih nukleotida, 5' monofosfata. SvePDEs imaju heterologni regulatorni domen i funkcionišu kao dimeri, iako je funkcionalnazna ajnost ove dimerizacije još uvek nedefinisana.

Familije PDEs koje su ozna ene kao 1, 2, 3 i 10 hidrolizuju i cAMP i cGMP; familje PDEs4, 7 i 8 cepaju prvenstveno cAMP; familije PDEs 5, 6 i 9 specifi no hidrolizuju cGMP.Aktivnost PDEs je neophodna za elijski signaling jer metabolizam cikli nih nukleotida modulišenjihove intracelularne koncentracije i uti e na posledi ni fiziološki odgovor i ponašanje elije.

176

PDEs regulišu funkcije srca, adrenalnu steroidogenezu, erektilni odgovor mužjaka,fototransduciju, itd. Specifi na ciljna mesta „za usidravanje“ mogu da lokalizuju enzim u blizinuizabranog proteina, te se tako moduliše nivo cikli nih nukleotida u specifi nim sub elijskimkompartmentima.

cGMP reguliše PDEs preko tri razli ita mehanizma: (1) pove anjem aktivnosti prekogrupnog delovanja na PDE5, PDE6 i PDE9; (2) menja brzinu hidrolize cAMP-a preko kompeticijeza kataliti ko mesto (PDE1, PDE2 i PDE3); (3) reguliše aktivnost enzima direktnim vezivanjem zaspecifi na alosterna mesta (PDE2, PDE5 PDE6 i PDE10). Pored toga, smatra se da preko cGMP-PKG-posredovane fosforilacije neke PDEs mogu biti aktivirane, dok neke mogu biti inhibisane.

PDE5 je homodimer koji specifi no hidrolizuje i degradira cGMP. Direktno vezivanje cGMP-a za alosterno vezno mesto favorizuje fosforilaciju PDE5 ili sa PKG ili sa PKA, te na taj na inindirektno stimuliše enzimsku aktivnost. Sugerisano je da vezivanje cGMP direktno aktivira PDE5ali ovaj efekat nije demonstriran u in vivo sistemu. Pokazano je da je PDE6 u specifi nimfotoreceptorima („rod“ PDE6-A i PDE6-B, i „cone“ PDE6-C) gradjena od dve velike kataliti kiaktivne subjedinice ( , u „rods“ i u „cones“) koje su asocirane sa razli itim manjih inhibitornim subjedinicama i subjedinicama. Veruje se da vezivanje cGMP za alsoterno mesto PDE6 reguliše

interakciju izmedju kataliti kih subjedinica, inhibitornih subjedinica i transducin, veoma važankorak u fototransdukciji.

4.7.4.5. cGMP i elijska fiziologijaKao što je napomenuto, veoma veliki broj fizioloških odgovora elije je posredovan preko cGMP. Udaljem tekstu e biti veoma kratko prikazani samo najmarkantniji fiziološki odgovori koji seaktiviraju cGMP-signalnim putem, uklju uju i regulaciju motiliteta elija glatkih miši a krvnihsudova i intestinuma, regulaciju homeostaze intestinalnog fluida i elektrolita, kao ifototransdukciju.

cGMP u estvuje u regulaciji motiliteta elija glatkih miši a zidova krvnih sudova iintestinuma. Mehanizam koji karakteriše kontrakciju glatke muskulature je baziran nasinegisti kim i antagonisti kim silama/snagama koje regulišu intracelularnu koncentraciju Ca2+

[Ca2+]i. Kontraktilne snage prouzrokuju pove anje koncentracije intracelularnog Ca2+ i/ilipove avaju senzitivnost intracelularne sredine za Ca2+. Sprotno tome, dilatiraju e snage redukujuintracelularnu koncentraciju Ca2+ i/ili desenzitiziraju intracelularnu sredinu za Ca2+. Efekat ovadva suprotna procesa je fosforilacija lakog lanaca miozina od 20 kDa (engl. Miosine Light Chain20 kDa – MLC20) na serinu 19 preko kinaze lakog lanca miozina, što dovodi do vazokonstrikcije.

177

Suprotno, defosforilacije MLC20 od strane fosfataze lakog lanca miozina produkujevazorelaksaciju.

Egzogeni i endogeni signalni molekuli (npr. nitro-vazodilatatori, endotelijalijumom-obezbedjeni faktor relaksacije i nateiureti ni peptidi) prouzrokuju vazodilataciju preko pove anjakoncentracije intracelularnog cGMP-a.

Slika 4.34. Molekularni mehanizmi koji omogu avaju relaksaciju vaskularne glatke muskulature posredovanu preko cGMP.cGMP prouzrokuje relaksaciju glatke muskulature kontrolom intracelularne koncentracije Ca2+ [Ca2+]i, i to redukcijom [Ca2+]i i desenzitivizacijom kontraktilnog aparataprema Ca2+. cGMP redukuje [Ca2+]i preko nekoliko mehanizama: Inhibicijom influksa Ca2+ preko L-tipa Ca2+ kanala (1), ili pove anjem efluksa Ca2+ (2) preko aktivacijeATPaze koja pumpa Ca2+ (2d) ili preko Na+/Ca2+ izmenjiva a (2b). Pored toga, cGMP može da pove ava efluks Ca2+ stimulacijom hiperpolarizacije membrane prekoaktivacije Na+/K+ ATPase (2c) i K+ kanala (2a), te na taj na in pove ava izlazak Ca2+ preko Na+/Ca2+ izmenjiva a. Takodje, cGMP pove ava odvajanje Ca2+ prekoaktivacije ATPaze sarkoplazmati nog retikuluma koja pumpa Ca2+ (3; Ph-fosfolamban). cGMP smanjuje mobilizaciju Ca2+ preko inhibicije agonistima-indukovanogformiranja IP3 ili preko inhibicije IP3 receptora na sarkoplazmati nom retikulumu(4; R-receptor, G-G protein, PLC – fosfolipaza C, IP3R – IP3 receptor). cGMPdesenzitiviše kontraktilni aparat za Ca2+ (5) verovatno aktivacijom fosfataze lakog lanca miozina, što rezultira defosforilacijom lakog lanca miozina od 20 kDa .

178

cGMP, kao sekundarni glasnik aktivira dalje signal-transdukcione proteine, što kulminirarelaksacijom elija glatke muskulature i to na dva na ina: i preko desenzitizacijekontraktilnog aparata prema Ca2+ i smanjenjem intracelularne koncentracije Ca2+. Ove efektecGMP ostvaruje preko nekoliko molekularnih mehanizama (Slika 4.34.). cGMP-indukovanaredukcija [Ca2+]i se ostvaruje inhibicijom influksa Ca2+ preko L-tipa Ca2+ kanala (1), ili pove anjemefluksa Ca2+ (2) preko aktivacije ATPaze koja pumpa Ca2+ (2d) ili preko Na+/Ca2+ izmenjiva a (2b).Pored toga, cGMP može da pove ava efluks Ca2+ stimulacijom hiperpolarizaciju membrane prekoaktivacije Na+/K+ ATPase (2c) i K+ kanala (2a), te na taj na in pove ava izlazak Ca2+ prekoNa+/Ca2+ izmenjiva a. Takodje, cGMP pove ava odvajanje Ca2+ preko aktivacije ATPazesarkoplazmati nog retikuluma koja pumpa Ca2+ (3; Ph-fosfolamban). cGMP smanjuje mobilizacijuCa2+ preko inhibicije agonistima-indukovanog formiranja IP3 ili preko inhibicije IP3 receptora nasarkoplazmati nom retikulumu(4; R-receptor, G-G protein, PLC – fosfolipaza C, IP3R – IP3

receptor). cGMP desenzitiviše kontraktilni aparat za Ca2+ (5) verovatno aktivacijom fosfataze lakoglanca miozina, što rezultira defosforilacijom lakog lanca miozina od 20 kDa (MLC20). Prema tome,cGMP ima veoma važnu, ali i kompleksnu ulogu u relaksaciji glatke muskulature koju ispoljavapreko kontrole intracelularne koncentracije Ca2+ (Slika 4.34.). Pored toga, smatra se da u in vivouslovima razli iti mehanizmi deluju sinergisti ki u smislu smanjenja [Ca2+]i i indukcije vaskularnerelaksacije koriš enjem cGMP-a kao sekundarnog glasnika.

cGMP u estvuje u regulaciji homeostaze intestinalnog fluida i elektrolita.Termostabilni bakterijski endotoksin, ST, indukuje skretornu diareju preko aktivacije guanililciklaze i pove avanja intracelularne koncentracije cGMP-a (Slika 4.35.). Ciljni proteini u eliji zaovaj patofiziološki efekat su epitelijalne elije koje oblažu i ograni avaju intestinum jer je jedino unjima detektovan receptor za ST a to je mGC-C. Poreme ajem ekspresije gena koji kodira ovajreceptor rezultira rezistencijom prema ST-indukovanoj diareji, što demonstrira da je mGC-Capsolutno neophodna za ST-indukovanu intestinalnu sekreciju. Pokazano je da, vezivanje ST zamGC-C simuliše intestinalnu sekreciju preko pove anja intracelularne koncentracije cGMP-a.cGMP aktivira CFTR (engl. Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) i favorizujeefluks hlorida što prvenstveno tera i transport vode u lumen intestinuma. Smatra se da je PKGglavni molekularni target cGMP-a u nizu transdukcije signala i aktivacije CFTR. Pored PKG II, idrugi mehanizmi posrduju cGMP-zavisnu aktivaciju CFTR. cGMP može direktno da aktivira PKA ida stimuliše CFTR-posredovani hloridni efluks u humanim elijama kolona koje ne ekspresujuPKG II (Slika 4.35.). Bakterije, kao što je E.coli imaju plazmide koji kodiraju familiju homologihpeptida tj. termostabilnih endotoksina, STs, i mogu da naseljavaju intestinum nakonkonzumiranja hrane i/ili vode koja je kontaminirana ovom bakterijom. Naseljene bakterije

179

produkuju ST u lumen intestinuma, a ST specifi no prepoznaje i vezuje se za mGC-Cekspresovanoj na membrani epitelijalnih elija koje grade ivice etkastog pokrova elijaintestinalne mukoze. ST-indukovana aktivacija mGC-C rezultira pove anjem intracelularne

koncentracije cGMP-a i posledi nomaktivacijom PKG II koja je takodjelokalizovana na membrani ivi nihepitelijalnih elija etkastog pokrovamukoznih intestinalnih elija (Slika 4.35.).

Slika 4.35. Regulacija intestinalne sekrecije posredstvomST-indukovane aktivacije mGC-C i pove anjaintracelularnog nivoa cGMP-a.Bakterije, kao što je E.coli imaju plazmide koji kodiraju familijuhomologih peptida tj. termostabilnih endotoksina, STs, i mogu danaseljavaju intestinum nakon konzumiranja hrane i/ili vode koja jekontaminirana ovom bakterijom. Naseljene bakterije produkuju ST ulumen intestinuma, a ST specifi no prepoznaje i vezuje se za mGC-Cekspresovane na membrani epitelijalnih elija koje grade iviceetkastog pokrova elija intestinalne mukoze. ST-indukovana aktivacija

mGC-C rezultira pove anjem intracelularne koncentracije cGMP-a iposledi nom aktivacijom PKG II koja je takodje lokalizovana namembrani ivi nih epitelijalnih elija etkastog pokrova mukoznihintestinalnih elija. Pored toga, cGMP može da aktivira i PKA, ilidirektno, ili inhibicijom cAMP-specifi nih PDEs i indukuju i akumulacijucAMP. CFTR protein (hloridni kanal) koji je takodje kolokalizovan samGC-C i PKGII može biti fosforilisan i sa PKG i sa PKA. FosforilacijaCFTR kanala sa jednom od ove dve protein kinaze prouzrokujeperzistentno stanje otvorenog kanala, što dozvoljava hloridima da sekre u u smeru njihovog koncentracijskog gradijenta iz intracelularnog uekstracelularni kompartment, tj. da izlaze u lumen intestinuma. Drugijonski kanali i transporteri održavaju elektroneutralnost u eliji tokomST-indukovanog efluksa hlorida. Vektoralni protok vode odbazolatelarne do apikalne površine je navodjen ovom jonskomprovodljivoš u, što rezultira akumulacijom fluida i elektrolita uintestinalnom lumenu i prouzrokuje sekretornu diareju.

Pored toga, cGMP može da aktivira i PKA, ili direktno, ili inhibicijom cAMP-specifi nih PDEs iindukuju i akumulaciju cAMP. CFTR protein (hloridni kanal) koji je takodje kolokalizovan samGC-C i PKGII može biti fosforilisan i sa PKG i sa PKA. Fosforilacija CFTR kanala sa jednom odove dve protein kinaze prouzrokuje perzistentno stanje otvorenog kanala, što dozvoljavahloridima da se kre u u smeru njihovog koncentracijskog gradijenta iz intracelularnog uekstracelularni kompartment, tj. da izlaze u lumen intestinuma. Drugi jonski kanali i transporteriodržavaju elektroneutralnost u eliji tokom ST-indukovanog efluksa hlorida (Slika 4.35.).Vektoralni protok vode od bazolatelarne do apikalne površine je navodjen ovom jonskomprovodljivoš u, što rezultira akumulacijom fluida i elektrolita u intestinalnom lumenu i

180

prouzrokuje sekretornu diareju. Iako postoje dokazi o uklju enosti cGMP u regulaciji intestinalnihfluida i homeostaze elektrolita, fiziološka zna ajnost ovih mehanizama nije sasvim jasna, aliprisustvo mGC-C u intestinumu reptila i ptica sugeriše jasnu evolutivnu konzerviranost oveizoforme guanilil ciklaze. Pored toga, miševi kod kojih je poreme ena ekspresija gena ili za mGC-Cili za njen „down-stream“ ciljni protein, PKG II, ne ispoljavaju abnormalnosti u razvojuintestinalnog trakta, izuzev izostanka odgovora na guanilin/uroguanilil/ST.

cGMP u estvuje u fototransdukciji. Fototransdukcija na spoljašnjem segmentu retinepredstavlja živi primer važnosti i neophodnosti cGMP u fiziološkim procesima. I ne samo to, cGMPreguliše i fazu obnavljanja vizuelne ekscitacije, kao i adaptaciju na svetlost podloge. Oba tipafotoreceptora (rod i cone) sadrže unikatne proteine koji deluju kooperativno u kontroliintracelularnih koncentracija klju nih sekundarnih glasnika cGMP i Ca2+ ([cGMP]i i[Ca2+]i). Ovopotom reguliše sve mehanizme kojima se omogu uje i obezbedjuje fototransdukcije i determinišefiziološki odgovor na svetlo.

Slika 4.36. Uloga cGMP-a u fototransdukciji kod ki menjaka.

181

Molekularne komponenete sisarske fototransdukcione mašinerije se kombinuju da bi kreiralekompleksnu kaskadu u kojoj cGMP i Ca2+ veoma striktno interaguju da bi konvertovalieksternalnu energiju (svetlost u formi fotona) u internalni signal (elektri ne impulse). Prema tome,tokom mraka, visoki nivo cGMP osigurava [Ca2+]i od oko 500 nM i održava spoljašni segmentrod-receptora u depolarizovanom stanju. U ovakvim uslovima kompleks PDE6 je veoma slaboaktivan, CNG1 kanal je otvoren, a aktivnost plazma membranskog Na+/Ca2+K+-izmenjiva alimitira pove anje [Ca2+]i. Svetlo pokre e sekvencijalnu aktivaciju rodopsina, transducina ikompleksa PDE6, što dovodi do hidrolize cGMP-a. Posledi no smanjenje intracelularnekoncentracije cGMP-a prouzrokuje zatvaranje CNG1 kanala i remeti struju Ca2+. Na taj na in sesmanjuje [Ca2+]i na oko 50 nM (što je 10 puta manje nego u mraku) i prouzrokujehiperpolarizacija membrane fotoreceptora. Svetlom-indukovano smanjenje [Ca2+]i se registruje iose a preko Ca2+-vezuju ih proteina koji nakon vezivanja Ca2+ inhibišu aktivaciju rodopsina istimulišu guanilil ciklze, pa prema tome pove avaju koncentraciju intracelularnog cGMP-aposreduju i oporavak od fotoekscitacije.

Tokom zadnje dekade, sa ekspanzijom molekularnnih tehnika kloniranja, znanje o familiji guanililciklaza i njihovim ulogama u fiziološkim i patofiziološkim procesima se dramati no proširilo. Ipak,postoji veliki broj zna ajnih pitanja i zanimljivih izazova za budu a istraživanja, kao što suprecizni molekularni mehanizmi koji regulišu protok informacija izmedju razli itih domenaguanilil ciklaze u posredovanju receptor-efektor komunikacije. Pored toga, veoma je važnodefinisati elijske komponente, signal-transdukcione proteine koji regulišu aktivnost guanililciklaze, kao što su kinaze i fosfataze. Takodje, posebnu pažnju zaslužuje odnos izmedju aktivnostiguanilil ciklaze i elijskog metabolizma, posebno zbog toga što su mGCs tesno regulisne sa ATP, teporeme aj intracelularne koncentracije ove molekule može imati snažne posledice na mGC-posredovani signaling. Pored toga, neophodno je ispitati integraciju guanilil ciklaza u generalnimehanizam elijske transdukcije signala, kao i cross-talk izmedju izmedju elementa GC-cGMP-signalinga i drugih signalnih kaskada, kao što je na primer cAMP-PKA signalni put (Slika 4.37.).Na kraju, identifikacija i karakterizacija novih “down-stream” receptora za cGMP e daljedefinisati ulogu ovih važnih signal-transdukcionih mehanizama u elijskoj fiziologiji.

182

Slika 4.37. Šematski prikaz signalnihputeva aktiviranih cikli nim nukleotidima.CNG (cyclic nucleotide-gated channels); GEF(guanine nucleotide exchange factors); GPCR(G protein-coupled receptors); HCN(hyperpolarization-activated nonselectivecation channels); LPS+IFN (lipopolysacharide+interferon); NOS (nitric oxide synthase); PDE(phosphodiesterase); PKA (protein kinase A;C and R, catalytic and regulatory units); PKG(protein kinase G); Xn (PKA phosphorylatedproteins, including L-type voltage-gated Ca2+

channels, ryanodine and InsP3 receptors,troponin, and CREB proteins); Yn (PKGphosphorylated proteins, including InsP3receptors, Ca2+-activated K+ channels andCREB proteins).

183

4.8. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO RECEPTORA TIROZIN FOSFATAZA

Kao što je ve spomenuto, samo mali broj serin/treonin fosfataza je odgovoran za uklanjanjefosfatne grupe sa fosforilisanih serinskih i treoninskih ostataka na proteinu. Nasuprot njima,humani genom kodira oko 30 razli itih tirozin fosfataza (PTPs, engl. protein tyrosinephosphatases). Kao i tirozin kinaze, tirozin fosfataze su u eliji zastupljene kao citoplazmati ne itransmembranske forme. Za protein fosfataze je karakteristi no da imaju veliku specifi nost zasvoje substrate, tj. da uklanjaju fosfatne grupe samo sa odredjenih fosfotirozinskih ostataka izfosforilisanog proteina. Takodje, ove fosfataze omogu avaju kratak život fosforilacije tirozina, takoda je nivo fosforilisanih tirozinskih ostataka u sastavu proteina elije nizak. Funkcija tirozinfosfataza je regulisana, tako da se one aktiviraju samo u odgovaraju im fazama aktivacijesignalnog puta.

Dve citoplazmati ne tirozin fosfataze ki menjaka imaju SH2 domene, pa se zato zovu SHP-1 iSHP-2. SHP-1 je uklju ena u prekidanje odgovorana citokine, tako što defosforiliše aktivirane Jakproteine19. Kod miševa koji nemaju gen za SHP-1,postoji nepravilnost u razvoju skoro svih krvnihelija, što ukazuje na zna aj SHP-1 u hematopoezi.

Obe kinaze, SHP-1 i SHP-2, su uklju ene i uprekidanje odgovora nekih RTKs.

Slika 4.38. Neki predstavnici protein tirozin fosfataza.Citoplazmati ne tirozin fosfataze SHP-1 i SHP-2 imaju sli ne strukture sa dvaSH2 domena. Tri transmembranske tirozin fosfataze imaju dva intracelularnafosfatazna domena (domen bliži membrani obezbedjuje ve u / svu kataliti kuaktivnost). DPTP je protein Drosophile; ostali su proteini sisara.

elije sisara poseduju veliki broj transmembranskihprotein fosfataza, uglavnom nepoznate funkcije. Za neke se pretpostavlja da imaju funkcijureceptora, pa se prema tome ozna avaju kao receptoru-sli ne tirozin fosfataze. Svi ovi molekuliimaju jedan transmembranski segment i obi no poseduju dva tirozin fosfatazna domena nacitosolnoj strani plazma membrane. Primer ovakvog molekula je CD45 protein, koji se ekspresuje

19 Mutirani receptor za eritropoetin ne može da regrutuje SHP-1, tako da JAK2 ostaje duže aktivna.

184

na površini svih leukocita. Iako ligand za ovaj “receptor” još uvek nije identifikovan, smatra se daCD45 protein ima ulogu u regulaciji aktivacije T i B limfocita, stranim antigenima. Uloga CD45proteina u signalnoj transdukciji, je analizirana na transfekovanim elijama, koje su ekspresovalerekombinantni hibridni protein, koji se sastojao od ekstracelularnog EGF-vezuju eg domena iintracelularnog CD45 tirozin fosfataznog domena. Rezultati su, neo ekivano, pokazali da vezivanjeEGF za hibridni receptor inaktiviše tirozin fosfataznu aktivnost molekula. Ovakvi rezultati suukazali na mogu nost medjusobne saradnje, receptor tirozin kinaze i receptor tirozin fosfataze,prilikom vezivanja svojih ekstracelularnih liganada. U svakom slu aju, aktivnost CD45 proteinaneophodna je za aktivaciju limfocita, a zna aj ligandom izazvane inhibicije aktivnosti CD45proteina još uvek nije jasan.

Neke receptoru-sli ne tirozin fosfataze, pokazuju osobine adhezivnih proteina i mogu imati uloguformiranju medju elijskih kontakata. Na primer, mogu imati zna ajnu ulogu u “navodjenju”aksona nervnih elija u toku razvoja nervnog sistema. Geni koji kodiraju neke receptoru-sli netirozin fosfataze su dobro ekspresovani u nervnom sistemu Drosophile. Ukoliko dodje do ošte enjaili mutacije nekog od ovih gena, aksoni neurona u razvoju ne e uspeti da pronadju ciljnu eliju sakojom bi trebalo da grade sinapsu.

Transmembranske tirozin kinaze mogu da funkcionišu i kao ligandi koji e aktivirati receptore nasusednim elijama. Primer za to je protein tirozin fosfataza / , koja se ekspresuje na površiniglijalnih elija u nervnom sistemu sisara. Protein tirozin fosfataza / , se vezuje za receptorneproteine tzv. kontaktine na membrani neurona u razvoju, i stimuliše eliju da formira duga keprodužetke. Postoji mogu nost da protein fosfataze, interakcijom sa neuronima, prenose i signalena glijalne elije, medjutim, ovakav bidirekcioni prenos signala još nije definitivno potvrdjen. Nakraju, u nekim slu ajevima, protein fosfataze su potrebne da bi poništile delovanje tirozinfosfataza, što je neophodno za normalan rast i navodjenje aksona ka ciljnoj eliji.

185

4.9. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO TCR KOMPLEKSA

Za limfocite, jedine elije sposobne da specifi no prepoznaju antigen (nosioci imunog odgovora), jekarakteristi no da na svojoj membrani ekspresuju receptore visoke specifi nosti za odredjeniantigen. To su tzv. receptori za antigen na T elijama tzv. TCR (engl. T cell antigen receptor) i naB limfocitima tzv. BCR (engl. B cell antigen receptor), koji je u stvari antitelo vezano zamembranu B limfocita. Preko receptora za antigene se prepoznaju strani antigeni koji su prodrli uorganizam, a njihova aktivacija obezbedjuje specifi nost imunog odgovora. Sa druge strane,vezivanje antigena za ove receptore, zajedno sa signalima koji poti u od mikroorganizama iliprodukata aktivacije mehanizama nespecifi ne imunosti, dovode do aktivacije imunog odgovora tj.pokre u proliferaciju i diferencijaciju specifi nih limfocita. U daljem tekstu e biti opisan prenossignala nastao vezivanjem antigena za TCR i aktivacija signalnih molekula koje pomažu, receptoruza antigen u aktivaciji T limfocita. Signalna transdukcija koja poti e od BCR-a je vrlo sli na onojkoja se aktivira vezivanjem antigena za TCR.

TCR, može da prepozna samo proteinske antigene koji su iskazani na površini drugih elija, takoda je za ispoljavanje njihove funkcije nužno da direktno reaguju sa drugim elijama npr. sainficiranim elijama doma ina, antigen-prezentuju im elijama, makrofagama i B limfocitima.Specijalizovani proteini, koji imaju ulogu u iskazivanju antigena T limfocitima, su produkti gena

glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC, engl.major histocompatibility complex). TCR prepoznajestrukturu antigeni nog peptida kao i odredjene ostatkeMHC molekula, na površini antigen-prezentuju ih ilidrugih elija doma ina.

Slika 4.39. TCR prepoznaje MHC+antigeni ni peptid

Biohemijski signal, koji se ostvaruje nakon prepoznavanja antigena od strane T limfocita, se neprenosi samim TCR nego su u taj proces uklju eni proteini koji su nekovalentno vezani zaantigenski receptor (CD i lanci) i predstavljaju TCR kompleks.

Za prepoznavanje antigena i prenos signala (signaling) su odgovorna dva seta molekula:visoko varjabilni TCR na T limfocitimasignalni proteini (CD i lanci)

186

T elije ekspresuju i druge membranske receptore koji ne prepoznaju antigene ali doprinoseodgovoru T elija na antigene (adhezione molekule koje stabilizuju vezivanje T elija, za elije kojeprezentuju antigen na svojoj membrani). To su pomo ne molekule.

4.9.1. Struktura TCR

TCR koji se ekspresuje na T limfocitima je heterodimer, uglavnom,sastavljen od dva transmembranska, polipeptidna lanca ( i ),kovalentno povezana disulfidnim vezama. i lanci se sastoje od N-terminalnog varijabilnog domena (V), konstantnog domena (C),hidrofobnog transmembranskog domena i kratkogcitoplazmati nog domena. V domeni i lanaca sadrže regionevisoke varijabilnosti (hipervarijabilne domene ili CDRs; engl.complementarity-determining regions).

Slika 4.40. TCR i pomo ne molekule.

Tri CDRs na lancu su rasporedjena pored tri sli na regiona na lancu tako da formiraju regionTCR-a koji specifi no prepoznaje antigen iskazan u kompleksu sa MHC molekulama. U ilanacu, CDR3 ima najve u varjabilnost i najviše doprinosi ukupnoj varjabilnosti TCR-a.

C domeni i lanaca sadrže regione koji imaju reziduecisteina koje doprinose medjusobnom disulfidnompovezivanju dva lanca. Transmembranski (hidrofobni)domen sadrži rezidue pozitivno naelektrisanihaminokiselina, kao što je lizin u lancu, i lizin i argininu lancu. Ove rezidue interaguju sa negativnimreziduama u transmembranskim regionima drugihpolipeptida koji formiraju TCR kompleks (CD i ). Obalanca, imaju kratke citoplazmati ne repove (5-12ostataka aminokiselina).

Slika 4.41. Struktura TCR

187

Citoplazmati ni regioni TCR-a su previše kratki da bi imali funkciju u transdukciji signala. Ovufunkciju vrše molekule koje su fizi ki povezane sa TCR-om i grade TCR kompleks.

4.9.2. CD3 i proteini

CD3 i proteini su nekovalentno povezani sa TCR heterodimerom. Kada TCR prepoznaantigen, ovi proteini prenose signal (ogovorni su za signalnu transdukciju) koji vodi ka aktivaciji Telija. CD3 molekula se sastoji iz 3 proteina: , i . TCR kompleks, takodje sadrži i disulfidno

povezan homodimer lanaca. CD3 i proteini su identi ni na svim T elijama, nezavisno odnjihove specifi nosti, što je vezano za njihovu funkciju prenosa signala, a ne prepoznavanjaantigena.

4.9.2.1. Struktura CD3 i proteina

Kao što je ve spomenuto CD3 proteini se sastoje od tri CD3 proteina to su , i lanci. N-termi-nalni ekstracelularni regioni ovih lanaca sadrže Ig-sli an domen – pripadaju Ig superfamiliji.Transmembranski domeni, sva tri CD3 lanca, sadrže negativno naelektrisani aspartat koji se vežeza pozitivno naelektrisane rezidue transmembranskog domena i lanaca TCR-a – održavakompleks intaktnim. Citoplazmati ni domeni , i lanaca (od 44-81 ostataka aminokiselina) sa-drže po jednu kopiju konzervisane sekvence važne za transmisiju signala “immunoreceptortyrosine-based activation motif” (ITAM). ITAM ima centralnu ulogu u signalingu preko TCRkompleksa. On je takodje, nadjen, na citoplazmati nim regionima drugih membranskih proteinalimfocita koji su uklju eni u proces transdukcije signala ( lanci TCR kompleksa, lanci Ig i

Ig membranskih Ig na B limfocitima, kao ikod nekoliko Fc receptora). lanci suizgradjeni od: kratkog ekstracelularnog re-giona (9 aminokiselinskih ostataka), trans-membranskog regiona koji sadrži negativanaspartat i duga kog citoplazmati nog repa(113 ostataka aminokiselina koje imaju 3ITAMa).

Slika 4.42. Komponente TCR kompleksa

188

Za ekspresiju TCR kompleksa potrebana je sinteza sve tri komponente.

Slika 4.43. Ekspresija TCR kompleksa.U nedostaku CD3 (u stvari bilo kojekomponente) ne e do i do formiranja TCRkompleksa, a svi proteini koji ga grade e bitidegradirani u eliji. Transfekovanje elija sagenom koji nedostaje (u ovom slu aju gen zaCD3 ) e dovesti do formiranja i ekspresije TCRkompleksa na elijskoj membrani.

4.9.2.2. Funkcije CD3 i proteinaCD3 i proteini povezuju prepoznavanje antigena i biohemijske dogadjaje koji dovode dofunkcionalne aktivacije T limfocita.Posle prepoznavanja antigena dolazi do fosforilacije tirozinske rezidue ITAMs u citoplazmati nomrepu CD3 i proteina. Fosfotirozin postaje vezno mesto za adapterne proteine i za tirozin kinazusa Src homologim 2 domenom (SH2), uklju uju i i ZAP-70 kinazu, koja se veže za lanac, kao iFyn kinazu koja se veže za CD3. Aktivacija ovih kinaza aktivira put signalne transdukcije kojivodi ka promenama ekspresije gena u T elijama.

4.9.3. CD4 i CD8 koreceptori uklju eni u aktivaciju T limfocita

CD4 i CD8 su proteini koji se vezuju za nepolimorfni region MHC molekule i uklju eni su uprenos signala tj. zajedno sa signalom TCR kompleksa iniciraju aktivaciju T elija.

4.9.3.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptoraCD4/CD8 su transmembranski glikoproteini, lanovi Ig superfamilije.CD4 se ekspresuje kao monomer, na površini perifernih T limfocita, kao i nekih drugih elija. Ima4 ekstracelularna Ig-sli na domena, hidrofobni transmembranski domen, i citoplazmati ni rep (38ostatka aminokiselina). Preko svoja dva N-terminalna Ig-sli na domena, veže se za MHC molekulklase II.

189

CD8 su disulfidno povezani heterodimeri, sastavljeni od CD8 i CD8 lanca. Oba lanca imajujedan ekstracelularan Ig-sli an domen, hidrofobni transmembranski region, i citoplazmati ni rep(25 aminokiselinskih ostataka). Ig domen CD8, se vezuje za nepolimorfni domen MHC molekulaklase I.

4.9.3.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptoraCD8 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase I. Ova klasa molekula se ekspresujena svim elijama koje imaju nukleus i uglavnom je vezana za iskazivanje intracelularnih antigena.CD4 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase II.

CD4/CD8 doprinose transdukciji signala nakon prepoznavanja antigena. Signalni put koji seaktivira vezivanjem za CD4/CD8 koreceptore uklju uje aktivaciju specifi ne familije Src kinazatzv. Lck (engl. leukocyte-specific protein tyrosine kinase) koja je nekovalentno vezana zacitoplazmati ni rep CD4 i CD8 koreceptora. Prenos signala je posredovan Lck kinazom. VezaCD4/CD8 i Lck je neophodna za maturaciju i aktivaciju T limfocita. Kada TCR prepozna antigen,

CD4/CD8 koreceptori se vežu za odgovaraju e MHCmolekule. Ovo vezivanje približava koreceptor i njegovuLck, do TCR kompleksa, a Lck fosforiliše tirozinske ostatkeITAM-a u CD3 i lancima i tako inicira aktivaciju T elija.Osim uloge u signalnoj transdukciji, CD4/CD8 koreceptori,pove avaju adheziju T limfocita za ciljnu eliju ( eliju kojaprezentuje antigen+MHC I/II).

4.9.4. Aktivacija TCR kompleksa

Cilj aktivacije kaskada signalnih reakcija u T elijama, je koordinisana aktivacija transkripcijegena u T limfocitima, a od ijih produkata zavisi odgovor i funkcije aktiviranih T elija. Signalniput koji se aktivira stimulacijom TCR kompleksa je najve im delom definisan in vitro analizama na

Slika 4.44. Lck signalni put u T limfocitima.Lck je tirozin kinaza (Src familija) povezana sacitoplazmaticnim repom CD4 i CD8. CD4/CD8 asociranaLck je neophodna za maturaciju i aktivaciju T elija.

190

razli itim populacijama T elija. Dobijeni rezultati su definisali osnovne karakteristike signalnetransdukcije u T elijama.

Multiplim vezivanjem za TCR i koreceptore, aktivira se signalni put TCR-a.Kao odgovor na prepoznavanje antigena dolazi do grupisanja membranskih receptora(engl. clustering), fosforilacije tirozinskih ostataka nekoliko proteina, i aktivacijeadapternih proteina.Signali TCR kompleksa, koordinativno aktiviraju nekoliko biohemijskih puteva:signalni put Ras-MAP kinasa, put protein kinaze C, i kalcijum-kalcineurin signalni put.Aktivacija ovih enzima se dešava vrlo brzo nakon stimulacije TCR-a (nekoliko minuta), aaktivacija svakog od ovih puteva indukuje transkripcione faktore koji stimu-lišu ekspresijurazli itih gena T elija.

U narednom tekstu e biti opisaniglavne etape u TCR signalnoj kaskadi.

Slika 4.45. Signalni putevi koji se aktivirajuaktivacijom TCR kompleksa

4.9.4.1. Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacijaprotein kinaza i adapternih proteina

Odmah nakon prepoznavanja antigena, na membrani T limfocita se pokre u procesi koji grupišumolekule koji u estvuju u signalnoj transdukciji.

191

Formiranje imunološke sinapseKada TCR kompleks prepozna kompleks antigen-MHC na membrani elija koje ga prezentuju,dolazi do brze mobilizacije membranskih proteina, i intracelularnih signalnih molekula, na mestokontakta antigen-prezentuju ih elija i T limfocita.

Region fizi kog kontakta izmedju T elija iantigen-prezentuju e elije se naziva imu-nološka sinapsa. Molekuli na membrani Telija se brzo mobilišu oko centra sinapse

koja uklju uje: TCR kompleks (TCR, CD3, lance), CD4 ili CD8 koreceptore, rece-

ptore za kostimulatore (kao što su CD28),kao i enzime i adapterne proteine koji supovezani sa citoplazmati nim repomtransmembranskih receptora. Integrini senalaze na periferiji sinapse, gde doprinosestabilizaciji kontakta izmedju T elije iAPC.

Slika 4.46. Fosforilacija tirozina u toku aktivacije T elija.Nakon prepoznavanja antigena, CD4-povezana Lck postajeaktivna i fosforiliše ITAM-e CD3 i lanaca. ZAP-70 se veže zafosfotirozine lanca i fosforiliše ih i aktivira. Aktivni ZAP-70fosforiliše tirozine u razli itim adaptornim molekulama kao što jeLAT (B). Adapterni protein postaje vezno mesto za elijskeenzime kao što je PLC 1 i proteine koji aktiviraju Ras i MAPkinaze (C), a ovi enzimi aktiviraju razli ite elijske odgovore

Mnoge sinapse se nalaze u regionima elijske membrane koji se razlikuju u lipidnom sastavu odostalih regiona membrane – mikrodomeni oboga eni glikolipidima. Prepoznavanje antigenastimuliše organizaciju membranskih molekula u sinapsu i angažovanje signalnih puteva kojiaktiviraju proteine citoskeleta.

192

Aktivacija tirozin kinaza.Odmah nakon organizacije membranskih molekula i formiranja sinapse dolazi do aktivacije tirozinkinaza20 povezanih sa citoplazmati nim domenima molekula CD3 i koreceptornih proteina, kao ifosforilacija tirozna u CD3 i lancima. Citoplazmati ni regioni CD3 i lanaca sadrže peptidnusekvencu tzv. ITAM (engl. immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) koja e bitifosforilisana Lck-om, kinazom koja pripada Src familiji tirozin kinaza, i koja je povezana sa C-terminalnim repom CD4/CD8 koreceptora21. Lck može biti aktivirana autofosforilacijom, a aktivnaLck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i lancima.

Još jedna kinaza je fizi ki povezana sa TCR kompleksom. To je Fyn, kinaza koja je povezana saCD3 proteinom i ima sli nu ulogu kao Lck.

Fosforilisani tirozin u okviru ITAM sekvence postaje vezno mesto (“docking site”) za tirozin kinazuZAP-70 (engl. -associated protein of 70-kD). ZAP-70 sadrži dva konzervisana regiona koja se vežuza fosfotirozine ITAM sekvenci lanaca. Vezani ZAP-70 postaje substrat za susednu Lck, kojafosforiliše tirozine ZAP-70. Jednom aktivirani ZAP-70, može da se autofosforiliše kao i dafosforiliše brojne signalne molekule. Kriti no mesto za aktivaciju “downstream” signalnihmolekula je aktivacija ZAP-70. Da bi se dostigao kriti an nivo angažovanja ZAP-70 molekulapotrebna je njegova multipla aktivacija i multipla fosforilacija ITAMs-a lanaca22.

Još jedna kinaza koja ima ulogu u aktivaciji T elija je PI-3 kinaza (engl. phosphatidylinositol-3),koja fosforiliše inozitol-lipide povezane sa membranom. Ovaj enzim se regrutuje aktivacijom TCR-a i adapternih proteina, a on generiše nastajanje nastajanje fosfatidilinozitol trifosfata (PIP3) odmembranskih bifosfata. PIP3 je vezno mesto za fosfolipazu C i Itk kinazu (engl. IL2-inducible T-cell kinase), kao i Btk u B limfocitima. PI-3 kinaza je uklju ena i u signaling koji poti e od CD28molekula.

Aktivnost kinaza u T elijama je kontrolisana delovanjem tirozin fosfataza. Tirozin fosfatazemogu da defosforilišu tirozinske ostatke, i na taj na in inhibišu ili stimulišu enzimsku aktivnost

20 Tirozin kinaze su enzimi koji katališu fosforilaciju ostatka tirozina u razli itim proteinskim supstratima.21 Kada se TCR veže za peptid-MHC kompleks, veza e se i CD4 ili CD8 koreceptori za nepolimorfne regione molekula klase II ili I vezivanje epribližiti citoplazmati ne repove CD4/CD8 koreceptora, ITAM regionima, CD3 i lanaca.22 Potreba da se jedna T elija veže za antigen više puta svaki in vezivanja dovodi do ponovne fosforilacije ITAM-a lanaca, što vodi kamultiplom angažovanju ZAP-70 molekula.

193

kinaza. TCR kompleks angažuje dva tipa fosfataza. To su SHP-1 i SHP-2, koje funkcionišu takošto inhibišu signalnu transdukciju uklanjanjem fosfatne grupe iz klju nih signalnih molekula.

Regrutovanje i aktivacija adapternih proteinaAktivirani ZAP-70 fosforiliše nekoliko adapternih proteina koji aktiviraju/vežu signalne molekule.Adapterni proteini23 vežu signalne molekule i organizuju ih u specifi ne elijske kompartmane(regione) i tako promovišu aktivaciju odredjenog signalnog puta. Za aktivaciju TCR signalnekaskade, neophodna je aktivacija ZAP-70 i fosforilacija LAT adapternog proteina (engl. linkeractivation of T cells). Fosforilisani tirozini LAT molekule su vezno mesto za SH2 domene drugihadapternih molekula i enzima uklju enih u nekoliko signalnih kaskada. Aktivirani LAT direktnovezuje fosfolipazu C 1 (klju ni enzim aktivacije T elija), i koordiniše regrutovanje nekoliko drugihadapternih proteina (SLP-76 kao i Grb-2) u imunološku sinapsu.

4.9.5. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima

Kao što je re eno, Ras je pripadnik familije guanozin nukleotid-vezuju ih proteina (mali Gproteini) koji su uklju eni u aktivaciju razli itih procesa u mnogim elijama. On je povezan saelijskom membranom preko kovalentno vezanih lipida. U neaktivnoj formi, vezno mesto Ras-a za

guanin nukleotide je okupirano guanozin-difosfatom (GDP). Kada se vezani GDP zameniguanozin-trifosfatom (GTP), Ras se konformaciono izmeni i može da regrutuje/aktivira razli iteenzime.

Kada ZAP-70 fosforiliše LAT, za LAT se vezuje Grb-2 (preko svog SH2 domena). Grb-2 angažujeRas GTP/GDP faktor razmene, nazvan Sos, koji katališe zamenu GDP sa GTP molekulom i takonastaje forma Ras-a vezana sa GTP-om (Ras GTP). Ras GTP funkcioniše kao alosterni aktivatorenzima zvanih MAP kinaze (engl. mitogen activated protein). U T elijama postoje tri glavne MAPkinaze: ERK, JNK i p38.

Ras GTP stimuliše aktivaciju, MAP kinazne kaskade, koja uklju uje najmanje tri razli ite kinaze,a svaka od njih fosforiliše/aktivira slede u u kaskadi. Aktivacija, MAP kinazne kaskade dovodi do

23 Adapterni proteini sadrže strukturne motive/domene kojim se vezuju za druge proteine. Ovi motivi uklju uju motive koji vežu Src 2 i 3 domene(SH2 i SH3), fosfotirozin-vezuju e domene (PTB) i PH domene.

194

aktivacije ERK-a24 (engl. extracellular receptor-activated kinase) koji fosforiliše protein Elk, kojistimuliše Fos, komponentu neophodnu za aktivaciju transkripcionog faktora AP-1 (activationprotein-1).

Paralelno sa aktivaciom Ras-a, TCR-povezane kinaze takodje mogu da aktiviraju i drugi GTP/GDPizmenjiva ki protein, tzv. Vav, koji deluje na drugi “mali G protein” – Rac. Rac GTP iniciraaktivaciju enzimske kaskade, koja rezultuje aktivacijom MAP kinaze, zvane JNK (engl. c-Jun N-terminal kinase). Aktivirana JNK fosforiliše c-Jun, drugu komponentu neophodnu za aktivacijuAP-1 transkripcionog faktora.

Slika 4.47. Ras-MAP signalni put u aktivaciji T limfocita.ZAP-70 se aktivira prepoznavanjem antigena (videti sliku 4.8.) fosforiše adapterneproteine vezane za membranu, što onda dovodo do vezivanje drugog adaptera Grb-2.ZAP-70 fosforiliše Grb-2 prave i mesto za privla enje Sos faktora za GTP/GDPrazmenu. Sos konvertuje Ras GDP u Ras GTP (nije prikazan) koji aktivira kaskaduenzima, što kulminira aktivacijom MAP kinaze koja se zove ERK kinaza. ParalelanRac-zavistan put koji se naziva stresom-aktiviranog proteina (engl. Stress-ActivatedProtein - SAP), ili SAP-zavisni kinazni put generiše drugu aktivnu MAP kinazu koja sezove JNK kinaza (nije prikazano na slici).

Tre i pripadnik familije MAP kinaza, je p38. Ovakinaza se takodje aktivira Rac GTP sistemom, arezultat njenog angažovanja je aktivacija razli itihtranskripcionih faktora.

4.9.6. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovan signalni put u T limfocitima

TCR signalni put uklju uje i aktivaciju 1 izoforme fosfolipaze C (PLC 1), a produkti nastalihidroliti kim razlaganjem membranskih lipida aktiviraju transkripcione faktore u T elijama.PLC 1 je citosolni enzim specifi an za inozitol fosfolipide. Fosforilisani LAT, aktivira PLC 1, kojakatališe hidrolizu membranskih fosfolipida tj. PIP2. Nastali IP3 i DAG aktiviraju dva odvojenasignalna puta u T elijama.

24 ERK je sinonim za MAP kinazu. ERK (ili MAP kinaza), JNK, i p38 su kinaze, koje se ekspresuju u elijama eukariota, a pripadaju istojsuperfamiliji, superfamiliji MAP kinaza.

195

IP3 difunduje kroz citoplazmu doendoplazmatskog retikuluma, gde sevezuje za receptor i stimuliše oslo-badjanje Ca++ iz endoplazmatskogretikuluma, pove avaju i nivo slobo-dnog Ca++ u citoplazmi sa 100 nM do600 ili ak 1000 nM. Ca++ se vezuje zakalmodulin, a kompleks Ca++ - kalmo-dulin aktivira nekoliko enzima, uklju-uju i i serin/treonin fosfatazu –

kalcineurin.

Slika 4.48. Signaling u T limfocitima prekometabolizma membranskih inozitol fosfolipida.

DAG je hidrofobna molekula koja ostaje u elijskoj membrani, na mestu gde je formirana.Kombinacija povišenog nivoa intracelularnog Ca++ i DAG-a, aktivra PKC koja je povezana saelijskom membranom. Aktivirana PKC se konformaciono menja, tako da njeno katiliti ko mesto

postaje dostupno supstratu.

4.9.7. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitima

Enzimi angažovani TCR signalnom kaskadom, aktiviraju transkripcione faktore, koji sevezuju za regulatorne domene brojnih gena u T elijama, i aktiviraju njihovu transkripciju.Citoplazmati ni putevi signalne transdukcije vode ka aktivaciji efektornih enzima, kao što sukinaze ERK, JNK i PKC, kao i fosfataza kalcineurin. Ovi enzimi doprinose aktivacijitranskripcionih faktora kao što su NFAT, AP-1 i NF- B koji funkcionišu kao stimulatori ekspresijegena u antigen-stimulisanim T elijama.

NFAT (engl. nuclear factor of activated T cells) je transkripcioni faktor neophodan za ekspresijuIL-2, IL-4, TNF i drugih citokinskih gena. On je prisutan u inaktivnoj, serin-fosforilisanoj formi ucitoplazmi nestimulisanih T limfocita. NFAT se aktivira kalcijum-kalmodulin zavisnom fosfatazom,

196

kalcineurinom. Kalcineurin defosforiliše citoplazmatski NFAT, i na taj na in izaziva njegovutranslokaciju u nukleus.

AP-1 je transkripcioni faktor nadjen u mnogim tipovima elija. AP-1 je ime za familiju DNA-vezuju ih faktora izgradjenih od dimera dva proteina koja se medjusobno vežu preko zajedni kihstrukturnih motiva tzv. “leucine zipper”. AP-1 faktor, koji je najbolje opisan, se sastoji iz Fos i Junproteina.

NF- B su homodimerni ili heterodimerni proteini koji su homologi sa proto-onkogenimazna ajnim za transkripciju mnogih gena u razli itim tipovima elija. NF- B je prisutan ucitoplazmi u kompleksu sa proteinima – inhibitorima B (I B) koji spere avaju njegovutranslokaciju u nukleus. Signalne kaskade PKC, MAP kinaze, kao i porast intracelularnogkalcijuma stimulišu fosforilaciju I B kinaze koja fosforiliše I B. Za fosforilisanu formu I B sevezuju peptidi ubikvitina, koji je obeležavaju za proteoliti ku degradaciju u proteazomima. NastaliNF- B se translocira u nukleus, gde doprinosi aktivaciji citokinskih gena i gena za receptorecitokina.

Slika 4.49. Aktivacija transkripcionihfaktora u T elijama.Veliki broj signalnih puteva konvergira u antigenima-stumulisanim T elijama, u cilju aktivacije igenerisanja transkripcionih faktora koji stimulišuekpresiju razli itih gena (u ovom slu aju IL-2 gena).Kalcijum – kalmodulinom aktivirani NFAT, kao i Rasi Rac signalni putevi generišu dve komponenete AP-1. Manje se zna o vezi izmedju TCR signala iaktivacije NF-kB (NF-kB je prikazan kao kompleksod dve subjedinice koje su tipi no p50 i p65 proteininazvani prema njihovoj molekulskoj veli ini ukilodaltonima). PKC je važna u aktivaciji T elija, aPKC je posebno važna u aktivaciji NF-kB. Svi ovitranskripcioni faktori funkcionišu koordinativno uregulaciji genske ekspresije. Obratiti pažnju nainjenicu da je prikazano da razli iti signalni putevi

aktiviraju jedinstvene trankripcione faktore, alipostoji i razumljivo preklapanje pojedinih signalnihputeva, pa svaki signalni put može da igra ulogu uaktivaciji velikog broja transkripcionih faktora.

197

SIGNALING KOJI UKLJU UJE SIGNALOM

REGULISANU PROTEOLIZU 05Potreba za sinhronizovano koordinisanom intracelularnom transdukcijom signala nijenikada ve a nego tokom razvoja organizma. Svaka elija u embrionu treba da bude vodjenakroz razvojni put ili neki drugi put u zavisnosti od njenihovog porekla, pozicije i karkateranjihovih suseda. Na svakom koraku razvojnog puta, elije moraju da razmenjuju signalne sasvojim susedima da bi koordinisale svoje ponašanje prema njihovom. Ve ina signalnih puteva kojisu do sada opisani se široko koriste tokom razvojnog puta i svi oni su tzv. reverzibilni signalniputevi kod kojih je inaktivacija jednako važna kao i inicijalna aktivacija. Pored ovih, postoje idrugi signalni putevi koji razvode signale u unutrašnjosti elije i u estvuju u razvoju organizma ikoji su esencijalni signalni putevi, ali ireverzibilni jer se komponente signalnog putaproteoliti ki cepaju. Svi ovi signalni putevi su zavisni bar delom od regulisane proteolize.Iako su mnogi od njih otkriveni kroz geneti ke studije na Drosophili melanogaster, oni su visokoevolutivno konzervisani i koriste se opet i ponovo tokom animalnog razvoja.

U ovom poglavlju e biti opisana etiri signalna puta: (1) Signalni put koji zavisi od aktivacije NF-, regulatornog proteina latentnih gena i ija aktivacija dozvoljava elijama da odgovaraju odmah

i odlu no na veliki broj stresom-indukovanih uslova. (2) Notch25/Delta signalni put koji tokomrazvoja determiniše sudbinu mnogih tipova elija. Proteoliti ku aktivaciju elijskog-površinskogNotch receptora facilitira presenilin 1, membranski protein koji ima implikacija u Alzheimer-ovojbolesti. (3) Signalni put aktiviran sekretovanim Wnt26 proteinima, signalnim molekulima koji

25 Notch (sr. urez, žleb) receptori su receptorni proteini koji imaju takvu strukturu koj li i na želeb ili urez u koji se „ume u“ Delta ligandi.26 Wnt je kovanica kombinacije Wg (engl. wingless) i Int. Wg gen je originalno identifikovan kao gen za polarnost segmenta kod Drosophilemelanogaster, a koji funkcioniše tokom embriogeneze, ali i metamorfoze tj. formiranju adulta. INT geni su orginalno identifikovani kao geniki menjaka u blizini nekoliko mesta za integraciju MMTV (engl. Mouse Mammary Tumor Virus). Int-1 gen i Wg gen su homologi i smatra se da suevolutivno nastali od istog preda kog gena.

198

posreduju u kontroli mnogih razvojnih procesa. (4) Signalni put aktiviran sekretovanimHedgehog27 (Hh) proteinima, signalnim molekulima koji posreduju u kontroli mnogih razvojnihprocesa i beski menjaka i ki menjaka. Sva etiri signalna puta imaju klju nu ulogu u animalnomrazvoju. Ukoliko je bilo koji od njih inaktivisan, razvoj organizma je ozbiljno poreme en i životinjaumire kao embrion ili tokom rodjenja.

5.1. NF-kB SIGNALNI PUT

Kao što je napomenuto ranije, signalom-indukovana fosforilacija je od neobi ne važnosti zamodulaciju aktivnosti mnogih transkripcionih faktora. Drugi mehanizam signalnom-indukovaneregulacije aktivnosti transkripcionih faktora je proizašao iz studija i na sisarskim elijama i naelijama Drosophile melanogaster i uklju uje fosforilaciju, a potom i posledi nu ubiquitinom-

posredovanu degradaciju inhibitornog proteina. Najizrazitiji primer ovakvog mehanizma aktivacijetranskripcionih faktora je aktivacija NF- transkripcionog faktora.

5.1.1. Signalom-indukovana degradacija citosolnog inhibitornog proteina aktivira NF-transkripcioni faktor

NF- (engl. Nuclear Factor – appa ) proteini su regulatorni proteini latentnih gena kojipredstavljaju srž u regulaciji inflamatorni procesa. NF- singnalni put je prvobitno otkriven naosnovu njegove transkripcione aktivnosti u ekspresiji gena koji kodira laki-lanac antitela(imunoglobulina) u B elijama, a danas se zna da je NF- glavni transkripcioni regulator uimunom sistemu sisara. Iako mušice ne prave antitela, otkriven je intracelularni i ekstracelularniprotein, Dorsal, koji je NF- homolog, i kod Drosphila posreduje imuni odgovor uperen premabakterijskim i viralnim infekcijama, i to preko indukcije sinteze velikog broja antimikorobijalnihpeptida koji se sekretuju iz elija. Ovo sugeriše da je NF- regulatorni sistem star više od polabiliona godina. NF- se veoma brzo aktivira u odgovoru elija imunog sistema sisara na

27 Hedgehog (sr. jež) signalni put je klju ni regulator animalnog razvoja konzervisan od mušice do oveka. Ovaj signalni put je dobio ime odnjegovog polipeptdinog liganda, intracelularne molekule koja se zove Hedgehog i koji je pronadjen kod Drosophile melanogaster. Hh je jedan odprodukata gena za segmentarnu polarnost Drosophile uklju en u ustanovljavanju baze za plan tela ove mušice. Mutacija u samo jednom genuHedgehog proteina produkuje larvu sa šiljatim procesima (zubi ima), te ona podse a na ježa (engl. hedgehog).Ovaj molekul je veoma važan tokomkasnijih faza embriogeneze i metamorfoze. Sisari imaju tri Hedgehog homologa od kojih je tzv. SHh (engl. Sonic Hedgehog) najviše istražen, apostoje još i DHh (engl. Desert Hedgehog) i Ihh (engl. Indian Hedgehog). Sva tri puta su jednako važna tokom embrionalnog razvoja.

199

infekciju, inflamaciju, kao i brojne stresogene situacije, kao što je jonizuju a radijacija. Poredtoga, NF- se takodje aktivira sa tzv. inflamatornim citokinima kao što su TNF- i IL-1, kojise sekretuju iz okolnih elija (najviše makrofaga), a kao odgovor na infekciju. Iako su receptori zaova dva proinflamatorna citokina strukturno razli iti, operišu na sli an na in.

lanovi familije NF- proteina dele strukturnu homologiju sa retroviralnim onkoproteinom v-Rel,pa se nekada klasifikuju i kao NF- /v-Rel familija proteina. Postoji pet definisanih lanovafamilije NF- proteina u sisarskim elijama: RelA (još se zove p65), RelB, c-Rel, NF- ( još sezove p50), NF- ( još se zove p52). lanovi familije NF- proteina mogu da formirajuhomodimere i heterodimere, a svaki od ovih dimera aktivira karakteristi an set gena. Inhibitorniprotein I- se tesno vezuje za ove dimere i „drži” ih u inaktivnosm stanju, u sklopu velikogproteinskog kompleksa u citosolu. Sve subjedinice heterodimernog NF- imaju homologeregione, na njihovim N-terminusima, koji su neophodni za dimerizaciju i vezivanje za DNK. Ustanju mirovanja, NF- je odvojen u citosolu u inaktivnom stanju preko direktnog vezivanja zainhibitoni protein I- . Jedan molekul I-kB se vezuje za N-terminalne domene svake subjedinice

p50/p65 , te na taj na inmaskira signal zanuklearnu lokalizaciju(engl.Nuclear LocalizationSignals - NLS). Vezivanjesignala, kao što su TNF-ili IL-1 aktiviraju signalniput vezivanjem za svojereceptore na površinielije. Protein ki-nazni

kompleks koji je nazvanI- kinaza, je ta kakonvergencije svihekstracelularnih signalakoji aktiviraju NF-

(Slika 5.1. i Slika 5.2.)

Slika 5.1. NF- signalni put.

200

U toku nekoliko minuta od stimulacije receptora aktivira se TAK1 (engl. Transcriptional factorActivated Kinase 1, act like mitogen-activated protein kinase kinase kinase) koja inicira aktivacijuI- kinaze, a ona aktivirana fosforiliše dva N-terminalna serinska ostatka na I- . Potom se zaove fosfo-serine vezuje E3 ubiquitin ligaza i vrši poliubikvitinaciju I- , zapo inju i njegovumomentalnu degradaciju proteazomom (videti sliku 4.18. u prethodnom poglavlju 4). U elijamakoje ekspresuju mutantnu formu I- kod koje su ova dva klju na serina zamenjena alaninima, teprema tome ne mogu biti fosforilisana, NF- je permanentno represovan, što jasno demonstrirada je fosforilacija I- esencijalna za aktivaciju NF- signalnog puta.

Slika 5.2. Aktivacija NF-signalnog puta sa TNF- .I TNF- i njegov receptor su trimerniproteini. Vezivanje TNF- prouzrokujerearanžiranje grupisanih (engl.clustered) citoplazmatskih repovareceptora koji potom regrutuju velikibroj intracelularnih signalnih proteina,uklju uju i RIP kinazu (engl. Receptor-Interacting Protein kinase) i dvaadapterna proteina, TRADD (engl.TNF-Receptor-Associated Death-Domain protein ) i TRAF2 (engl. TNF-Receptor-Associated Factor 2). Ovopotom regrutuje i aktivira jošnedefinisanu kinazu koja je nazvanaIKKK (engl. I- Kinase KinaseKinase) koja fosforiliše i aktivira IKK(engl. I- Kinase Kinase). IKK jeheterodimer gradjen od dve kinaznesubjedinice (IKK- i IKK- ) i jedneregularne adapterne subjedinice koja jenazvana IKK- . IKK- fosforiliše I-na dva serina, te time markira I-KBprotein za ubikvitinaciju i degradaciju uproteazomima. Signal za nuklearnulokalizaciju izložen na slobodnom NF-

sada usmerava transport ovogproteina u nukleus, gde on, ukooridinisanoj kolaboraciji sa drugimkoaktivatorima, stimuliše transkripcijuciljnih gena. Pored gena koji suuklju eni u imuni odgovor, NF-kBaktivira I- gen (nije prikazano)..Uloga RIP nije jasna: iako je njegovoprisustvo neophodno za TNF-signaling, njegov kinazni domen nije.

201

Odvajanje I- od NF- otkriva i izlaže region signala za nuklearnu lokalizaciju, te se NF-translocira u nukleus i aktivira transkripciju velikog broja ciljnih gena. Bez obzira na njegovuativaciju proteolizom, NF- signaling eventualno može biti ugašen negativnom povratnomspregom, ukoliko jedan od gena, ija je transkripcija momentalno indukovana sa NF- , kodira I-

. Ovo može dovesti do pove anja niova I- proteina koji u nukleusu vezuje aktivni NF- ivra a ga u citosol.

NF- stimuliše transkripciju više od 150 gena uklju uju i i gene koji kodiraju citokine ihemokine koji privla e elije imunog sistema i fibroblaste do mesta infekcije. Pored toga, NF-favorizuje ekspresiju receptornih proteina koji omogu avaju neutrofilima da migriraju iz krvi uokolna tkiva. Takodje, NF- stimuliše ekspresiju inducibilne forme enzima koji produkuje azotoksid (engl. inducible Nitric Oxide Synthase - iNOS), koji je toksi an za bakterijske elije, kao itranskripciju nekoliko anti-apoptoti kih faktora koji preveniraju programiranu elijsku smrt.Prema tome, ovaj jedan jedini transkripcioni faktor koordinira i aktivira odbranu organizma ilidirektnim odgovorom na patogene i stresogne stimuluse, ili indirektnim odogovorom na signalnemolekule oslobodjene iz drugih inficiranih ili ozledjenih elija i tkiva.

Pored uloge u infalamaciji i imunitetu, NF- igra zna ajnu ulogu u procesima razvoja. Na primer,embrioni miša koji ne ekspresuju jednu od subjedinica I-kB kinaze umiru zbog degeneracije jetreuzrokovane preteranom apoptozom elija koje bi normalno preživele. Smatra se da je degradacijaproteina zavisna od fosforilacije uobi ajeni regulatorni mehanizam u mnogim razli itim elijskimprocesima.

202

5.2. NOTCH/DELTA SIGNALNI PUT

Signaling od Notch receptornog proteina je možda najviše koriš eni signalni put u razvojuživotinja. Osnovna uloga mu je da kotroliše izbor elijske sudbine tokom razvoja, uglavnomamplifikacijom i konsolidacijom molekularnih razli itosti izmedju elija koje se medjusobnoograni avaju. I Notch protein i njegov ligand Delta protein su transmembranski proteini savelikim brojem ponovaka koji li e na epidermalni faktor rasta, EGF (engl. Epidermal GrowthFactor, EGF -like repeats) u svojim ekstracelularnim domenima. Iako je Notch singalning uklju enu razvoj mnogih tkiva, najpoznatiji je po svojoj ulozi u produkciji nervnih elija kod Drosophile.Nervne elije obi no rastu kao izolovane pojedina ne elije medju epitelijalnim slojemprekurskorskih elija. Tokom ovog procesa, svaka budu a nervna elija, ili opredeljenaprogenitorna elija nervne- elije, šalje signale ka svom najbližem susedu da se ne razvija u istompravcu u isto vreme. Ovaj proces se naziva lateralna inhbicija i u njemu se podrazmeva daokolne-grani ne i razvojno ekvivalentne elije koje su u kontaktu imaju razli ite sudbine. Proceslateralne inhibicije u kome u estuvu i Notch protein i njegov Delata ligand je visoko konzervisan iveoma važn tip elijske diferencijacije i kod beski menjaka i ki menjaka. Ovaj proces je posebnovažan spre avanju formiranja previše prekursora nervnih elija od nediferenciranog slojaepitelijalnih elija. Na primer, u embrionu mušice, inhibisane elije oko budu eg prekursoranervne elije e se razvijati u epidermalne elije. Lateralna inhbicija zavisi od kontakt-zavisnihsignalnih mehanizama koji su posredovani preko signalnog proteina Delta izloženog na površinibudu ih nervnih elija. Vezivanjem za Notch na susednim elijama, Delta ligand daje signalsusednim elijama da ne postanu nervne elije (Slika 5.3.).

Slika 5.3. Lateralna inhibicija posredovana sa Notch i Delta tokomrazvoja nervnih elija kod Drosophila.Kada pojedina ne elije epitela otpo nu svoj razvoj u nervne elije,istovremeno šalju signale susednim elijama i time spre avaju njihovrazvoj u nervne elije.Ovaj inhibitorni kontakt-zavistan signalingposredovan je ligandom Delta, koji se pojavljuje na površini budu ihnervnih elija i vezuje se za Notch proteine susednih elija. U mnogimtkivima, sve elije jedne grupacije inicijalno ekspresuju i Delta i Notch,pri emu postoji kompeticija me u njima. elija koja „pobedi” u ovojkompeticiji ima e snažno izraženu ekspresiju Delta liganda, te e usledtoga imati sposobnost i da inhibiše susedne elije. U nekim slu ajevimadopunski faktori interaguju sa Delta ili Notch, kako bi pojedine elijeu inili osetljivim na kasnije inhibitorne i druge prigušuju e signale.

203

Kada postoje poreme aji u procesu transdukcije signala ovog tipa kod mušica, elije-susedinervnih elija e se takodje razviti u nervne elije i produkovati mnogo više neurona na ra unepidermalnih elija, što je smrtonosno. Signaling izmedju elija koje su bliski susedi preko Notch iDelata (ili Delta-sli nog proteina Serrate) reguliše izbor sudbine elije u velikom broju razli itihtkiva, pomažu i da se kreira fino graduisani obrazac raznovrsnih tipova elija. Pored lateralneinhibicije, Notchom-posredovan signling može imati i druge efekte u nekim tkivima, i to na primer,da radi u obrnutom smeru, tj. da prouzrokuje da se susedne elije ponašaju sli no.

5.2.1. Regulisana intramembranska proteoliza katalisana preselinom 1 aktivira Notchreceptor

I Notch receptorni protein i Delta ligand su transmembranski proteini koji jednom presecajuelijsku membrani i oba ova proteina zahtevaju proteoliti ko procesovanje da bi bili funkcionalni.

Iako još uvek nije jasno zašto Delta ligand treba da bude razložen, proteoliza Notch proteina jeglavi mehanizam kojim Notch aktivacija menja ekspresiju gena u nukleusu. Kada se Notchaktivira vezivanjem Delta, intracelularne proteaze odvajaju citoplazmati ni rep od Notchproteina. Oslobodjeni rep se premešta u nukleus da aktivira transkripciju seta gena kojiodgovaraju na Notch-aktivaciju (engl. Notch-responsive genes). Notch rep deluje preko vezivanjaza genski regulatorni protein CSL (tako se zove kao kombinacija tri naziva proteina: engl. CBF1 inmammals, Suppressor of hairless in flies and Lag-1 in worms). Vezivanje Notch repa aktivira CSLi konvertuje ga iz transkripcionog represora u transkripcionog aktivatora. Produkti glavnih genakoji su aktivirani Notch signalingom su i sami proteini regulatori gena (genski regulatorniproteini), ali sa inhibitornim delovanjem jer oni blokiraju ekspresiju gena neophodnih za neuralnudiferencijaciju, u nervnom sistemu, kao i razli itih drugih gena u ostalim tkivima.

Notch receptor prolazi kroz tri proteoliti ke razgradnje, ali samo su dve zadnje zavisne od Deltaliganda. Kao deo svoje normalne biosinteze, proteaza koja se zove furin deluje u Goldži aparatu i„se e“ novo-sintetisani Notch protein u njegovom budu em ekstracelularnom domenu. Ovoproteoliti ko cepanja konvertuje Notch protein u heterodimer, koji se potom transportuje napovršinu elija kao zrela, matrurirana, forma receptora. Vezivanje Delta liganda za Notch receptorindukuje drugo proteoliti ko cepanje u transmembranskom domenu, posredovano memranskivezanom metaloproteazom koja se zove TACE (engl. Tumor necrosis factor Alpha ConvertingEnzyme). Finalno proteoliti ko cepanje, koje sledi veoma brzo nakon drugog, je katalisano

204

preselinom 1, koji cepa, i na taj na in i odvaja citoplazmati ni rep aktiviranog Notch receptora(Slika 5.5). Oslobodjeni rep se translocira u nukleus, vezuje za CSL genski regulatorni protein,aktivira ga i konvertuje iz transkripcionog represora u transkripcionog aktivatora (Slika 5.4.).

Slika 5.4. Procesovanje iaktivacija Notch proteinaproteoliti kim cepanjem.Strelice ozna ene brojevimaprikazuju mesta proteoliti kogcepanja. U trans mreži Goldžiaparata dešava se prvi korakproteoliti ke obrade, tokomkojeg se generiše zrela formaheterodimernog Notchreceptora, koji se zatim izlažena površini elije. VezivanjeDelta liganda, prisutnog nasusednim elijama, aktiviradva naredna proteoliti kakoraka. Notch i Deltainteraguju direktno prekosvojih ponovljivih EGF-usli nih (engl. EGF-like)domena. Neki podaci ukazujuna to da tenzija koja seispoljava na Notch proteinpreko endociti ke mašinerijeelija koje interaguju, aktivira

cepanje na poziciji 2.

Kao što je napomenuto, prvo proteoliti ko cepanje Notch proteina se odvija u Goldži kompleksudelovanjem furin proteaze. Ali, pre nego što stigne u Goldži aparat, Notch protein se sintetiše kaomonomerni membranski protein u endoplazmatskom retikulumu, gde se vezuje za preselin 1,protein koji osam puta preseca membranu. Kompleks putuje prvo u Goldži aparat gde se odvijaprvo, furinom-posredovano, proteoliti ko cepanje Notch proteina koje generiše ekstracelularnusubjedinicu i transmembransko-citosolnu subjedinicu. Ove dve subjedinice ostaju nekovalentno

205

asocirane jedna sa drugom u odsustvu interakcije sa Delta ligandom koji je na membrani drugeelije. Vezivanje Delta liganda za Notch receptor aktivira dva naredna proteoliti ka cepanja Notch

proteina (Slika 5.5.).

Slika 5.5. Regulisana intramembranskaproteoliza katalisana preselinom 1 aktiviraNotch/Delta signalni put.Ekstracelularna subjedinica Notch proteina jenekovalentno vezana za sa njegovomtransmembransko-citosolnom subjedinicom. 1 -Vezivanje Delta liganda sa susedne elije prvozapo inje proteoliti ko cepanje Notch proteinamembranski-vezanom metaloproteinazom TACE(engl. Tumor necrosis factor Alpha ConvertingEnzyme). 2 - Na taj na in se oslobadjaekstracelularni segment. 3 – Preselin 1, integralnimembranski protein potom katalizujeintramembransko cepanje koje oslobadjacitosolni Notch segment ili rep. 4 - Notch citosolnisegment se odmah translocira u nukleus gdedeluje na regulaciju ekspresije gena koji imajuuticaja na determinaciju sudbine elije tokomrazvoja.

Kao što je napomenuto, drugo proteoliti ko cepanje u okviru hidrofobnog transmembranskogdomena Notch proteina katalisano je membranski vezanom metaloproteazom TACE i odvajaekstracelularni deo, dok poslednje proteoliti ko cepanje katalisano preselinom 1, rezultiraoslobadjanjem Notch citosolnog segmenta, koji se odmah translocira u nukleus. Ovakva signalom-indukovana regulisana intramembranska proteoliza, ili RIP, (engl. Regulated IntramembraneProteolisis) se dešava kao odgovor elija na visoki nivo holesterola, kao i na prisustvo„nesavijenih” proteina (engl. unfolded) u endoplazmatskom retikulumu.

S obzirom da se cepanje Notch citosolnog segmenta (repa) odvija u okviru transmembranskogsegmenta, veoma podse a na cepanje drugog transmembranskog proteina, APP (engl. -AmyloidPrecursor Protein), koji je ekspresovan u neuronima i nije definisana njegova fiziološka funkcija,ali se zna da je uklju en u Alzheimer-ovu bolest. APP se cepa u okviru transmembranskogsegmenta oslobadjaju i jedan peptidni fragment u ekstracelularni prostor mozga, a drugi u citosolneurona. U Alzheimer-ovoj bolesti, ekstracelularni fragmenti se akumuliraju u preteranoj koli ini,

206

te se stoga agregiraju u filamente koji formiraju amiloidne plo e/plakove (engl. amyloidplaques), za koje se veruje da ošte uju i nervne elije, u estvuju u njihovom gubitku. Naj eš igenetski uzrok Alzheimer-ove bolesti je mutacija na genu za preselin 1 (PS1), koji poredproteoliti kog cepanja Notch proteina, participira i u cepanju APP. Mutacija na PS1 genuprouzrokuje cepanje APP u fragmente koji pove anom brzinom formiraju amiloidne plakove.Preselin 1 je prvi put i identifikovan kao produkt gena koji je uobi ajeno mutiran kod pacijenatasa autozomalno-dominantnom formom Alzheimer-ove bolesti. Kao što je napomenuto, glavnapatološka promena asocrana sa Alzheimer-ovom bolesti je akumulacija amiloidnih plakova kojisadrže agregate malih peptida gradjenih od 42 ostatka i nazvanih A 42. Ovi peptidi su derivatiproteoliti kog cepanja APP, koji zapravo prolazi kroz proteoliti ko cepanje preko dva signalna puta(Slika 5.6.). U oba puta, inicijalno cepanje se odvija u okviru ekstracelularnog domena ikatalisano je -sekretazom ili -sekretazom, a tip enzima koji katališe reakciju proteolize eodrediti dalju sudbinu signalnog puta. Nakon incijalnog cepanja u okviru ekstracelularnogdomena, na istom intramembranskom mestu, kod oba puta, odvija se drugo proteoliti ko cepanjekatalisano -sekretazom. Signalni put iniciran -sekretazom, koji uklju uje i istu membranski-vezanu metaloproteinazu TACE koja cepa Notch, generiše peptid (26 aminokiselinskih ostataka)koji nije štetan. Sa druge strane, signalni put iniciran -sekretazom generiše formiranjepatoloških A 42 (Slika 5.6.). „Missense“ mutacija na genu za preselin 1, uklju enom u Alzheimer-ovu bolest, poja ava formiranje A 42 peptida, što prouzrokuje ubrzano formiranje amiloidnihplakova i eventualno može dovesti do smrti neurona.

Slika 5.6. Proteoliti kocepanje APP, plazma-membranskog proteina.Levo: Sekvencijalnoproteoliti ko cepanjekatalisano -sekretazom (1) i-sekretazom (2) produkuje

neškodljivi membranski-usadjen peptid (engl.innocuous membrane-embedded peptide) od 26aminokiselina. -sekretaza jekompleks od nekolikoproteina, ali proteoliti komesto koje katalizuje

intramembransko cepanje je verovatno na preselinu 1. Desno: Cepanje ekstracelularnog domena katalisano -sekretazom (1), pra eno cepanjemu okviru membrane -sekretazom, generiše A 42 peptid (42 aminokiselinska ostatka) koji je uklju en u formiranju amiloidnih plakova u Alzheimer-ovoj bolesti. Uo iti da se u oba signalna puta citosolni segment APP oslobadja u citosol, ali mu funkcija nije poznata.

207

Geneti ki pokazatelji kod C.elegans, Drosophile i miševa uklazuju da je, i kod ovih organizama,preselin 1 protein neophodna komponeneta Notch signalnog puta, koja pomaže da se izvedefinalno proteoliti ko cepanje koje aktivira Notch protein. Notch signalni put je regulisanglikozilacijom. Jedna familija glikoziltransferaza, tzv. Fringe familija (engl. Fringe family), dodajeekstra še ere na O-vezane oligosaharide na Notch protein, što remeti specifi nost Notch proteinaza njegove ligande. Ovo je prvi primer modulacije ligand-receptor signalinga diferencijalnomreceptornom glikozilacijom.

208

5.3. WNT SIGNALNI PUT

Wnt28 proteini su sekretovani molekuli koji deluju kao lokalni medijatori u kontroli mnogihaspekata razvoja kod svih životinja u kojima su istraživani. Wnt proteini su otkriveni nezavisnokod mušica i miševa: kod Drosophila je wg (engl. wingless) gen otkriven zbog svoje uloge urazvoju krila, dok je kod miševa Int-1 gen pronadjen zbog toga što favorizuje razvoj tumora dojkekada je aktiviran integracijom virusa koji je do njega. Receptor na površini elije za Wnt pripadatzv. Frizzled familiji proteina koji sedam puta presecaju elijsku membranu (engl. seven-passtransmembrane proteins). Ovi receptori po strukturi li e na GPCRs, a neki od njih mogu i da vršetransdukciju signala, kao i GPCRs, preko G proteina i inozitol fosfolipidnog puta koji su opisaniranije (videti poglavlje 3). Ipak, Frizzled receptori uklju uju signalnu transdukciju preko signalnihputeva koji nisu zavisni i ne uklju uju G proteine. Osnovni signalni put Frizzled receptorauklju uje citoplazmati ni singalni protein nazvan Dishevelled protein. Najbolje okarakterisanDishevelled-zavistan put deluje preko regulacije proteolize multifunkcionalnog proteina koji sezove -katenin (ili Armadilo kod mušica).

5.3.1. Wnt proteini se vezuju za „Fizzled“ receptore i inhbišu degradaciju -katenina

-katenin i Armadilo protein su multifunkcionalni proteini koji su uklju eni i proces adhezijeelija- elija, a i kao regulatorni proteini latentnih gena (engl. latent gene regulatory proteins). Wnt

proteini aktiviraju ove puteve vezuju i se i za Fizzled receptor-protein i za ko-receptorni protein.Ko-receptorni protein je sli an receptornom proteinu za LDL (engl. Low Density Lipoprotein), te sestoga zove LDL-receptorima sli an protein, ili, LRP (engl. LDL-Receptor-Related-Protein). Nijejasno definisano kako Fizzled receptor i LRP aktiviraju Dishevelled protein, koji potom prevodi irazvodi signal dalje.

U odsustvu Wnt signalinga, najviše elijskog -kateinina je locirano u elija- elija adherentnimvezama, gde je asociran sa katherinima koji su transmembranski adhezioni proteini. U ovimadherentnim vezama, -katenin pomaže vezivanje katherina za aktinski citoskelet. Bilo koji

28 Wnt je kovanica kombinacije Wg (engl. wingless) i Int. Wg gen je originalno identifikovan kao gen za polarnost segmenta kod Drosophilemelanogaster, a koji funkcioniše tokom embriogeneze krila, ali i metamorfoze tj. formiranju adulta. INT geni su orginalno identifikovani kao geniki menjaka u blizini nekoliko mesta za integraciju sa MMTV (engl. Mouse Mammary Tumor Virus). Wg gen i Int-1 gen su homologi i smatra se dasu evolutivno nastali od istog preda kog gena.

209

molekul -katenina koji nije asociran sa katherinima se veoma brzo degradira u citoplazmi.Ova degradacija zavisi od velikog degradacionog kompleksa koji regrutuje -katenin i sadrži bartri druga proteina (Slika 5.7A): (1) Serin/treonin kinazu koja se zove GSK-3 (engl. GlycogenSynthase Kinase-3 ) i koja fosforiliše -katenin, te ga na taj na in markira za ubikvitinaciju irapidnu degradaciju u preoteazomima. (2) Tumorski-supresorni protein APC (engl. AdenomatousPolyposis Coli)29 koji pomaže favorizaciju degradacije -katenina pove avaju i afinitetdegradacionog kompleksa za -katenin, što je neophodno za efektivnu fosforilaciju -katenina saGSK-3 . (3) „Scaffold“ protein koji se naziva aksin drži proteinski kompleks zajedno.

Slika 5.7. Model Wnt aktivacije -katenin signalnog puta.A - U odsustvu Wnt signala, jedan -katenin je vezan za citosolni deo (rep)kaderin proteina (nije prikazano na slici).Bilo koji citosolni -katenin može postativezan, pomo u APC-axin-GSK-3degradacionog kompleksa. U ovomkompleksu -katenin je fosforilisanpomo u GSK-3 kompleksa, što aktiviranjegovu ubikvitilaciju i degradaciju uproteozomima. Geni koji odgovaraju naWnt, ostaju inaktivisani pomo u Grouchoko-represornog proteina, koji je vezan zagenski regulatorni protein LEF-I/TCF. B -Wnt se vezuje za Frizzled receptor i RLP iaktivira Dishevelled nepoznatimmehanizmom. Podjednako misterioznimmehanizmom, koji zahteva prisustvokazein kinaze 1 (nije prikazano na slici),do i e do inaktivacije GSK-3 udegradacionom kompleksu. Kao rezultatovoga, fosforilacija i degradacija -katenina je inhibisana i -katenin seakumulira u citoplazmi i jedru. U jedru se

-katenin vezuje za LEF-I/TCF, pri emuse odvaja Groucho, a -kateninfunkcioniše kao koaktivator koji stimulišetranskripciju Wnt ciljnih gena.

29 APC (engl. Adenomatous Polyposis Coli) je tako nazvan zbog toga što gen koji ga kodira veoma esto mutira u gen za adenom, benigni tiptumora, colona. Tumor se projektuje u lumen kao polip i eventualno može da se transformiše u maligni tumor.

210

Vezivanje Wnt proteina za Frizzled receptor i LRP prouzrokuje inhibiciju fosforilacije -katenina, a time i njegove degradacije. Mehanizam ovog procesa nije jasan do detalja, ali se znada zahteva prisustvo Dishevelled proteina i nekoliko drugih signalnih proteina koji se vezuju zaDishevilled protein, uklju uju i i serin/treonin kinazu koja se zove kazein kinaza 1 (engl. caseinkinase 1). Kao krajnji rezultat je akumulacija -katenina u citoplazmi i nukleusu (Slika 5.7B.).

U nukleusu se ciljni geni za Wnt signaling normalno održavaju u stanju „mirovanja“ prekoinhibitornog kompleksa genskih regulatornih proteina, koji uklju uju LEF-1/TCF30 familijuproteina vezanih za ko-represorni protein Groucho (videti sliku 5.7A.). Pove anje nedegradira-nog -katenina prouzrokovano Wnt signalingom dozvoljava ovom -kateinu da ulazi u nukleus ida se vezuje za LEF-1/TCF, sklanjaju i Groucho. U ovom slu aju b-katenin fukcioniše kao ko-aktivator, indukuju i transkripciju Wnt ciljnih gena (videti sliku 5.7B.).

Medju genima koji se aktiviraju preko -katenina je i c-myc, koji kodira protein c-Myc, mo anstimulator rasta i proliferacije elija. Mutacije APC gena su prisutne u oko 80% humanih kancerakolona. Ove mutacije inhibišu sposobnost proteina da se vezuju za -katenin, te se -kateninakumulira u nukleusu. Ovaj akumulirani, nuklearni, -katenin stimuliše transkripciju c-mycgena, kao i drugih Wnt ciljnih gena, ak i u odsustvu Wnt signalinga, što rezultiranekontrolisanom proliferacijom elija i favorizuje razvoj kancera.

30 LEF-1/TCF (engl. Lymphoid Enhancer-binding Factor - 1/ T Cell-specific transcription Factor)

211

5.4. HEDGEHOG SIGNALNI PUT

Kao i Wnt proteini, Hedgehog31 proteini su familija sekretornih proteinskih signalnih molekulakoji deluju kao lokalni medijatori u mnogim razvojnim procesima i beski menjaka i ki menjaka,i klju ni regulator animalnog razvoja konzervisan od mušice do oveka. Abnormalnosti uHedgehog signalnom putu tokom razvoja mogu biti letalne, a kod elija adulta mogu da vode gamalignim transformacijama i razvoju kancera. Hedgehog signalni put je dobio ime od njegovogpolipeptdinog liganda, intracelularne molekule koja se zove Hedgehog protein i koji je pronadjenkod Drosophile melanogaster. Hedgehog je jedan od produkata gena za segmentarnu polarnostDrosophile melanogaster uklju en u ustanovljavanju baze za plan tela ove mušice. Mutacija usamo jednom genu Hedgehog proteina polarnosti Drosophile melanogaster produkuje larvu sašiljatim procesima (zubi ima), te ona podse a na ježa (engl. hedgehog). Ovi molekui su veomavažni i tokom kasnijih faza embriogeneze i metamorfoze. Do sada su identifikovana tri gena kojakodiraju Hedgehog homologe proteine kod ki menjaka: SHh (engl. Sonic Hedgehog) je najvišeistražen, a postoje još i DHh (engl. Desert Hedgehog) i Ihh (engl. Indian Hedgehog). Sva tri puta sujednako važna tokom embrionalnog razvoja. Aktivna forma svih Hedgehog proteina je neobi nau tome što je kovalentno povezana sa holesterolom, što pomaže u restrikciji difuzije nakonsekrecije, te omogu ava i održava odredjeni stepen lokalizacije. Holesterol se dodaje tokom veomamarkantne faze procesovanja, u kojoj protein cepa/“se e“ sam sebe. Hedgehog proteini sutakodje modifikovani dodatkom lanca masnih kiselina, koji, iz nepoznatih razloga, može bitineophodan zahtev za signalnu aktivnost Hedgehog proteina. Dva transmembranska proteina,„Patched“ i „Smoothened“, posreduju odgovore na sve Hedgehog, pri emu „Patched“ inhibiše„Smoothened“.

5.4.1. Hedgehog proteini deluju preko receptornog kompleksa „Patched32“ i„Smoothened33“

Patched i Smoothened transmembranski proteini su receptori koji uklju uju signaling za sveHedgehog proteine. Pretpostavlja se da Patched protein preseca plazma membranu dvanaest putai on je receptor koji veže Hedgehog proteine, dok je Smoothened receptor transmembranski

31 Hedgehog (sr. jež).32 Patched (sr. zalepljen, zakrpljen).33 Smoothed (sr. ugladjen, ugla an, poravnan).

212

protein koji sedam puta preseca membranu sa strukturom sli nom Frizzled receptornimproteinima. U odsustvu Hedgehog signala Patched protein inhibiše aktivnost Smoothenedreceptora. Ova inhibicija se ukida kada se Hedgehog protein veže za Patched receptor, tetako dozvoljava Smoothened receptoru da prenosi signal u eliju. Signalni put koji seuklju uje nakon aktivacije Smoothened receptora (engl. Smoothened down-stream signalingpathway) najviše je prou en, razjašnjen i prezentovan kod Drosophile, te e on i biti ukratkoopisan kao primer Hedgehog signalinga.

Hedgehog signalni put koji je operativan kod Drosophile, u nekom pogledu, podse a ioperiše sli no kao i Wnt signalni put. U odsustvu Hedgehog signala, genski regulatorni proteinCi (engl. cubitus interruptus) se proteoliti ki cepa u proteazomima. Umesto da bude potpunodegradiran, on se procesuje da formira manje proteine koji se akumuliraju u nukleusu, gdedeluju kao transkripcioni represori, pomažu i inhibiciji nekih Hedgehog-responsive gena (Slika5.8A.). Proteoliti ko procesovanje Ci proteina zavisi od velikog multiproteinskog kompleksa.Kompleks sadrži (1) serin/treonin kinazu (naziva se, engl. Fused) nepoznate funkcije; (2) protein

za „usidravanje“ (naziva se, engl.Costal) koji vezuje kompleks zamikrotubule, te tako drži i uva Ciprotein van nukleusa; (3) adapterniprotein (naziva se, engl. Supressorof Fused).

Slika 5.8. Model Hedgehog signalinga kodDrosophile.A - U odsustvu Hedgehog proteina, Patched receptorinhibiše Smoothened receptor, verovatno putemdegradacije ili intracelularnog odvajanja Smoothenedproteina. Ci protein je lociran u proteinskom kompleksui cepa se kako bi formirao represora transkripcije, kojise akumulira u jedru i pomaže održavanje Hedgehoggena u inaktivnom stanju. Proteinski kompleks sadrži:serin/treonin kinazu Fused, u vrš uju i protein Costal(koji vezuje kompleks za mikrotubule) i adapterniprotein, koji funkcioniše kao supresor za Fused. B -Hedgehog protein se vezuje za Patched receptor i timeprekida inhibiciiju Smoothened receptora, koji sadašalje signal proteinskom kompleksu da prekineprocesovanuje Ci proteina, da se odvoji od mikrotubulai da oslobodi neprocesovani Ci protein, koji sada možeda se akumulira u jedru i da aktivira transkripciju genakoji odgovaraju na Hedgehog. Veliki broj dešavanja uokviru ovog puta, još uvek nisu poznati.

213

Kada se Hedgehog protein veže za Patched receptor aktvira se signalni put, procesovanje Ciproteina je supresovano, te se neprocesovani Ci protein oslobadja iz njegovog kompleksa, i ulazi unukleus gde aktivira transkripciju Hedgehog ciljnih gena (Slika 5.8B.).

Medju genima koji se aktviraju preko Ci proteina je i wnt gen koji kodira Wnt protein koji pomažeu formiranju obrazca tkiva u embrionu Drosophile. Drugi ciljni gen je patched gen sam po sebi, akao rezultat pove ane ekspresije Pathced receptornog proteina na površini elije inhibiše se daljiHedgehog signaling, što formira negativnu povratnu spregu.

Puno pukotina i nedostataka u informacijama vezanim za Hedgehog signaling treba da se popuni.Za sada je nepoznato kako, na primer, Patched protein inhibiše Smoothened receptor, kakoSmoothened receptor aktivira signalni put, kako je regulisana proteoliza Ci proteina (iako se znada je fosforilacija Ci preko PKA neophodna za procesovanje), ili kako je regulisano oslobadjanjemultiproteinskog kompleksa od mikrotubula, ili kako je kontrolisano oslobadjanjeneprocesovanog Ci proteina od multiproteinskog kompleksa.

Hedgehog signalni put kod ki menjaka je još manje poznat nego kod Drosophile. Pored pomenutatri proteina (engl. sonic, desert, indian Hedgehogs; SHh, DHh, IHh respectively) koja suhomologa Hedgehog proteinu Drosophile, postoje dve forme Patched receptora i tri Ci-sli naproteina (Gli1, Gli2, Gli3). Druga ije nego kod Drosophile, Hedgehog signaling stimulišetranskripciju Gli gena, ali nije jasno da li svi Gli proteini prolaze proteoliti ko procesovanje, iakopostoje podaci da Gli3 prolazi. Inaktivacione mutacije u jednom od humanih patched gena vodepreterano-aktivnom Hedgehog signalingu i dešavaju se vrlo esto u naj eš oj formi kožnogkancera, karcinomu bazalnih elija (engl. basal cell carcinoma), sugerišu i da Patched proteininormalno pomažu u o uvanju kontrole proliferacije elija kože.

214

215

SIGNALNI PUTEVI OD NUKLEARNIH

RECEPTORA 066.1. SIGNALING PREKO NUKLEARNIH RECEPTORA

Nuklearni receptori regulišu ekspresiju gena, u zavisnosti od interakcije sa malim lipofilnimmolekulama, i na taj na in se uklju uju u regulaciju velikog broja razli itih funkcija elija. To suproteini koji su ligand-zavisni transkripcioni faktori, a nalaze u citoplazmi i/ili nukleusu. Ligandi,difunduju kroz elijsku membranu i vezuju se za receptore u citoplazmi ili u nukleusu. Kompleksligand-receptor se vezuje za DNA elemente, u kontrolnim regionima ciljnih gena, i na taj na inuti e na transkripciju odredjenog gena.

6.1.1. Ligandi za nuklearne receptore

Prirodni ligandi za nuklearne receptore su lipofilni hormoni, kao što su steroidni hormoni, tiroidnihormoni, derivati vitamina A i D. Ovi hormoni imaju zna ajnu ulogu u regulaciji metabolizma,razvoja i diferencijacije, kao i funkcije razli itih elija u organizmu. Nedavno je utvrdjeno, da iintracelularni lipofilni metaboliti, kao što su prostaglandini, leukotrijeni, masne kiseline, derivatiholesterola, žu ne kiseline, pa ak i benzoati, mogu da funkcionišu kao ligandi za nulearnereceptore, i da na taj na in regulišu ekspresiju odgovaraju ih gena.

Generalno, ligandi za nuklearne receptore su mali, rigidni hidrofobni molekuli, sa polarnimdelovima na jednom kraju, koji im omogu avaju vezivanje za receptore preko Van der Waals-vih ihidrofobnih interakcija, kao i formiranje vodonikovih veza.

216

Tabela 6.1. Ligandi i HREs strukture za neke nuklearne receptoreReceptor Hormon Pola sekvence (heksamer) Konfiguracija HREGlukokortikoidni receptor, GR Kortizol AGAACA IR-3

Mineralokortikoidni receptor, MR Aldosteron AGAACA IR-3

Progesteronski receptor, PR Progesteron AGAACA IR-3

Androgeni receptor, AR Testosteron AGAACA IR-3

Estrogeni receptor, ER Estradiol RGGTCA IR-3

Receptor za tiroidne hormone, T3R 3,5,3`-L-trijodtironin, T3 hormno RGGTCA IR-0, DR-4, ER-6,8

Farnesoid receptor, FXR Farnesoidi AGGTCA IR-1, DR-5

Receptor za vitamin D3, VDR 1,25-Dihidroksi vitamin D3 RGKTCA DR-3

Receptor za 9-cis retinoicnu kiselinu, RXR 9-cis retinoicna kiselina, Terpenoidi AGGTCA DR-1

Receptor za all-trans retinoicnu kiselinu, RAR all-trans retinoicna kiselina AGTTCA IR-0, DR-2,5, ER-8

Receptor za aktivirani proliferator peroksizoma, PPAR 15-Deoksi- 12,14-prostaglandin J2 AGGTCA DR-1

COUP-TF ( , , ) ? RGGTCA Drs, 1Rs

NGFI-B ( , , ) ? AAAGGTCA NR, DR-5, IR-O

ROR ( , , ) ? YYCYRGGTCA NR

Skracenice: IR „invertovano ponavljana” (engl. inverted repeated); DR „direktno ponavljana” (engl. direct repeated); ER (engl. everted repeated); NR „bezponavljanja”. Broj HREs se odnosi na broj parova koji razdvajaju heksamere (pola mesta). NGFI-B (engl. nerve growth factor induced receptor); COUP-TF (engl.Chicken ovalbumin upstream promotor transcription factor); ROR (engl. Retinoic acid releated orphan receptor); , , su subtipovi receptora, kodirani razli;itimgenima.

6.1.2. Osnovni principi prenosa signala preko nuklearnih receptora

Model prenosa signala preko nuklearnih receptora je prikazana na slici 6.1. Nuklearni receptori senalaze u citoplazmi i/ili nukleusu. Mnogi od prirodnih liganada za nuklearne receptore sulipofilni hormoni, koji pasivno difunduju u eliju, ili se ligandi u eliju aktivno transporuju. Ueliji, hormonski ligand se veže za receptor koji je lokalizovan u citoplazmi i/ili u nukleusu, i time

aktivira transkripciono regulatornu funkciju receptora. U slu aju vezivanja za citosolne receptore,kompleks ligand-receptor se translocira u nukleus gde se veže za odgovaraju i region na DNA tzv.HRE (engl. hormone-responsive element) i uti e na transkripciju gena.

Neki receptori, kao što su PPARs (engl. peroxisome proliferator-activated receptors) i FXR(farnesoidni receptor), mogu da reaguju sa velikim brojem razli itih lipofilnih molekula. Zbog

217

toga se smatra da su ovi nuklearni receptori uklju eni u regulaciju metabolizma kao i udetoksifikaciju stranih materija.

Nuklearni receptori su ligand-zavisni transkripcioni regulatori, koji mogu da funkcionišu kaoaktivatori ili represori transkripcije. Oni se specifi no vezuju za HRE, regulatornog regiona ciljnoggena tj. gena ija se transkripcija reguliše. Zavisno od receptora, vezivanje za DNA je povezano saaktivacijom ili represijom susednih gena. Ipak generalno posmatrano, vezivanje liganda zareceptor aktivira transkripciju, a samo u retkim slu ajevima dolazi do blokade transkripcijeciljnog gena. U nekim slu ajevima, i receptor koji nije aktiviran ligandom je vezan za DNA , i ima

negativan efekat na transkripciju gena.Vezivanje liganda za takav receptor,deblokira aktivaciju transkripcije.

Pored vezivanja sa ligandom, nuklearnireceptor može biti aktiviran i angažovanjemdrugih mehanizama, kao što su fosforilacijareceptora nekom od kinaza, kao i vezivanjemza regulatorne proteine npr. ciklin D1.Drugim re ima, može do i do povezivanjadrugih signalnih puteva sa signalingompreko nuklearnih receptora.

Slika 6.1 Signalna transdukcija preko nuklearnih receptora.Nuklearni receptori su ligand-zavisni transkripcioni faktori koji sevezuju za odredjenu DNA sekvencu tzv. HRE. Hormon funkcionišekao ligand koji reguliše aktivnost receptora. Mnogi receptorifunkcionišu kao homo- i heterodimeri. Aktivirani receptor, vezan zaDNA inicira transkripciju direktno, ili indirektno preko protein-proteininterakcije sa hromatinom i kompleksom proteina koji iniciratranskripciju. Strelice pokazuju mogu u razli itu konfiguraciju HRE.

U poredjenju sa signalnim putevima koji poti u od aktivacije membranskih receptora, signalningpreko nuklearnih receptora je relativno jednostavne strukture. Signalni put uklju uje, skorodirektan efekat liganda iz ekstracelularnog prostora, uz angažovanje samo nekoliko proteina, natranskripciju u nukleusu. Danas su poznate i dobro okarakterisane proteinske komponente

218

angažovane u ovom signalnom putu, do nivoa aktivacije transkripcione mašinerije. Medjutim,zbog kompleksnosti aktivacije transkripcije, još uvek nije potpuno objašnjeno kako nuklearnireceptori aktiviraju transkripciju gena. Veliki broj proteina u estvuje u komunikaciji izmedjuaktivatora transkripcije i bazalne transkripcione mašinerije. Ovi proteini imaju vrlo važnufunkciju i u aktivaciji transkripcije gena, preko nuklearnih receptora. Smatra se da su u procesprenosa signala, od aktiviranog nukearnog receptora do stimulacije transkripcije, uklju eni brojnikoaktivatori, korepresori i medijatori, koji imaju klju nu ulogu u regulaciji transkripcije.

Regulatorni procesi koji funkcionišu preko regulacije transkripcije gena su mnogo sporiji od onihkoji uti u na aktivnost ve postojecih proteina/enzima. Signalna transdukcija preko nuklearnihreceptora dovodi do dugotrajnijih efekata u aktivnosti enzima, kada brzina regulatornog procesanije od ve eg znacaja. Regulatorni procesi koji angažuju nuklearne receptore se uglavnom odnose,na adaptaciju aktivnosti glavnih metaboli kih enzima na izmenjene uslove, tj. odnose se napromenu funkcije organizma. S`obzirom da razvoj i diferencijacija viših organizama, podrazumevadugotrajane funkcionalane promene organizma, regulatorni mehanizmi koji kontrolišu oveprocese, uklju uju angažovanje nuklearnih receptora. Na primer, hormoni koji aktivirajunuklearne raceptore, kao što su seksualni hormoni, tireoidni T3 hormon, D3 hormoni, retinoi nakiselina, su uklju eni u razvoj i diferencijaciju organizma.

6.1.3. Klasifikacija i struktura nuklearnih receptora

Prvi opisani nuklearni receptori su receptori za glukokortikoide, za estradiol i za progesteron. Odtada su otkriveni mnogi drugi, strukturno sli ni nuklearni receptori, grupisani u velikusuperfamiliju sa bar šest razli itih subfamilija. Svi nuklearni receptori imaju visok stepenhomologije na nivou sekvence aminokiselina, što sugeriše da funkcionišu koriste i sli nemehanizme. Ipak, još uvek nije poznata funkcija svih nuklearnih receptora, kao i priroda ligandakoji se za njih vežu. Mogu e je da za neke od ovih receptora tzv. orfanskih receptora ne postojiprirodni ligand i da funkcionišu u ligand-nezavisnom maniru.

Tipi ni nuklearni receptor sadrži pet razli itih domena, a svaki od njih ima karakteristi nufunkciju. To su varijabilni N-terminalni region (A/B), visoko konzervisani domen odgovoran zavezivanje sa DNA (C), linkerni domen (D) koji sadrži signale o nuklearnoj lokalizaciji, ligand-vezuju i domen koji je odgovoran i za dimerizaciju (E), i varijabilni C-terminalni domen (F). U A/B

219

regionu, kao i u E i F regionu su nadjeni domeni odgovorni za transaktivaciju (u A/B regionu AF-1 (engl. activation function 1), a u E i F regionu AF-2 (engl. activation function 2)).

Slika 6.2 Struktura nuklearnog receptora.

6.1.3.1. DNA elementi koji se vezuju za nuklearne receptore (HREs)Receptori za steroidne hormone, su proteini koji se vezuju za specifi nu sekvencu na DNA, tzv.HREs (engl. hormone-responsive elements). Smatra se da HREs ima zajedni ku strukturu, i da sesastoji od dve kopije heksamerne sekvence (koja je naravno specifi na za svaki nuklearni receptor,vidi tabelu 6-1).

Receptori se za HRE vezuju uglavnom kao dimeri, i to kao heterodimeri ili kao homodimeri. Malibroj nukleranih receptora se veže za HRE kao monomer. O ovom slu aju, HRE sadrži samo jednukopiju heksamerne sekvence za prepoznavanje, pa se ovi receptori vežu za HRE kao monomeri.

Na osnovu strukture subjedinica nuklearnih receptora, preko kojih se vezuju za DNA, i struktureHRE, mogu se razlikovati etiri kategorije nuklearnih receptora.

Dimeri receptora za steroidne hormoneHREs, za koje se vežu receptori za steroidne hormone, imaju palindromnu strukturu34, sli nuonoj koja je zastupjena u regionu DNA za koji se vežu represori prokariota. Na primer,glukokortikoidni receptor se kao homodimer, koji se formira u citosolu, veže za invertovanoponovljenu sekvencu, tj. dva heksamera HRE su organizovana kao lik i njegov odraz u ogledalu.Svaka subjedinica dimera, koji je u kompleksu sa DNA, je u kontaktu sa jednim heksameromHRE. Zahvaljuju i postojanju ovakve invertovano ponovljene sekvence prepoznavanja, ostvarujese veliki afinitet vezivanja izmedju dimernog receptora i HRE (slika 6.3).

34 Palindromne sekvence DNA vezuju dimerne proteine, u kojima je svaka subjedinica proteina u kontaktu sa jednim heksamerom DNA elementa.

220

RXR sadrži heterodimereNuklearni receptori, za all-trans retinoi nu kiselinu, 9-cis retinoi nu kiselinu, za T3 hormon i zavitamin D3, se vezuju za karakteristi nu nesimetri nu sekvencu DNA, koja se ponavlja35 (engl.direct repeat of recognition sequence). Vezivanje nuklearnih receptora za ovakvu sekvencu,formira heterodimerne receptore vezane za DNA. Jedna od subjedinica heterodimera, je uvek RXR(receptor za 9-cis retinoi nu kiselinu) koji se obi no veže za 5` kraj HRE. Od naro itog zna aja za

vezivanje receptora za HRE,koji sadrži sekvencu koja seponavlja, je injenica da suheksameri HRE organizovani umaniru “glava ka repu” štozahteva polarnu organizacijureceptornih dimera.Takodje, za HRE ovog tipa jekarakteristi no, da razmakizmedju heksamera koji seponavljaju može biti razli it(obi no iznosi od 1-5 baznihparova). Drugim re ima,variranje rastojanja izmedjuponovljenih heksamera možeda kreira razli ite HRE, kojeodredjuju koji e se hetero- ihomodimeri formirati tj. vezatiza sekvencu koju prepoznaju.

Slika 6.3. Oligomerna struktura nuklearnih receptora i struktura HREs. A. Vezivanje homodimernog receptora za dvosimetri ni palindromniDNA element. (dimer glukokortikoidnog receptora). B. Vezivanje heterodimernog receptora za DNA element koji sadrži ponavljanu sekvencu. C.Vezivanje RXR kao homodimera za HRE koji ima ponovljenu istu sekvencu. D. vezivanje monomernog receptora za HRE sa asimetri nomsekvencom.

35 Ponavljana sekvenca prepoznavanja, zahteva nesimetri nu prostornu organizaciju subjedinica proteina koji se za nju vezuju. Protein-DNAkompleks, u ovom slu aju, ima polarni karakter, a dva proteina vezana za dve polovine DNA elementa, mogu da nose razli ite funkcije.

221

Dimerni orfanski receptoriOrfanski receptori mogu da se vežu za DNA elemente koji sadrže sekvencu koja se direktnoponavlja. U ovom slu aju, receptori se kao homodimeri, vezuju za HRE, koji sadrži dva mesta(heksamera, medjusobno razdvojena razli itim brojem baznih parova) koja se direktno ponavljaju.

Monomerni “orfanski receptori”Ovoj grupi receptora pripadaju receptori (npr. RZR; engl. retinoic Z receptor ili NGFI-B; engl. NGF-induced clone B) koji se kao monomeri vežu za asimetricnu sekvencu. Funkcija ovih receptora jejoš uvek slabo poznata.

6.1.3.2. DNA vezuju i domen nuklearnog receptoraReceptor se za HRE vezuje preko DNA-vezuju eg domena, koji je u okviru familije nuklearnihreceptora najkonzervisaniji strukturni element (region C u primarnoj strukturi receptora). DNA-

vezuju i domen poseduje strukturne elementepreko kojih specifi no prepoznaje HRE, kao ielemente koji regulišu dimerizaciju receptora naHRE. Centralno mesto u DNA-vezuju em domenuzauzimaju dva Zn2Cys4 motiva. Zn-motivi imajuulogu u pozicioniranju DNA heliksa i nuklearnogreceptora, i nisu uklju eni u direktnu interakcijusa bazama DNA. N-terminalni Zn-motiv u estvujeu pozicioniranju heliksa preko interakcije saostacima še era i fosfata u ki mi DNA, dok C-terminalni Zn-motiv u estvuje u dimerizaciji i ukontaktu je sa fosfatnim ostacima DNA.

Slika 6.4 Funkcionalni domeni nuklearnog receptora (na primeru glukokortikoidnog receptora). A. AF-1 i AF-2: domeni koji posreduju ustimulaciji transkripcije. B. Model dva Zn++-Cys4 vezuju a motiva na domenu koji se vezuje za DNA. C. Kompleks formiran izmedju dimernih DNAvezuju ih domena GR i HRE. Crni krugovi predstavljaju jone Zn++. D. Koncensus sekvenca i konfiguracija HRE.

222

Sekvekce koje u okviru HRE, prepoznaju nuklearni receptori, su vrlo sli ne i uglavnom serazlikuju po polaritetu i veli ini rastojanja izmedju dva heksamera. Zato nije iznenadjuju e da sustrukture dimera receptora, koji se vezuju za heksamere HRE, adaptirane na odredjenuorijentaciju i rastojanje izmedju sekvenci sa kojima reaguju.

Za palindromnu sekvencu se vezuju homodimerni receptori, koji se formiraju ve u citosolu.Sekvenca i razmak izmedju heksamera u HRE je komplementarna DNA-vezuju im domenimadimernih receptora, kao i njihovom rastojanju. Geometrija dimera receptora odredjuje, kakavrazmak izmedju sekvenci prepoznavanja može da se toleriše da bi se formirao kompleks visokogafiniteta.

Takodje, u slu aju ponavljanih heksamera HRE (ponavljanih sekvenci prepoznavanja), razmakizmedju njih, ima klju nu ulogu u odredjivanju koji e se receptor, hetero- ili homodimer, vezatiza HRE.

6.1.3.3. Ligand vezuju i domen nuklearnog receptoraLigand-vezuju i domen (region E sa slika 6.2 i 6.4) ima tri zna ajne uloge:

odgovoran je za homo- i heterodimerizacijuvezivanje liganda (agoniste i antagoniste)transaktivaciju i transrepresiju (vezivanje koaktivatora i korepresora).

Pored DNA vezuju eg domena, koji obezbedjuje neke elemente za dimerizaciju receptora, ielementi ligand vezuju eg domena u estvuju u dimerizaciji.

6.1.3.4. Elementi transaktivacije nuklearnog receptoraVe ina nuklearnih receptora poseduje dva strukturna elementa AF-1 i AF-2, koji su uklju eni uaktivaciju transkripcije. AF-1 se nalazi u okviru A/B regiona i uklju en je u ligand-nezavisnutransaktivaciju. On štiti mesta fosforilacije i mesta interakcije sa koaktivatorima, a njegova ulogajoš nije u potpunosti razjašnjena. Sekvenca AF-2 domena, koji se nalazi u E regionu, je dobrokonzervisana u okviru superfamilije nuklearnih receptora. AF-2 funkcioniše u ligand-zavisnommaniru. AF-2 okružuje heliks H12, koji je deo ligand-vezuju eg domena, kao i druge strukturneelemente E regiona. Kada se ligand veže za receptor, hidrofilna površina H12 heliksa je okrenuta

223

ka spoljašnosti, i obezbedjuje površinu za vezivanje komplementarnih regiona koaktivatora ikorepresora.

6.1.4. Mehanizmi preko kojih nuklearni receptori regulišu transkripciju

Funkcije nuklearnih receptora se mogu opisati terminima transkripcione aktivacije itranskripcione represije tj. blokade. Iako je ve ina nuklearnih receptora uklju ena u aktivacijutranskripcije (posredovana „pozitivnom” HRE), postoji odredjeni broj receptora koji dovode doblokade transkripcije, kada se za njih veže ligand (posredivana „negativnom” HRE). Takodje, nekinuklearni receptori inhibišu bazalnu transkripciju, tako što su i u odsustvu liganda vezani za„pozitivnu HRE”.

U regulaciju transkripcije preko nuklearnih receptora su uklju ene višestruke protein-proteininterakcije. Pokazano je da nuklearni receptori direktno reaguju sa:

komponentama transkripcionog aparata koji reguliše bazalnu transkripciju (TFIIB i TAFproteini),koaktivatorima transkripcije,korepresorima transkripcije,drugim specifi nim transkripcionim faktorima.

Koaktivatori nuklearnih receptora.Identifikovan je veliki broj proteina, ili kompleksa proteina, koji imaju funkciju koaktivatoratranskripcije. Ovi proteini specifi no reaguju sa aktiviranim ligand-receptor kompleksom.Najbrojnija grupa koaktivatora pripada p160 familiji koaktivatora. U ovu grupu se ubraja idobro okarakterisan, koaktivator steroidnih receptora 1 (SRC-1, engl. steroid receptorcoactivator 1).Druga grupa koaktivatora funkcioniše kao multiproteinski kompleks. Takav je npr. TRAPkompleks (TRAP = engl. thyroid hormone receptor activating protein).

Pripadnici p160 familije koaktivatora, reaguju sa drugim proteinima ili proteinskim kompleksima,koji imaju funkciju posrednika u inicijaciji transkripcije, kao i/ili aktivnost histon acetilaze(HAT). Smatra se da je primarna funkcija p160 klase koaktivatora, u koncentrisanju HATaktivnosti u promotornim regionima ciljnih gena, dok su TRAP proteini odgovorni zauspostavljanje veze izmedju receptora vezanog za DNA i holoenzima RNA polimeraze II.

224

Reorganizacija hromatina je osnovni korak u aktivaciji transkripcije DNA prekrivene hromatinom.Stoga je acetilacija histona od izuzuzetnog zna aja za regulaciju transkripcije36. Nuklearnireceptori mogu da regrutuju koaktivatore koji imaju, ili su povezani sa, histon acetilaznomaktivnoš u (HAT). Drugim re ima nuklearni receptor vezan za DNA, može da regrutuje proteinskikompleks koji ima HAT aktivnost.

Drugi tipovi koaktivatora, uklju uju i i CBP/p300 proteine, takodje mogu direktno da interagujusa receptorima vezanim za DNA. Pripadnici SWi/SNF kompleksa, kao i E3 ubikvitin protein ligazaE6-AP, takodje imaju funkciju koaktivatora.

Korepresori nuklearnih receptora.Receptori za T3 (T3R) i za retinoi nu kiselinu (RAR), mogu da blokiraju transkripciju u odsustvuliganda za ove receptore. Blokada transkripcije je povezana sa vezivanjem korepresornih proteina.Na primer, nuklearni korepresori NcoR i SMRT (engl. silencing mediator for retinoic and thyroidhormone receptors), se vezuju za ligand-vezuju i domen receptora, a od receptora se odvajajukada se za njega veže odgovaraju i ligand.

Glavni mehanizam preko koga se ostvaruje blokada transkripcije, je angazovanje proteina kojiimaju aktivnost histon deacetilaza (HDAC), u promotornom regionu gena. Ve spomenutinuklearni korepresori, NcoR i SMRT proteini, reaguju sa proteinskim kompleksom (npr. mSin3 iNuRD kompleks) koji ima histon deacetilaznu aktivnost. Drugim re ima, korepresori nuklearnihreceptora, regrutuju proteine sa histon deacetilaznom aktivnosti u promotorni region, i na tajna in održavaju tzv. „represovano” stanje hromatina koje spre ava transkripciju.

6.1.5. Regulacija signalinga preko nuklearnog receptora

Prenos signala preko nuklearnog receptora je regulisan na nekoliko nivoa (slika 6.6). U narednomtekstu e biti navedena glavna mesta regulacije signalinga preko nuklearnih receptora.

36 Odredjene konformacije hromatina su povezane sa blokadom transkripcije. Za formiranje viših struktura hromatina najve im delom su odgovoranihistoni koji su podložni kovalentnim modifikacijama: acetilaciji (uglavnom rezidue lizina), fosforilaciji (Ser/Thr residue), metilaciji (ostaci lizina iarginina), i ubikvitinaciji. esto su modifikacije prisutne na N-terminalnom kraju histona, a njihovo prisustvo je u korelaciji sa transkripciono aktivnimstanjem histona.

225

Slika 6.5. Model blokade i aktivacije transkripcijepreko T3R. U odsustvu T3 hormona, heterodimerniRXR-T3R receptor blokira transkripciju, svojimvezivanjem za TRE (T3 responsive element).Blokada transkripcije se održava, zahvaljuju iregrutovanju korepresornog kompleksa proteina,koji ima histon deacetilaznu aktivnost. X =neidentifikovani kofaktor, koji pomaže održavanjebazalnog transkripcionog aparata, vezanog zapromotor, u neaktivnom stanju. U prisustvu T3hormona, korepresori se odvajaju i koaktivatori(SRC/p160 kompleks) se vezuju za heterodimernireceptor. Proteini koji imaju aktivnost histonacetilaze, pomažu u indukciji transkripcije. Takodje,promotor regrutuje i drugi kompleks koaktivatora,DRIP/TRAP, koji je uklju en u stabilizaciju vezivanjaholoenzima RNA polimeraze.

Regulacija na nivou koncentracije ligandaKoli ina liganda koji može da reaguje sa receptorom je prvi regulatorni nivo ovog signalnogputa. Koncentracija liganda može biti regulisana na razli ite na ine: sintezom i degradacijomhormona; modifikacijom hormona; sekrecijom, njihovim transportom i skladištenjem;mehanizmima povratne sprege, preko koncentracije hormona u cirkulaciji.

Regulacija fosforilacijom (delovanje drugih signalnih puteva)Fosforilacija Ser/Thr ostataka, na receptornom molekulu, je osnovni mehanizam povezivanjasignalnog puta preko nuklearnih receptora sa drugim signalnim putevima u eliji.Fosforilacija mnogih nuklearnih receptora obezbedjuje regulatorni mehanizam koji jenezavisan od receptor-ligand interakcije. Steroidni receptori su fosfoproteini, koji na N-terminalnom delu obi no sadrže nekoliko fosforilisanih aminokiselina. Posledice fosforilacijereceptornog proteina mogu biti razli ite. Na primer, fosforilacija uti e na vezivanje liganda, natransport u nukleus, na vezivanje za DNA i transaktivaciju. Poznato je da MAP kinaza može

226

da fosforiliše Ser 111 u A/B regionu estrogenog receptora, i da aktivira receptor, nezavisno odnjegovog vezivanja za ligand. U ovom slu aju dolazi do transkripcije ciljnih gena, i unedostaku estradiola. Fosforilacija estrogenog receptora preko MAP kinze, predstavlja primerukrštanja dva signalna puta u eliji: RTKs – MAP signalnog puta i signalniga prekonuklearnog receptora. Takodje, drugi signalni putevi kao što je signalni put PKA, TGF -signalni put, ili put Akt kinaze, mogu fosforilacijom da regulišu aktivnost nuklearnogreceptora. Može se re i da su signali koji se prenose preko nuklearnih receptora, integrisani uintracelularnu signalnu mrežu, i povezani sa ekstracelularnim signalima.

Pored fosforilacije samih receptora, mnogi koaktivatori i korepresori, takodje, mogu bitifosforilisani i na taj na in regulisani.

Interakcija sa drugim aktivatorima transkripcijeNuklearni receptori mogu modulisati ekspresuju gena, menjaju i aktivnost drugihtranskripcionih aktivatora. Na primer, ER, T3R, RAR, GR proteini deluju kao transrepresori

transkripcionogfaktora AP-1(heterodimer koji sesastoji od c-Jun i c-Fos proteina), iobrnuto, AP-1, možeda inhibišetransaktivaciju ovihnu-klearnihreceptora. Tako-dje,poznat je uzajamniantagonisticki efekatGR i funkcijetranskripcionogaktivatora NF B.

Slika 6.6. Funkcije domena nuklearnog receptora. A/B, C, E i F domeni nuklearnog receptora, su uklju eni u multiplu protein-protein interakciju ina taj na in podložni regulatornim uticajima. Kompleksi proteina sa histon deacetilaznom aktivnoš u (HDAC) i histon acetilaznom aktivnoš u(HAT) se preko korepresora ili koaktivatora vezuju za promotorni region.

227

Regulacija preko ubikvitinacijeNivo nuklearnih receptora, kao i korepresora i koaktivatora ovih receptora, u eliji jeregulisan ubikvitinin-posredovanom degradacijom proteina.

6.1.6. Signaling preko nuklearnih receptora za steroidne hormone

U zavisnosti od mehanizma aktivacije nuklearnih receptora, receptori su podeljeni u dve osnovnegrupe. U prvu grupu se ubrajaju receptori koji mogu biti lokalizovani i u citoplazmi i u nukleusu(ve ina receptora za steroidne hormone). U drugu grupu se ubrajaju receptori koji su uvek unukleusu (receptori za derivate retinoi ne kiseline, receptori za T3 hormon i vitamin D3).

Steroidni hormoni, mogu da se vežu za receptor koji se nalazi ili u citoplazmi ili u nukleusu.Vezivanje steroidnog hormona za svoj receptor u citosolu, dovodi do aktiviranja receptora itranslokacije u nukleus, gde inicira transkripciju ciljnih gena. Na slici 6.7. je prikazana signalnatransdukcija preko nuklearnog receptora za steroidne hormone.

6.1.6.1. Aktivacija citoplazmati nog aporeceptornog kompleksaSteroidni hormoni, se kao i drugi hormoni, cirkulacijom distribuiraju po organizmu. U cirkulaciji,steroidni hormoni, su obi no vezani za specifi an proteinski nosa (npr. transkortin transportujekortizol). Steroidni hormoni, difuzijom ulaze u eliju i aktiviraju receptor koji se nalazi ucitoplazmi.

Receptor, se u odsustvu hormona, u citosolu nalazi u formi neaktivnog kompleksa tzv.aporeceptorni komleks. Hormon se u aporeceptornom kompleksu proteina, veže za proteine kojipripadaju klasi aperona. aperoni su proteini, iji se nivo u eliji pove ava kao rezultatdelovanja nepovoljnih stresogenih uslova, npr. delovanja povišene temperature. Oni imajucentralnu ulogu u formiranju adekvatne konfiguracije „savijanju proteina” (engl. folding process) ueliji. Oni u estvuju u oblikovanju proteina tokom, i posle, biosinteze proteina na ribozomima,

tokom transporta proteina u membrani, i u nastajanju proteinskih kompleksa.

228

Analizom u kojoj je koriš ena ko-imunoprecipitacija je utvrdjeno, da steroidni hormoni reaguju samulti-proteinskim kompleksom aperona, koji sadrži i proteine Hsp90, Hsp70, i Hsp56 (Hsp,engl. heat shock protein37). Smatra se, da se receptor nalazi u optimalnoj konformaciji zavezivanje hormona, kada je u kompleksu sa Hsp90. Aktivacija receptora zahteva prisustvo Hsp90,koji se vezuje za dimerni receptor. Hsp90 održava receptor u „unfolded” konformaciji, sposobnoj

za interakciju sa ligandom. aperoni,klase Hsp70, potpomažu pravilnopovezivanje Hsp90 sa receptorom.Takodje, i drugi aperoni, kao što suHsp56 i p23 (protein mase 23 kD), suuklju eni u proces aktivacije rece-ptora. Kao što je ve spomenuto, vezi-vanje hormona za aporeceptorni kom-pleks inicira translokaciju receptorau nukleus. Aktivirani receptor sadržisekvencu za odgovaraju u lokali-zaciju u nukleusu, kao za interakcijusa DNA i transaktivaciju. Vezivanjehormona za receptor, postavlja trans-aktivacione domene u odgovaraju upoziciju i time omogu ava interakcijusa transkripcionim aparatom.

Slika 6.7. Signalna transdukcija preko receptora zasteroidne hormone. U citosolu steroidni receptor je uneaktivnoj formi u kompleksu sa Hsp proteinima (Hsp90,Hsp56, protein p23). Vezivanje za hormon, aktivirareceptor, on se transportuje u nukleus, gde može dareaguje sa odgovaraju om HRE.

Detaljan mehanizam aktivacije i transporta receptora u nukleus je još uvek nepoznat. Smatra seda još neki proteini, kao što je npr. RAP46 (engl. nuclear receptor-associating protein of 46

37 Naziv Hsp (heat shock protein) poti e od zapažanja da se produkcija ovih proteina pove ava nakon delovanja povišenih temperatura

229

kDa), funkcionišu u kooperaciji sa aperonima i doprinose transportu, i aktivaciji receptora.Nakon disocijacije od Hsp proteina, receptor-hormon kompleks je sposoban za vezivanje sa HRE itransaktivaciju.

aperoni u ovom sistemu funkcionišu kao regulatori aktivnosti receptora za steroidne hormone.Njihova funkcija je da fiksiraju receptor u optimalnoj konformaciji koja omogu ava da se receptorveže za hormon sa visokim afinitetom. Drugim re ima, funkcija aperona je da stabilizujuodredjenu konformaciju, optimalnu za vezivanje hormona. Takodje, neaktivan kompleksnuklearnog receptora vezanog za aperone, može biti nadjen i u nukleusu. Na primer, estrogenireceptor, se nalazi u nukleusu, u sastavu velikog kompleksa sa Hsp proteinima. Vezivanjeestradiola za receptor, omogu ava njegovo odvajanje od Hsp, vezivanje za DNA, formiranje dimerareceptora, i interakciju sa koaktivatorima i aparatom za transkripciju.

230

231

REGULACIJA RECEPTORA 07Ve je više puta spomenuto da su putevi signalne transdukcije višestruko regulisani. Nivohormona koji se produkuju i sekretuju iz odredjenih elija se konstantno podešava, u smisluzadovoljavanja odredjenih potreba organizma. Na primer, elije tubula bubrega sintetišu isekretuju više eritropoetina, kada je nivo O2 u krvi nizak i kada je organizmu potrebno višeeritrocita. Nakon stimulacije sa TNF , ili sa citokinima, indukuju se intracelularni proteini kao štosu Ski i SOCS, koji negativno regulišu aktivirane signalne puteve. Fosforilisani receptori i“downstream” signalni proteini se defosforilišu kontrolisanim delovanjem fosfataza. U ovom deluteksta e biti opisani mehanizmi koji “down” regulišu signalne puteve.

7.1. ENDOCITOZA MEMBRANSKIH RECEPTORA

Ukoliko nivo hormona u elijskom okruženju ostane visok nekoliko sati, elije se obi nodesenzitivišu, tako da ne mogu više da odgovore na tu koncentraciju hormona. Ovo spre avaneadekvatnu produženu aktivnost receptora, ali i u tim uslovima elije e obi no odgovoriti nadalji porast hormona. Ligand-zavisna receptorom-posredovana endocitoza je osnovnimehanizam koji smanjuje broj receptora na površini elije. Na ovaj na in se elije desenzitivišu nadelovanje peptide i mnogih hormona.

Na primer, vezivanje EGF-a za svoj receptor, izaziva konformacionu promenu u citoplazmati nomrepu receptora. Ova promena otkriva motiv, koji olakšava regrutovanje receptora u klatrinom-obavijene jamice, i internalizaciju receptora. Posle internalizacije, neki receptori (npr. LDLreceptor) se efikasno recikliraju na površinu elije. Ipak, mnogi internalizovani receptori za

232

peptidne hormone se uglavnom transportuju, zajedno sa vezanim ligandima, do lizozoma gde sedegradiraju.

Stimulacija fibroblasta visokom koncentracijom EGF-a u toku jednog sata, izaziva internalizacijureceptora i degradaciju ve ine receptornih molekula. Ako nivo ekstracelularnog EGF-a padne, brojreceptora na membrani se obnavlja sintezom novih molekula receptora. De novo sinteza je sporproces, koji može da traje duže od jednog dana. Ovaj primer ilustruje smanjenje osetljivosti elijena kontinualnu stimulaciju visokim koncentracijama hormona, i kako se nakon smanjenja nivoahormona, obnavlja po etni nivo membranskih receptora tj. elija postaje ponovo osetljiva na nizaknivo hormona.

Eksperimenti na mutiranim elijskim linijama, pokazuju da internalizacija RTKs ima zna ajnuulogu u regulaciji elijskog odgovora na EGF i druge faktore rasta. Na primer, mutacija na EGFreceptoru koja ga ini otpornim na ligand-zavisnu endocitozu, tako što spre ava inkorporacijureceptora u klatrinske jamice, pove ava osetljivost elija na mitogeni signal (EGF). Ovakvemutirane elije su sklone elijskoj transformaciji koja je indukovana EGF-om. Intersantno je dainternalizovani receptori, pre degradacije, mogu iz intacelularnih kompartmana da nastave svojufunkciju indukcije signalnih puteva.

U mnogim elijama se peptidni hormoni, koji se internalizuju vezani za receptore, degradujuintracelularno. Ako ekstracelularani nivo hormona nizak, ovaj proces može zna ajno da smanjinivo hormona, ak toliko da za nekoliko sati prestane dalja aktivacija signalnog puta. Na primer,nivo IL-2 u ekstracelularnom fluidu, (IL-2 stimuliše proliferaciju T limfocita), može, ovimmehanizmom, toliko da se smanji da potpuno prekine stimulaciju T limfocita. Takodje, mutiranaforma IL-2, se vezuje za receptor, normalno, kada je pH ekstracelularnom medijumu 7.5, ali vrloslabo u uslovima pH=6, koji su u endocitoznoj vezikuli ili endozomu. Niska pH vrednost, dovodido disocijacije mutiranog IL-2 od receptora u endosomu, tako da se on reciklira u ekstracelularnimedijum. Poluživot ovog mutanta IL-2, je duži od normalnog, što može biti korisno u terapiji, kadaje potrebna proliferacija T limfocita.

233

7.2. SEKRETOVANI PROTEINI MOGU DA VEŽU HORMONE I NA TAJ NA IN SPRE EAKTIVACIJU RECEPTORA

Drugi na in smanjenja aktivnosti membranskih receptora, je sekrecija proteina koji sadržesekvencu, za koju mogu da se vežu hormoni, ali ovi proteini/receptori nemaju funkciju u prenosusignala. Hormoni se vezuju za ovakve “mamce” receptore (engl. decoy receptors), što smanjujekoli inu hormona za interakciju sa receptorima sa signalnom funkcijom. Ovakav tip regulacije jezna ajan u kontroli reapsorpcije kosti, kompleksnom fiziološkom procesu koji integriše nekolikomolekularnih mehanizama.

Kod sisara, do puberteta se završava neto rast kostiju, medjutim dinami ki proces resorpcije iponovnog formiranja kostiju (engl. remodeling) se održava u toku itavog života. Procesremodelovanja omogu ava obnavljanje ošte enih kostiju, kao i oslobadjanje kalcijuma, fosfata idrugih jona, iz mineralizovanih kostiju u krv za upotrebu bilo gde u organizmu.

Osteoklasti, elije odgovorne za resorpciju kostiju, su makrofage koje sadrže visoko dinami neadhezivne strukture tzv. podosome u plazma membrani. v 3 integrin u podosomima je vrlovažan za inicijalno vezivanje osteoklasta za površinu kosti38. Nakon, inicijalnog vezivanja,osteoklasti formiraju specijalizovan vrlo vrst spoj/pe at (engl. tight seal) sa koštanom površinom,koji okružuje zatvoren ekstracelularan prostor. U taj prostor, adherirani osteoklasti, po inju dasekretuju korozivnu mešavinu HCl i proteaza, koja razlaže neorgansku komponentu i vršihidrolizu proteina kosti. Mehanizam nastanka i sekrecije HCl je vrlo sli an mehanizmu produkcijeHCl-a u acidnim elijama želuca. Kao i u slu aju gastri ne sekrecije, i u produkciju H+ uosteoklastima, su uklju eni karboanhidraza i anjonski antiport. Aktivacijom protonske pumpe, Vtipa, H+ se pumpaju u ekstracelularni prostor.

Resorpcija kosti je regulisana elijskim interakcijama osteoklasta sa susednim osteoblastima.Osteoblasti su elije uklju ene u formiranje kosti. Oni produkuju kolagen I, glavnu organskukomponentu kostiju. Osteoblasti na svojoj površini ekspresuju trimerni signalni protein, RANKL(engl. Receptor Activator for Nuclear Factor B Ligand), koji pripada TNF- superfamilijitrimernih proteina. RANKL je ligand za RANK (engl. Receptor Activator of Nuclear Factor B),receptor koji se ekspresuje na površini osteoklasta. Interakcija RANKL sa RANK, aktivira multiple

38 v 3 integrin je važan za inicijalno vezivanje osteoklasta za površinu kosti. Ukoliko se dodaju antitela za v 3 integrin, koja blokiraju njegovuaktivnost, blokira e se i resorpcija kosti.

234

intracelularne signalne puteve u osteoklastima, uklju uju i i NF -B signalni put. Aktivacija ovihsignalnih puteva, indukuje diferencijaciju osteoklasta, koji menjaju oblik i vrsto se vezuju zakost.

Osteoblasti, takodje, produkuju i sekretuju protein “mamac” tzv. OPG (engl. osteoprotegerin) kojije dobio naziv po svojoj osobini da “zaštiti kosti”. Sekretovani OPG vezuje RANKL na površiniosteoblasta, spe avaju i RANKL-RANK interakciju, a time i inhibiciju aktivacije osteoklasta iresorpciju kosti.

Slika 7. 1. Regulacija resorpcije kosti. Osteoklasti se inicijalno vezuju za kostpreko integrina iz podosoma. Interakcija sa susednim osteoblastima aktiviraosteoklaste, preko interakcije trimernih proteina RANKL i RANK (1) što izazivareorganizaciju citoskeleta, koja dovodi do formiranja specijalizovane vrste veze(tight seal) sa kosti (2). Aktivirani osteoklasti sekretuju u ekstracelularni prostor,korozivnu mešavinu HCl i proteaza koja resorbuje kosti (3). Osteoblasti mogu dasmanje resorpciju kosti, sekrecijom OPG. Vezivanjem ovog “receptora mamca” zaRANKL (4), što blokira vezivanje RANKL za RANK osteoklasta, a time i njihovuaktivaciju.

Osteopetroza je nasledna bolest, koja se manifestuje pove anom gustinom kosti i nastaje uslednenormalno male resorpcije kosti. Mnogo es a je osteoporoza, koja se vrlo esto javlja kod žena upostmenopauzi. Ovaj metaboli ki poreme aj dovodi do neproporcionalno velike resorpcije kostiju,dovode i do nastajanja poroznih kostiju, koje se lako lome. Mnogi steroidni hormoni (npr.estrogeni hormoni, glukokortikoidi), vitamin D, polipeptidni hormoni i lekovi mogu da uti u nametabolizam kosti, direktnim uticajem na osteoblaste menjanjem RANKL-RANK signalnogsistema. Na primer, estrogeni hormoni indukuju sekreciju OPG i tako inhibišu resorpciju kosti.Kada je nivo estradiola nizak, kao što je kod postmenopauzalnih žena, resorpcija raste i kosti suslabije. Možda je mogu razvoj tretmana osteoporoze koji se bazira na menjanju signalnog sistemakoji kontroliše resorpciju kosti.

235

LITERATURNI IZVORI LAlberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K & Walter P (2002): Molecular Biology of the

Cell 4ed with CD. Garland Science.Bolander FF (2004): Molecular Endocrinology. Elsevier Academic Press

Bradshaw RA & Dennis EA (2004): Handbook of Cell Signaling, three volume set 1-3.Academic Press.

ConnMP & Means AR (2000): Principles of Molecular Regulation. Humana Press.

Gomperts BD, Kramer IM & Tatham PER (2003): Signal Transduction. Elsevier Academic Press

Griffin EJ, Ojeda RS [2004]. Text Book of Endocrinology Physiology. Oxford University

Hancock JT (2005): Cell Signaling. Oxford University Press.

Hardy MP & Griswold MD (2005): Testicular Cell Dynamics and Endocrine Signaling.ANN.NY.ACAD.SCI.

Krauss G (2005): Biochemistry of Signal Transduction and Regulation. WILEY-VCH.

Kosti T & Andri S (2007): Molekularna i elijska imunologija. Skripta. WUS Austria.

Lucas KV, Pitari GN, Kazerounian S, Ruiz-Stewart I, Park J, Schulz S, Chepenik KP & WaldmanSA (2000): Guanylyl Cyclases and Signaling by cGMP. Pharmacological Reviews 52(3):375-413.

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky LS & Darnell J (2004):Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company.

Andri S, Kosti T, Andri N & Zori S (2005): Uporedna fiziologija životinja. WUS Austria.

Niehoff D (2005): Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease. JosephHenry Press.

Wilson J & Hunt T (2002): Molecular Biology of the Cell Problems Approach Book 4thed.Garland Science.

236

Autori:Silvana Andri i Tatjana Kosti

Izdaje:WUS AustriaPrirodno-matemati ki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu

Naslovnu stranu osmislili:NINI i TEJ

Grafi ko oblikovanje korica:Predrag Nikoli

Štampa:Daniel Print

237

CIP - ,

576.5(075.8)

Mehanizmi elijske komunikacijeSilvana Andri i Tatjana KostiWUS Austria, Daniel Print, Prirodno-matemati ki fakultetNovi Sad, 2007- 237 str. : ilustr. ; 21 cm

Tiraž: 100.

ISBN 987-86-7031-119-01. Andri , Silvanaa) Signaling - elije

COBISS.SR-ID 221486087